JP2022525428A - Ｔｔｒガイドｒｎａと、ｒｎａガイドｄｎａ結合剤をコードするポリヌクレオチドとを含む組成物および方法 - Google Patents

Ｔｔｒガイドｒｎａと、ｒｎａガイドｄｎａ結合剤をコードするポリヌクレオチドとを含む組成物および方法 Download PDF

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Abstract

ＴＴＲ遺伝子内で編集するための、例えば、二本鎖切断を導入するための組成物および方法が提供される。トランスサイレチンに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を有する対象を治療するための組成物および方法が提供される。

Description

本特許出願は、２０１９年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／８２５，６３７号に対する優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年３月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は、２０２０－０３－２４＿０１１５５－００２８－００ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは４５１ＫＢである。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、ＴＴＲ遺伝子によって生成されるタンパク質であり、通常、レチノールおよびサイロキシンを全身に輸送するように機能する。ＴＴＲは、主に肝臓で合成され、脈絡叢および網膜でほんのわずか産生される。ＴＴＲは通常、血中の可溶性四量体タンパク質として循環する。
四量体の安定性を乱し得る病原性バリアントは、ＴＴＲ遺伝子の変異体対立遺伝子によってコードすることができる。変異体ＴＴＲは、アミロイド（すなわち、ミスフォールディングＴＴＲタンパク質の凝集体）を生成し得るミスフォールディングＴＴＲを生じる場合がある。いくつかの場合では、ＴＴＲの病原性バリアントは、アミロイドーシス、すなわち、アミロイドの蓄積から生じる疾患を引き起こし得る。例えば、ミスフォールディングＴＴＲ単量体は、末梢神経、心臓、および消化管などの組織内のアミロイド原線維内で重合し得る。アミロイドプラークはまた、ミスフォールディングＴＴＲ上に沈着した野生型ＴＴＲも含み得る。
また、６０歳以上の男性では、野生型ＴＴＲのミスフォールディングおよび沈着が認められ、これが心拍の問題、心不全、手根管と関連している。
ＴＴＲの沈着によって特徴付けられるアミロイドーシスは、「ＡＴＴＲ」、「ＴＴＲ関連アミロイドーシス」、「ＴＴＲアミロイドーシス」、または「ＡＴＴＲアミロイドーシス」、「ＡＴＴＲ家族性アミロイドーシス」（家族内の遺伝子変異と関連する場合）、または「ＡＴＴＲｗｔ」または「野生型ＡＴＴＲ」（野生型ＴＴＲのミスフォールディングおよび沈着から生じる場合）と称され得る。
ＡＴＴＲは、広範囲にわたる症状を呈する場合があり、異なる種類のＡＴＴＲを有する患者は、異なる特徴および予後を有し得る。ＡＴＴＲのいくつかの種類としては、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、および野生型ＴＴＲアミロイドーシス（ｗｔ－ＴＴＲアミロイドーシス）が挙げられる。ＦＡＰは、一般に、感覚運動ニューロパチーを呈し、一方、ＦＡＣおよびｗｔ－ＴＴＲアミロイドーシスは、一般に、うっ血性心不全を呈する。ＦＡＰおよびＦＡＣは、通常、ＴＴＲ遺伝子における遺伝子変異と関連付けられ、ＴＴＲ遺伝子における１００を超える異なる変異は、ＡＴＴＲと関連付けられている。対照的に、ｗｔ－ＴＴＲアミロイドーシスは、加齢と関連付けられ、ＴＴＲにおける遺伝子変異とは関連付けられない。世界でおよそ５０，０００人の患者がＦＡＰおよびＦＡＣを患う可能性があると推定されている。
ＴＴＲにおける１００を超える変異が、ＡＴＴＲに関連するが、特定の変異が、ニューロパチーおよび／または心筋症とより密接に関連する。例えば、ＴＴＲのＴ６０における変異は、心筋症およびニューロパチーの両方と関連し、Ｖ３０における変異は、ニューロパチーの方により関連しており、Ｖ１２２における変異は、心筋症の方により関連している。
ＡＴＴＲの治療のための様々な治療アプローチが研究されてきたが、疾患の進行を止め、生活の質を向上させる承認薬物は存在しない。ＡＴＴＲの治療のために肝臓移植が研究されているが、顕著なリスクを伴い、移植後に疾患の進行が継続することがあるため、その使用は減少しつつある。ジフルニサルおよびタファミジスなどの小分子安定剤は、ＡＴＴＲの進行を遅らせるように思われるが、これらの薬剤は、疾患の進行を止めるものではない。
破壊のためにアミロイド原線維を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ノックダウン、アンチセンスノックダウン、またはモノクローナル抗体を使用するアプローチも、現在研究されているが、ＴＴＲ発現の短期間抑制に関する結果は、予備データを奨励することを示しており、ＴＴＲの長期間続く抑制を生じさせることができる治療の必要性が存在する。
したがって、以下の実施形態が提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤とともにガイドＲＮＡを用い、ＴＴＲ遺伝子の発現を実質的に低減するか、またはノックアウトし、それによって、ＡＴＴＲに関連するＴＴＲタンパク質の産生を実質的に低減するか、または除去する組成物および方法を提供する。ＴＴＲ遺伝子の改変によってＡＴＴＲに関連するＴＴＲタンパク質の産生を実質的に低減するか、または除去することは、長期的な低減または除去となり得る。
以下の実施形態が本明細書で提供される。
実施形態１は、組成物であって、
（ｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、
ａ．オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいは
ｂ．オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有するか、または少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいは
ｃ．オープンリーディングフレームが、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４に列挙されるコドン、表５の低Ａセット、または表５の低Ａ／Ｕセットであるコドンのセットからなり、かつ／あるいは
ｄ．オープンリーディングフレームは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１２３％の範囲であり、かつ／あるいは
ｅ．オープンリーディングフレームは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％の範囲である、核酸と、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターであって、ガイドＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターと、を含む、組成物である。
実施形態２は、ＴＴＲ遺伝子を修飾し、かつ／またはＴＴＲ遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法であって、組成物を細胞に送達することを含み、組成物が、
（ｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、
ａ．オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいは
ｂ．オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有するか、または少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいは
ｃ．オープンリーディングフレームが、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４に列挙されるコドン、表５の低Ａセット、または表５の低Ａ／Ｕセットであるコドンのセットからなり、かつ／あるいは
ｄ．オープンリーディングフレームは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１２３％の範囲であり、かつ／あるいは
ｅ．オープンリーディングフレームは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％の範囲である、核酸と、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターであって、ガイドＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターと、を含む、方法である。
実施形態３は、対象においてＴＴＲ血清濃度を低減し、ＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療し、かつ／またはＴＴＲを含むアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、組成物が、
（ｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、
ａ．オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいは
ｂ．オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいは
ｃ．オープンリーディングフレームが、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４に列挙されるコドン、表５の低Ａセット、または表５の低Ａ／Ｕセットであるコドンのセットからなり、かつ／あるいは
ｄ．オープンリーディングフレームは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１５０％の範囲であり、かつ／あるいは
ｅ．オープンリーディングフレームは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％の範囲である、核酸と、
（ｉｉ）ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターであって、ガイドＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターと、を含み、それによって、対象においてＴＴＲ血清濃度を低減し、ＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療し、かつ／またはＴＴＲを含むアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防する、方法である。
実施形態４は、ガイドＲＮＡが、配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、２９、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６１、６３、６５、６６、６８、または６９から選択されるガイド配列を含む、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態５は、細胞または対象においてＴＴＲ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する際に使用するための、実施形態１または４の組成物である。
実施形態６は、細胞または対象においてＴＴＲ遺伝子を修飾する際に使用するための、実施形態１、４、または５の組成物である。
実施形態７は、対象においてＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療する際に使用するための、実施形態１、４、５、または６の組成物である。
実施形態８は、対象においてＴＴＲ血清濃度を低減する際に使用するための、実施形態１、４、５、６、または７の組成物である。
実施形態９は、対象においてアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防する際に使用するための、実施形態１、４、５、６、７、または８の組成物である。
実施形態１０は、本方法が、３０分間より長い注入によって組成物を投与することを含む、実施形態２～９のいずれか１つの使用のための組成物または方法である。
実施形態１１は、組成物が、約４５～７５分間、７５～１０５分間、１０５～１３５分間、１３５～１６５分間、１６５～１９５分間、１９５～２２５分間、２２５～２５５分間、２５５～２８５分間、２８５～３１５分間、３１５～３４５分間、または３４５～３７５分間の注入によって投与される、実施形態１０の方法または使用のための組成物である。
実施形態１２は、組成物が、約１．５～６時間の注入によって投与される、実施形態１０または１１の方法または使用のための組成物である。
実施形態１３は、組成物が、約６０分間、約９０分間、約１２０分間、約１５０分間、約１８０分間、または約２４０分間の注入によって投与される、実施形態１０の方法または使用のための組成物である。
実施形態１４は、組成物が、約１２０分間の注入によって投与される、実施形態１０の方法または使用のための組成物である。
実施形態１５は、組成物が、血清ＴＴＲレベルを低減する、実施形態２～１４のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１６は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベルと比較して、血清ＴＴＲレベルが少なくとも５０％低減される、実施形態１５の方法または使用のための組成物である。
実施形態１７は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベルと比較して、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、もしくは９９～１００％、血清ＴＴＲレベルを低減する、実施形態１５１の方法または使用のための組成物である。
実施形態１８は、組成物がＴＴＲ遺伝子の編集を引き起こす、実施形態２～１７のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１９は、編集が、編集される集合体のパーセンテージ（編集パーセント）として計算される、実施形態１８の方法または使用のための組成物である。
実施形態２０は、編集パーセントが、集合体の３０～９９％である、実施形態１９の方法または使用のための組成物である。
実施形態２１は、編集パーセントが、集合体の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％である、実施形態１９の方法または使用のための組成物である。
実施形態２２は、組成物が、少なくとも１つの組織におけるアミロイド沈着を低減する、実施形態２～２１のいずれか１つの実施形態のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態２３は、少なくとも１つの組織が、胃、結腸、坐骨神経、または後根神経節のうちの１つ以上を含む、実施形態２２の方法または使用のための組成物である。
実施形態２４は、アミロイド沈着が、組成物の投与の８週間後に測定される、実施形態２２または２３の方法または使用のための組成物である。
実施形態２５は、アミロイド沈着が、陰性対照、または組成物の投与前に測定されるレベルと比較される、実施形態２２～２４のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態２６は、アミロイド沈着が、生検試料において、および／または免疫染色によって測定される、実施形態２２～２５のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態２７は、アミロイド沈着が、陰性対照においてみられるアミロイド沈着の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％低減する、実施形態２２～２６のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態２８は、アミロイド沈着が、組成物の投与前にみられるアミロイド沈着の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％低減する、実施形態２２～２７のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態２９は、組成物が、少なくとも２回投与または送達される、実施形態２～２８のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態３０は、組成物が、少なくとも３回投与または送達される、実施形態２９の方法または使用のための組成物である。
実施形態３１は、組成物が、少なくとも４回投与または送達される、実施形態２９の方法または使用のための組成物である。
実施形態３２は、組成物が、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回まで投与または送達される、実施形態２９の方法または使用のための組成物である。
実施形態３３は、投与または送達が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間の間隔で行われる、実施形態２９～３２のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態３４は、投与または送達が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週間の間隔で行われる、実施形態２９～３２のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態３５は、投与または送達が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヶ月間の間隔で行われる、実施形態２９～３２のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態３６は、ガイドＲＮＡが、ガイド配列を含み、かつ配列番号１２６のヌクレオチド配列をさらに含むｃｒＲＮＡを含み、配列番号１２６のヌクレオチドが、ガイド配列にその３’末端で続く、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態３７は、ガイドＲＮＡが、デュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）である、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態３８は、デュアルガイドＲＮＡが、配列番号１２６のヌクレオチド配列を含み、配列番号１２６のヌクレオチドがガイド配列にその３’末端で続くｃｒＲＮＡと、ｔｒＲＮＡと、を含む、実施形態３７の方法または組成物である。
実施形態３９は、ガイドＲＮＡが、シングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１～３６のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態４０は、ｓｇＲＮＡが、配列番号３のパターンを有するガイド配列を含む、実施形態３９の方法または組成物である。
実施形態４１は、ｓｇＲＮＡが、配列番号３の配列を含む、実施形態３９の方法または組成物である。
実施形態４２は、ｓｇＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列、ならびに配列番号１２６のヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む、実施形態３９～４１のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態４３は、ｓｇＲＮＡが、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含む、実施形態３９～４２のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態４４は、ｓｇＲＮＡが、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４から選択される配列を含む、実施形態３９の方法または組成物である。
実施形態４５は、ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態４６は、少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４５の方法または組成物である。
実施形態４７は、少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態４５または４６の方法または組成物である。
実施形態４８は、少なくとも１つの修飾が、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４５～４７のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態４９は、少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、実施形態４５～４８のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５０は、少なくとも１つの修飾が、３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、実施形態４５～４９のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５１は、少なくとも１つの修飾が、最初の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、実施形態４５～５０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５２は、少なくとも１つの修飾が、最後の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、実施形態４５～５１のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５３は、少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４５～５２のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５４は、少なくとも１つの修飾が、３’末端における最後の３個のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４５～５３のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５５は、ガイドＲＮＡが、配列番号３の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４５～５４のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５６は、組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１～５５のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５７は、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、実施形態１～５６のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態５８は、ＬＮＰが、ＣＣＤ脂質を含む、実施形態５７の方法または組成物である。
実施形態５９は、ＣＣＤ脂質が、脂質Ａまたは脂質Ｂであり、任意選択で、ＣＣＤ脂質が、脂質Ａである、実施形態５８の方法または組成物である。
実施形態６０は、ＬＮＰが、ヘルパー脂質を含む、実施形態５７～５９のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６１は、ヘルパー脂質が、コレステロールである、実施形態６０の方法または組成物である。
実施形態６２は、ＬＮＰが、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）を含む、実施形態５７～６１のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６３は、ステルス脂質が、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、実施形態６２の方法または組成物である。
実施形態６４は、
（ｉ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６であり、
（ｉｉ）ＬＮＰが、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約２７～３９．５ｍｏｌ％のヘルパー脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約５～７（例えば、約６）であり、
（ｉｉｉ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０であり、
（ｉｖ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６であり、
（ｖ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６であり、
（ｖｉ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約０～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約３～１０であり、
（ｖｉｉ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約１ｍｏｌ％未満の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０であり、
（ｖｉｉｉ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０であり、ＬＮＰ組成物が、中性リン脂質を本質的に含まないか、または含まず、あるいは
（ｉｘ）ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～７である、実施形態５７～６３のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ａは、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％が、約３である、実施形態６４の方法または組成物である。
実施形態６４ｂは、アミン脂質のｍｏｌ％が、約５０である、実施形態６４または６４ａの方法または組成物である。
実施形態６４ｃは、アミン脂質のｍｏｌ％が、約５５である、実施形態６４～６４ｂのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｄは、アミン脂質のｍｏｌ％が、±３ｍｏｌ％である、実施形態６４～６４ｃのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｅは、アミン脂質のｍｏｌ％が、±２ｍｏｌ％である、実施形態６４～６４ｄのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｆは、アミン脂質のｍｏｌ％が、４７～５３ｍｏｌ％である、実施形態６４～６４ｅのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｇは、アミン脂質のｍｏｌ％が、４８～５３ｍｏｌ％である、実施形態６４～６４ｆのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｈは、アミン脂質のｍｏｌ％が、５３～５７ｍｏｌ％である、実施形態６４～６４ｇのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｉは、Ｎ／Ｐ比が、６±１である、実施形態６４～６４ｈのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｊは、Ｎ／Ｐ比が、６±０．５である、実施形態６４～６４ｉのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｋは、アミン脂質が、脂質Ａである、実施形態６４～６４ｊのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｌは、アミン脂質が、脂質Ａの類似体である、実施形態６４～６４ｌのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｍは、類似体が、アセタール類似体である、実施形態６４ｌの方法または組成物である。
実施形態６４ｎは、アセタール類似体が、Ｃ４～Ｃ１２アセタール類似体である、実施形態６４ｍの方法または組成物である。
実施形態６４ｏは、アセタール類似体が、Ｃ５～Ｃ１２アセタール類似体である、実施形態６４ｍの方法または組成物である。
実施形態６４ｐは、アセタール類似体が、Ｃ５～Ｃ１０アセタール類似体である、実施形態６４ｍの方法または組成物である。
実施形態６４ｑは、アセタール類似体が、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、およびＣ１２類似体から選択される、実施形態６４ｍの方法または組成物である。
実施形態６４ｒは、ヘルパー脂質が、コレステロールである、実施形態６４～６４ｑのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｓは、中性脂質が、ＤＳＰＣである、実施形態６４～６４ｒのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｔは、中性脂質が、ＤＰＰＣである、実施形態６４～６４ｓのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｕは、ＰＥＧ脂質が、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む、実施形態６４～６４ｔのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｖは、ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－２ｋを含む、実施形態６４～６４ｕのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｗは、ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態６４～６４ｖのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｘは、ＰＥＧ－ＤＭＧが、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、実施形態６４ｗの方法または組成物である。
実施形態６４ｙは、ＬＮＰ組成物が、中性脂質を本質的に含まない、実施形態６４～６４ｘのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６４ｚは、中性脂質が、リン脂質である、実施形態６４ｙの方法または組成物である。
実施形態６５は、ＬＮＰが、中性脂質を含み、任意選択で、中性脂質が、ＤＳＰＣである、実施形態５７～６４ｚのいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６６は、アミン脂質が、約５０ｍｏｌ％で存在する、実施形態６４または６５の方法または組成物である。
実施形態６７は、中性脂質が、約９ｍｏｌ％で存在する、実施形態６４～６６のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６８は、ステルス脂質が、約３ｍｏｌ％で存在する、実施形態６２～６７のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態６９は、ヘルパー脂質が、約３８ｍｏｌ％で存在する、実施形態６０～６８のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７０は、ＬＮＰが、約６のＮ／Ｐ比を有する、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７１は、ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約５０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣなどの中性脂質と、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質などのステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）とを含み、脂質成分の残りが、コレステロールなどのヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６である、実施形態７０の方法または組成物である。
実施形態７２は、アミン脂質が、脂質Ａである、実施形態６４～７１のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７３は、中性脂質が、ＤＳＰＣである、実施形態６４～７２のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７４は、ステルス脂質が、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、実施形態６２～７３のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７５は、ヘルパー脂質が、コレステロールである、実施形態６０～７４のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７６は、ＬＮＰが、脂質成分を含み、脂質成分が、約５０ｍｏｌ％の脂質Ａと、約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとを含み、脂質成分の残りが、コレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６である、実施形態７０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７７は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓクリバーゼである、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態７８は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、実施形態７７の方法または組成物である。
実施形態７９は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が修飾されている、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態８０は、修飾されたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、実施形態７９の方法または組成物である。
実施形態８１は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓである、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態８２は、組成物が、薬学的製剤であり、薬学的に許容される担体をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態８３は、組成物が、ＴＴＲを含むアミロイドまたはアミロイド原線維を低減または予防する、実施形態２～８２のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態８４は、アミロイドまたはアミロイド原線維が、神経、心臓、または消化管内のものである、実施形態８３の方法または使用のための組成物である。
実施形態８５は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＴＴＲ遺伝子におけるＤＳＢの修復中に変異を引き起こす、実施形態２～８４のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態８６は、ＮＨＥＪが、ＴＴＲ遺伝子におけるＤＳＢの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入を引き起こす、実施形態８５の方法または使用のための組成物である。
実施形態８７は、ヌクレオチド変異の欠失または挿入が、ＴＴＲ遺伝子においてフレームシフトまたはナンセンスを誘導する、実施形態８６の方法または使用のための組成物である。
実施形態８８は、フレームシフトまたはナンセンス変異が、肝臓細胞の少なくとも５０％のＴＴＲ遺伝子において誘導される、実施形態８６の方法または使用のための組成物である。
実施形態８９は、フレームシフトまたはナンセンス変異が、肝臓細胞の５０％～６０％、６０％～７０％、７０％または８０％、８０％～９０％、９０～９５％、９５％～９９％、または９９％～１００％のＴＴＲ遺伝子において誘導される、実施形態８８の方法または使用のための組成物である。
実施形態９０は、ヌクレオチドの欠失または挿入が、ＴＴＲ遺伝子において、オフターゲット部位におけるよりも少なくとも５０倍以上生じる、実施形態８６～８９のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態９１は、ヌクレオチドの欠失または挿入が、ＴＴＲ遺伝子において、オフターゲット部位におけるよりも５０倍～１５０倍、１５０倍～５００倍、５００倍～１５００倍、１５００倍～５０００倍、５０００倍～１５０００倍、１５０００倍～３００００倍、または３００００倍～６００００倍多く生じる、実施形態９０の方法または使用のための組成物である。
実施形態９２は、ヌクレオチドの欠失または挿入が、初代ヒト肝細胞において３個以下、２個以下、１個以下、または０個のオフターゲット部位で生じ、任意選択で、オフターゲット部位が、初代ヒト肝細胞のゲノム内のタンパク質コード領域では生じない、実施形態８６～９１のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態９３は、ヌクレオチドの欠失または挿入が、Ｃａｓ９を過剰発現する細胞においてヌクレオチドの欠失または挿入が生じるオフターゲット部位の数より少ない数の初代ヒト肝細胞におけるオフターゲット部位で生じ、任意選択で、オフターゲット部位が、初代ヒト肝細胞のゲノム内のタンパク質コード領域内で発生しない、実施形態９２の方法または使用のための組成物である。
実施形態９４は、Ｃａｓ９を過剰発現する細胞が、Ｃａｓ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞である、実施形態９３の方法または使用のための組成物である。
実施形態９５は、初代ヒト肝細胞におけるオフターゲット部位の数が、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡでインビトロでトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することによって決定され、任意選択で、オフターゲット部位が、初代ヒト肝細胞のゲノム内のタンパク質コード領域内で発生しない、実施形態９２～９４のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態９６は、初代ヒト肝細胞におけるオフターゲット部位の数が、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡおよびドナーオリゴヌクレオチドでインビトロでトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することを含むオリゴヌクレオチド挿入アッセイによって決定され、任意選択で、オフターゲット部位が、初代ヒト肝細胞のゲノム内のタンパク質コード領域内で発生しない、実施形態９２～９４のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態９７は、ガイドＲＮＡの配列が、
ａ）配列番号９２もしくは１０４、
ｂ）配列番号８７、８９、９６、もしくは１１３、
ｃ）配列番号１００、１０２、１０６、１１１、もしくは１１２、または
ｄ）配列番号８８、９０、９１、９３、９４、９５、９７、１０１、１０３、１０８、もしくは１０９である、実施形態１～３６または３９～９６のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態９８は、ガイドＲＮＡが、初代ヒト肝細胞のゲノム内のタンパク質コード領域内で発生するオフターゲット部位でインデルを生成しない、実施形態９７の方法または組成物である。
実施形態９９は、組成物を投与することで、対象におけるＴＴＲのレベルを低減する、実施形態２～９８のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１００は、ＴＴＲのレベルが、少なくとも５０％低減する、実施形態９９の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０１は、ＴＴＲのレベルが、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％または８０％、８０％～９０％、９０～９５％、９５％～９９％、または９９％～１００％低減する、実施形態１００の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０２は、ＴＴＲのレベルが、血清、血漿、血液、脳脊髄液、または喀痰において測定される、実施形態１００または１０１の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０３は、ＴＴＲのレベルが、肝臓、脈絡叢、および／または網膜において測定される、実施形態１００または１０１の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０４は、ＴＴＲのレベルが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介して測定される、実施形態９９～１０３のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１０５は、対象が、ＡＴＴＲを有する、実施形態２～１０４のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１０６は、対象が、ヒトである、実施形態２～１０５のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１０７は、対象が、ＡＴＴＲｗｔを有する、実施形態１０５または１０６の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０８は、対象が、遺伝性ＡＴＴＲを有する、実施形態１０５または１０６の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０９は、対象が、ＡＴＴＲの家族歴を有する、実施形態２～１０６または１０８のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１１０は、対象が、家族性アミロイドポリニューロパチーを有する、実施形態２～１０６または１０８～１０９のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１１１は、対象が、ＡＴＴＲの神経症状のみ、または主にＡＴＴＲの神経症状を有する、実施形態２～１１０のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１１２は、対象が、家族性アミロイド心筋症を有する、実施形態２～１１１のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１１３は、対象が、ＡＴＴＲの心臓症状のみ、または主にＡＴＴＲの心臓症状を有する、実施形態２～１１０または１１２のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１１４は、対象が、Ｖ３０変異を有するＴＴＲを発現する、実施形態２～１１３のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１１５は、Ｖ３０変異が、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、またはＶ３０Ｍである、実施形態１１４の方法または使用のための組成物である。
実施形態１１６は、対象が、Ｔ６０変異を有するＴＴＲを発現する、実施形態２～１１３のいずれか１つの実施形態の方法または使用のための組成物である。
実施形態１１７は、Ｔ６０変異が、Ｔ６０Ａである、実施形態１１６の方法または使用のための組成物である。
実施形態１１８は、対象が、Ｖ１２２変異を有するＴＴＲを発現する、実施形態２～１１３のいずれか１つの実施形態の方法または使用のための組成物である。
実施形態１１９は、Ｖ１２２変異が、Ｖ１２２Ａ、Ｖ１２２Ｉ、またはＶ１２２（－）である、実施形態１１８の方法または使用のための組成物である。
実施形態１２０は、対象が、野生型ＴＴＲを発現する、実施形態２～１１３のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１２１は、対象が、Ｖ３０、Ｔ６０、またはＶ１２２変異を有するＴＴＲを発現しない、実施形態２～１０７、または１２０のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１２２は、対象が、病的な変異を有するＴＴＲを発現しない、実施形態２～１０７、または１２０～１２１のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１２３は、対象が、野生型ＴＴＲについてホモ接合である、実施形態１２２の方法または使用のための組成物である。
実施形態１２４は、対象が、投与後に、感覚運動ニューロパチーの症状が改善し、安定化し、または変化が遅くなる、実施形態２～１２３のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１２５は、感覚運動ニューロパチーが改善し、安定化し、または変化が遅くなることが、筋電図、神経伝導検査、または患者が報告する転帰を使用して測定される、実施形態１２４の方法または使用のための組成物である。
実施形態１２６は、対象が、うっ血性心不全の症状が改善し、安定化し、または変化が遅くなる、実施形態２～１２５のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１２７は、うっ血性心不全が改善し、安定化し、または変化が遅くなることが、心臓バイオマーカー検査、肺機能検査、胸部ｘ線、または心電図法を使用して測定される、実施形態１２６の方法または使用のための組成物である。
実施形態１２８は、組成物または薬学的製剤が、ウイルスベクターを介して投与される、実施形態２～１２７のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１２９は、組成物または薬学的製剤が、脂質ナノ粒子を介して投与される、実施形態２～１２７のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１３０は、対象が、組成物または製剤を投与する前に、ＴＴＲ遺伝子内の特定の変異について試験される、実施形態２～１２９のいずれか１つの方法または使用のための組成物である。
実施形態１３１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５、６、９、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６３、６５、６６、６８、または６９である、先行実施形態のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１３９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４０は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１３である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号１９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１４９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５０は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２３である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号２９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１５９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６０は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３３である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号３９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１６９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７０は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４３である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号４９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１７９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８０は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５３である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１８９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９０は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６３である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号６９である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９８は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態１９９は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２００は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７４である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０１は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７５である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０２は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７６である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０３は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７７である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０４は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号７８である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０５は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号８０である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０６は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号８１である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０７は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号８２である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法または組成物である。
実施形態２０８は、オープンリーディングフレームが、その配列の少なくともその最初の１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％にわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有する、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２０９は、オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２１０は、オープンリーディングフレームのコドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％が、表４、表５、または表７に列挙されるコドンである、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２１１は、表４、表５、または表７に列挙されるコドンが、表４に列挙されるコドンである、実施形態２１０の組成物または方法である。
実施形態２１２は、表４、表５、または表７に列挙されるコドンが、表５の低Ｕコドンセットのコドンである、実施形態２１０の組成物または方法である。
実施形態２１３は、表４、表５、または表７に列挙されるコドンが、表５の低Ａコドンセットのコドンである、実施形態２１０の組成物または方法である。
実施形態２１４は、表４、表５、または表７に列挙されるコドンが、表５の低Ａ／Ｕコドンセットのコドンである、実施形態２１０の組成物または方法である。
実施形態２１５は、表４、表５、または表７に列挙されるコドンが、表７に列挙されるコドンである、実施形態２１０の組成物または方法である。
実施形態２１６は、オープンリーディングフレームが、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１０１％、１０２％、１０３％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、または１２３％の範囲である、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２１７は、オープンリーディングフレームが、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１０１％、１０２％、１０３％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、または１５０％の範囲である、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２１８は、核酸が、配列番号２３２、２３４、２３６、２３８、２４１、または２７５～２７７のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する５’ＵＴＲを含む、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２１９は、核酸が、配列番号２３３、２３５、２３７、２３９、または２４０のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する３’ＵＴＲを含む、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２２０は、核酸が、同じ供給源からの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２２１は、核酸が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、およびＣａｐ２から選択される５’キャップを含むｍＲＮＡである、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２２２は、オープンリーディングフレームが、配列番号３７７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２２３は、核酸が、ウリジンの少なくとも１０％が修飾ウリジンで置換されるｍＲＮＡである、先行実施形態のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２２４は、修飾ウリジンが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、シュードウリジン、５－メトキシウリジン、または５－ヨードウリジンのうちの１つ以上である、実施形態２２３の組成物または方法である。
実施形態２２５は、修飾ウリジンが、Ｎ１－メチル－シュードウリジンまたは５－メトキシウリジンのうちの片方または両方である、実施形態２２３の組成物または方法である。
実施形態２２６は、修飾ウリジンが、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである、実施形態２２３の組成物または方法である。
実施形態２２７は、修飾ウリジンが、５－メトキシウリジンである、実施形態２２３の組成物または方法である。
実施形態２２８は、ｍＲＮＡ中のウリジンの１５％～４５％が、修飾ウリジンで置換されている、実施形態２２３～２１０のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２２９は、ｍＲＮＡ中のウリジンの少なくとも２０％または少なくとも３０％が、修飾ウリジンで置換されている、実施形態２２３～２１１のいずれか１つの組成物または方法である。
実施形態２３０は、ｍＲＮＡ中のウリジンの少なくとも８０％または少なくとも９０％が、修飾ウリジンで置換されている、実施形態２２９の組成物または方法である。
実施形態２３１は、ｍＲＮＡ中のウリジンの１００％が、修飾ウリジンで置換されている、実施形態２２９の組成物または方法である。
実施形態２３２は、ＡＴＴＲを有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、実施形態１または４～２３１のいずれかの組成物または製剤の使用である。
実施例２に記載されるような２名のドナーからの初代ヒト肝細胞における編集％を示す。 （上記（図１Ａ）の通り。） 実施例２に記載されるような初代カニクイザル肝細胞における編集％を示す。 ＬＮＰの３０分間投与を、長い投薬プロトコルと比較した、非ヒト霊長類におけるインビボ研究での血清ＴＴＲレベル（図３Ａ）、肝臓ＴＴＲ編集（図３Ｂ）、および循環ＡＬＴレベル（図３Ｃ）を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。）
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本発明は例示される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。これとは逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれ得る、すべての代替物、改変物、および均等物を網羅することが意図される。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「コンジュゲート（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数のコンジュゲートを含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含むなどである。
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値および測定可能な値は、有意な桁および測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、以下の詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。
上の明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「および／または」に等しい意味で使用される。
本明細書で使用される章の見出しは、構成的な目的のみのためであり、所望の主題を決して限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の材料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、改変物、および均等物を包含する。
Ｉ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語および句は、以下の意味を有することを意図する。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、およびそれらの類似体であるポリマーを含む）を含む多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはＮ１－メチルシュードウリジン等の修飾ウリジン）、イノシン、プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－もしくはアザ－プリン、デアザ－もしくはアザ－ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、およびＯ４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．編集、１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照）。核酸は、骨格がポリマーの位置に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基および連結のみを含んでいてもよく、または従来の構成要素および置換の両方（例えば、２’メトキシ連結を有する従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の両方を含有するポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体である「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡおよびＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはその類似体およびＤＮＡ内のチミンもしくはその類似体の存在によって異なり得る。
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、三次元立体配座を採用することができるアミノ酸残基を含む多量体化合物を指す。ポリペプチドには、限定されないが、酵素、酵素前駆体タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、受容体、核酸結合タンパク質、抗体などが含まれる。ポリペプチドは、翻訳後修飾、非天然アミノ酸、人工基などを含んでよいが、必ずしもそうではない。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、および「ガイド」は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても既知である）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても既知である）のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは多様性を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるような修飾ＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）および関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用できる。いくつかの実施形態において、ガイド配列と標的配列とは、１００％相補的または同一である。他の実施形態において、ガイド配列と標的配列とは、少なくとも１個のミスマッチを含有していてもよい。例えば、ガイド配列および標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態において、ガイド配列および標的配列は、１～４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列および標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。
Ｃａｓタンパク質の核酸基質は二本鎖核酸であるため、Ｃａｓタンパク質の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖およびマイナス鎖（すなわち、与えられる配列およびその配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、標的配列の逆相補体に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）／ニッカーゼおよびその不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれる。本明細書で使用される「Ｃａｓタンパク質」とも称される「Ｃａｓヌクレアーゼ」には、Ｃａｓクリバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、およびｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が包含される。Ｃａｓクリバーゼ／ニッカーゼおよびｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤には、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはそのＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニットおよびクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼなどの、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡガイドＤＮＡクリバーゼまたはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２Ｃａｓクリバーゼおよびクラス２Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、ならびにクリバーゼ／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が含まれる。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、およびｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））は、Ｃａｓ９と相同性であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１およびＳ３を参照。「Ｃａｓ９」は、Ｓｐｙ Ｃａｓ９、本明細書に列挙されるＣａｓ９のバリアント、およびそれらの等価物を包含する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。
「修飾ウリジン」は、本明細書では、ウリジンと同じ水素結合受容体を有し、ウリジンとは１つ以上の構造的差異を有する、チミジン以外のヌクレオシドを指すために使用される。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、置換ウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、アルコキシ、例えば、メトキシ）がプロトンの代わりに置かれるウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、置換シュードウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、アルキル、例えば、メチル）がプロトンの代わりに置かれるシュードウリジン、例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、置換ウリジン、シュードウリジン、または置換シュードウリジンのうちのいずれかである。
本明細書で使用される「ウリジン位置」は、ウリジンまたは修飾ウリジンによって占有されるポリヌクレオチド中の位置を指す。したがって、例えば、「ウリジン位置の１００％が修飾ウリジンである」ポリヌクレオチドは、同じ配列の従来のＲＮＡ（すべての塩基が標準的なＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧ塩基である）中のウリジンであり得るすべての位置に修飾ウリジンを含有する。別に指示されない限り、本開示中またはそれに付随する配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｂｌｅ）または配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）のポリヌクレオチド配列中のＵは、ウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。
本明細書で使用される場合、第２の配列に対する第１の配列のアラインメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧと１００％の同一性を有する配列を含むが、その理由は、アラインメントが、第２の配列の３つのすべての位置において一致があるという点で１００％の同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、および修飾ウリジン等のヌクレオシド類似体の存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジン等）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンのすべてについてのアデノシン；別の例は、シトシンおよび５－メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである配列５’－ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知である、Ｓｍｉｔｈ－ＷａｔｅｒｍａｎおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アラインメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズムおよびパラメータ設定の設定が適切であることを理解するであろう。一般的に類似する長さおよび予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
「ｍＲＮＡ」は、ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡであり、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソームおよびアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば２’－メトキシリボース残基を含む、リン酸糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸リン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。一般に、ｍＲＮＡは、実質的な量のチミジン残基（例えば、０個の残基または３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２個未満のチミジン残基；または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、もしくは０．１％未満のチミジン含有量）を含まない。ｍＲＮＡは、そのウリジン位置のいくつかまたはすべてに修飾ウリジンを含むことができる。
本明細書で使用される場合、所与のＯＲＦの「最小ウリジン含有量」は、（ａ）すべての位置で最小ウリジンコドンを使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦのウリジン含有量である。所与のアミノ酸についての最小ウリジンコドンは、最も少ないウリジンを有するコドンである（フェニルアラニンについてのコドンを除いて、通常、０または１であり、最小ウリジンコドンは２個のウリジンを有する）。修飾ウリジン残基は、最小ウリジン含有量を評価する目的でウリジンと同等とみなされる。
本明細書で使用される場合、所与のＯＲＦの「最小ウリジンジヌクレオチド含有量」は、（ａ）すべての位置で最小のウリジンコドン（上述の通り）を使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦの可能な最小ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含有量である。ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含有量は、ＯＲＦ中のＵＵジヌクレオチドの数え上げとして、またはウリジンジヌクレオチドのウリジンによって占められる位置の割合として、割合に基づいて、絶対的な用語で表現することができる（例えば、ＡＵＵＡＵは、５個の位置のうちの２個が、ウリジンジヌクレオチドのウリジンによって占められているため、ウリジンジヌクレオチド含有量は４０％である）。修飾ウリジン残基は、最小ウリジンジヌクレオチド含有量を評価する目的でウリジンと同等であるとみなされる。本明細書で使用される場合、所与のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の「最小アデニン含有量」は、（ａ）すべての位置で最小アデニンコドンを使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦのアデニン含有量である。所与のアミノ酸の最小アデニンコドンは、最も少ないアデニンを有するコドンである（リジンおよびアスパラギンについてのコドンを除いて、通常０または１であり、最小アデニンコドンは２個のアデニンを有する）。修飾アデニン残基は、最小アデニン含有量を評価する目的でアデニンと同等であるとみなされる。
本明細書で使用される場合、所与のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の「最小アデニンジヌクレオチド含有量」は、（ａ）すべての位置で最小のアデニンコドン（上述の通り）を使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦの可能な最小アデニンジヌクレオチド（ＡＡ）含有量である。アデニンジヌクレオチド（ＡＡ）含有量は、ＯＲＦ中のＡＡジヌクレオチドの数え上げとして、またはアデニンジヌクレオチドのアデニンによって占められる位置の割合として、割合に基づいて、絶対的な用語で表現することができる（例えば、ＵＡＡＵＡは、５個の位置のうちの２個が、アデニンジヌクレオチドのアデニンによって占められているため、アデニンジヌクレオチド含有量は４０％である）。修飾アデニン残基は、最小アデニンジヌクレオチド含有量を評価する目的でアデニンと同等であるとみなされる。
本明細書で使用される場合、「ＴＴＲ」は、ＴＴＲ遺伝子の遺伝子産物であるトランスサイレチンを指す。
本明細書で使用される場合、「アミロイド」は、通常可溶性であるタンパク質またはペプチドの異常な凝集体を指す。アミロイドは不溶性であり、アミロイドは、臓器や組織にタンパク質性沈着物を生成し得る。アミロイド中のタンパク質またはペプチドは、タンパク質の多くのコピーが一緒に粘着して原線維を形成することを可能にする形態へとミスフォールディングされ得る。いくつかの形態のアミロイドは、人体において正常な機能を有し得るが、本明細書で使用される「アミロイド」は、タンパク質の異常な凝集体または病的な凝集体を指す。アミロイドは、ＴＴＲなどの単一のタンパク質もしくはペプチドを含み得るか、またはＴＴＲおよび追加のタンパク質などの複数のタンパク質もしくはペプチドを含み得る。
本明細書で使用される場合、「アミロイド原線維」は、分解に耐性であるアミロイドの不溶性繊維を指す。アミロイド原線維は、特定のタンパク質またはペプチド、ならびにそれが凝集した組織および細胞型に基づいて症状を生じ得る。
本明細書で使用される場合、「アミロイドーシス」は、アミロイドまたはアミロイド原線維の沈着によって引き起こされる症状を特徴とする疾患を指す。アミロイドーシスは、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、神経系、および消化管を含む多くの臓器に影響を与える可能性がある。
本明細書で使用される場合、「ＡＴＴＲ」、「ＴＴＲ関連アミロイドーシス」、「ＴＴＲアミロイドーシス」、「ＡＴＴＲアミロイドーシス」、または「ＴＴＲに関連するアミロイドーシス」は、ＴＴＲの沈着に関連するアミロイドーシスを指す。
本明細書で使用される場合、「家族性アミロイド心筋症」または「ＦＡＣ」は、主に拘束型心筋症を特徴とする遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を指す。ＦＡＣでは、うっ血性心不全が一般的である。平均発症年齢は、およそ６０～７０歳であり、診断後の推定寿命は４～５年である。
本明細書で使用される場合、「家族性アミロイドポリニューロパチー」または「ＦＡＰ」は、主に感覚運動ニューロパチーを特徴とする遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を指す。ＦＡＰでは、自律神経ニューロパチーが一般的である。ニューロパチーが主要な特徴であるが、ＦＡＰの症状には、悪液質、腎不全、および心臓病も含まれ得る。ＦＡＰの平均発症年齢は、およそ３０～５０歳であり、診断後の推定寿命は５～１５年である。
本明細書で使用される場合、「野生型ＡＴＴＲ」および「ＡＴＴＲｗｔ」は、Ｔ６０Ａ、Ｖ３０Ｍ、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ１２２Ａ、またはＶ１２２（－）などの病的なＴＴＲ変異に関連しないＡＴＴＲを指す。ＡＴＴＲｗｔは、老人性全身性アミロイドーシスとも呼ばれてきた。発症は、典型的には６０歳以上の男性で発生し、最も一般的な症状は、うっ血性心不全および心房細動などの異常な心拍である。さらなる症状には、息切れ、疲労、めまい、腫脹（特に脚）、吐き気、狭心症、睡眠障害、および体重減少などの心機能不良の結果が含まれる。手根管症候群の既往は、ＡＴＴＲｗｔのリスクの増加を示し、いくつかの場合では、早期疾患を示す可能性がある。ＡＴＴＲｗｔは、一般に、時間の経過とともに心機能の低下を引き起こすが、野生型ＴＴＲ沈着物はよりゆっくりと蓄積するため、遺伝性ＡＴＴＲよりも良好な予後を有する可能性がある。既存の治療は、他の形態のＡＴＴＲ（肝臓移植を除く）と類似しており、一般に、利尿薬および液体および塩分摂取の制限から抗凝固剤、および重症例では心臓移植に至るまで、心臓機能のサポートまたは改善を目的としている。それにもかかわらず、ＦＡＣと同様に、ＡＴＴＲｗｔは、診断から３～５年以内に心不全により死亡することがある。
本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物および方法に有用なガイド配列を、表１および本出願全体に示す。
本明細書で使用される場合、「遺伝性ＡＴＴＲ」は、ＴＴＲ遺伝子の配列における変異と関連するＡＴＴＲを指す。ＡＴＴＲに関連するＴＴＲ遺伝子中の既知の変異には、Ｔ６０Ａ、Ｖ３０Ｍ、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ１２２Ａ、またはＶ１２２（－）の置換を有するＴＴＲを生じる変異が含まれる。
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかである多数のヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはその両方）の発現の低減を指す。タンパク質のノックダウンは、（例えば、血清または細胞培地において）組織または細胞集合体によって分泌されるタンパク質を検出することによって、または目的の組織または細胞集合体からタンパク質の全細胞量を検出することのいずれかによって、測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は既知であり、目的の組織または細胞集合体から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングを含む。いくつかの実施形態において、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現のある程度の喪失、例えば、転写されるｍＲＮＡの量の低減、または細胞集合体（組織にみられるものなどのインビボ集合体を含む）によって発現または分泌されるタンパク質の量の低減を指し得る。
本明細書で使用される場合、「変異体ＴＴＲ」は、ＴＴＲの野生型アミノ酸配列と比較して、ＴＴＲのアミノ酸配列に変化を有するＴＴＲ（すなわち、ＴＴＲタンパク質）の遺伝子産物を指す。ヒト野生型ＴＴＲ配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７２７６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１８２７１で利用可能である。例えばヒトにおけるＡＴＴＲに関連するＴＴＲの変異体形態としては、Ｔ６０Ａ、Ｖ３０Ｍ、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ１２２Ａ、またはＶ１２２（－）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）とともに含むガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へとガイドし、ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列に結合し、その場合、この薬剤はクリバーゼまたはニッカーゼであり、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニックを形成するか、または切断するように指向される。
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患または障害のための投与または治療の任意の適用を指し、その疾患を阻害すること、その進行を止めること、その疾患の１つ以上の症状を緩和すること、その疾患を治癒させること、またはその疾患の１つ以上の症状の再発を予防することを含む。例えば、ＡＴＴＲの治療は、ＡＴＴＲの症状を緩和することを含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、「病的な変異」という用語は、ＴＴＲなどの遺伝子産物が、ＡＴＴＲなどの疾患の発症を引き起こす、促進する、寄与する、または阻害することができない可能性が高い変異を指す。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰ）という用語は、分子間力によって互いに物理的に会合する複数の（すなわち、１つより多い）脂質分子を含む粒子を指す。ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（単層および多層の小胞、例えば、いくつかの実施形態において、実質的に球形であり、より特定の実施形態において、水性コアを含み得る「リポソーム」ラメラ相脂質二重層を含み、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であってよい。例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７１７３０５４Ａ１およびＷＯ２０１９０６７９９２Ａ１も参照されたい。対象にヌクレオチドを送達することが可能な当業者に公知の任意のＬＮＰを、ガイドＲＮＡと、本明細書に記載のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸とともに利用され得る。
本明細書で使用される場合、「ドナーオリゴヌクレオチド」または「ドナーテンプレート」という用語は、標的部位（例えば、ゲノムＤＮＡの標的部位）に挿入される所望の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＬＮＰまたはトランスフェクションの使用を介して、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸配列とともに送達されてもよい。
本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」（ＮＬＳ）または「核局在化配列」という用語は、そのような配列を含むか、またはそのような配列に連結された分子の、真核細胞の核への輸送を誘導するアミノ酸配列を指す。核局在化シグナルは、輸送される分子の一部を形成し得る。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、共有結合、水素結合、またはイオン相互作用によって分子の残りの部分に連結され得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という語句は、一般的に無毒であり、生物学的に望ましくないものではなく、薬学的使用のために他の方法では許容されるものではない、薬学的組成物を調製するのに有用であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「注入」は、例えば、およそ３０分間～１２時間の注入時間での１つ以上の薬剤の能動的投与を指す。いくつかの実施形態において、１つ以上の薬剤は、例えば、本明細書に記載のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えばＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡと、本明細書に記載のｇＲＮＡとを含むＬＮＰを含む。
本明細書で使用される場合、「注入予防」は、静脈内コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン１０ｍｇまたは等価物）、解熱剤（例えば、経口アセトアミノフェンまたはパラセタモール５００ｍｇ）、静脈内Ｈ１遮断薬（例えば、ジフェンヒドラミン５０ｍｇまたは等価物）、および静脈内Ｈ２遮断薬（例えば、ラニチジン５０ｍｇまたは等価物）のうちの１つ以上またはすべてを含む、治療（例えば、ＬＮＰの投与を含む）前に対象に投与されるレジメンを指す。注入予防は、任意選択で、経口コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン８ｍｇまたは等価物）の事前投与と組み合わせられる。いくつかの実施形態において、経口コルチコステロイドは、治療の８～２４時間前に投与される。いくつかの実施形態において、静脈内コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン１０ｍｇまたは等価物）、経口アセトアミノフェン５００ｍｇ、静脈内Ｈ１遮断薬（例えば、ジフェンヒドラミン５０ｍｇまたは等価物）、静脈内Ｈ２遮断薬（例えば、ラニチジン５０ｍｇまたは等価物）のうちの１つ以上またはすべてが、治療の１～２時間前に投与される。いくつかの実施形態において、Ｈ１遮断薬および／またはＨ２遮断薬は、経口投与される。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。
ＩＩ．ＴＴＲ遺伝子を標的とする方法および組成物
本明細書では、対象においてＴＴＲ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、細胞もしくは対象においてＴＴＲ遺伝子を修飾し、対象においてＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療し、対象においてＴＴＲ血清濃度を低減し、かつ／または対象においてアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防するための方法、ならびにこのような方法で使用するための組成物を含む、関連する組成物が開示される。一般に、開示される組成物は、ＴＴＲを標的とするガイドＲＮＡと、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸とを含む。このような方法および組成物で治療される対象は、野生型もしくは非野生型のＴＴＲ遺伝子配列を有していてもよく、例えば、ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｗｔ、またはＡＴＴＲの遺伝性もしくは家族性の形態であってもよい）を有する対象であってもよい。
いくつかの実施形態において、組成物は、３０分間より長い注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、３０分間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、６０分間より長い注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、９０分間より長い注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、１２０分間より長い、１５０分間より長い、１８０分間より長い、２４０分間より長い、３００分間より長い、または３６０分間より長い注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、または少なくとも１２時間、注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、０．５～１．５時間、１．５～２．５時間、２．５～３．５時間、３．５～４．５時間、４．５～５．５時間、５．５～６．５時間、６．５～７．５時間、７．５～８．５時間、８．５～９．５時間、９．５～１０．５時間、１０．５～１１．５時間、または１１．５～１２．５時間、注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、約６０分間、約９０分間、約１２０分間、約１５０分間、約１８０分間、約２４０分間、約３００分間、または約３６０分間、注入によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、約４５～７５分間、７５～１０５分間、１０５～１３５分間、１３５～１６５分間、１６５～１９５分間、１９５～２２５分間、２２５～２５５分間、２５５～２８５分間、２８５～３１５分間、３１５～３４５分間、または３４５～３７５分間、注入により投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、約１．５～６時間、注入によって投与される。
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
開示される方法および組成物で使用されるガイドＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子を標的とするガイド配列を含む。ＴＴＲ遺伝子を標的とする例示的なガイド配列を、表１に配列番号５～８２で示す。
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上述のガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１２６）。ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１２５）。
いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、修飾されている。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号３で以下に示される修飾パターンを含み、ここで、Ｎが、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、Ｎの全体が、本明細書に記載されるようなガイド配列を含み、修飾ｓｇＲＮＡが、以下の配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３）を含み、「Ｎ」が、任意の天然または非天然のヌクレオチドであってもよい。例えば、本明細書に包含されるのは、配列番号３であり、ここで、Ｎは、本明細書に開示されるガイド配列のいずれかに置き換えられる。修飾は、ガイドのヌクレオチドについてのＮ置換にかかわらず、配列番号３に示されるままである。すなわち、ガイドのヌクレオチドは「Ｎ」を置き換えるが、最初の３個のヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され、第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間、第２のヌクレオチドと第３のヌクレオチドとの間、および第３のヌクレオチドと第４のヌクレオチドとの間にホスホロチオエート結合が存在する。
いくつかの実施形態において、表２に列挙される配列のうちのいずれか１つが包含される。
Figure 2022525428000010
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Figure 2022525428000012
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Figure 2022525428000019
対応するｓｇＲＮＡ ＩＤを有するガイドＩＤのアラインメントマッピング、ならびにカニクイザルゲノムに対する相同性およびカニクイザル適合ガイドＩＤを表３に提供する。
Figure 2022525428000020
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Figure 2022525428000023
Figure 2022525428000024
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）であってもよいＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を、ＴＴＲ中の標的ＤＮＡ配列に指向させるガイド配列を含む。ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列に対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各々の組成物および方法の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、シングルＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合していてもよく、または別個のＲＮＡ上にあってもよい（ｄｇＲＮＡ）。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
本明細書に記載される各々の組成物、使用および方法の実施形態において、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子と、を含む。第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子は共有結合していなくてもよいが、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によってＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。
本明細書に記載される各々の組成物、使用および方法の実施形態において、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」としてシングルＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合した表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列のも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合される。
いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のｔｒＲＮＡ配列のすべてまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、先端切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存する。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００個より多いヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、例えば１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などの特定の二次構造を含み得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５～８２から選択されるガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５～８２から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列は、配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、２９、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６１、６３、６５、６６、６８、または６９である。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列は、配列番号５、６、９、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６３、６５、６６、６８、または６９である。特に、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含むガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり得る。配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含むガイドＲＮＡは、化学修飾ｓｇＲＮＡ、例えば、末端修飾ＲＮＡであり得る。配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含むガイドＲＮＡは、ｄｇＲＮＡ、例えば、化学修飾ｄｇＲＮＡであり得る。
他の実施形態において、組成物は、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか２つ以上から選択されるガイド配列を含む少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５～８２の核酸のうちのいずれかに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を各々含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
他の実施形態において、組成物は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列のうちのいずれか２つ以上から選択されるガイド配列を含む少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を各々含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列は、配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、２９、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６１、６３、６５、６６、６８、または６９から選択される１つの配列、または２つの配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列は、配列番号５、６、９、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６３、６５、６６、６８、または６９から選択される１つの配列、または２つの配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表２に示される配列（配列番号８７～１２４）のいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、表２に示される配列（配列番号８７～１２４）のいずれか１つを含むが、示される修飾を含まない（すなわち、非修飾配列番号８７～１２４）ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号８７～１２４の核酸のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号８７～１２４の核酸のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるが、示される修飾を含まない（すなわち、非修飾配列番号８７～１２４）配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、修飾の有無にかかわらず、配列番号８７～１２４で表２のｓｇＲＮＡ配列に示されるガイド配列の代わりに、表１に示されるガイド配列のいずれか１つを含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４のいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４のいずれか１つを含むが、表２に示される修飾を含まない（すなわち、非修飾配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４）ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４のうちのいずれか１つを含むが、少なくとも１つの化学修飾を有し、表２に示される修飾パターンを含まない（すなわち、化学修飾された配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４）ｓｇＲＮＡである。化学修飾されたガイドＲＮＡは、表２に示されるような修飾のうちの１つ以上を含んでもよい。いくつかの実施形態において、表２に示される修飾パターンを含まない化学修飾された配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４は、５’および／または３’末端修飾を含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４の核酸のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４の核酸のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるが、示されるような修飾を含まない（すなわち、非修飾配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４）配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、修飾の有無にかかわらず、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、または１２２～１２４における表２のｓｇＲＮＡ配列に示されるガイド配列の代わりに、表１に示されるガイド配列のうちのいずれか１つを含む。
本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子内の標的配列を認識する（例えば、それにハイブリダイズする）ために有用であり得る。例えば、ＴＴＲ標的配列は、ガイドＲＮＡを含む提供されるＣａｓクリバーゼによって認識され、切断され得る。したがって、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリバーゼは、ガイドＲＮＡをＴＴＲ遺伝子の標的配列に対して指向させてもよく、ガイドＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリバーゼは、標的配列を切断する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＴＴＲ遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、遺伝子の特定の領域における変異（例えば、ヌクレアーゼ媒介性ＤＳＢの結果として生じるインデルに起因するフレームシフト変異）は、遺伝子の他の領域における変異よりも許容性が低くてもよく、したがって、ＤＳＢの位置は、もたらされ得るタンパク質ノックダウンの量または種類における重要な因子である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＴＴＲ遺伝子内の特定の位置に指向させるために使用される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＴＴＲのエクソン１、エクソン２、エクソン３、またはエクソン４内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するガイド配列を有するように設計されている。
Ｂ．ｇＲＮＡの修飾
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、化学修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然および／または天然に存在する成分または構造の存在を記載するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、および／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖および／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。上に列挙されるものなどの化学修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシドおよびヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、すべての塩基がホスホロチオエート基などの修飾リン酸基を有する。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のすべて、または実質的にすべてがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、１、２、３、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡ内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）が、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中にみられるものによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清に由来するヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボとエクスビボの両方において細胞集合体に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン（特にインターフェロン）発現および放出の誘導および細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含む。
骨格修飾のいくつかの実施形態において、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態において、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルを含む。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによってもまた修飾できる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。
リン酸基は、ある骨格修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、帯電したリン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例は、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スフホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）を含み得る。
リン酸リンカーとリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられている核酸を模倣できるスキャフォールドもまた構築できる。そのような修飾は、骨格および糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例は、非限定的に、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物を含み得る。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖に対する１つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されていてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’－アルコキシドイオンを形成するようにさらに脱プロトン化されることがもはや起こり得ないので、核酸の安定性を増強し得る。
２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中「Ｒ」がアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲであって式中Ｒが、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎが０～２０の整数であり得るもの（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、および４～２０）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基をフッ素で置き換える２’－フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレン架橋を介して同一のリボース糖の４’炭素へと接続し得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、Ｏ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠失している「アンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は，メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を含み得る。
「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（ここでアミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここでＲは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含み得、任意選択で、例えば本明細書において記載されるようなアミノによって置換されていてもよい。
糖修飾は、１つ以上の炭素を含み、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えばＬ－ヌクレオシドを含み得る。
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書において記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことのできる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、および塩基の合成誘導体を含み得る。
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態において、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基は、化学修飾されていてもよく、またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾されていてもよい。特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ分子の一本鎖突出におけるヌクレオチドの１つ以上またはそのすべては、デオキシヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、２０１６年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ」という発明の名称のＵＳ６２／４３１，７５６に開示された修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上の修飾を含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅによって修飾されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’－Ｏ－メチルの修飾は、以下のように描写され得る。
Figure 2022525428000025
ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
本出願において、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’－Ｆで置換されたヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’－Ｆの置換は、以下のように描写され得る。
Figure 2022525428000026
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合とは、ホスホジエステル連結、例えばヌクレオチド塩基間の結合での１個の非架橋リン酸酸素を硫黄が置換する結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ－オリゴとも称され得る。
ＰＳ修飾を示すために、「＊」を使用し得る。本出願では、用語Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊を使用して、ＰＳ結合で隣りの（例えば３’）ヌクレオチドに結合されているヌクレオチドを示すことができる。
本出願では、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」を使用して、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
以下の図は、非架橋リン酸酸素へのＳ－の置換を示し、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる。
Figure 2022525428000027
脱塩基ヌクレオチドは、窒素系塩基を欠いているものを指す。以下の図は、塩基を欠く脱塩基（脱プリンとしても知られる）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する。
Figure 2022525428000028
反転した塩基は、通常の５’から３’への連結とは反転した連結を有するものを指す（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）。例えば、
Figure 2022525428000029
脱塩基ヌクレオチドは、反転した連結と接続することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’結合を介して末端５’ヌクレオチドに結合してもよいし、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合してもよい。末端５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。
いくつかの実施形態において、５’末端部における最初の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上、および３’末端部における最後の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、反転した脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性および／または性能を増加させることが当該技術分野において周知の他のヌクレオチド修飾である。
いくつかの実施形態において、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を用いて連結される。
いくつかの実施形態において、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号３に示される修飾パターンを含み、Ｎが、任意の天然もしくは非天然のヌクレオチドであり、Ｎの全体が、標的配列にヌクレアーゼを指向させるガイド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号８７～１２４のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つと、配列番号１２５のヌクレオチドと、を含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号１２５のヌクレオチドが、ガイド配列の３’末端にあり、ガイド配列は、配列番号３に示されるように修飾され得る。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列と、配列番号１２５のヌクレオチドと、を含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号１２５のヌクレオチドが、ガイド配列の３’末端にあり、ガイド配列は、配列番号３に示されるように修飾され得る。
Ｃ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸
本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）をコードするＯＲＦを含む核酸を、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれかを用いる組成物または方法に組み合わせてもよい。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、ｍＲＮＡであり得る。
１．低アデニン含有量のＯＲＦ
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の約１５０％の範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのアデニン含有量は、その最小アデニン含有量の約１４５％以下、１４０％以下、１３５％以下、１３０％以下、１２５％以下、１２０％以下、１１５％以下、１１０％以下、１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、または１０１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量に等しい。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１５０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１４５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１４０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１３５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１３０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１２５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１２０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１１５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１１０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１０５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１０４％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１０３％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１０２％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量の約１０１％以下である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の２００％の範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのアデニンジヌクレオチド含有量は、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１９５％以下、１９０％以下、１８５％以下、１８０％以下、１７５％以下、１７０％以下、１６５％以下、１６０％以下、１５５％以下、１５０％以下、１４５％以下、１４０％以下、１３５％以下、１３０％以下、１２５％以下、１２０％以下、１１５％以下、１１０％以下、１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、または１０１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量に等しい。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約２００％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１９５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１９０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１８５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１８０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１７５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１７０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１６５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１６０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１５５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量に等しい。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１５０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１４５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１４０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１３５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１３０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１２５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１２０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１１５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１１０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０４％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０３％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０２％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０１％以下である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニンジヌクレオチド含有量の９０％以下であるアデニンジヌクレオチド含有量までの範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのアデニンジヌクレオチド含有量は、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニンジヌクレオチド含有量の約８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が、０個のアデニントリヌクレオチドから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０個のアデニントリヌクレオチドまでの範囲である（さらに長い数のアデニンは、その中の固有の３個のアデニンセグメントの数として計数する、例えば、アデニンテトラヌクレオチドは、２個のアデニントリヌクレオチドを含有し、アデニンペンタヌクレオチドは、３個のアデニントリヌクレオチドを含有するなど）。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が、０％のアデニントリヌクレオチドから、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、または２％のアデニントリヌクレオチドまでの範囲であり、アデニントリヌクレオチドの含有パーセントは、アデニントリヌクレオチド（またはさらに長い数のアデニン）の一部を形成するアデニンによって占められる配列中の位置のパーセントとして計算され、その結果、配列ＵＵＵＡＡＡおよびＵＵＵＵＡＡＡＡは、各々、アデニントリヌクレオチド含有量が５０％である。例えば、いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が２％以下である。例えば、いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が１．５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．９％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．８％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．７％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．６％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．４％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．３％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．２％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が０．１％以下である。いくつかの実施形態において、アデニントリヌクレオチドを含まないＯＲＦを含むＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が提供される。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、アデニントリヌクレオチド含有量が、その最小アデニントリヌクレオチド含有量から、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニントリヌクレオチド含有量の９０％以下であるアデニントリヌクレオチド含有量までの範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのアデニントリヌクレオチド含有量は、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニントリヌクレオチド含有量の約８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である。
例えば、ＯＲＦの十分な画分において最小アデニンコドンを使用することによって、所与のＯＲＦは、アデニン含有量またはアデニンジヌクレオチド含有量またはアデニントリヌクレオチド含有量を低減することができる。例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンに変換することによってＯＲＦ配列に逆翻訳することができ、ＯＲＦの一部またはすべては、以下に示される例示的な最小アデニンコドンを使用する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％が、表４に列挙されるコドンである。
Figure 2022525428000030
いくつかの実施形態において、コドンの少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％が表４に列挙されるコドンであるコドンのセットからなるＯＲＦを含む、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、最小ヌクレオチドホモポリマー、例えば、同じヌクレオチドの反復ストリングを有する。例えば、いくつかの実施形態において、表４に列挙されるコドンから最小ウリジンコドンを選択するとき、核酸は、ヌクレオチドホモポリマーの数および長さを減少させる最小アデニンコドンを選択すること、例えば、アラニンについてＧＣＣの代わりにＧＣＧを選択すること、またはグリシンについてＧＧＧの代わりにＧＧＣを選択することによって構築される。
前述の実施形態のいずれにおいても、核酸は、ｍＲＮＡであり得る。
２．翻訳を増加させ、および／または高発現ｔＲＮＡに対応するコドン、例示的なコドンセット
いくつかの実施形態において、核酸は、ヒトなどの哺乳動物における翻訳を増加させるコドンを有するＯＲＦを含む。さらなる実施形態において、核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト）の臓器（例えば肝臓）における翻訳を増加させるコドンを有するＯＲＦを含む。さらなる実施形態において、核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞型（例えば肝細胞）における翻訳を増加させるコドンを有するＯＲＦを含む。哺乳動物、細胞型、哺乳動物の臓器、ヒト、ヒトの臓器などにおける翻訳の増加は、ＯＲＦの野生型配列の翻訳の程度と比較して、またはＯＲＦの由来となる生物もしくはアミノ酸レベルで最も良く似たＯＲＦを含有する生物（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、または原核生物に由来するＣａｓヌクレアーゼであり得る場合には、別の原核生物、例えば、他の以下に記載の原核生物由来のＣａｓヌクレアーゼ）のコドン分布と一致するコドン分布を有するＯＲＦと比較して、決定することができる。あるいは、いくつかの実施形態において、哺乳動物、細胞型、哺乳動物の臓器、ヒト、ヒトの臓器などにおけるＣａｓ９配列の翻訳の増加は、任意の適用可能な点変異、異種ドメインなどを含む、他がすべて等しい配列番号２０５の配列を有するＯＲＦの翻訳と比較して決定される。ヒト肝臓およびヒト肝細胞を含むヒトにおける発現を増加させるのに有用なコドンは、ヒト肝臓／肝細胞における高発現ｔＲＮＡに対応するコドンであってもよく、これらはＤｉｔｔｍａｒ ＫＡ，ＰＬｏｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（１２）：ｅ２２１（２００６）に記載されている。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、ヒトなどの哺乳動物における高発現ｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸についての最高発現ｔＲＮＡ）に対応するコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、ヒト臓器などの哺乳動物臓器における高発現ｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸についての最高発現ｔＲＮＡ）に対応するコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、ヒト肝臓などの哺乳動物肝臓における高発現ｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸についての最高発現ｔＲＮＡ）に対応するコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、ヒト肝細胞などの哺乳動物肝細胞における高発現ｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸についての最高発現ｔＲＮＡ）に対応するコドンである。
あるいは、生物（例えば、ヒト）における高発現ｔＲＮＡに対応するコドンを一般に使用してもよい。
コドン選択に対する前述のアプローチのうちのいずれかは、例えば、表４のコドンから開始し、次いで、１つより多い選択肢が利用可能な場合、一般に生物（例えば、ヒト）において、または目的の臓器または細胞型、例えば、肝臓または肝細胞（例えば、ヒトの肝臓またはヒトの肝細胞）のいずれかにおいて、より高発現のｔＲＮＡに対応するコドンを使用することによって、上に示される最小アデニンコドンと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示されるコドンセット（例えば、低Ｕ、低Ａ、または低Ａ／Ｕコドンセット）由来のコドンである。低Ａおよび低Ａ／Ｕセット中のコドンは、１つより多い選択肢が利用可能な場合、より高発現のｔＲＮＡに対応するコドンも使用しつつ、示されるヌクレオチドを最小限にするコドンを使用する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示される低Ｕコドンセット由来のコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示される低Ａコドンセット由来のコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示される低Ａ／Ｕコドンセット由来のコドンである。
Figure 2022525428000031
３．例示的な配列
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦは、配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいはＯＲＦは、少なくともその最初の５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有するか、または少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいはＯＲＦは、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４もしくは５に列挙されるコドンであるコドンのセットからなり、かつ／あるいはＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１２３％までの範囲であり、かつ／あるいはＯＲＦは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％までの範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦは、配列番号３７７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦは、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、配列番号２０３、２１３、２６８、もしくは３８６～３９６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＯＲＦは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１５０％までの範囲であり、かつ／あるいはアデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％までの範囲である。いくつかの実施形態において、コードされたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、配列番号２０３、２１３、２６８、もしくは３８６～３９６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量～その最小ウリジン含有量の１５０％までの範囲であり、かつ／あるいはウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量～その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の１５０％までの範囲である。いくつかのこのような実施形態において、アデニンおよびウリジンヌクレオチド含有量の両方は、それぞれの最小値の１５０％以下である。いくつかの実施形態において、アデニンおよびウリジンジヌクレオチド含有量の両方は、それぞれの最小値の１５０％以下である。いくつかの実施形態において、前述の同一性レベルのいずれかは、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦは、少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する。その最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドは、開始コドンの最初のヌクレオチド（典型的には、ＡＴＧ）から測定され、その結果、Ａがヌクレオチド１であり、Ｔがヌクレオチド２である、などである。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレームは、その配列の少なくともその最初の１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％にわたって配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する。ＯＲＦの配列の長さは、開始コドンの始まりから終止コドンの最後までのヌクレオチドの数であり、その配列の最初の１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、全配列の長さの所定のパーセンテージを構成する開始コドンの最初のヌクレオチドから始まるヌクレオチドの数に対応する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２４３と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２４３のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２４４と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２４４のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２５６と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２５６のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２５７と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２５７のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２５８と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２５８のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２５９と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２５９のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２６０と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２６０のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号２６１と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２６１のＯＲＦ（すなわち、配列番号２０４）が、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３７６と少なくとも９０％の同一性を有し、任意選択で、配列番号３７６のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つの代替ＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３７７と少なくとも９０％の同一性を有し、任意選択で、配列番号３７７のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つの代替ＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３７８と少なくとも９０％の同一性を有し、任意選択で、配列番号３７８のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つの代替ＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３７９と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３７９のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３８０と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３８０のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３８１と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３８１のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３８２と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３８２のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３８３と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３８３のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３８４と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３８４のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、配列番号３８５と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号３８５のＯＲＦが、配列番号３１１～３１３、３２８、３２９、３４６～３４８、３５５、３５６、３６３、または３６４のうちのいずれか１つのＯＲＦと置換されている、配列を含む。
いくつかの実施形態において、配列番号２４３、２４４、２５６～２６１、または３７６～３８５の任意選択で置換された配列との同一性の程度は、少なくとも９５％である。いくつかの実施形態において、配列番号２４３、２４４、２５６～２６１、または３７６～３８５の任意選択で置換された配列との同一性の程度は、少なくとも９８％である。いくつかの実施形態において、配列番号２４３、２４４、２５６～２６１、または１７６～３８５の任意選択で置換された配列との同一性の程度は、少なくとも９９％である。いくつかの実施形態において、配列番号２４３、２４４、２５６～２６１、または３７６～３８５の任意選択で置換された配列との同一性の程度は、１００％である。
４．核酸、ｍＲＮＡ、およびＯＲＦの追加の特徴
本明細書に記載の追加の特徴のいずれも、実現可能な範囲で、上述の実施形態のいずれかと組み合わされ得る。
ａ）低ウリジン含有量
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）をコードするＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量～その最小ウリジン含有量の約１５０％の範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのウリジン含有量は、その最小ウリジン含有量の約１４５％以下、１４０％以下、１３５％以下、１３０％以下、１２５％以下、１２０％以下、１１５％以下、１１０％以下、１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、または１０１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量に等しい。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１５０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１４５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１４０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１３５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１３０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１２５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１２０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１１５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１１０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１０５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１０４％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１０３％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１０２％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量の約１０１％以下である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量～その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の２００％の範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのウリジンジヌクレオチド含有量は、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１９５％以下、１９０％以下、１８５％以下、１８０％以下、１７５％以下、１７０％以下、１６５％以下、１６０％以下、１５５％以下、１５０％以下、１４５％以下、１４０％以下、１３５％以下、１３０％以下、１２５％以下、１２０％以下、１１５％以下、１１０％以下、１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、または１０１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量に等しい。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約２００％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１９５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１９０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１８５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１８０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１７５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１７０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１６５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１６０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１５５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量に等しい。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１５０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１４５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１４０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１３５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１３０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１２５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１２０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１１５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１１０％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１０５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１０４％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１０３％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１０２％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約１０１％以下である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含有量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジンジヌクレオチド含有量の９０％以下であるウリジンジヌクレオチド含有量までの範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのウリジンジヌクレオチド含有量は、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジンジヌクレオチド含有量の約８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０個のウリジントリヌクレオチドから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０個のウリジントリヌクレオチドまでの範囲である（さらに長い数のウリジンは、その中の固有の３個のウリジンセグメントの数として計数する、例えば、ウリジンテトラヌクレオチドは、２個のウリジントリヌクレオチドを含有し、ウリジンペンタヌクレオチドは、３個のウリジントリヌクレオチドを含有するなど）。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０％のウリジントリヌクレオチドから、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、または２％のウリジントリヌクレオチドまでの範囲であり、ウリジントリヌクレオチドの含有パーセントは、ウリジントリヌクレオチド（またはさらに長い数のウリジン）の一部を形成するウリジンによって占められる配列中の位置のパーセントとして計算され、その結果、配列ＵＵＵＡＡＡおよびＵＵＵＵＡＡＡＡは、各々のウリジントリヌクレオチド含有量が５０％である。例えば、いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、２％以下である。例えば、いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、１．５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．９％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．８％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．７％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．６％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．５％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．４％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．３％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．２％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、０．１％以下である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチドを有さない。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、ウリジントリヌクレオチド含有量が、その最小ウリジントリヌクレオチド含有量から、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジントリヌクレオチド含有量の９０％以下であるウリジントリヌクレオチド含有量までの範囲である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのウリジントリヌクレオチド含有量は、問題となるｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジントリヌクレオチド含有量の約８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である。
例えば、ＯＲＦの十分な画分において最小ウリジンコドンを使用することによって、所与のＯＲＦは、ウリジン含有量またはウリジンジヌクレオチド含有量またはウリジントリヌクレオチド含有量を低減することができる。例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンに変換することによってＯＲＦ配列に逆翻訳することができ、ＯＲＦの一部またはすべては、以下に示される例示的な最小ウリジンコドンを使用する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％が、表６に列挙されるコドンである。
Figure 2022525428000032
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、コドンの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、表６に列挙されるコドンである、コドンのセットからなる。
ｂ）低アデニンおよびウリジン含有量
実行可能な範囲で、低アデニン含有量に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、低ウリジン含有量に関して本明細書に記載される特徴のいずれかと組み合わせることができる。例えば、ウリジン含有量が、その最小ウリジン含有量～その最小ウリジン含有量の約１５０％の範囲であり（例えば、ＯＲＦのウリジン含有量は、その最小ウリジン含有量の約１４５％以下、１４０％以下、１３５％以下、１３０％以下、１２５％以下、１２０％以下、１１５％以下、１１０％以下、１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、または１０１％以下であり）、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の約１５０％の範囲である（例えば、その最小アデニン含有量の約１４５％以下、１４０％以下、１３５％以下、１３０％以下、１２５％以下、１２０％以下、１１５％以下、１１０％以下、１０５％以下、１０４％以下、１０３％以下、１０２％以下、または１０１％以下である）ＯＲＦを含む、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が提供され得る。ウリジンおよびアデニンジヌクレオチドについても同様である。同様に、ＯＲＦ中のウリジンヌクレオチドおよびアデニンジヌクレオチドの含有量は、上に記載した通りであってもよい。同様に、ＯＲＦ中のウリジンジヌクレオチドおよびアデニンヌクレオチドの含有量は、上に記載した通りであってもよい。
例えば、ＯＲＦの十分な画分において最小ウリジンおよびアデニンコドンを使用することによって、所与のＯＲＦは、ウリジンおよびアデニンヌクレオチドおよび／またはジヌクレオチド含有量を低減することができる。例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンに変換することによってＯＲＦ配列に逆翻訳することができ、ＯＲＦの一部またはすべては、以下に示される例示的な最小ウリジンおよびアデニンコドンを使用する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％が、表７に列挙されるコドンである。
Figure 2022525428000033
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、コドンの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が、表７に列挙されるコドンである、コドンのセットからなる。表７からわかるだろうが、列挙されている３つのセリンコドンの各々は、１個のＡまたは１個のＵのいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ウリジン最小化は、セリンについてＡＧＣコドンを使用することによって優先される。いくつかの実施形態において、アデニン最小化は、セリンに対してＵＣＣおよび／またはＵＣＧコドンを使用することによって優先される。
ｃ）コードされたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリバーゼ活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型のＣａｓヌクレアーゼであってもよい）を含む。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、および他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照のこと）、ならびにそれらの修飾（例えば、操作型または変異体）態様が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８（Ａ１）、ＵＳ２０１６／０３１２１９９（Ａ１）を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、またはＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはそのＣｍｒ２サブユニット、およびＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系に由来していてもよい。様々なＣＲＩＳＰＲ系およびＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓクリバーゼ、例えば、Ｃａｓ９クリバーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、クリバーゼである。
Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、およびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは、ＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、１個より多いＲｕｖＣドメインおよび／または１個より多いＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導することができる。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡを切断してもよく、ｄｓＤＮＡの１つの鎖を切断してもよく、またはＤＮＡクリバーゼまたはニッカーゼ活性を有していなくてもよい。例示的なＣａｓ９アミノ酸配列は、配列番号２０３として提供される。開始および終止コドンを含む例示的なＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＯＲＦ配列は、配列番号３１１として提供される。融合タンパク質に含めるのに好適な例示的なＣａｓ９ ｍＲＮＡコード配列は、配列番号３４６として提供される。
いくつかの実施形態において、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
ｄ）異種機能ドメイン、核局在化シグナル
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で連結され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、少なくとも１個のＮＬＳに対してＣ末端に融合され得る。ＮＬＳを、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個より多いＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部で連結された２個のＳＶ４０ ＮＬＳの配列に融合される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合していてもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結している。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳなしで融合され得る。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、単節型配列、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７８）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２９０）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２９１）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＮＬＳ配列は、ＬＡＡＫＲＳＲＴＴ（配列番号２７９）、ＱＡＡＫＲＳＲＴＴ（配列番号２８０）、ＰＡＰＡＫＲＥＲＴＴ（配列番号２８１）、ＱＡＡＫＲＰＲＴＴ（配列番号２８２）、ＲＡＡＫＲＰＲＴＴ（配列番号２８３）、ＡＡＡＫＲＳＷＳＭＡＡ（配列番号２８４）、ＡＡＡＫＲＶＷＳＭＡＦ（配列番号２８５）、ＡＡＡＫＲＳＷＳＭＡＦ（配列番号２８６）、ＡＡＡＫＲＫＹＦＡＡ（配列番号２８７）、ＲＡＡＫＲＫＡＦＡＡ（配列番号２８８）、またはＲＡＡＫＲＫＹＦＡＶ（配列番号２８９）を含み得る。特定の実施形態において、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７８）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意選択で、融合部位に含まれる。いくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかの１つ以上のＮＬＳは、以下に記載される異種機能ドメインのいずれかなどの１つ以上の追加の異種機能ドメインと組み合わせて、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤中に存在する。例示的なＮＬＳのコード配列は、配列番号２９２～３０４として提供される。
いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）の細胞内半減期を改変することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が増加し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が低減し得る。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を増加させることができる。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を低減させることができる。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして機能し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルペインプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。いくつかの実施形態において、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子－１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子－１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞が発現する発達的に下方制御されたタンパク質－８（ＮＥＤＤ８、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー－８（ＡＴＧ８）および－１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜固定ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折りたたみ修飾因子－１（ＵＦＭ１）、およびユビキチン様タンパク質－５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、マーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、マーカードメインは、蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、および橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態において、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであってもよい。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ－Ｈｉｓ、およびカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）を特異的なオルガネラ、細胞型、組織、または臓器に標的化し得る。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をミトコンドリアに標的化し得る。
さらなる実施形態において、異種機能ドメインは、エフェクタードメインであってもよい。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤がその標的配列に指向されるとき、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼが、ｇＲＮＡによって標的配列に指向されるとき、エフェクタードメインは、標的配列を修飾するか、または影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択され得る。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－６（２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”，Ｃｅｌｌ １５４：４４２－５１（２０１３）を参照のこと。したがって、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、本質的に、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列に結合するように指向され得る転写因子になる。特定の実施形態において、ＤＮＡ修飾ドメインは、脱メチル化ドメインまたはメチルトランスフェラーゼドメインなどのメチル化ドメインである。特定の実施形態において、エフェクタードメインは、塩基編集ドメインなどのＤＮＡ修飾ドメインである。特定の実施形態において、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡに特異的修飾、例えばデアミナーゼドメインを導入する核酸編集ドメインである。例えば、ＷＯ２０１５／０８９４０６、ＵＳ ２０１６／０３０４８４６を参照のこと。ＷＯ２０１５／０８９４０６およびＵＳ２０１６／０３０４８４６に記載されている核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、およびＣａｓ９バリアントは、参照により本明細書に組み込まれる。
ｅ）ＵＴＲ、Ｋｏｚａｋ配列
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒドロキシステロイド １７－ベータデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４またはＨＳＤ）由来の少なくとも１つのＵＴＲ、例えば、ＨＳＤ由来の５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファグロビン（ＨＢＡ）ｍＲＮＡ、ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡ、またはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓベータグロビン（ＸＢＧ）ｍＲＮＡ由来の少なくとも１つのＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧ由来の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’および３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧ由来の５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧ由来の３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＸＢＧ、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、グリセルアルデヒド ３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ－アクチン、アルファ－チューブリン、腫瘍タンパク質（ｐ５３）、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）由来の５’および３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、同じ供給源、例えば、アクチン、アルブミン、またはＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧなどのグロビンなどの構成的に発現されたｍＲＮＡ由来の５’および３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸は、配列番号２３２、２３４、２３６、２３８、２４１、または２７５～２７７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸は、配列番号２３３、２３５、２３７、２３９、または２４０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、前述の同一性レベルのいずれかは、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸は、配列番号２３２、２３４、２３６、２３８、または２４１のうちのいずれか１つの配列を有する５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸は、配列番号２３３、２３５、２３７、２３９、または２４０のうちのいずれか１つの配列を有する３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲを含まず、例えば、５’キャップと開始コドンとの間に追加のヌクレオチドは存在しない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップと開始コドンとの間にＫｏｚａｋ配列（以下に記載される）を含むが、任意の追加の５’ＵＴＲを有しない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、３’ＵＴＲを含まず、例えば、終止コドンとポリＡテールとの間に追加のヌクレオチドは存在しない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、Ｋｏｚａｋ配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列は、核酸から翻訳されるポリペプチドの翻訳開始および全収率に影響を及ぼす可能性がある。Ｋｏｚａｋ配列は、開始コドンとして機能し得るメチオニンコドンを含む。最小Ｋｏｚａｋ配列は、ＮＮＮＲＵＧＮであり、以下のうちの少なくとも１つが真である。第１のＮがＡまたはＧであり、第２のＮがＧである。ヌクレオチド配列の文脈において、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）を意味する。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＲＮＮＲＵＧＮ、ＮＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＡＵＧＮ、ＮＮＮＡＵＧＧ、またはＲＮＮＡＵＧＧである。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、小文字の位置に対して、ミスマッチがゼロであるか、または１個もしくは２個までのミスマッチを有するｒｃｃＲＵＧｇである。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、小文字の位置に対して、ミスマッチがゼロであるか、または１個もしくは２個までのミスマッチを有するｒｃｃＡＵＧｇである。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、小文字の位置に対して、ミスマッチがゼロであるか、または１個、２個、もしくは３個までのミスマッチを有するｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号３０５のヌクレオチド４～１３）である。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、小文字の位置に対して、ミスマッチがゼロであるか、または１個、２個、３個、もしくは４個までのミスマッチを有するｇｃｃＡｃｃＡＵＧである。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＡＣＣＡＵＧである。いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、小文字の位置に対して、ミスマッチがゼロであるか、または１個、２個、３個、もしくは４個までのミスマッチを有するｇｃｃｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号３０５）である。
ｆ）ポリＡテール
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリアデニル化（ポリＡ）テールをさらに含む。場合によっては、ポリＡテールは、ポリＡテール内の１つ以上の位置で、１つ以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断される」。ポリＡテールは、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドを含み得るが、１個以上の非アデニンヌクレオチドも含む。本明細書で使用される場合、「非アデニンヌクレオチド」は、アデニンを含まない任意の天然または非天然ヌクレオチドを指す。グアニン、チミン、およびシトシンヌクレオチドは、例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）上のポリＡテールは、目的のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤または配列をコードするヌクレオチドに対して３’に位置する連続するアデニンヌクレオチドを含み得る。場合によっては、ｍＲＮＡ上のポリＡテールは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤または目的の配列をコードするヌクレオチドに対して３’に位置する非連続アデニンヌクレオチドを含み、非アデニンヌクレオチドは、規則的な間隔もしくは不規則な間隔でアデニンヌクレオチドを中断する。
いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、ｍＲＮＡのインビトロ転写に使用されるプラスミドにコードされ、転写産物の一部となる。プラスミドにコードされるポリＡ配列、すなわち、ポリＡ配列中の連続するアデニンヌクレオチドの数は、正確でなくてもよく、例えば、プラスミド中の１００個のポリＡ配列は、転写されたｍＲＮＡ中に正確に１００個のポリＡ配列を生じさせなくてもよい。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、プラスミドにコードされておらず、ＰＣＲテーリングまたは酵素テーリングによって、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して追加される。
いくつかの実施形態において、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリ（Ａ）結合タンパク質が一連の連続するアデニンヌクレオチドに結合することができるように、連続したアデニンヌクレオチドを中断するように配置される。いくつかの実施形態において、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、または１２個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態において、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８～５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態において、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８～１００個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態において、非アデニンヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニンヌクレオチドの後にあり、その後に少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドが続く。
本開示のポリＡテールは、連続するアデニンヌクレオチドの１個の配列と、それに続く１個以上の非アデニンヌクレオチドと、任意選択で、追加のアデニンヌクレオチドとを含み得る。
いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、１個の非アデニンヌクレオチドまたは１個の連続する一連の２～１０個の非アデニンヌクレオチドを、含むかまたは含有する。いくつかの実施形態において、非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、または１２個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。場合によっては、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８～５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態において、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。
いくつかの実施形態において、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、またはチミンである。場合によっては、非アデニンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非アデニンヌクレオチドは、シトシンヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非アデニンヌクレオチドは、チミンヌクレオチドである。場合によっては、１個より多い非アデニンヌクレオチドが存在する場合、非アデニンヌクレオチドは、ａ）グアニンおよびチミンヌクレオチド、ｂ）グアニンおよびシトシンヌクレオチド、ｃ）チミンおよびシトシンヌクレオチド、またはｄ）グアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチドから選択されてもよい。非アデニンヌクレオチドを含む例示的なポリＡテールは、配列番号２６２として提供される。
ｇ）修飾ヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸は、一部またはすべてのウリジン位置に、修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲンまたはＣ１～Ｃ３アルコキシで、５位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、例えば、Ｃ１～Ｃ３アルコキシで、１位で修飾されたシュードウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は、修飾ウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、修飾ウリジン、例えば、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、シュードウリジン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、５－メトキシウリジンであり、残りは、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は、５－ヨードウリジンであり、残りは、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。
ｈ）５’キャップ
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは、一般に、核酸の５’－３’鎖の第１のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位のヌクレオチド）の５’位に対して５’－トリホスフェートを介して連結した７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して、以下に記載されるようにさらに修飾されてもよい）である。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１および第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１および第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシおよび２’－ヒドロキシを含む。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１および第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照のこと。ヒト核酸などの哺乳動物核酸を含む、ほとんどの内因性の高級真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０、およびＣａｐ１およびＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１およびＩＦＩＴ－５等の自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒト等の哺乳動物において免疫原性である場合があり、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。ＩＦＩＴ－１およびＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとの核酸の結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合があり、ｍＲＮＡの翻訳を潜在的に阻害する。
キャップは、ＲＮＡ中に共転写的に含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（抗逆キャップ類似体、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７－メチルグアニン ３’－メトキシ－５’－トリホスフェートを含むキャップ類似体であり、開始時にインビトロで転写産物に組み込むことができる。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位のヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６－１４９５を参照のこと。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
Figure 2022525428000034
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ （ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧおよびＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化態様も、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３およびＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）構造は、本明細書において、上に列挙されているカタログ番号の最後の３桁を使用して言及されることがある（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３について「ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）１１３」）。
Figure 2022525428000035
あるいは、転写後に、キャップをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ カタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、そのＤ１サブユニットによって与えられるＲＮＡトリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性と、そのＤ１２サブユニットによって与えられるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニンおよびＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるように、７－メチルグアニンをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３－４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２４４７２－２４４７９を参照のこと。キャップおよびキャッピングアプローチの追加の考察については、例えば、ＷＯ２０１７／０５３２９７およびＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．（２００９）Ｎｏ．５３，１２９－１３０を参照のこと。
Ｄ．ＲＮＡの有効性の決定
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの有効性は、他の構成要素、例えば、本明細書に記載されるもののいずれかなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸とともに送達されるときに決定される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡとＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸との組み合わせの有効性が決定される。
本明細書に記載される場合、本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの使用は、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生じる場合があり、細胞機構による修復時に挿入／欠失（インデル）変異の形態でエラーを生じ得る。インデルに起因する多くの変異は、リーディングフレームを変化させるか、または未成熟終止コドンを導入し、したがって、非機能性タンパク質を産生する。
いくつかの実施形態において、特定のｇＲＮＡまたは組み合わせの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態において、インビトロモデルは、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、インビトロモデルは、ＨＵＨ７ヒト肝臓がん細胞である。いくつかの実施形態において、インビトロモデルは、ＨｅｐＧ２細胞である。いくつかの実施形態において、インビトロモデルは、初代ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態において、インビトロモデルは、初代カニクイザル肝細胞である。初代ヒト肝細胞を使用することに関して、市販の初代ヒト肝細胞を使用して、実験間のより高い一貫性を提供することができる。いくつかの実施形態において、インビトロモデルにおいて（例えば、初代ヒト肝細胞において）欠失または挿入が起こるオフターゲット部位の数は、例えば、インビトロでＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡでトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することによって、決定される。いくつかの実施形態において、そのような決定は、インビトロでＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、およびドナーオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することを含む。そのような決定のための例示的な手順を以下の作業実施例に提供する。
いくつかの実施形態において、特定のｇＲＮＡまたは組み合わせの有効性は、ｇＲＮＡ選択プロセスのための複数のインビトロ細胞モデルにわたって決定される。いくつかの実施形態において、選択されたｇＲＮＡとのデータの細胞株比較が行われる。いくつかの実施形態において、複数の細胞モデルで交差スクリーニングを実施する。
いくつかの実施形態において、特定のｇＲＮＡまたは組み合わせの有効性は、インビボモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態において、インビボモデルは、げっ歯類モデルである。いくつかの実施形態において、げっ歯類モデルは、変異体ヒトＴＴＲ遺伝子であり得るヒトＴＴＲ遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態において、インビボモデルは、非ヒト霊長類、例えばカニクイザルである。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは組み合わせの有効性は、ＴＴＲの編集パーセントによって測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの編集パーセントを、例えば、インビトロモデルの場合は全細胞培養物において、またはインビボモデルの場合は血清または組織において、ＴＴＲタンパク質のノックダウンを達成するために必要な編集パーセントと比較する。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは組み合わせの有効性は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルの数および／または頻度によって測定される。いくつかの実施形態において、細胞集合体において、および／または標的部位におけるインデル生成の頻度と比較して、非常に低い頻度（例えば、５％未満）で、オフターゲット部位でインデルを生成する有効なガイドＲＮＡおよび組み合わせが提供される。したがって、本開示は、標的細胞型（例えば、肝細胞）においてオフターゲットインデル形成を示さないか、または細胞集合体において、および／または標的部位でのインデル生成の頻度と比較して、オフターゲットインデル形成の頻度が５％未満であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、標的細胞型（例えば、肝細胞）において任意のオフターゲットインデル形成を示さないガイドＲＮＡおよび組み合わせを提供する。いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、５個未満のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドＲＮＡおよび組み合わせが提供される。いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、４、３、２、または１個以下のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドＲＮＡおよび組み合わせが提供される。いくつかの実施形態において、オフターゲット部位は、標的細胞（例えば、肝細胞）ゲノム内のタンパク質コード領域内では発生しない。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集事象、例えば、挿入／欠失（「インデル」）変異の形成、および標的ＤＮＡにおける相同性誘導修復（ＨＤＲ）事象を検出することは、ＷＯ２０１８／０６７４４７またはＳｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１０５１－１０５７（２００７）に記載されるように、タグ化プライマーを用いた線形増幅およびタグ化増幅産物の単離を利用する（本明細書ではこれ以降、「ＬＡＭ－ＰＣＲ」または「線形増幅（ＬＡ）」法と呼ばれる）。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集事象、例えば、挿入／欠失（「インデル」）変異の形成、および標的ＤＮＡにおける相同性誘導修復（ＨＤＲ）事象を検出することは、線形増幅産物またはさらなる増幅産物をシークエンシングすることをさらに含む。シークエンシングは、次世代配列決定、および線形増幅産物またはさらなる増幅産物のプラスミドへのクローニング、プラスミドまたはプラスミドの一部のシークエンシングを含め、当業者に既知の任意の方法を含んでもよい。例示的な次世代シークエンシング方法は、例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６：１１３５－１１４５（２００８）に記載される。他の態様において、遺伝子編集事象、例えば、挿入／欠失（「インデル」）変異の形成、および標的ＤＮＡにおける相同性誘導修復（ＨＤＲ）事象を検出することは、線形増幅産物もしくはさらなる増幅産物に対してデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行うこと、または線形増幅産物もしくはさらなる増幅産物と、ＨＤＲテンプレート配列を含むＤＮＡを同定するように設計された核酸プローブとを接触させること、および線形増幅産物もしくはさらなる増幅産物に結合したプローブを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的ＤＮＡにおけるＨＤＲテンプレートの位置を決定することをさらに含む。
特定の実施形態において、本方法は、標的ＤＮＡ内の挿入部位の配列を決定することをさらに含み、挿入部位は、ＨＤＲテンプレートが標的ＤＮＡに組み込まれる位置であり、挿入部位は、いくつかの標的ＤＮＡ配列およびいくつかのＨＤＲテンプレート配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは組み合わせの有効性は、ＴＴＲの分泌によって測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの分泌は、細胞培地または血清を用いた酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの分泌は、編集を測定するために使用されるのと同じインビトロまたはインビボ系またはモデルにおいて測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの分泌は、初代ヒト肝細胞において測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの分泌は、ＨＵＨ７細胞において測定される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの分泌は、ＨｅｐＧ２細胞において測定される。
ＥＬＩＳＡアッセイは、当業者に一般的に知られており、血清ＴＴＲレベルを決定するように設計することができる。例示的な一実施形態において、血液を収集し、血清を単離する。全ＴＴＲ血清レベルは、Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ） ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、型ロブＯＫＩＡ００１１１）またはヒトＴＴＲを測定するための同様のキットを使用して決定され得る。キットが利用可能ではない場合、測定するときにＴＴＲに特異的な捕捉抗体で事前にコーティングされたプレートを使用して、ＥＬＩＳＡを開発することができる。プレートを室温で所定時間インキュベートした後、洗浄する。酵素－抗ＴＴＲ抗体コンジュゲートを添加し、インキュベートする。未結合の抗体コンジュゲートを除去し、プレートを洗浄した後、酵素と反応する発色基質溶液を添加する。プレートを、使用される酵素および基質に特有の吸光度で、適切なプレートリーダーで読み取る。
いくつかの実施形態において、細胞（組織由来のものを含む）中のＴＴＲの量は、ｇＲＮＡまたは組み合わせの有効性を測定する。いくつかの実施形態において、細胞中のＴＴＲの量は、ウェスタンブロットを使用して測定される。いくつかの実施形態において、使用される細胞は、ＨＵＨ７細胞である。いくつかの実施形態において、使用される細胞は、初代ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態において、使用される細胞は、動物から得られる初代細胞である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの量を、細胞数の変化を制御するために、グリセルアルデヒド ３－リン酸デヒドロゲナーゼＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）の量と比較する。
ＩＩＩ．ＬＮＰ製剤およびＡＴＴＲの治療
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡを含む（例えば、配列番号５～８２のうちのいずれか１つ以上のガイド配列、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、ＴＴＲ遺伝子内のＤＳＢを誘導する。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法であって、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のいずれか１つ以上のガイド配列、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡ（例えば、化学修飾されたガイドＲＮＡ）を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上、または配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、ＴＴＲ遺伝子内のＤＳＢを誘導する。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子を修飾する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（例えば、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、ＴＴＲ遺伝子を修飾する。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子を修飾する方法であって、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、ＴＴＲ遺伝子を修飾する。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲを治療する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（例えば、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、ＡＴＴＲを治療する。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲを治療する方法であって、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、ＡＴＴＲを治療する。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ血清濃度を低減する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（例えば、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、アミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ血清濃度を低減する方法であって、本明細書に記載のガイドＲＮＡ（例えば、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、アミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、対象のアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（例えば、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、対象のアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する方法であって、配列番号８７～１１３のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、アミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、対象のアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する方法であって、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（例えば、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、対象のアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する方法であって、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが投与され、アミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする本明細書に記載される核酸またはベクターとともに投与される。ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、表１のガイド配列もしくは表２からの１つ以上のｓｇＲＮＡを、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、核酸から翻訳されたＣａｓヌクレアーゼと一緒に含むｇＲＮＡは、ＤＳＢを誘導し、修復中の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＴＴＲ遺伝子内の変異をもたらす。いくつかの実施形態において、ＮＨＥＪは、ヌクレオチド変異の欠失または挿入を引き起こし、ＴＴＲ遺伝子におけるフレームシフトまたはナンセンスを誘導する。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸を（例えば、本明細書に提供される組成物で）投与することは、対象におけるＴＴＲのレベル（例えば、血清レベル）を低下させ、したがって、アミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積および凝集を予防する。
いくつかの実施形態において、対象のアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積および凝集を低減もしくは予防することは、対象の１つ以上の組織、例えば、胃、結腸、または神経組織におけるＴＴＲ沈着を低減または予防することを含む。いくつかの実施形態において、神経組織は、坐骨神経または後根神経節を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ沈着は、胃、結腸、坐骨神経、および後根神経節のうちの２つ、３つ、または４つにおいて低減する。所与の組織における沈着のレベルは、例えば、免疫染色を使用して、生検試料を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、対象のアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低減もしくは予防すること、および／またはＴＴＲ沈着を低減もしくは予防することは、所定時間、血清ＴＴＲレベルを低減することに基づいて推測される。実施例で考察されるように、本明細書で提供される方法および使用に従って血清ＴＴＲレベルを低減することによって、例えば、組成物の投与の８週間後に測定されるように、上および実施例で考察されるものなどの組織から沈着したＴＴＲのクリアランスを引き起こし得ることが見出されている。
いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、または家禽である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、表１のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または表２からの１つ以上のｓｇＲＮＡを含む）（例えば、本明細書で提供される組成物で）の使用、ならびにＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする本明細書に記載の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の使用は、ＡＴＴＲを有するヒト対象を治療するための医薬の調製のために提供される。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよい。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよび核酸を含む組成物は、静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよび核酸を含む組成物は、肝循環に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるガイドＲＮＡおよび核酸を含む組成物の単回投与は、変異体タンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるガイドＲＮＡおよび核酸を含む組成物の単回投与は、細胞の集合体における変異体タンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。他の実施形態において、本明細書で提供されるガイドＲＮＡおよび核酸を含む組成物の１回より多い投与は、累積的な効果によって編集を最大化するのに有益であり得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、２回、３回、４回、５回、またはさらに多く、例えば、２回投与することができる。投与は、例えば、１日間～２年間、例えば、１日間～７日間、７日間～１４日間、１４日間～３０日間、３０日間～６０日間、６０日間～１２０日間、１２０日間～１８３日間、１８３日間～２７４日間、２７４日間～３６６日間、または３６６日間～２年間の範囲の期間で分割することができる。
いくつかの実施形態において、組成物は、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）、例えば、０．０１～０．１ｍｐｋ、０．１～０．３ｍｐｋ、０．３～０．５ｍｐｋ、０．５～１ｍｐｋ、１～２ｍｐｋ、２～３ｍｐｋ、３～５ｍｐｋ、５～１０ｍｐｋの範囲、または０．１、０．２、０．３、０．５、１、２、３、５、もしくは１０ｍｐｋの有効量で投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、２～４ｍｇ／ｋｇ、例えば、２．５～３．５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、約３ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書の組成物による治療の有効性は、送達から１年後、２年後、３年後、４年後、５年後、または１０年後にみられる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物による治療の有効性は、治療の前後のＴＴＲの血清レベルを測定することによって評価される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲの血清レベルの低減によって評価される、組成物による治療の有効性は、１週目、２週目、３週目、４週目、２ヶ月目、３ヶ月目、４ヶ月目、５ヶ月目、６ヶ月目、７ヶ月目、８ヶ月目、９ヶ月目、１０ヶ月目、または１１ヶ月目でみられる。
いくつかの実施形態において、治療は、疾患の進行を遅らせるか、または止める。
いくつかの実施形態において、治療は、ＦＡＰの進行を遅らせるか、または止める。いくつかの実施形態において、治療は、感覚運動ニューロパチーまたは自律神経ニューロパチーの症状を改善し、安定化し、または変化を遅らせる。
いくつかの実施形態において、治療は、ＦＡＣの症状を改善し、安定化し、または変化を遅らせる。いくつかの実施形態において、治療は、拘束型心筋症またはうっ血性心不全の症状を改善し、安定化し、または変化を遅らせる。
いくつかの実施形態において、治療の有効性は、対象の生存時間の増加によって測定される。
いくつかの実施形態において、治療の有効性は、感覚運動ニューロパチーまたは自律神経ニューロパチーの症状の改善、またはその進行の遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、身体のある領域を移動させるか、または身体の任意の領域において感じる能力の増加、または低減の遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、嚥下、呼吸、腕、手、脚、または足の使用、または歩行の能力の改善または能力の増加、または低減の遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、神経痛の進行の改善、または遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、神経痛は、疼痛、熱傷、しびれ、または異常な感覚を特徴とする。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、姿勢低血圧、めまい、消化管運動障害、膀胱機能障害、または性機能障害の改善、または増加の遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、脱力の進行の改善または遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、筋電図、神経伝導検査、または患者が報告する転帰を使用して測定される。
いくつかの実施形態において、治療の有効性は、うっ血性心不全またはＣＨＦの症状の改善または進行の遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、息切れ、呼吸困難、疲労、足首、足、脚、腹部、または首の静脈の腫脹の低減または増加の遅れによって測定される。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、体内の流体蓄積の改善または進行の遅れによって測定され、体重増加、頻尿、または夜間の咳などの尺度によって評価されてもよい。いくつかの実施形態において、治療の有効性は、心臓バイオマーカー試験（例えば、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド［ＢＮＰ］またはＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド［ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ］）、肺機能検査、胸部ｘ線、または心電図法を使用して測定される。
Ａ．併用療法
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む）、および本明細書に記載のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸（例えば、本明細書に提供される組成物で）、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードする本明細書に記載の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）またはベクターを、ＡＴＴＲの症状を緩和するのに適した追加の療法と合わせて投与することを含む、併用療法を含む。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載のＬＮＰ、例えば、ＣＣＤ脂質（例えば、脂質Ａなどのアミン脂質）、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）、および任意選択で中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含むＬＮＰで投与される。
いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲのための追加の療法は、感覚運動ニューロパチーまたは自律神経ニューロパチーのための治療である。いくつかの実施形態において、感覚運動ニューロパチーまたは自律神経ニューロパチーのための治療は、非ステロイド性抗炎症薬、抗うつ薬、抗けいれん薬、抗不整脈薬、または麻薬剤である。いくつかの実施形態において、抗うつ薬は、三環系薬剤またはセロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗うつ薬は、アミトリプチリン、デュロキセチン、またはベンラファキシンである。いくつかの実施形態において、抗けいれん薬は、ガバペンチン、プレガバリン、トピラメート、またはカルバマゼピンである。いくつかの実施形態において、感覚運動ニューロパチーのための追加の療法は、経皮的電気神経刺激である。
いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲのための追加の療法は、拘束型心筋症またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）のための治療である。いくつかの実施形態において、ＣＨＦの治療は、ＡＣＥ阻害剤、アルドステロンアンタゴニスト、アンジオテンシン受容体遮断薬、ベータ遮断薬、ジゴキシン、利尿薬、またはイソソルビド二硝酸塩／ヒドララジン塩酸塩である。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ阻害剤は、エナラプリル、カプトプリル、ラミプリル、ペリンドプリル、イミダプリル、またはキナプリルである。いくつかの実施形態において、アルドステロンアンタゴニストは、エプレレノンまたはスピロノラクトンである。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン受容体遮断薬は、アジルサルタン、カデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、またはバルサルタンである。いくつかの実施形態において、ベータ遮断薬は、アセブトロール、アテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、またはプロプラノロールである。いくつかの実施形態において、利尿薬は、クロロチアジド、クロルタリドン、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、メトラゾン、ブメタニド、フロセミド、トルセミド、アミロリド、またはトリアメテレンである。
いくつかの実施形態において、併用療法は、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ、およびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸（例えば、本明細書に提供される組成物で）を、ＴＴＲまたは変異体ＴＴＲを標的とするｓｉＲＮＡとともに投与することを含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、野生型または変異体ＴＴＲの発現をさらに低減するか、またはなくすことができる任意のｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、薬物パチシラン（ＡＬＮ－ＴＴＲ０２）またはＡＬＮ－ＴＴＲｓｃ０２である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供される組成物で）の後に投与される。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、本明細書で提供されるｇＲＮＡ組成物のいずれかで治療した後に、定期的に投与される。
いくつかの実施形態において、併用療法は、本明細書に記載のガイド配列（例えば、表１に開示されるもの）のうちのいずれか１つ以上、または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのうちのいずれか１つ、および本明細書に記載のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸（例えば、本明細書に提供される組成物で）を、ＴＴＲまたは変異体ＴＴＲを標的とするアンチセンスヌクレオチドとともに投与することを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスヌクレオチドは、野生型または変異体ＴＴＲの発現をさらに低減するか、またはなくすことができる任意のアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスヌクレオチドは、薬物イノテルセン（ＩＯＮＳ－ＴＴＲＲｘ）である。いくつかの実施形態において、アンチセンスヌクレオチドは、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ、およびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸（例えば、本明細書に提供される組成物で）の後に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスヌクレオチドは、本明細書で提供されるｇＲＮＡ組成物のいずれかで治療した後に、定期的に投与される。
いくつかの実施形態において、併用療法は、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ、およびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸（例えば、本明細書に提供される組成物で）を、ＴＴＲの正しくフォールディングされた四量体形態の動的安定化を促進する小分子安定剤とともに投与することを含む。いくつかの実施形態において、小分子安定剤は、薬物タファミジス（Ｖｙｎｄａｑｅｌ（登録商標））またはジフルニサルである。いくつかの実施形態において、小分子安定剤は、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上または表２のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供される組成物で）の後に投与される。いくつかの実施形態において、小分子安定剤は、本明細書で提供される組成物のいずれかで治療した後に、定期的に投与される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表１に開示されるガイド配列は、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されてもよく、および／または表２のｓｇＲＮＡは、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４から選択されてもよく、および／またはガイドＲＮＡは、化学修飾されたガイドＲＮＡであってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、注入予防を含む。いくつかの実施形態において、注入予防は、遺伝子編集組成物の前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、注入予防は、核酸組成物の投与の８～２４時間前または１～２時間前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、注入予防は、コルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態において、注入予防は、コルチコステロイド、疼痛および熱を低減させ、かつ／またはＣＯＸ酵素および／またはプロスタグランジンを阻害し得る解熱剤（例えば、経口アセトアミノフェン（パラセタモールとも呼ばれる））、Ｈ１遮断薬、またはＨ２遮断薬のうちの１つ以上、またはすべてを含む。いくつかの実施形態において、注入予防は、静脈内コルチコステロイド（デキサメタゾン８～１２ｍｇ、例えば、１０ｍｇまたは等価物）および解熱剤（例えば、経口アセトアミノフェンまたはパラセタモール５００ｍｇ）を含む。いくつかの実施形態において、Ｈ１遮断薬（例えば、ジフェンヒドラミン５０ｍｇまたは等価物）および／またはＨ２遮断薬（例えば、ラニチジン５０ｍｇまたは等価物）は、経口投与される。いくつかの実施形態において、Ｈ１遮断薬（例えば、ジフェンヒドラミン５０ｍｇまたは等価物）および／またはＨ２遮断薬（例えば、ラニチジン５０ｍｇまたは等価物）は、静脈内投与される。いくつかの実施形態において、注入予防は、核酸組成物の注入の１～２時間前に静脈内投与される。いくつかの実施形態において、静脈内Ｈ１遮断薬および／または静脈内Ｈ２遮断薬は、経口等価物に置き換えられる。注入予防は、核酸組成物を投与することに関連する有害反応を低減するように機能し得る。いくつかの実施形態において、注入予防は、核酸組成物を投与する前に、必要な前投薬として投与される。本明細書に記載のコルチコステロイド、注入予防、およびガイドＲＮＡ含有組成物の投与量、頻度および投与様式は、独立して制御することができる。
開示される方法で使用されるコルチコステロイドは、当該技術分野で既知のレジメン、例えば、米国ＦＤＡが承認したレジメンに従って投与され得る。いくつかの実施形態において、例えば、ヒト対象へのまたはヒト対象において使用するための投与を含め、コルチコステロイドは、約０．７５ｍｇ～約２５ｍｇの範囲の量で投与され得る。いくつかの実施形態において、例えば、ヒト対象へのまたはヒト対象において使用するための投与を含め、コルチコステロイドは、約０．０１～０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１～０．４０ｍｇ／ｋｇまたは０．２５～０．４０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与され得る。
いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ含有組成物の前に投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ含有組成物の後に投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ含有組成物と同時に投与される。いくつかの実施形態において、複数回用量のコルチコステロイドは、ガイドＲＮＡ含有組成物の投与の前または後に投与される。いくつかの実施形態において、複数回用量のガイドＲＮＡ含有組成物は、コルチコステロイドの投与の前または後に投与される。いくつかの実施形態において、複数回用量のコルチコステロイドおよび複数回用量のガイドＲＮＡ含有組成物が投与される。
適切な場合、ある用量のコルチコステロイドは、適切な間隔で別々に投与される少なくとも２つのサブ用量として投与され得る。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ含有組成物の投与の前に、少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態において、ある用量のコルチコステロイドは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ含有組成物の投与の後に、少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５日間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５週間の間隔で、または前述の値のうちのいずれか２つによって制限される範囲内の時間量で、（例えば、本明細書に記載のガイドＲＮＡ含有組成物の投与の前、投与とともに、および／または投与の後に）投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ含有組成物の投与前に、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５週間の間隔で、または前述の値のうちのいずれか２つによって制限される範囲内の時間量で、投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ含有組成物の投与後に、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５週間の間隔で、または前述の値のうちのいずれか２つによって制限される範囲内の時間量で、投与される。
いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、少なくとも３回投与される投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、少なくとも４回投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、最大５回、６回、７回、８回、９回、または１０回投与される。第１の用量は経口であってもよく、第２の用量またはその後の用量は、非経口投与、例えば注入によるものであってもよい。あるいは、第１の用量は、非経口であってもよく、第２の用量またはその後の用量は、経口投与によるものであってもよい。
いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ含有組成物の静脈内投与の前に経口投与される。いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ含有組成物の静脈内投与時または静脈内投与後に経口投与される。
いくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。いくつかの実施形態において、デキサメタゾンは、核酸組成物の注入の１～２時間前に静脈内投与される。いくつかの実施形態において、デキサメタゾンは、核酸組成物の注入の１～２時間前に、８～１２ｍｇ、例えば、１０ｍｇの量で静脈内投与される。いくつかの実施形態において、デキサメタゾンは、核酸組成物の注入の８～２４時間前に経口投与される。いくつかの実施形態において、デキサメタゾンは、核酸組成物の注入の８～２４時間前に、８～１２ｍｇ、例えば、８ｍｇの量で経口投与される。いくつかの実施形態において、デキサメタゾンは、核酸組成物の注入の８～２４時間前に、８～１２ｍｇ、例えば、８ｍｇの量で経口投与され、デキサメタゾンは、核酸組成物の注入の１～２時間前に、８～１２ｍｇ、例えば、１０ｍｇの量で静脈内投与される。
Ｂ．核酸組成物の送達
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡおよびＲＮＡとしてＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする本明細書に記載の核酸を含むか、または１つ以上のベクター上でコードされる、本明細書に記載の核酸組成物は、脂質ナノ粒子で製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、それらの内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる「ＬＩＰＩＤ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」という名称のＷＯ２０１７１７３０５４Ａ１、「ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」という名称のＷＯ２０１９０６７９９２Ａ１を参照のこと。対象にヌクレオチドを送達することが可能な当業者に公知の任意の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、本明細書に記載のガイドＲＮＡと、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸とともに利用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴを含む、ＲＮＡのためのＬＮＰ製剤の様々な実施形態が、本明細書に開示される。かかるＬＮＰ製剤は、（ｉ）ＣＣＤ脂質、例えば、アミン脂質と、（ｉｉ）中性脂質と、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質と、（ｉｖ）ステルス脂質、例えば、ＰＥＧ脂質とを含み得る。ＬＮＰ製剤のいくつかの実施形態は、ヘルパー脂質、中性脂質、およびＰＥＧ脂質などのステルス脂質とともに、「アミン脂質」を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤は、１％未満の中性リン脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤は、０．５％未満の中性リン脂質を含む。「脂質ナノ粒子」によって、分子間力によって互いに物理的に結合する複数の（すなわち、１つを超える）脂質分子を含む粒子を意味する。
ＣＣＤ脂質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ成分を肝臓細胞に送達するための脂質組成物は、ＣＣＤ脂質を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質Ａである。脂質Ａは以下のように描写できる。
Figure 2022525428000036
脂質Ａは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば８４～８６ページ）に従って合成され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。脂質Ｂは以下のように描写できる。
Figure 2022525428000037
脂質Ｂは、ＷＯ２０１４／１３６０８６（例えば１０７～０９ページ）に従って合成され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。脂質Ｃは以下のように描写できる。
Figure 2022525428000038
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。
脂質Ｄは以下のように描写できる。
Figure 2022525428000039
脂質Ｃおよび脂質Ｄは、ＷＯ２０１５／０９５３４０に従って合成され得る。
ＣＣＤ脂質はまた、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、または脂質Ｄに対する等価物であり得る。特定の実施形態において、ＣＣＤ脂質は、脂質Ａに対する等価物、脂質Ｂに対する等価物、脂質Ｃに対する等価物、または脂質Ｄに対する等価物である。
アミン脂質
いくつかの実施形態において、生理活性薬剤の送達のためのＬＮＰ組成物は、「アミン脂質」を含み、アミン脂質は、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、脂質Ｄ、または脂質Ａの等価物（脂質Ａのアセタール類似体を含む）、脂質Ｂの等価物、脂質Ｃの等価物、および脂質Ｄの等価物として定義される。
いくつかの実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａであり、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル （９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる。脂質Ａは以下のように描写できる。
Figure 2022525428000040
脂質Ａは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば８４～８６ページ）に従って合成され得る。特定の実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａに対する等価物である。
特定の実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａの類似体である。特定の実施形態において、脂質Ａ類似体は、脂質Ａのアセタール類似体である。特定のＬＮＰ組成物において、アセタール類似体は、Ｃ４～Ｃ１２アセタール類似体である。いくつかの実施形態において、アセタール類似体は、Ｃ５～Ｃ１２アセタール類似体である。追加の実施形態において、アセタール類似体は、Ｃ５～Ｃ１０アセタール類似体である。さらなる実施形態において、アセタール類似体は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、およびＣ１２アセタール類似体から選択される。
本明細書に記載のＬＮＰにおける使用に好適なアミン脂質は、インビボで生分解可能であり、生理活性薬剤（例えば、ＲＮＡ）を細胞に送達するのに適している。アミン脂質は、低い毒性を有する（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ以上の量のＲＮＡカーゴで副作用がない動物モデルにおいて許容される）。特定の実施形態において、アミン脂質を含むＬＮＰは、アミン脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものを含む。特定の実施形態において、アミン脂質を含むＬＮＰは、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものを含む。特定の実施形態において、アミン脂質を含むＬＮＰは、例えば、脂質（例えば、アミン脂質）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または別の構成要素を測定することによって、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものを含む。特定の実施形態において、ＬＮＰの脂質封入されたもの対遊離の脂質、ＲＮＡ、または核酸成分が測定される。
脂質クリアランスは、文献に記載されているように測定されてもよい。Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２１（８），１５７０－７８（「Ｍａｉｅｒ」）を参照のこと。例えば、Ｍａｉｅｒにおいて、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ系が、６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、外側尾静脈を介する静脈内ボーラス注射によって、０．３ｍｇ／ｋｇで投与された。投与後０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、９６、および１６８時間で、血液、肝臓、および脾臓試料を採取した。組織採取の前にマウスに生理食塩水で灌流させ、血液試料を処理して血漿を得た。すべての試料は、処理され、ＬＣ－ＭＳによって分析された。さらに、Ｍａｉｅｒは、ＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ製剤の投与後の毒性を評価するための手順を記載している。例えば、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを、雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに、５ｍＬ／ｋｇの用量体積で単回静脈内ボーラス注射により、０、１、３、５、および１０ｍｇ／ｋｇ（５動物／群）で投与した。２４時間後、意識のある動物の頸静脈から約１ｍＬの血液が得られ、血清を単離した。投与後７２時間で、すべての動物を剖検のために安楽死させた。臨床的徴候、体重、血清化学、臓器重量および組織病理の評価を行った。Ｍａｉｅｒは、ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を評価するための方法を記載しているが、これらの方法は、本開示のＬＮＰ組成物の投与のクリアランス、薬物動態、および毒性の評価に適用され得る。
アミン脂質によって、クリアランス速度が増加し得る。いくつかの実施形態において、クリアランス速度は、脂質クリアランス速度であり、例えば、脂質が血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態において、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度であり、例えば、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡが血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態において、クリアランス速度は、ＬＮＰが血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態において、クリアランス速度は、ＬＮＰが肝臓組織または脾臓組織などの組織から除去される速度である。特定の実施形態において、高いクリアランス速度によって、実質的な有害作用のない安全性プロファイルが得られる。アミン脂質は、循環および組織におけるＬＮＰ蓄積を減少させ得る。いくつかの実施形態において、循環および組織におけるＬＮＰ蓄積の減少によって、実質的な有害作用のない安全性プロファイルが得られる。
本開示のアミン脂質は、それらが含まれる媒体のｐＨに応じて電離していてもよい（例えば、塩を形成してもよい）。例えば、わずかに酸性の媒体において、アミン脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びていてもよい。逆に、例えば、ｐＨがおよそ７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、アミン脂質はプロトン化されず、したがって電荷を帯びていない場合がある。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、少なくとも約９のｐＨでプロトン化されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、少なくとも約９のｐＨでプロトン化されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、少なくとも約１０のｐＨでプロトン化されてもよい。
アミン脂質の大部分がプロトン化されるｐＨは、その固有のｐＫａに関連する。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、それぞれ独立して、約５．１～約７．４の範囲のｐＫａを有していてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、それぞれ独立して、約５．５～約６．６の範囲のｐＫａを有していてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、それぞれ独立して、約５．６～約６．４の範囲のｐＫａを有していてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のアミン脂質は、それぞれ独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有していてもよい。例えば、本開示のアミン脂質は、それぞれ独立して、約５．８～約６．５の範囲のｐＫａを有してもよい。約５．１～約７．４の範囲のｐＫａを有する陽イオン性脂質が、インビボで、例えば肝臓にカーゴを送達するのに有効であることがわかっているので、ＬＮＰを製剤化する際にアミン脂質のｐＫａが重要な考慮事項となり得る。さらに、約５．３～約６．４の範囲のｐＫａを有する陽イオン性脂質が、インビボで、例えば腫瘍に送達するのに有効であることがわかっている。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照のこと。
追加の脂質
本開示の脂質組成物における使用に好適な「中性脂質」としては、例えば、様々な中性、非荷電性、または双性イオン性の脂質を含む。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ポスホコリン（ｐｏｈｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、およびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。一実施形態において、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。別の実施形態において、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。別の実施形態において、中性リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり得る。
「ヘルパー脂質」には、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが含まれる。本開示において使用するのに好適なヘルパー脂質としては、限定されないが、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが挙げられる。一実施形態において、ヘルパー脂質は、コレステロールであってもよい。一実施形態において、ヘルパー脂質は、ヘミコハク酸コレステロールであってもよい。
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば血管中）で存在し得る時間の長さを変化させる脂質である。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。本明細書において使用されるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。本開示の脂質組成物における使用に好適なステルス脂質としては、限定されないが、脂質部分に連結した親水性頭部基を有するステルス脂質が挙げられる。本開示の脂質組成物における使用に好適なステルス脂質およびそのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，２００８，ｐｇ．５５－７１およびＨｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１－５２の中に見出され得る。追加の好適なＰＥＧ脂質は、例えば、ＷＯ２００６／００７７１２に開示される。
一実施形態において、ステルス脂質の親水性頭部基は、ＰＥＧに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含む。ステルス脂質は、脂質部分を含み得る。いくつかの実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒径を制御することによって製剤化プロセスを補助し得る。本明細書において使用されるＰＥＧ脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。典型的には、ＰＥＧ脂質は、脂質部分およびＰＥＧに基づくポリマー部分を含む。
一実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧに基づくポリマー（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリ［Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］から選択されるポリマー部分を含む。
一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧに基づくポリマー部分（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）を含む。
ＰＥＧ脂質は、脂質部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、脂質部分は、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和もしくは不飽和炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミド基を含むものを含め、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドに由来していてもよく、鎖は、１つ以上の官能基（例えば、アミドもしくはエステルなど）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アルキル鎖長は、約Ｃ１０～Ｃ２０を含む。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。鎖長は、対称でも非対称でもよい。
別に指示されない限り、本明細書において使用される「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態において、ＰＥＧは、任意選択で置換されたエチレングリコールまたはエチレンオキシドの直鎖または分岐鎖のポリマーである。一実施形態において、ＰＥＧは非置換である。一実施形態において、ＰＥＧは、例えば、１つ以上のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換されている。一実施形態において、この用語は、ＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含む（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと）。別の実施形態において、この用語は、ＰＥＧコポリマーを含まない。一実施形態において、ＰＥＧは、約１３０～約５０，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約３０，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約２０，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約１５，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約１０，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約６，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約５，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約４，０００、副次的な実施形態において、約１５０～約３，０００、副次的な実施形態において、約３００～約３，０００、副次的な実施形態において、約１，０００～約３，０００、副次的な実施形態において、約１，５００～約２，５００の分子量を有する。
特定の実施形態において、ＰＥＧ（例えばステルス脂質などの脂質部分または脂質に共役する）は、「ＰＥＧ－２Ｋ」であり、「ＰＥＧ２０００」とも呼ばれ、これは約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ－２Ｋは、本明細書において、以下の式（Ｉ）によって表され、式中、ｎは４５であり、この数は、数平均重合度が約４５サブユニット
Figure 2022525428000041
 を含むことを意味する。しかしながら、例えば、数平均重合度が約２３サブユニット（ｎ＝２３）、および／または６８サブユニット（ｎ＝６８）を含む、当該技術分野において公知の他のＰＥＧの実施形態を使用してもよい。いくつかの実施形態において、ｎは約３０～約６０の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは約３５～約５５の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは約４０～約５０の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは約４２～約４８の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは４５であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、および非置換アルキルから選択され得る。いくつかの実施形態において、Ｒは非置換アルキルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒはメチルであってもよい。
本明細書において記載される実施形態のいずれにおいても、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（ＮＯＦ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎからカタログ番号ＧＭ－０２０）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）（カタログ番号ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、ＮＯＦ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ製のカタログ番号８８０１２０Ｃ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ、ＧＳ－０２０，ＮＯＦ Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリラート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ）、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択され得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－Ｃ－ＤＭＡであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＷＯ２０１６／０１０８４０（段落［００２４０］～［００２４４］）に開示される化合物Ｓ０２７であってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－Ｃ１４であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－Ｃ１６であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－Ｃ１８であってもよい。
ＬＮＰ製剤化
ＬＮＰは、（ｉ）封入およびエンドソーム脱出のためのアミン脂質と、（ｉｉ）安定化のための中性脂質と、（ｉｉｉ）これも安定化のためのヘルパー脂質と、（ｉｖ）ステルス脂質、例えば、ＰＥＧ脂質とを含有し得る。中性脂質は、省略されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびｇＲＮＡのうちの１つ以上を含むＲＮＡ成分を含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ成分として、クラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｇＲＮＡとを含む。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ成分と、アミン脂質と、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ステルス脂質とを含み得る。特定のＬＮＰ組成物において、ヘルパー脂質は、コレステロールである。他の組成物において、中性脂質は、ＤＳＰＣである。追加の実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａまたは脂質Ａの等価物と、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ステルス脂質と、ガイドＲＮＡとを含む。特定の組成物において、アミン脂質は、脂質Ａである。特定の組成物において、アミン脂質は、脂質Ａまたはそのアセタール類似体であり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
特定の実施形態において、脂質組成物は、製剤中の成分の脂質のそれぞれのモル比に従って記載される。本開示の実施形態は、製剤中の成分の脂質のそれぞれのモル比に従って記載される脂質組成物を提供する。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約４５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約５５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約５０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約５０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、アミン脂質のｍｏｌ％は、約５５ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのアミン脂質のｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのアミン脂質のｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、または±０．２５ｍｏｌ％である。すべてのｍｏｌ％数は、ＬＮＰ組成物の脂質成分の分率として示される。特定の実施形態において、アミン脂質ｍｏｌ％のＬＮＰのロット間の変動性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約７ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約８ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％であり得る。
一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、約１２ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％、または約１５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約９ｍｏｌ％であり得る。
一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質のｍｏｌ％は、約０．１ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約０．１ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％、約３．５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％、約４．５ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％であり得る。
一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％未満であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約０．５ｍｏｌ％未満であり得る。一実施形態において、中性脂質、例えば、中性リン脂質のｍｏｌ％は、約０ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％、約０．４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、中性脂質を含まない（すなわち、０ｍｏｌ％の中性脂質）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、中性脂質を本質的に含まない（すなわち、約０ｍｏｌ％の中性脂質）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、中性リン脂質を含まない（すなわち、０ｍｏｌ％の中性リン脂質）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、中性リン脂質を本質的に含まない（すなわち、約０ｍｏｌ％の中性リン脂質）。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチの中性脂質のｍｏｌ％は、標的中性脂質のｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間の変動性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、脂質成分を１００ｍｏｌ％にするように、アミン脂質、中性脂質、およびＰＥＧ脂質の濃度に基づいて調整される。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、脂質成分を１００ｍｏｌ％にするように、アミン脂質およびＰＥＧ脂質の濃度に基づいて調整される。一実施形態において、ヘルパー脂質のｍｏｌ％は、脂質成分を少なくとも９９ｍｏｌ％にするように、アミン脂質およびＰＥＧ脂質の濃度に基づいて調整される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのヘルパーのｍｏｌ％は、標的ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間の変動性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約２ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約２ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約２．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約３ｍｏｌ％であり得る。一実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約２．５ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、標的ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間の変動性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
特定の実施形態において、カーゴは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ、もしくはＣａｓ９）をコードする核酸、およびｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸、またはｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの組み合わせを含む。一実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａまたはその等価物を含み得る。いくつかの態様において、アミン脂質は、脂質Ａである。いくつかの態様において、アミン脂質は、脂質Ａ等価物、例えば脂質Ａの類似体である。特定の態様において、アミン脂質は、脂質Ａのアセタール類似体である。種々の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質と、中性脂質と、ヘルパー脂質と、ＰＥＧ脂質とを含む。特定の実施形態において、ヘルパー脂質は、コレステロールである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＳＰＣである。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａと、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ＰＥＧ脂質とを含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質と、ＤＳＰＣと、コレステロールと、ＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａ、脂質Ａのアセタール類似体を含む脂質Ａの等価物から選択される。追加の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａと、コレステロールと、ＤＳＰＣと、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとを含む。
種々の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質と、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ＰＥＧ脂質とを含む。種々の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質と、ヘルパー脂質と、中性リン脂質と、ＰＥＧ脂質とを含む。種々の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、およびＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含む。種々の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質と、ヘルパー脂質と、ＰＥＧ脂質とを含む。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、中性リン脂質などの中性脂質を含まない。種々の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、およびＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含む。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＤＳＰＥのうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＳＰＣである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＰＰＣである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＡＰＣである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＭＰＣである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＯＰＣである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＯＰＥである。特定の実施形態において、中性脂質は、ＤＳＰＥである。特定の実施形態において、ヘルパー脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａと、ヘルパー脂質と、ＰＥＧ脂質とを含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａ、ヘルパー脂質、およびＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質と、コレステロールと、ＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａのアセタール類似体を含む、脂質Ａおよび脂質Ａの等価物から選択される。特定の実施形態において、アミン脂質は、脂質ＡのＣ５～Ｃ１２またはＣ４～Ｃ１２アセタール類似体である。追加の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、脂質Ａと、コレステロールと、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとを含む。
本開示の実施形態はまた、封入される核酸のアミン脂質の正に帯電したアミン基（Ｎ）と負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間のモル比に従って記載される脂質組成物を提供する。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表されてもよい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、およびＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、核酸成分とを含んでいてもよく、Ｎ／Ｐ比は、約３～１０である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、およびＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、核酸成分とを含んでいてもよく、Ｎ／Ｐ比は、約３～１０である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、およびヘルパー脂質を含む脂質成分と、ＲＮＡ成分とを含んでいてもよく、Ｎ／Ｐ比は、約３～１０である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、およびＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、ＲＮＡ成分とを含んでいてもよく、Ｎ／Ｐ比は、約３～１０である。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約５～７であってもよい。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約３～７であってもよい。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約４．５～８であってもよい。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、約６であってもよい。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、６±１であってもよい。一実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、６±０．５であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、標的Ｎ／Ｐ比の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間の変動性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分は、核酸、例えば、本明細書に開示される核酸、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載のＣａｓ９ ｍＲＮＡ）をコードする核酸と、本明細書に記載のｇＲＮＡとを含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分は、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ ｍＲＮＡと、本明細書に記載のｇＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分は、本明細書に記載のクラス２Ｃａｓヌクレアーゼ ｍＲＮＡと、本明細書に記載のｇＲＮＡとを含む。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｇＲＮＡは、本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、例えば、本明細書に記載の化学修飾したｓｇＲＮＡであり得る。
特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、上述のＲＮＡ成分と、アミン脂質と、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ＰＥＧ脂質とを含み得る。特定のＬＮＰ組成物において、ヘルパー脂質は、コレステロールであり、中性脂質は、ＤＳＰＣであり、かつ／またはＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。特定の組成物において、アミン脂質は、脂質Ａおよびその等価物、例えば、脂質Ａのアセタール類似体から選択される。一実施形態において、ＬＮＰ組成物の脂質成分は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、およびＰＥＧ脂質からなる。一実施形態において、ＬＮＰ組成物の脂質成分は、アミン脂質、ヘルパー脂質、およびＰＥＧ脂質からなる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む特定の組成物において、ヘルパー脂質は、コレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むいくつかの組成物において、中性脂質は、ＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む特定の組成物は、約１ｍｏｌ％未満の中性脂質、例えば中性リン脂質を含む。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む特定の組成物は、約０．５ｍｏｌ％未満の中性脂質、例えば中性リン脂質を含む。特定の組成物において、ＬＮＰは、中性脂質、例えば、中性リン脂質を含まない。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む追加の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。特定の実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａおよびその等価物、例えば、脂質Ａのアセタール類似体から選択される。
特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡ）と、本明細書に記載の少なくとも１つのｇＲＮＡとを含む。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ）との比が約２５：１～約１：２５である。特定の実施形態において、ＬＮＰ製剤は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ）との比が約１０：１～約１：１０である。特定の実施形態において、ＬＮＰ製剤は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ）との比が約８：１～約１：８である。本明細書で測定される場合、比は、重量基準である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡ）との比が約５：１～約１：５である。いくつかの実施形態において、比の範囲は、約３：１～１：３、約２：１～１：２、約５：１～１：２、約５：１～１：１、約３：１～１：２、約３：１～１：１、約３：１、約２：１～１：１である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡとｍＲＮＡとの比は、約３：１または約２：１である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ）との比は、約１：１である。比は、約２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５であり得る。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＲＮＡ水溶液と有機溶媒系脂質溶液（例えば、１００％エタノール）とを混合することによって形成される。好適な溶液または溶媒は、水、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールを含むか、またはそれらを含有してもよい。例えば、ＬＮＰのインビボ投与のための薬学的に許容される緩衝液を使用してもよい。特定の実施形態において、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ６．５以上に維持するために使用される。特定の実施形態において、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持するために使用される。特定の実施形態において、本組成物は、約７．２～約７．７の範囲のｐＨを有する。追加の実施形態において、本組成物は、約７．３～約７．７の範囲、または約７．４～約７．６の範囲のｐＨを有する。さらなる実施形態において、本組成物は、約７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７のｐＨを有する。組成物のｐＨは、マイクロｐＨプローブで測定されてもよい。特定の実施形態において、凍結保護剤が組成物に含まれる。凍結保護剤の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯ、およびエチレングリコールが挙げられる。例示的な組成物は、例えばスクロースなどの凍結保護剤を最大１０％含んでもよい。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％の凍結保護剤を含んでもよい。特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％のスクロースを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、およびそれらの混合物を含んでもよい。特定の例示的な実施形態において、緩衝液は、ＮａＣｌを含む。特定の実施形態において、ＮａＣｌは、省かれる。ＮａＣｌの例示的な量は、約２０ｍＭ～約４５ｍＭの範囲であってもよい。ＮａＣｌの例示的な量は、約４０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌの量は、約４５ｍＭである。いくつかの実施形態において、緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液である。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約２０ｍＭ～約６０ｍＭの範囲であってもよい。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓの量は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ＮａＣｌおよびＴｒｉｓを含む。ＬＮＰ組成物の特定の例示的な実施形態は、Ｔｒｉｓ緩衝液中に５％のスクロースと４５ｍＭのＮａＣｌを含有する。他の例示的な実施形態において、組成物は、約５％ ｗ／ｖの量のスクロースと、約４５ｍＭのＮａＣｌと、約５０ｍＭのＴｒｉｓをｐＨ７．５で含有する。塩、緩衝液、および凍結保護剤の量は、製剤全体の浸透圧が維持されるように変化させてもよい。例えば、最終浸透圧は、４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持されてもよい。さらなる実施形態において、浸透圧は、３５０～２５０ｍＯｓｍ／Ｌである。特定の実施形態は、３００±２０ｍＯｓｍ／Ｌの最終浸透圧を有する。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体混合、Ｔ混合、または交差混合が使用される。特定の態様において、流速、接合部のサイズ、接合部の幾何形状、接合部の形状、管の直径、溶液、および／またはＲＮＡおよび脂質の濃度を変化させてもよい。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物は、例えば、透析、タンジェンシャルフロー濾過、またはクロマトグラフィーを介して濃縮または精製してもよい。ＬＮＰは、例えば、懸濁液、エマルション、または凍結乾燥粉末として保存してもよい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は２～８℃で保存され、特定の態様において、ＬＮＰ組成物は室温で保存される。追加の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、例えば－２０℃または－８０℃で冷凍保存される。他の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、約０℃～約－８０℃の範囲の温度で保存される。凍結ＬＮＰ組成物は、使用前に、例えば氷上で、室温で、または２５℃で解凍してもよい。
ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（単層および多層の小胞、例えば、いくつかの実施形態において、実質的に球形であり、より特定の実施形態において、水性コアを含み得る「リポソーム」ラメラ相脂質二重層を含み、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であってよい。
さらに、ＬＮＰ組成物は、治療上有効な用量でインビボにおいて細胞毒性レベルまで蓄積しないという点で生分解性である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、治療用量レベルで実質的な有害作用をもたらす自然免疫応答を引き起こさない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＬＮＰ組成物は、治療用量レベルで毒性を引き起こさない。
いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０．００５～約０．７５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０．０１～約０．５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０～約０．４の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０～約０．３５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０～約０．３５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０～約０．３の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０～約０．２５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０～約０．２の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、約０．０８、０．１、０．１５、０．２、または０．４未満であってもよい。
本明細書に開示されるＬＮＰは、サイズ（例えば、Ｚ平均直径）が約１～約２５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約１０～約２００ｎｍである。さらなる実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約２０～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約６０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１００ｎｍである。別に指示されない限り、本明細書で言及されるすべてのサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒでの動的光散乱によって測定されるような、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料は、カウント数がおよそ２００～４００ｋｃｐとなるように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈される。データは、強度測定値の加重平均（Ｚ平均直径）として提示される。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約５０％～約１００％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約５０％～約７０％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約７０％～約９０％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約９０％～約１００％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約７５％～約９５％の範囲の平均封入効率で形成される。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約１．００Ｅ＋０５ｇ／ｍｏｌ～約１．００Ｅ＋１０ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約５．００Ｅ＋０５ｇ／ｍｏｌ～約７．００Ｅ＋０７ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約１．００Ｅ＋０６ｇ／ｍｏｌ～約１．００Ｅ＋１０ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約１．００Ｅ＋０７ｇ／ｍｏｌ～約１．００Ｅ＋０９ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約５．００Ｅ＋０６ｇ／ｍｏｌ～約５．００Ｅ＋０９ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量で形成される。
いくつかの実施形態において、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ、重量平均モル質量（Ｍｗ）対数平均モル質量（Ｍｎ）の比）は、約１．０００～約２．０００の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｍｗ／Ｍｎは、約１．００～約１．５００の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｍｗ／Ｍｎは、約１．０２０～約１．４００の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｍｗ／Ｍｎは、約１．０１０～約１．１００の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｍｗ／Ｍｎは、約１．１００～約１．３５０の範囲であってもよい。
本開示のＬＮＰの多分散指数（「ｐｄｉ」）およびサイズを特性決定するために、動的光散乱（「ＤＬＳ」）を使用することができる。ＤＬＳは、試料を光源に供した結果として生じる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から決定されたＰＤＩは、集合体内の粒径（平均粒径付近）の分布を表し、完全に均一な集合体のＰＤＩはゼロである。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、０．００５～０．７５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、０．０１～０．５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、０．０２～０．４の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、０．０３～０．３５の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、ｐｄｉは、０．１～０．３５の範囲であってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＬＮＰは、サイズが１～２５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが１０～２００ｎｍである。さらなる実施形態において、ＬＮＰは、サイズが２０～１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが５０～１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが５０～１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが５０～１２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが７５～１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、サイズが３０～２００ｎｍである。別に指示されない限り、本明細書で言及されるすべてのサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒでの動的光散乱によって測定されるような、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料は、カウント数がおよそ２００～４００ｋｃｔとなるように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈される。データは、強度測定値の加重平均として提示される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、５０％～１００％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、５０％～７０％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、７０％～９０％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、９０％～１００％の範囲の平均封入効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、７５％～９５％の範囲の平均封入効率で形成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と会合するＬＮＰは、ＡＴＴＲを治療するための医薬の調製において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と会合するＬＮＰは、ＡＴＴＲを有する対象においてアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積および凝集を低減もしくは予防するための医薬の調製において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と会合するＬＮＰは、血清ＴＴＲ濃度を低減するための医薬の調製において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と会合するＬＮＰは、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどの霊長類においてＡＴＴＲを治療する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と会合するＬＮＰは、ＡＴＴＲを有する対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどの霊長類においてアミロイドもしくはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積および凝集を低減もしくは予防する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と会合するＬＮＰは、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなどの霊長類において血清ＴＴＲ濃度を低減する際に使用するためのものである。
エレクトロポレーションも、カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達のために、任意のエレクトロポレーション方法論が使用され得る。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションを使用して、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよびＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼまたはＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸のうちのいずれか１つを送達し得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のうちのいずれか１つをエクスビボで細胞に送達するための方法であって、ｇＲＮＡおよび核酸がＬＮＰと会合している、方法を含む。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、およびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等のヌクレアーゼであってもよい）をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸と、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１であってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸と、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９であってもよい。一実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列のすべてまたは一部が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、さらにベクター配列を含んでいてもよく、ここで、ベクター配列は、自然状態ではｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡとともに見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのベクター内の非連続核酸によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、連続核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の反対側の鎖によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同一の鎖によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、環状であってもよい。他の実施形態において、ベクターは直線状であってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシド内に封入され得る。非限定的な例示的なベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターを含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、その野生型の対応物から遺伝子組換えされていてもよい。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを促進するため、またはベクターの１つ以上の特性を変更するようにするため、挿入、欠失、または１つ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。このような特性は、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組み込み、複製、転写、および翻訳を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムの一部分は，より大きいサイズを有する外来性配列をパッケージングすることができるように、削除され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、増強した形質導入効率を有し得る。いくつかの実施形態において、宿主におけるウイルスによって誘発される免疫応答は低減され得る。いくつかの実施形態において、宿主ゲノムへのウイルス配列の組み込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグレース等）は、ウイルスを非組み込み性になるようにするために変異され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは複製欠損であってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動する外来性の転写または翻訳の制御配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスはヘルパー依存性であってよい。例えば、増幅しベクターをウイルス粒子にパッケージングするのに必要とされるウイルスの構成要素（例えばウイルスタンパク質）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。このような場合、ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー構成要素は、本明細書において記載されるベクター系とともに宿主細胞に導入され得る。他の実施形態において、ウイルスはヘルパーフリーであってよい。例えば、ウイルスは、一切のヘルパーウイルスなしで増幅し、ベクターをパッケージングすることが可能であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるベクター系は、ウイルス増幅およびパッケージングに必要なウイルスの構成要素をもコードすることもできる。
非限定的な例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶＬＫ０３である。他の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスは非組み込み性であってよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、すべてのコードウイルス領域が、５’および３’の末端逆位配列（ＩＴＲ）から離れており、パッケージングシグナル（「Ｉ」）がウイルスから削除されてそのパッケージング能力が増加している、高クローニング能、または「ガットレス」アデノウイルスであってよい。さらに他の実施形態において、ウイルスベクターは、ＨＳＶ－１ベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＳＶ－１に基づいたベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態において、それはベクター依存性ではない。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのために構造的な構成要素を有するヘルパーウイルスを必要とし、一方で、非必須のウイルス機能を除去した３０ｋｂ－欠失ＨＳＶ－１は、ヘルパーウイルスを必要としない。追加の実施形態において、ウイルスベクターは、バクテリオファージＴ４であってもよい。いくつかの実施形態において、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部が空であるとき、任意の直線状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージングすることができる。さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。なおもさらなる実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態において、本明細書において開示されるようなベクター系のすべての構成要素を送達するために１つを超えるベクターを使用する必要がある可能性がある。例えば、１つのＡＡＶベクターは、ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードする配列を含有していてもよく、一方、第２のＡＡＶベクターは、１つ以上のガイド配列を含有していてもよい。
いくつかの実施形態において、ベクターは、細胞内において１つ以上のコード配列の発現を駆動することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば細菌細胞などの原核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞などの真核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、真核生物細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、真核生物細胞は、げっ歯類細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、真核生物細胞は、ヒト細胞であってもよい。異なる種類の細胞における発現を駆動するための好適なプロモーターは、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、プロモーターは野生型であってもよい。他の実施形態において、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために修飾されていてもよい。さらに他の実施形態において、プロモーターは短縮されているが、なおもその機能を維持していてもよい。例えば、プロモーターは、ウイルスへのベクターの適切なパッケージングのために、通常の細部または低減されたサイズを有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書において記載されるヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターによってコードされるヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質であってよい。いくつかの実施形態において、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含み得る。他の実施形態において、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つを超えるコピーを含み得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列へと作動可能に連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つプロモーターへと作動可能に連結されていてもよい。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的、誘導性、または組織特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリゼリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子α（ＥＦ１ａ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能性フラグメント、または先行するいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、短縮型ＣＭＶプロモーターであってもよい。他の実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓での発現に特異的なプロモーターであってもよい。
ベクターは、本明細書において記載されるガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含む。他の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つより多いコピーを含む。１つより多いガイドＲＮＡを有する実施形態において、ガイドＲＮＡは、それらが非同一であり、異なる標的配列を標的化するようであってもよく、それらが同一の標的配列を標的化する点において同一であってもよい。ベクターが１つより多いガイドＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、各ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼとの複合体（例えば、Ｃａｓ ＲＮＰ複合体）内の活性または安定性などの他の異なる特性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲなどの少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列に作動可能に連結されていてもよい。一実施形態において、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３、またはｔＲＮＡキメラであってもよい。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照のこと。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識され得る。ＰｏｌＩＩＩプロモーターの非限定的な例は、Ｕ６およびＨ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。他の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターへと作動可能に連結され得る。１つより多いガイドＲＮＡを有する実施形態において、発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同一または異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドおよびガイドＲＮＡのｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のベクター上に提供され得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドおよびｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは単一の転写産物へと転写され得る。例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡを形成するように単一の転写産物から加工され得る。あるいは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと転写され得る。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、同一のベクター上のそれらの対応するプロモーターによって駆動され得る。さらに他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、異なるベクターによってコードされ得る。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む同一のベクター上に配置され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼの発現は、それら自身の対応するプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼの発現を駆動する同一のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼの転写産物は、単一の転写産物内に含まれてもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼの転写産物の非翻訳領域（ＵＴＲ）内にあってもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写産物の５’ＵＴＲ内にあってもよい。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写産物の３’ＵＴＲ内にあってもよいいくつかの実施形態において、転写産物の細胞内半減期は、その３’ＵＴＲ内にガイドＲＮＡを含み、それによって３’ＵＴＲの長さを短縮することによって低減することができる。追加の実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写産物のイントロン内にあってもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡが転写産物から適切にスプライシングされるように、ガイドＲＮＡが内部に位置するイントロンにおいて、好適なスプライス部位が追加され得る。いくつかの実施形態において、一時的に非常に近接した同じベクターからのＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの発現は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体のより効率的な形成を促進し得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、ベクター系を含む。いくつかの実施形態において、ベクター系は、１つの単一のベクターを含み得る。他の実施形態において、ベクター系は、２つのベクターを含み得る。追加の実施形態において、ベクター系は３つのベクターを含み得る。異なるガイドＲＮＡが多重化のために使用されるとき、またはガイドＲＮＡの複数のコピーが使用されるとき、ベクター系は、３つを超えるベクターを含み得る。
いくつかの実施形態において、ベクター系は、それが標的細胞に送達した後にのみ発現を開始するために、誘導性プロモーターを含み得る。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。
追加の実施形態において、ベクター系は、それが特異的な組織に送達した後にのみ発現を開始するために、組織特異的プロモーターを含み得る。
ベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、または微小胞によって送達され得る。ベクターはまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって送達されてもよい。例えば、それらの内容がそれぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月５日に公開され、「ＬＩＰＩＤ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」という名称のＷＯ２０１７／１７３０５４、および２０１９年４月４日に公開され、「ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」という名称のＷＯ２０１９０６７９９２Ａ１を参照されたい。本明細書に記載されるＬＮＰおよびＬＮＰ製剤のうちのいずれも、ガイドを単独で、またはｃａｓヌクレアーゼまたはｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸とともに送達するのに好適である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分と脂質成分とを含み、脂質成分が、アミン脂質と、中性脂質と、ヘルパー脂質と、ステルス脂質とを含み、Ｎ／Ｐ比が約１～１０である、ＬＮＰ組成物が包含される。
場合によっては、脂質成分は、脂質Ａまたはそのアセタール類似体と、コレステロールと、ＤＳＰＣと、ＰＥＧ－ＤＭＧとを含み、Ｎ／Ｐ比は、約１～１０である。いくつかの実施形態において、脂質成分は、約４０～６０ｍｏｌ％のアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約３～１０である。いくつかの実施形態において、脂質成分は、約５０～６０ｍｏｌ％のアミン脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質とを含み、脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約３～８である。場合によっては、脂質成分は、約５０～６０ｍｏｌ％のアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、約２．５～４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質とを含み、脂質成分の残りが、コレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約３～８である。場合によっては、脂質成分は、４８～５３ｍｏｌ％の脂質Ａと、約８～１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、約１．５～１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質とを含み、脂質成分の残りが、コレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、３～８±０．２である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、脂質成分を含み、脂質成分は、約５０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣなどの中性脂質と、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質などのステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）とを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、脂質成分の残りが、コレステロールなどのヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６である。いくつかの実施形態において、アミン脂質は、脂質Ａである。いくつかの実施形態において、中性脂質は、ＤＳＰＣである。いくつかの実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ脂質である。いくつかの実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、脂質成分を含み、脂質成分は、約５０ｍｏｌ％の脂質Ａと、約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとを含み、脂質成分の残りが、コレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、全身的に送達され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、肝循環に送達され得る。
この説明および例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において、別に指示されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、パーセンテージ、または割合、および他の数値を表すすべての数字は、どの場合においても用語「約」によって、まだそれほど非修飾である範囲により修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、および均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、および任意の単語の単数形の使用は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含めることに留意されたい。本明細書で使用される「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形は、リスト内のアイテムの列挙が、リストされたアイテムに置換または追加できる他の同様のアイテムを除外しないように、非限定的であることを意図している。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
一般的な試薬および方法
別に指示されない限り、ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡテンプレートおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によって合成した。転写は、一般に、Ｔ７プロモーター、配列番号２４３（配列番号２０４のＲＮＡ ＯＲＦをコードする）などの本明細書に開示される転写配列、およびプラスミドにコードされるポリＡテール（配列番号２６３）を含む構築物から行われた。
すべての方法について、転写産物濃度を、２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
ＬＮＰ製剤化
脂質成分を、以下に記載される脂質成分モル比で１００％エタノールに溶解した。化学修飾したｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを組み合わせ、２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解し、およそ０．４５ｍｇ／ｍＬの全ＲＮＡカーゴ濃度を得た。ＬＮＰを、約６のＮ／Ｐ比で、以下に記載されるように、１：２ ｗ／ｗ比での化学修飾したｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの比で、製剤化した。別に指示されない限り、ＬＮＰを、５０％の脂質Ａ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール、および３％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧで製剤化した。
エタノール中の脂質と、２体積部のＲＮＡ溶液と、１体積部の水とを衝突噴流混合することによって、ＬＮＰを形成した。エタノール中の脂質を、交差混合により、２体積部のＲＮＡ溶液と混合する。第４の水の流れを、インラインティーを通る交差の出力流と混合する。（例えば、ＷＯ２０１６／０１０８４０、図２を参照のこと）。差圧式流量を使用して混合する間、水性溶媒と有機溶媒の２：１の比を維持した。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（およそ１：１ ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でタンジェンシャルフロー濾過を使用して濃縮し、次いで、透析濾過により、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）へと緩衝液を交換した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または－８０℃で保存した。
ＬＮＰ組成分析
本開示のＬＮＰの多分散指数（「ｐｄｉ」）およびサイズを特性決定するために、動的光散乱（「ＤＬＳ」）を使用する。ＤＬＳは、試料を光源に供した結果として生じる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から決定されたＰＤＩは、集合体内の粒径（平均粒径付近）の分布を表し、完全に均一な集合体のＰＤＩはゼロである。
電気泳動光散乱を使用して、指定のｐＨでのＬＮＰの表面電荷を特性決定する。表面電荷、すなわちゼータ電位は、ＬＮＰ懸濁液中の粒子間の静電反発／引力の大きさの尺度である。
非対称フローフィールドフローフラクショネーション－マルチアングル光散乱（ＡＦ４－ＭＡＬＳ）を使用して、流体力学的半径によって組成物内の粒子を分離させた後、分画された粒子の分子量、流体力学半径、および二乗平均平方根半径を測定する。これにより、分子量および粒度分布、ならびにＢｕｒｃｈａｒｄ－Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒ Ｐｌｏｔ（粒子の内部コア密度を示唆する時間経過に伴う流体力学半径に対する二乗平均平方根（「ｒｍｓ」）半径の比）、およびｒｍｓコンフォメーションプロット（分子量のｌｏｇに対するｒｍｓ半径のｌｏｇ、得られる線形フィッティングの傾きが、伸長性に対する圧縮性の程度を与える）などの二次的特徴を評価することが可能になる。
ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を使用して、粒度分布および粒子濃度を決定することができる。ＬＮＰ試料を適切に希釈し、顕微鏡スライドに注入する。粒子が視野を通ってゆっくりと注がれるときに、カメラにより散乱光を記録する。動画をキャプチャした後、ナノ粒子トラッキング分析により、ピクセルをトラッキングし、拡散係数を計算することによって動画を処理する。この拡散係数は、粒子の流体力学半径に変換することができる。また、この装置により、分析で計数された個々の粒子の数を計数し、粒子濃度を得る。
低温電子顕微鏡（「ｃｒｙｏ－ＥＭ」）を使用して、ＬＮＰの粒径、形態、および構造特性を決定することができる。
ＬＮＰの脂質組成分析は、液体クロマトグラフィーと、それに続く帯電エアロゾル検出（ＬＣ－ＣＡＤ）から決定することができる。この分析により、実際の脂質含有量と理論上の脂質含有量との比較を提供することができる。
ＬＮＰ組成物は、平均粒径、多分散指数（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、ＲＮＡの封入効率、およびゼータ電位について分析される。ＬＮＰ組成物は、脂質分析、ＡＦ４－ＭＡＬＳ、ＮＴＡ、および／またはｃｒｙｏ－ＥＭによってさらに特性決定され得る。平均粒径および多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＤＬＳ装置を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。ＬＮＰ試料をＰＢＳ緩衝液で希釈した後、ＤＬＳにより測定した。平均粒径の強度に基づく測定であるＺ平均直径を、数平均直径およびｐｄｉとともに報告する。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ装置も、ＬＮＰのゼータ電位を測定するために使用される。試料は、測定前にｐＨ７．４の０．１×ＰＢＳで１：１７に（５０μＬを８００μＬに）希釈する。
蛍光に基づくアッセイ（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ＲＮＡ濃度および遊離ＲＮＡを決定する。封入効率を、（全ＲＮＡ－遊離ＲＮＡ）／全ＲＮＡとして計算する。ＬＮＰ試料は、０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む１×ＴＥ緩衝液で適切に希釈して全ＲＮＡを決定するか、１×ＴＥ緩衝液で遊離ＲＮＡを決定する。標準曲線を、組成物の作製に使用した開始ＲＮＡ溶液を利用することによって作成し、１×ＴＥ緩衝液±０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で希釈する。次に、Ｄｉｌｕｔｅｄ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（製造業者の使用説明書に従う）を標準物および試料の各々に添加して、遮光状態で、室温でおよそ１０分間インキュベートする。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、励起波長、自動カットオフ波長、および発光波長をそれぞれ４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、および５２５ｎｍに設定して試料を読み取る。全ＲＮＡおよび遊離ＲＮＡを、適切な標準曲線から決定する。
封入効率を、（全ＲＮＡ－遊離ＲＮＡ）／全ＲＮＡとして計算する。ＤＮＡ由来のカーゴ成分の封入効率を決定するために同じ手順を使用してもよい。蛍光に基づくアッセイでは、一本鎖ＤＮＡの場合はＯｌｉｇｒｅｅｎ Ｄｙｅを使用してもよく、二本鎖ＤＮＡの場合はＰｉｃｏｇｒｅｅｎ Ｄｙｅを使用してもよい。あるいは、全ＲＮＡ濃度は、逆相イオン対形成（ＲＰ－ＩＰ）ＨＰＬＣ法によって決定することができる。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用してＬＮＰを破壊し、ＲＮＡを放出する。次いで、ＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって、脂質成分からクロマトグラフィーによってＲＮＡを分離し、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用して、標準曲線に対して定量化する。
ＡＦ４－ＭＡＬＳを使用して、分子量および粒度分布、ならびにそれらの計算からの二次統計を調べる。ＬＮＰを必要に応じて希釈し、ＨＰＬＣオートサンプラーを使用してＡＦ４分離チャネルに注入し、これらを集束させ、次いで、チャネルを横切るクロスフローにおいて、指数関数的勾配で溶出させる。すべての流体は、ＨＰＬＣポンプおよびＷｙａｔｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによって駆動される。ＡＦ４チャネルから溶出する粒子は、ＵＶ検出器、マルチアングル光散乱検出器、準弾性光散乱検出器、および示差屈折率検出器を通過する。生データを、Ｄｅｂｅｙｅモデルを使用することによって処理して、検出器信号から分子量およびｒｍｓ半径を決定する。
ＬＮＰの脂質成分を、帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）に接続したＨＰＬＣによって定量的に分析する。４つの脂質成分のクロマトグラフィー分離を逆相ＨＰＬＣによって達成する。ＣＡＤは、すべての不揮発性化合物を検出する破壊質量系検出器であり、分析対象物の構造に関係なく信号は一貫している。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡカーゴ
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡカーゴを、インビトロ転写によって調製した。キャップされたポリアデニル化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、以下のような方法を使用して、線状プラスミドＤＮＡテンプレートおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。Ｔ７プロモーターおよび９０～１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有するプラスミドＤＮＡを、２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、および１ｘ反応緩衝液の条件で、ＸｂａＩとともに３７℃で２時間インキュベートすることによって線状化する。ＸｂａＩを、反応物を６５℃で２０分間加熱することによって不活性化する。線状プラスミドを、酵素および緩衝塩から精製する。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件下、３７℃で１．５～４時間インキュベートすることによって行う。５０ｎｇ／μＬの線状プラスミド、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々、２～５ｍＭ、１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１ｘ反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、ＴＦＦおよび／またはＬｉＣｌ沈殿を含む方法で精製した。
以下の実施例のｓｇＲＮＡを、ホスホラミダイトを使用して既知の方法によって化学的に合成した。
ＬＮＰによるインビトロでのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの送達
初代ヒト肝臓肝細胞（ＰＨＨ）（Ｇｉｂｃｏ）ならびに初代カニクイザル肝臓肝細胞（ＰＣＨ）（ＩｎＶｉｔｒｏ Ａｄｍｅｔ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓ）を解凍し、追加物質（Ｇｉｂｃｏ、カタログＣＭ７５００）を含む肝細胞解凍培地に再懸濁させ、次いで、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を、肝細胞プレーティング培地および追加物質パック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２１７６０１およびＣＭ３０００）に再懸濁させた。細胞を計数し、ＰＨＨについては３３，０００細胞／ウェル、ＰＣＨについては５０，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ－ｃｏａｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉでコーティングした９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８７７２７２）上にプレーティングした。プレーティングした細胞を、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気での組織培養インキュベーター中で５時間放置し、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について調べ、肝細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２１７６０１およびＣＭ４０００）で１回洗浄した。
ＰＨＨおよびＰＣＨを、以下にさらに記載されるように、ＬＮＰで処理した。ＬＮＰで処理する前に、細胞株を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＬＮＰを、３％カニクイザル血清または３％ウシ胎児血清を含む培地中、３７℃で５分間インキュベートし、本明細書でさらに提供される量で細胞に投与した。
ゲノムＤＮＡ単離
処理した細胞を、処理後７２時間で採取した。細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルから、５０μＬ／ウェルのＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログＱＥ０９０５０）を使用して、製造業者のプロトコルに従って溶解させた。すべてのＤＮＡ試料に対し、本明細書に記載されるように、ＰＣＲおよびその後のＮＧＳ分析を行った。
ＮＧＳシークエンシング
簡単に述べると、ゲノム中の標的位置での編集効率を定量的に決定するために、ゲノムＤＮＡが単離され、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入および欠失の存在を同定した。
標的部位（例えば、ＴＴＲ）の周りのＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。シークエンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のプロトコルに従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシークエンシングした。低品質スコアを有するものを除外した後に、リードを適切な参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８、ｍａｃＦａｓ５）とアラインメントした。得られたリードを含むファイルを、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、目的の標的領域と重なり合うリードを選択し、挿入、置換、もしくは欠失を含むリードの数に対する、野生型リードの数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」および「編集パーセント」）は、野生型を含む配列リードの総数に対する、挿入もしくは欠失を有する配列リードの総数として定義される。
実施例１－初代肝細胞におけるＣａｓ９ ｍＲＮＡのＬＮＰ送達による用量応答
様々なガイドおよびｍＲＮＡの組み合わせの有効性を、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）および初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）においてインビトロで評価した。ＰＨＨおよびＰＣＨ細胞を上述のようにプレーティングし、次いで、表８および９にそれぞれ記載されるように様々な用量のＬＮＰで処理した。ＬＮＰは、ｍＲＮＡとしてＧ０００５０２（配列番号１１４）と、ｍＲＮＡ０００００１（配列番号１）またはｍＲＮＡ００００４２（配列番号３７７）のいずれかとを含有していた。７２時間後に細胞を溶解し、編集％をＮＧＳにより決定した。各状態を３回に分けてアッセイし、表８および９は、編集％についての平均および標準偏差を示す。
Figure 2022525428000042
Figure 2022525428000043
実施例２－初代肝細胞におけるＣａｓ９ ｍＲＮＡのＬＮＰ送達による用量応答
ＰＣＨおよびＰＨＨ細胞において、様々なガイドおよびｍＲＮＡの組み合わせをインビトロで評価した。２名のドナー由来のＰＨＨ細胞と、ＰＣＨ細胞を、上述のようにプレーティングし、表１０および１１にそれぞれ記載される用量のＬＮＰで処理した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ００００４２（配列番号３７７）と、４つのシングルガイドＲＮＡのうちの１つとを含有していた。ガイドＧ０００４８０およびＧ０００４８６（配列番号８７および９３）は、ヒトＴＴＲ遺伝子を完全に標的とする。ガイドＧ０００５０２（配列番号１１４）は、標的化領域内で単一のミスマッチを有するヒトＴＴＲ遺伝子を標的とする。Ｇ０００７３９（配列番号２）は、陰性対照である。７２時間後に細胞を溶解し、編集％をＮＧＳにより決定した。各条件を３回に分けてアッセイした。表１０および図１は、ＰＨＨ細胞における編集％の結果を示す。表１１および図２は、ＰＣＨ細胞における編集％の結果を示す。
Figure 2022525428000044
Figure 2022525428000045
Figure 2022525428000046
Figure 2022525428000047
実施例３－追加のｍＲＮＡの特性決定
本実施例の材料および方法は、２０１８年９月２８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３４３９号に記載されている通りであった。異なるコドンスキームを使用するＣａｓ９配列を、改善されたタンパク質発現を試験するように設計した。各配列を、別個のコドンセットを使用して、配列番号２０３のＣａｓ９アミノ酸をコードするように設計した。各オープンリーディングフレーム配列において、単一のコドンを使用して、各アミノ酸をコードした。配列は、ＮＣＢＩ－ＧｅｎＢａｎｋ Ｆｌａｔ Ｆｉｌｅ Ｒｅｌｅａｓｅ １６０．０（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２９２、Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ），Ｄ１６－２０）に基づくＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓにおける完全なタンパク質コード遺伝子内に生じるコドンの頻度と、コドンの中の特定のヌクレオチドの存在量に基づいて変動する。表５に示されるコドンスキームに基づいて、配列番号２０３のＣａｓ９タンパク質をコードする、Ｃａｓ９のためのいくつかの異なるオープンリーディングフレーム（配列番号２５２、３１１、および３１２）を構築した。これらを、ＨＳＤ ５’ＵＴＲ（配列番号２４１）、アルブミン３’ＵＴＲ、Ｔ７プロモーター、およびポリＡテールも含有する構築物に組み込んだ。アルブミン３’ＵＴＲおよびポリＡテールを含有する例示的な配列は、配列番号２５３であり、３’ＵＴＲおよびポリＡテールは、配列番号２５２のＨＳＤ ５’ＵＴＲおよびＯＲＦに続く。
ウリジンの代わりに１００％のＮ１－メチルシュードウリジンを使用して、ＩＶＴによって各構築物についてメッセンジャーＲＮＡを作製した。ＨｅｐＧ２細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、８００ｎｇの各々のＣａｓ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションから６時間後、細胞を凍結解凍によって溶解させ、遠心分離によって透明化した。ＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｃａｓ９タンパク質レベルを決定した。簡潔に述べると、総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイによって決定された。ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６－ウェルＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＳＥＣＴＯＲ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログＬ１５ＳＡ－１）を、Ｃａｓ９マウス抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログＣＦ８１１１７９）を捕捉抗体として、かつＣａｓ９（７Ａ９－３Ａ３）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ１４６９７）を検出抗体として使用して、製造業者のプロトコルに従って調製した。組換えＣａｓ９タンパク質を、１Ｘ Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ，ＥＤＴＡ－Ｆｒｅｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ７８４３７）を使用し、Ｄｉｌｕｅｎｔ ３９（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中の較正標準として使用した。ＥＬＩＳＡプレートを、Ｍｅｓｏ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ１２０装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して読み取り、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０ソフトウエアパッケージ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてデータを分析した。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）を標的とするガイド（Ｇ５０２、配列番号１１４）とともにｍＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、編集パーセントを測定することにより、インビトロで編集効率を評価した。表１２に示される配列番号を含むＣａｓ９ ｍＲＮＡを、３ｎｇ～１００ｎｇのｍＲＮＡ濃度で評価した。未処理の細胞は、測定可能な編集を示さなかった。表１２は、インビトロでのＣａｓ９タンパク質発現および編集に対する異なるコドンセットの効果を示す。
Figure 2022525428000048
インビボでのコドンスキームの有効性を決定するために、Ｃａｓ９タンパク質発現を、表４に記載のコドンスキームを使用して、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡからインビボで発現する場合に測定した。表２６に示されるメッセンジャーＲＮＡを、ＴＴＲを標的とするガイドＲＮＡ（Ｇ２８２、配列番号２４２）を有するＬＮＰとして製剤化した。ＬＮＰは、クロスフロー手順を使用して組み立てられ、それぞれ、５０％の脂質Ａ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール、および３％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを５０：３８：９：３のモル比で含有し、Ｎ：Ｐ比は６．０であった。ＬＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ ＰＤ－１０フィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、０．３２ｍｇ／ｍｌの濃度（ＬＮＰ濃度）で使用した。ＣＤ－１雌マウス（１群当たりｎ＝５）に、１ｍｐｋを静脈内投与した。投与後３時間で、動物を安楽死させ、肝臓を採取し、肝臓におけるＣａｓ９発現を測定した。Ｃａｓ９タンパク質発現を、上に記載のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、肝臓において測定した。およそ４０～５０ｍｇの肝臓組織を、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ＢＰ－１１５）中のビーズミルによって、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ１１８３６１７０００１）で均質化した。表１３は、肝臓におけるＣａｓ９発現結果を示す。低Ａおよび低Ａ／Ｕコドンスキーム（配列番号３１１および３１２のＯＲＦ）についてのｍＲＮＡは、試験したＯＲＦのうち最も高いＣａｓ９発現を示した。陰性対照のＣａｓ９タンパク質発現は、定量化の下限（ＬＬＯＱ）未満であった。
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インビボでのコドンスキームの有効性を決定するために、ゲノム編集を、異なるコドンスキームを使用して、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡからインビボで測定した。表２７に示されるメッセンジャーＲＮＡを、ＴＴＲを標的とするガイドＲＮＡ（Ｇ２８２、配列番号２４２）を有するＬＮＰとして製剤化した。ＬＮＰは、クロスフロー手順を使用して組み立てられ、それぞれ、５０％の脂質Ａ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール、および３％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを５０：３８：９：３のモル比で含有し、Ｎ：Ｐ比は６．０であった。ＬＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ ＰＤ－１０フィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度（ＬＮＰ濃度）で使用した。ＣＤ－１雌マウス（１群当たりｎ＝５、配列番号２５２で治療した群のｎ＝４を除く）に、０．１ｍｐｋを静脈内投与した。投与後６日目に、動物を安楽死させ、血液および肝臓を採取し、血清ＴＴＲおよび肝臓編集を測定した。表１４は、インビボ編集結果および血清ＴＴＲレベルを示す。
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異なるｍＲＮＡ濃度でのコドンスキームの有効性を決定するために、インビボ用量応答実験を行った。表１５に示されるメッセンジャーＲＮＡを、ＴＴＲを標的とするガイドＲＮＡ（Ｇ２８２、配列番号２４２）を有するＬＮＰとして製剤化した。ＬＮＰは、クロスフロー手順を使用して組み立てられ、５０％の脂質Ａ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール、および３％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含有していた。ＬＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ ＰＤ－１０フィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを使用して精製し、０．７ｍｇ／ｍｌの濃度（ＬＮＰ濃度）で使用した。ＣＤ－１雌マウス（１群当たりｎ＝５）に、０．０３、０．１、または０．３ｍｐｋを静脈内投与した。投与後７日目に、動物を安楽死させ、血液および肝臓を採取し、血清ＴＴＲおよび肝臓編集を測定した。表１４は、インビボ編集結果および血清ＴＴＲレベルを示す。
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異なるＵＴＲを有するコドンスキームの有効性を決定するために、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡの投与後にインビボでゲノム編集をインビボで測定した。表１５に示されるメッセンジャーＲＮＡを、ＴＴＲを標的とするガイドＲＮＡ（Ｇ２８２、配列番号２４２）を有するＬＮＰとして製剤化した。ＬＮＰは、クロスフロー手順を使用して組み立てられ、それぞれ、５０％の脂質Ａ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール、および３％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを５０：３８：９：３のモル比で含有し、Ｎ：Ｐ比は６．０であった。ＬＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ ＰＤ－１０フィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度（ＬＮＰ濃度）で使用した。ＣＤ－１雌マウス（１群当たりｎ＝５、配列番号２４３編集についてｎ＝４）に、０．１ｍｐｋを静脈内投与した。投与後６日目に、動物を安楽死させ、血液および肝臓を採取し、血清ＴＴＲおよび肝臓編集を測定した。表１６は、インビボ編集および血清ＴＴＲの結果を示す。
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実施例４－カニクイザルにおける３０分間および２時間の静脈内注入を介して投与した複数回用量ＬＮＰ研究
ｎ＝３のコホートの雄のカニクイザルに、ＬＮＰまたはビヒクル対照投与の少なくとも１時間前に、２ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス注射を介してデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を投与した。各コホートは、ＮＨＰ当たり３ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を提供するために、様々な用量のＬＮＰを摂取した。投薬群を表１７に示す。２つのコホートは、注入時間を比較するために、３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を摂取した。製剤は、ｇＲＮＡ：ｍＲＮＡ比が重量基準で１：２で、配列番号３７７を含むＣａｓ９ ｍＲＮＡ）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）Ｇ０００５０２（配列番号１１４）を含有していた。３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量（全ＲＮＡ含有量）を摂取したコホートに、３０分間または１２０分間の静脈内注入によって投与した。様々な用量のＬＮＰ（単位ｍｇ／ｋｇ、全ＲＮＡ含有量）を有する他のコホートはすべて、１２０分間の静脈内注入によって投与した。
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投与後２９日目に、ケタミン／キシラジンの筋肉内注射下で、１６ゲージのＳｕｐｅｒＣｏｒｅ生検ニードルを使用して、肝臓の右葉／側面を標的とする単一の超音波ガイド下経皮生検により、肝臓検体を収集した。動物ごとに、１．０ｃｍ３～１．５ｃｍ３の全肝生検試料を収集した。各生検検体を液体窒素中でフラッシュ凍結させ、－８０℃で保存した。前述のように、肝臓検体の編集分析をＮＧＳシークエンシングによって行った。肝臓編集の結果、最大約７０％の編集が実証された。記載され
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肝臓試料を生検し、それぞれ、表１８および図３Ａ～図３Ｂならびに表１９および図３Ｃにみられるように、編集パーセントデータ、血清ＴＴＲデータ、およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルについて分析した。肝臓編集および血清ＴＴＲデータの結果は、３０分間の注入時間による３ｍｇ／ｋｇ用量と、１２０分間の注入時間による３ｍｇ／ｋｇ用量との間に有効性に有意差がないことを実証する。しかしながら、３０分間より長い注入時間の投与は、肝臓損傷バイオマーカーであるＡＬＴのレベル減少を示す。ＡＬＴレベルは、３ｍｇ／ｋｇ用量において、３０分間の注入時間の方が高いことが観察され、これは、潜在的な肝臓ストレスを示している。
実施例４についての材料および方法。ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡテンプレートおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によって合成した。転写は、一般に、Ｔ７プロモーター（配列番号２３１）、配列番号３７７（配列番号３１１のＲＮＡ ＯＲＦをコードする）などの本明細書に開示される転写配列、およびプラスミドにコードされるポリＡテール（配列番号２６３）を含む構築物から行われた。
すべての方法について、転写産物濃度を、２６０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）での光吸光度を測定することによって決定し、転写産物をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
ＬＮＰ製剤化
脂質成分を、以下に記載される脂質成分モル比で１００％エタノールに溶解した。化学修飾したｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを組み合わせ、２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解し、およそ１．５ｍｇ／ｍＬの全ＲＮＡカーゴ濃度を得た。ＬＮＰを、約６のＮ／Ｐ比で、以下に記載されるように、１：２ ｗ／ｗ比での化学修飾したｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの比で、製剤化した。ＬＮＰを、５０％の脂質Ａ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール、および３％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧで製剤化し、ＬＮＰを、実施例１に記載のクロスフロー技術によって形成した。混合中、差圧式流量を使用して、水性溶媒と有機溶媒の２：１の比を維持した。希釈したＬＮＰを、タンジェンシャルフロー濾過を使用して濃縮し、次いで、濾過および貯蔵の前に、透析濾過により緩衝液を交換した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡカーゴ
キャップされたポリアデニル化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、実施例１に記載の方法を使用して、線状プラスミドＤＮＡテンプレートおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。
ゲノムＤＮＡ単離
ゲノムＤＮＡを、肝臓試料から、５０μＬ／ウェルのＢｕｃｃａｌＡｍｐ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログＱＥ０９０５０）を使用して、製造業者のプロトコルに従って抽出した。すべてのＤＮＡ試料に対し、本明細書に記載されるように、ＰＣＲおよびその後のＮＧＳ分析を行った。
ＮＧＳシークエンシング
簡単に述べると、ゲノム中の標的位置での編集効率を定量的に決定するために、ゲノムＤＮＡが単離され、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入および欠失の存在を同定した。
標的部位（例えば、ＴＴＲ）の周りのＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。プライマー配列を以下に提供する。シークエンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のプロトコルに従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシークエンシングした。低品質スコアを有するものを除外した後に、リードをカニクイザル参照ゲノム（例えばｍａｃＦａｓ５）とアラインメントした。得られたリードを含むファイルを、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、目的の標的領域と重なり合うリードを選択し、挿入、置換、もしくは欠失を含むリードの数に対する、野生型リードの数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」および「編集パーセント」）は、野生型を含む配列リードの総数に対する、挿入もしくは欠失を有する配列リードの総数として定義される。
配列表
以下の配列表は、本明細書に開示される配列のリストを提供する。ＤＮＡ配列（Ｔを含む）が、ＲＮＡに関して参照される場合、Ｔは、Ｕで置き換えられるべきであり（文脈に応じて、修飾または非修飾であり得る）、逆もまた同様であることが理解される。
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Claims (59)

  1. 組成物であって、
    （ｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、
    ａ．前記オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいは
    ｂ．前記オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有するか、または少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいは
    ｃ．前記オープンリーディングフレームが、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４に列挙されるコドン、表５の低Ａセット、または表５の低Ａ／Ｕセットであるコドンのセットからなり、かつ／あるいは
    ｄ．前記オープンリーディングフレームは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１２３％の範囲であり、かつ／あるいは
    ｅ．前記オープンリーディングフレームは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％の範囲である、核酸と、
    （ｉｉ）ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターであって、前記ガイドＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターと、を含む、組成物。
  2. ＴＴＲ遺伝子を修飾し、かつ／または前記ＴＴＲ遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法であって、組成物を細胞に送達することを含み、前記組成物が、
    （ｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、
    ａ．前記オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいは
    ｂ．前記オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９３％の同一性を有するか、または少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいは
    ｃ．前記オープンリーディングフレームが、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４に列挙されるコドン、表５の低Ａセット、または表５の低Ａ／Ｕセットであるコドンのセットからなり、かつ／あるいは
    ｄ．前記オープンリーディングフレームは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１２３％の範囲であり、かつ／あるいは
    ｅ．前記オープンリーディングフレームは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％の範囲である、核酸と、
    （ｉｉ）ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターであって、前記ガイドＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターと、を含む、方法。
  3. 対象においてＴＴＲ血清濃度を低減し、ＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療し、かつ／またはＴＴＲを含むアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、
    （ｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、
    ａ．前記オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、かつ／あるいは
    ｂ．前記オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００のヌクレオチドにわたって配列番号３１１と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ／あるいは
    ｃ．前記オープンリーディングフレームが、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％が表４に列挙されるコドン、表５の低Ａセット、または表５の低Ａ／Ｕセットであるコドンのセットからなり、かつ／あるいは
    ｄ．前記オープンリーディングフレームは、アデニン含有量が、その最小アデニン含有量～その最小アデニン含有量の１５０％の範囲であり、かつ／あるいは
    ｅ．前記オープンリーディングフレームは、アデニンジヌクレオチド含有量が、その最小アデニンジヌクレオチド含有量～その最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％の範囲である、核酸と、
    （ｉｉ）ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターであって、前記ガイドＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択されるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするベクターと、を含み、それによって、前記対象においてＴＴＲ血清濃度を低減し、ＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療し、かつ／またはＴＴＲを含むアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防する、方法。
  4. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、２９、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６１、６３、６５、６６、６８、または６９から選択されるガイド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  5. 細胞もしくは対象において前記ＴＴＲ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、細胞もしくは対象において前記ＴＴＲ遺伝子を修飾し、対象においてＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療し、対象においてＴＴＲ血清濃度を低減し、または対象においてアミロイドもしくはアミロイド原線維の蓄積を低減もしくは予防する際に使用するための、請求項１または４に記載の組成物。
  6. 前記方法が、３０分間より長く、例えば、約４５～７５分間、７５～１０５分間、１０５～１３５分間、１３５～１６５分間、１６５～１９５分間、１９５～２２５分間、２２５～２５５分間、２５５～２８５分間、２８５～３１５分間、３１５～３４５分間、３４５～３７５分間、約１．５～６時間、約６０分間、約９０分間、約１２０分間、約１５０分間、約１８０分間、または約２４０分間の注入によって前記組成物を投与することを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物または方法。
  7. 前記組成物が、前記組成物の投与前の血清ＴＴＲレベルと比較して、例えば少なくとも５０％、血清ＴＴＲレベルを低減するか、または前記組成物の投与前の血清ＴＴＲレベルと比較して、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、もしくは９９～１００％、血清ＴＴＲレベルを低減する、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  8. 前記組成物が、前記ＴＴＲ遺伝子の編集を引き起こし、任意選択で、前記編集が、編集される集合体のパーセンテージ（編集パーセント）として計算され、さらに任意選択で、前記編集パーセントが、前記集合体の３０～９９％、例えば、前記集合体の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％である、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  9. 前記組成物が、少なくとも１つの組織におけるアミロイド沈着を低減し、任意選択で、前記少なくとも１つの組織が、胃、結腸、坐骨神経、または後根神経節のうちの１つ以上を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  10. アミロイド沈着が、前記組成物の投与の８週間後に測定される、請求項９に記載の方法または使用のための組成物。
  11. アミロイド沈着が、前記組成物の投与前にみられるアミロイド沈着の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％低減する、請求項９または１０に記載の方法または使用のための組成物。
  12. 前記組成物が、少なくとも２回投与または送達される、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  13. 前記投与または送達が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５日間の間隔で、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５週間の間隔で、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５ヶ月間の間隔で行われる、請求項１２に記載の方法または使用のための組成物。
  14. 前記ガイドＲＮＡが、前記ガイド配列を含み、かつ配列番号１２６のヌクレオチド配列をさらに含むｃｒＲＮＡを含み、前記配列番号１２６のヌクレオチドが、前記ガイド配列にその３’末端で続く、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  15. 前記ガイドＲＮＡが、シングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  16. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号３のパターンを有するガイド配列を含む、請求項１５に記載の方法または組成物。
  17. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号３の配列を含む、請求項１５または１６に記載の方法または組成物。
  18. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２の前記ガイド配列、ならびに配列番号１２６の前記ヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  19. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  20. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号８７～１１３、１１５～１２０、および１２２～１２４から選択される配列を含む、請求項１９に記載の方法または組成物。
  21. 前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  22. 前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、または２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法または組成物。
  23. 前記少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上および／または３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、請求項２１または２２に記載の方法または組成物。
  24. 前記少なくとも１つの修飾が、最初の４個のヌクレオチド間および／または最後の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  25. 前記少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドおよび／または３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  26. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  27. 前記ガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む前記核酸が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  28. 前記ＬＮＰが、ＣＣＤ脂質を含み、任意選択で、前記ＣＣＤ脂質が、脂質Ａまたは脂質Ｂであり、さらに任意選択で、前記ＣＣＤ脂質が、脂質Ａである、請求項２７に記載の方法または組成物。
  29. 前記ＬＮＰが、ヘルパー脂質を含み、任意選択で、前記ヘルパー脂質が、コレステロールである、請求項２７または２８に記載の方法または組成物。
  30. 前記ＬＮＰが、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）を含み、任意選択で、前記ステルス脂質が、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  31. （ｉ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６であり、
    （ｉｉ）前記ＬＮＰが、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約２７～３９．５ｍｏｌ％のヘルパー脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約５～７（例えば、約６）であり、
    （ｉｉｉ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０であり、
    （ｉｖ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６であり、
    （ｖ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６であり、
    （ｖｉ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約０～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約３～１０であり、
    （ｖｉｉ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約１ｍｏｌ％未満の中性脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０であり、
    （ｖｉｉｉ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約４０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約１．５～１０ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０であり、前記ＬＮＰ組成物が、中性リン脂質を本質的に含まないか、または含まず、あるいは
    （ｉｘ）前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約５０～６０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質と、約２．５～４ｍｏｌ％のステルス脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）とを含み、前記脂質成分の残りが、ヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が約３～７である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  32. 前記ＬＮＰが、約６のＮ／Ｐ比を有する、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  33. 前記ＬＮＰが、中性脂質を含み、任意選択で、前記中性脂質が、ＤＳＰＣである、請求項２６～３２に記載の方法または組成物。
  34. 前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約５０ｍｏｌ％の脂質Ａなどのアミン脂質と、約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣなどの中性脂質と、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質などのステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）とを含み、前記脂質成分の残りが、コレステロールなどのヘルパー脂質であり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６である、請求項３２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  35. 前記ＬＮＰが、脂質成分を含み、前記脂質成分が、約５０ｍｏｌ％の脂質Ａと、約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、約３ｍｏｌ％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとを含み、前記脂質成分の残りが、コレステロールであり、前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比が、約６である、請求項３２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  36. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓクリバーゼである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  37. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、請求項３６に記載の方法または組成物。
  38. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が修飾されており、任意選択で、修飾された前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  39. 前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  40. 前記組成物が、薬学的製剤であり、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  41. 非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、前記ＴＴＲ遺伝子においてフレームシフトまたはナンセンス変異を誘導する前記ＴＴＲ遺伝子におけるＤＳＢの修復中に変異を引き起こす、請求項４０に記載の方法または使用のための組成物。
  42. フレームシフトまたはナンセンス変異が、肝臓細胞の少なくとも５０％の前記ＴＴＲ遺伝子において誘導される、請求項４１に記載の方法または使用のための組成物。
  43. ヌクレオチドの欠失または挿入が、前記ＴＴＲ遺伝子において、オフターゲット部位におけるよりも少なくとも５０倍以上生じる、請求項４１または４２に記載の方法または使用のための組成物。
  44. 前記ガイドＲＮＡの配列が、
    ａ）配列番号９２もしくは１０４、
    ｂ）配列番号８７、８９、９６、もしくは１１３、
    ｃ）配列番号１００、１０２、１０６、１１１、もしくは１１２、または
    ｄ）配列番号８８、９０、９１、９３、９４、９５、９７、１０１、１０３、１０８、もしくは１０９であり、
    任意選択で、前記ガイドＲＮＡが、初代ヒト肝細胞のゲノム内のタンパク質コード領域内で発生するオフターゲット部位でインデルを生成しない、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  45. 前記組成物を投与することで、前記対象におけるＴＴＲのレベルを低減する、請求項２～４４のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  46. 前記対象が、ＡＴＴＲｗｔまたは遺伝性ＡＴＴＲなどのＡＴＴＲを有する、請求項２～４５のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  47. 前記対象が、ヒトである、請求項２～４６のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  48. 前記対象が、家族性アミロイドポリニューロパチー、ＡＴＴＲの神経症状のみ、または主にＡＴＴＲの神経症状、家族性アミロイド心筋症、またはＡＴＴＲの心臓症状のみ、または主にＡＴＴＲの心臓症状を有する、請求項２～４７のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  49. 前記対象が、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、もしくはＶ３０ＭなどのＶ３０変異を有するＴＴＲを発現し、前記対象が、Ｔ６０ＡなどのＴ６０変異を有するＴＴＲを発現し、前記対象が、Ｖ１２２Ａ、Ｖ１２２Ｉ、もしくはＶ１２２（－）などのＶ１２２変異を有するＴＴＲを発現し、または前記対象が、野生型ＴＴＲを発現する、請求項２～４８のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  50. 前記対象が、投与後に、感覚運動ニューロパチーの症状が改善し、安定化し、もしくは変化が遅くなり、かつ／または前記対象が、うっ血性心不全の症状が改善し、安定化し、もしくは変化が遅くなる、請求項２～４９のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  51. 前記組成物または薬学的製剤が、ウイルスベクターを介して投与される、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  52. 前記組成物または薬学的製剤が、脂質ナノ粒子を介して投与される、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
  53. 配列番号５～７２、７４～７８、および８０～８２から選択される配列が、配列番号５、６、９、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２７、３０、３５、３６、３７、３８、５５、６３、６５、６６、６８、または６９である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法または組成物。
  54. 前記オープンリーディングフレームが、配列番号３１１と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  55. 前記オープンリーディングフレームの前記コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％が、表４、表５、または表７に列挙されるコドンである、請求項１～５４のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  56. 前記オープンリーディングフレームが、配列番号３７７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  57. 前記核酸が、前記ウリジンの少なくとも１０％が修飾ウリジンで置換されるｍＲＮＡである、請求項１～５６のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  58. 前記修飾ウリジンが、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、シュードウリジン、５－メトキシウリジン、または５－ヨードウリジンのうちの１つ以上である、請求項５７に記載の組成物または方法。
  59. ＡＴＴＲを有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、請求項１または４～５８のいずれか一項に記載の組成物または製剤の使用。
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