JP2022171843A - がん適応症のためのマルチモーダル治療用細胞系に関連する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】がん適応症のためのマルチモーダル治療用細胞系に関連する組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、例えば、がんを治療するためマルチモーダル療法に関連する組成物および方法を含む。本明細書に記載のマルチモーダル治療は、例えば、がんを有する対象などのそれを必要とする対象に治療効果を提供するために、協調様式で機能する複数の薬剤を提供および/または投与する。いくつかの態様では、本開示は、例えば、第1の外因性ポリペプチド、第2の外因性ポリペプチド、および第3の外因性ポリペプチドなどの複数のポリペプチド(例えば、外因性ポリペプチド)などの複数の薬剤を含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供する。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、2016年1月11日に出願された米国特許出願第62/277130号明細書、2016年7月7日に出願された米国特許出願第62/359448号明細書、2016年8月4日に出願された米国特許出願第62/370915号明細書、2016年11月11日に出願された米国特許出願第62/420973号明細書の優先権を主張する。
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、2016年1月11日に出願された米国特許出願第62/277130号明細書、2016年7月7日に出願された米国特許出願第62/359448号明細書、2016年8月4日に出願された米国特許出願第62/370915号明細書、2016年11月11日に出願された米国特許出願第62/420973号明細書の優先権を主張する。
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含む。2017年1月5日に作成された前記ASCIIコピーは、R2081-7020WO_SL.t×tと命名され、サイズは24,800バイトである。
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含む。2017年1月5日に作成された前記ASCIIコピーは、R2081-7020WO_SL.t×tと命名され、サイズは24,800バイトである。
赤血球は、例えば、毒性代謝物を分解するための、または生体異物を不活性化するための、および他の生物医学的用途における、薬物送達系としての使用が検討されている。
本発明は、マルチモーダル療法に関連する組成物および方法を含む。この療法は、例えば、がんを治療するために有用である。本明細書に記載のマルチモーダル治療は、例えば、がんを有する対象などのそれを必要とする対象に治療効果を提供するために、協調様式で機能する複数の薬剤を提供および/または投与する。一般に、本明細書に記載のマルチモーダル療法は、協調様式(例えば、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性)で機能する、複数の作用剤(例えば、ポリペプチド)(例えば、発現しまたはそれを含有する)を含む、例えば、除核赤血球などの遺伝子操作赤血球製剤の対象への投与を含む。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、第1の外因性ポリペプチド、第2の外因性ポリペプチド、および第3の外因性ポリペプチドなどの複数のポリペプチド(例えば、外因性ポリペプチド)などの複数の薬剤を含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、複数の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供し、複数の第1および第2の外因性ポリペプチドは、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性の活性を有する。
いくつかの態様では、本開示は、第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球を提供し、
a)第1および第2の外因性ポリペプチドは同一標的に作用し、任意選択的に、標的は細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり;
b)第1の外因性ポリペプチドは第1の内因性ヒトタンパク質に、第2の外因性ポリペプチドは第2の内因性ヒト標的タンパク質に、例えば、500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdで結合し;
c)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し(例えば、結合し)、第1および第2の標的は同一生物学的経路の構成要素であり、任意選択的に、標的は、細胞表面受容体、内因性ヒトタンパク質、またはその双方であり;
d)第1の外因性ポリペプチドは第1のアポトーシス促進ポリペプチドを含み、第2の外因性ポリペプチドは第2のアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、TRAIL受容体リガンド、例えば、TRAILポリペプチドを含み;
e)第1および第2の外因性ポリペプチドは互いに近接しており、少なくとも1、2、5、10、30、または60秒間;1、2、5、10、30、または60分間、または1、2、3、6、12、または14時間にわたり、例えば、10、7、5、4、3、2、1、0.5、0.2、または0.1nm未満の間隔であり;
f)第1および第2の外因性ポリペプチドは、互いに500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdを有し;
g)第1の外因性ポリペプチドは、例えば、MHCクラスII分子などのMHC分子である抗原提示ポリペプチドを含み、第2の外因性ポリペプチドは、抗原、例えば、がん抗原を含み;
h)第1および第2の外因性ポリペプチドは異なる標的に作用し、任意選択的に、標的の少なくとも1つは、細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり、例えば、がん細胞などの第1の細胞型に結合する第1の外因性ポリペプチド、および例えば、T細胞などの免疫エフェクター細胞などの第2の細胞型に結合する第2の外因性ポリペプチドであり;
i)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の存在比を有し;
j)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、それぞれ、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の比率で、第1の標的および第2の標的に対するKdを有し;
k)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に対する第1の活性(例えば、結合)を有し、第2の外因性ポリペプチドは第1の標的に対する第2の活性(例えば、結合)を有し、例えば、第1および第2の外因性ポリペプチドは単一標的に結合し;
l)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し(例えば、結合し)、第1および第2の標的は同一経路の部分であり、任意選択的に、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し、同時に第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し;
m)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し(例えば、結合し)、第1および第2の標的は異なる経路の部分であり、任意選択的に、第1および第2の経路はどちらも所与の細胞性応答を促進するように作用し;
n)第1の外因性ポリペプチドは、除核赤血球を例えば、ヒト細胞などの所望の部位に局在させ、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、T細胞活性化活性または抗原提示活性などの免疫調節活性などの治療活性を有し(例えば、がんワクチン);
o)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的、例えば、第1の細胞、例えば、がん細胞に結合し、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的、例えば、第2の細胞、例えば、第2の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に結合し;
p)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、非ヒトタンパク質であり;
q)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドはどちらも、例えば、生合成酵素などの酵素であり;
r)第1の外因性ポリペプチドは中間分子の形成を促進し、第2の外因性ポリペプチドは中間分子に作用し;または
s)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、経路の連続的段階に作用する。
a)第1および第2の外因性ポリペプチドは同一標的に作用し、任意選択的に、標的は細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり;
b)第1の外因性ポリペプチドは第1の内因性ヒトタンパク質に、第2の外因性ポリペプチドは第2の内因性ヒト標的タンパク質に、例えば、500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdで結合し;
c)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し(例えば、結合し)、第1および第2の標的は同一生物学的経路の構成要素であり、任意選択的に、標的は、細胞表面受容体、内因性ヒトタンパク質、またはその双方であり;
d)第1の外因性ポリペプチドは第1のアポトーシス促進ポリペプチドを含み、第2の外因性ポリペプチドは第2のアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、TRAIL受容体リガンド、例えば、TRAILポリペプチドを含み;
e)第1および第2の外因性ポリペプチドは互いに近接しており、少なくとも1、2、5、10、30、または60秒間;1、2、5、10、30、または60分間、または1、2、3、6、12、または14時間にわたり、例えば、10、7、5、4、3、2、1、0.5、0.2、または0.1nm未満の間隔であり;
f)第1および第2の外因性ポリペプチドは、互いに500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdを有し;
g)第1の外因性ポリペプチドは、例えば、MHCクラスII分子などのMHC分子である抗原提示ポリペプチドを含み、第2の外因性ポリペプチドは、抗原、例えば、がん抗原を含み;
h)第1および第2の外因性ポリペプチドは異なる標的に作用し、任意選択的に、標的の少なくとも1つは、細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり、例えば、がん細胞などの第1の細胞型に結合する第1の外因性ポリペプチド、および例えば、T細胞などの免疫エフェクター細胞などの第2の細胞型に結合する第2の外因性ポリペプチドであり;
i)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の存在比を有し;
j)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、それぞれ、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の比率で、第1の標的および第2の標的に対するKdを有し;
k)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に対する第1の活性(例えば、結合)を有し、第2の外因性ポリペプチドは第1の標的に対する第2の活性(例えば、結合)を有し、例えば、第1および第2の外因性ポリペプチドは単一標的に結合し;
l)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し(例えば、結合し)、第1および第2の標的は同一経路の部分であり、任意選択的に、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し、同時に第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し;
m)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し(例えば、結合し)、第1および第2の標的は異なる経路の部分であり、任意選択的に、第1および第2の経路はどちらも所与の細胞性応答を促進するように作用し;
n)第1の外因性ポリペプチドは、除核赤血球を例えば、ヒト細胞などの所望の部位に局在させ、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、T細胞活性化活性または抗原提示活性などの免疫調節活性などの治療活性を有し(例えば、がんワクチン);
o)第1の外因性ポリペプチドは第1の標的、例えば、第1の細胞、例えば、がん細胞に結合し、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的、例えば、第2の細胞、例えば、第2の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に結合し;
p)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、非ヒトタンパク質であり;
q)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドはどちらも、例えば、生合成酵素などの酵素であり;
r)第1の外因性ポリペプチドは中間分子の形成を促進し、第2の外因性ポリペプチドは中間分子に作用し;または
s)第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、経路の連続的段階に作用する。
本明細書の態様のいずれでも、例えば、上記の態様は、本明細書の1つまたは複数の実施形態、例えば、以下の実施形態によって特徴付けられ得る。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは相乗的活性を有する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは相加的活性を有する。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは近接依存性活性を有する。標的部分または部分群との相互作用の前、最中または後において、複数のポリペプチド間の近接性は、生体内または生体外で、そのような近接性の非存在下では見られない特性または結果を与えてもよい。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、標的細胞(例えば、T細胞などの免疫エフェクター細胞)上の例えば、第1の標的細胞ポリペプチドなどの第1の標的部分と相互作用し、例えば、結合し、第2の外因性ポリペプチドは、標的細胞上の例えば、第2の標的細胞ポリペプチドなどの第2の標的部分と相互作用する(例えば、第1および第2の標的細胞ポリペプチドの結合が、標的細胞の生物学的特性を変化させる)。一実施形態では、第1および第2の標的は、標的細胞上の多量体複合体のサブユニットである。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、赤血球と標的細胞との融合を促進し、第2の外因性ポリペプチドは、表1、表2、または表3のいずれかのポリペプチドである(例えば、表1、表2、表3、または表4のいずれかのヒトポリペプチド、例えば、ヒト野生型ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド)。
いくつかの実施形態では、第1および第2の外因性ポリペプチドは、相互に作用し、例えば、第1のものは、例えば、切断またはリン酸化によって第2のものを修飾し、または第1および第2のものは、二量体もしくは多量体タンパク質を形成する。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、3、4、5、6、7、8、9、または10の異なる外因性ポリペプチドを含む。一実施形態では、異なる外因性ポリペプチドの複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)または全部は、例えば、互いに少なくとも40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または99.5%の配列同一性など、互いに予め選択された相同性レベルを有する。一実施形態では、異なる外因性ポリペプチドの複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)または全部は、例えば、参照配列(ポリペプチド配列全体または例えば、予め選択されたドメインなどのその一部を含む参照配列)との少なくとも40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5%、または100%の配列同一性など、参照配列と予め選択された相同性レベルを有し、例えば、異なる外因性ポリペプチドの複数または全部は、抗体または抗体分子である。いくつかの実施形態では、参照配列は、抗体配列またはその断片である。いくつかの実施形態では、参照配列は、重鎖定常領域またはその一部、軽鎖定常領域またはその断片、重鎖可変領域またはその一部、軽鎖可変領域またはその断片、または前述の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、少なくとも2つであるが、5、6、7、8、9、または10以下の異なる外因性ポリペプチド、例えば、除核赤血球によって保持されない1つまたは複数の外因性核酸によってコードされる外因性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、除核赤血球によって保持されない1つまたは複数の外因性核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態では、第1、第2、および任意選択的に第3の外因性ポリペプチドの1つまたは複数(例えば、2つまたは3つ)は、膜貫通ポリペプチドまたは表面アンカー型ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは標的細胞上の部分と相互作用し、例えば、結合し、第2の外因性ポリペプチドは、標的細胞の特性を変化させ、例えば、標的細胞を、殺滅または活性化する。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドは、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の存在比を有する。いくつかの実施形態では、第1および第2のポリペプチドは、どちらも化学量論的作用様式を有するか、またはどちらも触媒作用機序を有し、どちらも例えば、約1:1または約2:1~1:2などの類似存在量で存在する。いくつかの実施形態では、重量またはコピー数基準で、第1の外因性ポリペプチドは、第2の外因性ポリペプチドより、少なくとも約10%、20%、30%、50%、または2、3、4、5、10、20、50、または100倍豊富である(任意選択的に、10倍または100倍に至る)。いくつかの実施形態では、重量またはコピー数基準で、第2の外因性ポリペプチドは、第1の外因性ポリペプチドより、少なくとも約10%、20%、30%、50%、または2、3、4、5、10、20、50、または100倍豊富である(任意選択的に、10倍または100倍に至る)。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは化学量論的作用機序を有し、第2のポリペプチドは触媒作用機序を有し、第1のポリペプチドは第2のポリペプチドよりも豊富である。いくつかの実施形態では、第2のポリペプチドは化学量論的作用機序を有し、第1のポリペプチドは触媒作用機序を有し、第2のポリペプチドは第1のポリペプチドよりも豊富である。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、標的化部分を含む
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、以下の特徴の1つ以上を有する:
a)0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、または0.5%のNaClでの50%未満の細胞溶解の浸透圧脆性;
b)約10~200fLの細胞容積、または約1ミクロン~約20ミクロン、約2ミクロン~約20ミクロン、約3ミクロン~約20ミクロン、約4ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約20ミクロン、約6ミクロンおよび~約20ミクロン、約5ミクロン~約15ミクロン、または約10ミクロン~約30ミクロンの細胞の直径;
c)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%を超える胎児ヘモグロビン;または少なくとも約20、25、または30pg/細胞のヘモグロビン;または
d)アネキシンV染色による測定で、30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の細胞表面側のホスファチジルセリン含有量。
a)0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、または0.5%のNaClでの50%未満の細胞溶解の浸透圧脆性;
b)約10~200fLの細胞容積、または約1ミクロン~約20ミクロン、約2ミクロン~約20ミクロン、約3ミクロン~約20ミクロン、約4ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約20ミクロン、約6ミクロンおよび~約20ミクロン、約5ミクロン~約15ミクロン、または約10ミクロン~約30ミクロンの細胞の直径;
c)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%を超える胎児ヘモグロビン;または少なくとも約20、25、または30pg/細胞のヘモグロビン;または
d)アネキシンV染色による測定で、30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の細胞表面側のホスファチジルセリン含有量。
いくつかの実施形態では、複数の外因性ポリペプチドの少なくとも1つ、例えば、全部がグリコシル化される。いくつかの実施形態では、複数の外因性ポリペプチドの少なくとも1つ、例えば、全部がリン酸化される。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は網状赤血球である。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドまたはポリペプチド群は、LPXTG(配列番号17)などのソルターゼ転写(すなわち、ソルターゼ反応によって生じ得る配列)を欠く。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの除核赤血球を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書に記載の疾患または病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、がん、例えば、本明細書に記載されるがんである。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の網赤血球などの赤核赤血球を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、例えば、膜貫通受容体などの第1および第2の細胞表面部分を接近させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの赤核細胞を提供するステップを含む、複数の近接依存性分子を送達、提示、または発現させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、赤血球前駆体と、外因性ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸とを接触させて、核除去ができる条件に細胞を置くことを提供する、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの除核赤血球を生産する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、少なくとも108、109、1010、1011、または1012個で、例えば、本明細書に記載の網状赤血球などの複数の除核赤血球を含む、例えば、医薬品などの調製品を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、網状赤血球などの除核赤血球である遺伝子操作された赤血球(RBC)と、例えば、生体外または生体内複合体である標的細胞との細胞複合体を提供し、複合体形成は、外因性ポリペプチドの1つによって媒介される。いくつかの実施形態では、細胞複合体は、少なくとも2、3、4、5、10、20、50、または100個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞複合体は、遺伝子操作されたRBCに加えて、例えば、がん細胞および免疫エフェクター細胞などの少なくとも2つの細胞型を含む。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、網状赤血球などの除核赤血球などの遺伝子操作されたRBCと、例えば、本明細書に記載のマルチモーダル対をコードする、1つまたは複数の核酸分子などの核酸とを含む、反応混合物を立証する。いくつかの実施形態では、核酸は、赤血球中で活性である少なくとも1つのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載の(例えば、表1、表2、および表3の)少なくとも2つのタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、第3の外因性ポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、本開示は、標的細胞または対象に関する情報を提供する、例えば、受信するステップと、その情報に応答して複数の外因性ポリペプチドを選択するステップと、外因性ポリペプチドをコードする核酸をRBCまたはRBC前駆体に導入するステップとを含む、本明細書に記載の遺伝子操作されたRBC(例えば、網状赤血球などの赤血球)を生産する方法を含む。
いくつかの局面では、本発明は、候補赤血球系細胞、例えば、RBCを提供するステップと、例えば、外因性ポリペプチドのマルチモーダル対などの複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸が、存在するかどうかを判定するステップとを含む、遺伝子操作された赤血球系細胞、例えば、RBC(例えば、網状赤血球などの除核RBC)を評価する方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、例えば、RBCなどの候補赤血球系細胞を提供するステップと、例えば、タンパク質検出によって、例えば、外因性ポリペプチドのマルチモーダル対などの複数の外因性ポリペプチドが存在するかどうかを判定するステップとを含んでなる、例えば、RBC(例えば、網状赤血球などの除核RBC)などの遺伝子操作された赤血球系細胞を評価する方法を含んでなる。
本開示は、いくつかの態様では、
標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチドと、
標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドと
を含む除核赤血球系細胞を提供し、
(a)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、IdeSポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジとCH2領域との間で抗体を切断する部分を含み;
(b)第2の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、;
(c)第2の外因性ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、標的が、例えば、第1の外因性ポリペプチドまたは第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、標的は抗体または補体因子を含み;
(d)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含み;
(e)標的は、ポリペプチド;炭水化物(例えば、グリカン)、脂質(例えば、リン脂質)、または核酸(例えば、DNAまたはRNA)であり;
(f)第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し;
(g)標的は抗体(例えば、抗薬物抗体)を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の可変領域に結合し;
(h)標的は抗体(例えば、抗薬物抗体)を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の定常領域に結合し;
(i)第1の外因性ポリペプチドは、約1~2pM、2~5pM、5~10pM、10~20pM、20~50pM、50~100pM、100~200pM、200~500pM、500~1000pM、1~2nM、2~5nM、5~10nM、10~20nM、20~50nM、50~100nM、100~200nM、200~500nM、500~1000nM、1~2μM、2~5μM、5~10μM、10~20μM、20~50μM、または50~100μMの標的親和性を有し;
(j)第2の外因性ポリペプチドは、約10-1~10-7M、10-1~10-2M、10-2~10-3M、10-3~10-4M、10-4~10-5M、10-5~10-6M、または10-6~10-7MのKMを有し;
(k)標的に対する第2の外因性ポリペプチドのKM(M単位で測定)で除した、標的に対する第1の外因性ポリペプチドのKd(M単位で測定)の比率は、約1×10-9~2×10-9、2×10-9~5×10-9、5×10-9~1×10-8、1×10-8~2×10-8、2×10-8~5×10-8、5×10-8~1×10-7、1×10-7~2×10-7、2×10-7~5×10-7、5×10-7~1×10-6、1×10-6~2×10-6、2×10-6~5×10-6、5×10-6~1×10-5、1×10-5~2×10-5、2×10-5~5×10-5、5×10-5~1×10-4、1×10-4~2×10-4、2×10-4~5×10-4、5×10-4~1×10-3、1×10-3~2×10-3、2×10-3~5×10-3、5×10-3~1×10-2、1×10-2~2×10-2、2×10-2~5×10-2、5×10-2~1×10-1、1×10-1~2×10-1、2×10-1~5×10-1、または5×10-1~1であり;
(l)標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドの観察された反応速度は、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが第1の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く;
(m)赤血球系細胞上の第2の外因性ポリペプチドの平均数に対する、赤血球系細胞上の第1の外因性ポリペプチドの平均数の比率は、約50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、または1:50であり;
(n)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性は、修飾された(例えば、切断された)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性より高く;
(o)除核赤血球系細胞の治療有効用量は、投与時における対象の末梢血中の標的の量に対する化学量論比より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(p)有効用量中の除核赤血球系細胞数は、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的分子などの標的数より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(q)第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(r)第1の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(s)第1の外因性ポリペプチドの数および第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、除核赤血球系細胞は、それぞれ標的に対する基準値より少なく、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(t)第2の外因性ポリペプチドは、少なくとも10-1M、10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、または10-7MのKMで標的を修飾し(例えば、切断し;
(u)第2の外因性ポリペプチドは、シャペロンを含み;
(v)第1の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み、第2の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み;または
(w)除核赤血球系細胞の有効量は、第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)
の1つまたは複数である。
標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチドと、
標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドと
を含む除核赤血球系細胞を提供し、
(a)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、IdeSポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジとCH2領域との間で抗体を切断する部分を含み;
(b)第2の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、;
(c)第2の外因性ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、標的が、例えば、第1の外因性ポリペプチドまたは第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、標的は抗体または補体因子を含み;
(d)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含み;
(e)標的は、ポリペプチド;炭水化物(例えば、グリカン)、脂質(例えば、リン脂質)、または核酸(例えば、DNAまたはRNA)であり;
(f)第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し;
(g)標的は抗体(例えば、抗薬物抗体)を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の可変領域に結合し;
(h)標的は抗体(例えば、抗薬物抗体)を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の定常領域に結合し;
(i)第1の外因性ポリペプチドは、約1~2pM、2~5pM、5~10pM、10~20pM、20~50pM、50~100pM、100~200pM、200~500pM、500~1000pM、1~2nM、2~5nM、5~10nM、10~20nM、20~50nM、50~100nM、100~200nM、200~500nM、500~1000nM、1~2μM、2~5μM、5~10μM、10~20μM、20~50μM、または50~100μMの標的親和性を有し;
(j)第2の外因性ポリペプチドは、約10-1~10-7M、10-1~10-2M、10-2~10-3M、10-3~10-4M、10-4~10-5M、10-5~10-6M、または10-6~10-7MのKMを有し;
(k)標的に対する第2の外因性ポリペプチドのKM(M単位で測定)で除した、標的に対する第1の外因性ポリペプチドのKd(M単位で測定)の比率は、約1×10-9~2×10-9、2×10-9~5×10-9、5×10-9~1×10-8、1×10-8~2×10-8、2×10-8~5×10-8、5×10-8~1×10-7、1×10-7~2×10-7、2×10-7~5×10-7、5×10-7~1×10-6、1×10-6~2×10-6、2×10-6~5×10-6、5×10-6~1×10-5、1×10-5~2×10-5、2×10-5~5×10-5、5×10-5~1×10-4、1×10-4~2×10-4、2×10-4~5×10-4、5×10-4~1×10-3、1×10-3~2×10-3、2×10-3~5×10-3、5×10-3~1×10-2、1×10-2~2×10-2、2×10-2~5×10-2、5×10-2~1×10-1、1×10-1~2×10-1、2×10-1~5×10-1、または5×10-1~1であり;
(l)標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドの観察された反応速度は、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが第1の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く;
(m)赤血球系細胞上の第2の外因性ポリペプチドの平均数に対する、赤血球系細胞上の第1の外因性ポリペプチドの平均数の比率は、約50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、または1:50であり;
(n)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性は、修飾された(例えば、切断された)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性より高く;
(o)除核赤血球系細胞の治療有効用量は、投与時における対象の末梢血中の標的の量に対する化学量論比より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(p)有効用量中の除核赤血球系細胞数は、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的分子などの標的数より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(q)第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(r)第1の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(s)第1の外因性ポリペプチドの数および第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、除核赤血球系細胞は、それぞれ標的に対する基準値より少なく、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(t)第2の外因性ポリペプチドは、少なくとも10-1M、10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、または10-7MのKMで標的を修飾し(例えば、切断し;
(u)第2の外因性ポリペプチドは、シャペロンを含み;
(v)第1の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み、第2の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み;または
(w)除核赤血球系細胞の有効量は、第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)
の1つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、(b)第2の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、標的は任意選択的に、抗体、例えば、抗薬物抗体である。いくつかの実施形態では、修飾は、例えば、第1の外因性ポリペプチドまたは第1の外因性ポリペプチド以外の分子である別の分子と相互作用する標的の能力を変化させ、例えば、増大または低下させる。
いくつかの実施形態では、(d)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、例えば、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第1の標的ドメインは、第2の標的ドメインから放出される。いくつかの実施形態では、切断は、第1の基質に対する第1の標的ドメインの親和性、および第2の基質に対する第2の標的ドメインの片方または双方を変化させる。一実施形態では、標的は抗体を含み、第1の標的ドメインは1つ以上のCDRを含み、第2の標的ドメインは例えば、Fc領域である定常領域の一部を含む。
いくつかの実施形態では、(a)~(w)の少なくとも2つ(例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(e)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(i)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(j)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(m)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(q)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(r)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(a)および(s)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(e)および(i)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(e)および(j)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(e)および(m)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(e)および(q)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(e)および(r)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(e)および(s)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(i)および(j)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(i)および(m)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(i)および(q)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(i)および(r)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(i)および(s)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(j)および(m)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(j)および(q)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(j)および(r)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(j)および(s)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(m)および(q)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(m)および(r)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(m)および(s)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(q)および(r)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(q)および(s)が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも(r)および(s)が存在する。
いくつかの実施形態では、少なくとも、
(a)および(b)、(a)および(c)、(a)および(d)、(a)および(e)、(a)および(f)、(a)および(g)、(a)および(h)、(a)および(i)、
(a)および(j)、(a)および(k)、(a)および(l)、(a)および(m)、(a)および(n)、(a)および(o)、(a)および(p)、(a)および(q)、(a)および(r)、(a)および(s)、(a)および(t)、(a)および(u)、(a)および(v)、(a)および(w)、
(b)および(c)、(b)および(d)、(b)および(e)、(b)および(f)、(b)および(g)、(b)および(h)、(b)および(i)、(b)および(j)、(b)および(k)、(b)および(l)、(b)および(m)、(b)および(n)、(b)および(o)、(b)および(p)、(b)および(q)、(b)および(r)、(b)および(s)、(b)および(t)、(b)および(u)、(b)および(v)、(b)および(w)、
(c)および(d)、(c)および(e)、(c)および(f)、(c)および(g)、(c)および(h)、(c)および(i)、(c)および(j)、(c)および(k)、(c)および(l)、(c)および(m)、(c)および(n)、(c)および(o)、(c)および(p)、(c)および(q)、(c)および(r)、(c)および(s)、(c)および(t)、(c)および(u)、(c)および(v)、(c)および(w)、(d)および(e)、(d)および(f)、(d)および(g)、(d)および(h)、(d)および(i)、(d)および(j)、(d)および(k)、(d)および(l)、(d)および(m)、(d)および(n)、(d)および(o)、(d)および(p)、(d)および(q)、(d)および(r)、(d)および(s)、(d)および(t)、(d)および(u)、(d)および(v)、(d)および(w)、
(e)および(f)、(e)および(g)、(e)および(h)、(e)および(i)、(e)および(j)、(e)および(k)、(e)および(l)、(e)および(m)、(e)および(n)、(e)および(o)、(e)および(p)、(e)および(q)、(e)および(r)、(e)および(s)、(e)および(t)、(e)および(u)、(e)および(v)、(e)および(w)、
(f)および(g)、(f)および(h)、(f)および(i)、(f)および(j)、(f)および(k)、(f)および(l)、(f)および(m)、(f)および(n)、(f)および(o)、(f)および(p)、(f)および(q)、(f)および(r)、(f)および(s)、(f)および(t)、(f)および(u)、(f)および(v)、(f)および(w)、
(g)および(h)、(g)および(i)、(g)および(j)、(g)および(k)、(g)および(l)、(g)および(m)、(g)および(n)、(g)および(o)、(g)および(p)、(g)および(q)、(g)および(r)、(g)および(s)、(g)および(t)、(g)および(u)、(g)および(v)、(g)および(w)、(h)および(i)、(h)および(j)、(h)および(k)、(h)および(l)、(h)および(m)、(h)および(n)、(h)および(o)、(h)および(p)、(h)および(q)、(h)および(r)、(h)および(s)、(h)および(t)、(h)および(u)、(h)および(v)、(h)および(w)、
(i)および(j)、(i)および(k)、(i)および(l)、(i)および(m)、(i)および(n)、(i)および(o)、(i)および(p)、(i)および(q)、(i)および(r)、(i)および(s)、(i)および(t)、(i)および(u)、(i)および(v)、(i)および(w)、
(j)および(k)、(j)および(l)、(j)および(m)、(j)および(n)、(j)および(o)、(j)および(p)、(j)および(q)、(j)および(r)、(j)および(s)、(j)および(t)、(j)および(u)、(j)および(v)、(j)および(w)、
(k)および(l)、(k)および(m)、(k)および(n)、(k)および(o)、(k)および(p)、(k)および(q)、(k)および(r)、(k)および(s)、(k)および(t)、(k)および(u)、(k)および(v)、(k)および(w)、(l)および(m)、(l)および(n)、(l)および(o)、(l)および(p)、
(l)および(q)、(l)および(r)、(l)および(s)、(l)および(t)、(l)および(u)、(l)および(v)、(l)および(w)、
(m)および(n)、(m)および(o)、(m)および(p)、(m)および(q)、(m)および(r)、(m)および(s)、(m)および(t)、(m)および(u)、(m)および(v)、(m)および(w)、
(n)および(o)、(n)および(p)、(n)および(q)、(n)および(r)、(n)および(s)、(n)および(t)、(n)および(u)、(n)および(v)、(n)および(w)、
(o)および(p)、(o)および(q)、(o)および(r)、(o)および(s)、(o)および(t)、(o)および(u)、(o)および(v)、(o)および(w)、(p)および(q)、(p)および(r)、(p)および(s)、(p)および(t)、(p)および(u)、(p)および(v)、(p)および(w)、
(q)および(r)、(q)および(s)、(q)および(t)、(q)および(u)、(q)および(v)、(q)および(w)、
(r)および(s)、(r)および(t)、(r)および(u)、(r)および(v)、(r)および(w)、
(s)および(t)、(s)および(u)、(s)および(v)、(s)および(w)、(tおよび(u)、(t)および(v)、(t)および(w)、
(u)および(v)、(u)および(w)、または
(v)および(w)
が存在する。
(a)および(b)、(a)および(c)、(a)および(d)、(a)および(e)、(a)および(f)、(a)および(g)、(a)および(h)、(a)および(i)、
(a)および(j)、(a)および(k)、(a)および(l)、(a)および(m)、(a)および(n)、(a)および(o)、(a)および(p)、(a)および(q)、(a)および(r)、(a)および(s)、(a)および(t)、(a)および(u)、(a)および(v)、(a)および(w)、
(b)および(c)、(b)および(d)、(b)および(e)、(b)および(f)、(b)および(g)、(b)および(h)、(b)および(i)、(b)および(j)、(b)および(k)、(b)および(l)、(b)および(m)、(b)および(n)、(b)および(o)、(b)および(p)、(b)および(q)、(b)および(r)、(b)および(s)、(b)および(t)、(b)および(u)、(b)および(v)、(b)および(w)、
(c)および(d)、(c)および(e)、(c)および(f)、(c)および(g)、(c)および(h)、(c)および(i)、(c)および(j)、(c)および(k)、(c)および(l)、(c)および(m)、(c)および(n)、(c)および(o)、(c)および(p)、(c)および(q)、(c)および(r)、(c)および(s)、(c)および(t)、(c)および(u)、(c)および(v)、(c)および(w)、(d)および(e)、(d)および(f)、(d)および(g)、(d)および(h)、(d)および(i)、(d)および(j)、(d)および(k)、(d)および(l)、(d)および(m)、(d)および(n)、(d)および(o)、(d)および(p)、(d)および(q)、(d)および(r)、(d)および(s)、(d)および(t)、(d)および(u)、(d)および(v)、(d)および(w)、
(e)および(f)、(e)および(g)、(e)および(h)、(e)および(i)、(e)および(j)、(e)および(k)、(e)および(l)、(e)および(m)、(e)および(n)、(e)および(o)、(e)および(p)、(e)および(q)、(e)および(r)、(e)および(s)、(e)および(t)、(e)および(u)、(e)および(v)、(e)および(w)、
(f)および(g)、(f)および(h)、(f)および(i)、(f)および(j)、(f)および(k)、(f)および(l)、(f)および(m)、(f)および(n)、(f)および(o)、(f)および(p)、(f)および(q)、(f)および(r)、(f)および(s)、(f)および(t)、(f)および(u)、(f)および(v)、(f)および(w)、
(g)および(h)、(g)および(i)、(g)および(j)、(g)および(k)、(g)および(l)、(g)および(m)、(g)および(n)、(g)および(o)、(g)および(p)、(g)および(q)、(g)および(r)、(g)および(s)、(g)および(t)、(g)および(u)、(g)および(v)、(g)および(w)、(h)および(i)、(h)および(j)、(h)および(k)、(h)および(l)、(h)および(m)、(h)および(n)、(h)および(o)、(h)および(p)、(h)および(q)、(h)および(r)、(h)および(s)、(h)および(t)、(h)および(u)、(h)および(v)、(h)および(w)、
(i)および(j)、(i)および(k)、(i)および(l)、(i)および(m)、(i)および(n)、(i)および(o)、(i)および(p)、(i)および(q)、(i)および(r)、(i)および(s)、(i)および(t)、(i)および(u)、(i)および(v)、(i)および(w)、
(j)および(k)、(j)および(l)、(j)および(m)、(j)および(n)、(j)および(o)、(j)および(p)、(j)および(q)、(j)および(r)、(j)および(s)、(j)および(t)、(j)および(u)、(j)および(v)、(j)および(w)、
(k)および(l)、(k)および(m)、(k)および(n)、(k)および(o)、(k)および(p)、(k)および(q)、(k)および(r)、(k)および(s)、(k)および(t)、(k)および(u)、(k)および(v)、(k)および(w)、(l)および(m)、(l)および(n)、(l)および(o)、(l)および(p)、
(l)および(q)、(l)および(r)、(l)および(s)、(l)および(t)、(l)および(u)、(l)および(v)、(l)および(w)、
(m)および(n)、(m)および(o)、(m)および(p)、(m)および(q)、(m)および(r)、(m)および(s)、(m)および(t)、(m)および(u)、(m)および(v)、(m)および(w)、
(n)および(o)、(n)および(p)、(n)および(q)、(n)および(r)、(n)および(s)、(n)および(t)、(n)および(u)、(n)および(v)、(n)および(w)、
(o)および(p)、(o)および(q)、(o)および(r)、(o)および(s)、(o)および(t)、(o)および(u)、(o)および(v)、(o)および(w)、(p)および(q)、(p)および(r)、(p)および(s)、(p)および(t)、(p)および(u)、(p)および(v)、(p)および(w)、
(q)および(r)、(q)および(s)、(q)および(t)、(q)および(u)、(q)および(v)、(q)および(w)、
(r)および(s)、(r)および(t)、(r)および(u)、(r)および(v)、(r)および(w)、
(s)および(t)、(s)および(u)、(s)および(v)、(s)および(w)、(tおよび(u)、(t)および(v)、(t)および(w)、
(u)および(v)、(u)および(w)、または
(v)および(w)
が存在する。
いくつかの実施形態では、標的は、例えば、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、または寄生成分などの感染成分以外のものである。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、標的結合ドメインを含んでなる。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドの表面露出部分は、標的に結合する。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドの表面露出部分は、例えば、プロテアーゼ活性などの酵素活性を含んでなる。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドの表面露出部分は、標的を酵素的に修飾し、例えば、切断する。いくつかの実施形態では、標的は、抗薬物抗体と、抗薬物抗体がそれに結合するポリペプチドを含んでなる第1の外因性ポリペプチドと、抗薬物抗体を切断してFab部分およびFc部分を生じるプロテアーゼを含んでなる第2の外因性ポリペプチドとを含んでなる。いくつかの実施形態では、除核赤血球は、第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球より、迅速な速度で対象の身体から標的を排除できる。いくつかの実施形態では、除核赤血球は、標的と、または例えば、切断中に標的に作用する第2の外因性タンパク質の反応生成物と、複合体形成する。
本開示はまた、特定の態様では、膜貫通ドメインと、抗薬物抗体に結合できる表面露出ポリペプチドとを含む第1の外因性ポリペプチド、および
膜貫通ドメインと、表面露出IdeSポリペプチドとを含む第2の外因性ポリペプチド
を含む除核赤血球系細胞を提供する。
膜貫通ドメインと、表面露出IdeSポリペプチドとを含む第2の外因性ポリペプチド
を含む除核赤血球系細胞を提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば、IdeSポリペプチドなどの抗体を切断し得るプロテアーゼと、例えば、I型またはII型赤血球膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインとを含む、ポリペプチドも提供する。本開示はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸も提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば、IdeSポリペプチドなどの抗体を切断し得るプロテアーゼをコードする第1の配列、
例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインをコードする第2の配列、および
任意選択的に、赤血球系細胞において活性なプロモーター配列
を含む核酸も提供し、
第1および第2の配列は作動可能に連結されて融合タンパク質を形成する。
例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインをコードする第2の配列、および
任意選択的に、赤血球系細胞において活性なプロモーター配列
を含む核酸も提供し、
第1および第2の配列は作動可能に連結されて融合タンパク質を形成する。
本開示はまた、いくつかの態様では、
例えば、本明細書に記載の第1の外因性ポリペプチドなどの、標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチドをコードする第1の核酸配列、
例えば、本明細書に記載の第2の核酸配列などの、標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列、および
任意選択的に、赤血球系細胞において活性なプロモーター配列
を含む核酸組成物も提供する。
例えば、本明細書に記載の第1の外因性ポリペプチドなどの、標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチドをコードする第1の核酸配列、
例えば、本明細書に記載の第2の核酸配列などの、標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列、および
任意選択的に、赤血球系細胞において活性なプロモーター配列
を含む核酸組成物も提供する。
いくつかの実施形態では、第1の核酸配列および第2の核酸配列は連続しているか、または別個の分子(例えば、混合分子または別個の容器内)である。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、同一オープンリーディングフレームの一部であり、それらの間に位置するプロテアーゼ切断部位を有する。いくつかの実施形態では、第1の核酸は第1のプロモーターと作動可能に連結され、第2の核酸は第2のプロモーターと作動可能に連結される。
本開示は、いくつかの態様では、
(A)(A-ii)例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインに融合された、(A-i)複数の結合部分(例えば、抗体分子、例えば、scFvドメイン)をコードする核酸、および
(B)任意選択的に、(B-ii)例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインに融合された、(B-i)複数の酵素(例えば、プロテアーゼ)をコードする核酸
を含むキットを提供し、
(A-i)および(A-ii)は、赤血球系細胞における発現を誘導する核酸と作動可能に連結され、(Bi)および(B-ii)は、赤血球系細胞において発現を誘導する核酸と作動可能に連結される。
(A)(A-ii)例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインに融合された、(A-i)複数の結合部分(例えば、抗体分子、例えば、scFvドメイン)をコードする核酸、および
(B)任意選択的に、(B-ii)例えば、膜貫通ドメインなどの膜アンカードメインに融合された、(B-i)複数の酵素(例えば、プロテアーゼ)をコードする核酸
を含むキットを提供し、
(A-i)および(A-ii)は、赤血球系細胞における発現を誘導する核酸と作動可能に連結され、(Bi)および(B-ii)は、赤血球系細胞において発現を誘導する核酸と作動可能に連結される。
本開示は、いくつかの態様では、標的ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、例えば、標的ポリペプチドなどの標的の断片を生産する方法、例えば、第1の標的ドメインを含む標的の断片を生産する方法、例えば、可変領域断片を生産する方法、または定常領域含有断片を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは標的を切断して断片を提供する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドの断片は、免疫応答および/または炎症を活性化しない。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を、標的ポリペプチドを含む対象に投与するステップを含む。
本開示はまた、特定の態様では、例えば、阻害剤(標的)の前駆体を本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、例えば、競合阻害剤などの阻害剤を生産する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、標的と相互作用し、例えば、標的を切断する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、抗体断片(例えば、Fab断片)である。いくつかの実施形態では、標的は抗体であり、それは切断されて、例えば、Fab断片である抗体断片である阻害剤が生じる。いくつかの実施形態では、阻害剤は、免疫応答および/または炎症を活性化しない。いくつかの実施形態では、阻害剤の前駆体は、例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を阻害剤の前駆体を含む対象に投与するステップを含む。
本開示はまた、いくつかの態様では、ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、例えば、プロドラッグを薬物に変換するなど、例えば、ポリペプチドなどの標的を変換しまたは活性化する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、標的(例えば、プロドラッグ)と相互作用し、例えば、標的を切断する。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、薬物は、例えば、Fab断片などの抗体断片である。いくつかの実施形態では、薬物は、免疫応答および/または炎症を活性化しない。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を例えば、プロドラッグなどのポリペプチドを含む対象に投与するステップを含む。
本開示はまた、いくつかの態様では、内因性ポリペプチドを本明細書に記載の赤血球系細胞に接触させるステップを含む、第1の活性状態から第2の活性状態に(例えば、不活性状態から活性状態に、または活性状態から不活性状態に)、内因性ポリペプチドを変換する方法も提供する。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは標的と相互作用し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、標的を切断し、またはそれが別の分子と相互作用する能力、例えば、結合する能力を変化させる。いくつかの実施形態では、内因性ポリペプチドは、例えば、抗薬物抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、赤血球系細胞を、内因性ポリペプチドを含む対象に投与するステップを含む。
本開示は、いくつかの態様では、本明細書に記載の赤血球系細胞を対象に投与するステップを含む、対象において標的(例えば、抗体、例えば、抗薬物抗体)のレベルを低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは標的と相互作用し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、標的を切断し、またはそれが別の分子と相互作用する能力、例えば、結合する能力を変化させる。本開示はまた、特定の態様では、本明細書に記載の赤血球細胞を対象に投与するステップを含む、対象において抗体の阻害性断片(例えば、Fab断片)を生成する方法も提供する。本開示は、本明細書に記載の赤血球系細胞を対象に投与するステップを含む、対象において例えばがんなどの疾患を治療する方法をさらに提供する。
例えば、上述の方法のいずれかの実施形態などのいくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、
標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチド、および
標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドを含み、
(a)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、IdeSポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジとCH2領域との間で抗体を切断する部分を含み;
(b)第2の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、標的は任意選択的に、抗体であり;
(c)第2の外因性ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、標的が、例えば、第1の外因性ポリペプチドまたは第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、標的は抗体または補体因子を含み;
(d)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含み;
(e)標的は、ポリペプチド;炭水化物(例えば、グリカン)、脂質(例えば、リン脂質)、または核酸(例えば、DNA、またはRNA)であり;
(f)第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し;
(g)標的は抗体を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の可変領域に結合し;
(h)標的は抗体を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の定常領域に結合し;
(i)第1の外因性ポリペプチドは、約1~2pM、2~5pM、5~10pM、10~20pM、20~50pM、50~100pM、100~200pM、200~500pM、500~1000pM、1~2nM、2~5nM、5~10nM、10~20nM、20~50nM、50~100nM、100~200nM、200~500nM、500~1000nM、1~2μM、2~5μM、5~10μM、10~20μM、20~50μM、または50~7μMの標的親和性を有し;
(j)第2の外因性ポリペプチドは、約10-1~10-7M、10-1~10-2M、10-2~10-3M、10-3~10-4M、10-4~10-5M、10-5~10-6M、または10-6~10-7MのKMを有し;
(k)標的に対する第2の外因性ポリペプチドのKM(M単位で測定)で除した、標的に対する第1の外因性ポリペプチドのKd(M単位で測定)の比率は、約1×10-9~2×10-9、2×10-9~5×10-9、5×10-9~1×10-8、1×10-8~2×10-8、2×10-8~5×10-8、5×10-8~1×10-7、1×10-7~2×10-7、2×10-7~5×10-7、5×10-7~1×10-6、1×10-6~2×10-6、2×10-6~5×10-6、5×10-6~1×10-5、1×10-5~2×10-5、2×10-5~5×10-5、5×10-5~1×10-4、1×10-4~2×10-4、2×10-4~5×10-4、5×10-4~1×10-3、1×10-3~2×10-3、2×10-3~5×10-3、5×10-3~1×10-2、1×10-2~2×10-2、2×10-2~5×10-2、5×10-2~1×10-1、1×10-1~2×10-1、2×10-1~5×10-1、または5×10-1~1であり;
(l)標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドの観察された反応速度は、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが第1の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く;
(m)赤血球系細胞上の第2の外因性ポリペプチドの平均数に対する、赤血球系細胞上の第1の外因性ポリペプチドの平均数の比率は、約50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、または1:50であり;
(n)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性は、修飾された(例えば、切断された)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性より高く;
(o)除核赤血球系細胞の治療有効用量は、投与時における対象の末梢血中の標的の量に対する化学量論比より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(p)有効用量中の除核赤血球系細胞数は、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的分子などの標的数より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(q)第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(r)第1の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(s)第1の外因性ポリペプチドの数および第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、それぞれ標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(t)第2の外因性ポリペプチドは、少なくとも10-1M、10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、または10-7MのKMで標的を修飾し(例えば、切断し);
(u)第2の外因性ポリペプチドは、シャペロンを含み;
(v)第1の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み、第2の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み;または
(w)除核赤血球系細胞の有効量は、第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)
の1つまたは複数である。
標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチド、および
標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドを含み、
(a)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、IdeSポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジとCH2領域との間で抗体を切断する部分を含み;
(b)第2の外因性ポリペプチドは、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、標的は任意選択的に、抗体であり;
(c)第2の外因性ポリペプチドは、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、標的が、例えば、第1の外因性ポリペプチドまたは第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、標的は抗体または補体因子を含み;
(d)第2の外因性ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含み;
(e)標的は、ポリペプチド;炭水化物(例えば、グリカン)、脂質(例えば、リン脂質)、または核酸(例えば、DNA、またはRNA)であり;
(f)第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し;
(g)標的は抗体を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の可変領域に結合し;
(h)標的は抗体を含み、第1の外因性ポリペプチドは抗体標的の定常領域に結合し;
(i)第1の外因性ポリペプチドは、約1~2pM、2~5pM、5~10pM、10~20pM、20~50pM、50~100pM、100~200pM、200~500pM、500~1000pM、1~2nM、2~5nM、5~10nM、10~20nM、20~50nM、50~100nM、100~200nM、200~500nM、500~1000nM、1~2μM、2~5μM、5~10μM、10~20μM、20~50μM、または50~7μMの標的親和性を有し;
(j)第2の外因性ポリペプチドは、約10-1~10-7M、10-1~10-2M、10-2~10-3M、10-3~10-4M、10-4~10-5M、10-5~10-6M、または10-6~10-7MのKMを有し;
(k)標的に対する第2の外因性ポリペプチドのKM(M単位で測定)で除した、標的に対する第1の外因性ポリペプチドのKd(M単位で測定)の比率は、約1×10-9~2×10-9、2×10-9~5×10-9、5×10-9~1×10-8、1×10-8~2×10-8、2×10-8~5×10-8、5×10-8~1×10-7、1×10-7~2×10-7、2×10-7~5×10-7、5×10-7~1×10-6、1×10-6~2×10-6、2×10-6~5×10-6、5×10-6~1×10-5、1×10-5~2×10-5、2×10-5~5×10-5、5×10-5~1×10-4、1×10-4~2×10-4、2×10-4~5×10-4、5×10-4~1×10-3、1×10-3~2×10-3、2×10-3~5×10-3、5×10-3~1×10-2、1×10-2~2×10-2、2×10-2~5×10-2、5×10-2~1×10-1、1×10-1~2×10-1、2×10-1~5×10-1、または5×10-1~1であり;
(l)標的を修飾する第2の外因性ポリペプチドの観察された反応速度は、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが第1の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く;
(m)赤血球系細胞上の第2の外因性ポリペプチドの平均数に対する、赤血球系細胞上の第1の外因性ポリペプチドの平均数の比率は、約50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、または1:50であり;
(n)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性は、修飾された(例えば、切断された)標的に対する第1の外因性ポリペプチドの親和性より高く;
(o)除核赤血球系細胞の治療有効用量は、投与時における対象の末梢血中の標的の量に対する化学量論比より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(p)有効用量中の除核赤血球系細胞数は、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的分子などの標的数より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(q)第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(r)第1の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(s)第1の外因性ポリペプチドの数および第2の外因性ポリペプチドの数は、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、それぞれ標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における対象の末梢血中の標的の数より少なく;
(t)第2の外因性ポリペプチドは、少なくとも10-1M、10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、または10-7MのKMで標的を修飾し(例えば、切断し);
(u)第2の外因性ポリペプチドは、シャペロンを含み;
(v)第1の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み、第2の外因性ポリペプチドは表面露出部分を含み;または
(w)除核赤血球系細胞の有効量は、第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)
の1つまたは複数である。
例えば、融合タンパク質などの外因性ポリペプチドが関与する、本明細書に記載の組成物および方法のいずれかのいくつかの実施形態では、
i)赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、同一配列を有し;
ii)融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、同一膜貫通領域であり;
iii)融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば、完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含み、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、または500個のアミノ酸を欠き;
iv)融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%は、1、2、3、4、5、10、20、または50個のアミノ酸を超えて互いに異ならず;
v)外因性ポリペプチドは、ソルターゼ移入シグネチャを欠き;
vi)外因性ポリペプチドは、1、2、3、4、または5個未満の配列の異なる融合ポリペプチド上に存在する部分を含み;
vii)外因性ポリペプチドは、単一の融合ポリペプチドとして存在し;
viii)融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にGly-Glyを含有せず;
ix)融合タンパク質はGly-Glyを含有せず、または融合タンパク質はGly-Glyを含有せず、または細胞外領域にGly-Glyを含有せず、膜貫通部分の1、2、3、4、5、10、20、50、または100個のアミノ酸内の細胞外領域にGly-Glyを含有せず;またはそれらの組み合わせである。
i)赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、同一配列を有し;
ii)融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、同一膜貫通領域であり;
iii)融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば、完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含み、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、または500個のアミノ酸を欠き;
iv)融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%は、1、2、3、4、5、10、20、または50個のアミノ酸を超えて互いに異ならず;
v)外因性ポリペプチドは、ソルターゼ移入シグネチャを欠き;
vi)外因性ポリペプチドは、1、2、3、4、または5個未満の配列の異なる融合ポリペプチド上に存在する部分を含み;
vii)外因性ポリペプチドは、単一の融合ポリペプチドとして存在し;
viii)融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にGly-Glyを含有せず;
ix)融合タンパク質はGly-Glyを含有せず、または融合タンパク質はGly-Glyを含有せず、または細胞外領域にGly-Glyを含有せず、膜貫通部分の1、2、3、4、5、10、20、50、または100個のアミノ酸内の細胞外領域にGly-Glyを含有せず;またはそれらの組み合わせである。
本明細書に記載の細胞系は、細胞系の一部ではない別の(1つまたは複数の)抗増殖性、抗新生物性または抗腫瘍性の薬物または治療と組み合わせて使用されてもよい。このような薬物または治療としては、例えば、細胞毒性薬(例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、コルチコステロイド)などの化学療法薬;チロシンキナーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤などのがん増殖遮断薬;T細胞療法(例えば、CAR-T細胞療法)(例えば、PMID:26611350を参照されたい)、ナチュラルキラー(NK)細胞免疫調節(例えば、PMID:26697006を参照されたい);およびがんワクチン(PMID:26579225);L-アスパラギナーゼおよびボルテゾミブ(Velcade(登録商標))などのその他の化学薬品が挙げられる。例えば、ホルモン感受性がんのために、ホルモン療法(または抗ホルモン療法)が使用され得る。
本明細書に記載の細胞系は、外科手術、放射線療法、または寒冷療法などのがんのための非薬物治療と組み合わせて使用されてもよい。場合によっては、本発明の治療方法は、2つまたはそれ以上のその他の治療法または薬物と組み合わされた本明細書に記載の細胞系を含んでもよく、例えば、乳がんは、外科手術または放射線療法と組み合わせた本明細書に記載の細胞系と、化学療法カクテルまたは生物学的製剤(例えば、抗HER2抗体)との組み合わせで治療されてもよい。
本開示は、前述の態様および/または実施形態の任意の1つまたは複数の全ての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載される実施形態の任意の1つまたは複数との組み合わせを検討する。
本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で用いられ得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献(例えば、配列データベース参照番号)は、その全体が参照により援用される。例えば、本明細書において、例えば、本明細書中の任意の表において参照される全てのGenBank、Unigene、およびEntrez配列は、参照により援用される。別段の指定がない限り、本明細書中の任意の表を含む本明細書で特定される配列受入番号は、2016年1月11日現在のデータベース入力項目を参照する。1つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受入番号を参照する場合、配列変異型の全てが包含される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
複数の第1および第2の外因性ポリペプチドが、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性を有する、複数の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球。
(項目2)
第1の外因性ポリペプチド、第2の外因性ポリペプチド、および第3の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球。
(項目3)
第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球であって、
a)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが同一標的に作用し、任意選択的に、前記標的が細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり;
b)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の内因性ヒトタンパク質に、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の内因性ヒト標的タンパク質に、例えば、500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdで結合し;
c)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第1および第2の標的が同一生物学的経路の構成要素であり、任意選択的に、前記標的が細胞表面受容体、内因性ヒトタンパク質、またはその双方であり;
d)前記第1の外因性ポリペプチドが第1のアポトーシス促進ポリペプチドを含み、前記第2の外因性ポリペプチドが第2のアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、TRAIL受容体リガンド、例えば、TRAILポリペプチドを含み;
e)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが互いに近接しており、少なくとも1、2、5、10、30、または60秒間;1、2、5、10、30、または60分間、または1、2、3、6、12、または14時間にわたり、例えば、10、7、5、4、3、2、1、0.5、0.2、または0.1nm未満の間隔であり;
f)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが、互いに500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdを有し;
g)前記第1の外因性ポリペプチドが、抗原提示ポリペプチド、例えば、MHC分子、例えば、MHCクラスII分子を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが、抗原、例えば、がん抗原を含み;
h)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが異なる標的に作用し、任意選択的に、前記標的の少なくとも1つが細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドが第1の細胞型、例えば、がん細胞に結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に結合し;
i)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の存在比を有し;
j)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、それぞれ、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の比率で、第1の標的および第2の標的に対するKdを有し;
k)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に対する第1の活性(例えば、結合)を有し、前記第2の外因性ポリペプチドが第1の標的に対する第2の活性(例えば、結合)を有し、例えば、前記第1および第2の外因性ポリペプチドが単一標的に結合し;
l)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第1および第2の標的は同一経路の部分であり、任意選択的に、前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し、同時に前記第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し;
m)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第1および第2の標的が様々な経路の部分であり、任意選択的に、前記第1および第2の経路がどちらも所与の細胞性応答を促進するように作用し;
n)前記第1の外因性ポリペプチドが、除核赤血球を例えば、ヒト細胞などの所望の部位に局在させ、前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、T細胞活性化活性、例えば、T細胞阻害活性または抗原提示活性などの免疫調節活性などの治療活性を有し;
o)前記第1の外因性ポリペプチドが例えば、第1の細胞型、例えばがん細胞などの第1の細胞に結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが例えば、第2の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞などの第2の細胞に結合し;
p)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、非ヒトタンパク質であり;
q)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドがどちらも、例えば、生合成酵素などの酵素であり;
r)前記第1の外因性ポリペプチドが中間分子の形成を促進し、前記第2の外因性ポリペプチドが中間分子に作用し;または
s)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、経路の連続的段階に作用する、除核赤血球。
(項目4)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが薬剤相加的活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目5)
前記第1のポリペプチドが(例えば、抗EPCAM分子を含んでなる)がん細胞に結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが(例えば、抗CD45抗体分子を含んでなる)がん細胞に結合する、項目4に記載の除核赤血球。
(項目6)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが薬剤相乗的活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目7)
前記第1の外因性ポリペプチドが、アポトーシスを媒介する第1の細胞受容体に対するリガンド(例えば、TRAIL受容体に対するリガンドであり、例えば、TRAILポリペプチドを含む)を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが、アポトーシスを媒介する第1の細胞受容体に対するリガンド(例えば、TRAIL受容体に対するリガンドであり、例えば、TRAILポリペプチドを含む)を含む、項目6に記載の除核赤血球。
(項目8)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが乗法的活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目9)
前記第1の外因性ポリペプチドが、表2のT細胞活性化リガンドまたはそのT細胞活性化変異型(例えば、断片)を含んでなり、前記第2の外因性ポリペプチドが、表2の第2のT細胞活性化リガンドまたはそのT細胞活性化変異型(例えば、断片)を含んでなる、項目8に記載の除核赤血球。
(項目10)
前記第1の外因性ポリペプチドが、表3の阻害性リガンドの阻害剤またはその阻害性断片もしくは変異型を含んでなり、前記第2の外因性ポリペプチドが、表3の阻害性リガンドの第2の阻害剤またはその阻害性断片もしくは変異型を含んでなる、項目8に記載の除核赤血球。
(項目11)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが独立機能活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目12)
前記第1の外因性ポリペプチドが第1のサイトカインに結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが第2のサイトカインに結合する、項目11に記載の除核赤血球。
(項目13)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが局在ベース活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目14)
前記第1の外因性ポリペプチドが、がん細胞にまたはその近くに結合する(例えば、腫瘍新生血管に結合する)標的化部分を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが、抗がん機能(例えば、酵素、血管新生阻害剤、免疫賦活性分子、またはアポトーシス促進剤を含んでなる)を有する、項目13に記載の除核赤血球。
(項目15)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが近接依存性活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目16)
標的部分または部分群との相互作用の前、最中、または後において、複数のポリペプチド間の近接性が、生体内または生体外でこのような近接性の非存在下では見られない性質または結果を与える、項目15項に記載の除核赤血球。
(項目17)
前記第1の外因性ポリペプチドが、例えば、標的細胞(例えば、T細胞などの免疫エフェクター細胞)上の第1の標的細胞ポリペプチドなどの第1の標的部分と相互作用し、例えば、結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、前記標的細胞(例えば、その中で前記第1および第2の標的細胞ポリペプチドの結合が、前記細胞の生物学的特性を変化させる)上の第2の標的細胞ポリペプチドなどの第2の標的部分と相互作用し、例えば、結合する、項目15に記載の除核赤血球。
(項目18)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドがスキャフォールドベース活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目19)
前記第1のポリペプチドががん細胞の細胞表面マーカー(例えば、CD19、EpCAM、CD20、CD45、EGFR、またはHER2)に結合し、前記第2のポリペプチドが免疫エフェクター細胞(例えば、CD3)の細胞表面マーカーに結合する、項目18に記載の除核赤血球。
(項目20)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが多量体ベース活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目21)
前記第1の外因性ポリペプチドがMHCIIα鎖を含み、前記第2の外因性ポリペプチドがMHCIIβ鎖ポリペプチドを含む、項目20に記載の除核赤血球。
(項目22)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが代償性活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目23)
前記第1の外因性ポリペプチドが治療用タンパク質であり、前記第2の外因性ポリペプチドが第1の外因性ポリペプチドの阻害剤であり、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドが前記第2の外因性ポリペプチドに結合するよりも、前記第1の外因性ポリペプチドが前記標的により強力に結合する、項目22に記載の除核赤血球。
(項目24)
前記第1の外因性ポリペプチドが抗CD40抗体分子を含んでなり、前記第2の外因性ポリペプチドがCD40またはその断片もしくは変異型を含んでなる、項目22に記載の除核赤血球。
(項目25)
前記第1の外因性ポリペプチドが、前記赤血球の標的細胞との融合を促進し、前記第2の外因性ポリペプチドが、表1、表2、または表3のいずれかのポリペプチドである、項目1~24のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目26)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが相互に作用し、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドが例えば、切断またはリン酸化によって前記第2の外因性ポリペプチドを修飾する、項目1~25のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目27)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが、二量体または多量体タンパク質を形成する、項目1~26のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目28)
少なくとも2つであるが、5、6、7、8、9、または10以下の異なる外因性ポリペプチド、例えば、前記除核赤血球によって保持されない1つまたは複数の外因性核酸によってコードされる外因性ポリペプチドを含む、項目1~27のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目29)
前記外因性ポリペプチドが、前記除核赤血球によって保持されない1つまたは複数の外因性核酸によってコードされる、項目1~28のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目30)
前記第1、第2、および任意選択的に、第3の外因性ポリペプチドの1つまたは複数(例えば、2または3つ)が、膜貫通ポリペプチドまたは表面アンカー型ポリペプチドである、項目1~29のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目31)
前記第1の外因性ポリペプチドが、標的細胞上の部分と相互作用し、例えば、結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが前記標的細胞の特性を変化させ、例えば、前記標的細胞を殺滅しまたは活性化する、項目1~30のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目32)
前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、または約100:1~1:100の存在比を有する、項目1~31のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目33)
前記第1および第2のポリペプチドの双方が化学量論的作用機序を有するか、またはその双方が触媒作用機序を有し、どちらも例えば、約1:1または約2:1~1:2などの同様の存在量で存在する、項目1~32のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目34)
前記第1の外因性ポリペプチドが、前記第2の外因性ポリペプチドよりも、重量またはコピー数基準で少なくとも約10%、20%、30%、50%、または2、3、4、5、10、20、50、または100倍豊富である(任意選択的に10倍または100倍に至る)、項目1~33のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目35)
前記第1のポリペプチドが化学量論的作用機序を有し、前記第2のポリペプチドが触媒作用機序を有し、前記第1のポリペプチドが前記第2のポリペプチドよりも豊富である、項目1~34のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目36)
a)0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、または0.5%のNaClでの50%未満の細胞溶解の浸透圧脆性;
b)約10~200fLの細胞容積、または約1ミクロン~約20ミクロン、約2ミクロン~約20ミクロン、約3ミクロン~約20ミクロン、約4ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約20ミクロン、約6ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約15ミクロン、または約10ミクロン~約30ミクロンの細胞の直径;
c)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%を超える胎児ヘモグロビン;または少なくとも約20、25、または30pg/細胞のヘモグロビン;または
d)アネキシンV染色による測定で、30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の細胞表面側のホスファチジルセリン含有量
の1つまたは複数の特性を有する、項目1~35のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目37)
複数の外因性ポリペプチドの少なくとも1つ、例えば、全部が、グリコシル化されている、項目1~36のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目38)
網状赤血球である、項目1~37のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目39)
前記外因性ポリペプチドまたはポリペプチド群が、LPXTG(配列番号17)などのソルターゼ移入シグネチャを欠く、項目1~38のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目40)
例えば、融合タンパク質などの外因性ポリペプチドが、
i)赤血球系細胞表面の前記融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が同一配列を有し;
ii)前記融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、同一膜貫通領域であり;
iii)前記融合タンパク質が完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば、完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含み、このセグメントが、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、または500個のアミノ酸を欠き;
iv)前記融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、1、2、3、4、5、10、20、または50個のアミノ酸を超えて互いに異ならず;
v)前記外因性ポリペプチドは、ソルターゼ移入シグネチャを欠き;
vi)前記外因性ポリペプチドが、1、2、3、4、または5未満の配列の異なる融合ポリペプチド上に存在する部分を含み;
vii)前記外因性ポリペプチドが、単一の融合ポリペプチドとして存在し;
viii)前記融合タンパク質が、内因性膜貫通タンパク質と前記部分との接合部にGly-Glyを含有せず;
ix)前記融合タンパク質がGly-Glyを含有せず、または前記融合タンパク質がGly-Glyを含有せず、または細胞外領域にGly-Glyを含有せず、膜貫通部分の1、2、3、4、5、10、20、50、または100個のアミノ酸内の細胞外領域にGly-Glyを含有せず;
またはそれらの組み合わせである、項目1~39のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目41)
標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチド、および
標的を修飾する第2の外因性ポリペプチド
を含む除核赤血球系細胞であって、
(a)前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、IdeSポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジとCH2領域との間で抗体を切断する部分を含み;
(b)前記第2の外因性ポリペプチドが、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを前記標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、前記標的が任意選択的に、抗体であり;
(c)前記第2の外因性ポリペプチドが、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、前記標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、前記標的が、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドまたは前記第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、前記標的が抗体を含み;
(d)前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含み;
(e)前記標的が、ポリペプチド;炭水化物(例えば、グリカン)、脂質(例えば、リン脂質)、または核酸(例えば、DNAまたはRNA)であり;
(f)前記第1の外因性ポリペプチドが、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し;
(g)前記標的が抗体を含み、前記第1の外因性ポリペプチドが前記抗体標的の可変領域に結合し;
(h)前記標的が抗体を含み、前記第1の外因性ポリペプチドが抗体標的の定常領域に結合し;
(i)前記第1の外因性ポリペプチドが、約1~2pM、2~5pM、5~10pM、10~20pM、20~50pM、50~100pM、100~200pM、200~500pM、500~1000pM、1~2nM、2~5nM、5~10nM、10~20nM、20~50nM、50~100nM、100~200nM、200~500nM、500~1000nM、1~2μM、2~5μM、5~10μM、10~20μM、20~50μM、または50~100μMの標的親和性を有し;
(j)前記第2の外因性ポリペプチドが、前記標的に対して約10-1~10-7M、10-1~10-2M、10-2~10-3M、10-3~10-4M、10-4~10-5M、10-5~10-6M、または10-6~10-7MのKMを有し;
(k)前記標的に対する前記第2の外因性ポリペプチドのKM(M単位で測定)で除した、前記標的に対する前記第1の外因性ポリペプチドのKd(M単位で測定)の比率が、約1×10-9~2×10-9、2×10-9~5×10-9、5×10-9~1×10-8、1×10-8~2×10-8、2×10-8~5×10-8、5×10-8~1×10-7、1×10-7~2×10-7、2×10-7~5×10-7、5×10-7~1×10-6、1×10-6~2×10-6、2×10-6~5×10-6、5×10-6~1×10-5、1×10-5~2×10-5、2×10-5~5×10-5、5×10-5~1×10-4、1×10-4~2×10-4、2×10-4~5×10-4、5×10-4~1×10-3、1×10-3~2×10-3、2×10-3~5×10-3、5×10-3~1×10-2、1×10-2~2×10-2、2×10-2~5×10-2、5×10-2~1×10-1、1×10-1~2×10-1、2×10-1~5×10-1、または5×10-1~1であり;
(l)前記標的を修飾する前記第2の外因性ポリペプチドの観察された反応速度が、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが前記第1の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く;
(m)前記赤血球系細胞上の前記第2の外因性ポリペプチドの平均数に対する、前記赤血球系細胞上の前記第1の外因性ポリペプチドの平均数の比率が、約50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、または1:50であり;
(n)前記標的に対する前記第1の外因性ポリペプチドの親和性が、前記修飾された(例えば、切断された)標的に対する前記第1の外因性ポリペプチドの親和性より高く;
(o)前記除核赤血球系細胞の治療有効用量が、投与時における対象の末梢血中の前記標的の量に対する化学量論比より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(p)有効用量中の前記除核赤血球系細胞数が、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の標的分子などの前記標的の数より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(q)前記第2の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく;
(r)前記第1の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく;
(s)前記第1の外因性ポリペプチドの数および前記第2の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、それぞれ標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく;
(t)前記第2の外因性ポリペプチドが、少なくとも10-1M、10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、または10-7MのKMで標的を修飾し(例えば、切断し);
(u)前記第2の外因性ポリペプチドが、シャペロンを含み;
(v)前記第1の外因性ポリペプチドが表面露出部分を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが表面露出部分を含み;または
(w)前記除核赤血球系細胞の有効量が、前記第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)
の1つまたは複数である、除核赤血球系細胞。
(項目42)
(b)前記第2の外因性ポリペプチドが、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを前記標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、前記標的は任意選択的に、例えば、抗薬物抗体などの抗体である、項目41に記載の除核赤血球系細胞。
(項目43)
前記修飾が、前記標的が、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドまたは前記第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、増加または減少させる、項目41または42に記載の除核赤血球系細胞。
(項目44)
(d)前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドなどの前記標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含む、項目41~43のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目45)
前記第1の標的ドメインが前記第2の標的ドメインから放出される、項目44に記載の除核赤血球系細胞。
(項目46)
切断が、前記第1の基質に対する前記第1の標的ドメインの親和性、および前記第2の基質に対する前記第2の標的ドメインの親和性の片方または双方を変化させる、項目44または45に記載の除核赤血球系細胞。
(項目47)
前記標的が抗体を含み、前記第1の標的ドメインが1つまたは複数のCDR含み、前記第2の標的ドメインが例えば、Fc領域などの定常領域の一部を含む、項目41~46のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目48)
前記標的が、感染成分以外の、例えば、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、または寄生成分以外のものである、項目41~47のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目49)
前記第1の外因性ポリペプチドが、標的結合ドメインを含む、項目41~48のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目50)
前記第1の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、前記標的に結合する、項目41~49のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目51)
前記第2の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、例えば、プロテアーゼ活性などの酵素活性を含む、項目41~50のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目52)
前記第2の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、前記標的を酵素的に修飾し、例えば、切断する、項目41~51のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目53)
前記標的が抗薬物抗体を含み、前記第1の外因性ポリペプチドがそれに対して抗薬物抗体が結合するポリペプチドを含み、前記第2の外因性ポリペプチドが抗薬物抗体を切断してFab部分およびFc部分を生じるプロテアーゼを含む、項目41~52のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目54)
前記除核赤血球が、前記第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球よりも速い速度で、対象の身体から前記標的を排除できる、項目41~53のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目55)
前記除核赤血球が、前記標的と、または例えば、切断中に前記標的に作用する前記第2の外因性タンパク質の反応生成物と、複合体形成する、項目41~54のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目56)
膜貫通ドメインと、抗薬物抗体に結合できる表面露出ポリペプチドとを含む第1の外因性ポリペプチド、および
膜貫通ドメインおよび表面露出IdeSポリペプチドを含む第2の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球系細胞。
(項目57)
例えば、少なくとも108、109、1010、1011、または1012個の細胞などの項目1~56のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む医薬品などの製剤。
(項目58)
がんを治療するための、項目1~56のいずれか一項に記載の細胞。
(項目59)
前記がんが、(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん(cancer of unknown primary)、骨転移がん、脳転移がん、肝臓転移がん、肺転移がん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん(gastric cancer)、妊娠性絨毛腫瘍(GTT)、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、NSCLC、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻および洞がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫(NHL)、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん(非黒色腫)、軟部組織肉腫、胃がん(stomach cancer)、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん(unknown primary cancer)、子宮がん、膣がん、および外陰部がんから選択される、項目58に記載の細胞。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
複数の第1および第2の外因性ポリペプチドが、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性を有する、複数の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球。
(項目2)
第1の外因性ポリペプチド、第2の外因性ポリペプチド、および第3の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球。
(項目3)
第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドを含む、例えば、網状赤血球などの除核赤血球であって、
a)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが同一標的に作用し、任意選択的に、前記標的が細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり;
b)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の内因性ヒトタンパク質に、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の内因性ヒト標的タンパク質に、例えば、500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdで結合し;
c)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第1および第2の標的が同一生物学的経路の構成要素であり、任意選択的に、前記標的が細胞表面受容体、内因性ヒトタンパク質、またはその双方であり;
d)前記第1の外因性ポリペプチドが第1のアポトーシス促進ポリペプチドを含み、前記第2の外因性ポリペプチドが第2のアポトーシス促進ポリペプチド、例えば、TRAIL受容体リガンド、例えば、TRAILポリペプチドを含み;
e)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが互いに近接しており、少なくとも1、2、5、10、30、または60秒間;1、2、5、10、30、または60分間、または1、2、3、6、12、または14時間にわたり、例えば、10、7、5、4、3、2、1、0.5、0.2、または0.1nm未満の間隔であり;
f)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが、互いに500、200、100、50、20、10、5、2、または1nM未満のKdを有し;
g)前記第1の外因性ポリペプチドが、抗原提示ポリペプチド、例えば、MHC分子、例えば、MHCクラスII分子を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが、抗原、例えば、がん抗原を含み;
h)前記第1および第2の外因性ポリペプチドが異なる標的に作用し、任意選択的に、前記標的の少なくとも1つが細胞表面受容体および/または内因性ヒトタンパク質であり、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドが第1の細胞型、例えば、がん細胞に結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に結合し;
i)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の存在比を有し;
j)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、それぞれ、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、約100:1~1:100の比率で、第1の標的および第2の標的に対するKdを有し;
k)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に対する第1の活性(例えば、結合)を有し、前記第2の外因性ポリペプチドが第1の標的に対する第2の活性(例えば、結合)を有し、例えば、前記第1および第2の外因性ポリペプチドが単一標的に結合し;
l)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第1および第2の標的は同一経路の部分であり、任意選択的に、前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し、同時に前記第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し;
m)前記第1の外因性ポリペプチドが第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドが第2の標的に作用し(例えば、結合し)、前記第1および第2の標的が様々な経路の部分であり、任意選択的に、前記第1および第2の経路がどちらも所与の細胞性応答を促進するように作用し;
n)前記第1の外因性ポリペプチドが、除核赤血球を例えば、ヒト細胞などの所望の部位に局在させ、前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、T細胞活性化活性、例えば、T細胞阻害活性または抗原提示活性などの免疫調節活性などの治療活性を有し;
o)前記第1の外因性ポリペプチドが例えば、第1の細胞型、例えばがん細胞などの第1の細胞に結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが例えば、第2の細胞型、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞などの第2の細胞に結合し;
p)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、非ヒトタンパク質であり;
q)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドがどちらも、例えば、生合成酵素などの酵素であり;
r)前記第1の外因性ポリペプチドが中間分子の形成を促進し、前記第2の外因性ポリペプチドが中間分子に作用し;または
s)前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、経路の連続的段階に作用する、除核赤血球。
(項目4)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが薬剤相加的活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目5)
前記第1のポリペプチドが(例えば、抗EPCAM分子を含んでなる)がん細胞に結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが(例えば、抗CD45抗体分子を含んでなる)がん細胞に結合する、項目4に記載の除核赤血球。
(項目6)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが薬剤相乗的活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目7)
前記第1の外因性ポリペプチドが、アポトーシスを媒介する第1の細胞受容体に対するリガンド(例えば、TRAIL受容体に対するリガンドであり、例えば、TRAILポリペプチドを含む)を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが、アポトーシスを媒介する第1の細胞受容体に対するリガンド(例えば、TRAIL受容体に対するリガンドであり、例えば、TRAILポリペプチドを含む)を含む、項目6に記載の除核赤血球。
(項目8)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが乗法的活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目9)
前記第1の外因性ポリペプチドが、表2のT細胞活性化リガンドまたはそのT細胞活性化変異型(例えば、断片)を含んでなり、前記第2の外因性ポリペプチドが、表2の第2のT細胞活性化リガンドまたはそのT細胞活性化変異型(例えば、断片)を含んでなる、項目8に記載の除核赤血球。
(項目10)
前記第1の外因性ポリペプチドが、表3の阻害性リガンドの阻害剤またはその阻害性断片もしくは変異型を含んでなり、前記第2の外因性ポリペプチドが、表3の阻害性リガンドの第2の阻害剤またはその阻害性断片もしくは変異型を含んでなる、項目8に記載の除核赤血球。
(項目11)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが独立機能活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目12)
前記第1の外因性ポリペプチドが第1のサイトカインに結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが第2のサイトカインに結合する、項目11に記載の除核赤血球。
(項目13)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが局在ベース活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目14)
前記第1の外因性ポリペプチドが、がん細胞にまたはその近くに結合する(例えば、腫瘍新生血管に結合する)標的化部分を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが、抗がん機能(例えば、酵素、血管新生阻害剤、免疫賦活性分子、またはアポトーシス促進剤を含んでなる)を有する、項目13に記載の除核赤血球。
(項目15)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが近接依存性活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目16)
標的部分または部分群との相互作用の前、最中、または後において、複数のポリペプチド間の近接性が、生体内または生体外でこのような近接性の非存在下では見られない性質または結果を与える、項目15項に記載の除核赤血球。
(項目17)
前記第1の外因性ポリペプチドが、例えば、標的細胞(例えば、T細胞などの免疫エフェクター細胞)上の第1の標的細胞ポリペプチドなどの第1の標的部分と相互作用し、例えば、結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、前記標的細胞(例えば、その中で前記第1および第2の標的細胞ポリペプチドの結合が、前記細胞の生物学的特性を変化させる)上の第2の標的細胞ポリペプチドなどの第2の標的部分と相互作用し、例えば、結合する、項目15に記載の除核赤血球。
(項目18)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドがスキャフォールドベース活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目19)
前記第1のポリペプチドががん細胞の細胞表面マーカー(例えば、CD19、EpCAM、CD20、CD45、EGFR、またはHER2)に結合し、前記第2のポリペプチドが免疫エフェクター細胞(例えば、CD3)の細胞表面マーカーに結合する、項目18に記載の除核赤血球。
(項目20)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが多量体ベース活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目21)
前記第1の外因性ポリペプチドがMHCIIα鎖を含み、前記第2の外因性ポリペプチドがMHCIIβ鎖ポリペプチドを含む、項目20に記載の除核赤血球。
(項目22)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが代償性活性を有する、項目1~3のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目23)
前記第1の外因性ポリペプチドが治療用タンパク質であり、前記第2の外因性ポリペプチドが第1の外因性ポリペプチドの阻害剤であり、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドが前記第2の外因性ポリペプチドに結合するよりも、前記第1の外因性ポリペプチドが前記標的により強力に結合する、項目22に記載の除核赤血球。
(項目24)
前記第1の外因性ポリペプチドが抗CD40抗体分子を含んでなり、前記第2の外因性ポリペプチドがCD40またはその断片もしくは変異型を含んでなる、項目22に記載の除核赤血球。
(項目25)
前記第1の外因性ポリペプチドが、前記赤血球の標的細胞との融合を促進し、前記第2の外因性ポリペプチドが、表1、表2、または表3のいずれかのポリペプチドである、項目1~24のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目26)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが相互に作用し、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドが例えば、切断またはリン酸化によって前記第2の外因性ポリペプチドを修飾する、項目1~25のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目27)
前記第1および第2の外因性ポリペプチドが、二量体または多量体タンパク質を形成する、項目1~26のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目28)
少なくとも2つであるが、5、6、7、8、9、または10以下の異なる外因性ポリペプチド、例えば、前記除核赤血球によって保持されない1つまたは複数の外因性核酸によってコードされる外因性ポリペプチドを含む、項目1~27のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目29)
前記外因性ポリペプチドが、前記除核赤血球によって保持されない1つまたは複数の外因性核酸によってコードされる、項目1~28のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目30)
前記第1、第2、および任意選択的に、第3の外因性ポリペプチドの1つまたは複数(例えば、2または3つ)が、膜貫通ポリペプチドまたは表面アンカー型ポリペプチドである、項目1~29のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目31)
前記第1の外因性ポリペプチドが、標的細胞上の部分と相互作用し、例えば、結合し、前記第2の外因性ポリペプチドが前記標的細胞の特性を変化させ、例えば、前記標的細胞を殺滅しまたは活性化する、項目1~30のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目32)
前記第1の外因性ポリペプチドおよび前記第2の外因性ポリペプチドが、重量基準またはコピー数基準で、約1:1、約2:1~1:2、約5:1~1:5、約10:1~1:10、約20:1~1:20、約50:1~1:50、または約100:1~1:100の存在比を有する、項目1~31のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目33)
前記第1および第2のポリペプチドの双方が化学量論的作用機序を有するか、またはその双方が触媒作用機序を有し、どちらも例えば、約1:1または約2:1~1:2などの同様の存在量で存在する、項目1~32のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目34)
前記第1の外因性ポリペプチドが、前記第2の外因性ポリペプチドよりも、重量またはコピー数基準で少なくとも約10%、20%、30%、50%、または2、3、4、5、10、20、50、または100倍豊富である(任意選択的に10倍または100倍に至る)、項目1~33のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目35)
前記第1のポリペプチドが化学量論的作用機序を有し、前記第2のポリペプチドが触媒作用機序を有し、前記第1のポリペプチドが前記第2のポリペプチドよりも豊富である、項目1~34のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目36)
a)0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、または0.5%のNaClでの50%未満の細胞溶解の浸透圧脆性;
b)約10~200fLの細胞容積、または約1ミクロン~約20ミクロン、約2ミクロン~約20ミクロン、約3ミクロン~約20ミクロン、約4ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約20ミクロン、約6ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約15ミクロン、または約10ミクロン~約30ミクロンの細胞の直径;
c)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%を超える胎児ヘモグロビン;または少なくとも約20、25、または30pg/細胞のヘモグロビン;または
d)アネキシンV染色による測定で、30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満の細胞表面側のホスファチジルセリン含有量
の1つまたは複数の特性を有する、項目1~35のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目37)
複数の外因性ポリペプチドの少なくとも1つ、例えば、全部が、グリコシル化されている、項目1~36のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目38)
網状赤血球である、項目1~37のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目39)
前記外因性ポリペプチドまたはポリペプチド群が、LPXTG(配列番号17)などのソルターゼ移入シグネチャを欠く、項目1~38のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目40)
例えば、融合タンパク質などの外因性ポリペプチドが、
i)赤血球系細胞表面の前記融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が同一配列を有し;
ii)前記融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、同一膜貫通領域であり;
iii)前記融合タンパク質が完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば、完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含み、このセグメントが、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、または500個のアミノ酸を欠き;
iv)前記融合タンパク質の少なくとも50、60、70、80、90、95、または99%が、1、2、3、4、5、10、20、または50個のアミノ酸を超えて互いに異ならず;
v)前記外因性ポリペプチドは、ソルターゼ移入シグネチャを欠き;
vi)前記外因性ポリペプチドが、1、2、3、4、または5未満の配列の異なる融合ポリペプチド上に存在する部分を含み;
vii)前記外因性ポリペプチドが、単一の融合ポリペプチドとして存在し;
viii)前記融合タンパク質が、内因性膜貫通タンパク質と前記部分との接合部にGly-Glyを含有せず;
ix)前記融合タンパク質がGly-Glyを含有せず、または前記融合タンパク質がGly-Glyを含有せず、または細胞外領域にGly-Glyを含有せず、膜貫通部分の1、2、3、4、5、10、20、50、または100個のアミノ酸内の細胞外領域にGly-Glyを含有せず;
またはそれらの組み合わせである、項目1~39のいずれか一項に記載の除核赤血球。
(項目41)
標的と相互作用する第1の外因性ポリペプチド、および
標的を修飾する第2の外因性ポリペプチド
を含む除核赤血球系細胞であって、
(a)前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、IdeSポリペプチドなどであり、例えば、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジとCH2領域との間で抗体を切断する部分を含み;
(b)前記第2の外因性ポリペプチドが、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを前記標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、前記標的が任意選択的に、抗体であり;
(c)前記第2の外因性ポリペプチドが、ポリペプチド、例えば、酵素、例えば、前記標的の二次、三次、または四次構造を修飾するプロテアーゼを含み、いくつかの実施形態では、前記標的が、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドまたは前記第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、減少または増加させ、任意選択的に、前記標的が抗体を含み;
(d)前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドなどの標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含み;
(e)前記標的が、ポリペプチド;炭水化物(例えば、グリカン)、脂質(例えば、リン脂質)、または核酸(例えば、DNAまたはRNA)であり;
(f)前記第1の外因性ポリペプチドが、例えば、抗体などの標的と結合するが切断せず、前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、抗体中の共有結合などの共有結合などの結合を切断し;
(g)前記標的が抗体を含み、前記第1の外因性ポリペプチドが前記抗体標的の可変領域に結合し;
(h)前記標的が抗体を含み、前記第1の外因性ポリペプチドが抗体標的の定常領域に結合し;
(i)前記第1の外因性ポリペプチドが、約1~2pM、2~5pM、5~10pM、10~20pM、20~50pM、50~100pM、100~200pM、200~500pM、500~1000pM、1~2nM、2~5nM、5~10nM、10~20nM、20~50nM、50~100nM、100~200nM、200~500nM、500~1000nM、1~2μM、2~5μM、5~10μM、10~20μM、20~50μM、または50~100μMの標的親和性を有し;
(j)前記第2の外因性ポリペプチドが、前記標的に対して約10-1~10-7M、10-1~10-2M、10-2~10-3M、10-3~10-4M、10-4~10-5M、10-5~10-6M、または10-6~10-7MのKMを有し;
(k)前記標的に対する前記第2の外因性ポリペプチドのKM(M単位で測定)で除した、前記標的に対する前記第1の外因性ポリペプチドのKd(M単位で測定)の比率が、約1×10-9~2×10-9、2×10-9~5×10-9、5×10-9~1×10-8、1×10-8~2×10-8、2×10-8~5×10-8、5×10-8~1×10-7、1×10-7~2×10-7、2×10-7~5×10-7、5×10-7~1×10-6、1×10-6~2×10-6、2×10-6~5×10-6、5×10-6~1×10-5、1×10-5~2×10-5、2×10-5~5×10-5、5×10-5~1×10-4、1×10-4~2×10-4、2×10-4~5×10-4、5×10-4~1×10-3、1×10-3~2×10-3、2×10-3~5×10-3、5×10-3~1×10-2、1×10-2~2×10-2、2×10-2~5×10-2、5×10-2~1×10-1、1×10-1~2×10-1、2×10-1~5×10-1、または5×10-1~1であり;
(l)前記標的を修飾する前記第2の外因性ポリペプチドの観察された反応速度が、その他の点では類似した反応条件下において、類似しているが前記第1の外因性ポリペプチドを欠く除核細胞の反応速度より高く;
(m)前記赤血球系細胞上の前記第2の外因性ポリペプチドの平均数に対する、前記赤血球系細胞上の前記第1の外因性ポリペプチドの平均数の比率が、約50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、または1:50であり;
(n)前記標的に対する前記第1の外因性ポリペプチドの親和性が、前記修飾された(例えば、切断された)標的に対する前記第1の外因性ポリペプチドの親和性より高く;
(o)前記除核赤血球系細胞の治療有効用量が、投与時における対象の末梢血中の前記標的の量に対する化学量論比より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(p)有効用量中の前記除核赤血球系細胞数が、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の標的分子などの前記標的の数より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく);
(q)前記第2の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく;
(r)前記第1の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量または生体外有効量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく;
(s)前記第1の外因性ポリペプチドの数および前記第2の外因性ポリペプチドの数が、例えば、除核赤血球系細胞の有効用量などの予め選択された除核赤血球系細胞の量で構成され、それぞれ標的に対する基準値より少なく(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少なく)、例えば、投与時における前記対象の末梢血中の前記標的の数より少なく;
(t)前記第2の外因性ポリペプチドが、少なくとも10-1M、10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、または10-7MのKMで標的を修飾し(例えば、切断し);
(u)前記第2の外因性ポリペプチドが、シャペロンを含み;
(v)前記第1の外因性ポリペプチドが表面露出部分を含み、前記第2の外因性ポリペプチドが表面露出部分を含み;または
(w)前記除核赤血球系細胞の有効量が、前記第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)
の1つまたは複数である、除核赤血球系細胞。
(項目42)
(b)前記第2の外因性ポリペプチドが、標的上の部位を修飾し、例えば、それに特異的であり、例えば、それに結合し、(例えば、特異的に)結合して修飾し、例えば、共有結合的に修飾し、例えば、部分を切断または除去しまたはそれを前記標的に付着させる、酵素(例えば、プロテアーゼ)を含み、前記標的は任意選択的に、例えば、抗薬物抗体などの抗体である、項目41に記載の除核赤血球系細胞。
(項目43)
前記修飾が、前記標的が、例えば、前記第1の外因性ポリペプチドまたは前記第1の外因性ポリペプチド以外の分子などの別の分子と相互作用する能力を変化させ、例えば、増加または減少させる、項目41または42に記載の除核赤血球系細胞。
(項目44)
(d)前記第2の外因性ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドなどの前記標的を、例えば、第1の基質に結合する第1の標的ドメインおよび第2の基質に結合する第2の標的ドメインなどの、第1の標的ドメインおよび第2の標的ドメインの間で切断する、酵素(例えば、プロテアーゼ)などのポリペプチドを含む、項目41~43のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目45)
前記第1の標的ドメインが前記第2の標的ドメインから放出される、項目44に記載の除核赤血球系細胞。
(項目46)
切断が、前記第1の基質に対する前記第1の標的ドメインの親和性、および前記第2の基質に対する前記第2の標的ドメインの親和性の片方または双方を変化させる、項目44または45に記載の除核赤血球系細胞。
(項目47)
前記標的が抗体を含み、前記第1の標的ドメインが1つまたは複数のCDR含み、前記第2の標的ドメインが例えば、Fc領域などの定常領域の一部を含む、項目41~46のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目48)
前記標的が、感染成分以外の、例えば、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、または寄生成分以外のものである、項目41~47のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目49)
前記第1の外因性ポリペプチドが、標的結合ドメインを含む、項目41~48のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目50)
前記第1の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、前記標的に結合する、項目41~49のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目51)
前記第2の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、例えば、プロテアーゼ活性などの酵素活性を含む、項目41~50のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目52)
前記第2の外因性ポリペプチドの表面露出部分が、前記標的を酵素的に修飾し、例えば、切断する、項目41~51のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目53)
前記標的が抗薬物抗体を含み、前記第1の外因性ポリペプチドがそれに対して抗薬物抗体が結合するポリペプチドを含み、前記第2の外因性ポリペプチドが抗薬物抗体を切断してFab部分およびFc部分を生じるプロテアーゼを含む、項目41~52のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目54)
前記除核赤血球が、前記第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球よりも速い速度で、対象の身体から前記標的を排除できる、項目41~53のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目55)
前記除核赤血球が、前記標的と、または例えば、切断中に前記標的に作用する前記第2の外因性タンパク質の反応生成物と、複合体形成する、項目41~54のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
(項目56)
膜貫通ドメインと、抗薬物抗体に結合できる表面露出ポリペプチドとを含む第1の外因性ポリペプチド、および
膜貫通ドメインおよび表面露出IdeSポリペプチドを含む第2の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球系細胞。
(項目57)
例えば、少なくとも108、109、1010、1011、または1012個の細胞などの項目1~56のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む医薬品などの製剤。
(項目58)
がんを治療するための、項目1~56のいずれか一項に記載の細胞。
(項目59)
前記がんが、(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん(cancer of unknown primary)、骨転移がん、脳転移がん、肝臓転移がん、肺転移がん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん(gastric cancer)、妊娠性絨毛腫瘍(GTT)、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、NSCLC、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻および洞がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫(NHL)、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん(非黒色腫)、軟部組織肉腫、胃がん(stomach cancer)、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん(unknown primary cancer)、子宮がん、膣がん、および外陰部がんから選択される、項目58に記載の細胞。
定義
本明細書の用法では、「抗体分子」という用語は、例えば、免疫グロブリン鎖または少なくとも1つの免疫グロブリン可変領域配列を含むその断片などのタンパク質を指す。「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体分子は、例えば、二重特異性抗体分子などの多特異性抗体分子である。抗体分子の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、scFv抗体断片、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、直鎖抗体、sdAb(VLまたはVHのどちらか)などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物VHHドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する2つのFab断片を含む二価の断片などの抗体断片から形成される多特異性抗体、抗体から単離されたエピトープ結合断片、マキシ抗体、ミニ抗体、ナノボディ、細胞内抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、v-NAR、およびbis-scFvが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「抗体分子」という用語は、例えば、免疫グロブリン鎖または少なくとも1つの免疫グロブリン可変領域配列を含むその断片などのタンパク質を指す。「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体分子は、例えば、二重特異性抗体分子などの多特異性抗体分子である。抗体分子の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、scFv抗体断片、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、直鎖抗体、sdAb(VLまたはVHのどちらか)などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物VHHドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する2つのFab断片を含む二価の断片などの抗体断片から形成される多特異性抗体、抗体から単離されたエピトープ結合断片、マキシ抗体、ミニ抗体、ナノボディ、細胞内抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、v-NAR、およびbis-scFvが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「併用療法」または「組み合わせ投与」は、特定の疾患または病状に対する治療レジメンの一部として、2つ(以上)の異なる薬剤または治療法が対象に投与されることを意味する。治療レジメンは、各薬剤の投与の用量および周期性を含み、その結果、対象に対する別個の薬剤の効果が重複する。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤の送達は同時でありまたは並行し、薬剤は共配合されてもよい。その他のいくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤は共配合されずに、規定レジメンの一部として逐次様式で投与される。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤または治療法の組み合わせ投与の結果、症状またはその他の障害関連パラメータの低下は、1つの薬剤または治療法が単独で、または他の薬剤の不存在下で与えられる場合に観察されるであろうものを上回る。2つの治療法の効果は、部分的に相加的、完全に相加的であり得て、または相加的を上回り得る(例えば、相乗的)。各治療薬の逐次投与または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介する直接吸収をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の適切な経路によってもたらされ得る。治療薬は、同一経路によってまたは異なる経路によって投与され得る。例えば、組み合わせの第1の治療薬が静脈内注射によって投与されてもよい一方で、組み合わせの第2の治療剤は経口的に投与されてもよい。
用語「協調された」または「協調様式」は、複数の薬剤が一緒に作用して治療上の利益を提供することを意味する。協調活性のタイプとしては、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォール-ベース、多量体ベース、および代償性活性が挙げられる。一実施形態では、同一除核RBC中で送達される複数の外因性ポリペプチドによってもたらされる治療効果のレベルは、複数のポリペプチドのそれぞれが異なる除核RBCから送達される場合に見られるものより高い。
本明細書の用法では、「除核」とは、例えば、成熟赤血球への分化によってその核を失った細胞などの核を欠く細胞を指す。
本明細書の用法では、「外因性ポリペプチド」という用語は、そのタイプの野生型細胞によって産生されず、または外来ポリペプチドを含有する細胞よりも野生型細胞においてより低いレベルで存在するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞に導入された核酸によってコードされるポリペプチドであり、その核酸は任意選択的に細胞によって保持されない。
本明細書の用法では、「マルチモーダル療法」という用語は、協調機能(例えば、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性)を有する複数の(例えば、2、3、4または5またはそれ以上の)外因性薬剤(例えば、ポリペプチド)を提供する、例えば、除核赤血球療法などの療法を指す。
本明細書の用法では、「経路」または「生物学的経路」という用語は、逐次様式で一緒に作用する、例えば、ポリペプチドなどの複数の生物学的分子を指す。経路の例としては、シグナル伝達カスケードが挙げられる。いくつかの実施形態では、経路は、細胞外シグナルの検出で始まり、標的遺伝子の転写の変化で終わる。いくつかの実施形態では、経路は、細胞質シグナルの検出で始まり、標的遺伝子の転写の変化で終わる。経路は、線状または分枝状であり得る。分枝状の場合、それは、複数の入力(収束)または複数の出力(発散)を有し得る。
本明細書の用法では、「近接依存性」分子は、単独よりも第2の分子と近接している場合に、例えば、より大きいなど、異なる活性を有する第1の分子を指す。いくつかの実施形態では、1対の近接依存性リガンドは、それらが互いに離れている場合よりも近接している場合に、下流因子をより強く活性化する。
明細書の用法では、「受容体成分」は、それ自体が、または複合体の一部として、受容体として機能するポリペプチドを指す。したがって受容体成分は、ポリペプチド受容体と、受容体複合体の一部として機能するポリペプチドとを包含する。
「相乗作用」または「相乗的」という用語は、それら個々の効果と比較して、2つ以上の薬剤(例えば、除核赤血球の一部であるポリペプチド)の組み合わせの相加効果を超えることを意味する。特定のいくつかの実施形態では、相乗的活性は、第1のポリペプチドを含む除核赤血球および第2のポリペプチドを含む除核赤血球の効果と比較して、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む除核赤血球の相加効果を上回る。いくつかの実施形態では、相乗的活性は、第1の薬剤が検出可能な出力Xレベルを生じ、第2の薬剤が検出可能な出力Xレベルを生じて、第1および第2の薬剤が一緒になって出力Xの加算値を超えるレベルを生じる場合に存在する。
本明細書の用法では、ポリペプチドの「変異型」という用語は、そのポリペプチドと比較して、例えば、1つまたは複数の置換、挿入または欠失などの少なくとも1つの配列の相違を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、変異型は、そのポリペプチドと、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する。変異型には、断片も含まれる。いくつかの実施形態では、断片は、完全長ポリペプチドと比較して、N末端、C末端、またはその双方で(それぞれ独立して)、1、2、3、4、5、10、20、または100個のアミノ酸を欠く。
例示的外因性ポリペプチドおよびその使用
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球治療薬は、例えば、外因性ポリペプチド、脂質、または小分子などの、1つまたは複数の(例えば、2、3、4、5、6、10またはそれ以上の)異なる外因性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、赤血球治療薬は、本明細書に記載の2つ以上の異なるタンパク質を含む外因性融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、例えば、網状赤血球などの除核赤血球は、本明細書に記載の2つ以上の異なる外因性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の(例えば、全部の)外因性ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片もしくは変異型である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球治療薬は、例えば、外因性ポリペプチド、脂質、または小分子などの、1つまたは複数の(例えば、2、3、4、5、6、10またはそれ以上の)異なる外因性薬剤を含む。いくつかの実施形態では、赤血球治療薬は、本明細書に記載の2つ以上の異なるタンパク質を含む外因性融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、例えば、網状赤血球などの除核赤血球は、本明細書に記載の2つ以上の異なる外因性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の(例えば、全部の)外因性ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたはその断片もしくは変異型である。
いくつかの実施形態では、2つ以上のポリペプチドは同一標的に作用し、その他のいくつかの実施形態では、それらは2つ以上の異なる標的に作用する。いくつかの実施形態では、単一の標的または複数の標的は、内因性ヒトタンパク質または可溶性因子(例えば、ポリペプチド、小分子、または無細胞核酸)から選択される。
外因性タンパク質の1つまたは複数は、例えば、ヒト細胞である哺乳類細胞などの真核細胞に特徴的な、翻訳後修飾を有してもよい。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の(例えば、2、3、4、5またはそれ以上の)外因性タンパク質は、グリコシル化され、リン酸化され、またはその双方である。糖タンパク質の生体外検出は、過ヨウ素酸シッフ(PAS)法の変法を用いて、SDS-PAGEゲルおよびウェスタンブロット上で慣例的に達成される。糖タンパク質の細胞局在化は、当該技術分野で公知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して達成されてもよい。リン酸化は、ホスホ特異的抗体を用いてウェスタンブロットによって評価されてもよい。
翻訳後修飾としてはまた、疎水性基へのコンジュゲーション(例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、またはGPI化)、補因子へのコンジュゲーション(例えば、リポイル化、フラビン部分(例えば、FMNまたはFAD)、ヘムC、ホスホパンテテイニル化、またはレチニリデンシッフ塩基形成)、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ヒプシン形成、アシル化(例えば、O-アシル化、N-アシル化、またはS-アシル化)、ホルミル化、アセチル化、アルキル化(例えば、メチル化またはエチル化)、アミド化、ブチリル化、γ-カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ADP-リボース化などのヌクレオチド付加、酸化、リン酸エステル(O結合型)またはホスホロアミダート(N結合)形成、(例えば、リン酸化またはアデニリル化)、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、S-グルタチオン付加、S-ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ISG化、SUMO化、ユビキチン化、NEDD化、またはアミノ酸の化学修飾(例えば、シトルリン化、脱アミド、脱離(eliminylation)、またはカルバミル化)、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化(例えば、プロリン、セリン、アラニン、またはメチオニンのラセミ化)も挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化としては、糖タンパク質を生じる、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、またはトリプトファンへのグリコシル基の付加が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化は、例えば、O結合型グリコシル化またはN結合グリコシル化を含む。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の外因性ポリペプチドは融合タンパク質であり、例えば、内因性赤血球タンパク質またはその断片との、例えば、膜貫通タンパク質との、例えば、GPAまたはその膜貫通断片との融合体である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の外因性ポリペプチドは、例えば、任意選択的に二量体化ドメインを含む、第2の融合外因性ポリペプチドなどの、二量体化または多量体化を促進するドメインと融合する。いくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、例えば、FcドメインまたはCH3ドメインなどの、抗体分子の一部を含む。いくつかの実施形態では、第1および第2の二量体化ドメインは、ノブ・イン・ホール変異(例えば、T366YノブおよびY407Tホール)を含み、ヘテロ二量体化を促進する。
例えば、表1~4のいずれかから選択されるヒトポリペプチドなどの例示的なヒトポリペプチドとしては、以下が挙げられる。
a)例えば、疾患状態に関連しない天然に存在する形態のヒトポリペプチドなどのヒトポリペプチドの天然に存在する形態;
b)例えば、2017年1月11日付けのGenBankデータベースなどのデータベースに現れる配列を有する、疾病状態に関連しないヒトポリペプチドの天然に存在する形態などの、例えば、2017年1月11日付けのGenBankデータベースなどのデータベースに現れる配列を有する、ヒトポリペプチド;
c)a)またはb)の配列と、1、2、3、4、5または10個以下のアミノ酸残基が異なる配列を有する、ヒトポリペプチド;
d)a)またはb)の配列と、1、2、3、4、5または10%以下が異なる配列を有する、ヒトポリペプチド;
e)a)またはb)の配列と実質的に異ならない配列を有する、ヒトポリペプチド;または
f)a)またはb)の配列を有するヒトポリペプチドと、例えば、酵素活性(例えば、特異性または代謝回転)または結合活性(例えば、結合特異性または親和性)などの生物学的活性において実質的に異ならない、c)、d)、またはe)の配列を有するヒトポリペプチド。f)に記載の候補ペプチドは、作製され、本明細書に記載のような類似の活性についてスクリーニングされ得て、本明細書に記載のような除核RBCで発現される場合には、同等である)。
a)例えば、疾患状態に関連しない天然に存在する形態のヒトポリペプチドなどのヒトポリペプチドの天然に存在する形態;
b)例えば、2017年1月11日付けのGenBankデータベースなどのデータベースに現れる配列を有する、疾病状態に関連しないヒトポリペプチドの天然に存在する形態などの、例えば、2017年1月11日付けのGenBankデータベースなどのデータベースに現れる配列を有する、ヒトポリペプチド;
c)a)またはb)の配列と、1、2、3、4、5または10個以下のアミノ酸残基が異なる配列を有する、ヒトポリペプチド;
d)a)またはb)の配列と、1、2、3、4、5または10%以下が異なる配列を有する、ヒトポリペプチド;
e)a)またはb)の配列と実質的に異ならない配列を有する、ヒトポリペプチド;または
f)a)またはb)の配列を有するヒトポリペプチドと、例えば、酵素活性(例えば、特異性または代謝回転)または結合活性(例えば、結合特異性または親和性)などの生物学的活性において実質的に異ならない、c)、d)、またはe)の配列を有するヒトポリペプチド。f)に記載の候補ペプチドは、作製され、本明細書に記載のような類似の活性についてスクリーニングされ得て、本明細書に記載のような除核RBCで発現される場合には、同等である)。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、例えば、先行する段落のa)、b)、c)、d)、e)、またはf)のヒトポリペプチドの全部または断片などのヒトポリペプチドまたはその断片を含む。一実施形態では、外因性ポリペプチドは、先行する段落のa)、b)、c)、d)、e)、またはf)のヒトポリペプチドの全部または断片と、追加的なアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドを含む。一実施形態では、追加的なアミノ酸配列は、異なるヒトポリペプチドについての先行する段落のa)、b)、c)、d)、e)、またはf)のヒトポリペプチドの全部または断片を含む。
本発明は、その機能的断片もしくは変異型(例えば、表1~4に列挙される抗原のリガンド結合断片またはその変異型)が作製され、本明細書に記載のような類似の活性についてスクリーニングされ得て、本明細書に記載のような除核RBCで発現される場合には、同等である)ことを検討する。
いくつかの実施形態では、2つ以上の外因性薬剤(例えば、ポリペプチド)は、本明細書に記載のような薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性である関連機能を有する。いくつかの実施形態では、これらの記述子のうちの2つ以上が、所与のRBCに適用される。
薬剤相加的構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が薬剤相加的である場合、一緒に作用する薬剤の効果は、いずれかの薬剤が単独で作用する効果よりも大きい。一実施形態では、2つの薬剤は、RBCにおいて(例えば、RBC表面で)異なる(例えば、相補的)機能を有し、一緒に作用して(単独で作用する薬剤のいずれかと比較して)、例えば、標的に対するより高い結合親和性、または例えば、単一の標的などの標的によるシグナル伝達のより大きな程度の調節などの、より強い作用を有する。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤は、それぞれ、例えば、同一標的タンパク質内の異なるエピトープなどの同一標的に結合する。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が薬剤相加的である場合、一緒に作用する薬剤の効果は、いずれかの薬剤が単独で作用する効果よりも大きい。一実施形態では、2つの薬剤は、RBCにおいて(例えば、RBC表面で)異なる(例えば、相補的)機能を有し、一緒に作用して(単独で作用する薬剤のいずれかと比較して)、例えば、標的に対するより高い結合親和性、または例えば、単一の標的などの標的によるシグナル伝達のより大きな程度の調節などの、より強い作用を有する。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤は、それぞれ、例えば、同一標的タンパク質内の異なるエピトープなどの同一標的に結合する。
一実施形態では、薬剤は互いに結合し、例えば、ヘテロ二量体複合体の構成員である。一実施形態では、薬剤は、単独で作用する場合よりも一緒に作用する場合に、標的に対するより大きい結合活性を有する。
いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤は、いずれかの薬剤単独よりも標的へのより密接な結合ができるようにする。いくつかの実施形態では、例えば、サイトカイン受容体成分、例えば、IL-1受容体成分、例えば、インターロイキン受容体成分などの受容体成分のヘテロ二量体は、いずれかの受容体成分単独よりも高い親和性で標的(例えば、IL-1)に結合する。多くのシグナル伝達分子は、細胞表面にヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成して、そのリガンドに結合する。サイトカイン受容体は、例えば、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体であり得る。例えば、IL-2受容体は、IL2Ra、IL2Rb、およびIL2Rgの3つの異なる分子を含む。IL-13受容体は、IL13RaおよびIL4Rのヘテロ二量体である。IL-23受容体は、IL23RおよびIL12Rb1のヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、TNFα受容体は、TNFR1およびTNFR2のヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の外因性ポリペプチドは、表1のサイトカイン、またはサイトカイン受容体結合断片もしくはその変異型を含んでなる。発現されるサイトカインは、典型的に野生型ヒト受容体配列またはその変異型または断片を有し、それは、その標的受容体を通じて結合してシグナル伝達できる。サイトカインおよびそれらの受容体の表は、本明細書で表1として提供される。サイトカインは、RBCの表面に存在し得る。
いくつかの実施形態では、薬剤は、循環中の抗体、例えば、抗薬物抗体を捕捉するための、例えば、Fc結合分子などの異なる抗体結合分子である。いくつかの実施形態では、薬剤は互いに非競合的であり、個々の抗体またはオプソニン化粒子のより高い親和性結合を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、1つまたは複数の薬剤は、タンパク質A、Fc受容体1(FcR1)、FcR2a、FcR2b、FcR3、FcR4、FcRn(新生児Fc受容体)またはその抗体結合断片もしくは変異型から選択される。
いくつかの実施形態では、標的は、例えば、がん性B細胞、T細胞、リンパ系細胞、または循環腫瘍細胞(CTC)などの循環がん細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された赤血球(例えば、網状赤血球)を用いて、がん細胞を捕捉し、それを循環から除去する。例えば、1つまたは複数の薬剤は、細胞表面の異なるタンパク質に結合して、治療の特異性を高める。例えば、薬剤は、CTCを捕捉するための抗EPCAMおよび抗CD45抗体分子、またはB細胞系急性白血病細胞を捕捉するための抗CD19および抗CD20抗体分子を含んでなる。
除核赤血球は、標的(例えば、抗薬物抗体)と相互作用する第1の外因性ポリペプチドと、標的を修飾する第2の外因性ポリペプチド(例えば、IdeSなどのプロテアーゼ)とを含んでなり得る。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、本明細書に記載のがんなどのがんを有する対象などの対象に投与される。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球系細胞の有効量は、第1の外因性ポリペプチドを欠くまたは第2の外因性ポリペプチドを欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞の有効量より少ない(例えば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%少ない)。いくつかの実施形態では、予め選択された量は、除核赤血球系細胞の有効量または生体外有効量である。いくつかの実施形態では、予め選択された量(例えば、有効量)は、アッセイにおいて、例えば、1、2、3、4、5、または6時間などの予め選択された時間内に、例えば、基質の少なくとも10%、20%、30%、405、50%、60%、70%、80%、または90%を生成物(produce)に変換するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、予め選択された量(例えば、生体外有効量)は、5時間以内に標的抗体の少なくとも50%を切断するのに有効である。アッセイは、例えば、溶液中の可溶性の非修飾(例えば、非切断)標的のレベルの減少を測定してもよい。
いくつかの実施形態では、標的の基準値は、投与時における対象の末梢血中の標的の数である。いくつかの実施形態(例えば、生体外有効量の細胞が関与する実施形態)では、標的の基準値は、アッセイのための反応混合物中の標的の数である。
第1の外因性ポリペプチド(例えば、結合剤)
第1の外因性ポリペプチドは、標的に結合し得る。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗薬物抗体などの抗体を認識する結合ドメインを含んでなる。
第1の外因性ポリペプチドは、標的に結合し得る。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗薬物抗体などの抗体を認識する結合ドメインを含んでなる。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、結合ドメインおよび膜アンカードメイン(例えば、I型またはII型赤血球膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメイン)を含む。いくつかの実施形態では、膜アンカードメインは修飾因子(例えプロばテアーゼ)ドメインのC末端またはN末端である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、本明細書中の配列番号9に記載されるような、またはその膜貫通部分、または前述のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリペプチドなどである、GPAまたはその膜貫通部分を含む。いくつかの実施形態では、GPAポリペプチドは結合ドメインのC末端である。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2007030708号パンフレットの例えば、34~45頁に掲載されるアドレス部分または標的化部分を含む。
第1の外因性ポリペプチドとしての使用に適切に適合され得るタンパク質のその他の例としては、標的が受容体リガンドである場合などの、受容体のリガンド結合ドメインが挙げられる。逆に、第1の外因性ポリペプチドは、標的が受容体である、受容体リガンドを含み得る。標的リガンドは、ポリペプチドまたは小分子リガンドであり得る。
さらなるいくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチン(「Fn3」)の第10のIII型ドメインのような免疫グロブリン様折り畳みを有するポリペプチドに由来するドメインを含み得る。米国特許第6,673,901号明細書;米国特許第6,462,189号明細書を参照されたい。Fn3は小型であり(約95残基)、モノマー性、可溶性、および安定性である。それはジスルフィド結合を有さず、還元環境における安定性を改善する。構造は、Fn3が9個でなく7個のβ鎖を有すること以外は、Ab VHドメインのものと同様のβサンドイッチとして記述されてもよい。Fn3の両端には3つのループがあり;これらのループの3つの位置は、VHドメインのCDR1、2、および3の位置に対応する。Fn3の94個のアミノ酸の配列は、次のとおりである:
CDR様のアミノ酸位置は、残基23~30(BCループ)、52~56(DEループ)、および77~87(FGループ)として定義される。したがって、CDR様ループの1つまたは複数を修飾またはランダム化して結合ドメインのライブラリーが作成されてもよく、それは次に、所望のアドレス結合部位への結合についてスクリーニングされてもよい。国際公開第0232925号パンフレットもまた参照されたい。Fn3は、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)の大きなサブファミリーの一例である。Fn3ファミリーには、細胞接着分子、細胞表面ホルモン、およびサイトカイン受容体、シャペロニン、および炭水化物結合ドメインが含まれ、これらはまた全て、結合剤としての使用のために適合されてもよい。さらに、転写因子NF-kBのDNA結合ドメインの構造もまた、Fn3折り畳みと密接に関連しており、これもまた結合剤としての使用のために適合されてもよい。同様に、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンは、標的化部分としての使用に適合させ得る免疫グロブリン様折り畳みを含有する。
さらに他のいくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、その動態およびアドレス部位への結合の選択性に基づいて選択された、例えば、合成進化された、遺伝子操作されたポリペプチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドの配列は、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのスクリーニングまたは選択方法を用いて設計される。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、可溶性受容体(および任意選択的に可溶性受容体を含む標的)のペプチドリガンド、標的に結合する合成ペプチド、補体制御領域(および任意選択的に補体因子を含む標的)、または細胞表面受容体(および任意選択的に細胞表面受容体を含む標的)のリガンドを含む。
第2の外因性ポリペプチド(例えば、プロテアーゼ)
いくつかの実施形態では、(標的を修飾する)第2の外因性ポリペプチドは、表4に記載される因子である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、表4に記載されるプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、細菌プロテアーゼ、ヒトプロテアーゼ、または植物プロテアーゼ、またはその断片もしくは変異型である。
いくつかの実施形態では、(標的を修飾する)第2の外因性ポリペプチドは、表4に記載される因子である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、表4に記載されるプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、細菌プロテアーゼ、ヒトプロテアーゼ、または植物プロテアーゼ、またはその断片もしくは変異型である。
いくつかの実施形態では、(標的を修飾する)第2の外因性ポリペプチドはプロテアーゼである。例示的プロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼ;ジペプチダーゼ;ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ;ペプチジルジペプチダーゼ;セリン型カルボキシペプチダーゼ;メタロカルボキシペプチダーゼ;システイン型カルボキシペプチダーゼ;オメガペプチダーゼ;セリンプロテイナーゼ;システインプロテイナーゼ;アスパラギン酸プロテイナーゼ;メタロプロテイナーゼ;または未知の機序のプロテイナーゼに分類されるものが挙げられる。
アミノペプチダーゼとしては、細胞質ゾルアミノペプチダーゼ(ロイシルアミノペプチダーゼ)、メンブレンアラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、x-proアミノペプチダーゼ、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱性アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、細胞質ゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、x-trpアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、d-立体特異的アミノペプチダーゼ、およびアミノペプチダーゼが挙げられる。ジペプチダーゼとしては、x-hisジペプチダーゼ、x-argジペプチダーゼ、x-メチル-hisジペプチダーゼ、cys-glyジペプチダーゼ、glu-gluジペプチダーゼ、pro-xジペプチダーゼ、x-proジペプチダーゼ、met-xジペプチダーゼ、非立体特異的ジペプチダーゼ、細胞質ゾル非特異的ジペプチダーゼ、メンブレンジペプチダーゼ、およびβ-ala-hisジペプチダーゼが挙げられる。ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼとしては、ジペプチジルペプチダーゼI、ジペプチジルペプチダーゼII、ジペプチジルペプチダーゼIII、ジペプチジルペプチダーゼIV、ジペプチジルジペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼI、およびトリペプチジルペプチダーゼIIが挙げられる。ペプチジルジペプチダーゼとしては、ペプチジルジペプチダーゼAおよびペプチジルジペプチダーゼBが挙げられる。セリン型カルボキシペプチダーゼとしては、リソソームpro-xカルボキシペプチダーゼ、セリン型D-ala-D-alaカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼC、およびカルボキシペプチダーゼDが挙げられる。メタロカルボキシペプチダーゼとしては、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、リジン(アルギニン)カルボキシペプチダーゼ、gly-Xカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼH、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼM、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、亜鉛D-ala-D-alaカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼA2、メンブレンpro-xカルボキシペプチダーゼ、チューブリニル-tyrカルボキシペプチダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼTが挙げられる。オメガペプチダーゼとしては、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジルグリシンアミダーゼ、ピログルタミルペプチダーゼI、β-アスパルチルペプチダーゼ、ピログルタミルペプチダーゼII、n-ホルミルメチオニルペプチダーゼ、プテロイルポリ-[γ]-グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、γ-glu-Xカルボキシペプチダーゼ、およびアシルムラモイル-alaペプチダーゼが挙げられる。セリンプロテイナーゼとしては、キモトリプシン、キモトリプシンC、メトリジン、トリプシン、トロンビン、凝固第Xa因子、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、α溶菌プロテアーゼ、グルタミル、エンドペプチダーゼ、カテプシンG、凝固第VIIa因子、凝固第IXa因子、ククミシン(cucumisi)、プロリルオリゴペプチダーゼ、凝固第XIa因子、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ、凝固第XIIa因子、キマーゼ、補体成分clr55、補体成分cls55、古典的補体経路c3/c5コンバターゼ、補体因子I、補体因子D、-経路c3/c5コンバターゼ、セレビシン、ヒポデルミンC、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ1a、γレニン(γ-reni)、ベノンビンAB、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、サブチリシン、オリジン、エンドペプチダーゼK、テルモミコリン、テルミターゼ、エンドペプチダーゼSO、T-プラスミノーゲンアクチベーター、タンパク質C、膵臓エンドペプチダーゼE、膵臓エラスターゼII、IGAセリンエンドペプチダーゼ、U-プラスミノーゲン、アクチベーター、ベノンビンA、フューリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムAまたは細胞毒性Tリンパ球プロテイナーゼ1、グランザイムBまたは細胞毒性Tリンパ球プロテイナーゼ2、ストレプトグリシンA、ストレプトグリシン(treptogrisin)B、グルタミルエンドペプチダーゼII、オリゴペプチダーゼB、リムルス凝固因子C、リムルス凝固因子、リムルス凝固酵素、オンプチン、リプレッサーLexA、細菌リーダーペプチダーゼI、およびトガビリン、フラビリンが挙げられる。システインプロテイナーゼとしては、カテプシンB、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトペイン、アクチニド、カテプシン1、カテプシンH、カルパイン、カテプシンT、グリシル、エンドペプチダーゼ、がんプロコアグラント、カテプシンS、ピコルナイン3C、ピコルナイン2A、カリカイン、アナナイン、ステムブロメライン、果実ブロメライン、レグマイン、ヒストリサイン、およびインターロイキン1-β変換酵素が挙げられる。アスパラギン酸プロテイナーゼとしては、ペプシンA、ペプシンB、ガストリクシン、キモシン、カテプシンD、ネオペンテシン、レニン、レトロペプシン、pro-オピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンI、アスペルギロペプシンII、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンA、シタリドペプシンB、キサントモナペプシン、カテプシンE、バリエルペプシン、細菌リーダーペプチダーゼI、シュードモナペプシン、およびプラスメプシンが挙げられる。メタロプロテイナーゼとしては、アトロリシンA、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質内コラゲナーゼ、ネプリリシン、エンベリシン、IgA-特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンN-エンドペプチダーゼ、チメトオリゴペプチダーゼ、ニューロリシン、ストロメライシン1、メプリンA、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼ、ペプチジル-lysメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメライシン2、マトリリシンゼラチナーゼ、アエロモノリシン、シュードリシン、サーモリシン、バシロリシン、アウレオリシン、コッコリシン、ミコリシン、β-溶解メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル-aspメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゼラチナーゼB、レイシュマノリシン、サッカロリシン、オートリシン、ジュウテロリシン、セラリシン、アトロリシンB、アトロリシンC、アトロキサーゼ、アトロリシンE、アトロリシンF、アダマリシン、ホリリシン、ルベルリシン、ボトロパシン、ボトロリシン、オフィオリシン、トリメレリシンI、トリメレリシンII、ムクロリシン、ピトリリシン、インスリシン、O-シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、ルッセリシン、ミトコンドリア、中間体、ペプチダーゼ、ダクチルイシン、ナルジリシン、マグノリシン、メプリンB、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、およびトキシリシンが挙げられる。未知の機序のプロテアーゼとしては、サーモプシンおよび多触媒性エンドペプチダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、前述のいずれかの断片もしくは変異型を含む。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、IdeSポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、IdeSポリペプチドは、配列番号8として下に記載される配列、または配列番号8の配列のタンパク質分解活性断片(例えば、少なくとも100、150、200、250、または300アミノ酸の断片)、または前述のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する配列を含む核酸が関与するいくつかの実施形態では、核酸は、配列番号8として下に記載する配列を有するIdeSポリペプチド、またはそのタンパク質分解性活性断片、または前述のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する配列をコードする。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、修飾因子ドメイン(例えば、IdeSポリペプチドなどのプロテアーゼドメイン)および膜アンカードメイン(例えば、I型またはII型赤血球膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメイン)を含む。いくつかの実施形態では、膜アンカードメインは修飾因子(例えプロばテアーゼ)ドメインのC末端またはN末端である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、GPAまたはその膜貫通部分を含む。いくつかの実施形態では、GPAポリペプチドは、
の配列、またはその膜貫通部分、または前述のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するポリペプチドを有する。いくつかの実施形態では、GPAポリペプチドは、修飾因子(例えば、プロテアーゼ)ドメインのC末端である。
いくつかの実施形態では、例えば、グリシン-セリンリンカー、例えば、GGSGGSGG(配列番号10)および/またはGGGSGGGS(配列番号11)の配列を含むリンカーなどのリンカーは、IdeSポリペプチドと膜貫通ポリペプチドとの間に配置される。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド、例えば、第2の外因性ポリペプチド、例えば、プロテアーゼ、例えば、IdeSポリペプチドは、リーダー配列、例えば、GPAリーダー配列、例えば、MYGKIIFVLLLSEIVSISA(配列番号12)を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、第2の外因性ポリペプチドなどの外因性ポリペプチドは、例えば、HAタグまたはFLAGタグなどのタグをさらに含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ(例えば、免疫グロブリン分解酵素、例えば、免疫グロブリンG分解酵素、例えば、IdeS)は、ヒンジ領域で、CH2領域で、またはヒンジ領域とCH2領域との間で、免疫グロブリンを切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、例えば、以下の配列中の2つのイタリック体のグリシンの間、またはイタリック体のアラニンとグリシンの間などの、以下の配列の1つで免疫グロブリンを切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ(例えば、細菌プロテアーゼ)は、例えば、IdeSまたはIgAプロテアーゼなどのIgGを切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ(例えば、パパインなどのパパインファミリープロテアーゼ)は、例えば、重鎖の224位と225位との間のヒスチジン-スレオニン結合および/または重鎖の233位と234位との間のグルタミン酸-ロイシン結合などのFcとFab領域との間で、免疫グロブリンを切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼまたはその他の修飾因子は、表4に列挙される標的に作用する。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2007030708号パンフレットの例えば、45~46頁に記載される触媒部分を含む。
第2の外因性ポリペプチドは、標的に作用して化学変化を誘発し、それによりその活性を調節し得る部分、例えば、標的内の反応を触媒し得る部分を含み得る。第2の外因性ポリペプチドは、天然に存在する酵素、その活性な(例えば、触媒的に活性な)断片、または酵素活性を有するように遺伝子操作されたタンパク質、例えば、セリンプロテアーゼ活性モチーフを含有するように設計されたタンパク質などの遺伝子操作された酵素を含み得る。第2の外因性ポリペプチドの触媒領域は、標的中に所望の化学変化を誘発するのに有効なアミノ酸配置を含み得る。それらは、天然酵素、変異型、チモーゲン、または完全球形ドメインのN末端またはC末端切断バージョンであってもよい。
第2の外因性ポリペプチドは、単独では乱交雑性で、多くの異なる生体分子上でそれが認識する切断部位に結合し、反応動態が比較的芳しくないこともある、酵素的に活性な部位を含み得る。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、第2の外因性ポリペプチドの近くの標的の局所濃度を増加させることによって特異性を提供または改善する。
第2の外因性ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、標的が別の酵素(例えば、既に対象中に存在する酵素)によって認識され作用を受けるように、それを修飾し得る。一実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、その活性が阻害または上方制御されるように、標的の構造を変化させる部分を含む。多くの天然に存在する酵素はその他の酵素を活性化し、これらは本明細書に記載の組成物および方法に従って活用され得る。
第2の外因性ポリペプチドは、プロテアーゼ;グリコシダーゼ;リパーゼ;またはその他のヒドロラーゼ;アミダーゼ(例えば、N-アセチルムラモイル-L-アラニンアミダーゼ、PGRP-Lアミダーゼ);またはイソメラーゼ、トランスフェラーゼ(キナーゼなど)、リアーゼ、酸化還元酵素、オキシダーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼ、トランスフェラーゼなどをはじめとするその他の酵素活性を含み得る。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、ヒトリゾチーム、ヒトリゾチームの機能部分、ヒトPGRP-L、ヒトPGRP-Lの機能部分、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼA2の機能部分、またはMMP-2(ゼラチナーゼA)またはMMP-9(ゼラチナーゼB)などのマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)細胞外酵素を含む。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、キモトリプシン、トリプシンまたはエラスターゼまたはカリクレインなどの哺乳類酵素をはじめとするキモトリプシンファミリー、またはサブチリシンなどの細菌酵素をはじめとするサブチリシン(substilisin)ファミリーなどのセリンプロテイナーゼである。一般的三次元構造は、2つのファミリーで異なるが、それらは同一活性部位配置を有し、同一機序を通じて触媒作用が進行する。セリンプロテイナーゼは、基質残基と相互作用する様々な酵素のサブサイトにおける、アミノ酸置換に関連する異なる基質特異性を示す。触媒三つ組を形成する、His-57、Asp-102、およびSer-195(キモトリプシノーゲン番号付与)の3つの残基は、触媒プロセスにおいて重要である。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、パパインまたはアクチニジンまたはブロメラインなどの植物プロテアーゼ、いくつかの哺乳類リソソームカテプシン、細胞質ゾルカルパイン(カルシウム活性化)、およびいくつかの寄生性プロテアーゼ(例えば、トリパノソーマ属(Trypanosoma)、住血吸虫属(Schistosoma))をはじめとする、システインプロテイナーゼである。パパインは典型であり、最も良く研究されたファミリーの一員である。セリンプロテイナーゼと同様に、触媒作用は共有結合型中間体の形成を通じて進行し、システインおよびヒスチジン残基が関与する。必須のCys-25およびHis-159(パパイン番号付与)は、それぞれSer-195およびHis-57と同じ役割を果たす。求核剤は、ヒドロキシル基ではなくチオレートイオンである。チオレートイオンは、His-159の隣接するイミダゾリウム基とのイオン対の形成を通じて安定化される。攻撃する求核試薬は、双方のステップにおいてチオレート-イミダゾリウムイオン対であり、水分子は要求されない。
あるいくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドはアスパラギン酸プロテイナーゼであり、その大部分はペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーとしては、ペプシンおよびキモシンならびにリソソームカテプシンD、レニンなどのプロセッシング酵素、および特定の真菌プロテアーゼ(ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン)などの消化酵素が挙げられる。第2のファミリーは、レトロプロプシンとも呼ばれるエイズウイルス(vims)(HIV)由来のプロテアーゼなどのウイルスプロテイナーゼを含む。セリンおよびシステインプロテイナーゼとは対照的に、アスパラギン酸プロテイナーゼによる触媒作用は、共有結合型中間体が関与しないが、四面体中間体が存在する。求核攻撃は、水分子から2つのカルボキシル基の2つのダイアドへの1つのプロトン移動と、同時のCO-NH結合切断を伴う基質のカルボニル酸素への第2のプロトン移動の2つによって達成される。「プッシュプル」機序と称されることがあるこの一般的な酸塩基触媒は、非共有結合型中性四面体中間体の形成をもたらす。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、細菌、真菌ならびに高等生物中に見いだされ得るメタロプロテイナーゼである。それらは配列およびその構造が大きく異なるが、大多数の酵素は触媒的に活性な亜鉛(Zn)原子を含有する。場合によっては、亜鉛は、活性を失うことなく、コバルトまたはニッケルなどの別の金属によって置換されてもよい。細菌サーモリシンは特徴がよく分かっており、その結晶学的構造は、亜鉛が、2つのヒスチジンおよび1つのグルタミン酸によって結合されていることを示唆する。多くの酵素は、亜鉛の2つのヒスチジンリガンドを提供する配列HEXXHを含有するのに対して、第3のリガンドはグルタミン酸(サーモリシン、ネプリライシン、アラニルアミノペプチダーゼ)またはヒスチジン(アスタシン)のどちらかである。その他のファミリーは、Zn原子の異なる結合様式を示す。触媒機序は、切断可能な結合のカルボニル基への亜鉛結合水分子の攻撃の後に、非共有結合型四面体中間体の形成をもたらす。この中間体は、グルタミン酸プロトンの脱離基への移行によってさらに分解される。
いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、イソメラーゼ(例えば、切断して化学結合を形成するか、または立体構造変化を触媒するイソメラーゼ)を含む。いくつかの実施形態では、イソメラーゼは、ラセミ化酵素(例えば、アミノ酸ラセミ化酵素)、エピメラーゼ、シス-トランスイソメラーゼ、分子内酸化還元酵素、分子内トランスフェラーゼ、または分子内リアーゼである。
いくつかの実施形態では、第2の外因性プロテアーゼは、シャペロンを含む。例えば、シャペロンは、一般的シャペロン(例えば、GRP78/BiP、GRP94、GRP170)、レクチンシャペロン(例えば、カルネキシンまたはカルレティキュリン)、非古典的分子シャペロン(例えば、HSP47またはERp29)、折り畳みシャペロン(例えば、PDI、PPI、またはERp57)、細菌または古細菌シャペロン(例えば、Hsp60、GroEL/GroES複合体、Hsp70、DnaK、Hsp90、HtpG、Hsp100、Clpファミリー(例えば、ClpAおよびClpX)、Hsp104)であり得る。いくつかの実施形態では、除核赤血球は、例えば、イムノフィリン、Sti1、p50(Cdc37)、またはAha1などのコシャペロンを含む。いくつかの実施形態では、分子シャペロンはシャペロニンである。
第2の外因性タンパク質(標的を改変する)の候補は、それらの活性に基づいてスクリーニングされ得る。試験される各分子の比活性に応じて、その分子に適したアッセイが用いられ得る。例えば、第2の外因性タンパク質がプロテアーゼである場合、プロテアーゼをスクリーニングするために使用されるアッセイは、例えば、クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動に基づくアッセイなどのプロテアーゼによって生成される切断産物を検出するアッセイであり得る。
一例では、第2の外因性ポリペプチドは、キナーゼ活性を有してもよい。キナーゼ活性のアッセイは、目的の標的に共有結合的に取り込まれたリン酸塩の量を測定し得る。例えば、目的の標的に組み込まれたリン酸塩は、シンチレーションカウンターを用いて放射線の放出を測定することによって定量化され得る、リン酸塩の放射性同位体であり得る。
標的および適応症
いくつかの実施形態では、標的は、表4に列挙される標的である。
いくつかの実施形態では、標的は、表4に列挙される標的である。
いくつかの実施形態では、標的は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFβから選択される免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、標的は表3に列挙される阻害性リガンドであり、第1の外因性ポリペプチドは、任意選択的に、表3の対応する標的受容体由来の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的は表3の標的受容体であり、第1の外因性ポリペプチドは、任意選択的に、表3の対応する阻害性リガンド由来の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、免疫チェックポイント分子(例えば、トリプシン)を切断するプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、例えば、がんを治療するために、T細胞は、例えば、その受容体(例えば、表3の受容体)をT細胞阻害をブロックする分子と接触させることによって、活性化され、または不活性化が防止される。
いくつかの実施形態では、標的は、例えば、ヒト抗体などの抗体である。
本明細書に記載の遺伝子操作された赤血球系細胞はまた、薬剤に対する抗体を有する対象(例えば、図7を参照されたい)を治療するために使用され得る。赤血球系細胞は、対象において抗薬物抗体のレベルを低下させ得て、任意選択的に、その疾患を治療する治療用タンパク質をさらに含み得る。例えば、赤血球系細胞は、例えば、標的が抗薬物抗体である、標的に結合する第1の外因性ポリペプチドを含む。赤血球系細胞は、標的を不活性化する(例えば、切断する)第2の外因性ポリペプチド(例えば、IdeS)をさらに含み得る。赤血球系細胞は、任意選択的に、例えば、対象がそれに対して抗薬物抗体を産生した以前の治療薬と同じまたは異なる治療用タンパク質などである、例えば、対象がそれに対して抗体を産生した以前の治療薬と同じ疾患を治療する、治療用タンパク質などの第3の外因性ポリペプチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、抗CD20抗体分子、抗VEGF-A抗体分子、抗HER2抗体分子、フィルグラスチムなどのG-CSF類似体、抗EGFR抗体分子(例えば、セツキシマブ)、例えば、エポエチンなどのエリスロポエチン、または例えば、IFNβ1aまたはIFNβ1bなどのインターフェロンに対する抗薬物抗体を含んでなる。このような治療方法では、患者は、本明細書に記載の遺伝子操作された赤血球系細胞の投与前、投与中および/または投与後に、例えば、中和抗薬物抗体の存在などの、抗薬物抗体の存在について試験されてもよい。
薬剤相乗的構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が薬剤相乗的である場合、薬剤は、単一経路内の2つ以上の異なる標的に作用する。一実施形態では、2つ以上の薬剤を合わせた作用は、個々の薬剤のいずれかの作用よりも大きい。例えば、第1および第2のポリペプチドは、同一下流標的にシグナル伝達する、細胞受容体のリガンドである。例えば、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的細胞受容体のリガンドを含み、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的細胞受容体のリガンドを含み、例えば、その第1および第2の標的細胞受容体は、同一下流標的にシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し、同時に第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し、例えば、第1の外因性ポリペプチドの第1の標的への結合と、第2の外因性ポリペプチドの第2の標的への結合には、いくらかの一時的な重複がある。いくつかの実施形態では、同時作用は、どちらかの標的が単独作用するまたは隔離されている場合に予期されるよりも大きな規模の相乗的応答を生じる。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が薬剤相乗的である場合、薬剤は、単一経路内の2つ以上の異なる標的に作用する。一実施形態では、2つ以上の薬剤を合わせた作用は、個々の薬剤のいずれかの作用よりも大きい。例えば、第1および第2のポリペプチドは、同一下流標的にシグナル伝達する、細胞受容体のリガンドである。例えば、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的細胞受容体のリガンドを含み、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的細胞受容体のリガンドを含み、例えば、その第1および第2の標的細胞受容体は、同一下流標的にシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用し、同時に第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用し、例えば、第1の外因性ポリペプチドの第1の標的への結合と、第2の外因性ポリペプチドの第2の標的への結合には、いくらかの一時的な重複がある。いくつかの実施形態では、同時作用は、どちらかの標的が単独作用するまたは隔離されている場合に予期されるよりも大きな規模の相乗的応答を生じる。
一実施形態では、第1および第2のポリペプチドは、アポトーシスを媒介する第1の細胞受容体および第2の細胞受容体のリガンドである。一実施形態では、薬剤は、例えば、野生型または変異型TRAILポリペプチド、またはTRAIL受容体に結合して、例えば、がん細胞などの標的細胞でアポトーシスを誘導する抗体分子などの2つ以上のTRAIL受容体リガンドを含んでなる。いくつかの実施形態では、TRAIL受容体リガンドを含んでなる除核RBCが使用されて、NSCLCが治療される。いくつかの実施形態では、TRAIL受容体リガンドを含むRBCは、例えば、本明細書に記載の標的化部分などの標的化部分をさらに含む。一実施形態では、第1の標的および第2の標的は、例えば、基質タンパク質などの同一基質と相互作用する。一実施形態では、第1の標的および第2の標的は、異なる基質と相互作用する。
TRAIL(TNF関連アポトーシス誘導リガンド)は、アポトーシスを誘導するTNFファミリーのメンバーである。TRAILは、TRAIL R1およびTRAIL R2の少なくとも2つの受容体を有する。TRAIL受容体作動薬、例えば、受容体の1つまたは複数に結合するTRAILの変異体、またはTRAILR1またはTRAILR2の片方または双方に結合する抗体分子(例えば、Gasparian et al,Apoptosis 2009 Jun 14(6)、Buchsbaum et al.Future Oncol 2007 Aug3(4)を参照されたい)は、広範ながんの臨床療法として開発されている。TRAIL受容体作動薬の臨床試験は、いくつかの理由の中でも特に、多くの原発性がんが単一の受容体を通じたシグナル伝達に感受性ではなく、むしろ双方の受容体が細胞毒性を誘発する必要があるという事実のために失敗した(Marconi et al,Cell Death and Disease(2013)4,e863)。一実施形態では、遺伝子操作された血液細胞上に発現される薬剤は、組み合わせでTRAIL受容体に双方のTRAIL受容体を同時に作用させる単一受容体特異的TRAIL作動薬であり、したがって標的がん細胞のアポトーシスの相乗的誘導をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、除核赤血球(例えば、網状赤血球)は、その表面に、TRAIL R1に結合する第1のポリペプチドとTRAIL R2に結合する第2のポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドは、TRAIL R1またはTRAIL R2に対して、その他の受容体のKdよりも2、3、4、5、10、20、50、100、200、または500倍強力なKdを有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、TRAIL R1特異的リガンドおよびTRAIL R2特異的リガンドを含む除核赤血球は、ほぼ同じ親和性でTRAIL R1およびTRAIL R2に結合するリガンドを含む除核赤血球よりも、より良好なTRAIL R1およびTRAIL R2のヘテロ二量体化を促進する。
いくつかの実施形態では、1つ、2つ、またはそれ以上の外因性ポリペプチドは、TNFスーパーファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞死受容体DR4(TRAIL-R1)およびDR5(TRAIL-R2)の片方または双方に結合する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、TNFRSF10A/TRAILR1、TNFRSF10B/TRAILR2、TNFRSF10C/TRAILR3、TNFRSF10D/TRAILR4、またはTNFRSF11B/OPGの1つまたは複数に結合する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、MAPK8/JNK、カスパーゼ8、およびカスパーゼ3の1つまたは複数を活性化する。
いくつかの実施形態では、TRAILポリペプチドは、本明細書の配列番号1~5のいずれかの配列、またはそれに対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を有するTRAIL作動薬である。配列同一性は、例えば、BLAST(基本的局所アライメント検索ツールツール)によって測定される。配列番号1~5は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Mohr et al.BMCCancer(2015)15:494)にさらに記載される。
配列番号:1
可溶性TRAIL変異型DR4-1
配列番号2
可溶性TRAIL変異型DR4-2
配列番号3
可溶性TRAIL変異型DR4-3
配列番号4
可溶性TRAIL変異型DR5-1
配列番号5
可溶性TRAIL変異型DR5-2
可溶性TRAIL変異型DR4-1
配列番号2
可溶性TRAIL変異型DR4-2
配列番号3
可溶性TRAIL変異型DR4-3
配列番号4
可溶性TRAIL変異型DR5-1
配列番号5
可溶性TRAIL変異型DR5-2
TRAIL受容体リガンドの全ての組み合わせが想定される。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は、配列番号1および配列番号2;配列番号1および配列番号3;配列番号1および配列番号4;配列番号1および配列番号5;配列番号2および配列番号3;配列番号2および配列番号4;配列番号2および配列番号5;配列番号3および配列番号4;配列番号3および配列番号5;または配列番号4および配列番号5、または前述のいずれかの断片もしくは変異型を含む。
いくつかの実施形態では、TRAIL受容体リガンドは、抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は、TRAIL R1およびTRAIL R2の片方または双方を認識する。抗体分子は、例えば、マパツムマブ(ヒト抗DR4 mAb)、チガツズマブ(ヒト化抗DR5 mAb)、レキサツムマブ(ヒト抗DR5 mAb)、コナツムマブ(ヒト抗DR5 mAb)、またはアポマブ(ヒト抗DR5 mAb)であってもよい。いくつかの実施形態では、除核赤血球(例えば、網状赤血球)は、TRAIL受容体に結合する、2つ以上(例えば、3、4、5またはそれ以上)の異なる抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、除核赤血球(例えば、網状赤血球)は、TRAIL受容体と少なくとも1つのTRAILポリペプチドとに結合する、少なくとも1つの抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、同時に、経路の上流および下流段階を標的化することで、薬剤相乗的に作用する、多段階合成経路の修飾因子である。
乗法的構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が乗法的である場合、第1の薬剤は第1の経路の一部である第1の分子に作用し、第2の薬剤は第2の経路の一部である第2の分子に作用し、それらの経路は所望の応答に向けて協力して作用する。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が乗法的である場合、第1の薬剤は第1の経路の一部である第1の分子に作用し、第2の薬剤は第2の経路の一部である第2の分子に作用し、それらの経路は所望の応答に向けて協力して作用する。
いくつかの実施形態では、所望の応答は、例えば、がん細胞などの細胞死である。理論による拘束は望まないが、がん治療において、例えば、腫瘍または腫瘍微小環境のために、アネルギー性でありまたは別の様式で非機能性である、内因性または外因性の抗腫瘍T細胞を活性化することは有益であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、複数のT細胞活性化経路を始動させ、抗がん免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された赤血球系細胞は、T細胞増殖を促進する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2、3、4、または5またはそれ以上)のT細胞活性化リガンドは、表2のリガンドまたはそのT細胞活性化変異型(例えば、断片)を含んでなる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2、3、4、または5またはそれ以上)のT細胞活性化リガンドは、表2の標的受容体またはそのT細胞活性化変異型(例えば、断片)に結合する、抗体分子を含んでなる。いくつかの実施形態では、第1および第2のポリペプチドは、例えば、CD80、41BB-リガンド、CD86、またはそれらの任意の組み合わせなどの異なるT細胞活性化リガンドを含んでなり、T細胞を刺激して免疫腫瘍学の設定においてアネルギーを克服する。いくつかの実施形態では、除核赤血球(例えば、網状赤血球)は、4-1BBL、OX40L、およびCD40L、またはその断片もしくは変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質は、相補的活性化経路を通じてシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、リガンドは、活性化サイトカイン、インターフェロン、または例えば、IFNa、IL2、またはIL6などのTNFファミリーメンバー(例えば、表1の)、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、薬剤は、上記クラスの分子の組み合わせである。薬剤は、標的受容体に対する内因性リガンドまたは抗体分子に由来し得る。
いくつかの実施形態では、抗IL6またはTNFa抗体分子は、本明細書の配列番号6または7のどちらかの配列、またはそれと少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を含む。
別の例として、第1および第2のポリペプチドは、T細胞活性化リガンドと、免疫腫瘍学の設定において、例えば、CD80および抗PD1などの免疫阻害分子(例えば、免疫阻害受容体)を阻害する薬剤とを含んでなる。別の実施形態では、1つの薬剤は、活性化4-1BBL、またはその断片もしくは変異型であり、第2の薬剤は、PD1シグナル伝達を遮断する抗体分子(例えば、PD1またはPD-L1に対する抗体分子)である。したがって、いくつかの実施形態では、標的T細胞は、活性化され、また阻害も防止される。免疫阻害分子を阻害する薬剤の例としては、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFβ、またはその機能的変異型(例えば、断片)の阻害剤(例えば、それに結合する抗体分子)が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、表3の阻害性リガンドの阻害剤、またはその阻害性断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、表3の標的受容体またはその断片もしくは変異型に結合する、抗体分子である。
いくつかの実施形態では、がんを治療するための薬剤の1つは、例えば、IL-2、IL-12、または表1の別の活性化サイトカイン、またはその断片もしくは変異型などの活性化サイトカインを含んでなる。
いくつかの実施形態では、目的は、T細胞を活性化または阻害することである。本明細書に記載の活性化レセプターまたは阻害レセプターのどちらかを発現してもよいその他の免疫細胞よりも優先的に、T細胞が標的化されることを確実にするために、赤血球(例えば、網状赤血球)上の薬剤の1つは、例えば、T細胞受容体(TCR)または別のT細胞マーカーに結合する抗体分子などの標的化部分を含み得る。標的化部分は、本明細書の「局在化構成」と題されたセクションでより詳細に記載される。いくつかの実施形態では、特異的T細胞サブタイプまたはクローンは増強されてもよく(抗腫瘍特異性を有するT細胞)、または阻害されてもよい。いくつかの実施形態では、赤血球(例えば、網状赤血球)上の1つまたは複数の薬剤は、抗原特異的様式でT細胞受容体に選択的に結合するペプチド-MHC分子である。
いくつかの実施形態では、複数の薬剤は、例えば、腫瘍細胞などの複合標的に由来する複数の抗原を含んでなり、それに対して、複数の特異性を有する複雑な免疫応答を起こすことが望ましい。
いくつかの実施形態では、第1および第2の外因性ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、抗原および共刺激分子を含んでなり、例えば、赤血球系細胞はAPCとして、例えば、がんワクチン接種のために機能し得る。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球(例えば、網状赤血球)は、第1の標的および第2の標的を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは、第1の標的に作用し(例えば、結合し)、第2の外因性ポリペプチドは第2の標的に作用する。任意選択的に、除核赤血球は第3の外因性ポリペプチドを含み、患者は第3の標的を含む。いくつかの実施形態では、第3の外因性ポリペプチドは、第3の標的に作用する。
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、第1の経路における第1の標的の作動薬または拮抗薬である第1の外因性ポリペプチドを含み、第2の経路における第2の標的の作動薬または拮抗薬である第2の外因性ポリペプチドをさらに含み、第1および第2の経路は、所望の応答に向けて協調して作用する。第1および第2の外因性ポリペプチドは、どちらも作動薬であり得て;どちらも拮抗薬であり得て;または1つは作動薬であり得てもう1つは拮抗薬であり得る。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の外因性ポリペプチドは、免疫チェックポイント作動薬または拮抗薬である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、標的化剤をさらに含む。
独立機能構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が独立機能関係を有する場合、薬剤は2つの異なる(例えば、相補的な)機能を有する。例えば、第1の薬剤は第1の標的に結合し、第2の薬剤は第2の標的に結合する。患者は、第1または第2の標的を欠いていてもよい。任意選択的に、第1および第2の薬剤は異なる経路にある。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が独立機能関係を有する場合、薬剤は2つの異なる(例えば、相補的な)機能を有する。例えば、第1の薬剤は第1の標的に結合し、第2の薬剤は第2の標的に結合する。患者は、第1または第2の標的を欠いていてもよい。任意選択的に、第1および第2の薬剤は異なる経路にある。
敗血症、腫瘍溶解症候群、およびサイトカインストームによって特徴付けられるその他の状態では、障害は炎症性サイトカインの多様な混合物によって駆動される。1つのサイトカインに対する既存の単独療法は、これらの急性状態を治療するにはしばしば不十分である。さらに、サイトカインストームの駆動機構を測定して、間に合うように臨床的障害を予防することは、時には不可能であり得る。一実施形態では、第1および第2のペプチドは、2つの異なるサイトカインに結合する分子(例えば、抗体分子)である。いくつかの実施形態では、薬剤は異なるサイトカインに結合して中和し、したがって遺伝子操作された赤血球製品は、サイトカインストームからの多面的な保護を提供する。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、例えば、IL-1、IL02、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35、またはIL-36などのインターロイキンを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、表1のサイトカインまたはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、第1のサイトカインはTNFaであり、第2のサイトカインは例えば、IL-6などのインターロイキン、または前述のいずれかの断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗TNFa、抗IL-6、または抗IFNg抗体分子、またはそれらの任意の組み合わせ、前述のいずれかの断片もしくは変異型を含む。
いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドおよび第2の外因性ポリペプチドを含む除核赤血球(例えば、網状赤血球)は、第1の標的を有するが第2の標的を有しない対象に投与され、または患者は第1の標的または第2の標的を有しないと思われている。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドは第1の標的に作用(例えば、結合)し、第2の外因性ポリペプチドは実質的に結合しないままである。任意選択的に、除核赤血球は第3の外因性ポリペプチドを含み、患者は第3の標的を欠き、または第3の標的を有しないと思われている。いくつかの実施形態では、除核赤血球は複数の外因性ポリペプチドを含み、患者は複数の外因性ポリペプチドの1つまたはサブセットの標的を有せず、または有しないと思われている。
独立機能構成の例は、図4に示される。図4の赤血球系細胞は、第1の外因性ポリペプチド(白色)、第2の外因性ポリペプチド(網掛け)、および任意選択の第3の外因性ポリペプチド(クロスハッチング(close hatching))を含む。第1の外因性ポリペプチドは、例えば、サイトカインAなどの第1の標的に結合し得て、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、サイトカインBなどの第2の標的に独立して結合する。この遺伝子操作された赤血球系細胞は、双方のサイトカインが対象に存在する場合、どちらも補足して除去する。サイトカインの1つのみが対象に存在する場合、遺伝子操作された赤血球系細胞は、そのサイトカインを除去し得る。いくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2つまたは全部)の外因性ポリペプチドは、例えば、scFvなどの抗体分子を含み、任意選択的に、膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的は、複数のサイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含む。
局在化構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が局在化関係を有する場合、第1の薬剤は、作用部位に局在化していない場合のそれらの活性と比較して、第2のまたはその他の薬剤または薬剤群の活性を増強する作用部位に、RBCを局在化させる(例えば、第1の薬剤のその標的への結合によって、その標的の領域における第2の薬剤の局所濃度の増加がある)。いくつかの実施形態では、1つの薬剤は、赤血球(例えば、網状赤血球)を作用部位に標的化する役割を果たし、1つまたは複数の薬剤は治療効果を有する。一実施形態では、第1の薬剤の結合は、例えば、ポリペプチドなど、第2の薬剤によって結合された実体の活性を増加させる。一実施形態では、第1の薬剤は、例えば、第2の薬剤によって結合されたポリペプチドなどの実体の基質または生成物に結合する。RBCを局在化させる薬剤は、例えば、標的細胞上の受容体に対するリガンドであっても、または標的細胞上の細胞表面分子に結合する抗体であってもよい。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が局在化関係を有する場合、第1の薬剤は、作用部位に局在化していない場合のそれらの活性と比較して、第2のまたはその他の薬剤または薬剤群の活性を増強する作用部位に、RBCを局在化させる(例えば、第1の薬剤のその標的への結合によって、その標的の領域における第2の薬剤の局所濃度の増加がある)。いくつかの実施形態では、1つの薬剤は、赤血球(例えば、網状赤血球)を作用部位に標的化する役割を果たし、1つまたは複数の薬剤は治療効果を有する。一実施形態では、第1の薬剤の結合は、例えば、ポリペプチドなど、第2の薬剤によって結合された実体の活性を増加させる。一実施形態では、第1の薬剤は、例えば、第2の薬剤によって結合されたポリペプチドなどの実体の基質または生成物に結合する。RBCを局在化させる薬剤は、例えば、標的細胞上の受容体に対するリガンドであっても、または標的細胞上の細胞表面分子に結合する抗体であってもよい。
図9に示されるように、細胞は、1つまたは複数の標的化剤を含み得る。標的化剤は、外因性ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、2つの標的化剤を含んでなる赤血球系細胞は、標的化剤の1つのみを含んでなるその他の点では類似した赤血球系細胞と比較して、その標的に結合する赤血球系細胞の特異性および/または親和性および/または結合活性を増加させてもよい。赤血球系細胞は、任意選択的に、例えば、抗がん活性などの治療活性を有する、外因性ポリペプチドをさらに含んでなる。治療活性を有する外因性ポリペプチドは、酵素、捕捉試薬、作動薬、または拮抗薬を含んでなり得る。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、受容体またはその断片もしくは変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、scFvなどの抗体分子を含んでなる。
別の例として、標的化剤は、例えば、固形腫瘍細胞などのがん細胞にまたはその近くに結合し、第2の薬剤(例えば、第2のポリペプチド)は抗がん機能を有する。いくつかの実施形態では、作用部位は腫瘍血管系である。いくつかの実施形態では、標的化剤は、血管新生マーカーに結合し、例えば、avB1、avB3、またはavB5、またはa4b1インテグリンなどのインテグリン、例えば、合成ペプチドノッチン(Kim et al,JACS 2016,137(1))、または例えば、エキスタチン、RGD、EETI2.5F、またはVCAM-1などの内因性または天然リガンドに結合し、または血管新生に際しても豊富に見られる前立腺特異的膜抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的化剤は、(例えば、多発性骨髄腫細胞において発現される)CD269、または(例えば、ALM細胞において発現される)CD123、(例えば、T細胞において発現され;CD80/CD86によって結合され得る)CD28、(例えば、卵巣がんにおいて発現される)NY-ESO-1などのがん細胞マーカーに結合する。
治療剤は、例えば、いくつかのストラテジーがある、抗がん効果を有してもよい。例えば、治療剤は、例えば、腫瘍細胞によって増殖のために選択的に要求される代謝産物を分解する、アスパラギナーゼ、メチオニンγリアーゼ(MGL)、セリンデヒドロゲナーゼ(dehyrodgenase)、またはその断片もしくは変異型などの酵素であってもよい。治療剤は、例えば、血管増殖を防止するためのアンギオポエチン(angiopoitin)の阻害剤、またはVEGFまたはVEGFRの阻害剤などの血管新生の阻害剤であってもよい。治療剤は、サイトカインまたはT細胞活性化リガンド(例えば、表1および表2を参照されたい)のどちらかの、T細胞を活性化するための免疫刺激分子であってもよい。治療剤は、例えば、T細胞または炎症性マクロファージなどの免疫エフェクター細胞に結合し、エフェクター細胞を捕捉して腫瘍の近傍に持ち込んでもよい。治療剤は、例えば、TRAILまたはFAS-Lまたは他のデスリガンド、または毒素などの細胞死の直接的なメディエーターであり得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、例えば、作動性抗体分子などのTRAIL受容体の作動薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、治療剤はアポトーシス促進剤である。いくつかの実施形態では、治療剤はアジュバントを含んでなる。これらの治療剤のいずれについても、最終結果は、腫瘍部位に局在する赤血球治療剤であり、したがってその抗腫瘍効果をその効能を高める場所に集中させる。
いくつかの実施形態では、例えば、B細胞がんを治療するために、第1の外因性ポリペプチドは、細胞をがん細胞に標的化し得る、表面露出抗CD20抗体分子を含んでなり、第2の外因性ポリペプチドは、がん細胞を阻害(例えば、殺滅)し得る、表面露出抗CD40抗体分子を含んでなる。赤血球系細胞は、例えば、図8に示される、抗CD40抗体分子の阻害剤をさらに含んでなり得る。
第1の外因性ポリペプチドは標的化剤を含んでなり得て、第2の外因性ポリペプチドは酵素を含んでなり得る(例えば、図11)。例えば、がんの治療などのいくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、がん細胞に結合する標的化剤を含んでなる第1のポリペプチドと、がん細胞を阻害する(例えば、殺滅し、アネルギーを誘発し、増殖を阻害する)第2のポリペプチドとを含んでなる。例えば、標的化剤は、例えば、がん性T細胞などのT細胞表面のCD4に結合する、抗CD4抗体を含んでなり得る。第2のポリペプチドは、表面に露出し得るまたは細胞内にあり得る酵素を含んでなり得て、例えば、酵素は細胞内であり膜結合性でない。酵素は、トリプトファンを枯渇させて、がん性T細胞またはADAまたはその断片もしくは変異型にアネルギーを誘発し得る、IDOまたはその断片もしくは変異型であってもよい。酵素は、プロテアーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、例えば、ヘルパーT細胞などのT細胞などの免疫細胞および/または疾患細胞である。標的化剤は、例えば、scFvなどの抗体分子を含んでもよい。
第1の外因性ポリペプチドは標的化剤を含んでなり得て、第2の外因性ポリペプチドは標的の作動薬を含んでなり得る(例えば、図12を参照されたい)。いくつかの実施形態では、標的化剤は、受容体またはその断片もしくは変異型、抗体分子、リガンドまたはその断片もしくは変異型、サイトカインまたはその断片もしくは変異型を含んでなる。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、アテニュエーター、アクチベーター、細胞殺傷剤、または細胞毒性分子(例えば、小分子、タンパク質、例えば、アンチセンスRNAなどのRNA、またはTLRリガンド)を含んでなる。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは細胞内であり例えば、膜結合性でなく、いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは表面に露出している。
赤血球系細胞は、標的化剤および捕捉剤を含んでなり得る(例えば、図13)。例えば、第1の外因性ポリペプチドは、例えば、抗BCMA抗体分子などの形質細胞に結合する標的化剤を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、第2の外因性ポリペプチドは、標的が内因性受容体と相互作用するのを妨げるように、例えば、受容体結合部位と重なる部分で標的に結合するように標的に結合する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、疾患部位で受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化剤は、リガンドまたはサイトカインまたはその断片もしくは変異型、または例えば、scFvなどの抗体分子を含んでなる。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、受容体またはその断片もしくは変異型、または例えば、scFvなどの抗体分子を含んでなる。いくつかの実施形態では、リガンドは、望まれないサイトカインまたはケモカインである。
標的化剤は、赤血球系細胞を細胞の特定のサブタイプに誘導し得る。細胞は、例えば、細胞死を軽減、活性化または誘導し得るなど、標的細胞内の所与の活性または経路を促進する、第2の外因性ポリペプチドをさらに含んでなり得る。例えば、図14は、標的細胞に結合し得る第1の外因性ポリペプチドを含んでなる、赤血球系細胞を描写する。赤血球系細胞は、がん細胞を阻害する(例えば、殺滅し、または増殖を阻害する)、第2の外因性ポリペプチドをさらに含んでなり得る。例えば、第2の外因性ポリペプチドは、例えば、アポトーシス促進剤、例えば、がん細胞にアポトーシスを誘発するTRAILポリペプチドなどの細胞殺傷剤を含んでなり得る。赤血球系細胞は、表面に露出したまたは細胞内にある、標的化剤およびアテニュエーターまたはアクチベーターを含んでいてもよい。例えば、細胞は、標的化剤と、IDOまたはADAまたはその断片もしくは変異型などの酵素とを含んでなり得る。
近接性ベースの構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が近接性ベースの関係を有する場合、2つの薬剤はより強く機能し、例えば、それらが物理的に分離している場合よりも互いに近接している場合に、より顕著な効果を発揮する。いくつかの実施形態では、2つの薬剤は、それらが互いに直接結合している場合、それらが複合体の一部である場合(例えば、第3の因子によって連結される場合)、それらが同一細胞膜上に存在する場合、またはそれらが細胞膜の同一サブセクション上に存在する場合(例えば、脂質ラフト内、脂質ラフトの外側、または細胞骨格構成要素などの細胞内構造に直接的または間接的に結合する場合)に、近接している。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは第1の標的分子に結合し、第2のポリペプチドは第2の標的分子に結合し、この結合は、第1の標的分子および第2の標的分子を互いにより近く移動させ、例えば、互いに結合させる。いくつかの実施形態では、第1および第2の標的分子は、標的細胞上の細胞表面受容体である。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が近接性ベースの関係を有する場合、2つの薬剤はより強く機能し、例えば、それらが物理的に分離している場合よりも互いに近接している場合に、より顕著な効果を発揮する。いくつかの実施形態では、2つの薬剤は、それらが互いに直接結合している場合、それらが複合体の一部である場合(例えば、第3の因子によって連結される場合)、それらが同一細胞膜上に存在する場合、またはそれらが細胞膜の同一サブセクション上に存在する場合(例えば、脂質ラフト内、脂質ラフトの外側、または細胞骨格構成要素などの細胞内構造に直接的または間接的に結合する場合)に、近接している。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドは第1の標的分子に結合し、第2のポリペプチドは第2の標的分子に結合し、この結合は、第1の標的分子および第2の標的分子を互いにより近く移動させ、例えば、互いに結合させる。いくつかの実施形態では、第1および第2の標的分子は、標的細胞上の細胞表面受容体である。
近接性ベースの構成の一例は、図4に示される。図4の赤血球系細胞は、任意選択の第1の外因性ポリペプチド(白色)、第2の外因性ポリペプチド(薄いグレー)、および第3の外因性ポリペプチド(濃いグレー)を含む。第2および第3の外因性ポリペプチドは、例えば、サイトカインBなどの標的の同一ポリペプチド鎖内の異なるエピトープに結合する。赤血球上に載った第2および第3の外因性ポリペプチドは、第2および第3の外因性ポリペプチドが遊離ポリペプチドである場合よりも、高い結合活性で標的に結合する。例として、2つ以上の外因性ポリペプチドは、同一標的上の異なる部位に結合し得て、標的はサイトカイン、酵素、または抗体である。
スキャフォールド構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が骨格関係を有する場合、薬剤は2つ以上の標的を一緒にして、標的が互いに相互作用する可能性を高める。一実施形態では、第1および第2の薬剤は、RBCの表面で互いに結合する(スキャフォールドを形成する)、例えば、2つの複合ポリペプチドである。一実施形態では、赤血球(例えば、網状赤血球)は、例えば、表1、表2、および表3のいずれかなどの本明細書に記載の1つまたは複数(例えば、2つ)のタンパク質を認識する抗体分子などの、二重特異性抗体分子を含む。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が骨格関係を有する場合、薬剤は2つ以上の標的を一緒にして、標的が互いに相互作用する可能性を高める。一実施形態では、第1および第2の薬剤は、RBCの表面で互いに結合する(スキャフォールドを形成する)、例えば、2つの複合ポリペプチドである。一実施形態では、赤血球(例えば、網状赤血球)は、例えば、表1、表2、および表3のいずれかなどの本明細書に記載の1つまたは複数(例えば、2つ)のタンパク質を認識する抗体分子などの、二重特異性抗体分子を含む。
標的は、例えば、タンパク質、細胞、小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施形態では、第1および第2の標的はタンパク質である。一実施形態では、第1および第2の標的は細胞である。
別の例として、RBCは、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)とがん細胞を互いに近傍に持ち込んで、免疫エフェクター細胞によるがん細胞の殺滅を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドはがん細胞の細胞表面マーカーに結合し、第2のポリペプチドは免疫エフェクター細胞の細胞表面マーカーに結合する。第1および第2のポリペプチドは、例えば、抗体分子を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、がん細胞マーカーは、CD19(例えば、B細胞急性白血病において発現される)、EpCAM(例えば、CTCにおいて発現される)、CD20(例えば、B細胞急性白血病において発現される)、CD45(例えば、CTCにおいて発現される)、EGFR、HER2(例えば、乳がん細胞において発現される)から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞マーカーはCD3である。
いくつかの実施形態では、RBCは、免疫エフェクター細胞を別の免疫細胞の近傍に持ち込んで、例えば、がんワクチンのために、例えば、抗原提示を促進する(例えば、1つの細胞が抗原提示細胞であり、もう1つの細胞がT細胞である場合)。
いくつかの実施形態では、RBCは、第1の抗体分子ドメインおよび第2の抗体分子ドメインを含む外因性融合ポリペプチドを発現し、外因性ポリペプチドは、二重特異性抗体として機能し、例えば、第1の抗体分子ドメインは、第1の細胞上の第1の標的に結合し、第2の抗体分子ドメインは、例えば、異なる細胞型などの第2の細胞上の第2の標的に結合する。
多量体構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が多量体構成を有する場合、薬剤は、互いに組み合わさって、例えば、互いに結合して、標的上で機能または活性を有する複合体を形成する。一実施形態では、薬剤は、例えば、MHCIなどの細胞表面複合体のサブユニットであり、機能はペプチドに結合することである。一実施形態では、薬剤はMHCIIのサブユニットであり、機能はペプチドに結合することである。一実施形態では、薬剤は、例えば、MHCIなどの細胞表面分子のサブユニット、および例えば、MHCI分子上に負荷されたペプチドなどのペプチドであり、機能はペプチドを提示することである。一実施形態では、薬剤は、MHCIIのサブユニット、例えば、MHCII分子に負荷されたペプチドなどのペプチドであり、機能はペプチドを提示することである。一実施形態では、複合体は機能的MHCIであり、薬剤はMHCI(α鎖1~3)およびβ-2ミクログロブリン、またはその断片もしくは変異型である。一実施形態では、複合体はMHCIIであり、薬剤はMHCIIα鎖およびMHCIIβ鎖、またはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、MHC分子は、例えば、MHCIIαサブユニットおよびMHCIIβサブユニット、または双方のサブユニットを含む融合分子またはその抗原提示断片などの、ヒトMHCクラスIまたはIIを含む。これらの2つのポリペプチドを有するRBCは、いくつかの実施形態では、免疫誘導または抗原提示のために使用される。いくつかの実施形態では、RBCは、例えば、一本鎖ペプチド-MHCコンストラクトなどのMHC分子と抗原との間の融合物である、単一のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、例えば、ペプチドまたはβ-2ミクログロブリンなどの複合体の非膜係留構要素は、表面への輸送に先だって、細胞内の別の薬剤と共にアセンブルされ、細胞によって分泌され、次に、多量体の膜係留構成要素によって表面で捕捉されるか、または精製形態で遺伝子操作された赤血球に添加される。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が多量体構成を有する場合、薬剤は、互いに組み合わさって、例えば、互いに結合して、標的上で機能または活性を有する複合体を形成する。一実施形態では、薬剤は、例えば、MHCIなどの細胞表面複合体のサブユニットであり、機能はペプチドに結合することである。一実施形態では、薬剤はMHCIIのサブユニットであり、機能はペプチドに結合することである。一実施形態では、薬剤は、例えば、MHCIなどの細胞表面分子のサブユニット、および例えば、MHCI分子上に負荷されたペプチドなどのペプチドであり、機能はペプチドを提示することである。一実施形態では、薬剤は、MHCIIのサブユニット、例えば、MHCII分子に負荷されたペプチドなどのペプチドであり、機能はペプチドを提示することである。一実施形態では、複合体は機能的MHCIであり、薬剤はMHCI(α鎖1~3)およびβ-2ミクログロブリン、またはその断片もしくは変異型である。一実施形態では、複合体はMHCIIであり、薬剤はMHCIIα鎖およびMHCIIβ鎖、またはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、MHC分子は、例えば、MHCIIαサブユニットおよびMHCIIβサブユニット、または双方のサブユニットを含む融合分子またはその抗原提示断片などの、ヒトMHCクラスIまたはIIを含む。これらの2つのポリペプチドを有するRBCは、いくつかの実施形態では、免疫誘導または抗原提示のために使用される。いくつかの実施形態では、RBCは、例えば、一本鎖ペプチド-MHCコンストラクトなどのMHC分子と抗原との間の融合物である、単一のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、例えば、ペプチドまたはβ-2ミクログロブリンなどの複合体の非膜係留構要素は、表面への輸送に先だって、細胞内の別の薬剤と共にアセンブルされ、細胞によって分泌され、次に、多量体の膜係留構成要素によって表面で捕捉されるか、または精製形態で遺伝子操作された赤血球に添加される。
抗原は、いくつかの実施形態では、例えば、がんワクチンなどのがん抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、または35アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、複合体は、異なるポリペプチド鎖に由来する複数のサブドメインを含み、複合体が活性であるためには、その全てが発現されなくてはならない。
代償性構成
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が代償性関係を有する場合、第1の薬剤は、第2の薬剤の望ましくない特性を低下させる。例えば、いくつかの実施形態では、第2の薬剤は所与のレベルの免疫原性を有し、第1の薬剤は、例えば、免疫細胞に負にシグナル伝達することによって(表3を参照されたい)、または第2の薬剤の抗原性エピトープを遮蔽することによって、免疫原性を低下させる。いくつかの実施形態では、第2の薬剤は所定の半減期を有し、第1の薬剤は第2の薬剤の半減期を延長する。例えば、第1の薬剤は、シャペロンまたはその断片もしくは変異型を含み得る。
2つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)が代償性関係を有する場合、第1の薬剤は、第2の薬剤の望ましくない特性を低下させる。例えば、いくつかの実施形態では、第2の薬剤は所与のレベルの免疫原性を有し、第1の薬剤は、例えば、免疫細胞に負にシグナル伝達することによって(表3を参照されたい)、または第2の薬剤の抗原性エピトープを遮蔽することによって、免疫原性を低下させる。いくつかの実施形態では、第2の薬剤は所定の半減期を有し、第1の薬剤は第2の薬剤の半減期を延長する。例えば、第1の薬剤は、シャペロンまたはその断片もしくは変異型を含み得る。
除核赤血球系細胞は、治療用タンパク質およびその阻害剤を同時発現し得る(例えば、図8)。阻害剤は、体内の所望の位置で放出されて(例えば、治療薬への結合を止めるが細胞表面に残留する)、治療タンパク質を活性化し得る。
例えば、いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、治療活性を有する第1の外因性ポリペプチド(例えば、抗CD40抗体分子)と、第1の外因性ポリペプチドを阻害する第2の外因性ポリペプチド(例えば、CD40またはその断片もしくは変異型)とを含む。第2のポリペプチド(例えば、CD40)は、赤血球系細胞が、例えば、がん細胞などの所望の位置にあるまで、例えば、オフターゲット効果を制限するまで、第1の外因性ポリペプチド(例えば、抗CD40またはその変異型)の活性を阻害してもよい。第2の外因性ポリペプチド(例えば、TNFα)は、第1の外因性ポリペプチド(例えば、抗TNFα)が結合する、標的の変異型(例えば、内因性CD40)を含み得る。例えば、変異型は、標的の存在下で競合する弱結合性変異型であり得る。いくつかの実施形態では、第1の外因性ポリペプチドの第2の外因性ポリペプチドに対するKdは、第1の外因性ポリペプチドのその標的に対するKdよりも少なくとも2、3、5、10、20、50、または100倍高い。赤血球系細胞は、任意選択的に、標的化剤、例えば、抗CD20抗体分子を含む第3の外因性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、対象の所望の部位で薬物(例えば、インスリン)になるプロドラッグ(例えば、プロインスリン)を含む。
3つ以上の薬剤(例えば、ポリペプチド)を含む除核赤血球
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球(例えば、網状赤血球)は、例えば、少なくとも4、5、10、20、50、100、200、500、または1000などの3つまたはそれ以上の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球集団は、例えば、少なくとも4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、または5000などの3つまたはそれ以上の薬剤を含み、例えば、集団中の異なるRBCは異なる薬剤を含み、または集団中の異なるRBは異なる複数の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、RBC中のまたはRBC集団中の2つ以上の(例えば、全部の)薬剤は、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球(例えば、網状赤血球)は、例えば、少なくとも4、5、10、20、50、100、200、500、または1000などの3つまたはそれ以上の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球集団は、例えば、少なくとも4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、または5000などの3つまたはそれ以上の薬剤を含み、例えば、集団中の異なるRBCは異なる薬剤を含み、または集団中の異なるRBは異なる複数の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、RBC中のまたはRBC集団中の2つ以上の(例えば、全部の)薬剤は、薬剤相加的、薬剤相乗的、乗法的、独立機能、局在ベース、近接依存性、スキャフォールドベース、多量体ベース、または代償性活性を有する。
いくつかの実施形態では、RBCは、RBC前駆細胞を、薬剤をコードする複数のmRNAに接触させることによって産生される。
真核生物提示スクリーニング。一実施形態では、例えば、生体外または生体内結合アッセイにおける使用のために、コンビナトリアルな高多様性の細胞プールが作製される。細胞表面タンパク質をコードするコンビナトリアルな高多様性の核酸ライブラリーが、作製され得る。このようなライブラリーは、例えば、完全に可変性の配列からなるか、または高度に可変性のコンビナトリアル配列に融合された固定配列を含み得る。これらは、電気穿孔、形質移入またはウイルス形質導入などの方法を用いて、混合物としてまたは個別に、赤血球前駆細胞に導入され得る。一実施形態では、引き続いて、所望の成熟度まで細胞を分化培地中で増殖させる。一実施形態では、細胞は、高度に多重化された生体外アッセイのために使用される。細胞は、マイクロタイタープレート内で、生物学的サンプルと共にインキュベートされる。ウェルは、所望のレベルのストリンジェンシーで、細胞適合性緩衝液を用いて洗浄される。残留する細胞が単離され、特異的配列の濃縮について分析される。一実施形態では、分析は、例えば、質量分析を用いてタンパク質レベルで実施され、結合された集団において富化されたアミノ酸モチーフが同定される。一実施形態では、分析が核酸レベル(RNAまたはDNA)で実施され、結合集団が豊富な対応するアミノ酸モチーフを同定する核酸配列が同定される。一実施形態では、高多様性細胞集団が(健常または病的のどちらかの)動物モデルに注射される。一実施形態では、細胞は蛍光標識されて、生体内での分布または局在が視覚化される。次に、動物の様々な組織が採取され、対応するアミノ酸モチーフを同定する特定のアミノ酸モチーフまたは核酸配列の相対的な富化について分析され得る。
発現最適化。多数の変異型は、個々の細胞に同時に形質移入され、それらの相対的転写または翻訳能力が評価され得る。いくつかの実施形態では。タンパク質コード配列のライブラリーは、多様な5’非翻訳領域、3’非翻訳領域、コドン表現、アミノ酸変化、およびその他の配列の相違をもって、設計および合成される。これのライブラリーは、電気穿孔、形質移入またはウイルス形質導入などの方法を用いて、混合物としてまたは個別に、赤血球前駆細胞に導入される。一実施形態では、引き続いて、所望の成熟度まで細胞を分化培地中で増殖させる。
除核赤血球の物理的特性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のRBC(例えば、網状赤血球)は、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含有量などの、本明細書に記載の1つまたは複数(例えば、2、3、4、またはそれ以上)の物理的特徴を有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、外因性タンパク質を発現する除核RBCは、野生型の未処理RBCに似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧性に負荷されたRBCは、時には、浸透圧の脆弱性の増加、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の減少、または細胞膜の細胞表面側の単分子上のホスファチジルセリンレベルの増加などの異常な物理的特徴を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のRBC(例えば、網状赤血球)は、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含有量などの、本明細書に記載の1つまたは複数(例えば、2、3、4、またはそれ以上)の物理的特徴を有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、外因性タンパク質を発現する除核RBCは、野生型の未処理RBCに似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧性に負荷されたRBCは、時には、浸透圧の脆弱性の増加、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の減少、または細胞膜の細胞表面側の単分子上のホスファチジルセリンレベルの増加などの異常な物理的特徴を示す。
いくつかの実施形態では、除核RBCは、細胞によって保持されないか、精製されていないか、またはRBCの外部に完全に存在しなかった、外因性核酸によってコードされる外因性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、RBCは、安定剤を欠く組成物中にある。
浸透圧脆弱性
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、外因性ポリペプチドを含まない単離された未培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態では、除核赤血球の集団は、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、または0.5%のNaClで、50%未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例59の方法を用いてアッセイされ得る。
いくつかの実施形態では、除核赤血球は、外因性ポリペプチドを含まない単離された未培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態では、除核赤血球の集団は、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、または0.5%のNaClで、50%未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例59の方法を用いてアッセイされ得る。
細胞サイズ
いくつかの実施形態では、除核RBCは、ほぼ野生型の未処理のRBCの直径または容積を有する。
いくつかの実施形態では、除核RBCは、ほぼ野生型の未処理のRBCの直径または容積を有する。
いくつかの実施形態では、RBC集団は約4、5、6、7、または8ミクロンの平均直径を有し、任意選択的に、集団の標準偏差は1、2、または3ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のRBCは、約4~8、5~7、または約6ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、RBCの直径は、約1ミクロン未満、約20ミクロンを超える、約1ミクロン~約20ミクロン、約2ミクロン~約20ミクロン、約3ミクロン~約20ミクロン、約4ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約20ミクロン、約6ミクロン~約20ミクロン、約5ミクロン~約15ミクロンまたは約10ミクロン~約30ミクロンである。細胞の直径は、いくつかの実施形態では、Advia
120血液検査システムを用いて測定される。
120血液検査システムを用いて測定される。
いくつかの実施形態では、RBCの平均赤血球容積の容積(the volume of the mean corpuscular volume)は、10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fLを超え、または150fLを超える(greater than...or greater than)。一実施形態では、RBCの平均赤血球容積は、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL未満であり、または200fL未満である(less than...or less than)。一実施形態では、RBCの平均赤血球容積は、80~100、100~200、200~300、300~400、または400~500フェムトリットル(fL)である。いくつかの実施形態では、RBC集団は、本段落に記載される平均赤血球容積を有し、集団の標準偏差は、50、40、30、20、10、5、または2fL未満である。平均赤血球容積は、いくつかの実施形態では、例えば、コールターカウンターなどの血液学的分析装置を用いて測定される。
ヘモグロビン濃度
いくつかの実施形態では、除核RBCは、野生型未処理RBCと同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態では、RBCは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%を超え、または10%を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態では、RBCは、少なくとも約20、22、24、26、28、または30pgの、任意選択的に、約30pgに至る、総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態では、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例33のドラブキン試薬法を用いて判定される。
いくつかの実施形態では、除核RBCは、野生型未処理RBCと同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態では、RBCは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%を超え、または10%を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態では、RBCは、少なくとも約20、22、24、26、28、または30pgの、任意選択的に、約30pgに至る、総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態では、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例33のドラブキン試薬法を用いて判定される。
ホスファチジルセリン含有量
いくつかの実施形態では、除核RBCは、その細胞膜の細胞表面側の単分子層上に、野生型の未処理RBCとほぼ同じホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型の未処理RBCの細胞膜の細胞質側の単分子層上にあり、低張負荷は、ホスファチジルセリンを細胞表面側の単分子層に分布させ、免疫応答を始動し得る。いくつかの実施形態では、RBCの集団は、アネキシンV染色について陽性である約30、25、20、15、10、9、8、6、5、4、3、2、または1%未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン曝露は、いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例54の方法を用いて、PSに優先的に結合するアネキシン-V-FITCについて染色し、フローサイトメトリーによってFITC蛍光を測定することで評価される。
いくつかの実施形態では、除核RBCは、その細胞膜の細胞表面側の単分子層上に、野生型の未処理RBCとほぼ同じホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型の未処理RBCの細胞膜の細胞質側の単分子層上にあり、低張負荷は、ホスファチジルセリンを細胞表面側の単分子層に分布させ、免疫応答を始動し得る。いくつかの実施形態では、RBCの集団は、アネキシンV染色について陽性である約30、25、20、15、10、9、8、6、5、4、3、2、または1%未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン曝露は、いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例54の方法を用いて、PSに優先的に結合するアネキシン-V-FITCについて染色し、フローサイトメトリーによってFITC蛍光を測定することで評価される。
その他の特性
いくつかの実施形態では、RBCの集団は、GPAに対して陽性である、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%または95%(任意選択的に、90または100%に至る)の細胞を含む。GPAの存在は、いくつかの実施形態では、FACSを用いて検出される。
いくつかの実施形態では、RBCの集団は、GPAに対して陽性である、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%または95%(任意選択的に、90または100%に至る)の細胞を含む。GPAの存在は、いくつかの実施形態では、FACSを用いて検出される。
いくつかの実施形態では、RBCは、対象において少なくとも30、45、または90日間の半減期を有する。
いくつかの実施形態では、RBCを含む細胞の集団は、約10、5、4、3、2または1%未満の棘状赤血球を含む。
いくつかの実施形態では、RBCは除核され、例えば、本明細書に記載の治療製剤として使用されるRBCを含む細胞集団は、50%、60%、70%、80%、90%を超えて除核される。いくつかの実施形態では、例えば、RBCなどの細胞は、例えば、不活性化されている、非機能性核を含有する。
除核赤血球の製造方法
外因性薬剤(例えば、ポリペプチド)を含む(例えば、発現する)除核赤血球(例えば、網状赤血球)の製造方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第2015/073587号パンフレットおよび国際公開第2015/153102号パンフレットに記載される。
外因性薬剤(例えば、ポリペプチド)を含む(例えば、発現する)除核赤血球(例えば、網状赤血球)の製造方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第2015/073587号パンフレットおよび国際公開第2015/153102号パンフレットに記載される。
いくつかの実施形態では、例えば、CD34+造血前駆細胞などの造血前駆細胞を、1つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸または核酸群と接触させ、細胞が培養中で増殖して分化できるようにする。
いくつかの実施形態では、2つ以上のポリペプチドが、例えば、単一ベクターなどの単一核酸内でコードされる。いくつかの実施形態では、単一ベクターは各遺伝子のための別個のプロモーターを有して、引き続くタンパク質分解処理により2つのタンパク質が得られるように、中央にプロテアーゼ切断部位を有する単一のポリペプチドに最初に転写される2つのタンパク質を有し、または任意のその他の適切な構成を有する。いくつかの実施形態では、2つ以上のポリペプチドは、2つ以上の核酸でコードされ、例えば、各ベクターは、ポリペプチドの1つをコードする。
核酸は、例えば、DNAまたはRNAであってもよい。例えば、レトロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV1)などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどのスプマウイルスをはじめとするいくつかのウイルスが、遺伝子移入ビヒクルとして使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第2014/183071号パンフレットまたは国際公開第2014/183066号パンフレットに記載されるような、Sortag技術を用いて作製される。
いくつかの実施形態では、RBCは、少なくとも1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000、または100,000倍に(任意選択的に、100,000、200,000、または500,000倍に至るまで)増殖される。細胞数は、いくつかの実施形態では、自動細胞計数器を使用して測定される。
いくつかの実施形態では、RBC集団は、少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または98%の(任意選択的に、約80、90、または100%に至る)除核RBCを含む。いくつかの実施形態では、RBCの集団は、1%未満の生存除核細胞を含有し、例えば、検出可能な生存除核細胞を含有しない。核除去は、いくつかの実施形態では、核染色を用いるFACSによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、または80%の(任意選択的に、約70、80、90、または100%に至る)RBCは、1つまたは複数(例えば、2、3、4またはそれ以上)の外因性ポリペプチドを含む。ポリペプチドの発現は、いくつかの実施形態では、ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、FACSによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、または80%の(任意選択的に、約70、80、90、または100%に至る)RBCは核除去され、1つまたは複数(例えば、2、3、4またはそれ以上)の外因性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、RBC集団は、約1×109~2×109、2×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~2×1010、2×1010~5×1010、5×1010~1×1011、1×1011~2×1011、2×1011~5×1011、5×1011~1×1012、1×1012~2×1012、2×1012~5×1012、または5×1012~1×1013個の細胞を含む。
物理的に近接した相乗的薬剤
いくつかの態様では、本開示は、互いに物理的に近接した第1の薬剤および第2の薬剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、互いに物理的に近接している場合には相乗的に作用するが、離れている場合には相乗的に作用しない。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は、共有結合しており、例えば、融合タンパク質の一部であるか、または一緒に化学的に共役している。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は非共有結合的に連結し、例えば、互いに直接結合し、またはスキャフォールドに結合している。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は、ナノ粒子(例えば、1~100、100~2,500、または2,500~10,000nmの直径)リポソーム、小胞、ビーズ、ポリマー、移植片、またはポリペプチド複合体の一部である(例えば、連結している)。
いくつかの態様では、本開示は、互いに物理的に近接した第1の薬剤および第2の薬剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、互いに物理的に近接している場合には相乗的に作用するが、離れている場合には相乗的に作用しない。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は、共有結合しており、例えば、融合タンパク質の一部であるか、または一緒に化学的に共役している。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は非共有結合的に連結し、例えば、互いに直接結合し、またはスキャフォールドに結合している。いくつかの実施形態では、第1および第2の薬剤は、ナノ粒子(例えば、1~100、100~2,500、または2,500~10,000nmの直径)リポソーム、小胞、ビーズ、ポリマー、移植片、またはポリペプチド複合体の一部である(例えば、連結している)。
いくつかの実施形態では、組成物は、互いに物理的に近接している(例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に連結する)、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10の異なる薬剤を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される1つまたは複数(例えば、2、3、4、5、またはそれ以上)の薬剤、例えば、本明細書に記載の外因性ポリペプチド、例えば、表1、表2、または表3のいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくは変異型、またはそれに対する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2、3、またはそれ以上)の外因性ポリペプチドは、サイトカイン、インターロイキン、サイトカイン受容体、Fc結合分子、T細胞活性化リガンド、T細胞受容体、免疫阻害分子、共刺激分子、MHC分子、APC結合分子、毒素、標的化剤、抗がん剤、がん細胞マーカー、がん細胞マーカー結合薬剤、またはTRAIL受容体リガンドを含んでなる。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2、3、またはそれ以上)の外因性ポリペプチドは、TRAIL受容体リガンド、例えば、本明細書の配列番号1~5のいずれかの配列、またはそれと少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列、またはTRAIL受容体に結合する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、第1の薬剤は、例えば、TRAIL-RIなどの第1のTRAIL受容体に結合し、第2の薬剤は、例えば、TRAIL-RIIなどの第2のTRAIL受容体に結合する。いくつかの実施形態では、近接する2つのTRAIL受容体リガンドは、どちらかのTRAIL受容体リガンドだけと比較して、標的細胞において相乗的な程度のアポトーシスを提供する。本明細書の実施例1は、がん細胞が、(例えば、除核赤血球の表面の)近接した2つのTRAIL受容体リガンドを含む組成物で処理された場合における、相乗的活性を実証する。
1つまたは複数の薬剤を含む遺伝子操作された赤血球
いくつかの態様では、本開示は、外因性薬剤を含む遺伝子操作された赤血球(例えば、網状赤血球)を提供する。より具体的には、いくつかの態様では、本開示は、外因性ポリペプチドを含む除核赤血球(例えば、網状赤血球)を提供する。赤血球は、任意選択的に、第2の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。
いくつかの態様では、本開示は、外因性薬剤を含む遺伝子操作された赤血球(例えば、網状赤血球)を提供する。より具体的には、いくつかの態様では、本開示は、外因性ポリペプチドを含む除核赤血球(例えば、網状赤血球)を提供する。赤血球は、任意選択的に、第2の異なる外因性ポリペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド(例えば、任意選択的に第2の外因性ポリペプチドをさらに含む、赤血球を構成する外因性ポリペプチド)は、本明細書に記載の外因性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、表1、表2、または表3のいずれか、またはその断片もしくは変異型、またはそれに対する抗体分子から選択される。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド(例えば、任意選択的に、第2の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、赤血球を構成する外因性ポリペプチド)は、例えば、がんの治療のために、例えば、CD80、CD86、41BBL、またはそれらの任意の組み合わせなどの刺激性リガンドを含んでなる。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、例えば、多発性骨髄腫などのがんの治療のために、CD269などのがん細胞抗原を含んでなる。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド(例えば、任意選択的に、第2の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、赤血球を構成する外因性ポリペプチド)は、免疫チェックポイント分子を阻害する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、(例えば、膜貫通部分および表面露出部分を含んでなる)遺伝子操作された赤血球の表面に位置し、免疫チェックポイント分子に結合する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、PD-1またはPD-L1である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および/またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFβである。
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド(例えば、任意選択的に第2の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、赤血球を構成する外因性ポリペプチド)は、免疫チェックポイント分子を阻害する。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、阻害抗体分子(例えば、単一特異性抗体、モノクローナル抗体、または一本鎖抗体などの抗体)である。抗体分子は、例えば、ヒト化または完全ヒトであってもよい。その他の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、例えば、Fc-受容体融合タンパク質などの融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質と相互作用する抗体分子などの薬剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイント受容体のリガンドと相互作用する抗体分子などの薬剤である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、CTLA-4(例えば、イピリムマブ/ヤーボイまたはトレメリムマブなどの抗CTLA4抗体)の阻害剤(例えば、阻害抗体または小分子阻害剤)である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、PD-1(例えば、ニボルマブ/Opdivo(登録商標);ペンブロリズマブ/Keytruda(登録商標);ピジリズマブ/CT-011)の阻害剤(例えば、阻害抗体または小分子阻害剤)である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、PD-L1(例えば、MPDL3280A/RG7446;MEDI4736;MSB0010718C;BMS936559)の阻害剤(例えば、阻害抗体または小分子阻害剤)である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、PDL2(例えば、AMP224などのPDL2/Ig融合タンパク質)の阻害剤(例えば、阻害抗体またはFc融合物または小分子阻害剤)である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、B7-H3(例えば、MGA271)、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせの阻害剤(例えば、阻害抗体または小分子阻害剤)である。
免疫チェックポイント分子の阻害剤は、少なくとも4つの主要なカテゴリーに分類され得る:i)T細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞上で直接、阻害経路を遮断する抗体分子などの薬剤(例えば、ニボルマブおよびペンブロリズマブのようなPD-1標的化抗体、TIM-3を標的化する抗体、およびLAG-3、2B4、CD160、A2aR、BTLA、CGEN-15049またはKIRを標的化する抗体)、ii)T細胞またはNK細胞上で直接、刺激経路を活性化する抗体などの薬剤(例えば、OX40、GITR、または4-1BBを標的化する抗体)、iii)免疫細胞上で抑制経路を遮断するか、または抗体依存性細胞毒性に頼って免疫細胞の抑制的集団を枯渇させる、抗体分子などの薬剤(例えば、イピリムマブなどのCTLA-4標的化抗体、VISTAを標的化する抗体、およびPD-L2、Gr1、またはLy6Gを標的化する抗体)、およびiv)がん細胞上で直接、抑制経路を遮断するか、または抗体依存性細胞毒性に頼ってがん細胞に対する細胞毒性を増強する、抗体分子などの薬剤(例えば、リツキシマブ、PD-L1を標的化する抗体、およびB7-H3、B7-H4、Gal-9、またはMUC1を標的化する抗体)。本明細書に記載されているこのような薬剤は、例えば、当該技術分野で公知の従来の方法によって設計および製造され得る(例えば、Templeton,Gene and Cell Therapy,2015;Green and Sambrook,Molecular Cloning,2012)。
本明細書に記載のポリペプチドのビヒクル
本明細書の多くのいくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2つ以上)の外因性ポリペプチドが、赤血球上またはその中に位置する一方で、本明細書に記載の任意の外因性ポリペプチドまたは外因性ポリペプチドの組み合わせは、別のビヒクル上またはその中にもまた位置し得る。ビヒクルは、例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソームを含み得る。例えば、いくつかの態様では、本開示は、例えば、その表面に本明細書に記載の1つまたは複数の薬剤を含む、ビヒクル(例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソーム)を提供する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の薬剤は、PD-1に結合するポリペプチド(例えば、PD-1に結合する抗体分子またはPD-L1などのPD-1の作動薬)、PD-L1に結合するポリペプチド(例えば、PD-L1に結合する抗体分子)、CD20に結合するポリペプチド(例えば、CD20に結合する抗体分子)、またはTRAIL受容体に結合するポリペプチド(例えば、TRAIL受容体の作動薬)を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の薬剤は、選択された薬剤、表1、表2、または表3のいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくは変異型、またはその作動薬または拮抗薬、またはそれに対する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、例えば、本明細書に記載の任意の薬剤対などの本明細書に記載の2つ以上の薬剤を含む。
本明細書の多くのいくつかの実施形態では、1つまたは複数(例えば、2つ以上)の外因性ポリペプチドが、赤血球上またはその中に位置する一方で、本明細書に記載の任意の外因性ポリペプチドまたは外因性ポリペプチドの組み合わせは、別のビヒクル上またはその中にもまた位置し得る。ビヒクルは、例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソームを含み得る。例えば、いくつかの態様では、本開示は、例えば、その表面に本明細書に記載の1つまたは複数の薬剤を含む、ビヒクル(例えば、細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソーム)を提供する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の薬剤は、PD-1に結合するポリペプチド(例えば、PD-1に結合する抗体分子またはPD-L1などのPD-1の作動薬)、PD-L1に結合するポリペプチド(例えば、PD-L1に結合する抗体分子)、CD20に結合するポリペプチド(例えば、CD20に結合する抗体分子)、またはTRAIL受容体に結合するポリペプチド(例えば、TRAIL受容体の作動薬)を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の薬剤は、選択された薬剤、表1、表2、または表3のいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくは変異型、またはその作動薬または拮抗薬、またはそれに対する抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、例えば、本明細書に記載の任意の薬剤対などの本明細書に記載の2つ以上の薬剤を含む。
いくつかの実施形態では、ビヒクルは赤血球系細胞を含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、有核赤血球、赤血球前駆体、または除核赤血球である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、臍帯血幹細胞、CD34+細胞、造血幹細胞(HSC)、脾臓コロニー形成(CFU-S)細胞、共通骨髄系前駆(CMP)細胞、未分化胚芽細胞コロニー成形細胞、赤芽球バースト形成細胞(BFU-E)、巨核球-赤血球前駆(MEP)細胞、赤血球コロニー形成単位(CFU-E)、網状赤血球、赤血球、誘導多能性幹細胞(iPSC)、間葉系幹細胞(MSC)、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、不死胞または不死化細胞である。
膜内カプセル化細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞またはその他のビヒクルは、例えば、半透膜などの膜内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、膜は、例えば、アニオン性アルギン酸多糖類などの多糖類を含む。いくつかの実施形態では、半透膜は、細胞を通過させないが、例えば、代謝産物、タンパク質またはDNAなどの小分子または巨大分子の通過を許す。いくつかの実施形態では、膜は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Lienert et al.,”Synthetic biology in mammalian cells:next generation research tools and therapeutics”Nature Reviews Molecular Cell Biology 15,95-107(2014)に記載されるものである。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、膜は、細胞を免疫系から保護しおよび/または複数の細胞を近接して保持し、互いの相互作用または互いの産物の相互作用を促進する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞またはその他のビヒクルは、例えば、半透膜などの膜内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、膜は、例えば、アニオン性アルギン酸多糖類などの多糖類を含む。いくつかの実施形態では、半透膜は、細胞を通過させないが、例えば、代謝産物、タンパク質またはDNAなどの小分子または巨大分子の通過を許す。いくつかの実施形態では、膜は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Lienert et al.,”Synthetic biology in mammalian cells:next generation research tools and therapeutics”Nature Reviews Molecular Cell Biology 15,95-107(2014)に記載されるものである。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、膜は、細胞を免疫系から保護しおよび/または複数の細胞を近接して保持し、互いの相互作用または互いの産物の相互作用を促進する。
例えば、除核赤血球などの本明細書中の組成物による治療法
外因性薬剤(例えば、ポリペプチド)を含む(例えば、発現する)除核赤血球(例えば、網状赤血球)の投与方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第2015/073587号パンフレットおよび国際公開第2015/153102号パンフレットに記載される。
外因性薬剤(例えば、ポリペプチド)を含む(例えば、発現する)除核赤血球(例えば、網状赤血球)の投与方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第2015/073587号パンフレットおよび国際公開第2015/153102号パンフレットに記載される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球は、例えば、ヒトなどの哺乳動物などの対象に投与される。治療され得る例示的哺乳類としては、限定されるものではないが、ヒト、飼育動物(例えば、イヌ、ネコなど)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど)、および実験動物(例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど)が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ヒト治療および獣医学用途の双方に応用可能である。
いくつかの実施形態では、RBCは、1、2、3、4、5または6ヶ月毎に患者に投与される。
いくつかの実施形態では、RBCの1用量は、約1×109~2×109、2×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~2×1010、2×1010~5×1010、5×1010~1×1011、1×1011~2×1011、2×1011~5×1011、5×1011~1×1012、1×1012~2×1012、2×1012~5×1012、または5×1012~1×1013個の細胞を含む。
いくつかの実施形態では、RBCは、患者の血流中において投与されたRBCの機能が、2週間~1年間にわたって、例えば、1ヶ月間~1年間以上にわたって、例えば、少なくとも2週間、4週間、6週間、8週間、3ヶ月間、6ヶ月間、1年間、2年間にわたって、維持されるのに十分な投薬レジメン(投与の用量および周期性)で、患者に投与される。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の除核赤血球(例えば、網状赤血球)などの本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書に記載の疾患または病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または病状はがんである。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療するための、例えば、本明細書に記載の赤血球などの赤血球系細胞の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療する薬剤を製造するための、例えば、本明細書に記載の赤血球などの赤血球系細胞の使用を提供する。
がん型としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん(cancer of unknown primary)、骨転移がん、脳転移がん、肝臓転移がん、肺転移がん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん(gastric cancer)、妊娠性絨毛腫瘍(GTT)、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、NSCLC、リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻および洞がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫(NHL)、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん(非黒色腫)、軟部組織肉腫、胃がん(stomach cancer)、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん(unknown primary cancer)、子宮がん、膣がん、および外陰部がんが挙げられる。
実施例1.表面で2つの異なるTRAIL受容体リガンドを発現するeRBCの薬剤相乗的活性
TRAIL受容体作動薬DR4.2(配列番号2)およびDR5.2(配列番号5)の遺伝子を合成した。遺伝子を、ヒトグリコフォリンAの遺伝子の上流のレンチウイルスベクター(SBI)にクローニングし、12アミノ酸Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(配列番号19))可撓性リンカーとHAエピトープタグ(YPYDVPDY(配列番号20))とをコードする配列によって隔てた。
TRAIL受容体作動薬DR4.2(配列番号2)およびDR5.2(配列番号5)の遺伝子を合成した。遺伝子を、ヒトグリコフォリンAの遺伝子の上流のレンチウイルスベクター(SBI)にクローニングし、12アミノ酸Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(配列番号19))可撓性リンカーとHAエピトープタグ(YPYDVPDY(配列番号20))とをコードする配列によって隔てた。
正常なヒトドナー由来の動員末梢血細胞に由来するヒトCD34+細胞をAllCells Inc.から凍結状態で購入した。細胞を、1%FBSを含むPBS中で解凍した。次に、StemSpan CC100サイトカインミックス添加StemSpan SFEM培地中で、1E5細胞/mLの密度で細胞を培養した。培地は、5日目に分化培地に交換した。
ウイルス生成プロトコルは以下のように行った。簡潔に述べると、HEK293T細胞を形質移入の24時間前に播種した。パッケージングプラスミドと共にコンストラクトを含有するレンチウイルスベクターで、細胞を形質移入した。形質移入の24時間後に培地交換を行い、形質移入の72時間後にウイルスを採取した。解凍後6日目に、1:1の細胞容積対ウイルス容積比の各ウイルスの等容積で細胞を形質導入し、5~10μg/mlのポリブレンと共に、1.5時間にわたり845×gでスピノキュレーションした。
形質導入細胞は、Hu et al,Blood 18 April 2013 Vol 121の方法に従って、合成培地中で、赤血球系細胞および成熟した除核網状赤血球に分化させた。手短に述べると、細胞培養手順は3つの段階から構成された。基礎培地の組成は、イスコフ改変ダルベッコ培地、2%ヒト末梢血漿、3%ヒトAB血清、200mg/mLホロフマントランスフェリン、3IU/mLヘパリン、および10mg/mLインスリンであった。第1相(0日目~6日目)では、10^5/mLの濃度のCD341細胞を、10ng/mL幹細胞因子、1ng/mLのIL-3、および3IU/mLエリスロポエチンの存在下で培養した。第2相(7日目~11日目)では、培地からIL-3を省いた。21日目まで持続した第3相では、細胞濃度を11日目に10^6/mLに調節し、15日目に5×10^6/mLに調節した。この相の培地は、基礎培地+3IU/mLエリスロポエチンであり、トランスフェリンの濃度は1mg/mLに調節した。
導入遺伝子の発現は、相補的蛍光色素フルオレセインおよびDyLight 650と化学的にコンジュゲートされた可溶性TRAIL R1およびTRAIL R2(Sigma-Aldrich Inc.から購入)で標識し、フローサイトメトリーで染色することによってモニターした。DR4.2およびDR5.2の双方のリガンドの発現レベルを、フローサイトメトリーを通じて確認した。
腫瘍細胞株アポトーシスアッセイは、Marconi et al、Cell Death and Disease 2013の修正バージョンに従って実施した。要約すると、DR4.2およびDR5.2を発現する完全に成熟した除核網状赤血球を、CFSE標識ラジ細胞と1:1の比率で24時間インキュベートした。その後、細胞をアネキシンVで染色し、フローサイトメトリーで分析した。アポトーシス百分率は、アネキシンVに対しても陽性に染色されたCFSE陽性ラジ細胞から判定した。
図1に示されるように、CFSE標識ラジ細胞を、非形質導入、DR4.2形質導入培養網状赤血球、DR5.2形質導入培養網状赤血球、またはDR4.2形質導入培養網状赤血球とDR5.2形質導入養網状赤血球との混合物と共にインキュベートした場合、バックグラウンドに対して最小の細胞死が観察された。しかし、CFSE標識ラジ細胞を、DR4.2およびDR5.2の双方で同時に形質導入され、したがって双方のタンパク質を同時に発現する培養網状赤血球と共にインキュベートした場合、有意な量の細胞死が観察された(ラジ細胞を用いたこのアッセイで達成可能なTRAIL誘発アポトーシスの最大量に相当する-例えば、Marconi et al.,Cell Death and Disease 2013を参照されたい)。このデータは、単一のTRAIL受容体作動薬を発現する細胞と比較して、そしてそれぞれが異なるTRAIL受容体作動薬を発現する細胞の混合物と比較してさえも、単一の遺伝子操作された赤血球の表面のTRAIL受容体作動薬の協調作用が、相乗的な様式で細胞殺滅を誘導できることを示唆する。
細胞集団は、AS-3添加剤溶液中で製剤化し、バーキットリンパ腫に罹患している患者に静脈内投与してもよい。患者は、リンパ節の大きさの縮小、肝脾腫の改善、および/または悪心および嘔吐の軽減によって判定されるように、症状の改善を示すことが期待される。
実施例2.敗血症の治療で使用するための5つのサイトカインを含む捕捉eRBCの生成
抗TNFa(配列番号7)、抗IL6(配列番号6)、CD14(Uniprot番号P08571)、IFNGR1(Uniprot番号15260)、およびIL12R1(Uniprot番号P42701)の遺伝子は、市販業者によって合成される。遺伝子をヒトグリコフォリンAの遺伝子の上流のレンチウイルスベクター(SBI)にクローニングして、12アミノ酸Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(配列番号19))可撓性リンカーとHAエピトープタグ(YPYDVPDY(配列番号20))とをコードする配列によって隔てる。
抗TNFa(配列番号7)、抗IL6(配列番号6)、CD14(Uniprot番号P08571)、IFNGR1(Uniprot番号15260)、およびIL12R1(Uniprot番号P42701)の遺伝子は、市販業者によって合成される。遺伝子をヒトグリコフォリンAの遺伝子の上流のレンチウイルスベクター(SBI)にクローニングして、12アミノ酸Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(配列番号19))可撓性リンカーとHAエピトープタグ(YPYDVPDY(配列番号20))とをコードする配列によって隔てる。
実施例1に記載されるように、ヒトCD34+細胞を培養し得て、ウイルスを生成し得る。形質導入された細胞は、本明細書に記載のように分化させる。
導入遺伝子の発現を評価するために、細胞を、リガンドTNFa、IL-6、IFNg、およびIL-12(Life Technologiesから購入された)、ならびに相補的蛍光色素に化学的にコンジュゲートされたリポ多糖(ThermoFisher)で同時に標識する。細胞をフローサイトメトリーにより分析して、(a)薬剤が全て細胞の表面で発現され、(b)薬剤がそれらの標的リガンドに結合できることを確認する。
細胞集団をAS-3添加剤溶液中で製剤化し、敗血症を発症している患者に静脈内投与する。患者は、循環サイトカインレベルの減少、血管漏出症候群の軽減または予防、および生存率の改善によって判定されるように、患者は症状の改善を示すことが期待される。
実施例3.がんワクチンとして使用するための腫瘍抗原のコンビナトリアルライブラリーを含んでなるeRBC
ヒトCD34+細胞は、実施例1に記載のように培養し得る。細胞は、本明細書に記載されるような赤血球系細胞に分化する。
ヒトCD34+細胞は、実施例1に記載のように培養し得る。細胞は、本明細書に記載されるような赤血球系細胞に分化する。
黒色腫がん細胞のサンプルは、生検によって患者から単離する。細胞を溶解し、シリカカラム精製(ThermoFisher)を用いて全RNAを抽出し、吸光度分光法によってRNA含有量を定量し、-80Cで保存する。
赤血球培養物の最終分化の4日前に、細胞を回収し、無血清IMDMで2回洗浄し、Opti-MEM中に10-40×10^6細胞/mLの最終濃度で再懸濁する。引き続いて、0.5mLの細胞懸濁液を20μgのmRNAと混合し、Easyject Plus装置(EquiBio,Kent,United Kingdom)を用いて300Vおよび150uFの条件で、0.4cmキュベット内で電気穿孔する。電気穿孔後、新鮮な赤血球成熟培地を細胞懸濁液に添加し、5%CO2を補給した加湿雰囲気中において37℃で、細胞をさらにインキュベートする。
完全に成熟した網状赤血球は、細胞溶解物の質量分析によってタンパク質発現について特性決定する。RNAの代わりにPBSを投与された、非電気穿孔細胞および電気穿孔細胞を対照として使用して、外因性がん由来タンパク質に由来する内因性網状赤血球タンパク質を同定する。
細胞集団をAS-3添加剤溶液中で製剤化し、黒色腫に罹患している患者に静脈内投与する。患者は、次に、CTスキャンによる転移塊の減少、および黒色腫皮膚病変の消散によって測定判定される、黒色腫抗原に対する免疫応答を示すことが期待される。
実施例4:非ホジキンリンパ腫(NHL)に対する抗腫瘍療法としての赤血球の遺伝子操作
PD-1およびPD-L1(RCT-抗PD-1およびRCT-抗PD-L1)に対する抗体をその表面に発現する赤血球を作製し、これらの細胞が、それぞれの標的に結合して強固な免疫応答を活性化し得るかどうかを評価した。フローサイトメトリーを用いて、それぞれRCT-抗PD-1およびRCT-抗PD-L1の組換えPD-1およびPD-L1への結合が判定され、非常に特異的であることが示された。N末端からC末端方向に、イピリムマブベースの抗CTLA4 scFv抗体ドメイン、エピトープ標識、および完全長GPA(細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを含んでなる、融合タンパク質をそれらの表面に発現する赤血球もまた生成した。抗CTLA4ポリペプチドの強力な発現がフローサイトメトリーアッセイで観察され、95.2%を超える細胞が、抗CTLA4をコードするベクターでの形質移入後に抗CTLA4を発現した。
PD-1およびPD-L1(RCT-抗PD-1およびRCT-抗PD-L1)に対する抗体をその表面に発現する赤血球を作製し、これらの細胞が、それぞれの標的に結合して強固な免疫応答を活性化し得るかどうかを評価した。フローサイトメトリーを用いて、それぞれRCT-抗PD-1およびRCT-抗PD-L1の組換えPD-1およびPD-L1への結合が判定され、非常に特異的であることが示された。N末端からC末端方向に、イピリムマブベースの抗CTLA4 scFv抗体ドメイン、エピトープ標識、および完全長GPA(細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを含んでなる、融合タンパク質をそれらの表面に発現する赤血球もまた生成した。抗CTLA4ポリペプチドの強力な発現がフローサイトメトリーアッセイで観察され、95.2%を超える細胞が、抗CTLA4をコードするベクターでの形質移入後に抗CTLA4を発現した。
生体外ジャーカット細胞IL-2分泌アッセイを用いて、機能活性を試験した。このアッセイでは、ジャーカット細胞を、CD3/CD28四量体による刺激によって誘導されるPD-L1を発現するNHL細胞(Z138)と共にインキュベートすることで、IL-2分泌を阻害する。IL-2分泌は、ジャーカット細胞およびZ138細胞をRCT-抗PD-1またはRCT-抗PD-L1と共に培養することでレスキューされたが、対照RCTではレスキューされなかった。RCT-抗CTLA4もまた、T細胞IL-2分泌のレスキューおよび回復を示した。
これらの遺伝子操作された赤血球が、標準的な抗原免疫復活アッセイにおいて、活性化を誘発する能力をアッセイした。抗原免疫復活アッセイにおいて、末梢血単核細胞(PBMC)のインターフェロンγ分泌の強固な4~6倍の増加が実証された。ドナーPBMCを一般的な流感ウイルス抗原で刺激した。免疫チェックポイント阻害に感受性である記憶T細胞を、対照PBMCまたは対照RCTと比較して、RCT-抗PD-1またはRCT-抗PD-L1と共培養することで、活性化およびγインターフェロン分泌について試験した。
これらの実験は、赤血球が特定の細胞-細胞相互作用に関与でき、免疫チェックポイントに関与し得することを示す。
さらに、それらの表面に、抗CD20一本鎖可変断片を発現する赤血球(RCT-抗CD20)を作製した。生体外でCD20+リンパ腫細胞を結合する、それらの能力を評価した。この実験は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡法を用いて、RCT-抗CD20の標的細胞への効率的かつ特異的結合を実証した。RCT-抗CD20細胞を、DoHH2(濾胞性リンパ腫)、Ramos(バーキットリンパ腫)、Granta-519(マントル細胞リンパ腫)、およびSU-DHL-4(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫)のリンパ腫亜型に相当するCD20+ヒトリンパ腫細胞株のパネルと共培養することによって、この相互作用がアポトーシスを誘導し得るかどうかもまた評価した。全ての場合において、RCT-抗CD20共培養は、RCTまたは可溶性リツキシマブモノクローナル抗体単独と比較して、アポトーシスの増加をもたらした。生体外における直接腫瘍細胞殺滅は、リンパ腫細胞上のCD20の過架橋のためにモノクローナル抗体単独よりも有効であると仮定される。この効果は、受容体クラスター形成の原位置実証と、アポトーシス経路の刺激の双方によって示された。これらの知見は、したがって、RCT上に発現されるタンパク質の新しい生物学を実証し、リンパ腫腫瘍生体内に対する影響の試験の根拠となった。
実施例5:標的タンパク質の捕捉および修飾
本実施例では、遺伝子組換え除核赤血球系細胞を用いて標的タンパク質を捕捉および修飾した。対照細胞および実験細胞はそれぞれ、それらの膜に内因性グリコフォリンA(GPA)を含み、これを使用して標的タンパク質に結合させた。実験細胞は、膜アンカーとして、GPAに融合した表面露出IdeSを含む外因性タンパク質を発現した。IdeSは抗体を切断して、F(ab’)2断片およびFc断片を生成できる。標的タンパク質は、FITCで蛍光標識された抗GPA抗体である。標的抗体の定常領域および可変領域はどちらもFITC標識されているので、抗体が切断された場合、双方の断片を検出し得た。
本実施例では、遺伝子組換え除核赤血球系細胞を用いて標的タンパク質を捕捉および修飾した。対照細胞および実験細胞はそれぞれ、それらの膜に内因性グリコフォリンA(GPA)を含み、これを使用して標的タンパク質に結合させた。実験細胞は、膜アンカーとして、GPAに融合した表面露出IdeSを含む外因性タンパク質を発現した。IdeSは抗体を切断して、F(ab’)2断片およびFc断片を生成できる。標的タンパク質は、FITCで蛍光標識された抗GPA抗体である。標的抗体の定常領域および可変領域はどちらもFITC標識されているので、抗体が切断された場合、双方の断片を検出し得た。
最初に、対照細胞およびIdeS発現細胞を、抗GPA抗体に結合する能力についてFACSによって試験した。対照およびIdeS発現細胞はどちらも、FITCと細胞との会合によって測定されるように、抗体に結合した(データ未掲載)。さらに、対照およびIdeS発現細胞はどちらも、蛍光標識抗ウサギFc抗体を用いた第2の検出法によって、またはそれを用いて測定されるように、抗体に結合した(データ未掲載)。これらの測定は、細胞をインキュベートして標的抗体のIdeS媒介切断ができるようにする前の初期の時点で行った。
対照的に、IdeS発現細胞のみが標的抗体を切断できた。これは、対照またはIdeS発現細胞を標的抗体と共にインキュベートして、抗体切断ができるようにすることによって示された。赤血球系細胞の表面の非損傷抗体を検出するために、蛍光標識抗ウサギFc抗体を反物に添加した。IdeS発現細胞は、細胞との抗ウサギFcの会合の減少を示し(図2)、これは、対照細胞と比較して、IdeS発現細胞の表面の低レベルのFcを示唆した。対照細胞またはIdeS発現細胞に会合する直接FITC標識標的抗体の量の減少はなく、これは標的抗体の少なくともFITC標識可変領域が、依然としてIdeS発現細胞および対照細胞に結合していることを示唆した。この結果は、ウェスタンブロットによって確認され、抗ウサギ重鎖および抗ウサギ軽鎖抗体を用いて、対照またはIdeS発現細胞の上清中の非損傷抗体および切断抗体を検出した。実験は、対照赤血球系細胞でなくIdeS発現赤血球系細胞が抗GPA抗体を切断し、重鎖断片の出現をもたらすことを示した(図3)。
したがって、対照細胞は標的抗体に結合できたが、IdeS発現細胞のみが標的抗体に結合して切断できた。
実施例6:RCT-抗PD-L1はT細胞増殖を促進する
この実施例は、PBMC単独と比較した場合、RCT-抗PD-L1とのインキュベーション後におけるT細胞の総数の4.4倍の増加に基づいて、RCT-抗PD-L1とPBMCとの共培養が、T細胞増殖の増強をもたらしたことを実証する。
この実施例は、PBMC単独と比較した場合、RCT-抗PD-L1とのインキュベーション後におけるT細胞の総数の4.4倍の増加に基づいて、RCT-抗PD-L1とPBMCとの共培養が、T細胞増殖の増強をもたらしたことを実証する。
実施例7:共刺激タンパク質を発現するRCT
別の角度からT細胞活性化にアプローチして、RCTが、抗原提示細胞上で発現されてT細胞上の41-BB受容体(RCT-41-BB-L)に結合する共刺激タンパク質である、41-BB-Lを発現するように設計した。RCT-41-BB-Lの組換え41-BBへの結合を、フローサイトメトリーを用いて判定した。PBMCとRCT-41-BB-Lとの共培養は、PBMC単独と比較してT細胞増殖の1.7倍の増加を示した。最終的に、RCT-41-BB-Lを、41-BBおよびNFkB-Luc2Pを過剰発現するジャーカット細胞と共にインキュベートすると、NFkB媒介性ルシフェラーゼ発現の活性化は対照と比較して30倍増加した。
別の角度からT細胞活性化にアプローチして、RCTが、抗原提示細胞上で発現されてT細胞上の41-BB受容体(RCT-41-BB-L)に結合する共刺激タンパク質である、41-BB-Lを発現するように設計した。RCT-41-BB-Lの組換え41-BBへの結合を、フローサイトメトリーを用いて判定した。PBMCとRCT-41-BB-Lとの共培養は、PBMC単独と比較してT細胞増殖の1.7倍の増加を示した。最終的に、RCT-41-BB-Lを、41-BBおよびNFkB-Luc2Pを過剰発現するジャーカット細胞と共にインキュベートすると、NFkB媒介性ルシフェラーゼ発現の活性化は対照と比較して30倍増加した。
実施例8:抗CD20およびTRAILリガンドを同現現する赤血球治療薬
抗CD20ならびにTrailリガンド(アポトーシス誘導剤)を同時現するように、赤血球系細胞を遺伝子操作した場合、Ramos細胞のRCT-抗CD20、RCT-Trail、およびRCT-抗CD20+Trail(同時発現)との共培養は、48時間後にそれぞれ32%、47%および76%のアポトーシスを与え、同時発現RCTの相乗的な細胞死滅効果が示唆された。
抗CD20ならびにTrailリガンド(アポトーシス誘導剤)を同時現するように、赤血球系細胞を遺伝子操作した場合、Ramos細胞のRCT-抗CD20、RCT-Trail、およびRCT-抗CD20+Trail(同時発現)との共培養は、48時間後にそれぞれ32%、47%および76%のアポトーシスを与え、同時発現RCTの相乗的な細胞死滅効果が示唆された。
TRAILリガンドおよび抗CD20部分を含んでなる細胞集団は、AS-3添加剤溶液中で製剤化して、例えば、がんに罹患している患者などの患者に静脈内投与してもよい。
Claims (1)
- 図面に記載の発明。
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