KR20190091497A - 고형 종양으로의 침투를 위한 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents

고형 종양으로의 침투를 위한 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법 Download PDF

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아바크 카베지안
로버트 제이. 딘스
조디 마타-핑크
시반 엘로울
네이슨 다우든
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루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명의 개시는, 예를 들어, 고형 종양과 같은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 구현예들에서, 조성물은 고형 종양 내로의 적혈구 세포의 침투를 촉진하는 폴리펩티드와 같은 외인성 폴리펩티드를 발현하는 적혈구 세포를 포함한다.

Description

고형 종양으로의 침투를 위한 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 12월 2일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/429,275에 대한 우선권을 주장하며, 상기 특허의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
적혈구는, 예를 들어, 독성 대사물을 분해하거나, 생체이물질(xenobiotics)을 비활성화시키기 위한 약물 전달 시스템으로서, 그리고 기타 생체의학 분야에 사용하기 위해 고려되어 왔다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 2017년 12월 1일에 생성된 상기 ASCII 카피는 R2081-7018WO_SL.txt로 명명되며, 220,057 바이트 크기이다.
본 발명은, 예를 들어, 암세포를 사멸시키고/사멸시키거나 암에 대한 면역 반응을 자극함으로써 암을 치료하는 세포 시스템을 포함한다. 고형 종양의 치료에서의 하나의 과제는 치료제, 특히 세포 치료제와 같은 큰 제제가 때때로 종양 덩어리에 침투하지 못한다는 것이다. 본 발명의 개시는, 특히, 결합제를 포함하는 적혈구 세포가 혈관구조에 전달되고, 이어서 혈관구조로부터 나와 고형 종양에 축적될 수 있음을 보여준다. 본 발명의 개시는 항암제 (예를 들어, 항체)를 포함하는 적혈구 세포가 항체 단독에 내성인 암을 치료할 수 있음을 또한 보여준다. 따라서, 본 발명의 개시는, 예를 들어, 고형 종양으로의 침투를 위한 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 세포 시스템은 표적화 기능, 암세포 사멸 기능, 면역 체크포인트 억제, 및/또는 보조 자극을 갖는 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 발현하는 적혈구 세포를 포함한다.
본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 항암제(예를 들어, 본원에 기재된 항암제)를 각각 포함하는 복수의 적혈구 세포(예를 들어, 본원에 기재된 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암(예를 들어, 본원에 기재된 암)에 걸린 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 항암제는 종양 모이어티(예를 들어, 세포 표면 종양 모이어티에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체)에 결합하는 제제 및/또는 항종양 효과를 갖는 제제, 예를 들어, 면역자극성 사이토카인, 종양 기아(starvation) 효소(예를 들어, 아스파라기나제, 메티오닌 감마 리아제, 또는 세린 데하이드로게나제), 세포독성 소분자, 방사성 핵종, 화학치료제, 독소, 소분자, 단백질 치료제, 암 백신, 체크포인트 조절제, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent), 보체 의존성 세포독성(CDC) 자극제, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 구현예들에서, 면역자극성 사이토카인은 타입 1 사이토카인 또는 타입 2 사이토카인, 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 하나의 제제는 종양 결합 활성과 항종양 효과 둘 모두를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 적혈구 세포 각각은 종양 결합제 및 항종양 효과를 갖는 다른 제제를 가지고, 제제들은 별개이거나 연결될 수 있으며, 예를 들어, 별개의 제제(예를 들어, 별개의 폴리펩티드)로 발현되거나 연결된 서열(예를 들어, 융합체)로서 발현될 수 있다.
본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 내성, 예를 들어, 난치성 또는 재발된 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 암을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 내성, 예를 들어, 난치성 또는 재발된 암의 세포에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 내성 암의 세포에 제제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 치료 미경험(treatment na
Figure pct00001
ve) 내성 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 암을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 치료 미경험 내성 암의 세포에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 치료 미경험 내성 암의 세포에 제제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 발암 돌연변이, 예를 들어, 세포 주기 유전자가 항시성 프로모터의 제어를 받게 하는 전위를 포함하는 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 암을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 발암 돌연변이, 예를 들어, 세포 주기 유전자가 항시성 프로모터의 제어를 받게 하는 전위를 포함하는 대상체 내의 암의 세포에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 암의 세포에 제제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, B 세포 암에 걸린 대상체를 치료하거나, 표 1로부터 선택된 항체, 예를 들어, 항-CD20 항체에 대한 내성을 발달시킨 대상체 내의 암성 B 세포에 제제를 전달하는 방법으로서, 세포, 예를 들어, 막횡단 도메인 및 종양 항원에 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 결합 도메인은 항-CD20 항체 도메인임)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)의 제조물을 대상체에게 투여함으로써 대상체를 치료하거나 암성 B 세포에 제제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서,
a) 조작된 적혈구 세포의 외부 표면 상의 융합 단백질의 수는 104개 초과, 예를 들어, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104개 초과, 또는 105개 초과, 예를 들어, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 또는 1 x 107개 초과(선택적으로 최대 1 x 107 또는 1 x 108개), 또는 약 1 x 104 내지 3 x 104개, 1 x 104 내지 5 x 104개, 1 x 104 내지 7 x 104개, 1 x 104 내지 9 x 104개이거나,
b) 조작된 적혈구 세포의 외부 표면 상의 융합 단백질의 수 또는 종양 항원에 대한 결합 도메인의 친화도는 다음을 유도하기에 충분하다:
i) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20 분자의 클러스터링,
ii) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20의 과클러스터링(hyper-clustering),
iii) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20의 가교결합,
iv) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20의 과가교결합(hyper cross-linking),
v) B 세포와 같은 표적 암세포의 아폽토시스, 예를 들어, 카스파제-비의존성 아폽토시스 및/또는 카스파제-의존성 아폽토시스,
ⅵ) B 세포와 같은 표적 암세포에서의, Src 패밀리 티로신 키나아제의 활성화, Fas 분자의 클러스터링, BCL2의 억제 또는 하향 조절, 및/또는 BCLx1의 억제 또는 하향 조절, 또는 이들의 조합.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 세포, 예를 들어, 막횡단 도메인 및 종양 항원에 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 결합 도메인은 항-CD20 항체 도메인 또는 항-PD-L1 항체 도메인임)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 제공하고, 여기서,
a) 적혈구 세포의 외부 표면 상의 융합 단백질의 수는 104개 초과, 예를 들어, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104개 초과, 또는 105개 초과, 예를 들어, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 또는 1 x 107개 초과(선택적으로 최대 1 x 107 또는 1 x 108개), 또는 약 1 x 104 내지 3 x 104개, 1 x 104 내지 5 x 104개, 1 x 104 내지 7 x 104개, 1 x 104 내지 9 x 104개이거나,
b) 적혈구 세포의 외부 표면 상의 융합 단백질의 수 또는 종양 항원에 대한 결합 도메인의 친화도는 다음을 유도하기에 충분하다:
i) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20 분자의 클러스터링,
ii) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20의 과클러스터링,
iii) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20의 가교결합,
iv) 종양 항원, 예를 들어, 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 표 1의 항원, 예를 들어, B 세포와 같은 표적 암세포의 표면 상의 CD20의 과가교결합,
v) B 세포와 같은 표적 암세포의 아폽토시스, 예를 들어, 카스파제-비의존성 아폽토시스 및/또는 카스파제-의존성 아폽토시스,
ⅵ) B 세포와 같은 표적 암세포에서의, Src 패밀리 티로신 키나아제의 활성화, Fas 분자의 클러스터링, BCL2의 억제 또는 하향 조절, 및/또는 BCLx1의 억제 또는 하향 조절, 또는 이들의 조합.
또한, 본 발명의 개시는, 특정 양태에서, 대상체 내의 혈관이 분포된 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을, 혈관이 분포된 고형 종양을 치료하기에 충분한 양으로, 대상체의 혈류에 투여함으로써 혈관이 분포된 고형 종양을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 혈관이 분포된 고형 종양의 종양 세포에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을, 혈관이 분포된 고형 종양의 종양 세포에 결합제를 전달하기에 충분한 양으로, 대상체의 혈류에 투여함으로써 혈관이 분포된 고형 종양의 종양 세포에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 항암제, 예를 들어, 항암 항체를 대상체 내의 고형 종양에 농축시키거나 대상체 내의 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가 항암제를 포함하는 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 고형 종양을 치료하기에 충분한 양으로 대상체의 혈류에 투여함으로써 항암제를 농축시키거나 고형 종양을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서, 선택적으로 항암제는 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 항암제, 예를 들어, 항암 항체를 대상체 내의 고형 종양에 농축시키거나 대상체 내의 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가 항암제를 포함하는 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포를 포함하는 제조물을 고형 종양을 치료하기에 충분한 양으로 대상체의 혈류에 투여함으로써 항암제를 농축시키거나 고형 종양을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서, 항암제는 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함한다.
추가로, 본 발명의 개시는, 특정 양태에서, 대상체 내의 혈관외 부위에 적혈구 세포를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 혈관외 부위에 존재하는 항원, 예를 들어, 종양 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 유효량의 제조물을 대상체의 혈류에 투여함으로써 혈관외 부위에 적혈구 세포를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명의 개시는, 특정 양태에서, 대상체 내의 혈관외 부위에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 혈관외 부위에 존재하는 항원, 예를 들어, 종양 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 유효량의 제조물을 대상체의 혈류에 투여함으로써 혈관외 부위에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 혈관이 분포되지 않은, 예를 들어, 혈관이 분포되기 전의 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을, 혈관이 분포되지 않은 고형 종양을 치료하기에 충분한 양으로, 대상체의 혈류에 투여함으로써 혈관이 분포되기 전의 고형 종양을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 혈관이 분포되지 않은, 예를 들어, 혈관이 분포되기 전의 고형 종양의 종양 세포에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을, 혈관이 분포되지 않은 고형 종양의 종양 세포에 결합제를 전달하기에 충분한 양으로, 대상체의 혈류에 투여함으로써 혈관이 분포되지 않은 고형 종양의 종양 세포에 제제를 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
여기서, 적혈구 세포의 표면 상의 결합제의 밀도는, 결합제와 종양 세포 항원의 결합시에, 종양 항원이 지질 래프트(lipid raft)에 축적되거나, 항종양 세포 항원의 분포가 종양 세포 내에서의 신호전달을 변경시키도록 충분히 교란되거나, 암세포의 표면 상의 종양 항원의 밀도가 유의하게 변경되거나, 항-아폽토시스 경로(예를 들어, BCL2 및/또는 BCLx1 경로)가 억제되거나, 암세포의 아폽토시스 경로가 유도되거나, 암세포의 괴사 경로가 유도되거나, 암세포의 막 특성이 유의하게 변경되거나, 이들의 조합을 일으키기에 충분하다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 제공하고, 여기서, 적혈구 세포의 표면 상의 결합제의 밀도는, 결합제와 종양 세포 항원의 결합시에, 종양 항원이 지질 래프트에 축적되거나, 항종양 세포 항원의 분포가 종양 세포 내에서의 신호전달을 변경시키도록 충분히 교란되거나, 암세포의 표면 상의 종양 항원의 밀도가 유의하게 변경되거나, 항-아폽토시스 경로(예를 들어, BCL2 및/또는 BCLx1 경로)가 억제되거나, 암세포의 아폽토시스 경로가 유도되거나, 암세포의 괴사 경로가 유도되거나, 암세포의 막 특성이 유의하게 변경되거나, 이들의 조합을 일으키기에 충분하다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 종양, 예를 들어, 혈관이 분포된 종양을 치료하는 방법으로서, 종양 침윤 림프구 상에서 발현되는 면역 체크포인트 분자와 같은 면역 체크포인트 분자(예를 들어, PD1)와 기능적으로 결합하는 면역 체크포인트-리간드(예를 들어, PD-L1)의 능력을 방해하는 모이어티를, 예를 들어, 표면 상에 포함하는 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 종양을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
여기서, 모이어티가 융합 단백질로서 발현되는 경우,
i) 적혈구 세포의 표면 상의 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 서열을 가지거나,
ii) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 막횡단 영역을 가지거나,
iii) 융합 단백질은 전장 내인성 막 단백질을 포함하지 않으며, 예를 들어, 전장 내인성 막 단백질의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500개의 아미노산이 결여된, 전장 내인성 막 단백질의 세그먼트를 포함하거나,
iv) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 50개 초과의 아미노산이 서로 다르지 않거나,
v) 모이어티는 LPXTG와 같은 소르타제 전달 기호(sortase transfer signature)(즉, 소르타제 반응에 의해 생성될 수 있는 서열)이 결여되거나,
vi) 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 미만의 서열이 구별되는 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
vii) 모이어티는 단일 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
viii) 융합 단백질은 내인성 막횡단 단백질과 모이어티의 접합부에 Gly-Gly를 함유하지 않거나;
ix) 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 이내의 아미노산인 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나; 이들의 조합이다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 종양 침윤 림프구 상에서 발현되는 면역 체크포인트 분자와 같은 면역 체크포인트 분자(예를 들어, PD1)와 기능적으로 결합하는 면역 체크포인트-리간드(예를 들어, PD-L1)의 능력을 방해하는 모이어티를, 예를 들어, 표면 상에 포함하는 적혈구 세포를 제공하고,
여기서, 모이어티가 융합 단백질로서 발현되는 경우,
i) 적혈구 세포의 표면 상의 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 서열을 가지거나,
ii) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 막횡단 영역을 가지거나,
iii) 융합 단백질은 전장 내인성 막 단백질을 포함하지 않으며, 예를 들어, 전장 내인성 막 단백질의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500개의 아미노산이 결여된, 전장 내인성 막 단백질의 세그먼트를 포함하거나,
iv) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 50개 초과의 아미노산이 서로 다르지 않거나,
v) 모이어티는 소르타제 전달 기호가 결여되거나,
vi) 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 미만의 서열이 구별되는 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
vii) 모이어티는 단일 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
viii) 융합 단백질은 내인성 막횡단 단백질과 모이어티의 접합부에 Gly-Gly를 함유하지 않거나;
ix) 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 이내의 아미노산인 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나; 이들의 조합이다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체 내의 종양, 예를 들어, 혈관이 분포된 종양을 치료하는 방법으로서, 자극 분자, 예를 들어, 4-1BBL 또는 이의 단편과 같은 보조 자극 분자를, 예를 들어, 표면 상에 포함하는 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 종양을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서,
자극 분자, 예를 들어, 보조 자극 분자의 수준 또는 면역 세포(예를 들어, T 세포) 상의 결합 파트너에 대한 보조 자극 분자와 같은 자극 분자의 친화도는, 면역 세포 증식을 유도하거나, 사이토카인(예를 들어, IL2 또는 IFN-감마)의 분비를 증가시키거나, 면역 세포, 예를 들어, 종양 침윤 림프구 및/또는 T 세포에서의 활성화 유도 세포 사멸을 감소시키기에 충분하고,
모이어티가 융합 단백질로서 발현되는 경우,
i) 적혈구 세포의 표면 상의 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 서열을 가지거나,
ii) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 막횡단 영역을 가지거나,
iii) 융합 단백질은 전장 내인성 막 단백질을 포함하지 않으며, 예를 들어, 전장 내인성 막 단백질의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500개의 아미노산이 결여된, 전장 내인성 막 단백질의 세그먼트를 포함하거나,
iv) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 50개 초과의 아미노산이 서로 다르지 않거나,
v) 모이어티는 소르타제 전달 기호가 결여되거나,
vi) 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 미만의 서열이 구별되는 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
vii) 모이어티는 단일 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
viii) 융합 단백질은 내인성 막횡단 단백질과 모이어티의 접합부에 Gly-Gly를 함유하지 않거나;
ix) 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 이내의 아미노산인 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나; 이들의 조합이다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 자극 분자, 예를 들어, 4-1BBL 또는 이의 단편과 같은 보조 자극 분자를, 예를 들어, 표면 상에 포함하는 적혈구 세포를 제공하고, 여기서,
자극 분자, 예를 들어, 보조 자극 분자의 수준 또는 면역 세포(예를 들어, T 세포) 상의 결합 파트너에 대한 보조 자극 분자와 같은 자극 분자의 친화도는, 면역 세포 증식을 유도하거나, 사이토카인(예를 들어, IL2 또는 IFN-감마)의 분비를 증가시키거나, 면역 세포, 예를 들어, 종양 침윤 림프구 및/또는 T 세포에서의 활성화 유도 세포 사멸을 감소시키기에 충분하고,
모이어티가 융합 단백질로서 발현되는 경우,
i) 적혈구 세포의 표면 상의 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 서열을 가지거나,
ii) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 동일한 막횡단 영역을 가지거나,
iii) 융합 단백질은 전장 내인성 막 단백질을 포함하지 않으며, 예를 들어, 전장 내인성 막 단백질의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500개의 아미노산이 결여된, 전장 내인성 막 단백질의 세그먼트를 포함하거나,
iv) 융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 50개 초과의 아미노산이 서로 다르지 않거나,
v) 모이어티는 소르타제 전달 기호가 결여되거나,
vi) 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 미만의 서열이 구별되는 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
vii) 모이어티는 단일 융합 폴리펩티드 상에 존재하거나;
viii) 융합 단백질은 내인성 막횡단 단백질과 모이어티의 접합부에 Gly-Gly를 함유하지 않거나;
ix) 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 이내의 아미노산인 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나; 이들의 조합이다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 대상체에서 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포를 자극하는 방법으로서, 각각의 세포가, 그의 표면 상에, 보조 자극 분자(예를 들어, 4-1BB-L, OX40-L, GITR-L, 또는 ICOS-L)를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 면역 효과기 세포를 자극하기에 충분한 양으로 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여함으로써 면역 효과기 세포를 자극하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서, 암, 예를 들어, 고형 종양을 검출하는 방법으로서,
각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 세포, 예를 들어, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 포함하는 제조물을 대상체에게(예를 들어, 대상체의 혈류에) 투여하는 단계로서, 복수의 각 세포는 (예를 들어, 세포 표면 상에 또는 세포의 내부에) 생체내 이미징에 의해 검출 가능한 표지, 예를 들어, 방사성 핵종, 형광단, 생체 발광제, 또는 MRI 조영제를 또한 포함하는 단계; 및
표지를, 예를 들어, MRI 또는 방사능 검출에 의해 검출함으로써 암을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 개시는, 일부 양태에서,
종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 표면 상에 포함하고,
(예를 들어, 세포 표면 상에 또는 세포의 내부에) 생체내 이미징에 의해 검출 가능한 표지, 예를 들어, 방사성 핵종, 형광단, 생체 발광제, 또는 MRI 조영제를 포함하는, 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는, 본원에 기재된 적혈구 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 항암제를 전달하거나, 제시하거나, 발현하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 적혈구 세포 전구체를 접촉시키는 단계 및 세포를 제핵이 일어날 수 있는 조건에 두는 단계를 제공하여 본원에 기재된 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 같은 본원에 기재된 복수의 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포), 예를 들어, 적어도 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012개의 세포를 포함하는 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 제공한다.
다음의 구현예는 본원의 양태들 중 임의의 것, 예를 들어, 상기 본원의 조성물 및 방법 중 임의의 것에 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 치료제(예를 들어, 항암제) 또는 진단제(예를 들어, 생체내 이미징에 의해 검출 가능한 표지)이다. 구현예들에서, 제제는 T 세포 활성화, 자극, 또는 증식을 촉진한다. 구현예들에서, 제제는 암세포 성장 또는 생존을 억제한다. 구현예들에서, 제제는 본원에 기재된 제제들의 둘 이상의 특성을 갖는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 적혈구 세포는 자가 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 동종 세포이다.
일부 구현예에서, 세포 시스템은 다음 중 하나(또는 하나 이상, 예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상)을 가져오기에 효과적인 양으로 그리고 효과적인 시간 동안 투여된다: (a) 종양 크기 감소, (b) 종양 성장 속도 감소, (c) 종양 세포 사멸 증가, (d) 종양 진행 감소, (e) 전이 횟수 감소, (f) 전이 속도 감소, (g) 종양 재발 감소, (h) 대상체의 생존율 증가, (i) 대상체의 무진행 생존율 증가.
구현예들에서, 종양은 비전이성 종양이다. 구현예들에서, 종양은 전이성 종양이다. 구현예들에서, 종양은 혈관이 분포된 비전이성 종양이다. 구현예들에서, 종양은 하나 이상의 종양 혈관을 포함한다. 구현예들에서, 종양(예를 들어, 혈관이 분포된 종양)은 VEGF 또는 bFGF를 분비한다. 구현예들에서, 종양(예를 들어, 혈관이 분포되지 않은 종양)은 VEGF 또는 bFGF를 생성하지 않는다. 구현예들에서, 종양(예를 들어, 혈관이 분포되지 않은 종양)은 PGK와 같은 항-VEGF 효소를 생성한다. 구현예들에서, 종양(예를 들어, 혈관이 분포된 종양)은 PGK와 같은 항-VEGF 효소를 생성하지 않는다. 구현예들에서, 종양은 괴사 영역을 포함한다. 구현예들에서, 종양은 혈관신생 촉진 인자를 발현한다.
구현예들에서, 암은 본원의 하나 이상의 종양 항원, 예를 들어, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, EGFR, GD2, HER2/neu, 또는 VEGF, 또는 이들의 조합을 발현한다.
구현예들에서, 암은 표 1의 암이고, 암 항원은 표 1의 암 항원이다. 구현예들에서, 암은 표 3의 암이다. 구현예들에서, 암은 기능적 카스파제 아폽토시스 경로가 결여된다. 구현예들에서, 고형 종양은 표 3의 고형 종양이다. 구현예들에서, 고형 종양은 원발성 종양 또는 전이성 종양 병변이다. 구현예들에서, 원발성 종양의 위치는 공지되어 있다. 구현예들에서, 암은 공지되지 않은 원발성 암 이외의 암이다.
구현예들에서, 투여 후, 적혈구 세포는 종양의 혈관외 영역, 종양의 비-괴사 영역, 또는 종양의 간질 영역에 상주 또는 존속한다. 구현예들에서, 종양에 존속하는 적혈구 세포는 적어도 3, 6, 또는 12시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28일(예를 들어, 최대 14 또는 28일) 동안 종양에 상주한다.
구현예들에서, 적혈구 세포의 표면 상의 결합제의 양은 다음과 같이 되게 하기에 충분하거나, 결합제의 그의 표적에 대한 결합 친화도는 다음과 같이 되게 하기에 충분하거나, 적혈구 세포는 다음과 같이 되게 하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여된다:
a) 종양 내(또는 종양의 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 mm3 영역 내)의 적혈구 세포 대 종양 세포의 비가 적어도 약 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 또는 1:100(예를 들어, 최대 100:1 또는 10:1)이 되거나;
b) 종양 내의 적혈구 세포 대 내인성 적혈구 세포의 비가 적어도 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 1,000:1, 또는 10,000:1(예를 들어, 최대 100:1, 1,000:1 또는 10,000:1)이 되거나;
c) 암세포 표면 단백질, 예를 들어, CD20의 과가교결합을 유도하거나;
d) 종양에 상주하는 적혈구 세포 대 대상체의 혈류 내의 적혈구 세포의 수의 비가, 예를 들어, 세포 투여 후 적어도 1시간 또는 12시간 또는 1일째, 3일째, 5일째, 또는 7일째에 또는 종양에서의 적혈구 세포 축적의 최고점에서, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 10:1, 20:1, 또는 100:1 초과(선택적으로, 최대 10:1 또는 100:1)이 되거나;
e) 종양 내에(또는 종양의 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 mm3 영역 내에) 상주하는 결합제, 예를 들어, 항체의 양이 다른 유사한 결합제, 예를 들어, 적혈구 세포와 관련되지 않은 항체, 예를 들어, 유리 항체의 양보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100배 더 크게 되거나(선택적으로 최대 10배 또는 100배 초과);
f) 기준, 예를 들어, 결합제가 결여된 유사한 적혈구 세포와 비교하여 종양 내의 적혈구 세포의 존속을 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500배) 증가시키거나;
g) 종양 내의 또는 종양의 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 mm3 영역 내의 적혈구 세포의 농도가, 예를 들어, 세포 투여 후 적어도 1시간 또는 12시간 또는 1일째, 3일째, 5일째, 또는 7일째에 또는 종양에서의 적혈구 세포 축적의 최고점에서, 종양외 구획과 비교하여 농축되어 있으며, 예를 들어, 대상체 내의 적혈구 세포의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95%(선택적으로, 최대 95% 또는 99%)가 종양에서 발견되고, 적혈구 세포의 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만이 제2 구획, 예를 들어, 간에서 발견되거나;
h) 종양의 혈관구조-인접 영역(예를 들어, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 mm3 영역) 내의 적혈구 세포의 농도가, 예를 들어, 세포 투여 후 적어도 1시간 또는 12시간 또는 1일째, 3일째, 5일째, 또는 7일째에 또는 종양에서의 적혈구 세포 축적의 최고점에서, 종양의 혈관구조-원거리 영역(예를 들어, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 mm3 영역)과 비교하여 농축되어 있으며, 예를 들어, 대상체 내의 적혈구 세포의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95%(선택적으로, 최대 95% 또는 99%)가 혈관구조-인접 영역에서 발견되고, 적혈구 세포의 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만, 또는 검출 불가능한 양이 혈관구조-원거리 영역에서 발견되는 것으로, 선택적으로 혈관 인접 영역은 혈관의 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 cm(예를 들어, 최대 5 cm) 이내이고, 종양의 혈관-원거리 영역은 혈관의 2, 3, 4, 5, 또는 10 cm보다 멀리 떨어져 있거나;
j) 순환중인 적혈구 세포의 수가 환자가 주입 반응, 심각한 점막 피부 반응, B 형 간염 바이러스 재활성화, 또는 진행성 다초점 백질뇌병증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮게 되거나;
k) 적혈구 세포가 대상체에게 투여된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월(선택적으로, 최대 6, 9 또는 12개월)째에 종양 부위에 존재하고/하거나 그러한 부위에서 활성이 되거나;
l) 암세포가, 적혈구 세포의 존재 하에서, 적혈구 세포에 포함되지 않은 동일한 양의 동일한 결합제, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서의 암세포보다 높은 속도로 세포 사멸(예를 들어, ADCC 또는 아폽토시스, 예를 들어, 카스파제-비의존성 아폽토시스)을 겪게 된다.
구현예들에서, 결합제를 표면 상에 포함하는 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 유리 결합제, 예를 들어, 적혈구 세포와 관련되지 않은 항체와 관련된 부작용을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD20에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 리툭시맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입 반응, 심각한 점막 피부 반응, B 형 간염 바이러스 재활성화, 또는 진행성 다초점 백질뇌병증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD52에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 알렘투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 혈구감소증, 주입 반응, 감염, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 HER2/neu에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 아도-트라스투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 간독성, 간 기능 부전, 좌심실 박출률 감소, 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 HER2/neu에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 트라스투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 심근병증, 주입 반응, 폐 독성, 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 EGFR에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 니모투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 근육통, 졸음, 방향 감각 상실, 혈뇨 및 상승된 간 기능 효소, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 EGFR에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 세툭시맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입 반응 또는 심폐 정지, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 VEGF에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 베바시주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 위장 천공, 수술 및 상처 치유 합병증, 출혈, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD33에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 겜투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 아나필락시스를 포함하는 과민 반응, 주입 반응, 폐 사건, 간독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD20에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 이브리투모맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 심각한 주입 반응, 혈구감소증(예를 들어, 장기 및/또는 중증 혈구감소증), 또는 심각한 피부 및 점막 피부 반응, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD20에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 토시투모맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 심각한 알레르기 반응 또는 혈구감소증(예를 들어, 장기 및/또는 중증 혈구감소증), 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 EGFR에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 파니투무맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 피부 독성을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD20에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 오파투무맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 B 형 간염 바이러스 재활성화 또는 진행성 다초점 백질뇌병증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CTLA-4에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 이필리무맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 면역 매개 이상 반응(예를 들어, 장염, 간염, 피부염, 신경병증, 또는 내분비병증) 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD30에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 브렌툭시맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 진행성 다초점 백질뇌병증, 또는 이의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 HER2에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 퍼투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 좌심실 박출률 감소 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD20에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 오비누투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 B 형 간염 바이러스 재활성화 또는 진행성 다초점 백질뇌병증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 PD-1에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 니볼루맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 면역 매개 사건(예를 들어, 폐렴, 대장염, 간염, 내분비병증, 신염 및 신장 기능 장애, 피부 이상 반응, 또는 뇌염), 주입 반응, 동종 HSCT의 합병증, 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 PD-1에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 펨브롤리주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 면역 매개 이상 반응(예를 들어, 대장염, 간염, 뇌하수체염, 신염, 갑상선기능항진증, 갑상선기능저하증) 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 PDGF-R α에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 올라라투맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입-관련 반응 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 PD-L1에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 아테졸리주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 면역-매개 이상 반응(예를 들어, 폐렴, 간염, 대장염, 내분비병증, 근무력 증후군, 중증 근무력증, 길랑-바레 또는 뇌수막염, 췌장염), 안구 염증 독성, 감염, 주입 반응, 또는 배-태아 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 SLAMF7에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 엘로투주맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입 반응, 감염, 2차 원발성 악성종양, 간독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 EGFR에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 네시투무맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 심폐 정지, 저마그네슘혈증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD38에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 다라투무맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입 반응, 호중구 감소증, 또는 혈소판 감소증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 VEGFR2에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 라무시루맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 출혈, 동맥 혈전색전성 사건, 고혈압, 주입 관련 반응, 위장 천공, 간경화 환자의 임상적 악화, 가역성 후두부 백질뇌병증 증후군, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 GD2 에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 디누툭시맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입 반응 또는 신경병증, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 CD19 ? CD3에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 블리나투모맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 사이토카인 방출 증후군 또는 신경 독성, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 IL-6에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 실툭시맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 주입 관련 반응 또는 위장 천공, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 RANK 리간드에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 데노수맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 감염, 피부 반응, 턱뼈의 골괴사, 또는 골 전환의 억제, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다. (예를 들어, 결합제가 EpCAM 및 CD3에 결합하는, 예를 들어, 결합제가 카투막소맙 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는) 구현예들에서, 순환중인 적혈구 세포의 수는 환자가 복통, 발열, 피로, 또는 메스꺼움/구토, 또는 이들의 조합을 경험하지 않도록 충분히 낮다.
구현예들에서, 적어도 약 1 x 1010, 2 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 5 x 1011개(예를 들어, 최대 1 x 1012개)의 적혈구 세포가 대상체에게 투여된다.
구현예들에서, 결합제를 포함하는 외인성 폴리펩티드는 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 결합제는 항체, 항체 단편, 단일쇄 항체, scFv, 또는 나노바디(nanobody)이다. 구현예들에서, 결합제는 항-CD20 항체 또는 항-PL-L1 항체를 포함한다.
구현예들에서, 결합제는 항-CD20 항체 이외의 것, 리툭시맙 이외의 것, 또는 암 줄기 세포 항원(예를 들어, CD44, CD47, MET, EpCam, Her2, EGFR, 또는 CD19)에 대한 항체 이외의 것이다. 구현예들에서, 결합제는 CD133, CD3, CD, CD16, CD19, CD20, CD56, CD44, CD24, 또는 CD133에 대한 항체 이외의 것이다.
구현예들에서, 종양 세포 항원은 막 단백질, 예를 들어, 막 인단백질이다.
구현예들에서, 적혈구 세포는 다른 유사한 유전자 조작되지 않은 적혈구 세포보다 큰 친화도로, 예를 들어, 적어도 2, 5, 10, 20, 50, 또는 100배(선택적으로, 최대 10배 또는 100배) 낮은 Kd를 가지면서 비-괴사성 종양 세포에 결합하거나 회합한다.
구현예들에서, 결합제는 표적화 활성을 가지며(예를 들어, 적혈구 세포가 결합제가 결여된 다른 유사한 적혈구 세포보다 높은 수준으로 종양에 축적되도록 함), 항암 활성을 갖는다(예를 들어, 암세포 사멸을 유발하거나, 미처리된 암과 비교하여 종양 성장을 지연시킴). 구현예들에서, 결합제는 표적화 활성을 가지며 항암 활성을 갖지 않는다.
구현예들에서, 본원에 기재된 항암제는 면역자극성 사이토카인, 종양 기아 효소(예를 들어, 아스파라기나제, 메티오닌 감마 리아제, 또는 세린 데하이드로게나제), 세포독성 소분자, 방사성 핵종, 화학치료제, 독소, 소분자, 단백질 치료제, 체크포인트 조절제, 아폽토시스 촉진제, 또는 이의 단편 또는 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 구현예들에서, 면역자극성 사이토카인은 타입 1 사이토카인 또는 타입 2 사이토카인, 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 구현예들에서, 면역자극 사이토카인은 IL-2 또는 IL-12, 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
구현예들에서, 적혈구 세포는 제2 제제를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 제2 제제는 항암제(예를 들어, 제2 항암제) 및/또는 제2 외인성 폴리펩티드다. 구현예들에서, 제2 제제는 방사성 핵종, 화학치료제, 독소, 소분자, 또는 단백질 치료제를 포함한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 체크포인트 조절제, 아폽토시스 촉진제, 또는 종양 기아 효소(예를 들어, 아스파라기나제)를 포함한다. 구현예들에서, 제2 제제는 면역 기능을 촉진하며, 예를 들어, 제2 제제는 전염증성 사이토카인 또는 면역 체크포인트 분자의 억제제를 포함한다.
구현예들에서, 제2 제제는, 적혈구 세포에 포함되지 않은 동일한 양의 다른 유사한 제2 제제와 비교하여, 적혈구 세포에 포함될 때 개선된 안전성 또는 감소된 부작용을 나타낸다.
구현예들에서, 결합제 또는 제2 제제는 암세포에 대한 면역 세포 활성을 증가시키거나, 면역 세포를 암으로 보급하거나, 면역 세포 활성화를 증가시키거나, 면역 체크포인트 억제에 대한 면역 세포 내성을 증가시키거나, 이들의 조합을 일으킨다. 구현예들에서, 결합제 또는 제2 제제는 아폽토시스를 증가시킨다. 구현예들에서, 결합제 또는 제2 제제는 암세포에서 이온 수준을 조절하며, 예를 들어, 주어진 이온의 수준을 증가 또는 감소시키고, 예를 들어, 칼슘 수준을 증가시킨다. 구현예들에서, 결합제 또는 제2 제제는 종양 세포에서 칼슘 채널 활성을 조절한다.
일부 구현예에서, 내성 암은 항체 치료제, 예를 들어, 표 1의 항체 치료제에 내성이다. 일부 구현예에서, 내성 암은 소분자 약물에 내성이다. 구현예들에서, 소분자 약물은 화학치료제, 예를 들어, 본원에 기재된 화학치료제다. 구현예들, 예를 들어, 내성 대상체에 관한 구현예들에서, 대상체는 표 1의 항체에 의한 처리에 반응하지 않았다. 구현예들에서, 대상체는 표 1의 항체에 대해 미경험 상태이다. 구현예들에서, 항체는 항-CD20 항체, 예를 들어, 리툭시맙이다. 구현예들에서, 항체 도메인은 표 1의 표적에 결합한다. 구현예들에서, 항체 도메인은, 예를 들어, 카바트(Kabat) 또는 코티아(Chothia) 정의를 사용하는, 표 2로부터의 CDR 또는 VR을 포함한다.
구현예들에서, 본원의 방법(예를 들어, 내성 암을 치료하는 방법)은 종양 항원에 결합하는 항체 도메인과 막횡단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 적혈구 세포의 제조물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 암은 그 항원에 결합하는 항체에 내성을 띠게 된다. 구현예들에서, 적혈구 세포에 포함된 항체 도메인은, 암이 내성인 항체 치료제, 예를 들어, 그 항체 치료제에 의한 처리 후 환자가 재발한 항체 치료제와 동일한 CDR을 가지거나 그 항체 치료제에 비하여 CDR이 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 돌연변이만큼 다르다.
구현예들, 예를 들어, 내성 대상체에 관한 구현예들에서, 환자는 항암 항체 치료제에 대한 내인성 항체를 포함하며, 예를 들어, 환자는 HAMA(인간 항-마우스 항체)를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포에 의한 처리 후, 환자는 항-약물 항체의 처리전 수준과 비교하여 감소된 수준의 항-약물 항체, 예를 들어, HAMA를 나타낸다. 구현예들에서, 환자는 손상된 카스파제-의존성 아폽토시스 경로를 가지며, 예를 들어, 카스파제, 예를 들어, 개시제 또는 실행 카스파제에 돌연변이를 갖는다. 구현예들에서, 돌연변이는 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 3, 카스파제 6, 또는 카스파제 7에 존재한다. 구현예들에서, 적어도 암세포의 서브세트는 항암 항체 치료제에 의해 결합되는 단백질, 예를 들어, CD20 또는 표 1의 표적에 영향을 주는 돌연변이(예를 들어, 그의 결실)를 갖지 않는다.
구현예들, 예를 들어, 발암성 돌연변이를 갖는 암을 치료하는 것을 포함하는 구현예들에서, 방법은 암이 돌연변이를 갖는다는 지식을 얻는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 암은 제2 발암성 돌연변이, 예를 들어, 표 8로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
구현예들에서, 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 보조 자극 분자)의 수준 또는 면역 세포(예를 들어, T 세포) 상의 결합 파트너에 대한 외인성 폴리펩티드의 친화도는 면역 세포 증식을 유도하기에 충분하다.
구현예들에서, 적혈구 세포는 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포, 예를 들어, 그물적혈구와 대략적인 직경 또는 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 초과 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 거의 동일한 포스파티딜세린 함량을 그 세포막의 외엽 상에 갖는다.
구현예들에서, 막횡단 도메인은 글리코포린 A(GPA), 글리코포린 B, 글리코포린 C, 글리코포린 D, 켈(kell), 밴드 3, 아쿠아포린 1, 글루트(glut) 1, 키드(kidd) 항원 단백질, 또는 레서스(rhesus) 항원의 막횡단 부분을 포함한다.
구현예들에서, 면역 체크포인트 조절을 포함하는 구현예들에서, 모이어티는 표 4의 항체 표 4의 항원에 결합하는 항체이다. 구현예들에서, 모이어티(예를 들어, PD-L1에 결합하는 모이어티)는 항-PD-L1 항체, 또는 PD1의 세포외 단편이다. 구현예들에서, 상기 모이어티는 면역 체크포인트-리간드(예를 들어, PD-L1)에 결합한다.
구현예들에서, 본원의 조성물 또는 방법은, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드를 포함하는 복수의 적혈구 세포와 함께 혼합된, 외인성 폴리펩티드가 결여된 적혈구 세포의 집단을 포함하거나, 이를 투여하는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 조성물 또는 방법은 100% 미만의 효율로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 집단을 포함하거나 이를 투여하는 단계를 포함한다.
구현예들, 예를 들어, 보조 자극 분자를 포함하는 구현예들에서, 적혈구 세포는 표적화 모이어티, 예를 들어, 결합 모이어티를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 결합 모이어티는 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 상의 항원에 결합한다. 구현예들에서, 결합 모이어티는 종양 세포 상의 항원 또는 종양 미세환경에 존재하는 항원에 결합한다. 구현예들에서, 보조 자극 분자는 4-1BB-L, OX40-L, GITR-L, 또는 ICOS-L이다.
구현예들에서, 자극 분자는 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포를 자극하는 분자이다. 구현예들에서, 자극 분자는 주요 자극제 또는 보조 자극 분자이다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 보조 자극 분자 및 주요 자극제를 포함한다. 다른 구현예들에서, 적혈구는 보조 자극 분자를 포함하고 주요 자극제를 포함하지 않는다. 구현예들에서, 적혈구는 보조 자극 분자를 포함하고 외인성 주요 자극제를 포함하지 않는다.
구현예들, 예를 들어, 내성 대상체를 포함하는 구현예들에서, 조작된 적혈구 세포의 외부 표면 상의 융합 단백질의 수 또는 종양 항원에 대한 결합 도메인의 친화도는 표적 세포, 예를 들어, B 세포로의 적혈구 세포의 결합을 유도하기에 충분하다.
구현예들에서, 투여는 전신 또는 국소 투여이다. 구현예들에서, 투여는 혈류로의 투여, 예를 들어, 정맥내 투여, 예를 들어, 정맥내 주입이다. 구현예들에서, 투여는 종양으로의 투여이다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 그의 표면 상에 다음과 같은 것을 포함한다:
i) 제1 보조 자극 분자(예를 들어, 본원에 기재된 보조 자극 분자, 예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자), 및
ii) 제2 보조 자극 분자(예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자), 및
iii) 선택적으로, 제3 또는 그 초과의 보조 자극 분자(예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자), 및
iv) 선택적으로, 종양 항원에 결합하는 표적화 부분.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 그의 표면 상에 다음과 같은 것을 포함한다:
i) 제1 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제1 제제(예를 들어, 본원에 기재된 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제제, 예를 들어, 표 4의 면역 체크포인트 분자, 예를 들어, 표 4의 항체 또는 다른 결합제에 결합하는 제제), 및
ii) 제2 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제2 제제(예를 들어, 표 4의 면역 체크포인트 분자, 예를 들어, 표 4의 항체 또는 다른 결합제에 결합하는 제제), 및
iii) 선택적으로, 면역 체크포인트 분자(예를 들어, 표 4의 면역 체크포인트 분자)에 결합하는 제3 또는 그 초과의 제제, 및
iv) 선택적으로, 종양 항원에 결합하는 표적화 부분.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 그의 표면 상에 다음과 같은 것을 포함한다:
i) 보조 자극 분자(예를 들어, 본원에 기재된 보조 자극 분자, 예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자, 예를 들어, 4-1BBL), 및
ii) 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제제(예를 들어, 본원에 기재된 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제제, 예를 들어, 표 4의 면역 체크포인트 분자, 예를 들어, 표 4의 항체 또는 다른 결합제, 예를 들어, 항-PD-L1에 결합하는 제제), 및
iii) 선택적으로, 종양 항원에 결합하는 표적화 부분.
구현예들, 예를 들어, 생체내 이미징을 위한 적혈구 세포를 포함하는 구현예들에서, 적혈구 세포는 PET 동위원소, 예를 들어, 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb, 89Zr 및 68Ga를 포함하는 표지를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 생체 발광제, 예를 들어, 루시퍼라제를 포함하는 표지를 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드(들)는 제핵 적혈구 세포에 의해 보유되지 않는 하나 이상의 외인성 핵산(들)에 의해 인코딩된다.
구현예들에서, 적혈구 세포는, 예를 들어, PBMC 증식 검정, 예를 들어, 실시예 5의 검정에 의해, 예를 들어, 적혈구 세포가 결여된 샘플과 비교하여, T 세포 증식, 예를 들어, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 모두의 증식을, 예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 10배 촉진한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 CD8+ T 세포의 증식을 CD4+ T 세포의 증식보다 더 강하게, 예를 들어, 동일한 양의 시간, 예를 들어, 5 일에 걸쳐 적어도 2배 또는 3배의 배수 증가 차이만큼 촉진한다. 일부 구현예에서, 검정 초기의 적혈구 세포 대 PMBC의 비는 약 1:1이다.
구현예들에서, 적혈구 세포는, 예를 들어, 유동세포분석법 검정, 예를 들어, 실시예 5의 검정에 의해, T 세포 샘플에서의 사이토카인 분비, 예를 들어, IFNg, TNFa, 또는 IFNg와 TNFα 둘 모두의 분비를 촉진한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 외인성 단백질이 결여된 다른 유사한 적혈구 세포로 처리된 다른 유사한 세포 샘플과 비교하여 증가된 사이토카인 분비, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 또는 5배의 증가를 촉진한다. 일부 구현예에서, 증가된 사이토카인 분비는 사이토카인-분비 세포(예를 들어, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 모두)의 증가된 증식에 적어도 부분적으로 기인한다.
구현예들에서, 적혈구 세포(예를 들어, 항-PD-L1 항체를 발현하는 적혈구 세포)는 PD-L1을 발현하는 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 암세포는, 예를 들어, 종양 세포에서 PD-L1 발현을 증가시키기에 충분한 양으로, IFN- 감마, 예를 들어, 내인성 IFN- 감마에 노출된다. 일부 구현예에서, 종양은 세포당 적어도 100,000, 125,000, 150,000, 200,000, 250,000, 300,000, 350,000, 또는 400,000개 카피의 PD-L1을 발현한다.
관련된 양태들에서, 본 발명의 개시는 다음과 같은 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 종양 상의 PD-L1 발현의 존재 또는 수준, 예를 들어, 종양 세포가 기준값보다 많은 세포당 PD-L1 폴리펩티드의 수를 갖는지 여부에 관한 정보를 (예를 들어, 직접 또는 간접적으로) 획득하는 단계로서, 예를 들어, 기준값이 100,000, 125,000, 150,000, 200,000, 250,000, 300,000, 350,000, 또는 400,000개 중 하나인 단계, 및
(b) (a)에 반응하여, 본원에 기재된 복수의 제핵 적혈구 세포, 예를 들어, 항-PD-L1 결합제, 예를 들어, 항-PD-L1 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 표면 상에 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 치료제를 선택하거나 이를 투여하는 단계.
본원에 기재된 세포 시스템은 세포 시스템의 일부가 아닌 또 다른(하나 이상의) 항-증식, 항-신생물 또는 항-종양 약물 또는 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 그와 같은 약물 또는 치료제는 화학요법 약물, 예를 들어, 세포독성 약물(예를 들어, 알킬화제, 항대사물, 항-종양 항생제, 국소이성화효소 억제제, 유사분열 억제제, 코르티코스테로이드); 암 성장 차단제, 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 및 프로테아솜 억제제; T 세포 요법(예를 들어, CAR-T 세포 요법)(예를 들어, PMID: 26611350 참조), 자연살(NK) 세포 면역조절(예를 들어, PMID: 26697006 참조); 및 암 백신(PMID: 26579225); 다른 화학 약물, 예를 들어, L-아스파라기나제 및 보르테조밉(bortezomib)(Velcade®)를 포함한다. 예를 들어, 호르몬-민감성 암에 대해 호르몬 요법(또는 항-호르몬 요법)이 사용될 수 있다.
본원에 기재된 세포 시스템은 또한 암에 대한 비-약물 요법, 예를 들어, 수술, 방사선요법, 또는 냉동요법과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 치료 방법은 2개 이상의 다른 요법 또는 약물과 조합된 본원에 기재된 세포 시스템을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 유방암은 수술 또는 방사선요법 및 화학요법 칵테일 또는 생물학적 제제(예를 들어, 항-HER2 항체)와 조합된 본원에 기재된 세포 시스템의 조합으로 치료될 수 있다.
본 발명의 개시는 상기 양태 및/또는 구현예 중 어느 하나 이상의 모든 조합뿐만 아니라 상세한 설명 및 실시예에 기재된 구현예 중 어느 하나 이상과의 조합을 고려한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌(예를 들어, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 예를 들어, 본원의 임의의 표에서 본원에 참조된 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참조로서 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 본원의 임의의 표를 포함하는 본원에 명시된 서열 수탁 번호는 2016년 12월 2일 현재의 데이터베이스 항목을 참조한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 수탁 번호를 언급하는 경우, 서열 변이체 모두가 포함된다.
도 1은 (좌측에서 우측으로) 항-CD20 항체 단독, 2차 항-아이소타입 항체와 함께 "가교결합된” 항-CD20 항체, (1:1 또는 1:5의) 대조 RCT-HA-GPA, 또는 (1:1 또는 1:5의) RCT-항CD20 항체 단독으로 처리된 4개의 림프종 세포주에서의 아폽토시스 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2는 카스파제-의존성 아폽토시스 억제제(FMK)의 존재 또는 부재 하에 RCT-항CD20 또는 대조 RCT-HA-GPA로 처리된 CD20+ 림프종 세포에서의 아폽토시스 수준을 나타낸 그래프이다. 1-1 및 1-5는 각각 1:1 및 1:5 비의 림프종 세포 대 RCT를 나타낸다.
도 3은 RCT-항CD20 또는 대조 RCT-HA-GPA로 처리된 마우스로부터의 CD20+ 종양의 조직 절편을 도시한다. H&E, 헤마톡실린 및 에오신은 유핵 세포, 내인성 적혈구, 및 조작된 적혈구 세포를 검출한다. CD31 염색은 내피 혈관구조를 검출한다. CD20 염색은 Ramos 종양 세포를 검출한다. HA는 조작된 적혈구 세포를 검출한다.
도 4는 대조 RCT-HA-GPA(상부 패널) 또는 RCT-항CD20(하부 패널)로 처리된 마우스에서의 이종 이식 종양의 형광 이미지이다.
도 5는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 RCT에 의한 IL-2 분비의 구제(rescue)를 나타낸 그래프이다. 좌측에서 우측으로, 막대들은 Jurkat(Jurkat 세포 단독, 기준선), Jurkat/Z138(NHL Z138 세포와 공동 배양된 Jurkat 세포, IL-2 분비의 억제를 나타냄), Jurkat/Z138/형질도입되지 않은 RCT(NHL Z138 세포 및 형질도입되지 않은 대조 적혈구 세포와 공동 배양된 Jurkat 세포, IL-2 분비가 구제되지 않음을 나타냄), Jurkat/Z138/atezo-플래그 RCT(NHL Z138 세포 및 RCT-항PDL1과 공동 배양된 Jurkat 세포, IL-2 분비의 구제를 나타냄), Jurkat/Z138/Ipi-플래그 RCT(NHL Z138 세포 및 RCT-항CTLA4와 공동 배양된 Jurkat 세포, IL-2 분비의 구제를 나타냄)에 상응한다. 그 다음 5개의 막대는 Jurkat 세포의 부재 하에서 IL-2 분비가 낮거나 없음을 보여준다. 가장 우측의 막대는 Jurkat 세포가 형질도입되지 않은 대조 적혈구 세포와 공동 배양될 때 IL-2 분비의 대략적인 기준선 수준을 보여준다.
도 6은 표준 항원 리콜(recall) 검정에서의 인터페론-감마 분비를 나타낸 그래프이다. 가장 좌측의 막대인 PBMC 단독은 기준선 인터페론-감마 분비를 보였다. 그 다음 5개의 막대인 지시된 수의 대조 RCT-HA-GPA 세포와 공동 배양된 PBMC는 기준선과 유사한 인터페론 감마 분비 수준을 나타내었다. 가장 우측에 있는 5개의 막대인 지시된 수의 RCT-항PD1 세포와 공동 배양된 PBMC는 증가된 인터페론 감마 분비 수준을 나타내었다.
도 7은 Jurkat 세포가 RCT-41BBL 또는 형질도입되지 않은 대조 적혈구 세포와 공동 배양될 때 RLU로 측정된 루시퍼라제 활성에 의해 표시되는 바와 같은 NFκB 활성화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 세포당 지시된 카피수의 4-1BB-L을 갖는 적혈구 세포로 인한 NF
Figure pct00002
κB 활성화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 지시된 수의 4-1BB-L RCT 세포로 인한 NFκB 활성화를 항 4-1BB 항체와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 좌측 패널에서는 4-1BB-L RCT 세포에 의해 유도된 CD4+ T 세포의 배수 변화를, 그리고 우측 패널에서는 4-1BB-L RCT 세포에 의해 유도된 CD8+ T 세포의 배수 변화를, 항 4-1BB 항체와 비교하여 나타낸 그래프 쌍이다.
도 11은 좌측 패널에서는 4-1BB-L RCT 세포에 의해 유도된 IFN- 감마 분비를, 그리고 우측 패널에서는 4-1BB-L RCT 세포에 의해 유도된 TNF-알파 분비를, 항 4-1BB 항체와 비교하여 나타낸 그래프 쌍이다.
도 12는 41BBL-RCT로 처리된 마우스 및 미처리된 대조군에서의 종양 크기를 나타내는 시간 경과이다.
도 13은 항-PD-L1 항체 또는 아이소타입 대조 항체를 갖는 적혈구 세포에 대한 종양 내의 적혈구 세포 대 혈관 내의 적혈구 세포의 비를 도시한다.
도 14는 지시된 RCT에 의해 유도된 신호전달, 증식, 사이토카인 수준, 및 항원 리콜 활성의 대략적인 배수 변화 수준을 요약한 차트이다.
도 15는 지시된 종양 세포로의 지시된 적혈구 세포의 결합을 정량화한 그래프이다.
정의
본원에 사용되는 용어 "항체"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편을 나타낸다. 용어 "항체"는 항체 및 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이특이적 항체이다. 항체의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화물-결합 Fvs(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예를 들어, sdAb(VL 또는 VH), 카멜리드(camelid) VHH 도메인, 항체 단편, 예를 들어, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 항체의 분리된 에피토프 결합 단편, 맥시바디(maxibodies), 미니바디(minibodies), 나노바디, 인트라바디(intrabodies), 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), v-NAR 및 비스-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 "조합 요법" 또는 "조합하여 투여됨"은 2개(또는 그 초과)의 상이한 제제 또는 치료제가 특정 질병 또는 질환에 대한 치료 요법의 일부로서 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 치료 요법은 대상체에 대한 별도의 제제의 효과가 중첩되도록 하는 각각의 제제의 투여의 용량 및 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 제제의 전달은 동시적이거나 동반적이며, 제제는 공동-제형화될 수 있다. 다른 구현예들에서, 2개 이상의 제제는 공동 제형화되지 않으며, 처방 요법의 일부로서 순차적 방식으로 투여된다. 일부 구현예에서, 조합된 2개 이상의 제제 또는 치료제의 투여는 증상 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 단독으로 전달되거나 다른 제제 또는 치료제의 부재 하에서의 하나의 제제 또는 치료제로 관찰되는 것보다 크도록 수행된다. 2개의 치료제의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 부가적인 것을 초과(예를 들어, 상승작용)할 수 있다. 각각의 치료제의 순차적 또는 실직적인 동시 투여는 경구 경로, 정맥내 경로, 근내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적절한 경로에 의해 수행될 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합물의 제1 치료제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 반면, 조합물의 제2 치료제는 경구 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)이 있고, 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 있다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al.(1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("카바트" 번호 매김 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948]("코티아" 번호 매김 체계) 또는 이들의 조합에 기술된 것들을 포함하는 다수의 잘 알려진 체계들 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다.
카바트 번호 매김 체계 하에서, 일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31-35(HCDR1), 50-65(HCDR2), 및 95-102(HCDR3)로 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2), 및 89-97(LCDR3)로 번호가 매겨진다. 코티아 번호 매김 체계 하에서, 일부 구현예에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26-32(HCDR1), 52-56(HCDR2), 및 95-102(HCDR3)로 번호가 매겨지고; VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2), 및 91-96(LCDR3)으로 번호가 매겨진다. 조합된 카바트 및 코티아 번호 매김 체계에서, 일부 구현예에서, CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 또는 둘 모두의 일부인 아미노산 잔기에 상응한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CDR은 VH, 예를 들어, 포유 동물 VH, 예를 들어, 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26-35(HCDRl), 50-65(HCDR2), 및 95-102(HCDR3); 및 VL, 예를 들어, 포유 동물 VL, 예를 들어, 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2), 및 89-97(LCDR3)에 상응한다.
본원에 사용되는 "제핵"은 핵이 결여된 세포, 예를 들어, 성숙한 적혈구로의 분화를 통해 핵을 잃은 세포를 나타낸다.
본원에 사용되는 "적혈구 세포"는 유핵 적혈구, 적혈구 전구체, 및 제핵 적혈구를 포함한다. 예를 들어, 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 일반 골수성 전구세포(CMP), 배반포 콜로니-형성 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 거핵세포-적혈구 전구세포(MEP) 세포, 적혈구 콜로니-형성 단위(CFU-E), 그물적혈구, 적혈구, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염적혈모구, 정염적혈모구 중 임의의 것이 적혈구 세포이다. 적혈구 세포의 제조는 이들 세포 중 임의의 것 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 무한증식 세포 또는 무한증식화 세포이다. 예를 들어, 무한증식화 적혈모구 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc를 발현하고 TP53을 억제하는 CD34+ 조혈 전구 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Huang et al., Mol Ther 2013, epub ahead of print September 3]에 기술된 바와 같음). 또한, 세포는 자가 사용을 목적으로 하거나 동종 수혈을 위한 원천을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 배양된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포는 제핵 적혈구다.
본원에 사용되는 용어 "외인성 폴리펩티드"는 상기 유형의 야생형 세포에 의해 생성되지 않거나, 외인성 폴리펩티드를 함유하는 세포에서보다 야생형 세포에서 낮은 수준으로 존재하는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 세포로 도입된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드이며, 상기 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다.
본원에 사용되는 종양 항원의 "과가교결합"은 그 항원이 세포의 표면 상에 클러스터를 형성하게 하거나 세제-불용성 세포막 복합체 또는 신호전달-처리 중심 내로 재분포되도록 하는 것을 나타낸다. 이 재분배는, 예를 들어, 문헌[Polyak et al., "Identification of a Cytoplasmic Region of CD20 Required for Its Redistribution to a Detergent-Insoluble Membrane Compartment" The Journal of Immunology, October 1, 1998, vol.161 no.7 3242-3248]에 기술된 바와 같이 검정될 수 있다. 과가교결합은 종양 항원들 사이의 공유 결합의 형성을 필요로 하지 않는다.
종양에 상주하는 제제와 관련하여 본원에 사용되는 용어 "상주하는"은 종양의 경계 내에, 예를 들어, 종양 세포들 사이 또는 종양 세포 내부에 존재하는 제제를 나타낸다.
종양에 존속하는 제제와 관련하여 본원에 사용되는 용어 "존속하는"은 장시간 또는 미리결정된 시간 동안 종양에 연속적으로 상주하는 제제를 나타낸다. 예를 들어, 제제가 종양 항원에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 경우, 표적화 모이어티를 포함하는 제제가 표적화 모이어티가 결여된 다른 유사한 제제(예를 들어, 개질되지 않은 적혈구 세포)보다 더 길게 종양에 연속적으로 상주한다면 제제는 종양에 존속하는 것이다. 구현예들에서, 종양에 존속하는 제제는 적어도 3, 6, 또는 12시간 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28 일(예를 들어, 최대 14 또는 28 일) 동안 종양에 상주한다.
본원에 사용되는 "내성" 종양은 요법에 반응하지 않는 종양을 나타낸다. 내성 종양은, 요법으로 치료되고, 종양이 요법에 반응을 나타내지 않은, 예를 들어, 환자가 치료에 불응성인, 예를 들어, 환자가 반응 기간 없이 진행성 질병을 나타낸, 대상체 내의 종양일 수 있다. 또한, 내성 종양은, 요법으로 치료되고 초기 반응(예를 들어, 완전한 반응 또는 부분적 반응)을 보였지만, 그 후 환자가 개선을 나타내는 것을 멈추거나(예를 들어, 환자의 반응이 정체 상태를 유지함) 재발한(예를 들어, 환자가 반응 기간 후에 진행성 질병을 나타냄), 대상체 내의 종양일 수 있다. 내성 종양은 또한 치료 미경험의 내성 종양, 예를 들어, 요법으로 치료되지 않은 대상체 내의 종양, 예를 들어, 종양이, 예를 들어, 종양 생검물의 시험관내 검정을 사용하거나 종양 시퀀싱에 의해, 요법에 내성인 것으로 결정된 종양일 수 있다. 또한, 내성 종양은 돌연변이와 같은 특징, 또는 요법에 내성임을 나타내는 단계를 갖는 종양일 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의해 전달된 치료제는 자유롭게 전달된, 즉, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의하지 않고 전달된 동일한 치료제보다 더 효능이 있고, 예를 들어, 그 치료제에 의한 치료에 내성인 종양을 치료하는 데 유용하다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의해 전달된 치료제는 상이한 치료제에 의한 치료에 내성인 종양을 치료하기 위해 투여된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포에 의한 치료는 내성 전에 개시된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포에 의한 치료는 내성 후에 개시된다.
본원에 사용되는 "불응성" 종양은, 요법으로 치료 되었으나 적절한 반응을 보이지 않은, 예를 들어, 환자가 치료 후에 무반응(NR) 또는 진행성 질병(PD)을 갖는 것으로 분류된 종양을 나타낸다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의해 전달되는 치료제는 자유롭게 전달된, 즉, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의하지 않고 전달된 동일한 치료제보다 더 효능이 있고, 예를 들어, 그 치료제에 불응성이거나 불응성이 된 종양을 치료하는 데 유용하다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의해 전달되는 치료제는 상이한 치료제에 불응성이거나 불응성이 된 종양을 치료하기 위해 투여된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포에 의한 치료는 종양이 불응성이 되기 전에 개시된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포에 의한 치료는 종양이 불응성이 된 후에 개시된다.
본원에 사용되는 "재발된" 종양은 관해(예를 들어, 요법에 의한 치료 후, 예를 들어, 완전한 반응 또는 부분적 반응) 상태가 된 후 진행되는 종양을 나타낸다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의해 전달되는 치료제는 자유롭게 전달된, 즉, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의하지 않고 전달된 동일한 치료제보다 더 효능이 있고, 예를 들어, 그 치료제에 의한 치료 후에 재발된 종양을 치료하는 데 유용하다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포에 의해 전달되는 치료제는 상이한 치료제에 의한 치료 후에 재발된 종양을 치료하기 위해 투여된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포에 의한 치료는 관해 동안 개시된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포에 의한 치료는 재발 후에 개시된다.
본원에 사용되는 "종양"은 제어되지 않은 성장을 갖는 복수의 비정상 세포를 나타낸다. "종양" 및 "암"이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 예를 들어, 두 용어 모두 고형 및 액체, 예를 들어, 확산성 또는 순환성 종양을 포함한다. 일 구현예에서, 암 또는 종양은 악성전이다. 일 구현예에서, 암 또는 종양은 악성이다. 다양한 암의 예는 본원에 기재되어 있고, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "종양 세포" 및 "암세포"는 종양 또는 암의 세포를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 "암 항원"과 상호 교환적으로 사용되는 "종양 항원"은 종양 세포에 포함되는, 예를 들어, 종양의 표면에 존재하는 모이어티(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)를 나타낸다. 구현예들에서, 종양 항원은 하나 이상의 유형의 비암성 세포(예를 들어, 암에 걸린 대상체 내의 비암성 세포) 상에, 예를 들어, 동일한 수준 또는 상이한 수준으로 또한 존재한다. 일 구현예에서, 종양 항원은 비-종양 세포 상에서보다 종양 세포 상에서 더 많은 평균 개수로 존재한다. 구현예들에서, 항원은 종양 세포 상에 존재하는 폴리펩티드 또는 이의 일부이다. 항원은 결합 파트너, 예를 들어, 항체 또는 비-항체 결합 파트너에 의해 결합될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 폴리펩티드의 "변이체"는 상기 폴리펩티드에 비해 적어도 하나의 서열 차이, 예를 들어, 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 변이체는 그 폴리펩티드와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는다. 변이체는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 단편은 전장 폴리펩티드에 비해 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두(각각 독립적)에 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 100개의 아미노산이 결여되어 있다.
종양과 관련하여 본원에 사용되는 "혈관이 분포된"은 혈관신생을 유도하고/하거나 종양 혈관을 포함하는 종양을 나타낸다. 종양 혈관은 정상 혈관과 다르며 조직학에 의해, 예를 들어, 불규칙한 형태 및 확장에 의해 구별될 수 있고; 종양 세포 및 내피 세포를 포함할 수 있다.
외인성 단백질
외인성 단백질 중 하나 이상은 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 특징적인 번역후 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질 중 하나 이상은 당화되거나, 인산화되거나, 당화 및 인산화된다. 당단백질의 시험관 내 검출은 과요오드산-쉬프(Periodic acid-Schiff)(PAS) 방법의 변형을 이용하여 SDS-PAGE 젤 및 웨스턴 블롯에서 일상적으로 달성된다. 당단백질의 세포 국소화는 당 분야에 공지된 렉틴 형광 컨쥬게이트를 이용하여 달성될 수 있다. 인산화는 포스포-특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다.
번역후 변형은 또한 소수성 기에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 프레닐화, 또는 글리피화), 보조인자에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 리포일화(lipoylation), 플라빈 모이어티(예를 들어, FMN 또는 FAD), 헴 C 부착, 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation), 또는 레티닐리덴 쉬프 염기 형성), 디프타미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 하이푸신(hypusine) 형성, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, 또는 S-아실화), 포르밀화, 아세틸화, 알킬화(예를 들어, 메틸화 또는 에틸화), 아미드화, 부티릴화, 감마-카르복실화, 말로닐화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 예를 들어, ADP-리보실화, 산화, 포스페이트 에스테르(O-결합) 또는 포스포르아미데이트(N-결합) 형성(예를 들어, 인산화 또는 아데닐릴화), 프로피오닐화, 피로글루타메이트 형성, S-글루타티오닐화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황산화, ISG화(ISGylation), 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화, 네딜화(Neddylation), 또는 아미노산의 화학적 변형(예를 들어, 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화(eliminylation), 또는 카르바밀화), 이황화 브릿지의 형성, 라세미화(예를 들어, 프롤린, 세린, 알라닌, 또는 메티오닌의 라세미화)를 포함한다. 구현예들에서, 당화는 당단백질을 발생시키는 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 트립토판으로의 글리코실기의 첨가를 포함한다. 구현예들에서, 당화는, 예를 들어, O-결합 당화 또는 N-결합 당화를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드는 길이가 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 아미노산이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 길이가 200 내지 300개, 300 내지 400개, 400 내지 500개, 500 내지 600개, 600 내지 700개, 또는 700 내지 800개 아미노산이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 길이가 500, 450, 400, 350, 또는 300개 미만의 아미노산이다.
구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 적어도 1,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 50,000, 100,000, 200,000, 또는 500,000개 카피의 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 약 200,000개, 150,000 내지 250,000개, 100,000 내지 300,000개, 또는 200,000 내지 300,000개 카피의 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함한다.
구현예들에서, 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드는 다량체, 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 육량체를 형성한다. 구현예들에서, (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는) 외인성 폴리펩티드는 삼량체, 예를 들어, 적혈구 세포의 표면에 있는 삼량체를 형성한다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 본원에 기재된 종양 항원, 예를 들어, 표 1의 종양 항원에 결합하는 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 표면-노출된 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 막횡단 도메인을 포함하는 표면-노출된 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 표 1 또는 표 2의 항체 또는 다른 결합제, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체에 상응하는 단일 도메인 항체, 예를 들어, scFv일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어, 경쇄 가변 단편, 중쇄 가변 단편, 또는 둘 모두일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 결합제의 활성 단편일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 항체, 예를 들어, 표 1 또는 표 2의 항체 또는 경쇄 가변 단편, 중쇄 가변 단편, 또는 둘 모두와 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 항체일 수 있다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체와 동일한 CDR을 가질 수 있지만, 프레임워크 및/또는 불변 영역에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 결합제와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 결합제, 예를 들어, 표 1 또는 표 2의 결합제 또는 이의 활성 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 결합제일 수 있다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 융합 단백질, 예를 들어, 내인성 적혈구 단백질 또는 이의 단편과의 융합체이다. 구현예들에서, 외인성 폴리펩티드는 막횡단 단백질, 예를 들어, 타입 I, 타입 II, 또는 타입 III 적혈구 막횡단 단백질 또는 이의 막횡단 단편을 포함한다. 구현예들에서, 막횡단 단백질은 GPA 또는 이의 막횡단 단편이다.
구현예들에서, 막횡단 도메인은 GPA 또는 이의 막횡단 부분, 예를 들어, 본원의 SEQ ID NO:1에 기재된 바와 같은 GPA 또는 이의 막횡단 부분, 또는 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, GPA 폴리펩티드는 결합 도메인의 C-말단이다. 구현예들에서, GPA 폴리펩티드는 다음과 같은 서열 또는 이의 막횡단 부분을 갖거나, 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드이다: LSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQ ID NO:1) 구현예들에서, GPA 폴리펩티드는 항체 도메인의 C- 말단이다.
구현예들에서, 외인성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:80 또는 SEQ ID NO:81의 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 구현예들에서, 4-1BBL의 기능적 단편은 4-1BB 결합 단편이다. 구현예들에서, 항-PD-L1의 기능적 단편은 PD-L1 결합 단편이다.
일 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 아폽토시스를 매개하는 세포 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 리간드는 TRAIL 수용체 리간드, 예를 들어, 야생형 또는 돌연변이 TRAIL 폴리펩티드, 또는 TRAIL 수용체에 결합하고 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 항체이다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 하나 이상의(예를 들어, 2 또는 3개의) TRAIL 수용체 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 TRAIL 수용체 리간드를 포함하는 제핵 적혈구 세포는 표적화 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 모이어티를 추가로 포함한다.
TRAIL(TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드)은 아폽토시스를 유도하는 TNF 패밀리의 일원이다. TRAIL은 적어도 2개의 수용체 TRAIL R1 및 TRAIL R2를 갖는다. TRAIL 수용체 효능제, 예를 들어, 수용체 중 하나 이상에 결합하는 TRAIL의 돌연변이체, 또는 TRAIL R1 또는 TRAIL R2 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 항체(예를 들어, 문헌[Gasparian et al., Apoptosis 2009 Jun 14(6), Buchsbaum et al. Future Oncol 2007 Aug 3(4)] 참조)가 광범위한 암에 대한 임상 요법으로 개발되었다. 구현예들에서, 제핵 적혈구 세포는 TRAIL R1 리간드 및 TRAIL R2 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 TNF 수퍼패밀리의 일원 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 사멸 수용체 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2) 중 하나 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 TNFRSF10A/TRAILR1, TNFRSF10B/TRAILR2, TNFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF10D/TRAILR4, 또는 TNFRSF11B/OPG 중 하나 이상에 결합한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 MAPK8/JNK, 카스파제 8, 및 카스파제 3 중 하나 이상을 활성화한다.
일부 구현예에서, TRAIL 폴리펩티드는 본원의 SEQ ID NO:2 내지 6 중 임의의 SEQ ID NO의 서열, 또는 이와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 TRAIL 효능제이다. 서열 동일성은, 예를 들어, BLAST(기본 로컬 정렬 검색 도구)에 의해 측정된다. SEQ ID No. 2 내지 6는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Mohr et al. BMC Cancer (2015) 15:494]에 추가로 기재된다.
SEQ ID NO:2
가용성 TRAIL 변이체 DR4-1
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRRRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
SEQ ID NO:3
가용성 TRAIL 변이체 DR4-2
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRRGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
SEQ ID NO:4
가용성 TRAIL 변이체 DR4-3
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRRRSNTLSSPNSKNEKALGIKINSWESSRRGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTDYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
SEQ ID NO:5
가용성 TRAIL 변이체 DR5-1
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMHHEASFFGAFLVG
SEQ ID NO:6
가용성 TRAIL 변이체 DR5-2
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQERIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMHHEASFFGAFLVG
일부 구현예에서, TRAIL 수용체 리간드는 항체, 예를 들어, 항체 단편을 포함한다. 구현예들에서, 항체는 TRAIL R1 및 TRAIL R2 중 하나 또는 둘 모두를 인식한다. 항체는, 예를 들어, 마파투무맙(인간 항-DR4 mAb), 티가투주맙(인간화된 항-DR5 mAb), 렉사투무맙(인간 항-DR5 mAb), 코나투무맙(인간 항-DR5 mAb), 또는 아포맙(인간 항-DR5 mAb)일 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 TRAIL 수용체에 결합하는 적어도 하나의 항체 및 적어도 하나의 TRAIL 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 표적화 활성을 갖는 결합제를 포함한다. 구현예들에서, 결합제는 또한 항암 활성을 가지며, 예를 들어, 동일한 외인성 폴리펩티드는 항암제 및 표적화 제제다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 제2 제제, 예를 들어, 항암 활성을 갖는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, 표적화 제제는 암세포, 예를 들어, 고형 종양 세포 또는 그 근처에 결합하고, 제2 제제(예를 들어, 제2 폴리펩티드)는 항암 기능을 갖는다. 일부 구현예에서, 작용 부위는 종양 혈관구조이다. 구현예들에서, 표적화 제제는 신생혈관구조의 마커에 결합하고, 예를 들어, 인테그린, 예를 들어, avB1, avB3, 또는 avB5, 또는 a4b1 인테그린, 예를 들어, 합성 펩티드 크노틴(knottin)(Kim et al, JACS 2016, 137(1)) 또는 내인성 또는 천연 리간드, 예를 들어, 에키스타틴(echistatin), RGD, EETI2.5F, 또는 VCAM-1에 결합하거나, 신생혈관구조에서 또한 풍부하게 발견되는 전립선-특이적 막 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 제제는 암세포 마커, 예를 들어, CD269(예를 들어, 다발골수종 세포에서 발현됨) 또는 CD123(예를 들어, ALM 세포에서 발현됨), CD28(예를 들어, T 세포에서 발현됨; CD28은 CD80/CD86에 의해 결합될 수 있음), NY-ESO-1(예를 들어, 난소암에서 발현됨)에 결합한다.
구현예들에서, 항암제는 성장하기 위해 종양 세포에 의해 선택적으로 요구되는 대사물을 분해하는 효소, 예를 들어, 아스파라기나제, 메티오닌 감마 리아제(MGL), 세린 데하이드로게나제, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 항암제는 혈관신생의 억제제, 예를 들어, 혈관의 성장을 추가로 방지하기 위한 안지오포이에틴의 억제제 또는 VEGF 또는 VEGFR의 억제제일 수 있다. 항암제는 T 세포를 활성화시키는 면역자극 분자, 예를 들어, 보조 자극 분자(예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자), 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 표 4 참조) 또는 사이토카인 또는 T 세포 활성화 리간드일 수 있다. 항암제는 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 또는 염증 대식세포에 결합할 수 있고, 효과기 세포를 포획하고, 종양에 근접시킬 수 있다. 항암제는 세포 사멸의 직접 매개체, 예를 들어, TRAIL 또는 FAS-L 또는 다른 사멸 리간드, 또는 독소일 수 있다. 일부 구현예에서, 항암제는 TRAIL 수용체의 효능제, 예를 들어, 효능제 항체를 포함한다. 구현예들에서, 항암제는 아폽토시스-촉진제이다. 구현예들에서, 항암제는 애쥬번트를 포함한다. 이들 항암제 중 임의의 치료제에 대해, 최종 결과는 종양 부위에 국소화되고, 이에 따라 효능을 증가시키는 위치에 항-종양 효과를 집중시키는 적혈구 치료제(RCT)이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 면역 체크포인트 분자를 억제한다. 구현예들에서, 외인성 폴리펩티드는 적혈구 세포의 표면에 위치하며(예를 들어, 막횡단 부분 및 표면-노출된 부분을 포함함) 면역 체크포인트 분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 면역 체크포인트 분자를 억제한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 억제 항체(예를 들어, 항체, 예컨대, 일특이적 항체, 모노클로날 항체, 또는 단일쇄 항체)이다. 항체는, 예를 들어, 인간화 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 다른 구현예들에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 융합 단백질, 예를 들어, Fc- 수용체 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 면역 체크포인트 단백질과 상호작용하는 제제, 예컨대, 항체이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 면역 체크포인트 수용체의 리간드와 상호작용하는 제제, 예컨대, 항체이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 CTLA-4의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, 항-CTLA4 항체, 예컨대, 이필리무맙/예르보이(Yervoy) 또는 트레멜리무맙)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PD-1의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, 니볼루맙/Opdivo®; 펨브롤리주맙/Keytruda®; 피딜리주맙/CT-011)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PD-L1의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, MPDL3280A/RG7446; MEDI4736; MSB0010718C; BMS 936559)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PDL2의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 Fc 융합체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, PDL2/Ig 융합 단백질, 예컨대, AMP 224)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 B7-H3(예를 들어, MGA271), B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제), 또는 이들의 조합물이다.
면역 체크포인트 분자의 억제제는 적어도 4개의 주요 범주로 나누어질 수 있다: i) T 세포 또는 자연살(NK) 세포 상에서 직접 억제 경로를 차단하는 항체와 같은 제제(예를 들어, PD-1 표적화 항체, 예를 들어, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙, TIM-3을 표적으로 하는 항체, 및 LAG-3, 2B4, CD160, A2aR, BTLA, CGEN-15049, 또는 KIR을 표적으로 하는 항체), ii) T 세포 또는 NK 세포 상에서 직접 자극 경로를 활성화시키는 항체와 같은 제제(예를 들어, OX40, GITR, 또는 4-1BB를 표적으로 하는 항체), iii) 면역 세포 상에서 억제 경로를 차단하거나, 면역 세포의 억제 집단을 고갈시키기 위해 항체-의존성 세포 세포독성에 의존하는 항체와 같은 제제(예를 들어, CTLA-4 표적화 항체, 예컨대, 이필리무맙, VISTA를 표적으로 하는 항체, 및 PD-L2, Gr1, 또는 Ly6G를 표적으로 하는 항체), 및 iv) 암세포 상에서 직접 억제 경로를 차단하거나, 암세포에 대한 세포독성을 향상시키기 위해 항체-의존성 세포 세포독성에 의존하는 항체와 같은 제제(예를 들어, 리툭시맙, PD-L1을 표적으로 하는 항체, 및 B7-H3, B7-H4, Gal-9, 또는 MUC1을 표적으로 하는 항체). 본원에 기재된 이러한 제제는, 예를 들어, 문헌[Templeton, Gene and Cell Therapy, 2015; Green and Sambrook, Molecular Cloning, 2012]에 기술된 바와 같이 설계되고 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 표 4의 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 표면-노출된 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 막횡단 도메인을 포함하는 표면-노출된 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 표 4의 항체 또는 다른 결합제, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 4의 항체에 상응하는 단일 도메인 항체, 예를 들어, scFv일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 4의 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어, 경쇄 가변 단편, 중쇄 가변 단편, 또는 둘 모두일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 4의 결합제의 활성 단편일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 4의 항체와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 항체, 예를 들어, 표 4의 항체 또는 경쇄 가변 단편, 중쇄 가변 단편, 또는 둘 모두와 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 항체일 수 있다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 4의 항체와 동일한 CDR을 가질 수 있지만, 프레임워크 및/또는 불변 영역에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 4의 결합제와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 결합제, 예를 들어, 표 4의 결합제 또는 이의 활성 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 결합제일 수 있다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 표 5의 보조 자극 분자 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 표면-노출된 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 막횡단 도메인을 포함하는 표면-노출된 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 표 5의 보조 자극 분자 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 5의 보조 자극 분자와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 단백질 서열, 예를 들어, 보조 자극 분자와 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 보조 자극 분자일 수 있다. 구현예들에서, 단편 또는 변이체는 보조 자극 분자의 아이소형, 예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자의 아이소형 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 구현예들에서, 단편 또는 변이체는 표 5의 보조 자극 분자의 성숙한 형태이며, 예를 들어, 표 5의 보조 자극 분자의 가공된 형태의 서열을 갖는다.
구현예들에서, 보조 자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) , ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137), CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, 및 CD19a,또는 이의 단편 또는 변이체 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 예로서, 적혈구 세포는, 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)와 암세포를 서로 근접시켜서 면역 효과기 세포에 의해 암세포의 사멸을 촉진한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 암세포의 세포 표면 마커에 결합하고, 제2 폴리펩티드는 면역 효과기 세포의 세포 표면 마커에 결합한다. 제1 및 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 항체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암세포 마커는 CD19(예를 들어, B 세포 급성 백혈병에서 발현됨), EpCAM(예를 들어, CTC에서 발현됨), CD20(예를 들어, B 세포 급성 백혈병에서 발현됨), CD45(예를 들어, CTC에서 발현됨), EGFR, HER2(예를 들어, 유방암세포에서 발현됨)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 세포 마커는 CD3이다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 대한 비히클
본원의 많은 구현예들에서 하나 이상의 외인성 폴리펩티드가 적혈구 세포 상 또는 내에 위치되는 한편, 본원에 기재된 임의의 외인성 폴리펩티드(들)는 또한 또 다른 비히클 상 또는 내에 위치될 수 있음이 이해된다. 비히클은, 예를 들어, 세포, 적혈구 세포, 소체, 나노입자, 마이셀, 리포솜, 또는 엑소좀을 포함할 수 있다. 비히클은, 예를 들어, 직경이 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1,000 nm, 1,500 nm, 2,000 nm, 또는 2,500 nm보다 큰 나노 입자 또는 입자와 같은 입자일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 발명의 개시는, 예를 들어, 표면 상에 본원에 기재된 하나 이상의 제제를 포함하는 비히클(예를 들어, 세포, 적혈구 세포, 소체, 나노입자, 마이셀, 리포솜, 또는 엑소좀)을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 표 2, 표 4, 또는 표 5 중 임의의 표의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 이의 효능제 또는 길항제, 또는 이에 대한 항체로부터 선택된 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 비히클은 본원에 기재된 2개 이상의 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 제제 중 임의의 쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 비히클은 적혈구 세포를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 유핵 적혈구, 적혈구 전구세포, 또는 제핵 적혈구이다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 일반 골수성 전구세포(CMP) 세포, 배반포 콜로니-형성 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 거핵세포-적혈구 전구세포(MEP) 세포, 적혈구 콜로니-형성 단위(CFU-E), 그물적혈구, 적혈구, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염적혈모구, 정염적혈모구, 또는 이들의 조합물이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 무한증식 또는 무한증식화 세포이다. 일부 구현예에서, 비히클은 면역 효과기 세포, 예를 들어, B 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 또는 동종 세포이다.
불균일한 세포의 집단
본원의 많은 구현예들에서 하나 이상의(예를 들어, 2개 이상의) 외인성 폴리펩티드가 단일 세포 상 또는 내에 위치되는 한편, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 조합물은 또한 복수의 세포 상에 위치될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 복수의 적혈구 세포를 제공하며, 복수의 제1 세포는 제1 외인성 폴리펩티드를 포함하고, 복수의 제2 세포는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 세포는 본원에 기재된 2개 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드 중 임의의 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 집단 내의 세포의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 또는 1%는 제1 외인성 폴리펩티드와 제2 외인성 폴리펩티드 둘 모두를 포함한다.
막 내에 캡슐화된 세포
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포 또는 본원에 기재된 다른 비히클은 막, 예를 들어, 반-투과성 막 내에 캡슐화된다. 구현예들에서, 막은 다당류, 예를 들어, 음이온성 다당류 알기네이트를 포함한다. 구현예들에서, 반투과성 막은 세포가 통과하는 것을 허용하지 않지만, 작은 분자 또는 거대분자, 예를 들어, 대사물, 단백질, 또는 DNA의 통과는 허용한다. 구현예들에서, 막은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Lienert et al., "Synthetic biology in mammalian cells: next generation research tools and therapeutics" Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95-107 (2014)]에 기재된 것이다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 막은 세포를 면역계로부터 차폐하고/차폐하거나 복수의 세포를 근접하게 유지시켜, 서로 또는 서로의 생성물과의 상호작용을 촉진한다.
제핵 적혈구 세포의 물리적 특징
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포는 본원에 기재된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 물리적 특징, 예를 들어, 삼투 취약성, 세포 크기, 헤모글로빈 농도, 또는 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 외인성 단백질을 발현하는 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 유사한 물리적 특징을 갖는다. 대조적으로, 저장성으로 로딩된 적혈구 세포는 때때로 비정상적인 물리적 특징, 예를 들어, 증가된 삼투 취약성, 변경된 세포 크기, 감소된 헤모글로빈 농도, 또는 세포막의 외엽 상에서의 증가된 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 세포에 의해 보유되지 않거나, 정제되지 않았거나, 적혈구 세포 외부에 완전히 존재하지 않는 외인성 핵산에 의해 인코딩된 외인성 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 안정제가 결여된 조성물에 존재한다.
삼투 취약성
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 외인성 폴리펩티드를 포함하지 않는 분리된 배양되지 않은 제핵 적혈구 세포와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 삼투 취약성은, 일부 구현예에서, WO2015/073587호의 실시예 59의 방법을 이용하여 결정된다.
세포 크기
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 대략적인 직경 또는 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 약 4, 5, 6, 7, 또는 8 마이크론의 평균 직경을 갖고, 선택적으로 집단의 표준 편차는 1, 2, 또는 3 마이크론 미만이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 적혈구 세포는 약 4 내지 8, 5 내지 7, 또는 약 6 마이크론의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 직경은 약 1 마이크론 미만, 약 20 마이크론 초과, 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 4 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 6 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론 또는 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론이다. 세포 직경은 일부 구현예에서 Advia 120 혈액학 시스템을 이용하여 측정된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적의 용적은 10 fL, 20 fL, 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL 초과, 또는 150 fL 초과이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적은 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL, 160 fL, 170 fL, 180 fL, 190 fL, 200 fL 미만, 또는 200 fL 미만이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적은 80 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 400 내지 500 펨토리터(fL)이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 본 단락에 기재된 평균 적혈구 용적을 가지며, 집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2 fL 미만이다. 평균 적혈구 용적은 일부 구현예에서 혈액학적 분석 장치, 예를 들어, 쿨터 계수기(Coulter counter)를 이용하여 측정된다.
헤모글로빈 농도
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 유사한 헤모글로빈 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 초과 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30 pg, 선택적으로 최대 약 30 pg의 전체 헤모글로빈을 포함한다. 헤모글로빈 수준은 일부 구현예에서 WO2015/073587호의 실시예 33의 드랍킨 시약(Drabkin's reagent) 방법을 이용하여 결정된다.
포스파티딜세린 함량
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 대략적으로 동일한 세포막의 외엽 상의 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 포스파티딜세린은 주로 야생형의 미처리된 적혈구 세포의 세포막의 내엽에 존재하며, 저장성 로딩은 포스파티딜세린이 외엽에 분포하도록 할 수 있으며, 여기서 이는 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 아넥신 V 염색에 대해 양성인 약 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 세포를 포함한다. 포스파티딜세린 노출은, 일부 구현예에서, 예를 들어, WO2015/073587호의 실시예 54의 방법을 이용하여 PS에 우선적으로 결합하는 아넥신-V-FITC에 대한 염색 및 유동세포분석법에 의한 FITC 형광 측정에 의해 평가된다.
다른 특징
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 GPA에 대해 양성인 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%(선택적으로, 최대 90 또는 100%)의 세포를 포함한다. GPA의 존재는 일부 구현예에서 FACS를 이용하여 검출된다.
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 대상체에서 적어도 30, 45, 또는 90일의 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포를 포함하는 세포의 집단은 약 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 톱니적혈구를 포함한다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 제핵된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 적혈구 세포는 비기능성인, 예를 들어, 비활성화된 핵을 함유한다.
만능 공여자 적혈구 세포
일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 세포가 투여될 대상체에 대해 자가이고/자가이거나 동종이다. 예를 들어, 대상체에 대해 동종인 적혈구 세포는 하나 이상의 혈액형 특이적 적혈구 세포(예를 들어, 세포는 대상체와 동일한 혈액형일 수 있음) 또는 하나 이상의 만능 공여자 적혈구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포는 기준 세포와 비교하여 감소된 면역원성을 가지며, 예를 들어, 낮은 하나 이상의 혈액군 항원의 수준을 갖는다.
동종 세포가 수혈에 사용되는 경우, 호환 가능한 ABO 혈액군이 선택되어 급성 혈관내 용혈 수혈 반응을 방지할 수 있다. ABO 혈액형은 적혈구의 표면 상의 혈액형 항원 A 및 B, 당단백질 및 당지질과 관련된 올리고당 사슬의 말단에서 발견되는 단당류 탄수화물 구조의 존재 또는 부재에 기초하여 정의된다(문헌 [Liu et al., Nat.Biotech.25:454-464 (2007)]에서 검토됨). O군 적혈구는 A 항원이나 B 항원을 함유하지 않기 때문에 임의의 ABO 혈액군의 수령자, 예를 들어, A군, B군, AB군, 또는 O군 수령자에게 안전하게 수혈될 수 있다. O군 적혈구는 만능으로 간주되며, 모든 수혈에서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 O형이다. 대조적으로, A군 적혈구 세포는 A군 및 AB군 수령자에게 주어질 수 있고, B군 적혈구 세포는 B군 및 AB군 수령자에게 주어질 수 있고, AB군 적혈구 세포는 AB 수령자에게 주어질 수 있다.
일부 경우에, O군이 아닌 적혈구 세포를 만능 혈액형으로 전환하는 것이 유익할 수 있다. A군 및 B군 적혈구의 표면 상의 면역우성 단당류의 효소적 제거는 O군-유사 적혈구 세포의 집단을 생성시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Liu et al., Nat. Biotech.25:454-464 (2007)] 참조). B군 적혈구 세포는 커피 생두로부터 유래된 α-갈락토시다제를 사용하여 전환될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 이. 메닝고셉티쿰(E. meningosepticum) 박테리아로부터 유래된 α-N-아세틸갈락토사미니다제 및 α-갈락토시다제 효소 활성은, 적혈구 세포 상에 존재하는 경우, 각각 면역우성 A 및 B 항원을 제거하는 데 사용될 수 있다(문헌[Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)]). 일 예에서, 본원에 기술된 바와 같이 분리된 패킹된 적혈구 세포는 α-N-아세틸갈락토사미니다제 및 α-갈락토시다제(패킹된 적혈구 세포 ml당 약 300 ㎍)의 존재 하에서 200 mM 글리신(pH 6.8) 및 3 mM NaCl 중에서 26℃에서 60분 동안 인큐베이션된다. 처리 후, 적혈구 세포는 원심 분리를 사용한 식염수 중에서의 3회 내지 4회 린스에 의해 세척되고, 표준 혈액 뱅킹 기술에 따라 ABO형이 판별된다.
ABO 혈액군 시스템은 수혈 및 이식에서 가장 중요한 한편, 일부 구현예에서, 투여될 적혈구 세포와 수령자 사이의 다른 혈액군들을 일치시키거나 하나 이상의 다른(예를 들어, 소수의) 혈액군에 대해 만능인 적혈구 세포를 선택하거나 제조하는 것이 유용할 수 있다. 제2 혈액군은 개체가 Rh+ 또는 Rh-일 수 있는 Rh 시스템이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 Rh-이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 O형 및 Rh-이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 1개 이상의 소수 혈액군 항원에 대해 음성, 예를 들어, Le(a-b-)(루이스 항원 시스템의 경우), Fy(ab-)(Duffy 시스템의 경우), Jk(a-b-)(Kidd 시스템의 경우), M-N-(MNS 시스템의 경우), K-k-(Kell 시스템의 경우), Lu(a-b-)(Lutheran 시스템의 경우), 및 H-항원 음성(봄베이(Bombay) 표현형), 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 또한 O형 및/또는 Rh-이다. 소수 혈액군은, 예를 들어, 문헌[Agarwal et al "Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north India" Blood Res. 2013 Mar; 48(1): 51-54] 및 문헌[Mitra et al "Blood groups systems" Indian J Anaesth. 2014 Sep-Oct; 58(5): 524-528]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함되어 있다.
제핵 적혈구 세포를 제조하는 방법
외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구 세포를 제조하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 조혈 전구 세포는 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 핵산들과 접촉되며, 세포는 배양시 확장되고 분화된다.
핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있다. 레트로바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 렌티바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV 1), 및 스푸마바이러스, 예를 들어, 거품형성 바이러스를 예로서 포함하는 다수의 바이러스가 유전자 전달 비히클로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 포함되는 WO2014/183071호 또는 WO2014/183066호에 기재된 바와 같은, 컨쥬게이션, 예를 들어, 소르태깅(sortagging)을 이용하여 생성된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 적어도 1000, 2000, 5000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000배(선택적으로, 최대 100,000, 200,000, 또는 500,000배) 확장된다. 세포의 수는 일부 구현예에서 자동화 세포 계수기를 이용하여 측정된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98%(선택적으로, 최대 약 80, 90, 또는 100%)의 제핵 적혈구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 1% 미만의 살아 있는 제핵 세포를 함유하고, 예를 들어, 검출 가능한 살아 있는 제핵 세포를 함유하지 않는다. 제핵은 일부 구현예에서 핵 염색을 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(선택적으로, 최대 약 70, 80, 90, 또는 100%)의 적혈구 세포는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 발현은 일부 구현예에서 폴리펩티드에 대한 표지된 항체를 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(선택적으로, 최대 약 70, 80, 90, 또는 100%)의 적혈구 세포는 제핵되고, 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 약 1x109 내지 2x109, 2x109 내지 5x109, 5x109 내지 1x1010, 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 1x1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 1x1012, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 5x1012, 또는 5x1012 내지 1x1013개의 세포를 포함한다.
본원의 조성물, 예를 들어, 적혈구 세포를 이용한 처리 방법
외인성 제제(예를 들어, 폴리펩티드)를 포함하는(예를 들어, 발현하는) 적혈구 세포를 투여하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.
구현예들에서, 본원에 기재된 제핵 적혈구는 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에게 투여된다. 치료될 수 있는 예시적 포유동물은 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험용 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의 적용 둘 모두에 적용 가능하다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월마다 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 용량은 약 1x109 내지 2x109, 2x109 내지 5x109, 5x109 내지 1x1010, 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 1x1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 1x1012, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 5x1012, 또는 5x1012 내지 1x1013개의 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 제핵 적혈구를 본원에 기재된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 암, 예를 들어, 본원에 기재된 암이다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 적혈구 세포의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 적혈구 세포의 용도를 제공한다.
암의 유형은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 항문암, 담관암, 방광암, 뼈암, 장암, 뇌종양, 유방암, 공지되지 않은 원발성 암, 뼈로 전이된 암, 뇌로 전이된 암, 간으로 전이된 암, 폐로 전이된 암, 유암종, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 안구암, 담낭암, 위암, 임신 융모 종양(GTT), 털세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, B-세포 림프종, 흑색종 피부암, 중피종, 남성암, 기태 임신, 구강암 및 입인두암, 골수종, 비강암 및 부비동암, 코인두암, 비-호지킨 림프종(NHL), 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 희귀암, 직장암, 타액선암, 속발성 암, 피부암(비-흑색종), 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 공지되지 않은 원발성 암, 자궁암, 질암, 및 외음부암을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 고도로 면역원성인 암이며, 예를 들어, 암은 (예를 들어, 암 생검물의 분석에 의해 결정된 바와 같이) 다음 특징 중 하나 이상을 갖는다: (a) 종양 침윤 림프구(TIL), 예를 들어, 1,000개 종양 세포당 적어도 1, 5, 10, 100개 TIL; (b) 돌연변이, 예를 들어, 종양 게놈 DNA의 메가염기(megabase)당 0.1개 이상의 체세포 돌연변이; (c) 신생 항원, 예를 들어, 신생 항원의 가공되고 제시된 모이어티를 인식하는 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 및/또는 하나 이상의 이디오타입 클론을 갖는 1개 이상의 신생 항원; (d) 3차 림프양 구조물; (e) 염증 유전자 발현의 높은 발현, 예를 들어, 비-암성 조직에서의 기준선 발현보다 높은 2배 증가된 사이토카인의 발현; 및 (f) 면역억제 표현형을 나타내는 면역 세포, 예를 들어, 사이토카인 발현이 결여된 수지상 세포. 암의 이러한 특징들을 평가하는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Clin Cancer Res. 2000 May;6(5):1875-81]; 문헌[Nature. 2013 Aug 22;500(7463):415-21. doi: 10.1038/nature12477. Epub 2013 Aug 14]; 문헌[Nature. 2014 Nov 27;515(7528):577-81. doi: 10.1038/nature13988]; 문헌[Trends Immunol. 2014 Nov;35(11):571-80. doi: 10.1016/j.it.2014.09.006. Epub 2014 Oct 22]; 문헌[Front Immunol. 2013 Dec 11;4:438. doi: 10.3389/fimmu.2013.00438]; 문헌[Eur J Cancer. 2009 Jan;45(2):228-47. doi: 10.1016/j.ejca.2008.10.026] 참조).
일부 구현예에서, 종양 세포는 원발성 종양에 존재한다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 순환 종양 세포가 아닌 것이다.
일부 구현예에서, 종양은 표 8의 유전자에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표 8의 유전자에서의 돌연변이는 표 8의 세 번째 칼럼에 명시된 돌연변이이다. 구현예들에서, 암은 적어도 2개의 상이한 돌연변이, 예를 들어, 표 8 내의 유전자에서의 돌연변이(예를 들어, 표 8의 세 번째 컬럼에 명시된 돌연변이) 및 제2 돌연변이를 포함한다. 구현예들에서, 제2 돌연변이는 표 8 내의 유전자의 돌연변이, 예를 들어, 표 8 의 세 번째 컬럼에 명시된 돌연변이이다. 구현예들에서, 종양 내의 일부 세포는 돌연변이를 포함하고, 다른 세포는 돌연변이를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 종양은 p53-null 세포를 포함하지 않는다. 구현예들에서, 종양을 갖는 환자는 p53-null 돌연변이에 대해 이형접합성이 아니다.
종양 돌연변이 상태는 PCR, 마이크로어레이, 또는 핵산 시퀀싱, 예를 들어, 고처리량 DNA 시퀀싱과 같은 다수의 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 종양은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된 종양 항원을 포함한다: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 일컬어짐); C-형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac (2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 일원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나아제-유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양-관련 당 단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Rα); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나아제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 전립선; 전립선 산성 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이(ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체), 탄산 탈수효소 IX(CAIX); 프로테아솜(프로솜(Prosome), 마크로파인(Macropain)) 서브유닛, 베타 타입, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 브레이크포인트(breakpoint) 클러스터 영역(BCR) 및 아벨손(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Ab1)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량-흑색종-관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-결합 수용체 클래스 C 그룹 5, 일원 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드의 헥사사카라이드 부분(GloboH); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 우로플라킨(uroplakin) 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 파넥신(pannexin) 3(PANX3); G 단백질-결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 올터네이트(Alternate) 리딩 프레임 단백질(TARP); 윌름즈(Wilms) 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 일원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인(prostein); 서바이빈(survivin); 텔로머라아제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴(Galectin) 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT); 육종 전좌 브레이크포인츠(breakpoints); 아폽토시스의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막횡단 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 일원 C(RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질)-유사(BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 브라더(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)), T 세포 3에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원(SART3); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신(proacrosin) 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 브레이크포인트 2(SSX2); 진행된 당화 최종생성물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1(RU1); 신장 유비쿼터스 2(RU2); 레구마인(legumain); 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 창자 카르복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 일원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 일원 f(CD300LF); C-타입 렉틴 도메인 패밀리 12 일원 A(CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸(Glypican)-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1)을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양은 표 1 또는 표 2의 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 요법에 내성이며, 예를 들어, 그 요법으로 처리되고 이에 반응하지 않는다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체에 상응하는 단일 도메인 항체, 예를 들어, scFv일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어, 경쇄 가변 단편, 중쇄 가변 단편, 또는 둘 모두일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 결합제의 활성 단편일 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 항체, 예를 들어, 표 1 또는 표 2의 항체 또는 경쇄 가변 단편, 중쇄 가변 단편, 또는 둘 모두와 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 항체일 수 있다. 예를 들어, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 항체와 동일한 CDR을 가질 수 있지만, 프레임워크 및/또는 불변 영역에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 단편 또는 변이체는 표 1 또는 표 2의 결합제와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 결합제, 예를 들어, 표 1 또는 표 2의 결합제 또는 이의 활성 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 결합제일 수 있다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 화학치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 화학치료제와 조합하여 투여되며, 예를 들어, 적혈구 세포는 화학치료제 전에, 화학치료제 후에, 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포 및 화학치료제는 혼합되고, 일부 구현예에서, 이들은 별도의 제조물로 존재한다. 적혈구 세포 및 화학치료제는 동일한 투여 경로(예를 들어, 정맥내) 또는 상이한 투여 경로(예를 들어, 정맥내 및 경구)를 통해 투여될 수 있다.
구현예들에서, 화학치료제는 미세소관 억제제, DNA 복제 억제제, 감광제, 또는 효소 억제제다. 구현예들에서, 화학치료제는 미세소관 억제제이다(예를 들어, 빈카 알칼로이드와 같이 미세소관 조립을 차단하거나, 탁산(taxane) 또는 에포틸론(epothilone)과 같이 미세소관 해체를 차단한다). 구현예들에서, 화학치료제는 DNA 복제 억제제(예를 들어, 엽산, 퓨린, 피리미딘, 또는 DNA의 항대사물과 같은 항대사물; 토포아이소머라제 I 또는 II의 억제제와 같은 토포아이소머라제 억제제; 또는 알킬화제, 백금-기반 제제, 비전형적 DNA 가교제, 또는 인터칼레이터와 같은 DNA 가교제)이다. 구현예들에서, 감광제는 포르피린 유도체이다.
더욱 구체적으로, 일부 구현예에서, 빈카 알칼로이드는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈플루닌, 빈데신, 또는 비노렐빈으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 탁산은 카바지탁셀, 도세탁셀, 라로탁셀, 오르타탁셀, 파클리탁셀, 또는 테세탁셀로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 엽산 항대사물은 디하이드로폴레이트 리덕타제 억제제(예를 들어, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 또는 프랄라트렉세이트) 또는 티미딜레이트 신타제 억제제(예를 들어, 랄티트렉시드 또는 페메트렉시드)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 퓨린 항대사물은 아데노신 데아미나제 억제제(예를 들어, 펜토스타틴), 할로겐화/리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제(예를 들어, 클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈), 또는 티오퓨린(예를 들어, 티오구아닌 또는 메르캅토퓨린)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 피리미딘 항대사물은 티미딜레이트 신타제 억제제(예를 들어, 플루오로우라실, 카페시타빈, 테가푸르(Tegafur), 카모푸르(Carmofur), 또는 플록스우리딘(Floxuridine)), DNA 폴리머라제 억제제(예를 들어, 시타라빈), 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제(예를 들어, 겜시타빈) 또는 저메틸화제(예를 들어, 데시타빈(Decitabine)의 아자시티딘(Azacitidine))으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 항대사물은 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제(예를 들어, 하이드록시카르바미드)이다. 구현예들에서, 토포아이소머라제 억제제는 토포아이소머라제 I의 억제제, 예를 들어, 캄프토테카 화합물, 예를 들어, 캄프토테신, 코시테칸, 벨로테칸, 기마테칸, 엑사테칸, 이리노테칸, 루르토테칸, 실라테칸, 토포테칸, 또는 루비테칸이다. 구현예들에서, 토포아이소머라제 억제제는 토포아이소머라제 II의 억제제, 예를 들어, 포도필룸 화합물(예를 들어, 에토포사이드 또는 테니포사이드)이다. 구현예들에서, 토포아이소머라제 억제제는 인터칼레이션 활성을 가지며, 예를 들어, 안트라사이클린(예를 들어, 아클라루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 암루비신, 피라루비신, 발루비신, 또는 조루비신) 또는 안트라센디온(예를 들어, 미톡산트론(Mitoxantrone) 또는 픽산트론(Pixantrone))이다.
구현예들에서, 알킬화제는 질소 머스타드, 예를 들어, 메클로르에타민, 시클로포스파미드(예를 들어, 이포스파미드 또는 트로포스파미드), 클로람부실(예를 들어, 멜팔란 또는 프레드니무스틴), 벤다무스틴, 우라무스틴, 또는 에스트라무스틴이다. 구현예들에서, 알킬화제는 니트로소우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 로무스틴, 포테무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 또는 스트렙토조신이다. 구현예들에서, 알킬화제는 알킬 술폰산염, 예를 들어, 부술판(예를 들어, 만노술판 또는 트레오술판)이다. 구현예들에서, 알킬화제는 아지리딘, 예를 들어, 카르보쿠온(Carboquone), 티오TEPA, 트리아지쿠온(Triaziquone), 또는 트리에틸렌멜라민이다. 구현예들에서, 백금-기반 제제는 카르보플라틴, 시스플라틴, 디시클로플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 또는 사트라플라틴으로부터 선택된다. 구현예들에서, 비전형적 DNA 가교제는 히드라진(예를 들어, 프로카바진), 트리아젠(Triazene)(예를 들어, 다카르바진 또는 테모졸로미드), 알트레타민, 미토브로니톨, 또는 피포브로만이다. 구현예들에서, 인터칼레이터는 스트렙토마이세스 화합물, 예를 들어, (악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 또는 플리카마이신)이다.
구현예들에서, 감광제는 아미노레불린산/메틸 아미노레불린산염, 에파프로시랄(Efaproxiral), 포르피린 유도체(예를 들어, 포르피머(Porfimer) 소듐 탈라포르핀(Talaporfin), 테모포르핀(Temoporfin), 또는 베르테포르핀(Verteporfin))로부터 선택된다.
구현예들에서, 효소 억제제는 파르네실트랜스퍼라제(Farnesyltransferase) 억제제(예를 들어, 티피파르닙(Tipifarnib)), CDK 억제제(예를 들어, 알보시딥(Alvocidib), 셀리시클립(Seliciclib), 또는 팔보시클립(Palbociclib)), 프로테아솜 억제제(예를 들어, (보르테조밉, 카르필조밉(Carfilzomib), 또는 익사조밉(Ixazomib)), 포스포디에스테라제 억제제(예를 들어, 아나그렐리드(Anagrelide)), IMP 데히드로게나제 억제제(예를 들어, 티아조푸린(Tiazofurin)), 아라키돈산염 5-리폭시게나제 억제제(예를 들어, 마소프로콜(Masoprocol)), PARP 억제제(예를 들어, 올라파립(Olaparib) 또는 루카파립(Rucaparib)), HDAC 억제제(예를 들어, 벨리노스타트(Belinostat), 파노비노스타트(Panobinostat), 로미뎁신(Romidepsin) , 또는 보리노스타트(Vorinostat)) 또는 포스포이노시티드(Phosphoinositide) 3-키나제 억제제, 예를 들어, (이델라리십(Idelalisib))으로부터 선택된다.
구현예들에서, 화학치료제는 수용체 길항제이다. 구현예들에서, 수용체 길항제는 엔도텔린 수용체 길항제(예를 들어, 아트라센탄(Atrasentan)), 레티노이드 X 수용체 길항제(예를 들어, 벡사로틴(Bexarotene)), 또는 성 스테로이드(예를 들어, 테스토락톤)으로부터 선택된다. 구현예들에서, 화학치료제는 암사크린(Amsacrine), 트라벡테딘(Trabectedin), 레티노이드(예를 들어, 알리트레티노인(Alitretinoin) 또는 트레티노인(Tretinoin)), 삼산화 비소, 아스파라긴 고갈제(deplete)(예를 들어, 페가스파르가제(Pegaspargase)의 아스파라기나제), 셀레콕시브, 데메콜신(Demecolcine), 엘레스클로몰(Elesclomol), 엘사미트루신(Elsamitrucin), 에토글루시드(Etoglucid), 로니다민(Lonidamine), 루칸톤(Lucanthone), 미토구아존(Mitoguazone), 미토탄(Mitotane), 오블리메르센(Oblimersen), 오마세탁신 메페숙시네이트(Omacetaxine mepesuccinate), 또는 에리불린(Eribulin)으로부터 선택된다.
표
[표 1] 치료용 항암 항체. 이 표는 규제 승인을 받았고/받았거나 임상 시험에 진입한 항체를 포함한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 2] 항체 VH 및 VL 서열. 이 표의 서열은 공개적으로 입수할 수 있는 출처로부터 수득한 것이며, 여기의 서열과 명명된 항체의 서열 사이에 불일치가 있을 경우 실제 항체가 우선한다.
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[표 3] 예시적 암
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[표 4] 면역 체크포인트 분자, 및 이에 결합하는 제제.
Figure pct00033
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[표 5] 보조 자극 분자, 및 이에 결합하는 제제.
Figure pct00036
Figure pct00037
[표 6] CD20 세포주에 결합하는 αCD20-RCT; 결합된 세포 퍼센트
Figure pct00038
[표 7] RCT-항CD20 또는 대조 RCT-HA-GPA에 노출된 암세포 내의 BCL-xL 및 BCL-2 수준
Figure pct00039
[표 8] 특정 암에서 돌연변이된 유전자
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[표 9] 추가적인 외인성 폴리펩티드 서열
Figure pct00064
실시예
실시예 1:종양 항원에 대한 결합제를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 발현하는 적혈구 세포는 종양 항원을 발현하는 세포에 결합하여 이러한 세포에서 아폽토시스를 촉진하고, 고형 종양에 침투한다
N 말단에서 C 말단 방향으로 리툭시맙 CD20 scFv 도메인, HA 에피토프 태그, 및 전장 GPA(세포외, 막횡단, 및 세포내 도메인을 포함함)를 포함하는 융합 단백질을 표면 상에서 발현하는 제핵 적혈구 세포(RCT-항CD20)를 생성하였다. 전장 GPA의 N 말단에 융합된 HA 에피토프 태그만을 표면 상에서 발현하는 대조 제핵 적혈구 세포(RCT-HA-GPA)를 생성하였다. 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포를 생성하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587에 기술되어 있다.
유동세포분석법에 의해 나타난 바와 같이, RCT-항CD20은 다수의 CD20-발현 세포주에 결합하였다(표 6 참조). 결합량은 세포주의 CD20 수준과 상관 관계가 있었다(데이터는 나타내지 않음).
Ramos CD20-발현 세포로의 RCT-항CD20의 결합을 또한 면역형광법에 의해 시각화하였다. 세포를 (DAPI를 사용하여) (예를 들어, Ramos 세포 상의) CD20, HA(αCD20-RCT 및 대조 RCT-HA-GPA 상의 태그), DNA에 대해 염색하였다. CD20+ Ramos 세포와 RCT-항CD20의 공동 배양은 CD20과 HA의 광범위한 공동 국재화를 보여주었고, 이는 RCT가 CD20+ 세포에 결합하고 CD20의 과가교결합을 유도한다는 것을 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, CD20+ Ramos 세포와 대조 RCT-HA-GPA의 공동 배양은 CD20과 HA의 최소 공동 국재화를 보여주었다.
RCT-항CD20 세포를 다음과 같은 다양한 림프종 아형을 대표하는 CD20+ 인간 림프종 세포주의 패널과 공동 배양함으로써 RCT-항CD20과 CD20-발현 세포 사이의 상호작용이 아폽토시스를 유도할 수 있는 지 여부를 추가로 평가하였다: DoHH2(여포성 림프종), Ramos(버킷 림프종), Granta-519(외투 세포 림프종) 및 SU-DHL-4(미만성 거대 B 세포 림프종). 모든 경우에 있어서, RCT-항CD20 공동 배양은 RCT-HA-GPA 또는 가용성 리툭시맙 모노클로날 항체 단독에 비하여 증가된 아폽토시스를 가져왔다(도 1). 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 시험관내에서의 직접적인 종양 세포 사멸이 림프종 세포 상에서의 CD20의 과가교결합으로 인해 모노클로날 항체 단독보다 더욱 효과적인 것으로 가정되었다.
가용성 리툭시맙에 비하여 RCT-항CD20의 성능을 정량하였다. 상기 설명된 아폽토시스 실험에서, RCT-항CD20 상의 항-CD20 분자의 수를 정량적 유동세포분석법에 의해 측정하였다. RCT-항CD20 대 림프종 세포의 비가 1:1인 샘플의 경우, 유사 수준의 유도된 아폽토시스에도 불구하고, 가용성 항체 조건에서보다 RCT 상에 대략 11.6배 적은 항-CD20 분자가 존재하였다. RCT-항CD20 대 림프종 세포의 비가 1:5인 샘플의 경우, RCT-항CD20에 의한 훨씬 더 강력한 아폽토시스 유도에도 불구하고, 가용성 항체 조건에서보다 RCT 상에 대략 2.3배 적은 항 CD20 분자가 존재하였다. 따라서, 가용성 항체가 적혈구 세포-탑재 항체보다 현저하게 높은 수준으로 존재하더라도, 적혈구 세포는 훨씬 더 강력한 효과를 나타내었다.
리툭시맙은 카스파제-매개 아폽토시스를 통해 CD20+ 세포를 사멸시키는 것으로 생각되므로, 항-CD20 항체 단독 또는 RCT-항CD20으로 처리된 CD20+ 세포에서 이 경로를 검사하였다. RCT-항CD20 세포 또는 대조 RCT-HA-GPA를 CD20-발현 표적 세포에 첨가하였다. 공동 배양물은 카스파제-매개 아폽토시스의 억제제인 Z-VAD-FMK, 또는 대조군으로서의 DMSO로 처리하였다. 표적 세포의 아폽토시스를 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, RCT-항CD20은 카스파제-매개 아폽토시스의 억제제 존재 하에서도 Ramos 세포에서 아폽토시스를 견고하게 촉진하였다. 이 놀라운 결과는 RCT-항CD20이 상응하는 항체 단독과는 다른 메커니즘을 통해 CD20+ 암세포를 사멸시킨다는 것을 나타낸다. 결과는, 재발하거나, 예를 들어, 손상된 카스파제-의존성 아폽토시스 경로로 인해, 항-CD20 항체와 같은 항체에 불응성인 환자가 그럼에도 불구하고 적혈구 상에 제시된 항체에 민감할 수 있음을 암시한다.
RCT-항CD20 촉발된 아폽토시스의 메커니즘을 추가로 특징화하기 위해, BCL-xL과 BCL-2 수준을 연구하였다. RCT-항CD20 또는 대조 RCT-HA-GPA 세포를 3 가지 암세포주(Raji, Ramos, 또는 DoHH2) 각각과 함께 배양하였다. 암세포 상의 BCL-xL과 BCL-2의 표면 수준을 유동세포분석법에 의해 측정하였다. 각 세포주에서, RCT-항CD20은 BCL-xL 및 BCL-2 수준을 감소시켰지만 대조 RCT-HA-GPA는 그렇지 않았다(표 7 참조). BCL2 및 BCLx1 항-아폽토시스 경로의 억제는 용량 의존적이었다.
고형 종양에 침투하는 능력에 대해서도 RCT-항CD20을 시험하였다. 적혈구 세포가 항체보다 훨씬 크기 때문에, 적혈구 세포가 고형 종양에 효율적으로 침투할 수 있을 것으로 기대되지 않았다. (예를 들어, 문헌[Newick et al.DOI: 10.1146/annurev-med-062315-120245], 문헌[Thurber et al.doi: 10.1016/j.addr.2008.04.012] 참조) 면역결핍 마우스 내로의 Ramos 세포의 피하 주사에 의해 이종이식 종양을 형성하였다. 마우스에게 mRBC-항CD20 또는 대조 mRBC-HA-GPA를 정맥내 투여하였다. mRBC-항CD20은, mRBC-HA-GPA와 비교하여, 예를 들어, H&E 염색 및 HA 염색에 의해, 광범위한 종양 침투를 나타내었다(도 3). 특히, mRBC-항CD20은 종양의 비-괴사 영역에 진입한 반면, mRBC-HA-GPA는 대체로 종양의 혈관구조 또는 괴사 영역으로 제한되었다(도 3). 특이적 종양 침투는 대조 mRBC-HA-GPA와 비교하여 형광 표지된 RCT-항CD20을 사용하여 또한 나타났다(도 4). 종양 내부의 mRBC-항CD20의 평균 형광 강도는 대조 mRBC-HA-GPA보다 2배가 넘게 높았다. 이 데이터는 항-CD20 항체와 같은 종양-결합 모이어티를 포함하는 적혈구 세포의 치료적 용도를 지지한다. 이러한 데이터는 또한 종양, 예를 들어, CD20 양성 종양 내로 적혈구 세포를 유도하는 표적화 도구로서의 항 CD20 항체와 같은 종양-결합 모이어티의 용도를 지지한다.
실시예 2:면역 체크포인트 억제제를 발현하는 적혈구 세포는 T 세포의 체크포인트 억제를 방지한다
N 말단에서 C 말단 방향으로 scFv 항체 도메인, 에피토프 태그(HA 또는 플래그), 및 전장 GPA(세포외, 막횡단, 및 세포질 도메인)를 포함하는 융합 단백질을 표면 상에서 발현하는 제핵 적혈구 세포를 생성하였다. scFv 도메인은 PD-1(RCT-항PD1), PD-L1(RCT-항PDL1), 또는 CTLA4(RCT-항CTLA4)에 대한 특이적 결합제였다. 항 PD-1 항체 도메인은 펨브롤리주맙 기반이다. 항-PD-L1 항체 도메인은 아테졸리주맙 기반이다. 항-CTLA4 항체 도메인은 이필리무맙 기반이다.
항-PD-L1 및 항-CTLA4 폴리펩티드의 견고한 발현이 유동세포분석법 검정에서 관찰되었는데, 항-PD-L1을 인코딩하는 벡터에 의한 형질감염 후 세포의 95.7% 이상이 항-PD-L1을 발현하였다. 유사하게, 항-CTLA4를 인코딩하는 벡터에 의한 형질감염 후 세포의 95.2% 이상이 항-CTLA4를 발현하였다.
세포를 Jurkat/IL-2 검정에서 시험하였다. Jurkat T 림프구는 전형적으로 IL-2를 분비하고, 자극시 PD-1, PD-L1, 및 CTLA4를 또한 발현한다. Jurkat 세포와 NHL 세포(Z138)의 공동 배양은 PD-1, PD-L1, 및 CTLA4 신호전달을 통해 면역 체크포인트를 촉발하여, Jurkat 세포 IL-2 분비의 하향 조절을 가져온다. RCT와 같은 시험 제제를 공동 배양물에 첨가한다. 면역 체크포인트를 억제하여 T 세포 활성을 보존하는 시험 제제의 능력은 높은 IL-2 분비 수준의 유지에 의해 검출된다.
Z-138(NHL) 및 Jurkat 세포와의 공동 배양시 IL-2 분비의 60% 억제가 Jurkat IL-2 검정에서 관찰되었다(도 5). 형질도입되지 않은 대조 RCT는 억제 효과를 구제하지 않는다. 그러나, RCT-항PDL1은 RCT-항CTLA4와 마찬가지로 T 세포 IL-2 분비의 구제와 복원을 나타내었다(도 5). 이 실험은 면역 체크포인트 억제제를 발현하는 RCT가 T 세포의 체크포인트 억제를 방지함으로써 면역 반응을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
표준 항원 리콜 검정에서 활성화를 유도하는 RCT-항PD1 및 RCT-항PDL1의 능력을 검정하였다. CMV 양성 공여자로부터의 PBMC를 CMV 펩티드로 자극하였다. 면역 체크포인트 억제에 민감한 기억 T 세포를, 대조 PBMC 또는 대조 RCT와 비교하여, RCT-항PD-1 또는 RCT-항PD-L1과의 공동 배양에 의해 활성화 및 감마 인터페론 분비에 대해 시험하였다. 항원 리콜 검정에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 인터페론-감마 분비의 3 내지 4배 증가가 나타났다(도 6). 대조 RCT-HA-GPA는 인터페론-감마 수준을 증가시키지 않았다. RCT-항PDL1은 이 검정에서 인터페론-감마 분비의 3 내지 6배 증가를 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 이 실험은 면역 체크포인트 억제제를 발현하는 RCT가 T 세포의 체크포인트 억제를 방지함으로써 면역 반응을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
RCT-항PDL1을, PBMC 증식을 촉진하는 능력에 대해 시험하였다. PBMC와 RCT-항PDL1의 공동 배양은 PBMC 단독과 비교하여 PBMC 세포의 3.6배 증가를 가져왔다. PBMC와 대조 RCT-HA-GPA의 공동 배양은 단지 2.3배 증가를 가져왔다. 이 실험은 면역 체크포인트 억제제를 발현하는 RCT가 면역 반응을 촉진할 수 있는 추가 메커니즘을 나타낸다.
실시예 3:보조 자극 분자를 발현하는 적혈구 세포는 T 세포 활성을 촉진한다
N 말단에서 C 말단 방향으로 4-1BBL 도메인, 에피토프 태그(HA 또는 플래그), 및 전장 GPA(세포외, 막횡단, 및 세포질 내)를 포함하는 융합 단백질을 표면 상에서 발현하는 제핵 적혈구 세포(RCT-41BBL)를 생성하였다. 41-BB-L은 항원 제시 세포 상에서 발현되고 T 세포 상의 41-BB 수용체에 결합하는 보조-자극 단백질이다.
재조합 41-BB로의 RCT-41-BB-L의 결합을 유동세포분석법을 이용하여 측정하였다.
RCB-41BBL은 4-1BB 및 NFkB-Luc2P(NFκB-조절 루시퍼라제 리포터 작제물)를 과발현하는 Jurkat T 세포와의 공동 배양에 의해 검정하였다. 4-1BBL의 결합시, T 세포는 대체로 증가된 NFκB 신호전달, 증가된 증식, 증가된 IL-2 및 인터페론-감마의 분비, 및 활성화 유도된 세포 사멸에 대한 보호를 나타낸다. 검정에서, RCT-41BBL은, 루시퍼라제 활성에 의해 측정되는 바와 같이, 대조군과 비교하여 NFκB 활성화를 30배 자극했다(도 7). 형질도입되지 않은 제핵 적혈구 세포는 루시퍼라제 수준을 증가시키지 않았다.
또한, PBMC와 RCT-41BBL의 공동 배양은 PBMC 단독와 비교하여 T 세포 증식의 1.7배 증가를 나타내었다.
이러한 실험은 제핵 적혈구 세포가 PBMC의 증식을 촉진하고 면역 세포 활성화를 담당하는 T 세포의 세포내 신호전달 경로를 활성화시키는 방식으로 보조 자극 분자를 성공적으로 제시할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 종양 항원에 대한 결합제 및 Trail 리간드를 공동 발현하는 적혈구 세포는 종양 항원을 발현하는 암세포에서 아폽토시스를 촉진한다
적혈구 세포가 상기 기술된 방법을 이용하여 항-CD20뿐만 아니라 Trail 리간드(아폽토시스 유도제)를 동시에 발현하도록 조작되었을 때, Ramos 세포와 (공동 발현되는) RCT-항CD20, RCT-Trail, 및 RCT-항CD20+ Trail의 공동 배양은 48시간 후에 각각 32%, 47% 및 76%의 아폽토시스를 나타내며, 이는 종양 세포 사멸에 대한 공동-발현 RCT의 상승 효과를 시사한다.
실시예 5: 보조 자극 분자를 발현하는 적혈구 세포는 T 세포 활성을 촉진한다
본원에 기술된 바와 같이, 성숙 단계에서 RCT 내로의 증가량의 4-1BB-L-HA에 대한 mRNA의 전기천공에 의해 아래 표에 나타낸 바와 같이 상이한 양의 4-1BB-L-HA를 발현하는 적혈구 세포를 생성하였다. 더 많은 양의 전기천공된 mRNA는, 발현 세포의 퍼센트 및 세포당 발현되는 카피 둘 모두로 측정했을 때, 인코딩된 단백질의 더 높은 발현을 가져왔다. 표 10은 2개의 복제본에 기초하여 발현 수준을 요약한 것이다.
[표 10]
Figure pct00065
전기천공 후, 적혈구 세포를 NFκB 루시퍼라제 검정에서 활성에 대해 시험하였다. 간략하게 말하면, 적혈구 세포를, 루시퍼라제 프로모터(Promega) 하에서 4-1BB 및 NFkB를 발현하는 상업적으로 이용 가능한 Jurkat 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이 시스템에서, 상업적으로 이용 가능한 키트(Promega)에 의해 측정된 바와 같은 증가된 루시퍼라제 활성은 NFkB의 활성화를 나타낸다. 100,000개의 Jurkat 4-1BB NFkB/Luc 세포를 세포막 상에서 상이한 양의 4-1BB-L을 발현하는 50,000개의 RCT와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 6시간 동안 인큐베이션한 후, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 8에 제시된 데이터는 루시퍼라제 활성의 견고한 증가가 초기에 용량 의존적이고, 이어서 세포당 발현되는 200,000개 카피의 4-1BB-L 후에 정체 상태가 됨을 나타낸다. 이 데이터는, 이러한 검정 조건 하에서, 최대 루시퍼라제 활성이 세포당 약 200,000개 카피의 4-1BB-L에 도달함을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 4-1BB-L RCT는 T 세포 활성을 촉진하는 능력에 대해 항 4-1BB 항체인 우토밀루맙(Utomilumab)과 비교하였다. 100,000개의 Jurkat 4-1BB NFkB/Luc 세포를, 증가하는 세포의 수(12,500, 50,000, 100,000, 200,000 또는 400,000개)의 4-1BB-L RCT 또는 대조 RCT(형질도입되지 않음)와 함께 인큐베이션하였다. Jurkat 4-1BB NFkB/Luc 세포는, 우토밀루맙의 가교결합을 위해 0.0025 nM 내지 250 nM 범위의 농도로 사용되는 2차 항 인간 IgG의 존재 또는 부재 하에, 증가하는 농도(0.001 nM 내지 100 nM 범위의 농도)의 4-1BB 효능제인 우토밀루맙과 함께 또한 인큐베이션하였다. 결과는 우토밀루맙 단독은 이 검정에서 NFkB 활성을 증가시키지 않았고, 시험된 농도 중 임의의 것에서 2차 항체 단독 또는 대조 RCT도 NFkB 활성을 증가시키지 않았음을 나타낸다. 2차 항 인간 IgG 항체에 의해 가교결합된 우토밀루맙의 고농도(0.1 nM 이상)는 루시퍼라제 활성의 4 내지 6배 증가를 가져왔고, 이는 NFkB 프로모터 활성화를 시사한다. Jurkat 4-1BB NFkB/Luc 세포와 4-1BB-L RCT의 인큐베이션은 12,500개의 RCT에서 출발하는 더욱 견고한 NFkB의 활성화를 유도하였고, 이는 20배의 NFkB 활성화를 가져왔다(도 9). Jurkat 4-1BB NFkB/Luc 세포와 함께 인큐베이션된 200,000개의 RCT에서 최대 활성이 관찰되었고, 루시퍼라제 활성 및 이에 따른 NFkB 활성의 90배 증가를 가져왔다. 따라서, 4-1BBL을 발현하는 적혈구 세포는 가교결합된 항체와 비교하여 극적으로 높은(약 15배 더 높은) T 세포 활성의 유도를 가져온다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 적혈구 세포 표면에서의 4-1BBL의 삼량체화는 그의 높은 활성에 기여할 수 있다.
4-1BB-L RCT는 또한 PBMC 증식을 증가시키는 것으로 나타났다. 3명의 상이한 공여자로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Astrate biologics로부터 수득하고, 증식 검정으로 분석하였다. PBMC를 제조업자 프로토콜에 따라 셀 트레이스 파 레드(Cell Trace Far Red)(CTFR, Thermo-Fisher)로 표지하였다. 100000개의 CTFR 표지된 PBMC를 미처리된 채로 방치하거나 0.5㎍/mL CD3 항체로 자극하였다. 세포를, 2차 항 인간 IgG 항체(2.5 nM, 25 nM 또는 250 nM)의 존재 또는 부재 하에서, 12,500, 25,000 또는 50,000개의 RCT(대조 RCT 또는 4-1BB-L를 발현하는 RCT), 또는 증가하는 용량(1 nM, 10 nM 또는 100 nM)의 우토밀루맙 또는 아이소타입 대조 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 5 일 동안 인큐베이션하고 유동세포분석법으로 분석하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 우토밀루맙과 가교결합 항체는 CD4 및 CD8 T 세포의 증식에 있어서 약간의 증가를 가져왔다. 한편, CTFR PBMC와 RCT 4-1BB-L의 인큐베이션은 CD4의 증식에 있어서 2배 내지 2.5배의 용량 의존적 증가를 가져왔고, CD8 세포의 증식에 있어서 4배 내지 7배의 용량 의존적 증가를 가져왔다. 데이터는 3명의 상이한 인간 공여자로부터의 PBMC의 증식을 나타내고, CD4 및 CD8 증식의 증가 배수의 계산은 CD3 항체를 갖는 동일한 공여자로부터의 PBMC의 증식에 비하여 이루어졌다. 이 실험은 RCT 4-1BB-L이 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 모두의 증식을 촉진하며, CD4+ 세포보다 CD8+ 세포에서 더욱 견고한 효과가 나타난다.
4-1BB-L RCT는 또한 사이토카인 분비를 증가시키는 것으로 나타났다. 3 명의 상이한 공여자로부터의 인간 PBMC를 Astrate biologics로부터 수득하고, 사이토카인 분비 검정으로 분석하였다. 100,000개의 PBMC를 미처리된 채로 방치하거나 0.5 ug/mL의 CD3 항체로 자극하였다. 세포를, 2차 항 인간 IgG 항체(2.5 nM, 25 nM, 250 nM 또는 2.5 uM)의 존재 또는 부재 하에서, 12,500, 25,000, 50,000 또는 100,000개의 RCT(대조 RCT 또는 4-1BB-L를 발현하는 RCT), 또는 증가하는 용량(1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1 uM)의 우토밀루맙 또는 아이소타입 대조 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 5일 동안 인큐베이션하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 유동세포분석법 기반 사이토카인 패널(Biolegend legendplex 인간 염증 패널)에서 사이토카인 분비에 대해 분석하였다. 도 11에 제시된 데이터는 우토밀루맙 단독이 400 pg/mL의 IFNg의 최대 분비를 가져왔고 2차 항체 가교결합과 함께 600 pg/mL의 IFNg의 최대 분비를 가져온 한편, PBMC와 RCT-4-1bB-L의 인큐베이션은 1500 pg/mL의 IFNg를 가져왔다. 유사한 효과가 TNFa 분비에서 관찰되며, PBMC와 RCT-4-1BB-L의 인큐베이션은 우토밀루맙 단독 또는 우토밀루맙과 2차 항체로 관찰되지 않는 TNFa 분비의 견고한 증가를 가져왔다.
실시예 6: 생체내 41BBL를 포함하는 적혈구 세포는 생체내에서의 종양 성장을 지연시킨다
결장암에 대한 MC38 마우스 모델 시스템을 사용하여 4-1BBL을 포함하는 적혈구 세포가 종양 성장에 미치는 영향을 시험하였다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 41BBL은 선천성 및 적응성 면역 무기(immune arms) 둘 모두에 대한 다양한 면역 효과기 반응을 유도함으로써 종양 성장을 지연시키는 것으로 생각된다. 가장 강력한 반응은 CD8+ 세포독성 T 세포를 자극하여 증식시키고, 증가된 인터페론 감마 생성 및 다수의 그랜자임의 발현을 통해 그의 효과기 잠재력을 증가시킨다. 대조적으로 다수의 4-1BB 효능제를 사용한 공개된 전임상 데이터는 MC38 또는 다른 모델에서 단일 제제 항종양 활성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았다(문헌[Chen, et al, 2014]; 문헌[Kudo-Saito, et al, 2006]; 문헌[Kocak, et al, Canc Res 2006]; 문헌[Tirapu, et al, Int J Cancer 2004]; 문헌[John, et al, Canc Res 2012]).
세포를 4-1BBL과 컨쥬게이션시켜 94.7%의 세포를 m4-1BB-L로 표지하였다. 세포당 표지된 분자의 양을 유동세포분석법을 이용하여 정량하였다. 동물 투여의 경우, 용량당 평균 1.1e9의 m4-1BB-L mRBC가 투여되었고, 세포당 평균 36,200개의 m4-1BB-L 분자는 용량당 0.084 mg/kg의 m4-1BB-L에 상응하였다.
5 x 105개의 MC-38 세포를 14 마리의 6 주 내지 8 주령 암컷 C57/B6 마우스의 좌측 옆구리에 피하 접종하였다. 동물의 무게와 상태를 매일 기록하고, 종양을 주당 3회 측정하였다.
각 종양을 2차원으로 측정함으로써 종양을 일주일에 3회 측정하였다. 종양 부피는 다음의 표준 공식을 이용하여 계산하였다: (L x W2)/2. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차를 각 시점에서 각 그룹에 대해 계산하였다.
미처리된 대조군과 비교하여 관찰된 m4-1BB-L mRBC의 항종양 활성은 도 12에 도시되고, m4-1BB-L mRBC로 처리된 마우스에서 종양 성장의 감소를 나타낸다. 종양 부피 분포는 연구 초기인 5일째 내지 9일째까지 그룹들 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(P<0.05, T 테스트).
체중을 매일 기록하였다. 체중의 변화는 1일째에 기록된 체중에 대하여 상대적으로 각 마우스에 대해 계산하였다. 처리는 대부분의 마우스에 대해 체중의 전반적인 증가에 의해 나타나는 바와 같이 잘 용인되었다. 약간의 체중 감소를 나타낸 마우스는 연구 전체에 걸쳐 총체중의 5% 이상을 잃지 않았다.
이러한 데이터는 적혈구 세포를 통한 4-1BB-L의 세포 제시의 유의한 효능 및 효력을 지지한다.
실시예 7: 종양 항원에 대한 결합제를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 발현하는 적혈구 세포는 고형 종양에 침투한다
제핵 적혈구 세포를 그의 표면에서 항-PD-L1과 컨쥬게이션시키고, 마우스의 종양에 침윤하는 능력에 대해 시험하였다.
마우스에게 B16F10 세포를 피하 접종하였다. 투여 전에 종양을 400 입방 ㎜까지 성장시켰다. 뮤린 RBC를 항 뮤린 PD-L1 및 아이소타입 대조군으로부터의 단편 항체(Fab)와 컨쥬게이션시켰다. 컨쥬게이션된 뮤린 RBC를 제조업체의 프로토콜에 따라 CTFR로 표지하였다. 세포를 동물에게 주입하였다. 주입 1일 후, 종양을 수집하였다. 종양을 절편화하고, 항 CD31로 염색하여 종양 혈관구조를 시각화하고, DAPI로 염색하여 핵을 시각화하였다. 염색된 절편을 스캔하고 사진을 찍었다. Halo 소프트웨어를 이용하여 종양 영역과 혈관구조 영역을 확인하였다. 이 두 영역에서의 표지된 RBC의 총 세포의 수를 아이소타입 대조군과 항 PD-L1 둘 모두에 대해 취하였다. 종양에서 발견된 RBC와 혈관에서 발견된 RBC 사이의 비를 계산하였다. 도 13에 제시된 데이터는 혈관 내의 RBC와 종양 내의 RBC 사이의 비가 아이소타입 대조 컨쥬게이션된 RBC에 대해 1(8 마리의 마우스로부터의 종양에서의 측정치의 평균)임을 시사하며, 이는 종양과 혈관구조에서의 유사한 양을 나타낸다. 혈관 내의 RBC와 종양 내의 RBC 사이의 비는 항 PD-L1 처리된 마우스에 대해 1.7이며, 이는 아이소타입 대조 마우스와 비교하여 항-PD-L1 그룹에서의 종양 내의 RBC의 농축을 나타낸다. 두 그룹 간의 비의 차이는 P<0.01(스튜던트 T 테스트)로 통계적으로 유의하였다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 고수준의 PD-L1을 발현하는 종양은 저수준의 PD-L1을 발현하는 종양보다 항-PD-L1을 포함하는 RCT에 더 잘 반응할 수 있다. B16F10 세포는 10ng/㎕의 IFN- 감마로 자극하였을 때 PD-L1의 세포 당 약 300,000개 카피를 발현하였다. 대조적으로, 동일한 조건 하에서, CT26 세포는 PD-L1의 세포당 약 150,000개 카피를 발현하였고, A20 세포는 PD-L1의 세포당 약 100,000개 카피를 발현하였다. PD-L1 카피 수는 퀀텀 심플리 셀룰라 키트(Quantum Simply Cellular kit)(Bangs Laboratories)를 사용하여 측정하였다. 항-PD-L1 항체를 표면에 포함하는 적혈구 세포는 A20 세포에 대해서보다 IFN-감마 처리된 B16F10 세포 및 CT26에 대해 더 높은 결합을 나타내었고, 이는 종양 세포로의 적혈구 세포의 증가된 결합을 가져오는 종양 세포 상에서의 더 높은 PD-L1 발현 수준과 일치한다.
실시예 8: 2개의 제제를 발현하는 적혈구 세포는 단독으로 발현된 폴리펩티드보다 더 큰 면역 효과기 세포 자극을 촉진한다.
1 명의 공여로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Astrate biologics 로부터 수득하고, IL-2 사이토카인 분비 검정으로 분석하였다. 500,000개의 PBMC를 5ug/mL의 CD3 항체로 자극하였다. 세포를 500,000개의 RCT 대조 세포 또는 항-PD-L1 또는 4-1BB-L을 발현하는 RCT와 함께 인큐베이션하였다. 병행하여, 500,000개의 RCT 항 PD-L1과 4-1BB-L을 발현하는 500,000개의 RCT의 조합을 시험하였다. 또한 병행하여, 항 PD-L1과 4-1BB-L 둘 모두를 발현하는 500,000개의 세포를 시험하였다. 24시간 후, 상등액을 수집하고, IL-2 ELISA를 수행하여 RCT-항 PD-L1 및 RCT 4-1BB-L과의 인큐베이션의 결과로써 배지로의 IL-2 분비를 평가하였다. RCT 항 PD-L1은 PBMC 단독과 비교하여 IL-2 분비의 4배 증가를 가져왔다. RCT 4-1BB-L은 4-1BB-L의 10배 증가된 분비를 가져온 반면, RCT 항 PD-L1과 RCT-4-1BB-L의 조합은 IL-2 분비의 13배 증가를 가져왔다. PD-L1 및 4-1BB-L이 비-중첩 세포 집단에서 발현될 때와 동일한 13배 증가가 항 PD-L1 및 4-1BB-L이 RCT 상에서 공동 발현되는 경우 측정되었지만, 공동 발현 세포는 비-중첩 세포 집단(총 1,000,000개의 세포)과 비교하여 용량의 절반(500,000개의 세포)에서 이 효과를 달성하였다.
이 실험은 2개의 제제 발현하는 적혈구 세포가 단독으로 발현된 폴리펩티드보다 더 큰 면역 효과기 세포 자극(사이토카인 분비에 의해 측정됨)을 생성하였음을 나타낸다. 여기서 사용된 2개의 제제는 보조 자극 분자(4-1BBL)와 면역 체크포인트 분자에 결합하는 제제(항 PD-L1)였다. 더욱이, 2개의 제제가 상이한 세포 집단에서 발현되었을 때보다 동일한 세포 상에서 발현되었을 때 효과가 더 컸다.
실시예 9: 항암제를 발현하는 RCT는 신호전달, 증식, 사이토카인 분비, 및 항원 리콜을 촉진한다
도 14의 표는 4-1BB-L, OX40-L, GITR-L, 및 ICOS-L을 발현하는 RCT로 생성된 데이터를 요약한 것이다. 신호전달 활성은 4-1BB-L, OX40-L 및 GITR-L에 대해 실시예 5에 기술된 바와 같은 NFkB/Luc 검정(NFkB/Luc 및 각각 4-1BB, OX40 또는 GITR에 대한 수용체를 발현하는 Jurkat 세포를 사용함)을 나타낸다. 증식 검정 및 사이토카인 분비 검정을 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 2 ug/mL의 CMV-감염 세포(Astarte)의 용해물을 사용하여 자극시킨, CMV-양성 공여자로부터의 200,000개의 PBMC(Astarte)를 사용하여 항원 리콜 검정을 수행하였다. 이어서 PBMC를 지시된 외인성 단백질을 발현하는 100,000개의 RCT와 함께 4일 동안 인큐베이션하였다. CD4+ 및 CD45RO+인 세포를 검출하기 위해 유동세포분석법으로 기억 T 세포 집단의 존재에 대해 세포를 분석하였다. 이러한 실험으로부터의 상등액을 수집하고, ELISA를 이용하여 IFNg에 대해 분석하였다. 이러한 실험은 다양한 보조 자극 분자를 발현하는 적혈구 세포가 T 세포 활성화를 유도함을 나타낸다.
<110> RUBIUS THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO CELL SYSTEMS FOR PENETRATNG SOLID TUMORS <130> R2081-7018WO <150> 62/429,275 <151> 2016-12-02 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val 1 5 10 15 Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp 20 25 30 Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val 35 40 45 Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu 50 55 60 Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val 65 70 75 80 Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg 85 90 95 Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro 100 105 110 Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr 115 120 125 Ser Asp Gln 130 <210> 2 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 77 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 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Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 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Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 80 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 80 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 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Claims (20)

  1. 대상체의 혈관외 부위에 제제, 예를 들어, 결합제를 전달하는 방법으로서,
    각각의 세포가, 그의 표면 상에, 상기 혈관외 부위에 존재하는 항원, 예를 들어, 종양 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 제핵 적혈구 세포를 포함하는 유효량의 제조물을 상기 대상체의 혈류에 투여함으로써, 상기 제제, 예를 들어, 결합제를 상기 혈관외 부위에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 내성, 예를 들어, 불응성 또는 재발된 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법으로서,
    각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 제핵 적혈구 세포를 포함하는 제조물을, 상기 암을 치료하기에 충분한 양으로 상기 대상체에게(예를 들어, 상기 대상체의 혈류에) 투여함으로써, 상기 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 대상체에서 혈관이 분포된 고형 종양을 치료하는 방법으로서,
    각각의 세포가, 그의 표면 상에, 종양 세포 항원에 대한 결합제, 예를 들어, 항체를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 복수의 제핵 적혈구 세포를 포함하는 제조물을, 상기 혈관이 분포된 고형 종양을 치료하기에 충분한 양으로 상기 대상체의 혈류에 투여함으로써, 상기 혈관이 분포된 고형 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드는 막횡단 도메인 및 항체를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항-CD20 항체이고, 상기 종양 항원은 CD20인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항-PD-L1 항체이고, 상기 종양 항원은 PD-L1인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드는 104개, 105개, 또는 106개보다 많은 카피 수로 존재하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적혈구 세포는 제2 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 기능적 카스파제 아폽토시스 경로가 결여되어 있는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 표 8의 돌연변이를 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 표 1의 항체 치료제에 내성인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 제핵 적혈구 세포는 다음 중 하나(이상, 예를 들어, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상)를 가져오기에 효과적인 양으로 그리고 효과적인 시간 동안 투여되는, 방법: (a) 종양 크기 감소, (b) 종양 성장 속도 감소, (c) 종양 세포 사멸 증가 (d) 종양 진행 감소, (e) 전이 횟수 감소, (f) 전이 속도 감소, (g) 종양 재발 감소, (h) 대상체의 생존율 증가, (i) 대상체의 무진행 생존율 증가.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 제핵 적혈구 세포는 표적 암세포, 예를 들어, B 세포의 아폽토시스, 예를 들어, 카스파제-비의존성 아폽토시스 및/또는 카스파제-의존성 아폽토시스를 가져오기에 효과적인 양으로 그리고 효과적인 시간 동안 투여되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항-CD20 항체이고, 상기 복수의 제핵 적혈구 세포는 상기 암세포의 표면 상에서 CD20의 과가교결합(hypercrosslinking)을 유도하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 종양에 상주하는 상기 외인성 단백질을 발현하는 상기 제핵 적혈구 세포 대 (ii) 상기 대상체의 혈류에서 상기 외인성 단백질을 발현하는 제핵 적혈구 세포의 수의 비는, 예를 들어, 상기 종양에서의 적혈구 세포 축적의 최고점에서, 1:1보다 높은, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 외인성 단백질을 발현하는 상기 제핵 적혈구 세포 대 (ii) 상기 종양 내의 내인성 적혈구 세포의 비가 적어도 2:1인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양에 상주하는 결합제, 예를 들어, 항체의 양은 적혈구 세포와 관련되지 않은 다른 유사한 결합제, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 유리 항체의 양보다 적어도 2 배 많은, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양에서의 상기 외인성 단백질을 발현하는 상기 제핵 적혈구 세포의 존속은 상기 결합제가 결여된 다른 유사한 제핵 적혈구 세포와 비교하여 적어도 2 배 증가되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
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