JP2022523794A - 環状ポリリボヌクレオチド及びその医薬組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／８１３，６６６号、２０１９年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８２５，６８３号、２０１９年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，１７４号、及び２０２０年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／９６７，５４５号の利益を主張するものであり、これらの全内容が参照により援用される。
特定の環状ポリリボヌクレオチドは、健常人の組織及び細胞を含むヒト組織及び細胞中に遍在的に存在する。
本開示は、規定された又は減少した量の線状ポリリボヌクレオチド分子を有する環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬組成物又は製剤、及びそれに関連する方法を提供する。本発明者らは、環状ポリリボヌクレオチド医薬組成物又は製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子が、環状ポリリボヌクレオチド医薬組成物又は製剤から検出、監視及び／又は制御され、例えば、減少又は精製されるべきであることを見出した。
医薬製剤
一態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、規定の方法によって測定した際に所定の閾値未満のレベルの線状ポリリボヌクレオチド分子を含み、例えば、製剤は、医薬品放出規格（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を満たすレベルの線状ポリリボヌクレオチド分子を含み、例えば、製剤は、本明細書において以下に記載される規格（例えば、ｗ／ｖ規格又はｗ／ｗ規格）を満たすレベルの線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。ある場合において、規格は、規定の方法によって測定した際に検出限界未満のレベルであり得る。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子である。ある実施形態において、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子である。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、精製工程前の製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子のレベルと比較して、精製工程後（例えば、１つ又は複数の精製工程後）に、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）だけ減少されるレベルの線状ポリリボヌクレオチド分子を有する。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子及び医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、医薬組成物は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、医薬組成物は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の２％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子及び製剤中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、又は１０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子及び製剤中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、又は５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、発現産物をコードする配列、又は複数の配列、例えば、治療用タンパク質又は核酸をコードする例えば治療的発現産物を含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、足場を含む配列、又は複数の配列（例えば、アプタマー配列）を含む。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子のレベルは、顕微鏡法、分光測色法、蛍光分析法、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光測色法、ＲＮＡ電気泳動、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、ＵＶ分光学的若しくは蛍光検出器、光散乱技術、ＨＰＬＣを含む分離の方法の使用を用いるか若しくは用いない表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＨＰＬＣによるもの、分離前若しくは分離後の誘導体化方法の使用を用いるか若しくは用いないチップ若しくはゲルベースの電気泳動、線状ポリリボヌクレオチド分子の検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用する検出方法の使用、又は顕微鏡法、視覚法若しくは分光光度計を用いる方法、又はそれらの任意の組合せを含む任意の好適な方法によって測定され得る。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤はまた、精製工程前と比較して、線状ポリリボヌクレオチドを減少させるために、医薬製剤を、富化又は精製工程（又は複数の精製工程）に供したときに、対象への投与後に、免疫又は炎症反応の減少したレベルの１つ以上のマーカーを生じる。ある実施形態において、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、サイトカイン又は免疫原性関連遺伝子の発現である。ある実施形態において、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、ＩＦＮ－β、ＯＡＳ、及びＯＡＳＬからなる群から選択される遺伝子の発現である。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤はさらに、不純物、例えば、プロセス関連不純物又は生成物関連物質を実質的に含まない。ある実施形態において、プロセス関連不純物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）、デオキシリボ核酸（例えば、宿主細胞デオキシリボ核酸などの細胞デオキシリボ核酸）、モノデオキシリボヌクレオチド又はジデオキシリボヌクレオチド分子、酵素（例えば、ヌクレアーゼ又はリガーゼ）、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料を含む。ある実施形態において、不純物は、緩衝液試薬、リガーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＲＮａｓｅ Ｒ、デオキシリボヌクレオチド分子、アクリルアミドゲル破片、及びモノデオキシリボヌクレオチド分子から選択される。ある実施形態において、医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質汚染を含む。
上に列挙される各態様のある実施形態において、医薬製剤はさらに、医薬品不純物又は汚染物質を実質的に含まず、例えば、医薬製剤は、リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まない。ある実施形態において、医薬製剤は、滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む。ある実施形態において、医薬製剤は、滅菌医薬製剤である。ある実施形態において、滅菌医薬製剤は、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援する。ある実施形態において、医薬製剤は、本出願の出願日の時点で公表されていた米国薬局方（ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）ｃｈａｐｔｅｒ ７１（ＵＳＰ＜７１＞）の標準を満たす。ある実施形態において、医薬製剤は、本出願の出願日の時点で公表されていた米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）ｃｈａｐｔｅｒ ８５（ＵＳＰ＜８５＞）の標準を満たす。
上に列挙される各態様のある実施形態において、製剤の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物又は環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物のフラグメントを含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、製剤の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物（例えば、環状化前形態（ｐｒｅ－ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ））を含む。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物又はそのフラグメント、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物又はそのフラグメント、又はそれらの組合せを含む。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物（例えば、環状化前形態）、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物、又はそれらの組合せを含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子フラグメントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又はそれらの間の任意のヌクレオチド数であるフラグメントである。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、疑似らせん構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、疑似二本鎖二次構造を含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、１つ以上のアプタマー配列を含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、内在性又は天然の環状ポリリボヌクレオチド配列をコードする配列を有する。
上に列挙される各態様のある実施形態において、医薬製剤は、最終的な環状ポリリボヌクレオチド薬剤製品の中間の医薬製剤である。ある実施形態において、医薬製剤は、原薬又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）である。ある実施形態において、医薬製剤は、対象に投与するための薬剤製品である。
上に列挙される各態様のある実施形態において、医薬製剤は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又は５００ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含む。
上に列挙される各態様のある実施形態において、医薬製剤は、ＤＮＡがゼロであるか、ＤＮＡを実質的に含まないか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍＬ以下のＤＮＡを含む。ある実施形態において、ＤＮＡは、モノデオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド分子、ポリデオキシリボヌクレオチド分子、又はそれらの任意の組合せを含む。ある実施形態において、医薬製剤は、分光光度計によって測定した際に、約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。ある実施形態において、医薬製剤のＤＮＡ濃度は、定量液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によってヌクレオシドを消化する酵素による全ＤＮＡ消化後に測定され、ここで、ＤＮＡの含量が、ＬＣ－ＭＳによって測定した際に、各塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の標準曲線から逆算される。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子と比較した線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例２又は実施例３の方法を用いて決定される。ある実施形態において、医薬製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例２の方法を用いて決定される。ある実施形態において、医薬製剤中の環状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例３の方法を用いて決定される。
ポリリボヌクレオチドの医薬製剤を作製する方法
別の態様において、医薬組成物を作製する方法は、ａ）環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と、ｂ）線状ポリリボヌクレオチド分子の量を減少させるように、製剤を処理する工程と、ｃ）任意選択的に、処理工程の前、その間、及び／又はその後、製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と、ｄ）製剤をさらに処理して、医薬用途のための医薬組成物を生成する工程とを含む。ある実施形態において、工程ｄ）のさらなる処理は、ｉ）ＤＮＡ及び／又はタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）及び／又はエンドトキシンを実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；ｉｉ）製剤中のＤＮＡ及び／又はタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）及び／又はエンドトキシンの量を評価する工程と；ｉｉｉ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；ｉｖ）任意選択的に、製剤を濃縮する工程とのうちの１つ以上を含む。
別の態様において、医薬品原薬（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を作製する方法は、ａ）環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と、ｂ）製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と、ｃ）製剤が、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準（例えば、医薬品放出基準、例えば、本明細書に記載される医薬品放出基準又は参照基準）を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品原薬として処理する工程とを含む。
別の態様において、医薬品原薬を作製する方法は、ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；ｂ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；ｃ）製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；ｄ）製剤が、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品原薬として処理する工程とを含む。
別の態様において、医薬品原薬を作製する方法は、ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；ｂ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；ｃ）製剤中に残っている線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；ｄ）製剤が、製剤中に存在する線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品原薬として処理する工程とを含む。
別の態様において、医薬品製品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）を作製する方法は、ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；ｂ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；ｃ）製剤中の線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量を測定する工程と；ｄ）製剤が、製剤中に存在する線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品製品として製剤化する工程と；ｅ）それが、医薬品製品中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、医薬品製品にラベルを付け、出荷する工程とを含む。
別の態様において、医薬品製品を作製する方法は、ａ）環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と、ｂ）それが、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品製品として製剤化する工程と、ｃ）医薬品製品のサンプル中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を測定する工程と、ｄ）それが、医薬品製品中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、医薬品製品を製剤化し、ラベルを付け、及び／又は出荷する工程とを含む。
別の態様において、医薬品製品を作製する方法は、ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；ｂ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；ｃ）製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を測定する工程と；ｄ）製剤が、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品製品として製剤化する工程と；ｅ）それが、医薬品製品中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、医薬品製品にラベルを付け、出荷する工程とを含む。
別の態様において、医薬組成物を作製する方法は、ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；ｂ）線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を得る工程と；ｃ）製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；ｄ）任意選択的に、処理工程後に残っている製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；ｅ）製剤をさらに処理して、医薬用途のための医薬組成物を生成する工程とを含む。ある実施形態において、本方法は、ｆ）デオキシリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；ｇ）製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；ｈ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；ｉ）製剤を濃縮する工程と；ｊ）製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を、印刷又はデジタルメディアに記録する工程とのうちの１つ以上をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、ｆ）タンパク質汚染を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；ｇ）製剤中のタンパク質汚染の量を評価する工程と；ｈ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；及びｉ）製剤を濃縮する工程とをさらに含む。ある実施形態において、工程ｄ）のさらなる処理は、ｆ）エンドトキシンを実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；ｇ）製剤中のエンドトキシンの量を評価する工程と；ｈ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；ｉ）製剤を濃縮する工程とのうちの１つ以上を含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、環状化工程は、スプリントライゲーションによって行われる。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を製剤化する工程は、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を、医薬品賦形剤と組み合わせることを含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、本方法は、製剤中のポリリボヌクレオチド分子（例えば、線状ポリリボヌクレオチド分子及び／又は環状ポリリボヌクレオチド分子）の量を、印刷又はデジタルメディアに、例えば、製剤の分析のための証明書に記録する工程をさらに含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、製剤化工程は、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を、医薬品賦形剤と組み合わせることを含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、参照基準は、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤についての医薬品放出規格である。例えば、参照基準は、以下のうちの１つ以上であり得る：（ａ）医薬製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、特定の量、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｕｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、６００ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ又は７５０ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子であり；（ｂ）医薬品製品又は医薬品原薬は、少なくとも特定の量、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ、又は７５０ｍｇ／ｍｌの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含み；又は（ｃ）医薬品製品又は医薬品原薬は、少なくとも特定の量、例えば、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、製剤中に存在する線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、ａ）製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、若しくは０．５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子；ｂ）製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、若しくは０．１％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子；又はｃ）製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、若しくは０．５％（ｗ／ｗ）以下の組み合わされた線状及びニックポリリボヌクレオチド分子から選択される。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも８０％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬組成物は、製剤中の全リボヌクレオチド分子の２０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬組成物は、製剤中の全リボヌクレオチド分子の１０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬製剤中の環状ポリリボヌクレオチド分子（例えば、全リボヌクレオチド分子に対する）は、顕微鏡法、分光測色法、蛍光分析法、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光測色法、ＲＮＡ電気泳動、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、ＵＶ分光学的若しくは蛍光検出器、光散乱技術、ＨＰＬＣを含む分離の方法の使用を用いるか若しくは用いない表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＨＰＬＣ、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いた若しくは用いないチップ若しくはゲルベースの電気泳動、線状ポリリボヌクレオチド分子の検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用する検出方法の使用、又は顕微鏡法、視覚法若しくは分光光度計を用いる方法によって測定される。例えば、全リボヌクレオチド分子に対する環状ポリリボヌクレオチドの量は、実施例２又は実施例３の方法を用いて決定され得る。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬品製品又は医薬品原薬はさらに、（ａ）リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まず；（ｂ）滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含み；（ｃ）滅菌薬剤製品又は滅菌原薬であり；（ｄ）無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援し；及び／又は（ｅ）ＵＳＰ＜７１＞又はＵＳＰ＜８５＞の標準を満たす。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、製剤は、製剤中に存在するＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡなどの細胞ＤＮＡ）の量についての参照基準をさらに満たす。ある実施形態において、製剤中に存在するＤＮＡ分子の量についての参照基準は、特定の量以下の存在、例えば、ＤＮＡ分子がゼロであるか、ＤＮＡ分子を実質的に含まないか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、若しくは５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、若しくは１００μｇ／ｍＬ以下のＤＮＡ分子の存在である。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、製剤は、製剤中に存在するタンパク質汚染（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質又はプロセス関連のタンパク質不純物、例えば、酵素）の量についての参照基準をさらに満たす。ある実施形態において、製剤中に存在するタンパク質汚染の量についての参照基準は、特定の量未満、例えば、環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染である。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、タンパク質汚染は、酵素を含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬品製品又は医薬品原薬は、分光光度計によって測定した際に約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含む。
上記の態様のそれぞれのある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物又は環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物のフラグメントを含む。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物（例えば、環状化前形態）を含む。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物又はそのフラグメント、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物又はそのフラグメント、又はそれらの組合せを含む。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物（例えば、環状化前形態）、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物、又はそれらの組合せを含む。
上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、発現産物をコードする配列、又は複数の配列、例えば、治療用タンパク質又は核酸をコードする例えば治療的発現産物を含む。上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、足場を含む配列（例えば、アプタマー配列）を有する。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、内在性又は天然の環状ポリリボヌクレオチド配列をコードする配列を有する。このような実施形態において、医薬製剤は、配列、例えば、発現産物をコードする参照配列に対して、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ）の配列同一性を有する配列を有する環状ポリリボヌクレオチド分子についての参照基準をさらに満たし得る。
使用の方法
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子を、対象の細胞又は組織、又は対象に送達する方法は、本明細書に記載される医薬製剤、本明細書に記載される医薬組成物、本明細書に記載される医薬品原薬、又は本明細書に記載される医薬品製品を、対象の細胞又は組織、又は対象に投与する工程を含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチド分子は、細胞、組織、又は対象、例えば、投与工程の少なくとも３日後（例えば、少なくとも４、５、６、７、１０、１２、１５、２０、２４日若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の後）に検出される。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチド分子を、対象の細胞又は組織、又は対象に送達する方法は、本明細書に記載される医薬製剤、本明細書に記載される医薬組成物、本明細書に記載される医薬品原薬、又は本明細書に記載される医薬品製品を、対象の細胞又は組織、又は対象に投与する工程を含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物は、投与工程の少なくとも３日後に、細胞、組織、又は対象において検出される。
別の態様において、治療用製品を、それを必要とする対象の細胞又は組織、又は対象に送達する方法は、本明細書に記載される医薬製剤、本明細書に記載される医薬組成物、本明細書に記載される医薬品原薬、又は本明細書に記載される医薬品製品を、対象の細胞又は組織、又は対象に投与する工程を含む。各上記の態様のある実施形態において、組成物又は製剤の環状ポリリボヌクレオチド分子は、治療用製品を含む配列を有する環状ポリリボヌクレオチド分子を含み、環状ポリリボヌクレオチド分子から転写又は翻訳された治療用製品が、細胞、組織、又は対象において、例えば、投与工程の少なくとも３日後（例えば、少なくとも４、５、６、７、１０、１２、１５、２０、２４日若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の後）に検出される。この態様のある実施形態において、組成物又は製剤の環状ポリリボヌクレオチド分子は、アプタマーを含む配列を有する環状ポリリボヌクレオチド分子を含み、環状ポリリボヌクレオチド分子は、細胞、組織、又は対象において、投与工程の少なくとも３日後（例えば、少なくとも４、５、６、７、１０、１２、１５、２０、２４日若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の後）に検出される。この態様のある実施形態において、組成物又は製剤の環状ポリリボヌクレオチドは、内在性又は天然の環状ポリリボヌクレオチド分子配列を有する環状ポリリボヌクレオチド分子を含み、内在性又は天然の環状ポリリボヌクレオチド分子は、細胞、組織、又は対象において、投与工程の少なくとも３日後（例えば、少なくとも４、５、６、７、１０、１２、１５、２０、２４日若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の後）に検出される。
別の態様において、非経口核酸送達系は、（ｉ）本明細書に記載される医薬製剤、本明細書に記載される医薬組成物、本明細書に記載される医薬品原薬、又は本明細書に記載される医薬品製品、及び（ｉｉ）非経口で許容される希釈剤を含む。この態様のある実施形態において、医薬製剤、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品は、任意の担体を含まない。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチドを送達する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬製剤、本明細書に記載される医薬組成物、本明細書に記載される医薬品原薬、又は本明細書に記載される医薬品製品を非経口的に投与する工程を含む。この態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における生物学的反応を引き起こす又は誘導するのに有効な量である。この態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における細胞又は組織に対する生物学的影響を与えるのに有効な量である。この態様のある実施形態において、非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に又は局所的に行われる。
別の態様において、環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織に、本明細書に記載される医薬製剤、本明細書に記載される医薬組成物、本明細書に記載される医薬品原薬、又は本明細書に記載される医薬品製品を非経口的に投与する工程を含む。この態様のある実施形態において、非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に又は局所的に行われる。
各上記の態様のある実施形態において、本方法は、投与工程前の、細胞、組織又は対象における環状ポリリボヌクレオチド分子又は環状ポリリボヌクレオチド分子から翻訳された産物の存在を評価する工程をさらに含む。各上記の態様のある実施形態において、本方法は、投与工程後（例えば、投与工程の２４時間、４８時間、７２時間、４日、７日、１４日若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の後）の、細胞、組織又は対象における環状ポリリボヌクレオチド分子又は環状ポリリボヌクレオチド分子から翻訳された産物の存在を評価する工程をさらに含む。上記の態様のそれぞれのある実施形態において、医薬製剤、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品は、希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）を含み、任意の担体を含まない。
定義
本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。
「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの用語は、請求項又は実施形態が化合物、組成物、生成物など自体を指す、すなわち、化合物、組成物、生成物などが、化合物、組成物、生成物などの製造について記載される方法によって得ることができるか又は生成可能であるが、化合物、組成物、生成物などが、記載される方法以外の方法によっても得られるか又は生成され得ることを示すのに使用される。「によって得られる」、「によって生成される」などの用語は、化合物、組成物、生成物が、記載される特定の方法によって得られるか又は生成されることを示す。「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの用語は、「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの好ましい実施形態として、「によって得られる」、「によって生成される」などの用語も開示することが理解されるべきである。
「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置、調節などの示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解されるべきである。「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、好ましい実施形態として、このような化合物、組成物、生成物などが処置、調節などに使用するためのものであることをさらに開示する。
「に使用するための化合物、組成物、生成物など」又は「のための薬剤、医薬組成物、獣医用組成物、診断用組成物などの製造における化合物、組成物、生成物などの使用」という表現は、このような化合物、組成物、生成物などが、ヒト又は動物の身体において実施され得る治療方法に使用されるものであることを示す。それらは、処置などの方法に関する実施形態及び請求項の均等な開示であると考えられる。実施形態又は請求項が、このように、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するのに使用するための化合物」を指す場合、これは、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するための薬剤の製造における化合物の使用」又は「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物に化合物を投与することによる処置の方法」の開示であるとも考えられる。「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置、調節などの示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解されるべきである。
「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状ポリリボヌクレオチドが治療によるヒト又は動物の身体の処置のために使用され得ることも開示することが意図される。したがって、それは、「治療に使用するための環状ポリリボヌクレオチド」と同等であることが意図される。
本明細書に記載される、環状ポリリボヌクレオチド分子、このような環状ポリリボヌクレオチド分子を含む組成物、このような環状ポリリボヌクレオチドを作製及び使用する方法などは、環状ＲＮＡ製剤における線状ＲＮＡ分子の影響（例えば、実施例１～１２）、及び（例えば、実施例１３を参照）異なる要素、例えば複製要素、発現配列、スタガー要素及びエンクリプトゲン（例えば、実施例１３を参照）又は例えば発現配列、スタガー要素及び調節要素（例えば、実施例３４及び４４を参照）を含む環状ポリリボヌクレオチドエフェクターの作製及び使用、並びにそれらの技術効果（例えば、実施例４３及び４４における線状同等物より増加した翻訳効率並びに実施例３３及び実施例６０における線状同等物より増加した半減期）を示す実施例に部分的に基づいている。これ以降の説明が、実施例において考えられる特定の発見及び組合せの様々な変形を想定していることは、特にこれらの実施例に基づいている。
本明細書において使用される際、「全リボヌクレオチド分子」という用語は、リボヌクレオチド分子の総質量を基準に測定した際に、線状ポリリボヌクレオチド分子、環状ポリリボヌクレオチド分子、モノマーリボヌクレオチド、他のポリリボヌクレオチド分子、そのフラグメント、及びその修飾形態を含む任意のリボヌクレオチド分子の総量を意味する。
本明細書において使用される際、「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃ ＲＮＡ）」又は「環状ポリリボヌクレオチド」又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」又は「環状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、同義的に使用され、遊離末端を有さない（すなわち、遊離３’及び／又は５’末端がない）構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又はエンドレス構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。
本明細書において使用される際、「フラグメント」という用語は、ヌクレオチド分子より短い少なくとも１つのヌクレオチドである、ヌクレオチド分子の任意の部分を意味する。例えば、ヌクレオチド分子は、線状ポリリボヌクレオチド分子であり得、そのフラグメントは、線状ポリリボヌクレオチド分子の一部である、モノリボヌクレオチド又は任意の数の連続ポリリボヌクレオチドであり得る。別の例として、ヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子であり得、そのフラグメントは、環状ポリリボヌクレオチド分子の一部である、ポリリボヌクレオチド又は任意の数の連続ポリリボヌクレオチドであり得る。
本明細書において使用される際、「エンクリプトゲン」という用語は、免疫細胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ環状ポリリボヌクレオチドの核酸配列又は構造を指し得る。
本明細書において使用される際、「発現配列」という用語は、産物、例えばペプチド若しくはポリペプチド又は調節核酸をコードする核酸配列である。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含むことができ、これらは、それぞれアミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。
本明細書において使用される際、「免疫タンパク質結合部位」という用語は、免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするのに役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって結合され得、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は回避する。本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、免疫原、例えば環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパク質又はペプチドである。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
本明細書において使用される際、「線状ＲＮＡ」又は「線状ポリリボヌクレオチド」又は「線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、同義的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。５’及び３’末端の一方又は両方は、遊離末端であっても、又は別の部分に結合されていてもよい。本明細書において使用される際、線状ＲＮＡは、環状化を生じておらず（例えば、環状化前である）、例えば、スプリントライゲーション、又は化学的、酵素的、リボザイム若しくはスプライシングに触媒される環状化方法によって、環状化のための出発材料として使用され得る。
本明細書において使用される際、「ニックＲＮＡ」又は「ニック線状ポリリボヌクレオチド」又は「ニック線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、同義的に使用され、環状ＲＮＡの切断又は分解から生じる５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。
本明細書において使用される際、「非環状ＲＮＡ」という用語は、全ニックＲＮＡ及び線状ＲＮＡを意味する。
本明細書において使用される際、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドである。
本明細書において使用される際、「疑似らせん構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれる。
本明細書において使用される際、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が内部二本鎖を形成する。
本明細書において使用される際、「調節要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列である。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中の反復される配列を含む。
本明細書において使用される際、「複製要素」という用語は、複製に有用であるか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフである。
本明細書において使用される際、「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分である。ある実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
本明細書において使用される際、「実質的に抵抗性」という用語は、対照と比較してエフェクターに少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものである。
本明細書において使用される際、「化学量論的翻訳」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成である。例えば、２つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有すること、例えば２つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が約０又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％若しくは２０％未満、又はそれらの間の任意のパーセンテージであり得ることを意味する。
本明細書において使用される際、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。
本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量である。ある実施形態において、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
本明細書において使用される際、「環状化効率」という用語は、得られる環状ポリリボヌクレオチドの、その非環状出発材料と比べた測定値である。
本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免疫応答を誘導する可能性である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボヌクレオチド又は炎症マーカーに対して誘起される抗体を測定する際、本明細書において提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで抗体又はマーカーの産生をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照によって誘起される抗体又はマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以下であり得る。別の例として、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボヌクレオチドに対する自然免疫応答を測定する際（炎症マーカーの測定など）、本明細書において提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで自然免疫応答の発生をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照に対する自然応答によって産生されるマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以下であり得る。
本明細書において使用される際、「不純物」という用語は、組成物、例えば、本明細書に記載される医薬組成物中に存在する不要な物質である。ある実施形態において、不純物は、プロセス関連不純物である。ある実施形態において、不純物は、最終組成物中の所望の生成物以外、例えば、本明細書に記載される有効薬剤成分、例えば、環状ポリリボヌクレオチド以外の生成物関連物質である。本明細書において使用される際、「プロセス関連不純物」という用語は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド以外の、最終組成物、製剤、又は生成物中で所望されない、組成物、製剤、又は生成物を製造する際に使用されるか、存在するか、又は生成される物質である。ある実施形態において、プロセス関連不純物は、ポリリボヌクレオチドの合成又は環状化において使用される酵素である。本明細書において使用される際、「生成物関連物質」という用語は、組成物、製剤、若しくは生成物、又はそれらの任意の中間体の合成中に生成される物質又は副生成物である。ある実施形態において、生成物関連物質は、デオキシリボヌクレオチドフラグメントである。ある実施形態において、生成物関連物質は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。ある実施形態において、生成物関連物質は、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドの誘導体又はフラグメント、例えば、１０、９、８、７、６、５、若しくは４つのリボ核酸、モノリボ核酸、ジリボ核酸、若しくはトリリボ核酸のフラグメントのうちの１つ以上である。
本明細書において使用される際、「を実質的に含まない」という用語は、生物学的、化学的、物理的、及び／又は薬理学的効果を誘発するのに必要なレベルより低い、組成物、製剤、若しくは生成物、又はそれらの任意の中間体中の成分のレベルである。ある実施形態において、成分のレベルが、微量で検出可能であるに過ぎないか、又はレベルが、質量分析法、ＵＶ－可視光、蛍光、光散乱、屈折率に基づく検出技術、又は検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用するものを用いて、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いて又は用いずに、関連する検出技術（例えば、クロマトグラフィー（カラムを用いる、紙を用いる、ゲルを用いる、ＨＰＬＣを用いる、ＵＨＰＬＣを用いるなど、又はＩＣ、ＳＥＣ、逆相、アニオン交換、混合モードなどによる）若しくは電気泳動（尿素ＰＡＧＥ、チップペース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）によって検出可能なレベルより低い場合、組成物、製剤、又は生成物は、成分を実質的に含まない。代わりに、組成物、製剤、又は生成物が、成分を実質的に含まないかどうかは、質量分析法、顕微鏡法、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、ＵＶ若しくはＵＶ－ｖｉｓ分光測色法、蛍光分析法（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又は検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる方法）による分離技術の使用なしで決定され得る。
本明細書において使用される際、「線状同等物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ配列類似性）を有し、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物（例えば、環状化前形態）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ配列類似性）及び同じか又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ配列類似性）及び異なる核酸修飾を有するか又は核酸修飾を有さず、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物であるポリリボヌクレオチド分子のフラグメントは、線状同等物ポリリボヌクレオチド分子より短い線状同等物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。ある実施形態において、線状同等物は、５’キャップをさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、３’ＵＴＲをさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
本明細書において使用される際、「アプタマー配列」という用語は、標的分子に特異的に結合する非天然、又は合成オリゴヌクレオチドである。典型的に、アプタマーは、２０～５００のヌクレオチドである。典型的に、アプタマーは、配列相同性より二次構造によってその標的に結合する。ある実施形態において、合成オリゴヌクレオチドは、標的分子に特異的に結合する天然のオリゴヌクレオチドと同じ配列を有し得る。
本明細書において使用される際、「担体」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾によって、部分的に若しくは完全に封入剤によって、又はそれらの組合せで、細胞内への組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを封入するか若しくはそれに共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、エクスビボ分化された網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。
本明細書において使用される際、「ネイキッド送達（ｎａｋｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」という用語は、担体を用いず、且つ細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾を有さない、細胞への送達のための製剤を意味する。ネイキッド送達製剤は、任意のトランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体を含まない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達製剤は、共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドを含み、且つ担体を含まない製剤である。
「希釈剤」という用語は、本明細書に記載される組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）が希釈又は溶解され得る不活性溶媒を含むビヒクルを意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、等張剤、又はそれらの混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例としては、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及び１，３－ブタンジオールが挙げられる。固体希釈剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、又は粉砂糖が挙げられる。
本明細書において使用される際、「非経口で許容される希釈剤」という用語は、組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）の非経口投与に使用される希釈剤である。
参照による援用
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
環状及び線状ＲＮＡへのプローブの結合並びにその後のＲＮａｓｅ ＨによるＲＮＡの分解を示す。環状ＲＮＡは、複数のバンドとして検出される線状及びコンカテマーＲＮＡと比較して、単一の切断された線状バンドとして検出される。分解が、非変性ポリアクリルアミドゲルにおいてサンプルを電気泳動し、ＲＮａｓｅ Ｈの添加を伴うか又は伴わない分解バンドを比較することによって検出された。 線状ＲＮＡバンド強度を線状ＲＮＡ標準と比較することによる、非変性ポリアクリルアミドゲルにおいて定量された線状ＲＮＡ含量を示す。 変性ポリアクリルアミドゲルの異なるバンドから抽出されたＲＮＡの定量を示す。 非精製環状ＲＮＡ製剤と比較した、ＢＪ線維芽細胞内における、経時的な精製環状ＲＮＡ製剤の持続性を示す。 異なる量の線状ＲＮＡを含有する環状ＲＮＡ製剤と比較した、ＢＪ線維芽細胞内における、経時的な精製環状ＲＮＡ製剤の発現レベルを示す。 精製環状ＲＮＡが、マウスへの注入後により高い発現を有し、並びに投与の１４日後にエクスビボで、肝臓中で測定した際により長い発現を示す。 ６％の尿素ＰＡＧＥゲルにおけるバンド強度を測定することによって計算した際の、精製の前及び後の線状ＲＮＡに対する環状ＲＮＡの比率のグラフを示す。バンドの定量は以下のとおりであった：精製前、ＲＮＡ産物の４２．６％が、環状ＲＮＡであり、ＲＮＡ産物の５７．４％が、線状ＲＮＡ（非精製ＲＮＡ）であり；精製後、ＲＮＡ産物の５０．４％が、環状ＲＮＡであり、ＲＮＡ産物の４９．６％が、線状ＲＮＡ（精製環状ＲＮＡ）であった。 ８４％の純度の環状ＲＮＡ、７１％の純度の環状ＲＮＡ、及びビヒクルのみを用いた実験における、トランスフェクションの６、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後の時点での細胞内のガウシアルシフェラーゼ活性を示す。 組み合わされた環状ＲＮＡ及び線状同等物ＲＮＡの両方でトランスフェクトされた細胞と比較した、ゲル精製環状ＲＮＡ製剤のみでトランスフェクトされた細胞を示す。環状ＲＮＡのみは、組み合わされた環状ＲＮＡ及び線状同等物ＲＮＡ製剤と比較して、用量依存的に増加した安定性を示した。 ゲル精製環状ＲＮＡ製剤のみでトランスフェクトされた細胞が、組み合わされた環状ＲＮＡ及び線状同等物ＲＮＡの両方でトランスフェクトされた細胞（用量依存的にこれらの自然免疫遺伝子の上方制御を示した）と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＯＡＳ、及びＩＦＮ－Ｂなどの自然免疫遺伝子の最小の発現を示したことを示す。 イントロンを有し、ＧＦＰを発現する対照環状ＲＮＡの概略図を示す。 リボスイッチに対するリガンドの存在下又は非存在下における環状ＲＮＡからのＧＦＰの発現を調節する合成リボスイッチ（赤色）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 エンクリプトゲン（イントロン）を有する例示的な環状ＲＮＡからのマウスモデルにおけるインビボタンパク質発現を示す概略図である。 その構造情報についてドットブロット分析にかけられ得る、１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 その構造情報についてＳＨＡＰＥ分析にかけられ得る、疑似らせん構造（ＨＤＶｍｉｎ）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 ＨＤＡｇ結合活性を示す、機能的疑似らせん構造（ＨＤＶｍｉｎ）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 例示的な自己複製可能な環状ＲＮＡの転写、自己切断及びライゲーションを示す概略図である。 有糸分裂中に保存され、娘細胞内で持続する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。示されるＢｒｄＵパルスは、分割した細胞を標識するのに使用される。 様々な例示的な環状ＲＮＡのインビトロ生成を示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 様々な例示的な環状ＲＮＡの環状化効率をまとめたグラフである。 その線状同等物と比較して、例示的な環状ＲＮＡの低下した分解感受性を示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 例示的な精製プロセス後の例示的な環状ＲＮＡを示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 ＩＲＥＳ、キャップ、５’及び３’ＵＴＲを欠いた例示的な環状ＲＮＡによるＦｌａｇタンパク質（約１５ｋＤａ）の発現を示すウエスタンブロット画像である。 例示的な環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を示すウエスタンブロット画像である。 例示的なスタガー要素を用いた又は用いない様々な例示的な環状ＲＮＡからの別個のタンパク質又は連続した長鎖ペプチドの生成を示すウエスタンブロット画像を示す。 例示的なスタガー要素又は終止要素（終止コドン）を用いた様々な例示的な環状ＲＮＡ間のタンパク質発現の比較を示すウエスタンブロット画像である。 ２つの例示的な環状ＲＮＡから翻訳されたタンパク質産物のウエスタンブロット分析からのシグナル強度をまとめたグラフである。 ビヒクル対照と比較した、例示的な環状ＲＮＡ及びその線状同等物の翻訳産物のルシフェラーゼ活性をまとめたグラフである。 線状ＲＮＡと比較した、例示的な環状ＲＮＡの半減期を試験する時間経過実験における異なる収集時点におけるＲＮＡ量をまとめたグラフである。 図３０Ａは、線状及び環状ＲＮＡの両方を捕捉したプライマーを用いた細胞への送達の２４時間後の線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 図３０Ｂは、環状ＲＮＡに対して特異的なプライマーを用いた線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 ＥＧＦタンパク質及びβ－チューブリンローディングコントロールについて調べられた環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡからの細胞溶解物のブロットを示す画像である。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 ローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 ローリングサークル型翻訳によって線状ＲＮＡ又は環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 ＩＲＥＳ翻訳開始によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 ＩＲＥＳ開始及びローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。 スタガー要素を用いた環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。 例示的な環状ＲＮＡの疑似二本鎖構造を有する予測構造を示す。 例示的な環状ＲＮＡの疑似らせん構造を有する予測構造を示す。 例示的な環状ＲＮＡの反復配列と連結された疑似らせん構造を有する予測構造を示す。 例示的な環状ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈによる分解が、コンカテマーＲＮＡではなく環状ＲＮＡと一致する核酸分解産物を生成したという実験データを示す。 様々なＲＮＡ長さの形成のために生成された様々な長さのＤＮＡの電気泳動画像を示す。 様々な長さの環状結合に対するＲＮＡｓｅ Ｒ処理及びｑＰＣＲ分析を用いてＲＮＡの環状化を確認した実験データを示す。 ｍｉＲＮＡ結合部位を有する例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。 自己スプライシングによる例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。 タンパク質結合部位を有する例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。 線状対照と比較して、分割細胞内の環状ＲＮＡのより高い安定性を示す実験データを示す。 複数の発現配列を有する例示的な環状ＲＮＡからのタンパク質発現及び複数の発現配列を有する例示的な環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を示す実験データを示す。 線状対照と比較して、例示的な環状ＲＮＡのトランスフェクトされた細胞に対する減少した毒性を示す実験データを示す。 例示的な環状ＲＮＡがストレス条件下で線状ＲＮＡと比較してより高いレベルで翻訳されたことを示す。 リボスイッチを有する環状ＲＮＡの生成を示す。 図５４Ａ、図５４Ｂ、および図５４Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。 図５４Ａ、図５４Ｂ、および図５４Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。 図５５Ａ、図５５Ｂ、および図５５Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。 マウスへの注入後、環状ＲＮＡが、注入の３、４及び７日後の時点でマウスの肝臓における線状ＲＮＡより高いレベルで検出されたことを示す。 図５７Ａおよび図５７Ｃは、マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。 ＲＮＡの注入後、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡがＲＮＡの投与の１６日後の時点で肝臓及び脾臓中で検出されたことを示す。 ＲＮＡの注入後、環状ＲＮＡではなく線状ＲＮＡが、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳによって評価した際、免疫原性を示したことを示す。
本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチド医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。
ある態様において、本明細書に記載される本発明は、減少した、制御された、又は特定のレベルの線状ＲＮＡを有する、環状ＲＮＡ組成物、製剤、並びに環状ＲＮＡ組成物及び製剤、特に、医薬環状ＲＮＡ組成物及び製剤を使用及び作製する方法を含む。本明細書、例えば、実施例１～１２に記載されるように、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの存在は、例えば、環状ＲＮＡの発現レベル、持続性、半減期、及び／若しくは安定性；及び／又は製剤に対する免疫応答に影響を与え得る。
表１は、詳細な説明の内容の簡単な概説を提供することが意図され、これは、決して排他的又は限定的なものではない。詳細な説明の特定の態様が、表１の詳細な説明の概説において反映されていない場合がある。
Figure 2022523794000002
Figure 2022523794000003
環状ポリリボヌクレオチド
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、発現産物、例えば、治療用発現産物をコードする、配列、又は複数の配列を有し、例えば、環状ＲＮＡは、治療用タンパク質又は核酸をコードする。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、アプタマーを含む、配列、又は複数の配列を有する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、内在性又は天然の環状ポリリボヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％又はそれらの間の任意のパーセンテージ）の配列同一性を有する配列をコードする配列を有する。ある実施形態において、環状ＲＮＡ及び製剤は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける好ましくない免疫応答を引き起こさない。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、その線状同等物、例えば、線状発現配列、又は線状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、その線状同等物のものより長い半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意のパーセンテージだけ長い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間以下～約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分割している間、細胞内で半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分割後の細胞内で半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間超～約３０日間、又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、分割している細胞内で半減期又は持続性を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞機能を、例えば一時的に又は長期間調節する。特定の実施形態において、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、安定して変化される。特定の実施形態において、例えば、約３０分間以下～約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、一時的に変化される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解することができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るときに環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングし、標的に送達する能力によって制限され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の要素を含む。ある実施形態において、要素は、スペーサー配列又はリンカーによって互いに隔てられ得る。ある実施形態において、要素は、１リボヌクレオチド、２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、最大で約１ｋｂ、少なくとも約１０００ヌクレオチド、それらの間のヌクレオチドの任意の量だけ互いに隔てられ得る。ある実施形態において、１つ以上の要素は、例えば、スペーサー要素を欠いて、互いに連続している。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の要素は、立体配座柔軟性がある。ある実施形態において、立体配座柔軟性は、配列が二次構造を実質的に含まないことによる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される１つ以上の所望の機能又は特性に対応する、例えば、リボソームのための結合部位、例えば、翻訳、例えば、ローリングサークル型翻訳に対応する二次又は三次構造を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の配列特性を含む。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＡＵリッチ領域又は要素（ＡＲＥ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のアデニンリッチ領域を含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の反復要素を含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、インビボで対象の細胞内における持続的発現のために構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。このような実施形態において、１つ以上の発現配列の発現は、比較的安定したレベルに維持され得るか、又は時間と共に増加し得る。発現配列の発現は、長期間にわたって比較的に安定的であり得る。例えば、ある場合において、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日又はそれ以上の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％減少しない。ある場合において、ある場合において、細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日又はそれ以上にわたって、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％を超えて変化しないレベルに維持される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せにおいて複製することが可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含むように改変される。
環状ＲＮＡを作製する方法
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの作製は、非天然であり、組み換え技術（以下に記載される方法；例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）又は化学合成を用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列の作製を含む。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの環状化は、スプリントライゲーションによって行われる。
ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは、本発明の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環化又はコンカテマー化の機構は、限定はされないが、化学的、酵素的、スプリントライゲーション、又はリボザイム触媒方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法は、当該技術分野でも記載されている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット；国際公開第２０１６１９７１２１号パンフレット；国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
例えば、本明細書に記載される実施例１３（以下を参照）には、医薬環状ＲＮＡ製剤を作製及び特性評価する方法が記載されている。
線状及び環状ＲＮＡの検出
本発明者らは、医薬環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの存在が、予想外の且つ時には望ましくない影響を与え得ることを見出した。したがって、本発明は、特に、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡと比べて富化され、分離され、及び／又は精製された医薬組成物及び製剤；線状ＲＮＡが監視され、評価され及び／又は制御され得る方法（例えば、環状ＲＮＡ製剤を製造する方法）；並びにこのような医薬組成物及び製剤を用いて、例えば、治療用エフェクター又は足場などのエフェクター（例えば、アプタマー配列）を、細胞、組織又は対象に送達する方法を特徴とする。ある実施形態において、環状ＲＮＡ製剤は、閾値レベル以下の線状ＲＮＡを有し、例えば、環状ＲＮＡ製剤は、線状ＲＮＡより富化され、線状ＲＮＡを減少させるように精製される。
一般に、医薬製剤中の要素の検出及び定量は、対象とする成分（例えば、環状ＲＮＡ、線状ＲＮＡ、フラグメント、不純物など）又は類似の材料（例えば、環状ＲＮＡのための標準として環状ＲＮＡ構造と同じ配列の線状ＲＮＡ構造を用いて）のいずれかである参照標準の使用を含み、又は内部標準又は試験サンプルからのシグナルの使用を含む。ある実施形態において、標準は、材料の工程の又は相対的な量についての検出器からの応答を確立するために使用される（応答係数）。ある実施形態において、応答係数は、１つ又は複数の濃度で標準から決定される（例えば、線状回帰分析を用いて）。ある実施形態において、次に、応答係数は、その成分によるシグナルから対象とする材料の量を決定するのに使用される。ある実施形態において、応答係数は、１の値であり、又は１の値を有すると仮定される。
ある実施形態において、医薬組成物中の環状ＲＮＡに対する線状ＲＮＡの検出及び定量は、環状ポリリボヌクレオチドの線状形態との比較を用いて決定される。ある実施形態において、医薬組成物中の全リボヌクレオチドの質量は、環状ポリリボヌクレオチドの線状形態を用いて生成される標準曲線を用いて、及び１の応答係数を仮定して、決定される。ある実施形態において、医薬製剤中の環状ポリリボヌクレオチドのｗ／ｗパーセンテージは、医薬製剤中の環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度との、複数の既知の量の環状ポリリボヌクレオチドの線状形態のバンド強度によって生成される標準曲線の比較によって決定される。ある実施形態において、バンドは、ゲルベース電気泳動中に生成され、バンド強度は、ゲル撮影装置（例えば、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒ）によって測定される。例えば、環状ポリリボヌクレオチドと比較した線状ポリリボヌクレオチドの量は、実施例２及び／又は実施例３の方法を用いて決定され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤は、本明細書に記載されるように評価した際に、閾値量（例えば、ここで、閾値量は、環状ポリリボヌクレオチド製剤についての参照基準、例えば、医薬品放出規格である）未満の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
ある実施形態において、医薬組成物中の全ＲＮＡに対するニックＲＮＡの検出及び定量は、環状ＲＮＡを含む製剤のゲル抽出後に、シーケンシングによって決定される。ある実施形態において、医薬組成物中の線状ＲＮＡに対するニックＲＮＡの検出及び定量は、環状ＲＮＡを含む製剤のゲル抽出後に、シーケンシングによって決定される。例えば、全ＲＮＡと比較したニックポリリボヌクレオチドの量は、実施例５の方法を用いて決定され得る。例えば、線状ＲＮＡと比較したニックポリリボヌクレオチドの量は、実施例５の方法を用いて決定され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤は、本明細書に記載されるように評価した際に、閾値量（例えば、ここで、閾値量は、環状ポリリボヌクレオチド製剤についての参照基準、例えば、医薬品放出規格である）未満のニックＲＮＡ、線状ＲＮＡ、又は組み合わされた線状及びニックＲＮＡを含む。例えば、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、若しくは０．１％以下の線状ポリリボヌクレオチド分子、又はそれらの間の任意のパーセンテージである。ある実施形態において、製剤中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、若しくは０．１％以下、又はそれらの間の任意のパーセンテージの、ニックポリリボヌクレオチド分子である。ある実施形態において、製剤中に存在する線状及びニックポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、若しくは０．１％以下、又はそれらの間の任意のパーセンテージの、組み合わされた線状ポリリボヌクレオチド及びニックポリリボヌクレオチド分子である。
ある実施形態において、標準は、サンプルと同じ条件下で実験される。例えば、標準は、サンプルと同じタイプのゲル、同じ緩衝液、及び曝露で実験される。さらなる実施形態において、標準は、サンプルと並行して実験される。ある実施形態において、要素の定量は、平均の結果を得るために、本発明の製剤からの複数のサンプル中で繰り返される（例えば、２回又はトリプリケートで）。ある実施形態において、線状ＲＮＡの定量は、パラレルキャピラリー（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ）電気泳動（例えば、フラグメント分析装置又はＵＶ検出を用いた分析的ＨＰＬＣを用いて）を用いて測定される。
環状ＲＮＡの精製
環状ポリリボヌクレオチドは、不要な物質（不要な（例えば、線状）ＲＮＡ、酵素、ＤＮＡなど）から分離、富化、又は精製され得る。ある実施形態において、不要な物質は、環状ポリリボヌクレオチドを作製及び／又は製造するプロセス中に存在するか、又はそれから生じる。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、医薬製剤、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品における製剤化の前に、富化及び／又は精製され得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、医薬製剤、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品における製剤化の後、富化及び／又は精製され得る。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、望ましくない要素、例えば、線状ＲＮＡ、若しくはニックＲＮＡ、並びに認識される不純物、例えば、遊離リボ核酸（例えば、モノリボ核酸、ジリボ核酸、若しくはトリリボ核酸）、ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡなどの細胞ＤＮＡ）、細胞又はプロセス関連タンパク質不純物（例えば、細胞若しくはプロセス関連不純物）などを除去するために、生成中又は生成後に精製され得る。ある実施形態において、不純物は、プロセス関連不純物である。ある実施形態において、プロセス関連不純物は、タンパク質（例えば、細胞タンパク質）、核酸（例えば、細胞核酸）、緩衝液又は緩衝液試薬、酵素、培地／試薬成分（例えば、培地、培地添加剤、遷移金属、若しくはビタミン）、分取用（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）若しくは分析用ゲル成分（例えば、アクリルアミド破片）、ＤＮＡ、又はクロマトグラフィー材料である。緩衝液試薬は、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＡＴＰ、ＳＤＳ、Ｎａ、グリコーゲン、トリス－ＨＣＬ、又はＥｔＯＨであり得る。緩衝液試薬としては、限定はされないが、アセテート、トリス、重炭酸塩、ホスフェート、クエン酸、ラクテート、又はＴＥＡが挙げられる。酵素は、リガーゼであり得る。リガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ ２であり得る。ある実施形態において、不純物は、緩衝液試薬、培地／試薬成分、塩、リガーゼ、ヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＲＮａｓｅ Ｒ、線状ポリリボヌクレオチド分子、デオキシリボヌクレオチド分子、アクリルアミド破片、又はモノヌクレオチド分子である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって富化又は精製され得る。非限定的な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げられる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、実施例３に記載されるように、ゲル精製、例えば、ＵＲＥＡゲル分離によって精製される。例えば、環状ＲＮＡは、変性ＰＡＧＥにおいて分解され得、環状ＲＮＡに対応するバンドが、切除され得、環状ＲＮＡは、公知の方法を用いてバンドから溶離され得る。次に、溶離された環状ＲＮＡは、分析され得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、クロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ミックスモードクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、例えば、逆相イオン対クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ）、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、並びにそれらの任意の組合せによって精製される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡ又は不純物からそれを分離するために、環状ポリリボヌクレオチドの構造的特徴を用いることによって精製される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、実施例９に記載されるものなどの構造的特徴（例えば、遊離末端の欠如）を用いることによって精製される。例えば、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡ同等物又はそのフラグメントのポリアデニル化を用いて、同じヌクレオチド配列を含有する環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡ同等物の混合プールを含む製剤から富化される。線状ＲＮＡ同等物又はそのフラグメントの３’末端が、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリアデニル化されて、３’ポリアデニン尾部の付加をもたらし得る。ある実施形態において、３’ポリアデニン尾部は、アフィニティーカラムなどのカラムを用いて、線状ＲＮＡ及びそのフラグメントのプルダウンを可能にして、環状ＲＮＡを富化する。ポリ（Ａ）ポリメラーゼはまた、ビオチン化Ｎ６－ＡＴＰ類似体などの修飾アデニンを組み込むことができる。３’ポリアデニン尾部へのビオチン化Ｎ６－ＡＴＰ類似体のこの付加が、ビオチン－ストレプトアビジン結合システムなどのシステムにおける線状ＲＮＡ及びそのフラグメントのプルダウンを可能にする。対照的に、環状化ＲＮＡは、３’末端を有さないため、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによってポリアデニル化されず、コンジュゲーションのためのポリアデニル化された尾部を有さず、プルダウンの際に捕捉されない。したがって、環状ＲＮＡは、プルダウン後に製剤中で富化される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡの構造的特徴（例えば、遊離末端の存在）を用いることによって精製される。例えば、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡ同等物のポリアデニル化を用いて、同じヌクレオチド配列を含有する環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡ同等物の混合プールを含む製剤から富化される。エキソヌクレアーゼは、線状ＲＮＡを加水分解するために、混合プールに加えられ得る。ある実施形態において、エキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼ又は５’エキソヌクレアーゼであり得る。ある実施形態において、３’エキソヌクレアーゼ及び５’エキソヌクレアーゼが使用され得る。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、質量基準で少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の純度である。純度は、質量分析法、ＵＶ－可視光、蛍光、光散乱、屈折率に基づく検出技術、又は検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用するものを用いて、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いて又は用いずに、限定はされないが、クロマトグラフィー（カラムを用いる、紙を用いる、ゲルを用いる、ＨＰＬＣを用いる、ＵＨＰＬＣを用いるなど、又はＩＣ、ＳＥＣ、逆相、アニオン交換、混合モードなどによる）又は電気泳動（尿素ＰＡＧＥ、チップペース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）などの分離技術の使用などの、当業者に公知のいくつかの分析技術のいずれか１つによって測定され得る。代わりに、純度は、質量分析法、顕微鏡法、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、ＵＶ又はＵＶ－ｖｉｓ分光測色法、蛍光分析法（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又は検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる方法による分離技術の使用なしで決定され得る。
ある実施形態において、純度は、生物学的試験方法（例えば、細胞ベース又は受容体ベースの試験）によって測定され得る。ある実施形態において、本明細書に記載される製剤中のリボヌクレオチドの総質量の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）又は１００％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子に含まれる。パーセントは、質量分析法、ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ、蛍光、光散乱、屈折率に基づく検出技術、又は検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用するものを用いて、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いて又は用いずに、限定はされないが、クロマトグラフィー（カラムを用いる、紙を用いる、ゲルを用いる、ＨＰＬＣを用いる、ＵＨＰＬＣを用いるなど、又はＩＣ、ＳＥＣ、逆相、アニオン交換、混合モードなどによる）又は電気泳動（尿素ＰＡＧＥ、チップペース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）などの分離技術の使用などの、当業者に公知のいくつかの分析技術のいずれか１つによって測定され得る。代わりに、純度は、質量分析法、顕微鏡法、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、ＵＶ又はＵＶ－ｖｉｓ分光測色法、蛍光分析法（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、又は検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を用いる方法による分離技術の使用なしで決定され得る。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、１００，０００μｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド濃度を有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、モノヌクレオチドを実質的に含まないか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、若しくは１００，０００μｇ／ｍＬ以下のモノヌクレオチド含量を有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、検出限界から１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬまでのモノヌクレオチド含量を有する。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、質量基準で全ヌクレオチドの０．１％（ｗ／ｗ）、０．２％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）、０．４％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、０．６％（ｗ／ｗ）、０．７％（ｗ／ｗ）、０．８％（ｗ／ｗ）、０．９％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）以下、又はそれらの間の任意のパーセンテージのモノヌクレオチド含量を有し、ここで、全ヌクレオチド含量は、デオキシリボヌクレオチド分子及びリボヌクレオチド分子の総質量である。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬ以下の線状ＲＮＡ含量、例えば、線状ＲＮＡ同等物又はＲＮＡフラグメントを有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、検出限界から１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、６００ｍｇ／ｍｌ、６５０ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ、又は７５０ｍｇ／ｍｌまでの線状ＲＮＡ含量、例えば、線状ＲＮＡ同等物又はＲＮＡフラグメントを有する。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、１０％（ｗ／ｗ）、９．９％（ｗ／ｗ）、９．８％（ｗ／ｗ）、９．７％（ｗ／ｗ）、９．６％（ｗ／ｗ）、９．５％（ｗ／ｗ）、９．４％（ｗ／ｗ）、９．３％（ｗ／ｗ）、９．２％（ｗ／ｗ）、９．１％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、若しくは０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれらの間のパーセンテージのニックＲＮＡ含量を有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、ゼロ程度のニックＲＮＡ含量を有するか、又はニックＲＮＡを実質的に含まない。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、３０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、０．５％（ｗ／ｗ）、若しくは０．１％（ｗ／ｗ）以下、又はそれらの間のパーセンテージの組み合わされた線状ＲＮＡ及びニックＲＮＡ含量を有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、ゼロ程度の組み合わされたニックＲＮＡ及び線状ＲＮＡ含量を有するか、又はニック及び線状ＲＮＡを実質的に含まない。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、質量分析法、ＵＶ分光学的若しくは蛍光検出器、光散乱技術、ＨＰＬＣを含む分離の方法の使用を用いるか若しくは用いない表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＨＰＬＣによるもの、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いた若しくは用いないチップ若しくはゲルベースの電気泳動、銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用する検出方法、又は顕微鏡法、視覚法若しくは分光光度計を用いる方法などの分析方法の検出限界以下の、線状ＲＮＡ含量、例えば、線状ＲＮＡ同等物又はＲＮＡフラグメントを有する。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、例えば、実施例２中の方法によって測定した際に、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ＲＮＡを有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状同等物又はそのフラグメントを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤の線状ポリリボヌクレオチド分子は、線状同等物（例えば、環状化前形態）を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドに対する非同等物又はそのフラグメントを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤の線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドに対する非同等物を含む。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドの同等物と、環状ポリリボヌクレオチドの非同等物又はそのフラグメントとの組合せを含む。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチドの同等物と、環状ポリリボヌクレオチドの非同等物との組合せを含む。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子フラグメントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又はそれらの間の任意のヌクレオチド数であるフラグメントである。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、例えば、分光光度計によって測定した際に、約１．６～約２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。ある実施形態において、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比は、約１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、又はそれらの間の任意の数である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体）は、例えば、分光光度計によって測定した際に、約１．８を超えるＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を有する。ある実施形態において、Ａ２６０／Ａ２８０吸光度比は、約１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又はそれ以上である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、不純物を実質的に含まない。様々な実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物中の少なくとも１つの不純物のレベルは、不純物を除去するための精製又は処理前の組成物のものと比較して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）減少される。ある実施形態において、少なくとも１つのプロセス関連不純物のレベルは、不純物を除去するための精製又は処理前の組成物のものと比較して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）減少される。ある実施形態において、少なくとも１つの生成物関連物質のレベルは、不純物を除去するための精製又は処理前の組成物のものと比較して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）減少される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）はさらに、プロセス関連不純物を実質的に含まない。ある実施形態において、プロセス関連不純物は、タンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）、デオキシリボ核酸（例えば、宿主細胞デオキシリボ核酸などの細胞デオキシリボ核酸）、モノデオキシリボヌクレオチド又はジデオキシリボヌクレオチド分子、酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、又はリガーゼ）、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料を含む。ある実施形態において、不純物は、緩衝液試薬、リガーゼ、ヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＲＮａｓｅ Ｒ、デオキシリボヌクレオチド分子、アクリルアミドゲル破片、及びモノデオキシリボヌクレオチド分子から選択される。ある実施形態において、医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質）汚染を含む。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、ＤＮＡ含量、例えば、鋳型ＤＮＡ又は細胞ＤＮＡ（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）を実質的に含まないか、ゼロ程度のＤＮＡ含量を有するか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のＤＮＡ含量を有する。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、ＤＮＡ含量を実質的に含まないか、ゼロ程度のＤＮＡ含量を有するか、又は質量基準で全ヌクレオチドの０．００１％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のＤＮＡ含量を有し、ここで、全ヌクレオチド分子は、デオキシリボヌクレオチド含量及びリボヌクレオチド分子の総質量である。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、ＤＮＡ含量を実質的に含まないか、ゼロ程度のＤＮＡ含量を有するか、又は定量液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によってヌクレオシドを消化する酵素による全ＤＮＡ消化後に測定した際に質量基準で全ヌクレオチドの０．００１％（ｗ／ｗ）、０．０１％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下のＤＮＡ含量を有し、ここで、ＤＮＡの含量が、ＬＣ－ＭＳによって測定した際に、各塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の標準曲線から逆算される。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ以下のタンパク質（例えば，細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素、生成関連タンパク質、例えば、担体タンパク質）汚染を有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体）は、検出限界から０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌまでのタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素などの生成関連タンパク質）汚染を有する。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、環状ポリリボヌクレオチドのミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素などの生成関連タンパク質）汚染を有する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体）は、環状ポリリボヌクレオチドのミリグラム（ｍｇ）当たり、検出のレベルから０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇまでのタンパク質（例えば、細胞タンパク質（ＣＰ）、例えば、酵素などの生成関連タンパク質）汚染を有する。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、例えば、リムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）試験によって測定した際に、低いレベルのエンドトキシンを有するか、又はエンドトキシンを実質的に含まない。ある実施形態において、医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの生成における中間体は、リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、２０ＥＵ／ｋｇ（重量）、１０ＥＵ／ｋｇ、５ＥＵ／ｋｇ、１ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まない。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド組成物は、低いレベルのヌクレアーゼ若しくはリガーゼを有するか、又はヌクレアーゼ若しくはリガーゼを含まない。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、約５０％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、１９％（ｗ／ｗ）、１８％（ｗ／ｗ）、１７％（ｗ／ｗ）、１６％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、１４％（ｗ／ｗ）、１３％（ｗ／ｗ）、１２％（ｗ／ｗ）、１１％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）以下の少なくとも１つの酵素、例えば、ポリメラーゼ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼを含む。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、滅菌されているか、又は微生物を実質的に含まず、例えば、組成物又は製剤は、無菌状態下で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援し、組成物又は製剤は、ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たし、及び／又は組成物又は製剤は、ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たす。ある実施形態において、医薬製剤は、滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ、５０ＣＦＵ／１００ｍｌ、４０ＣＦＵ／１００ｍｌ、３０ＣＦＵ／１００ｍｌ、２００ＣＦＵ／１００ｍｌ、１０ＣＦＵ／１００ｍｌ、又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤はさらに、カラムクロマトグラフィー又はｐＨ／バイアル不活性化などの、不純物を除去するための当該技術分野において公知の技術を用いて精製され得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤は、環状ポリリボヌクレオチド製剤が、精製工程前と比較して、精製工程（又は複数の精製工程）に供されたとき、対象への投与後に免疫又は炎症反応の減少したレベルの１つ以上のマーカーを生成する。精製は、本明細書に記載されるように、例えば、実施例１～８にあるように行われ得る。ある実施形態において、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、サイトカイン又は免疫応答関連遺伝子である。ある実施形態において、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、ＩＦＮ－β、ＯＡＳ、及びＯＡＳＬなどの遺伝子の発現である。
一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド製剤（例えば、環状ポリリボヌクレオチド医薬製剤又は組成物又は環状ポリリボヌクレオチド製剤の生成における中間体）は、例えば、実施例３に記載されるアッセイによって測定した際に、発現産物、例えば、タンパク質、例えば、インビトロ翻訳活性を発現する。
医薬組成物
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を含む。医薬組成物は、１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質を任意選択的に含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載される組成物（例えば、米国食品医薬品局（ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、不活性成分データベース（Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅ）に列挙される不活性成分のいずれか１つなどの、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）のためのビヒクル又は媒体として働く不活性物質を任意選択的に含み得る。本発明の医薬組成物は、滅菌されており且つ／又はパイロジェンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に援用される）に見られる。不活性物質の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油、及びそれらの混合物が挙げられる。
本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。医薬組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物；及び／又は家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、及び／又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、有効成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせて、次に必要に応じて及び／又は望ましい場合、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
医薬環状ＲＮＡ製剤を製造する方法
本明細書に開示される医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品を製造するための方法は、線状ＲＮＡ及び／又はニックＲＮＡを減少させるように、環状ポリリボヌクレオチドの製剤を処理する工程と、残っている線状ＲＮＡ及び／又はニックＲＮＡの量を評価する工程と、製剤をさらに処理して、医薬用途のための医薬組成物、原薬、又は薬剤製品を生成する工程とを含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品を製造するための方法は、環状ポリリボヌクレオチドの製剤を提供する工程と、線状ＲＮＡ及び／又はニックＲＮＡの量について製剤を評価する工程と、評価が、線状ＲＮＡ及び／又はニックＲＮＡについて所定の参照基準、例えば医薬品放出規格を満たす場合、製剤を処理して、医薬用途のための医薬組成物、原薬、又は薬剤製品を生成する工程とを含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品を試験するための方法は、環状ポリリボヌクレオチドの製剤を提供する工程と、線状ＲＮＡの量について製剤を評価する工程と、評価が、線状ＲＮＡについて所定の参照基準、例えば医薬品放出規格を満たすかどうかを決定する工程とを含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品を試験するための方法は、環状ポリリボヌクレオチドの製剤を提供する工程と、ニックＲＮＡの量について製剤を評価する工程と、評価が、ニックＲＮＡについて所定の参照基準、例えば医薬品放出規格を満たすかどうかを決定する工程とを含み得る。
例えば、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子の存在である。
例えば、製剤中に存在する環状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の分子である。
例えば、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子である。
例えば、製剤中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、又は１５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子である。
例えば、製剤中に存在する組み合わされたニック及び線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の組み合わされたニック及び線状ポリリボヌクレオチド分子である。ある実施形態において、医薬製剤は、最終的な環状ポリリボヌクレオチド薬剤製品の中間の医薬製剤である。ある実施形態において、医薬製剤は、原薬又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）である。ある実施形態において、医薬製剤は、対象に投与するための薬剤製品である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、（線状ＲＮＡの減少の前、その間又はその後）、ＤＮＡ、タンパク質汚染（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞タンパク質又はタンパク質プロセス不純物）、エンドトキシン、モノヌクレオチド分子、及び／又はプロセス関連不純物を実質的に除去するようにさらに処理される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、例えば、それが、線状ＲＮＡレベルについて規格を満たす場合、医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、医薬品賦形剤は、ｐＨを制御するための無機若しくは有機緩衝液、糖、アミノ酸又は環状ポリリボヌクレオチド安定性のための任意の他の材料、塩化ナトリウム若しくは張度を調整するための任意の他の材料、又は非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を含む。ある実施形態において、医薬品賦形剤は、単糖、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、若しくはトレハロース）、三糖、多糖、アミノ糖（例えば、メグルミン）、多価アルコール、塩（例えば、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、若しくは塩化ナトリウム）、ステアリン酸マグネシウム、アミノ酸（例えば、ヒスチジン又はアルギニン）、界面活性剤（例えば、グリセロール又はポリソルベート８０）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、カンファースルホン酸、又はリオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（例えば、シクロデキストリン）を含む。ある実施形態において、医薬品賦形剤は、クエン酸緩衝液を含む。ある実施形態において、医薬品賦形剤は、供与体メチル基Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を含む。ある実施形態において、医薬品賦形剤は、α－テルピネオール；α－トコフェロール；酢酸α－トコフェロール；α－トコフェロール；１，２，６－ヘキサントリオール；１，２－ジミリストイル－Ｓｎ－グリセロ－３－（ホスホ－Ｓ－）；１－グリセロール；１，２－ジミリストイル－Ｓｎ－グリセロ－３－；ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－Ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；１，２－ジパルミトイル－Ｓｎ－グリセロ－３－（ホスホ－）；Ｒａｃ－（１－グリセロール）；１，２－ジステアロイル－Ｓｎ－グリセロ－３－（ホスホ－Ｒａｃ－）；１，２－ジステアロイル－Ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；１－Ｏ－トリルビグアニド；２－エチル－１，６－ヘキサンジオール；酢酸；氷酢酸；無水酢酸；アセトン；アセトン重亜硫酸ナトリウム；アセチル化ラノリンアルコール；アセチル化モノグリセリド；アセチルシステイン；アセチルトリプトファン、ＤＬ－；アクリレートコポリマー；アクリル酸－イソオクチルアクリレートコポリマー；アクリル系接着剤７８８；活性炭；Ａｄｃｏｔｅ ７２Ａ１０３；アジピン酸；Ａｅｒｏｔｅｘ Ｒｅｓｉｎ ３７３０；アラニン（注入）；凝集アルブミン；コロイド状アルブミン；ヒトアルブミン；アルコール；無水アルコール；変性アルコール；希釈アルコール；Ａｌｆａｄｅｘ；アルギン酸；アルキルアンモニウムスルホン酸ベタイン；アルキルアリールスルホン酸ナトリウム；アラントイン；アリルα－イオノン；アーモンド油；酢酸アルミニウム；アルミニウムクロルヒドロキシアラントイネート；水酸化アルミニウム；水和水酸化アルミニウム－スクロース；水酸化アルミニウムゲル；水酸化アルミニウムゲルＦ ５００；水酸化アルミニウムゲルＦ ５０００；モノステアリン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；アルミニウムポリエステル；ケイ酸アルミニウム；オクテニルコハク酸デンプンアルミニウム；ステアリン酸アルミニウム；塩基性酢酸アルミニウム；無水硫酸アルミニウム；Ａｍｅｒｃｈｏｌ Ｃ；Ａｍｅｒｃｈｏｌ－Ｃａｂ；アミノメチルプロパノール；アンモニア；アンモニア溶液；濃アンモニア溶液；酢酸アンモニウム；水酸化アンモニウム；ラウリル硫酸アンモニウム；アンモニウムノノキシノール－４スルフェート；Ｃ－１２～Ｃ－１５直鎖のアンモニウム塩；第一級アルコールエトキシレート；硫酸アンモニウム；Ａｍｍｏｎｙｘ；Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ－２；Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ－９；アネトール；無水クエン酸；無水デキストロース；無水ラクトース；無水クエン酸三ナトリウム；アニス油；Ａｎｏｘｉｄ Ｓｂｎ；消泡剤；アンチピリン；アパフルラン；杏仁油Ｐｅｇ－６エステル；Ａｑｕａｐｈｏｒ；アルギニン；Ａｒｌａｃｅｌ；アスコルビン酸；パルミチン酸アスコルビル；アスパラギン酸；ペルーバルサム（Ｂａｌｓａｍ Ｐｅｒｕ）；硫酸バリウム；蜜ろう；合成蜜ろう；ベヘネス－１０；ベントナイト；塩化ベンザルコニウム；ベンゼンスルホン酸；塩化ベンゼトニウム；臭化ベンゾドデシニウム；安息香酸；ベンジルアルコール；安息香酸ベンジル；塩化ベンジル；ベータデクス；ビバプシチド；次没食子酸ビスマス；ホウ酸；ブロクリナト；ブタン；ブチルアルコール；ビニルメチルエーテル／マレイン酸のブチルエステル；無水物コポリマー（１２５０００Ｍｗ）；ステアリン酸ブチル；ブチル化ヒドロキシアニソール；ブチル化ヒドロキシトルエン；ブチレングリコール；ブチルパラベン；酪酸；Ｃ２０～４０パレス－２４；カフェイン；カルシウム；炭酸カルシウム；塩化カルシウム；グルセプト酸カルシウム；水酸化カルシウム；乳酸カルシウム；カルコブトロール（Ｃａｌｃｏｂｕｔｒｏｌ）；カルジアミドナトリウム；カロキセト酸三ナトリウム（Ｃａｌｏｘｅｔａｔｅ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ）；カルテリドールカルシウム；カナダバルサム；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド；カプリル酸／カプリン酸／ステアリン酸トリグリセリド；カプタン；カプチゾール；カラメル；カルボマー１３４２；カルボマー１３８２；カルボマー９３４；カルボマー９３４ｐ；カルボマー９４０；カルボマー９４１；カルボマー９８０；カルボマー９８１；カルボマーホモポリマーＢ型（アリル）；ペンタエリトリトール（架橋））；カルボマーホモポリマーＣ型（アリル）；ペンタエリトリトール（架橋））；二酸化炭素；カルボキシビニルコポリマー；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム；カルボキシポリメチレン；カラギーナン；カラギーナン塩；ヒマシ油；ニオイヒバ油セルロース；微晶質セルロース；Ｃｅｒａｓｙｎｔ－Ｓｅ；セレシン；セテアレス－１２；セテアレス－１５；セテアレス－３０；セテアリルアルコール／セテアレス－２０；エチルヘキサン酸セテアリル；セテス－１０；セテス－２；セテス－２０；セテス－２３；セトステアリルアルコール；塩化セトリモニウム；セチルアルコール；セチルエステルワックスｌ；パルミチン酸セチル；塩化セチルピリジニウム；クロロブタノール；クロロブタノール半水和物Ｉ；無水クロロブタノール；クロロクレゾール；クロロキシレノール；コレステロール；コレス；コレス－２４；シトレート；クエン酸；クエン酸一水和物；含水クエン酸；コカミドエーテルスルフェート；コカミンオキシド；ココベタイン；ココジエタノールアミド；ココモノエタノールアミド；カカオ脂；ココ－グリセリド；ヤシ油；硬化ヤシ油；ヤシ油／パーム核油グリセリド；ココイルカプリロカプレート；コラノキ（Ｃｏｌａ Ｎｉｔｉｄａ）種子抽出物；コラーゲン；着色料懸濁剤；トウモロコシ油；綿実油；クリーム基剤；クレアチン；クレアチニン；クロスカルメロースナトリウム；クロスポビドン；硫酸銅；無水硫酸銅；シクロメチコン；シクロメチコン／ジメチコンコポリオール；システイン；塩酸システイン；無水塩酸システイン；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２８；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３９；Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０；ダルファムプリジン；Ｄａｕｂｅｒｔ １－５ Ｐｅｓｔｒ（Ｍａｔｔｅ）１６４ｚ；デシルメチルスルホキシド；Ｄｅｈｙｄａｇ Ｗａｘ Ｓｘ；デヒドロ酢酸；Ｄｅｈｙｍｕｌｓ Ｅ；安息香酸デナトニウム；デオキシコール酸；デキストラン；デキストラン４０；デキストリン；デキストロース；デキストロース一水和物；デキストロース溶液；ジアトリゾ酸；ジアゾリジニル尿素；ジクロロベンジルアルコール；ジクロロジフルオロメタン；ジクロロテトラフルオロエタン；ジエタノールアミン；ピロ炭酸ジエチル；セバシン酸ジエチル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；フタル酸ジエチルヘキシル；アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム；ジイソプロパノールアミン；アジピン酸ジイソプロピル；ジリノール酸ジイソプロピル；ジメチコン３５０；ジメチコンコポリオール；ジメチコンＭｄｘ４－４２１０；ジメチコン医療用流体３６０；ジメチルイソソルビド；ジメチルスルホキシド；ジメチルアミノエチルメタクリレートーブチル；メタクリレート－メチルメタクリレート、コポリマー；ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト；ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン、コポリマー；ジノセブアンモニウム塩；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；ジプロピレングリコール；ココアンホ二酢酸二ナトリウム；スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム；スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム；スルホサリチル酸二ナトリウム；ジソフェニン；ジビニルベンゼンスチレンコポリマー；Ｄｍｄｍヒダントイン；ドコサノール；ドクサートナトリウム；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ２８０－２５１６；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ３８７－２５１６；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８０－１１９６；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８７－２０７０；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８７－２１９４；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８７－２２８７；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８７－２２９６；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８７－２８８８；Ｄｕｒｏ－Ｔａｋ ８７－２９７９；エデト酸カルシウム二ナトリウム；エデト酸二ナトリウム；無水エデト酸二ナトリウム；エデト酸ナトリウム；卵リン脂質；エンツホン；エンツホン；エピラクトース；エピテトラサイクリン塩酸塩；Ｅｓｓｅｎｃｅ Ｂｏｕｑｕｅｔ ９２００；エタノールアミン塩酸塩；酢酸エチル；オレイン酸エチル；エチルセルロース；エチレングリコール；エチレン酢酸ビニルコポリマー；エチレンジアミン；エチレンジアミン二塩酸塩；エチレン－プロピレンコポリマー；エチレン－酢酸ビニルコポリマー；エチレン－酢酸ビニルコポリマー；ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル；エチルパラベン；ユーカリプトール；エキサメタジム；食用脂肪；固形脂肪；脂肪酸エステル；脂肪酸ペンタエリトリオールエステル；脂肪酸；クエン酸脂肪アルコール；脂肪アルコール；Ｆｄ＆ＣブルーＮｏ．１；Ｆｄ＆ＣグリーンＮｏ．３；Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４；Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４０；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．１０；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．５；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．６；塩化第二鉄；酸化第二鉄；香味料８９－１８６；香味料８９－２５９；香味料Ｄｆ－１１９；香味料Ｄｆ－１５３０；香味増強剤；香味料イチジク８２７１１８；香味料ラズベリーＰｆｃ－８４０７；医薬用香味料Ｒｈｏｄｉａ Ｎｏ．Ｒｆ ４５１；フルオロクロロ炭化水素；ホルムアルデヒド；ホルムアルデヒド；分留ヤシ油；香料３９４９－５；香料５２０ａ；香料６．００７；香料９１－１２２；香料９１２８－Ｙ；香料９３４９８ｇ；香料マツバルサムＮｏ．５１２４；香料Ｂｏｕｑｕｅｔ １０３２８；香料Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ ６４０１－Ｂ；香料Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ ６４１１；香料Ｃｒｅａｍ Ｎｏ．７３４５７；香料Ｃｓ－２８１９７；香料Ｆｅｌｔｏｎ ０６６ｍ；香料Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ ４７３７３；香料Ｇｉｖａｕｄａｎ Ｅｓｓ ９０９０／１ ｃ；香料Ｈ－６５４０；香料Ｈｅｒｂａｌ １０３９６；香料Ｎｊ－１０８５；香料Ｐ Ｏ Ｆｌ－１４７；香料Ｐａ ５２８０５；香料Ｐｅｒａ Ｄｅｒｍ Ｄ；香料Ｒｂｄ－９８１９；香料Ｓｈａｗ Ｍｕｄｇｅ Ｕ－７７７６；香料Ｔｆ ０４４０７８；香料Ｕｎｇｅｒｅｒ Ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ Ｋ ２７７１；香料Ｕｎｇｅｒｅｒ Ｎ５１９５；フルクトース；酸化ガドリニウム；ガラクトース；γシクロデキストリン；ゼラチン；架橋ゼラチン；Ｇｅｌｆｏａｍスポンジ；ゲランガム（低アシル）；Ｇｅｌｖａ ７３７；ゲンチジン酸；ゲンチジン酸エタノールアミド；グルセプト酸ナトリウム；グルセプト酸ナトリウム二水和物；グルコノラクトン；グルクロン酸；グルタミン酸；グルタチオン；グリセリン；水素化ロジンのグリセロールエステル；クエン酸グリセリル；イソステアリン酸グリセリル；ラウリン酸グリセリル；モノステアリン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル／プロピレングリコール；パルミチン酸グリセリル；リシノ
ール酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル－ラウレス－２３；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇステアレート；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ－１００ステアレート；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ－４０ステアレート；ステアリン酸グリセリル－ステアラミドエチル；ジエチルアミン；トリオレイン酸グリセリル；グリシン；グリシン塩酸塩；ジステアリン酸グリコール；ステアリン酸グリコール；グアニジン塩酸塩；グアーガム；ヘアコンディショナー（１８ｎｌ９５－ｌｍ）；ヘプタン；ヘタスターチ；ヘキシレングリコール；高密度ポリエチレン；ヒスチジン；ヒトアルブミンミクロスフェア；ヒアルロン酸ナトリウム；炭化水素；可塑化炭化水素ゲル；塩酸；希塩酸；ヒドロコルチゾン；ヒドロゲルポリマー；過酸化水素；硬化ヒマシ油；硬化パーム油；硬化パーム／パーム核油Ｐｅｇ－６；エステル；水素化ポリブテン６３５－６９０；水酸化イオン；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸；ヒドロキシメチルセルロース；ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６；ヒドロキシプロピル－βシクロデキストリン；ヒプロメロース２２０８（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース２９１０（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース；イミド尿素；ヨウ素；ヨードキサム酸；イオフェタミン塩酸塩；アイリッシュモス抽出物；イソブタン；イソセテス－２０；イソロイシン；イソオクチルアクリレート；イソプロピルアルコール；イソステアリン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル－ミリスチルアルコール；パルミチン酸イソプロピル；ステアリン酸イソプロピル；イソステアリン酸；イソステアリルアルコール；等張塩化ナトリウム溶液；Ｊｅｌｅｎｅ；カオリン；Ｋａｔｈｏｎ Ｃｇ；Ｋａｔｈｏｎ Ｃｇ ＩＩ；ラクテート；乳酸；乳酸；乳酸；ラクトビオン酸；ラクトース；ラクトース一水和物；含水ラクトース；ラネス；ラノリン；ラノリンアルコール－鉱油；ラノリンアルコール；無水ラノリン；ラノリンコレステロール；ラノリン非イオン性誘導体；エトキシ化ラノリン；水素化ラノリン；塩化ラウラルコニウム；酸化ラウラミン；ラウルジモニウム加水分解動物コラーゲン；硫酸ラウレス；ラウレス－２；ラウレス－２３；ラウレス－４ Ｔ；ラウリン酸ジエタノールアミド；ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド；ラウロイルサルコシン；乳酸ラウリル；硫酸ラウリル；イングリッシュラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ Ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）花頂部；レシチン；無漂白レシチン；卵レシチン；水素化レシチン；水素化大豆レシチン；大豆レシチン；レモン油；ロイシン；レブリン酸；リドフェニン；軽油；軽油（８５Ｓｓｕ）；リモネン、（＋／－）－；リポコールＳｃ－１５；リジン；酢酸リジン；リジン一水和物；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；ケイ酸アルミニウムマグネシウム水和物；塩化マグネシウム；硝酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；マレイン酸；マンニトール；マプロフィックス（Ｍａｐｒｏｆｉｘ）；メブロフェニン（Ｍｅｂｒｏｆｅｎｉｎ）；医療用接着剤改変型Ｓ－１５；医療用消泡剤Ａ－Ｆエマルジョン；メドロン酸二ナトリウム；メドロン酸；メグルミン；メントール；メタクレゾール；メタリン酸；メタンスルホン酸；メチオニン；メチルアルコール；メチルグルセス－１０；メチルグルセス－２０；セスキステアリン酸メチルグルセス－２０；セスキステアリン酸メチルグルコース；ラウリン酸メチル；メチルピロリドン；サリチル酸メチル；ステアリン酸メチル；メチルボロン酸；メチルセルロース（４０００Ｍｐａ．Ｓ）；メチルセルロース；メチルクロロイソチアゾリノン；メチレンブルー；メチルイソチアゾリノン；メチルパラベン；微結晶性ワックス；鉱油；モノ及びジグリセリド；クエン酸モノステアリル；モノチオグリセロール；マルチステロール（Ｍｕｌｔｉｓｔｅｒｏｌ）抽出物；ミリスチルアルコール；乳酸ミリスチル；ミリスチル－γ－ピコリニウムクロリド；Ｎ－（カルバモイル－メトキシＰｅｇ－４０）－１，２－；ジステアロイル－セファリンナトリウム；Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド；ナイアシンアミド；ニオキシム；硝酸；Ｐｅｇ－２ステアレート；酢酸フェニル水銀；硝酸フェニル水銀；卵ホスファチジルグリセロール；リン脂質；卵リン脂質；ホスホリポン９０ｇ；リン酸；松葉油（ヨーロッパアカマツ（Ｐｉｎｕｓ Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））；ピペラジン六水和物；プラスチベース－５０ｗ；ポラクリリンイオントフォレシス（Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；塩化ポリドロニウム；ポロキサマー１２４；ポロキサマー１８１；ポロキサマー１８２；ポロキサマー１８８；ポロキサマー２３７；ポロキサマー４０７；ポリ（ビス（Ｐ－カルボキシフェノキシ）プロパン；無水物、セバシン酸；末端ブロック化ポリ（ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン／メチルヒドロゲンシロキサン）ジメチルビニル、ジメチルヒドロキシ、若しくはトリメチル；ポリ（Ｄｌ－乳酸－Ｃｏ－グリコール酸）；ポリ（Ｄｌ－乳酸－Ｃｏ－グリコール酸）；ポリアクリル酸（２５００００Ｍｗ）；ポリブテン（１４００Ｍｗ）；ポリカルボフィル；ポリエステル；ポリエステルポリアミンコポリマー；ポリエステルレーヨン；ポリエチレングリコール１０００；ポリエチレングリコール１４５０；ポリエチレングリコール１５００；ポリエチレングリコール１５４０；ポリエチレングリコール２００；ポリエチレングリコール３００；ポリエチレングリコール３００－１６００；ポリエチレングリコール３３５０；ポリエチレングリコール４００；ポリエチレングリコール４０００；ポリエチレングリコール５４０；ポリエチレングリコール６００；ポリエチレングリコール６０００；ポリエチレングリコール８０００；ポリエチレングリコール９００；第二鉄含有高密度ポリエチレン；黒色酸化物（＜１％）；低密度ポリエチレン；硫酸バリウム（２０～２４％）；ポリエチレンＴ；ポリエチレンテレフタレート；ポリグラクチン；ポリグリセリル３オレエート；ポリグリセリル４オレエート；ポリヒドロキシエチルメタクリレート；ポリイソブチレン；ポリイソブチレン（１１０００００Ｍｗ）；ポリイソブチレン（３５０００Ｍｗ）；ポリイソブチレン１７８－２３６；ポリイソブチレン２４１－２９４；ポリイソブチレン３５－３９；低分子量ポリイソブチレン；中分子量ポリイソブチレン；ポリイソブチレン／ポリブテン接着剤；ポリラクチド；ポリオール；ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン１８００；ポリオキシエチレンアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンプロピレン；ポリオキシル２０セトステアリルエーテル；ポリオキシル３５ヒマシ油；ポリオキシル４０硬化ヒマシ油；ステアリン酸ポリオキシル４０；ステアリン酸ポリオキシル４００；パルミトステアリン酸ポリオキシル６及びポリオキシル３２；ジステアリン酸ポリオキシル；ポリオキシルステアリン酸グリセリル；ポリオキシルラノリン；パルミチン酸ポリオキシル；ステアリン酸ポリオキシル；ポリプロピレン；ポリプロピレングリコール；ポリクオタニウム－１０；ポリクオタニウム－７；アクリルアミド／Ｄａｄｍａｃ；ポリシロキサン；ポリソルベート２０；ポリソルベート４０；ポリソルベート６０；ポリソルベート６５；ポリソルベート８０；ポリウレタン；ポリ酢酸ビニル；ポリビニルアルコール；ポリ塩化ビニル；ポリ塩化ビニル－ポリ酢酸ビニル、コポリマー；ポリビニルピリジン；ケシ油；炭酸カリウム；酢酸カリウム；カリウムミョウバン；炭酸水素カリウム；亜硫酸水素カリウム；塩化カリウム；クエン酸カリウム；水酸化カリウム；メタ重亜硫酸カリウム；リン酸二カリウム；リン酸二水素カリウム；カリウム石鹸；ソルビン酸カリウム；ポビドンアクリレートコポリマー；ポビドンヒドロゲルイオントフォレシス（Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；ポビドンＫ１７；ポビドンＫ２５；ポビドンＫ２９／３２；ポビドンＫ３０；ポビドンＫ９０；ポビドンＫ９０ｆ；ポビドン／エイコセンコポリマー；ポビドン；Ｐｐｇ－１２／Ｓｍｄｉコポリマー；Ｐｐｇ－１５ステアリルエーテル；Ｐｐｇ－２０メチルグルコースエーテルジステアレート；Ｐｐｇ－２６オレエート；プロダクトワット（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｗａｔ）；プロリン；プロムルゲン（Ｐｒｏｍｕｌｇｅｎ）Ｄ；プロムルゲンＧ；プロパン；噴霧剤Ａ－４６；没食子酸プロピル；炭酸プロピレン；プロピレングリコール；プロピレングリコールジアセテート；プロピレングリコールジカプリレート；プロピレングリコールモノラウレート；プロピレングリコールモノパルミトステアレート；プロピレングリコールパルミトステアレート；プロピレングリコールリシノレエート；プロピレングリコール／ジアゾリジニル；尿素／メチルパラベン／プロピルパラベン；プロピルパラベン；硫酸プロタミン；タンパク質加水分解物；Ｐｖｍ／Ｍａコポリマー；クアテルニウム－１５；クアテルニウム－１５シス型；クアテルニウム－５２；Ｒａ－２３９７；Ｒａ－３０１１；サッカリン；サッカリンナトリウム；無水サッカリンナトリウム；サフラワー油；Ｓｄアルコール３ａ；Ｓｄアルコール４０；Ｓｄアルコール４０－２；Ｓｄアルコール４０ｂ；Ｓｅｐｉｎｅｏ Ｐ ６００；セリン；ゴマ油；シアバター；Ｓｉｌａｓｔｉｃ医療用接着剤；シリコーンＡ型；シリカ；ケイ素；二酸化ケイ素；シリコーン；シリコーン接着剤４１０２；シリコーン接着剤４５０２；シリコーン接着剤Ｂｉｏ－Ｐｓａ Ｑ７－４２０１；シリコーン接着剤Ｂｉｏ－Ｐｓａ Ｑ７－４３０１；シリコーンエマルジョン；シリコーン／ポリエステルフィルムストリップ；シメチコン；シメチコンエマルジョン；Ｓｉｐｏｎ Ｌｓ ２０ｎｐ；ソーダ灰；酢酸ナトリウム；無水酢酸ナトリウム；アルキル硫酸ナトリウム；アスコルビン酸ナトリウム；安息香酸ナトリウム；炭酸水素ナトリウム；重硫酸ナトリウム；重亜硫酸ナトリウム；ホウ酸ナトリウム；ホウ酸ナトリウム十水和物；炭酸ナトリウム；炭酸ナトリウム十水和物；炭酸ナトリウム一水和物；セトステアリル硫酸ナトリウム；塩素酸ナトリウム；塩化ナトリウム；コレステリル硫酸ナトリウム；クエン酸ナトリウム；ココイルサルコシンナトリウム；デソキシコール酸ナトリウム；亜ジチオン酸ナトリウム；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；グルコン酸ナトリウム；水酸化ナトリウム；次亜塩素酸ナトリウム；ヨウ化ナトリウム；乳酸ナトリウム；乳酸ナトリウム、Ｌ－；ラウレス－２硫酸ナトリウム；ラウレス－３硫酸ナトリウム；ラウレス－５硫酸ナトリウム；ラウロイルサルコシンナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム；ラウリルスルホ酢酸ナトリウム；メタ重亜硫酸ナトリウム；硝酸ナトリウム；リン酸ナトリウム；リン酸ナトリウム二水和物；リン酸水素ナトリウム；無水リン酸水素ナトリウム；リン酸水素ナトリウム二水和物；リン酸水素ナトリウム十二水和物；リン酸水素ナトリウム七水和物；リン酸一ナトリウム；無水リン酸一ナトリウム；リン酸一ナトリウム二水和物；リン酸一ナトリウム又は一水和物；ポリアクリル酸ナトリウム（２５０００００Ｍｗ）；ピロリン酸ナトリウム；ピロリドンカルボン酸ナトリウム；デンプングリコール酸ナトリウム；コハク酸ナトリウム六水和物；硫酸ナトリウム；無水硫酸ナトリウム；硫酸ナトリウム十水和物；亜硫酸ナトリウム；スルホコハク酸ナトリウム化ウンデシレン（Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎａｔｅｄ Ｕｎｄｅｃｙｃｌｅｎｉｃ）、若しくはモノアルキロールアミド；酒石酸ナトリウム；チオグリコール酸ナトリウム；チオリンゴ酸ナトリウム；チオ硫酸ナトリウム；無水チオ硫酸ナトリウム；トリメタリン酸ナトリウム；キシレンスルホン酸ナトリウム；Ｓｏｍａｙ ４４；ソルビン酸；ソルビタン；イソステアリン酸ソルビタン；モノラウリン酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタン；モノパルミチン酸ソルビタン；モノステアリン酸ソルビ
タン；セスキオレイン酸ソルビタン；トリオレイン酸ソルビタン；トリステアリン酸ソルビタン；ソルビトール；ソルビトール溶液；大豆粉；大豆油；スペアミント油；鯨ろう；スクアラン；安定化オキシクロロ錯体；２－エチルヘキサン酸第一スズ；塩化第一スズ；無水塩化第一スズ；フッ化第一スズ；酒石酸第一スズ；デンプン；アルファ化デンプン１５００；トウモロコシデンプン；塩化ステアラルコニウム；ステアラルコニウムヘクトライト／炭酸プロピレン；ステアルアミドエチルジエチルアミン；ステアレス－１０；ステアレス－１００；ステアレス－２；ステアレス－２０；ステアレス－２１；ステアレス－４０；ステアリン酸；ステアリン酸ジエタノールアミド；ステアロキシトリメチルシラン；ステアルトリモニウム加水分解動物；コラーゲン；ステアリルアルコール滅菌水；スチレン／イソプレン／スチレンブロックコポリマー；サクシマー；コハク酸；スクラロース；スクロース；ジステアリン酸スクロース；スクロースポリエステル；スルファセタミドナトリウム；スルホブチルエーテルβ－シクロデキストリン筋肉内；二酸化硫黄；硫酸；亜硫酸；Ｓｕｒｆａｃｔｏｌ Ｑｓ；タガトース、Ｄ－；タルク；トール油；獣脂グリセリド；酒石酸；酒石酸；テノックス；テノックス－２；Ｔｅｒｔ－ブチルアルコール；Ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；Ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン；テトラキス（２－メトキシイソブチルイソシアニド）銅（Ｉ）；テトラフルオロボレート；オルトケイ酸テトラプロピル；テトロホスミン；テオフィリン；チメロサール；トレオニン；チモール；スズ；二酸化チタン；トコフェロール；トコフェルソラン；トリアセチン；トリカプリリン；トリクロロモノフルオロメタン；トリデセス－１０；ラウリル硫酸トリエタノールアミン；トリフルオロ酢酸；中鎖トリグリセリド；トリヒドロキシステアリン；トリラネス－４リン酸；トリラウレス－４リン酸；クエン酸三ナトリウム二水和物；Ｈｅｄｔａ三ナトリウム；Ｔｒｉｔｏｎ ７２０；Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－２００；トロラミン；トロマンタジン；トロメタミン；トリプトファン；チロキサポール；チロシン；ウンデシレン酸；Ｕｎｉｏｎ ７６ Ａｍｓｃｏ－Ｒｅｓ ６０３８；尿素；バリン；植物油；硬化植物油グリセリド；硬化植物油；ベルセタミド；Ｖｉｓｃａｒｉｎ；ビスコース／綿；ビタミンＥ；乳化ワックス、Ｗｅｃｏｂｅｅ Ｆｓ；白色セレシンワックス；白ろう；キサンタンガム；亜鉛；酢酸亜鉛；炭酸亜鉛；塩化亜鉛；又は酸化亜鉛を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と組み合わされる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、スクロース、ラクトース、又はトレハロースなどの二糖を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、スクロースを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、多糖を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、グリセロール又はポリソルベート８０などの界面活性剤を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、α－トコフェロールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、ホスホコリンを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、アルコールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、イソプロピルアルコールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、ラノリンアルコールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、ヒトアルブミンを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、水酸化アルミニウムゲルＦ ５００を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、アスパラギン酸を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、硫酸バリウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、安息香酸を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、カルシウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、塩化カルシウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、カルボキシメチルセルロースを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、クエン酸を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、エチレングリコールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、塩化第二鉄を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、炭化水素ゲルを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、塩化マグネシウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、ナイアシンアミドを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、ポリエチレングリコールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、塩化カリウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、プロピレングリコールを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、炭酸ナトリウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、塩化ナトリウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、乳酸ナトリウムを含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの製剤は、酢酸亜鉛を含む医薬品賦形剤とその後組み合わされる。
ある実施形態において、不純物（例えば、細胞タンパク質、細胞核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料、タンパク質汚染、又はエンドトキシン汚染）の量は、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品が、参照基準を満たすかどうかを決定するために測定される。
例えば、製剤中の存在するＤＮＡの量についての参照基準は、ゼロのＤＮＡ分子の存在であるか、ＤＮＡ分子を実質的に含まないか、又は１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、若しくは５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のＤＮＡの存在である。
例えば、製剤中に存在するタンパク質汚染の量についての参照基準は、環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質汚染の存在である。
ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品中に存在するエンドトキシンの量は、２０ＥＵ／ｋｇ（重量）、１０ＥＵ／ｋｇ、５ＥＵ／ｋｇ、１ＥＵ／ｋｇであるか、又は所定の閾値未満であり、例えば、製剤は、規定の方法による検出限界未満のレベルのエンドトキシンを含む。ある実施形態において、参照基準は、医薬品放出規格である。
ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、滅菌薬剤製品であるか、又は微生物を実質的に含まない（例えば、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援する）。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、ＵＳＰ＜７１＞の標準及び／又はＵＳＰ＜８５＞の標準を満たす。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品はさらに、医薬用途のためにラベルを付けられ、出荷される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ、５０ＣＦＵ／１００ｍｌ、４０ＣＦＵ／１００ｍｌ、３０ＣＦＵ／１００ｍｌ、２００ＣＦＵ／１００ｍｌ、１０ＣＦＵ／１００ｍｌ、又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む。
ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、又は５００ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含む。
ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品はさらに、カラムクロマトグラフィー又はｐＨ／バイアル不活性化などの、不純物を除去するための当該技術分野において公知の技術を用いて精製され得る。
環状化
一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環状化、又はコンカテマー化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達前にインビトロで環状化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環状化され得る。
細胞外環状化
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホジエステル結合を形成し得る。例の反応において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製造業者の説明に従って、１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＲＮＡリガーゼ２のようなスプリントリガーゼが、スプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＤＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハイブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、ＲＮＡリガーゼ２は、線状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、共有結合された環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼであり得る。
一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる線状環状ポリリボヌクレオチドが、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間行われ得る。
一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化され得る。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化するために、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化され得る。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力、及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、５’末端の近傍及び３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに結合して、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それらを環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合するための方法の非限定的な一覧が、米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’トリホスフェートをＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）線状環状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ、又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は１００％である。ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。
スプライシング要素
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スプライシング要素は、環状ポリリボヌクレオチドのスプライシングを媒介し得る完全なスプライシング要素であり得る。代わりに、スプライシング要素は、完了したスプライシング事象からの残留スプライシング要素でもあり得る。例えば、ある場合において、線状ポリリボヌクレオチドのスプライシング要素は、線状ポリリボヌクレオチドの環状化をもたらすスプライシング事象を媒介することができ、それにより、得られる環状ポリリボヌクレオチドは、このようなスプライシングを介した環状化事象からの残留スプライシング要素を含む。ある場合において、残留スプライシング要素は、スプライシングを媒介することができない。他の場合、残留スプライシング要素は、特定の状況下でスプライシングを依然として媒介することができる。ある実施形態において、スプライシング要素は、少なくとも１つの発現配列に隣接する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスプライシング要素を含む。ある実施形態において、スプライシング要素は、各発現配列の１つの側又は両側にあり、発現産物、例えば、ペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製されると、スプライスされた末端が互いに結合される内部スプライシング要素を含む。いくつかの例は、スプライス部位配列及びＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ、及びＡｌｕＳｚなどの短い逆方向反復（３０～４０ｎｔ）、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌｕ要素、並びに隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上流にある）又は後ろにある（下流にある）配列など、バックスプライス事象の近位にある（ｓｕｐｔａｂｌｅ４富化モチーフ）シス－配列要素に見られるモチーフを有する小型のイントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部スプライシング要素として本明細書の他の箇所に記載される少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。ある実施形態において、スプライシングに関連するリボソーム結合タンパク質は、環状ポリリボヌクレオチド生合成を調節し得る（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプライシング因子）。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの頭尾接合部（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に隣接する標準スプライス部位を含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの３－ヌクレオチドバルジによって隣接される４－塩基対ステムを含むバルジ－ヘリックス－バルジモチーフを含み得る。切断がバルジ領域において起こり、末端５’－ヒドロキシル基及び２’，３’－環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、３’，５’－ホスホジエステル架橋を形成する同じ分子の２’，３’－環状ホスフェートへの５’－ＯＨ基の求核攻撃によって進行する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＰＲ要素を有する多量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’－環状ホスフェート及び５’－ＯＨ末端を含む。ＨＰＲ要素は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を自己プロセシングし、それによって末端を互いにライゲートする。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲーションを媒介する配列を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするために、ＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、
Figure 2022523794000004
 ）を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするために、ループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中）を含み得る。別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば、５’及び３’スプライス接合部、又はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンなどの自己環状化触媒イントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例は、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング置換イントロン－エクソン配列、及びテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを含み得る。
他の環状化方法
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態において、相補的配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はそれ以上の対合ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、環状化の化学的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法、又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
ある実施形態において、環状化の酵素的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。ある実施形態において、ライゲーション酵素、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖、又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５、４３（４）：２４５４－２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”、及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。
発現配列
ペプチド又はポリペプチド
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このようなペプチドとしては、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸及びアミノ酸類似体が挙げられる。ペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。このようなペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量並びにこのような化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有し得る。このようなペプチドとしては、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬剤、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。
ポリペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。ポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満のアミノ酸又はそれを下回る長さを有し、有用であり得る。
本発明の環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列によって発現されるペプチド又はポリペプチドの非限定的な例としては、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０１４９］、［０１５０］、及び［０１５２］に記載されているものが挙げられる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、癌）、リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体及びＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素が挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、レポーター分子、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質、例えば蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ化タンパク質、例えばタンパク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えばキチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＳＮＡＰ－タグ、ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＺＺ）タグ、Ｈａｌｏ－タグ、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモジュリン－タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ－タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ－タグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ）；Ｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ－タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ－タグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；Ｓｐｏｔ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－タグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ－タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）を発現する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗原結合タンパク質、例えば、抗体、例えば抗体フラグメント又はその部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメント又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドが細胞内又は無細胞環境で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み又は機能的抗体を形成する他の翻訳後修飾に供され得る。
調節要素
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。複数の調節要素が当業者に周知である。
本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指し得る。ある実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。限定はされないが、開始コドン又は別の開始コドンなど、翻訳を開始させるコドンに隣接するヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は構造に影響を与えることが知られている。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることを用いて、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又は構造を変化させ得る。
一実施形態において、マスキング剤は、マスクされた開始コドン又は別の開始コドンにおける翻訳開始の可能性を低下させるために、コドンをマスクするか又は隠すために、開始コドン又は別の開始コドンの近くで使用され得る。別の実施形態において、マスキング剤は、翻訳が別の開始コドンから開始する可能性を増加させるために、環状ポリリボヌクレオチドの開始コドンをマスクするために使用され得る。
本明細書において提供される調節要素は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０１５６］～［０１６１］に記載されている調節要素のいずれかを含み得る。
翻訳開始配列
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態において、翻訳開始配列、例えばコザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。
環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０超の開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含み得る。翻訳は、第１の開始コドン上で開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドンでないコドン、例えばＡＵＧから開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０１６４］に記載されているものなどの別の翻訳開始配列から開始し得る。
ある実施形態において、翻訳は、Ｒｏｃａｇｌａｔｅｓによる真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングをブロックすることによって抑制されて、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写産物からの早期の上流の翻訳開始及び減少したタンパク質発現につながり、例えばｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照されたい）。
ＩＲＥＳ
ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド中に含むのに好適なＩＲＥＳ要素は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０１６６］～［０１６７］に記載されているものなどの、真核生物リボソームにかみ合うことが可能なＲＮＡ配列を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ又はそれを超える）の発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ又はそれを超える）の発現配列の両側に隣接する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、得られるペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす１つ以上のＩＲＥＳ配列を含む。
終止要素
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終止要素を有していても又は有していなくてもよい。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、環状ポリリボヌクレオチドが連続して翻訳されるように終止要素を欠いている。終止要素の排除は、リボソームの停滞又は落下がないために、発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドのローリングサークル型翻訳又は連続した発現をもたらし得る。このような実施形態において、ローリングサークル型翻訳は、各発現配列を介して連続した発現産物を発現する。ある他の実施形態において、発現配列の終止要素は、スタガー要素の一部であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終止要素を含む。しかしながら、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列のローリングサークル型翻訳又は発現が行われる。このような場合、リボソームが終止要素、例えば終止コドンに遭遇し、翻訳を終止するとき、発現産物は、リボソームから落下し得る。ある実施形態において、翻訳は、リボソーム、例えばリボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドと接触状態を保ちながら終止される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の末端に終止要素を含む。ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、連続して２つ以上の終止要素を含む。このような実施形態において、翻訳が終止され、ローリングサークル型翻訳が終止される。ある実施形態において、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチドと完全に離脱する。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成は、リボソームが翻訳の開始前に環状ポリリボヌクレオチドと再度かみ合うことを必要とし得る。一般に、終止要素は、翻訳の終止を示すインフレームヌクレオチド三つ組、例えばＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終止要素は、限定はされないが、翻訳を終止し得るオフフレーム又は－１及び＋１シフトされたリーディングフレーム（例えば、隠れた停止）などのフレームシフト終止要素である。フレームシフト終止要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレオチド三つ組、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡを含む。フレームシフト終止要素は、細胞に有害であることが多い、ｍＲＮＡの読み違いを防ぐ際に重要であり得る。
スタガー要素
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含む。ローリングサークル型翻訳を維持しながら、連続した発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドの生成を避けるために、スタガー要素は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するために含まれ得る。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成され得る。スタガー要素としては、限定はされないが、２Ａ様又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼ要素）配列が挙げられる。ある実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（ここで、Ｘ１は、存在しないか、又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、存在しないか、又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ、又はＶ、又はＩ、又はＳ、又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。ある実施形態において、この配列は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む。スタガー要素のいくつかの非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰが挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載されるスタガー要素は、本明細書に記載されるコンセンサス配列のＧとＰとの間などで発現産物を切断する。１つの非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するために少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、各発現配列からの個々のペプチド及び又はポリペプチドの翻訳をもたらす。
ある実施形態において、スタガー要素は、翻訳中にリボソームの休止を誘導する１つ以上の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックト核酸（ＬＮＡ）並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。これらなどの例は、分子の骨格に対する変化により、天然ＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び翻訳中にリボソームの休止を誘導し得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが本明細書の他の箇所に記載される。
ある実施形態において、スタガー要素は、他の形態で環状ポリリボヌクレオチド中に存在する。例えば、ある例示的な環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終止要素及び第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列から終止要素を隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、第１の発現配列及び第１の発現配列に続く発現配列は、環状ポリリボヌクレオチド中の２つの別個の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にし得る。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、終止要素を含み、第１の発現配列の発現産物をその後続の発現配列の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳される一方、第２の発現配列に続く発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されない。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中に１つのみの発現配列があり、第１の発現配列及びその後続の発現配列は、同じ発現配列である。ある例示的な環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終止要素及び終止要素を下流の翻訳開始配列から隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。あるこのような例において、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、第１の発現配列のある回の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳される一方、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されない。ある場合において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より、対応する環状ポリリボヌクレオチド中で少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍大きい。ある場合において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
調節核酸
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸をコードし、例えば内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡなど、ノンコーディングＲＮＡのような調節核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。
一実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝子などの遺伝子を標的にする。調節核酸は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０１７７］及び［０１８１］～［０１８９］に記載されている調節核酸のいずれかを含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡを含むか、又はガイドＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的化核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化される配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いても行われた。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であることも実証され、例えばＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー、サイレンサー若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し得る。
一実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として使用される。遺伝子編集のために、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得、例えばＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３０８を参照されたい。ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、ＤＮＡ切断が起こるためにＣａｓ９によって必要とされ；Ｃｐｆ１について、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために必要とされる。
環状ポリリボヌクレオチドは、遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節し得る。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、異なる遺伝子標的間で共有されるか又は特定の遺伝子標的に固有の配列に対する相補性を有する配列を含有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にし、それにより遺伝子ファミリー（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異、突然変異遺伝子など）におけるいくつかの遺伝子を標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に固有の配列を標的にするように設計され得る。
ある実施形態において、発現配列は、５０００ｂｐ未満（例えば、約５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ未満又はそれを下回る）の長さを有する。ある実施形態において、発現配列は、独立して又はそれに加えて、１０ｂｐ超（例えば、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、又はそれを超える）の長さを有する。
ある実施形態において、発現配列は、本明細書に記載される特徴の１つ以上、例えば１つ以上のペプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ以上の調節要素、１つ以上の調節核酸、例えば１つ以上のノンコーディングＲＮＡ、他の発現配列及びそれらの任意の組合せを含む。
翻訳効率
ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、参照、例えば線状同等物、線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドより高い。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％又はそれを超えて高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論比の発現産物を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生成する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に同等の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２又はそれを超える発現配列からの産物の化学量論的翻訳効率を有する。
ローリングサークル型翻訳
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。ある実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。ある実施形態において、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。ある実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
非翻訳領域
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えばＺＫＳＣＡＮ１である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、中に埋め込まれたアデノシン及びウリジンの１つ以上のストレッチを有するＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチシグネチャーは、発現産物のターンオーバ速度を上昇させ得る。
ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の導入、除去又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが環状ポリリボヌクレオチドに導入され得、ＡＲＥのコピーが発現産物の翻訳及び／又は生成を調節し得る。同様に、ＡＲＥは、環状ポリリボヌクレオチド中で同定され、除去又は改変されて細胞内安定性を調節し、したがって得られるタンパク質翻訳及び生成に影響を与え得る。
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれの隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドで使用され得る例示的なＵＴＲは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２００］～［０２０１］に記載されているものが挙げられる。
ポリＡ配列
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を含み得る。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列の長さは、１０ヌクレオチド長を超える。一実施形態において、ポリ－Ａ配列は、１５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００及び３，０００ヌクレオチド又はこれらを超える）。ある実施形態において、ポリＡ配列は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２０２］～［０２０４］中のポリＡ配列の説明に従って設計される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特性を調節するための修飾ポリＡを有する。ある実施形態において、ポリＡを欠いた又は修飾ポリＡを有する環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば免疫原性（例えば、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーのレベル）、半減期、発現効率などを改善する。
ＲＮＡ結合
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書、及び国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２０７］～［０２１５］において教示されるものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
タンパク質結合
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えばリボソームが、ＲＮＡ配列における内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えばリボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性又は外来性であるものとして隠すのに役立つヌクレオチド配列である。
線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始のために役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）であり、その後、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造にも関与することが知られている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
エンクリプトゲン
本明細書に記載される際、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において、細胞に送達されると、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの低下された免疫応答をもたらす環状ポリリボヌクレオチドが本明細書において提供される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性（例えば、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーのより低いレベル）を有する。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。核酸分子及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増加している。ＵＴＲの調節的特徴は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリプトゲンに含まれ得る。
ある実施形態において、５’又は３’ＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチド中のエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節する（例えば、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーのレベルを調節する）のに有用であり得る。
ある実施形態において、発現配列、例えば翻訳可能領域におけるＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の修飾の除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーのレベルの調節）を調節するのに有用であり得る。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は任意の他のノンコーディングＲＮＡへの結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節するだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば免疫タンパク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐか又は低下させ得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが以下に詳細に説明される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば修飾を欠いた環状ポリリボヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。特に、１つ以上のイノシンの追加は、ウイルスに対して内在性であるものとしてＲＮＡを区別することが示されている。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡのための１つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉを標的にし、ＲＩＧ－Ｉの発現を低下させる。ＲＩＧ－Ｉは、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。したがって、ＲＩＧ－１標的化ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸のための配列を有する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば宿主細胞免疫を低下させ得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避する際に環状ポリリボヌクレオチドを補助する配列、要素又は構造を欠いている。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基又はそれらの任意の組合せを欠き得る。
リボスイッチ
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッチを含む。
リボスイッチは、典型的に、小さい標的分子に直接結合することができる環状ポリリボヌクレオチドの一部であると考えられ、その標的の結合がＲＮＡ翻訳、発現産物安定性及び活性に影響を与える（Ｔｕｃｋｅｒ Ｂ Ｊ，Ｂｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ（２００５），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５（３）：３４２－８）。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドは、その標的分子の存在又は非存在に応じて、自らの活性を調節するのに直接関与する。ある実施形態において、リボスイッチは、別個の分子に対するアプタマーのような親和性の領域を有する。したがって、本発明のより広い文脈において、非コード核酸内に含まれる任意のアプタマーは、かさ容積からの分子の隔離のために使用され得る。「（リボ）スイッチ」活性による事象の下流での報告が特に有利であり得る。
ある実施形態において、リボスイッチは、限定はされないが、転写終結、翻訳開始の阻害、ｍＲＮＡ自己切断及び真核生物におけるスプライシング経路の変更を含む遺伝子発現に影響を与え得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合又は除去によって遺伝子発現を制御するように機能し得る。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドを、リボスイッチを活性化、不活性化又はブロックする条件に供して、発現を変化させる。発現は、例えば、ＲＮＡに結合するリボソームの転写の終止又はブロックの結果として変化され得る。トリガー分子又はその類似体の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させるか若しくは防ぐか、又はＲＮＡ分子の発現を促進するか若しくは増加させ得る。リボスイッチのいくつかの例が本明細書に記載される。
ある実施形態において、リボスイッチは、環状ジ－ＧＭＰリボスイッチ、ＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮ要素とも呼ばれる）、ｇｌｍＳリボスイッチ、グルタミンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、リジンリボスイッチ（Ｌ－ボックスとも呼ばれる）、ＰｒｅＱ１リボスイッチ（例えば、ＰｒｅＱ１－ｌリボスイッチ及びＰｒｅＱ１－ｌｌリボスイッチ）、プリンリボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、ＳＡＭリボスイッチ、ＳＡＭ－ＳＡＨリボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、テオフィリン結合リボスイッチ、チミンピロリン酸結合リボスイッチ、Ｔ．テングコンジェンシス（Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）ｇｌｍＳ触媒リボスイッチ、ＴＰＰリボスイッチ（ＴＨＩ－ボックスとも呼ばれる）、Ｍｏｃｏリボスイッチ、又はアデニン感知ａｄｄ－Ａリボスイッチであり、これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２３５］～［０２５２］に記載されている。
アプタザイム
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御要素として使用され、触媒ＲＮＡ（後述される「リボザイム」）の領域に結合される条件的発現のためのスイッチである。ある実施形態において、アプタザイムは、細胞型特異的翻訳において活性である。ある実施形態において、アプタザイムは、細胞状態特異的翻訳、例えばウイルス感染細胞で又はウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。
リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。リボザイムのいくつかの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型リボザイム、ＶＬリボザイム、リードザイム、ヘアピン型リボザイム、及び全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２５４］～［０２５９］に記載されている他のリボザイムが挙げられる。
複製要素
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補体環状ポリリボヌクレオチドを生成することによって行われ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写を開始させるためのモチーフを含み、ここで、転写は、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる内在性細胞機構（ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼのいずれかによって駆動される。ローリングサークル型転写事象の産物は、単位長において相補的又は伝播される環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを生成するためにリボザイムによって切断され得る。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、その相補体又はトランスにおけるＲＮＡ配列によってコードされ得る。ある実施形態において、コードされたリボザイムは、環状ＲＮＡ伝播を制御するためにリボザイムの活性を調節する（阻害又は促進する）配列又はモチーフを含み得る。ある実施形態において、単位長配列は、細胞内ＲＮＡリガーゼによって環状形態にライゲートされ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅に役立つ複製要素を含む。このような複製要素の例としては、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２８０］～［０２８２］に記載されているものが挙げられる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、エキソヌクレアーゼによる分解に対して実質的に抵抗性である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％又はそれらの間の任意のパーセンテージの速度において細胞内で複製する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞内で複製することが可能である。
実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製するが、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、宿主のゲノムに組み込まれない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、ごくわずかな組み換え頻度を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、例えば約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満又はそれを下回る組み換え頻度を有する。
足場配列
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、１つ以上の足場配列を含む。足場配列は、アプタマー配列であり得る。上に列挙される各態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド分子は、内在性又は天然の環状ポリリボヌクレオチド配列をコードする配列を有する。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的に結合する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、環状アプタマーである。一実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的に結合する１つ以上の結合部位を含む。一実施形態において、環状ＲＮＡは、アプタマー配列を含む。一実施形態において、環状ＲＮＡは、ＤＮＡ標的及びタンパク質標的の両方に結合し、例えば、転写を媒介する。別の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質複合体を合わせて、例えば、翻訳後修飾又はシグナル伝達を媒介する。別の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質などの２つ以上の異なる標的に結合し、例えば、これらのタンパク質を細胞質に輸送するか、又は標的の１つ以上の分解を媒介する。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも１つに結合し、それによって、細胞過程を調節する（例えば、タンパク質発現を変化させ、遺伝子発現を調節し、細胞シグナル伝達を調節するなど）。ある実施形態において、合成環状ＲＮＡは、標的又は選択されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の少なくとも１つの部分、例えば、結合部分との相互作用のための結合部位を含み、それによって、内在性同等物との結合で競合する。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞過程を調節する（例えば、タンパク質発現を変化させ、遺伝子発現を調節し、細胞シグナル伝達を調節するなど）複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、標的（例えば、転写因子）への結合によって、細胞を細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）に対して感作させ、これにより、細胞生存を減少させる。例えば、細胞を細胞毒性剤に対して感作させることにより、細胞毒性剤及び環状ＲＮＡの送達後に細胞生存が減少される。ある実施形態において、減少される細胞生存は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、又はその中の任意のパーセンテージだけ減少される。
ある実施形態において、複合体は、細胞への環状ＲＮＡの送達後、少なくとも５日間にわたって検出可能である。ある実施形態において、複合体は、細胞への環状ＲＮＡの送達後、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、又は１６日間にわたって検出可能である。
一実施形態において、合成環状ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成環状ＲＮＡは、タンパク質を結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成環状ＲＮＡは、ｍＲＮＡを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成環状ＲＮＡは、リボソームを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成環状ＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又は任意の他のノンコーディングＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを結合及び／又は隔離する。結合及び／又は隔離部位に加えて、環状ＲＮＡは、分解要素を含み得、これは、結合及び／又は隔離されたＲＮＡ及び／又はタンパク質の分解をもたらす。
一実施形態において、環状ＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列を含み、例えば、環状ＲＮＡは、天然の、非環状ｌｎｃＲＮＡ又はそのフラグメントの配列を含む。一実施形態において、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列は、スペーサー配列を用いて又は用いずに環状化されて、合成環状ＲＮＡを形成する。
一実施形態において、環状ＲＮＡは、リボザイム活性を有する。一実施形態において、環状ＲＮＡは、リボザイムとして作用し、病原性又は内在性ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子又はタンパク質を切断するのに使用され得る。一実施形態において、環状ＲＮＡは、酵素活性を有する。一実施形態において、合成環状ＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を特異的に認識及び切断することができる。別の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質を特異的に認識及び切断することができる。別の実施形態において、環状ＲＮＡは、小分子を特異的に認識及び分解することができる。
一実施形態において、環状ＲＮＡは、自滅性（ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ）又は自己切断性又は切断可能環状ＲＮＡである。一実施形態において、環状ＲＮＡは、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを送達するのに使用され得る。一実施形態において、合成環状ＲＮＡは、（１）自己切断可能要素（例えば、ハンマーヘッド型、スプライシング要素）、（２）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（例えば、グリセロール）、（４）化学的リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列によって隔てられるマイクロＲＮＡから構成される。別の実施形態において、合成環状ＲＮＡは、（１）自己切断可能要素（例えば、ハンマーヘッド型、スプライシング要素）、（２）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（例えば、グリセロール）、（４）、化学的リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列によって隔てられるｓｉＲＮＡから構成される。
一実施形態において、環状ＲＮＡは、転写／複製可能な環状ＲＮＡである。この環状ＲＮＡは、任意のタイプのＲＮＡをコードし得る。一実施形態において、合成環状ＲＮＡは、アンチセンスｍｉＲＮＡ及び転写要素を有する。一実施形態において、転写後、線状機能的ｍｉＲＮＡが、環状ＲＮＡから生成される。一実施形態において、環状ＲＮＡは、翻訳不可能な環状ポリリボヌクレオチドである。
一実施形態において、環状ＲＮＡは、翻訳要素と組み合わせて上記の属性の１つ以上を有する。
他の配列
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は人工核酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ分子をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は配列が挙げられる。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いていることは、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されないか、又はエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼの存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ－Ａ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節核酸及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
他の配列は、約２～約１００００ｎｔ、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
その環状化の結果として、環状ポリリボヌクレオチドは、それを線状ＲＮＡと区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡと比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環状ポリリボヌクレオチドは、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされるとき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドを生成する細胞形質転換試薬としてより有用になり、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エキソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が起こったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電気泳動によって）試験され得る。
さらに、線状ＲＮＡと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが仔牛小腸由来ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートされるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。
ヌクレオチドスペーサー配列
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７つ又はそれを超えるスペーサー配列を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２９５］～［０３０２］中の説明に従って構成される１つ以上のスペーサー配列を含む。
非核酸リンカー
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーも含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される配列又は要素の１つ以上の間に非核酸リンカーを有する。一実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の配列又は要素は、リンカーを用いて連結される。非核酸リンカーは、化学結合、例えば１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。ある実施形態において、非核酸リンカーは、ペプチド又はタンパク質リンカーである。このようなリンカーは、２～３０アミノ酸又はそれを超えるものであり得る。リンカーは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３０４］～［０３０７］に記載されているものなど、可撓性、剛性又は切断可能なリンカーを含む。
安定性／半減期
ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチド製剤は、対照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが、環状されていない線状ポリリボヌクレオチド（例えば、線状同等物）より増加した半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して抵抗性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー切断部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対照、例えば線状同等物より、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％又は少なくとも約１００００％長い半減期を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に細胞内で持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、有糸分裂後に娘細胞内で持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介する複製要素を含む。ある実施形態において、複製要素は、環状ポリリボヌクレオチドに対して相補的な線状ポリリボヌクレオチド（線状相補性）への環状ポリリボヌクレオチドの転写を媒介する。ある実施形態において、線状相補性ポリリボヌクレオチドは、相補的な環状ポリリボヌクレオチドに細胞内においてインビボで環状化され得る。ある実施形態において、相補的ポリリボヌクレオチドは、出発環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似したヌクレオチド配列を有する別の環状ポリリボヌクレオチドにさらに自己複製し得る。１つの例示的な自己複製要素としては、ＨＤＶ複製ドメインが挙げられる（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０－４５１：１６５－１７３によって記載されるように）。ある実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。
修飾
環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対して１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を含み得、特に親ポリリボヌクレオチドが本発明の範囲内に含まれる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ－Ａ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定された１００を超える様々なヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。ある実施形態において、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３１１］に記載されているものなど、群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
環状ポリリボヌクレオチドは、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合などに対する（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的に置換されるアミノ、任意選択的に置換されるチオール、任意選択的に置換されるアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置き換えられ得るか又は置換され得る。特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）又はそのハイブリッド）へのリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を高めるために、少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。ある実施形態において、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性（例えば、免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーのレベルを低下）を低下させ得る。
ある実施形態において、修飾は、化学修飾又は細胞誘導性修飾を含み得る。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からの“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ及びＰａｎによって記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫回避を促進し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているものなど、当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば５’末端修飾（リン酸化（一－、二－及び三－リン酸化）、共役、反転結合など）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基又は広いレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基による置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）又は共役塩基が挙げられる。修飾リボヌクレオチド塩基は、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンも含み得る。ある実施形態において、塩基修飾は、環状ポリリボヌクレオチドのいくつかの機能的効果を挙げると、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。ある実施形態において、修飾としては、双直交（ｂｉ－ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ヌクレオチド、例えば非天然塩基が挙げられる。例えば、参照により本明細書に援用されるＫｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａを参照されたい。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位における）又は糖の置換並びに骨格修飾は、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む。環状ポリリボヌクレオチドの具体例としては、限定はされないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、ヌクレオシド間修飾などの修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含む環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドとしては、中でも特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の趣旨では、且つ当該技術分野において時々参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾ＲＮＡもオリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有するリボヌクレオチドを含む。
修飾環状ポリリボヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びこれらの通常の３’－５’結合、２’－５’連結類似体を有するボラノホスフェート及び逆極性を有するものが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対が連結される（３’－５’を５’－３’に又は２’－５’を５’－２’に）。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負の電荷又は正の電荷を帯び得る。
環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関して、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を様々な置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載される別のヌクレオシド間結合による非修飾ホスフェート部分の大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄で置換されている。ホスフェートリンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による連結酸素の置換によっても修飾され得る。
非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を与えるためにａ－チオ置換ホスフェート部分が提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性、したがって細胞環境内でのより長い半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答を低減すると予測される。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドとしては、α－チオ－ヌクレオシド（例えば、５’－０－（ｌ－チオホスフェート）－アデノシン、５’－０－（ｌ－チオホスフェート）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－０－（ｌ－チオホスフェート）－グアノシン、５’－０－（ｌ－チオホスフェート）－ウリジン又は５’－０－（１－チオホスフェート）－プソイドウリジン）が挙げられる。
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合が本明細書に記載される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の細胞毒性ヌクレオシドを含み得る。例えば、細胞毒性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る。細胞毒性ヌクレオシドとしては、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組合せ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－ｌ－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（ｌＨ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）及び６－メルカプトプリンが挙げられる。さらなる例としては、フルダラビンホスフェート、Ｎ４－ベヘノイル－ｌ－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
環状ポリリボヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されても又はされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上若しくは全てのタイプ（例えば、天然ヌクレオチド、プリン又はピリミジン又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つ以上若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチドにおいて又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されても又はされなくてもよい。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、イノシンを含み、これは、免疫系が、ウイルスＲＮＡに対して内在性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドを特徴付けることを促進し得る。イノシンの組み込みは、向上したＲＮＡ安定性／減少した分解も媒介し得る。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド（又はその所与の配列）中の全てのヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、修飾としては、発現を増大し得るｍ６Ａ；免疫応答を弱め得るイノシン；ＲＮＡ安定性又は翻訳の読み過ごしを増大し得るプソイドウリジン（スタガー要素）、安定性を増大し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転座（例えば、核局在化）を促進する２，２，７－トリメチルグアノシンが挙げられる。
様々な糖修飾、ヌクレオチド修飾及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在し得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることを理解するであろう。修飾は、非コード領域の修飾でもあり得る。環状ポリリボヌクレオチドは、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して又はヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ若しくはＣのいずれか１つ以上に対して）又はその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％及び９５％～１００％）を含み得る。
構造
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば二次又は三次構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントが二本鎖セグメントに折り畳まれ、対間、例えばＡ－Ｕ及びＣ－Ｇの水素結合で結合される。ある実施形態において、末端ループに連結された二本鎖セグメントを有する、ステムとしても知られているらせんが分子内に形成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、疑似二本鎖二次構造を有するセグメントは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、セグメントは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、実質的に一本鎖対二本鎖領域を含む。ある実施形態において、一本対二本鎖の比率は、環状ポリリボヌクレオチドの機能性に影響を与え得る。
ある実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列である。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、タンパク質－又はＲＮＡ－結合部位を含み得る。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、増大した相互作用を可能にするために立体配座柔軟性であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、結合するか又はタンパク質若しくは核酸結合を増加させるために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
ある実施形態では、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列である。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、立体配座認識部位、例えばリボスイッチ又はアプタザイムを含み得る。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体配座的に固定され得る。あるこのような場合において、立体配座的に固定された配列は、環状ポリリボヌクレオチドを、タンパク質又は核酸の結合から立体的に遮蔽し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合を回避又は低減するために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
１６の可能な塩基対合があるが、これらの６つ（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＵＧ、ＣＧ）が実際の塩基対を形成し得る。残りは、ミスマッチと呼ばれ、らせん中に非常に低い頻度で存在する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、その機能に対する影響及び致命的な結果なしに容易に破壊することができず、それにより二次構造を維持する選択を与える。ある実施形態において、ステム（すなわちそれらのヌクレオチド配列）の一次構造は、らせん領域を依然として維持しながら、依然として変化し得る。塩基の性質は、より高次の構造に伴い、置換は、それらが二次構造を保つ限り可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、疑似らせん構造を有するセグメントは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドを有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、セグメントは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ又はＡリッチ配列又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を促進する分子内三重疑似らせん構造を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位、例えば少なくとも１つのタンパク質結合部位、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｔＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｒＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｐｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎｏＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｅｘＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｃａＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのＹ ＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｈｎＲＮＡ結合部位及び／又は少なくとも１つのｔＲＮＡモチーフを有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットに記載されているものなどの高次構造を含むように構成される。
送達
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、担体と共に又は伴わずに医薬組成物にも含まれ得る。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、医薬担体及び／又はポリマー担体、例えばリポソームなどの担体を含んで製剤化され得、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒト農用動物又は家畜、例えばウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に公知の方法によって送達され得る。このような方法としては、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、微量注入、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フゲン（ｆｕｇｅｎｅ）、直接音波負荷、細胞スクイージング、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、エクソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらの任意の組合せが挙げられる。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５、２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０にも記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ネイキッド送達製剤中で送達され得る。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、及び環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしで、環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。
ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、環状ポリリボヌクレオチドは、部分的に又は完全に封入されない。ある実施形態において、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助けるタンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーなどの部分に共有結合されないポリリボヌクレオチドであり得る。細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含有することはない。例えば、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含有することはない。
ある実施形態において、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まなくてもよい。例えば、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まなくてもよい。
ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、活性な細胞透過効果を示さない不活性成分を含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油であり得る。
ある実施形態において、ネイキッド送達製剤は、非経口で許容される希釈剤などの希釈剤を含み得る。希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態において、希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤であり得る。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に開示される医薬製剤、本明細書に開示される医薬組成物、本明細書に開示される医薬品原薬、又は本明細書に開示される医薬品製品は、非経口核酸送達系中にある。非経口核酸送達系は、本明細書に開示される医薬製剤、本明細書に開示される医薬組成物、本明細書に開示される医薬品原薬、又は本明細書に開示される医薬品製品、及び非経口で許容される希釈剤を含み得る。ある実施形態において、非経口核酸送達系中の本明細書に開示される医薬製剤、本明細書に開示される医薬組成物、本明細書に開示される医薬品原薬、又は本明細書に開示される医薬品製品は、任意の担体を含まない。
本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞にさらに関する。ある実施形態において、宿主又は宿主細胞は、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）又は他の生物若しくは細胞である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主の免疫系による所望されない応答が減少されるか、又は宿主の免疫系による所望されない応答を生成することができない。実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主において非免疫原性である。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
ある実施形態において、宿主又は宿主細胞が環状ポリリボヌクレオチドと接触される（例えば、それに送達又は投与される）。ある実施形態において、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物又はその両方の量は、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態において、培養物中の宿主成長の時間経過が決定される。成長が環状ポリリボヌクレオチドの存在下で増加又は減少される場合、環状ポリリボヌクレオチド若しくは発現産物又はその両方は、宿主の成長を増加又は減少させるのに有効であると特定される。
送達の方法
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を、細胞、組織又は対象に送達する方法は、本明細書に記載される医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品を、細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
ある実施形態において、送達の方法は、インビボ方法である。例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの送達の方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品を、それを必要とする対象に非経口的に投与することを含む。別の例として、環状ポリリボヌクレオチドを、対象の細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織に、本明細書に記載される医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品を非経口的に投与することを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における生物学的反応を引き起こすのに有効な量である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における細胞又は組織に対する生物学的影響を与えるのに有効な量である。ある実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、担体を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、希釈剤を含み、任意の担体を含まない。ある実施形態において、非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に、又は局所的に行われる。
ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、経口投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、経鼻的に投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、吸入によって投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、局所的に投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、眼内に投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、直腸内に投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬又は医薬品製品は、注入によって投与される。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品は、非経口的に投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品は、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮内に、頭蓋内に、髄腔内に、リンパ内に（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃｌｙ）、皮下に、又は筋肉内に投与される。ある実施形態において、医薬組成物、医薬品原薬、又は医薬品製品は、眼内投与、蝸牛内（内耳）投与、又は気管内投与によって投与される。ある実施形態において、本明細書に記載される送達の方法のいずれかは、担体を用いて行われる。ある実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの送達の方法は、担体又は細胞透過剤を用いずに行われる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物は、投与工程の後、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、又は少なくとも５日間にわたって、細胞、組織、又は対象において検出される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在は、投与工程の前に、細胞、組織、又は対象において評価される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在は、投与工程の後、細胞、組織、又は対象において評価される。
細胞及び小胞ベースの担体
本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤は、小胞又は他の膜ベースの担体中で細胞に投与され得る。
実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤は、細胞、小胞若しくは他の膜ベースの担体中で又はそれを介して投与される。一実施形態において、環状ＲＮＡ組成物又は製剤は、リポソーム又は他の同様の小胞中で製剤化され得る。リポソームは、内部水性区画を囲む単層若しくは多層脂質二重層及び比較的不透過性の外部親油性リン脂質二重層から構成される球形小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬剤分子の両方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）をわたってそれらの負荷を輸送し得る（概説について、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作製され得るが；リン脂質が、薬剤担体としてリポソームを生成するために最も一般的に使用される。多層小胞脂質の調製のための方法は、当該技術分野において公知である（例えば、多層小胞脂質調製に関連するその教示内容が、参照により本明細書に援用される米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。小胞形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自発的であり得るが、それは、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押し出し装置を使用することによって振とうする形で力を加えることによって促進することもできる（概説について、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質調製に関連するその教示内容が、参照により本明細書に援用されるＴｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されるように、減少するサイズのフィルタに通して押し出すことによって調製され得る。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保ち、薬剤安定性及び負荷容量を向上させ、薬剤の漏出を防ぐ改質された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬剤送達の重要な構成要素である。これらのナノ粒子は、有効に、薬剤送達を特定の標的に向け、薬剤安定性及び制御された薬剤放出を向上させ得る。リポソーム及びポリマーを組み合わせた新たなタイプの担体である脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）も用いられ得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアが、安定した構造を提供し、リン脂質シェルが、良好な生体適合性を提供する。したがって、２つの構成要素が、薬剤封入効率速度を高め、表面改質を促進し、水溶性薬剤の漏出を防ぐ。概説について、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
担体のさらなる非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。炭水化物担体の非限定的な例としては、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、及び無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリンが挙げられる。カチオン性担体の非限定的な例としては、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及びＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）が挙げられる。タンパク質担体の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンが挙げられる。
エキソソームも、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤のための薬剤送達ビヒクルとして使用され得る。概説について、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
エクスビボ分化された赤血球も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤のための担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１５０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。
例えば、国際公開第２０１８２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤を送達するための担体として使用され得る。
ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤を、標的とされる細胞に送達するための担体として使用され得る。
例えば、国際公開第２０１１０９７４８０号パンフレット、国際公開第２０１３０７０３２４号パンフレット、国際公開第２０１７００４５２６号パンフレット、又は国際公開第２０２００４１７８４号パンフレットに記載されるような植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤を送達するための担体として使用され得る。
発現の方法
本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。
ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、ポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、本方法は、本明細書において提供される連続したポリペプチド、本明細書において提供される別個のポリペプチド又はその両方への環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、ウサギ網状赤血球溶解物など、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、例えば、真核細胞のトランスフェクション又は細菌などの原核細胞の形質転換後、インビボで行われる。
ある態様において、本開示は、対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれを超える期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下しないように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれを超えて、約４０％を超えて変化しないレベルに維持されるように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与は、本明細書に記載される任意の送達方法を用いて行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、静脈注射によって対象に投与される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出生後投与、経口、注入によるもの（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下及び筋肉内）、眼内投与及び鼻腔内投与によるものが挙げられる。
ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、翻訳産物の修飾、折り畳み又は他の翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、例えば、細胞機構を介したインビボでの翻訳後修飾を含む。
本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に援用される。
上述される実施形態は、上記の機能特性を得るために組み合わされ得る。これは、得られる例示的な組合せ及び機能特性を記載する以下の実施例によっても示される。
番号付けされた実施形態セット＃１
［１］医薬製剤は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
［２］医薬製剤は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
［３］医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
［４］医薬製剤は、１つ又は複数の精製工程前のＲＮＡのレベルと比較して、１つ又は複数の精製工程後に、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）だけ減少される線状ＲＮＡのレベルを有する、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
［５］精製前と比較して、精製後に、免疫又は炎症反応の減少したレベルの１つ以上のマーカーを有する、段落１、２、３、又は４に記載の医薬製剤。
［６］免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、サイトカイン又は免疫原性関連遺伝子である、段落５に記載の医薬製剤。
［７］免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、ＩＦＮ－β、ＯＡＳ、及びＯＡＳＬからなる群から選択される遺伝子の発現である、段落５又は６のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［８］医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の３０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含み、宿主細胞タンパク質、宿主細胞デオキシリボ核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料から選択されるプロセス関連不純物を実質的に含まない、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
［９］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物を含む、いずれか１つの前の段落に記載の医薬製剤。
［１０］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物、又はそれらの組合せを含む、段落［１］～［２］、又は［９］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１１］医薬製剤は、リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まない、段落［１］～［１０］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１２］医薬製剤は、滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む、段落１～［１１］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１３］医薬製剤は、滅菌医薬製剤である、段落［１］～［１１］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１４］滅菌医薬製剤は、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援する、段落［１２］に記載の医薬製剤。
［１５］医薬製剤は、ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たす、段落［１］～［１４］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１６］医薬製剤は、ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たす、段落［１］～［１５］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１７］環状ポリリボヌクレオチド分子は、疑似らせん構造を含む、段落１～［１６］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１８］環状ポリリボヌクレオチド分子は、疑似二本鎖二次構造を含む、段落１～［１７］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１９］環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む、段落［１］～［１８］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２０］医薬製剤は、最終的な薬剤製品の中間の医薬製剤である、段落［１］～［１９］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２１］医薬製剤は、対象への投与のための最終的な薬剤製品である、段落［１］～［１９］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２２］医薬製剤は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又は５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、６５０ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、又は７５０ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含む、段落［１］～［２１］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２３］製剤は、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のデオキシリボヌクレオチド分子を含む、段落［１］～［２２］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２４］医薬製剤は、分光光度計によって測定した際に約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含む、段落［１］～［２３］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２５］医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、１ｐｇ、１０ｐｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質汚染を含む、段落［１］～［２４］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２６］タンパク質汚染は、酵素を含む、段落［２３］に記載の医薬製剤。
［２７］酵素は、ヌクレアーゼ又はリガーゼである、段落［２４］に記載の医薬製剤。
［２８］環状ポリリボヌクレオチド分子と比較した線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例２又は実施例３の方法を用いて決定される、段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２９］医薬製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例２の方法を用いて決定される、段落［１］、［２］、又は［９］～［２８］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［３０］医薬製剤中の環状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例３の方法を用いて決定される、段落［３］、［９］、又は［１１］～［２９］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［３１］医薬組成物を作製する方法であって、
ａ）環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
ｂ）製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｃ）任意選択的に、処理工程の後、製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
ｄ）製剤をさらに処理して、医薬用途のための医薬組成物を生成する工程と
を含む方法。
［３２］工程ｄ）のさらなる処理は、
ｅ）デオキシリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｆ）製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
ｇ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；
ｈ）製剤を濃縮する工程と；
ｉ）製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を、印刷又はデジタルメディアに記録する工程と
のうちの１つ以上を含む、段落［３１］に記載の方法。
［３３］工程ｄ）のさらなる処理は、
ｅ）タンパク質汚染を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｆ）製剤中のタンパク質汚染の量を評価する工程と；
ｇ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；
ｈ）製剤を濃縮する工程と
のうちの１つ以上を含む、段落［３１］～［３２］のいずれか１つに記載の方法。
［３４］工程ｄ）のさらなる処理は、
ｅ）エンドトキシンを実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｆ）製剤中のエンドトキシンの量を評価する工程と；
ｇ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；
ｈ）製剤を濃縮する工程と
のうちの１つ以上を含む、段落［３１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３５］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物を含む、段落［３１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３６］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物、又はそれらの組合せを含む、段落［３１］～［３５］のいずれか１つに記載の方法。
［３７］タンパク質汚染は、酵素を含む、段落［３１］～［３６］のいずれか１つに記載の方法。
［３８］医薬品原薬を作製する方法であって、
ａ）環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
ｂ）製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
ｃ）製剤が、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品原薬として処理する工程と
を含む方法。
［３９］医薬品製品を作製する方法であって、
ａ）環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
ｂ）製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を測定する工程と；
ｃ）それが、製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を医薬品製品として製剤化する工程と；
ｄ）それが、医薬品製品中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、医薬品製品にラベルを付け、出荷する工程と
を含む方法。
［４０］環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を製剤化する工程は、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を、医薬品賦形剤と組み合わせることを含む、段落［３８］～［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４１］製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、医薬品放出規格である、段落［３８］～［４０］のいずれか１つに記載の方法。
［４２］医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子の配列、例えば、参照環状ポリリボヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％）の配列同一性を有する配列について参照基準をさらに満たす、段落［４１］に記載の方法。
［４３］製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子の存在である、段落［３８］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４４］製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、顕微鏡法、分光測色法、蛍光分析法、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光測色法、ＲＮＡ電気泳動、又はＲＮＡｓｅ Ｈ分析によって測定した際に、特定の量以下（例えば、測定した際に検出不能なレベル又は検出限界未満のレベル）の線状ポリリボヌクレオチド分子の存在である、段落［３８］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４５］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物を含む、段落［３８］～［４４］のいずれか１つに記載の方法。
［４６］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物、又はそれらの組合せを含む、段落［３８］～［４５］のいずれか１つに記載の方法。
［４７］医薬品製品又は医薬品原薬は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又は５００ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含む、段落［３８］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［４８］医薬品製品又は医薬品原薬は、医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む、段落［３８］～［４７］のいずれか１つに記載の方法。
［４９］医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子は、顕微鏡法、分光測色法、蛍光分析法、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光測色法、ＲＮＡ電気泳動、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、ＵＶ分光学的若しくは蛍光検出器、光散乱技術、ＨＰＬＣを含む分離の方法の使用を用いるか若しくは用いない表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＨＰＬＣ、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いた若しくは用いないチップ若しくはゲルベースの電気泳動、線状ポリリボヌクレオチド分子の検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用する検出方法の使用、又は顕微鏡法、視覚法若しくは分光光度計を用いる方法によって測定される、段落［４８］に記載の方法。
［５０］全リボヌクレオチド分子に対する環状ポリリボヌクレオチドの量は、実施例３の方法を用いて決定される、段落［４８］又は［４９］に記載の方法。
［５１］医薬品製品又は医薬品原薬は、リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まない、段落［３８］～［５０］のいずれか１つに記載の方法。
［５２］医薬品製品又は医薬品原薬は、滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む、段落［３８］～［５１］のいずれか１つに記載の方法。
［５３］医薬品製品又は医薬品原薬は、滅菌薬剤製品又は滅菌原薬である、段落［３８］～［５２］のいずれか１つに記載の方法。
［５４］滅菌薬剤製品又は滅菌原薬は、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援する、段落［５３］に記載の方法。
［５５］医薬品製品又は医薬品原薬は、ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たす、段落［３８］～［５４］のいずれか１つに記載の方法。
［５６］医薬品製品又は医薬品原薬は、ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たす、段落［３８］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む、段落［３８］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［５８］製剤は、製剤中に存在するデオキシリボヌクレオチド分子の量について参照基準をさらに満たす、段落［３８］～［５７］のいずれか１つに記載の方法。
［５９］製剤中に存在するデオキシリボヌクレオチド分子の量についての参照基準は、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のデオキシリボヌクレオチド分子の存在である、段落［５８］に記載の方法。
［６０］製剤は、製剤中に存在するタンパク質汚染の量について参照基準をさらに満たす、段落［３８］～［５９］のいずれか１つに記載の方法。
［６１］製剤中に存在するタンパク質汚染の量についての参照基準は、環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、１ｐｇ、１０ｐｇ、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質汚染の存在である、段落［６０］に記載の方法。
［６２］医薬品製品又は医薬品原薬は、分光光度計によって測定した際に約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含む、段落［３８］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。
［６３］環状ポリリボヌクレオチドを、対象又は対象の細胞若しくは組織に送達する方法であって、段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品を、対象の細胞又は組織に投与する工程を含み、ここで、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物は、投与工程の少なくとも３日後に、細胞、組織、又は対象において検出される、方法。
［６４］投与工程前に、細胞、組織又は対象中の環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在を評価する工程をさらに含む、段落［６３］に記載の方法。
［６５］投与工程後に、細胞、組織又は対象中の環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在を評価する工程をさらに含む、段落［６３］～［６４］のいずれか１つに記載の方法。
［６６］（ｉ）段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品、及び（ｉｉ）非経口で許容される希釈剤を含む非経口核酸送達系。
［６７］段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品は、任意の担体を含まない、段落［６６］に記載の非経口核酸送達系。
［６８］環状ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、それを必要とする対象に、段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品を、それを必要とする対象に非経口的に投与する工程を含む方法。
［６９］環状ポリリボヌクレオチドは、対象における生物学的反応を引き起こすのに有効な量である、段落［６８］に記載の方法。
［７０］環状ポリリボヌクレオチドは、対象における細胞又は組織に対する生物学的影響を与えるのに有効な量である、段落［６８］に記載の方法。
［７１］環状ポリリボヌクレオチドを、対象の細胞又は組織に送達する方法であって、細胞又は組織に、段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品を非経口的に投与する工程を含む方法。
［７２］段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品は、担体を含む、段落［６８］～［７１］のいずれか１つに記載の方法。
［７３］段落［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤、段落［３１］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物、段落［３８］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品原薬、又は段落［３９］～［６２］のいずれか１つに記載の医薬品製品は、希釈剤を含み、任意の担体を含まない、段落［６８］～［７１］のいずれか１つに記載の方法。
［７４］非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に又は局所的に行われる、段落［６８］～［７３］のいずれか１つに記載の方法。
番号付けされた実施形態セット＃２
［１］医薬組成物を作製する方法であって、
ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；
ｂ）線状ポリリボヌクレオチドを環状化して、環状ポリリボヌクレオチドの製剤を生成する工程と；
ｃ）残っている線状ポリリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、環状ポリリボヌクレオチドの製剤を処理する工程と；
ｄ）任意選択的に、処理工程後の製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
ｅ）製剤をさらに処理して、医薬用途のための医薬組成物を生成する工程と
を含む方法。
［２］工程ｅ）のさらなる処理は、
ｆ）デオキシリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｇ）製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
ｈ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；
ｉ）製剤を濃縮する工程と；
ｊ）製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を、印刷又はデジタルメディアに記録する工程と
のうちの１つ以上を含む、段落［１］に記載の方法。
［３］工程ｅ）のさらなる処理は、
ｆ）タンパク質汚染を実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｇ）製剤中のタンパク質汚染の量を評価する工程と；
ｈ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；
ｉ）製剤を濃縮する工程と
のうちの１つ以上を含む、段落［１］～［２］のいずれか１つに記載の方法。
［４］工程ｅ）のさらなる処理は、
ｆ）エンドトキシンを実質的に除去するように、製剤を処理する工程と；
ｇ）製剤中のエンドトキシンの量を評価する工程と；
ｈ）医薬品賦形剤により製剤を製剤化する工程と；
ｉ）製剤を濃縮する工程と
のうちの１つ以上を含む、段落［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物又は環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物のフラグメントを含む、段落［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物又はそのフラグメント、環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物又はそのフラグメント、又はそれらの組合せを含む、段落［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］医薬組成物は、製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下の組み合わされた線状及びニックポリリボヌクレオチド分子を含む、段落［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］環状化は、スプリントライゲーションを含む、段落［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］タンパク質汚染は、酵素を含む、段落［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］環状ポリリボヌクレオチド分子と比較した線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例２又は実施例３の方法を用いて決定される、段落［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例２の方法を用いて決定される、段落［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］製剤中の環状ポリリボヌクレオチド分子の量は、実施例３の方法を用いて決定される、段落［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］医薬組成物は、製剤中の全リボヌクレオチド分子の３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、段落［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］医薬製剤は、環状ポリリボヌクレオチド分子、及び医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．１％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
［１５］精製前と比較して、精製後に、免疫又は炎症反応の減少したレベルの１つ以上のマーカーを有する、段落［１４］の医薬製剤。
［１６］免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、サイトカイン又は免疫原性関連遺伝子である、段落［１５］の医薬製剤。
［１７］免疫又は炎症反応の１つ以上のマーカーは、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、ＩＦＮ－β、ＯＡＳ、及びＯＡＳＬからなる群から選択される遺伝子の発現である、段落［１５］又は［１６］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１８］細胞タンパク質、細胞デオキシリボ核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料から選択されるプロセス関連不純物を実質的に含まない、段落［１４］～［１７］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［１９］ニック線状ポリリボヌクレオチド分子は、環状化後のニック線状ポリリボヌクレオチドである、段落［１４］～［１８］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２０］医薬製剤は、リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まない、段落［１４］～［１９］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２１］医薬製剤は、滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含む、段落［１４］～［２０］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２２］医薬製剤は、滅菌医薬製剤である、段落［１４］～［２１］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２３］滅菌医薬製剤は、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援する、段落［２２］に記載の医薬製剤。
［２４］医薬製剤は、ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たす、段落［１４］～［２３］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２５］医薬製剤は、ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たす、段落［１４］～［２４］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２６］環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む、段落［１４］～［２５］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２７］医薬製剤は、最終的な薬剤製品の中間の医薬製剤である、段落［１４］～［２６］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２８］医薬製剤は、対象への投与のための最終的な薬剤製品である、段落［１４］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［２９］医薬製剤は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含む、段落［１４］～［２８］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［３０］医薬製剤は、約９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、又は０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、段落［１４］～［２９］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［３１］医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも８０％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である、段落［１４］～［３０］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
［３２］医薬製剤は、製剤中の全リボヌクレオチド分子の２０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、段落［１４］～［３１］のいずれか１つに記載の医薬製剤。
以下の実施例は、本発明のある実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３５６］～［０３７５］、［０３９３］～［０４０５］、及び［０４３３］～［０４３６］に記載される実施例１～３、６、９、１０、及び１６、並びにそれらの対応する図面は、全体が参照により本明細書に援用される。
以下の表２は、以下に記載される各実施例の内容の簡単な概要を示すことが意図され、これは、決して限定的なものではない。実施例の特定の態様は、表２中の説明に反映されていない場合がある。
Figure 2022523794000005
Figure 2022523794000006
Figure 2022523794000007
Figure 2022523794000008
実施例１：ＲＮＡｓｅ Ｈ－生成核酸分解産物を評価することによる環状ＲＮＡ製剤の特性評価
この実施例は、ＲＮＡｓｅ Ｈ－生成核酸分解産物についての環状ＲＮＡ製剤の評価により、環状産物に対する線状及びコンカテマー産物を検出することができることを実証する。
ＲＮＡは、リガーゼと共にインキュベートされる場合、反応しないか又は分子内若しくは分子間結合を形成することができないかのいずれかであり、これは、それぞれ環状（遊離末端なし）又はコンカテマーＲＮＡ（線状）を生成する。相補的ＤＮＡプライマー及びＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼによる各タイプのＲＮＡの処理は、出発ＲＮＡ材料に応じて、特定のサイズの固有の数の分解産物を生成することが予測される。
ライゲートされたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ｈ分解によって生成されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて、コンカテマーＲＮＡ汚染を有さない環状ＲＮＡ又はコンカテマーＲＮＡ汚染を有する環状ＲＮＡであることが示され得る。プライマー及びＲＮａｓｅ Ｈが、環状ＲＮＡに加えられる場合、単一のプライマーが、環状ＲＮＡと共に二本鎖を形成し、ＲＮａｓｅ Ｈが、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖領域を分解して、単一の線状ＲＮＡ産物をもたらす。プライマー及びＲＮａｓｅ Ｈが、コンカテマーに加えられる場合、少なくとも２つのプライマーが、コンカテマーＲＮＡと共に二本鎖を形成し、ＲＮａｓｅ Ｈが、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を分解して、３つの産物をもたらし；１つの産物は、第１のプライマー結合領域への５’末端からのＲＮＡであり、１つの産物は、一緒にライゲートされたコンカテマーの数に応じて複数のＲＮＡを含み得る、第１のプライマー結合領域と次のプライマー結合領域との間のＲＮＡであり、最後の産物は、３’末端への最後のプライマー結合領域からのＲＮＡである。プライマー及びＲＮａｓｅ Ｈが、線状ＲＮＡに加えられる場合、単一のプライマーが、線状ＲＮＡと共に二本鎖を形成して、プライマー結合領域への５’末端からのＲＮＡに１つの産物をもたらし、３’末端へのプライマー結合領域に別の産物をもたらす。図１の左側の絵は、この手法を示す。
この実施例において、環状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
ＲＮＡの環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ／μｌの線状又は環状ＲＮＡ製剤を、３０分間にわたって３７℃で、０．２５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレアーゼ、及び０．３ｐｍｏｌｅ／μｌの、Ｎｌｕｃ ＲＮＡ（ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）に対して相補的なオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を、６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを、ＳＹＢＲ－グリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒによって視覚化した。視覚化されたゲルにおけるバンド強度を測定し、ＩｍａｇｅＪによって分析した。
図１の右側は、この実験における実際の切断産物を示す。ＲＮＡｓｅ Ｈエンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた線状ＲＮＡレーンにおけるバンドの数が、予測どおりに２つのバンドを生成した一方、単一のバンドが、レーンＡの場合、環状ＲＮＡレーンにおいて検出され、これは、環状ＲＮＡが、実際に環状であり、コンカテマーでないことを示している。レーンＢ及びレーンＣの場合、線状及びコンカテマー汚染からのバンドが、ＲＮＡｓｅ Ｈレーンにおいて出現する複数のより小さいフラグメントバンドの存在のため、ＲＮａｓｅ Ｈ処理後に可視であった。
実施例２：環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡ（標準曲線）
この実施例は、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの計算を実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を４％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを、６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを、ＳＹＢＲ－グリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒによって視覚化した。
ゲルにおけるＲＮＡの量を、既知の量及び同じサイズのＲＮＡ（標準ＲＮＡ）のバンド強度を比較することによって決定した。ゲルにおける不明のサンプルの量を決定するために、標準曲線を生成した（図２）。標準曲線を生成するために、１、０．５、０．２及び０．０５ｐｍｏｌｅの、環状ＲＮＡの線状同等物を、６％の変性ＰＡＧＥにおいて環状ＲＮＡ製剤と並行して充填した。変性ゲルを、ＳＹＢＲ－グリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒによって視覚化した。次に、ゲルにおける各バンド強度を測定し、ＩｍａｇｅＪによって分析した。異なるレーン（全ての場合、Ｒ２＞０．９８）のそれぞれに充填されたＲＮＡのバンド強度の分析によって、線状ＲＮＡの標準曲線を生成し、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの量を、線状ＲＮＡ標準曲線に基づいて決定した。
異なるサンプル中の線状ＲＮＡの量は、環状ＲＮＡ製剤Ａについて以下のとおりであった：線状ＲＮＡが、約０．３１モル／モル、又は１１５．９９ｎｇ／３９５ｎｇ、若しくは３０．２％であることが計算された。環状ＲＮＡ製剤Ｃについては：線状ＲＮＡは、約０．４５モル／モル、又は２６０．５２ｎｇ／４８８ｎｇ、若しくは４９．２％であることが計算された。
実施例３：環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡ（ゲル排除及び抽出）
この実施例は、製剤中の環状ＲＮＡの精製及び定量を実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを、６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを、ＳＹＢＲ－グリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒによって視覚化した（図３）。可視バンドを再度切除しし、ゲル破砕機（ｇｅｌ ｂｒｅａｋｅｒ）を使用することによって破砕した。ＲＮＡを抽出するために、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）を、破砕されたゲルに加え、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片をｓｐｉｎ Ｘカラムによって除去し、抽出されたＲＮＡを、エタノールで沈殿させた。個々のバンドから抽出されたＲＮＡを、Ｑｕｂｉｔ３蛍光光度計によって測定した。
異なるサンプルから抽出されたＲＮＡを、以下のように定量した：（製剤Ａ）約１４４６ｎｇの環状ＲＮＡ及び１７６ｎｇの線状ＲＮＡ（８９．１％の環状ＲＮＡ）；（製剤Ｂ）約９３４ｎｇの環状ＲＮＡ及び２７０ｎｇの線状ＲＮＡ（７７．５％の環状ＲＮＡ）；並びに（製剤Ｃ）約３２０ｎｇの環状ＲＮＡ及び３９６ｎｇの線状ＲＮＡ（４４．６％の環状ＲＮＡ）。
実施例４：環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡ
この実施例は、製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して９１％（ｗ／ｗ）の純度の環状ＲＮＡ分子の生成、及び生物学的影響をもたらすためのマウスにおけるその後の投与を実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
この実施例において、環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ ５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
線状ポリリボヌクレオチドが、最終的な環状ＲＮＡ産物製剤中に残っていた。環状ＲＮＡの純度及び最終産物製剤中に残っている線状ＲＮＡのパーセンテージを、最終産物製剤を６％のＴＢＥ－尿素ゲルにおいて電気泳動にかけ、ＩｍａｇｅＪを用いてバンドを分析することによって、各バッチについて定量した。総ＲＮＡ強度と比較して環状ＲＮＡの強度を計算することによって純度を評価し、パーセンテージとして示した。ここで、環状ＲＮＡは、製剤中の全ＲＮＡに対して９１％（ｗ／ｗ）の純度を有していた。
投与前に、ＰＢＳ及び１０％のＴｒａｎｓＩＴ担体を加えて、１００ｕＬの最終体積中の０．２５ｐｍｏｌｅの所望の最終環状ＲＮＡ濃度を達成した。マウスに、０．２５ｐｍｏｌｅの、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ（１００ｕＬ）をコードする環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入を与えた。
血液サンプル（約２５ｕＬ）を、サブモル量の引き抜き（ｓｕｂｍｏｌａｒ ｄｒａｗｉｎｇ）によって各マウスから採取した。投与の０、６時間、１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後の時点で血液をＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を、４℃において１３００ｇで３０分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。簡潔に述べると、５０ｕＬの１×ＧＬｕｃ基質を５ｕＬの血漿に加えて、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの投与の６時間並びに１、２、３、７、１４、及び２１日後の時点で血漿中において検出された。環状ＲＮＡのより高い発現が、注入の約２日後に観察され、発現の高いレベルが、長期間にわたって維持され、２１日の時点で依然として検出可能であった。全ての時点で、これらのレベルの活性は、陰性対照（ＰＢＳビヒクルのみ）について観察されたものより高かった。
この実施例は、製剤中の全ＲＮＡに対して９１％（ｗ／ｗ）の純度の環状ＲＮＡが問題なく生成され、静脈注射によって問題なく送達され、長期間にわたって血液中で検出可能なタンパク質を発現することができたことを実証する。
実施例５：ゲル精製環状ＲＮＡ中のニック環状ＲＮＡの定量
この実施例は、ゲル抽出によって精製された環状ＲＮＡが、製剤中の全ＲＮＡ分子に対して１．１％（ｗ／ｗ）以下のニックＲＮＡを含有することを実証する。
この実施例において、ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
この実施例において、環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。これは、ライゲーション接合部におけるＲＮＡの環状化をもたらして、環状ＲＮＡを生成する。環状ＲＮＡを、４％のＰＡＧＥゲルにおいて尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。この実施例において、精製環状ＲＮＡが、製剤中の全ＲＮＡに対して８０％（ｗ／ｗ）の純度を有することが評価された。
この実施例において、線状ＲＮＡの配列を、次世代シーケンシングによって評価した。精製環状ＲＮＡ製剤（８０％の純度）を、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＲＳ－２００－００１２）に記載されるライブラリー作製方法を用いて、ＮＧＳパイプラインのために調製した。この方法は、高い忠実度で３’末端同一性を保存した。簡潔に述べると、アダプターを、溶液中で利用可能な３’又は５’末端を有するＲＮＡ分子にライゲートした。無傷の環状ＲＮＡは、このライゲーションに供されず、結果として、この工程は、非環状ＲＮＡのみのために選択される。次に、これらの産物を逆転写し、増幅して、ｃＤＮＡライブラリーを生成し、それを続いて精製し、品質管理し、多重化する。次に、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｎｉｓｅｑ機械におけるシーケンシングに供する。
上述されるものと同様に、ＲｐｐＨ処理後のインビトロ転写からの線状ＲＮＡ産物を、シーケンシングのために処理した。
ＩＶＴの線状ＲＮＡ産物及びゲル精製環状ＲＮＡ製剤中の非環状ＲＮＡの両方のシーケンシング結果は、読み取りを、環状ＲＮＡを生成するのに使用される鋳型配列にマッピングし、ライゲーション接合部上に重なり合う読み取りの数を評価することによって比較した。
この分析において、残っている非環状ＲＮＡは、ニックＲＮＡ及びＩＶＴからの残留線状ＲＮＡ産物の混合物であると仮定される。この実施例において、非環状ＲＮＡが、ニックＲＮＡのみを含むと仮定される場合、ライゲーション接合部上に重なり合うフラグメントのパーセンテージは、５０％であると予測される。非環状ＲＮＡが、ＩＶＴからの残留線状ＲＮＡ産物のみを含むと仮定される場合、ライゲーション接合部上に重なり合うフラグメントのパーセンテージは、０％であると予測される。これらの統計的仮定及び対照実験を用いて、ニックＲＮＡの定量を可能にする標準曲線を生成した。これにより、ニックＲＮＡとして５．４％の非環状ＲＮＡの計算が得られた。
この実施例は、精製環状ＲＮＡ製剤の非環状ＲＮＡ画分の５．４％（ｗ／ｗ）（全ＲＮＡの１．１％（ｗ／ｗ）に相当する）がニックＲＮＡであったことを実証する。
実施例６：環状ＲＮＡ製剤中に存在する線状ＲＮＡは、インビトロの発現レベル及び持続性に影響を与えた
この実施例は、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの存在が、細胞内の環状ＲＮＡのタンパク質発現のレベル及び持続性に影響を与えることを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ガウシアルシフェラーゼ（ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
ライゲーション混合物をゲル精製して、鋳型ＤＮＡ、タンパク質、及び線状（非環状化）ＲＮＡを除去した。ＲＮＡ製剤を４％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。
細胞分裂中のゲル精製環状及び非精製ＲＮＡ製剤の持続性を、ＢＪ線維芽細胞において監視した。９６ウェルプレート中の細胞は、脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＬＭＲＮＡ００３）を用いて等量のゲル精製環状ＲＮＡ又は非精製ＲＮＡ製剤のいずれかで（リバース）トランスフェクトされた懸濁液であった。
ガウシアルシフェラーゼ酵素活性を、製造業者の説明に従って、ルシフェラーゼ酵素アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、１６１５８）を用いたタンパク質発現測定として、投与の６時間及び１～５日後に監視した。簡潔に述べると、１×セレンテラジン基質を、トランスフェクトされたウェルから細胞上清に加えた。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において基質添加の直後に読み取った。
ゲル精製環状ＲＮＡ製剤でトランスフェクトされた細胞からのタンパク質発現が、非精製ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞より高いレベルで及びより長い期間にわたって検出された（図４）。約１００倍高い発光（ＲＬＵ）が、５日間の期間にわたって非精製ＲＮＡと比較して精製環状ＲＮＡ製剤で検出された。
実施例７：環状ＲＮＡ製剤中に存在する線状ＲＮＡは、細胞内で、用量依存的に発現に影響を与えた
この実施例は、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡが、用量依存的に発現に悪影響を与えたことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ガウシアルシフェラーゼ（ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を４％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。線状ＲＮＡを、同じ４％の変性ＰＡＧＥゲルを用いて精製した。切除されたＲＮＡゲルフラグメント（線状又は環状）を破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。
ゲル精製環状ＲＮＡを含む製剤中の様々なレベルの線状ＲＮＡ同等物の影響を、ＢＪ線維芽細胞内の細胞分裂を監視することによって決定した。９６ウェルプレート中の細胞は、脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＬＭＲＮＡ００３）を用いて、ゲル精製環状ＲＮＡ製剤又は様々な線状ＲＮＡが補充された等量のゲル精製環状ＲＮＡ製剤のいずれかで（リバース）トランスフェクトされた懸濁液であった。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性を、製造業者の説明に従って、ルシフェラーゼ酵素アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、１６１５８）を用いて、タンパク質発現の尺度として、投与の６時間及び１～５日後に監視した。簡潔に述べると、１×セレンテラジン基質を、トランスフェクトされたウェルから細胞上清に加えた。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において基質添加の直後に読み取った。
ゲル精製環状ＲＮＡ製剤のみでトランスフェクトされた細胞からのタンパク質発現が、用量依存的に、組み合わされた環状及び線状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からのものより長い期間にわたって検出された（図５）。精製環状ＲＮＡのみのレベルは、１２０時間の時間経過にわたって安定したままであったが、環状及び線状ＲＮＡの両方を含むＲＮＡ製剤のレベルは、時間と共に低下し、低下速度は、線状ＲＮＡのレベルに比例する。意外なことに、細胞が、等量の環状ＲＮＡでトランスフェクトされ、サンプルの一部が２倍多いコーディングＲＮＡ（線状と組み合わされた環状）を含有していたとしても、増加したレベルの線状ＲＮＡは、環状ＲＮＡの量が一定に保たれていたとしても、時間と共にタンパク質発現レベルに悪影響を与えた。
この実施例は、減少したレベルの線状ＲＮＡを有する環状ＲＮＡが、改善された発現、例えば、発現の長さの改善を有することを実証する。
実施例８：環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡが、発現レベル及び時間に影響を与えた（ゲルイメージング）
この実施例は、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの存在が、インビボのタンパク質発現及び持続性のレベルを調節することを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を４％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを、６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを、ＳＹＢＲ－グリーンで染色し、Ｅ－ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒによって視覚化した。視覚化されたゲルにおけるバンド強度を測定し、ＩｍａｇｅＪによって分析した（図６）。
個々の製剤中の環状及び線状ＲＮＡを示すＲＮＡバンドを、Ｅ－ｇｅｌイメージングによって比較した。環状及び線状ＲＮＡ含量を、尿素ＰＡＧＥゲル分析によって定量した。簡潔に述べると、ゲルを、個々の製剤中の線状及び環状ＲＮＡ種の相対量について分析した。環状ＲＮＡ含量のパーセンテージを、以下のように計算した：環状ＲＮＡの量を、全ＲＮＡ量（環状＋線状ＲＮＡ）で除算した。レーンＡ中の環状ＲＮＡのパーセンテージは、７９．５％であり、レーンＢでは５３．９％であり、レーンＣでは４４．８％であった。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを有する環状ＲＮＡ、又は対照として線状ＲＮＡを含む製剤を、静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。製造業者の説明に従って、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された、単回用量の１０ｐｍｏｌの全ＲＮＡを動物に投与した。
ＲＮＡ投与の２４時間後、マウスに、４０ｕｇのフリマジン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１１２０；２０ｕｌの基質、８０ｕｌのＰＢＳ／投与）を腹腔内（ＩＰ）注入し、１０分間のインキュベーションの後、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを用いて、画像を取得した。投与の１４日後の時点で、動物に、４０ｕｇのフリマジン（Ｐｒｏｇｅｍｅｇａ、Ｎ１１２０、２０ｕｌの基質、８０ｕｌのＰＢＳ／投与）を腹腔内注入し、殺処分し、次に、肝臓を採取した。肝臓を、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを用いて採取の直後に２分間にわたって撮像した。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを用いて、線状及び環状ＲＮＡから発現されたナノルシフェラーゼの存在を測定した。画像を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．３．１（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＭＡ）ソフトウェアを用いて分析した。全身の固定体積ＲＯＩを、腹臥位で設置し、各個々の動物の仰臥位画像を、動物の同定に基づいて表示した。全光束（光子／秒）を計算し、全てのＲＯＩについてエクスポートして、群間の分析を容易にした。
７９．５％の環状ＲＮＡを有する製剤は、線状ＲＮＡ又は約４４．８％若しくは約５３．９％の環状ＲＮＡを含む製剤と比較して、２４時間の時点でより高いインビボ発現を示した。さらに、より高いパーセンテージの環状ＲＮＡ製剤からのルシフェラーゼ発現が、投与の１４日後の時点で、肝臓中で、エクスビボで分析された場合、約７９．５％の環状ＲＮＡ製剤からの発現は維持されたが、約４４．８％又は約５３．９％の環状ＲＮＡ製剤からの発現は維持されなかった。
したがって、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの存在は、インビボの発現及び持続性に影響を与える。
実施例９：ビオチン標識アデノシド及びその後のストレプトアビジンに媒介される捕捉を用いた、線状ＲＮＡのポリアデニル化による製剤からの環状ＲＮＡの富化
この実施例は、同じヌクレオチド配列を含む環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡ同等物の混合プールを含む製剤からの環状ＲＮＡの富化を実証する。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いたＲＮＡのポリアデニル化は、ＲＮＡへの３’ポリアデニン尾部の付加をもたらす。このプロセスは、ＲＮＡの３’末端がコンジュゲーションに利用可能であること必要とする。ＲＮＡが環状化されるとき、このような遊離末端は存在しない。ポリ（Ａ）ポリメラーゼはまた、ビオチン化Ｎ６－ＡＴＰ類似体などの修飾アデニンを組み込むことができる。これは、ビオチン－ストレプトアビジン結合システムを用いて、ビオチン化された、ポリアデニル化線状ＲＮＡのプルダウンを可能にする。したがって、モノリボヌクレオチドなどの任意のそのフラグメントを含む、ビオチン化された、ポリアデニル化線状ＲＮＡ同等物は、このビオチン－ストレプトアビジン結合システムを用いて、プルダウンの際に捕捉され得る。
この実施例において、環状ＲＮＡ（１．２ｋｂの長さ）を、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって生成された線状ＲＮＡから生成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。
ライゲーション後、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡの混合物が、スプリントＤＮＡと共に溶液中に存在する。ＤＮＡｓｅＩを用いて、提供される反応緩衝液（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＣａＣｌ２）と共に、ＤＮａｓｅ Ｉ［Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ６１０Ａ］を用いて、残っているスプリントを消化した。この反応物を、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｔ２０４０Ｌ］によって反応混合物から単離した。
ポリアデニル化反応のために、２．５ｕｇの、ライゲーション後（ｐｏｓｔ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）の、ＤＮａｓｅＩで処理された後（ｐｏｓｔ－ＤＮａｓｅＩ ｔｒｅａｔｅｄ）のＲＮＡを、多くのビオチン化Ｎ６－ＡＴＰ類似体［Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＵ－８０５－ＢＩＯ］、並びに提供される反応緩衝液（１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、３．０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、５０％のグリセロール）の存在下で、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７４２２５Ｚ２５ＫＵ］と共にインキュベートした。反応物を、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。ＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｔ２０３０Ｌ］によって反応混合物から単離した。
ポリアデニル化線状ＲＮＡを除去するために、ポリアデニル化反応からの０．５ｕｇのＲＮＡを、２×結合／洗浄緩衝液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ）による１対１の希釈によって平衡化し、５ｕＬの予め平衡化されたＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｃ１［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６５００１］ビーズスラリーと共にインキュベートした。ビーズを、磁気足場への２分間の曝露によって上清から分離した。上清を、ＲＮＡ含量についてＡ２６０吸光度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって分析し、ＲＮＡライゲーション産物増強について６％の尿素ＰＡＧＥによって分析した。ＢｉｏＲａｄ ＩｍａｇｅＬａｂを用いて、全ての分析されるサンプルについて、相対バンド強度を手動で定量した。
この実施例において、線状ＲＮＡに対する環状ＲＮＡの比率を、６％の尿素ＰＡＧＥゲル中のバンド強度を測定することによって計算した。バンドの定量が、図７に示される：精製前、ＲＮＡ産物の４２．６％が、環状ＲＮＡであり、ＲＮＡ産物の５７．４％が、線状ＲＮＡ（非精製ＲＮＡ）であり；精製後、ＲＮＡ産物の５０．４％が、環状ＲＮＡであり、ＲＮＡ産物の４９．６％が、線状ＲＮＡ（精製環状ＲＮＡ）であった。この実施例は、ビオチン化アデニン類似体を用いた線状ＲＮＡのポリアデニル化、その後のストレプトアビジンに媒介される線状ＲＮＡのプルダウンを用いて、同じヌクレオチド配列を含む環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡ同等物の混合プール中の環状ＲＮＡの８パーセントの増加を実証する。
実施例１０：環状ＲＮＡ製剤中に存在する線状ＲＮＡの減少は、コードされたタンパク質の発現を増加させた
この実施例は、主に環状ＲＮＡ組成物中に存在する線状ＲＮＡの減少が、細胞内のコードされたタンパク質の発現を増加させたことを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
２つのバッチの環状ＲＮＡを生成した。いずれの場合も、環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ ５’－ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ－３’及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
線状ＲＮＡが、最終環状ＲＮＡ産物中に残っていた。環状ＲＮＡの純度及び最終産物中に残っている線状ＲＮＡのパーセンテージを、６％のＴＢＥ－尿素ゲルにおいて最終産物を電気泳動にかけ、ＩｍａｇｅＪを用いてバンドを分析することによって、各バッチについて定量した。環状ＲＮＡの純度を、総ＲＮＡ強度と比較して、環状ＲＮＡの強度を計算することによって評価し、パーセンテージとして示した。ここで、バッチは、７１％の純度及び８４％の純度を有していた。
０．２ｐｍｏｌｅの各ＲＮＡバッチを、細胞トランスフェクションに使用した。ＲＮＡを、製造業者の推奨に従って、Ｏｐｔｉｍｅｍ及びＭｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘと組み合わせた。ビヒクルのみの対照を、ＲＮＡを含有しないことを除いて同様に調製した。時間＝０の時点で、各製剤をＢＪ線維芽細胞に加えた。
ガウシアルシフェラーゼの活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。２０μＬの各上清のサンプルを、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９９０）に加えた。サンプルを、トランスフェクションの６、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後の時点で取った。簡潔に述べると、１×セレンテラジン基質を各ウェルに加えた。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、基質添加及び混合の直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性が、トランスフェクションの６、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後の時点で８４％の純度の環状ＲＮＡを用いた実験において、細胞内で検出され（図８）、ビヒクルのみの対照によって得られる発現より高かった。８４％の純度の環状ＲＮＡから得られる発現は、７１％の純度の環状ＲＮＡから得られる発現より有意に高かった。トランスフェクションの２４時間後の時点で、ＧＬｕｃ活性は、７１％の純度の環状ＲＮＡがトランスフェクトされた場合と比較して、８４％の純度の環状ＲＮＡがトランスフェクトされた場合、３９７倍高かった。ＧＬｕｃ活性は、トランスフェクションの６、２４、４８及び７２時間後の時点で７１％の純度の環状ＲＮＡを用いた実験において、細胞内で検出され（図８）、ビヒクルのみの対照によって得られる発現より高かった。
この実施例は、より高い純度の環状ＲＮＡ（減少した線状ＲＮＡを含む）が、コードされたタンパク質の発現を増加させ、長くすることを実証した。
実施例１１：環状ＲＮＡ製剤中に存在する線状ＲＮＡは、細胞内で、用量依存的に環状ＲＮＡ安定性に影響を与えた
この実施例は、環状ＲＮＡ製剤中の線状ＲＮＡの存在が、用量依存的に環状ＲＮＡ安定性に悪影響を与えたことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を４％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状及び線状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメント（線状又は環状）を破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。
ゲル精製環状ＲＮＡの製剤中の様々なレベルの線状ＲＮＡ同等物の影響を、ＢＪ線維芽細胞内の環状ＲＮＡレベルを監視することによって決定した。９６ウェルプレート中の細胞を、脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＬＭＲＮＡ００３）を用いて、ゲル精製環状ＲＮＡ製剤、又は様々なレベルのゲル精製線状ＲＮＡが補充された等量のゲル精製環状ＲＮＡ製剤のいずれかでトランスフェクトした。環状ＲＮＡレベルを、トランスフェクションの６時間及び１～５日後の時点で環状ＲＮＡ特異的Ｑ－ＰＣＲによって分析した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｔ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ ＃ ４４０２９５３）を用いて、及び製造業者の説明に従って、ランダムプライミングによって細胞溶解物から生成した。Ｑ－ＰＣＲを、環状ＲＮＡのみを増幅し、且つその線状同等物を増幅しないように設計された外向きプライマーを用いて行い、倍率変化を、ハウスキーピング遺伝子としてβ－アクチンを用いてＰｆａｆｆｌ方法を用いて計算した。
環状ＲＮＡは、組み合わされた環状及び線状ＲＮＡの両方でトランスフェクトされた細胞と比較して、ゲル精製環状ＲＮＡ製剤のみでトランスフェクトされた細胞において、用量依存的に、より長い期間にわたってより高い量で検出された（図９）。精製環状ＲＮＡのみのレベルは、１２０時間の時間経過にわたって安定したままであったが；環状及び線状ＲＮＡの両方の組合せでトランスフェクトされた細胞内で検出された環状ＲＮＡのレベルは、時間と共に低下し、低下速度は、線状ＲＮＡのレベルと比例していた。意外なことに、細胞が等量の環状ＲＮＡでトランスフェクトされたとしても、線状ＲＮＡの存在は、時間と共に環状ＲＮＡレベルに悪影響を与えた。
この実施例は、線状ＲＮＡからの環状ＲＮＡの精製が、環状ＲＮＡ安定性に影響を与えることを実証する。
実施例１２：環状ＲＮＡ製剤中に存在する線状ＲＮＡは、細胞内で、用量依存的に自然免疫応答に影響を与えた
この実施例は、環状ＲＮＡ製剤中に存在する線状ＲＮＡが、用量依存的に自然免疫応答に悪影響を与えたことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、以下のように生成した。非修飾線状ＲＮＡを、ＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製した。環状ＲＮＡを、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素と共にＩＲＥＳを含むように設計した。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡを、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９）による転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成した。
環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を４％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状及び線状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。線状ＲＮＡを、同じ４％の変性ＰＡＧＥゲルを用いて精製した。切除されたＲＮＡゲルフラグメント（線状又は環状）を破砕し、ＲＮＡを、３７℃で１時間にわたって、ゲル溶離緩衝液（０．５ＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳ）で溶離させた。上清を収集し、ＲＮＡを、ゲル溶離緩衝液を、破砕されたゲルに加えることによってもう一度溶離させ、１時間にわたってインキュベートした。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。
ゲル精製環状ＲＮＡの製剤中の様々なレベルの線状ＲＮＡ同等物の影響を、ＢＪ線維芽細胞内の環状ＲＮＡレベルを監視することによって決定した。９６ウェルプレート中の細胞は、脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＬＭＲＮＡ００３）を用いて、ゲル精製環状ＲＮＡ製剤、又は様々なレベルのゲル精製線状ＲＮＡが補充された等量のゲル精製環状ＲＮＡ製剤のいずれかで（リバース）トランスフェクトされた懸濁液であった。免疫遺伝子レベルを、トランスフェクションの６時間及び１～５日後の時点でＱ－ＰＣＲによって分析した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｔ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ ＃ ４４０２９５３）を用いて、及び製造業者の説明に従って、ランダムプライミングによって細胞溶解物から生成した。Ｑ－ＰＣＲを、免疫遺伝子特異的プライマーを用いて行い、相対ＲＮＡレベルを、Ｐｆａｆｆｌ方法及びハウスキーピング遺伝子としてのβ－アクチンを用いて計算した。
ゲル精製環状ＲＮＡ製剤のみでトランスフェクトされた細胞内の環状ＲＮＡは、自然免疫遺伝子の発現の限られた増加を示した。逆に、組み合わされた環状及び線状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、用量依存的に、自然免疫遺伝子の上方制御を実証した（図１０）。
実施例１３：細胞培養物における非免疫原性
この実施例は、細胞トランスフェクション後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン、例えばＺＫＳＣＡＮ１イントロン及びＧＦＰ ＯＲＦを含むように設計される。さらに、対照環状ＲＮＡは、イントロンを含むか又は含まずに、ＧＦＰ ＯＲＦを含むように設計される（図１１を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。ＨｅＬａ細胞が５００ｎｇの環状ＲＮＡでトランスフェクトされる。
環状ＲＮＡのトランスフェクションは、以下の条件を含む：（１）細胞培養培地中の裸の環状ＲＮＡ（Ｌｉｎｇｏｒ ｅｔ ａｌ ２００４）；（２）エレクトロポレーション（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５）；（３）カチオン性脂質（ＳＮＡＬＰ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（Ｃｈｅｓｎｏｙ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，２０００）；（３）カチオン性ポリマー（ＰＥＩ、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン）（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ）；（４）ウイルス様粒子（ＨＰＶからのＬ１、ポリオーマウイルスからのＶＰ１）（Ｔｏｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ ２００６）；（５）エクソソーム（ＳＢＩからのＥｘｏ－Ｆｅｃｔ）；（６）ナノ構造リン酸カルシウム（ナノＣａＰ）（Ｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２００６）；（６）ペプチド形質導入ドメイン（ＴＡＴ、ポリＲ、ＳＰ、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ１など）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００９）；（７）小胞（ＶＳＶ－Ｇ、ＴＡＭＥＬ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１７）；（８）細胞スクイージング；（ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（９）ナノ粒子（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ ２０１６）；及び／又は（１０）マグネトフェクション（Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ ２００９）。トランスフェクション方法が細胞培養培地（ＤＭＥＭ １０％のＦＢＳ）中で行われ、細胞が、その後、２４～４８時間にわたって培養される。
トランスフェクションの２～４８時間後、培地が除去され、示されるＲＮＡ及びトランスフェクトされたＲＮＡの相対的発現がｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の場合、全ＲＮＡは、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及びＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細胞から単離される。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて３連で行われる。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルが定量化され、アクチン、ＧＡＰＤＨ又はＨＰＲＴ値に対して正規化される。環状ＲＮＡトランスフェクションについての示されるＲＮＡ遺伝子の相対的発現は、トランスフェクトされたＲＮＡのレベルによって正規化され、エンクリプトゲンを含有しない環状ＲＮＡトランスフェクションによる細胞の発現レベルと比較される。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析に加えて、実施例６に上述されるように、ウエスタンブロット分析及び免疫組織化学を用いて、ＧＦＰ発現効率を評価する。
エンクリプトゲンを含有するＧＦＰ陽性細胞は、弱められた免疫原性応答を示すことが予測される。
さらに、（１）初代マウス樹枝状細胞；（２）ＴＬＲ－７、８又は９を安定的に発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）；（３）単球由来樹枝状細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）、又は（４）Ｒａｗ ２６４．７細胞は、上述されるようにＧＦＰをコードする環状ＲＮＡを生成するＺＫＳＣＡＮ１又はｔｄイントロンを含むＤＮＡプラスミドでトランスフェクトされる。トランスフェクションの６～４８時間後、細胞培養物上清が収集され、サイトカイン発現がＥＬＩＳＡを用いて測定される。細胞培養物上清が収集されるとき、細胞がノーザンブロット、遺伝子発現アレイ及びＦＡＣＳ分析のために収集される。
ＥＬＩＳＡの場合、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ＩＬ－１２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＦＮ－α、ＴＮＦ－α及びＩＬ－８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のためのＥＬＩＳＡキットが使用される。ＥＬＩＳＡが製造業者の推奨に従って行われる。環状ＲＮＡトランスフェクト細胞についての示されるサイトカインの発現が対照ＲＮＡトランスフェクト細胞のレベルと比較される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるように分析する。プローブは、プラスミドから得られ、ヒトＩＦＮ－α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）のコード領域に特異的である。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
遺伝子発現アレイの場合、ＲＮＡがフェノール系溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及び／又はＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離される。ＲＮＡを増幅し、分析する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ＧＸ中のＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ１２ｖ４チップ）。モック対照処理細胞におけるレベルが増加倍数の計算のためのベースラインとして使用される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６に対する直接共役抗体で染色し、フローサイトメーターにおいて分析する。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して、これらのマーカーの低下された発現を示すことが予測される。
実施例１４：選択的発現のためのリボスイッチ
この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）の発現を調節する合成リボスイッチ（配列番号９）を、ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（２Ａ配列）（配列番号３）と共に含むように設計される（図１２を参照されたい）。環状ＲＮＡは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３５６］～［０３６５］に記載される実施例１及び２並びにそれらの対応する図面に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
テオフィリンは、リボスイッチの活性化を誘導して、遺伝子発現のオフスイッチをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１０によって記載されるように）。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ発現を制御することが予測される。テオフィリンの存在下でＧＦＰ発現が観察されることは予測されなかった。
ＨｅＬａ細胞を、テオフィリン依存性合成リボスイッチ（配列番号９）の制御下でＧＦＰをコードする５００ｎｇの記載される環状ＲＮＡでトランスフェクトして、選択的発現を評価する。トランスフェクション方法は、実施例７に記載されるとおりである。
３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間の培養後、細胞を、１ｎＭ～３ｍＭの範囲の濃度のテオフィリンを用いて及び用いずに処理する。２４時間の連続した培養後、細胞を室温で１５分間にわたって４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、ブロックし、０．２％の洗浄剤を含むＰＢＳ中の１０％のＦＢＳを用いて４５分間にわたって透過処理する。次に、サンプルを、ＧＦＰに対する一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％のＦＢＳ及び０．１％の洗浄剤を含むＰＢＳ中のＡｌｅｘａ ４８８及びＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共役された二次抗体と共に室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートする。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現について分析する。
実施例１５：インビボでの非免疫原性
この実施例は、細胞トランスフェクション後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する。
この実施例は、エンクリプトゲン（この場合ではイントロン）を有する環状ＲＮＡの投与後の免疫応答の定量化及び比較を記載している（図１３を参照されたい）。一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡのいずれも、対照と比較して、環状ＲＮＡの１回以上の投与後、免疫原性応答を低下させる（例えば、対照ＲＮＡの投与と比較して低下させる）。
環状ＲＮＡについての免疫原性の指標は、血清中のサイトカインレベルである。
この実施例において、サイトカイン血清濃度が環状ＲＮＡの１回以上の投与後に調べられる。前の実施例のいずれか１つからの環状ＲＮＡが皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）を介して６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与される。血清が異なるコホートから抜き取られる：エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡ及びエンクリプトゲンを有さない環状ＲＮＡの注射を全身及び／又は局所的に注入されたマウス。
採取された血清サンプルをＰＢＳ中で１～１０倍に希釈し、酵素結合免疫吸着法（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により、マウスＩＦＮ－αについて分析する。
血清中のサイトカインレベルに加えて、炎症マーカーの発現は、免疫原性の別の指標である。この実施例において、ビヒクル（環状ＲＮＡなし）、線状ＲＮＡ又は環状ＲＮＡで処理されたマウスからの脾臓組織を投与の１、４及び２４時間後に採取する。サンプルを、以下の技術、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析、ノーザンブロット又はＦＡＣＳ分析を用いて分析する。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の場合、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＴＮＦ－α及びＰＫＲについてのｍＲＮＡレベルを上述されるように定量化する。
ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるようにＩＦＮ－α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）について分析する。
ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３に対する直接共役抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６で染色し、フローサイトメーターにおいて分析する。
一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡは、対照ＲＮＡと比較して、１回又は複数回の投与後、サイトカインレベルを低下させるであろう（ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット、ＦＡＣＳ及び／又はｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される際）。
実施例１６：環状ＲＮＡは、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む
この実施例は、環状ＲＮＡが少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含むことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つにより、ＧＦＰ ＯＲＦ及びＩＲＥＳを含むように合成される（図１４を参照されたい）。Ｊ２及びＫ１モノクローナル抗体によるドットブロットアッセイを用いて、少なくとも４０ｂｐの長さの二本鎖ＲＮＡ構造を測定する。環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）をナイロン膜（スーパーチャージ（ｓｕｐｅｒ ｃｈａｒｇｅｄ）Ｎｙｔｒａｎ）上にブロッティングし、乾燥させ、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中５％の脱脂粉乳でブロックし、６０分間にわたってｄｓＲＮＡ特異的ｍＡｂ Ｊ２又はＫ１（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）と共にインキュベートする。膜をＴＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次にＨＲＰ共役ロバ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で処理し、次に６回洗浄し、ドットを、増強化学発光ウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化する。
環状ＲＮＡは、内部の疑似二本鎖ＲＮＡセグメントを生成することが予測される。
実施例１７：環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を含む
この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖構造を含むことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶｍｉｎの発現の追加を伴って及び伴わずに、上述される方法の１つによって合成される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造を形成し（図１５を参照されたい）、陽性対照として使用される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４によって示されるように）。
環状ＲＮＡ構造が機能的疑似二本鎖構造を含むかどうかを試験するために、本発明者らは、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）によって分析される選択的２’ＯＨアシル化を用いて二次構造を決定する。ＳＨＡＰＥは、単一ヌクレオチド分解におけるＲＮＡの局所的骨格柔軟性を評価する。ＳＨＡＰＥ求電子剤に対する塩基位置の反応性は、二次構造に関連している：塩基対合された位置は、反応性が弱く、非対合位置は、より反応性が高い。
ＳＨＡＰＥが環状ＲＮＡ、ＨＤＶｍｉｎ及び線状ＲＮＡにおいて行われる。ＳＨＡＰＥは、それぞれＷｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００６及びＧｒｉｆｆｉｎ ２０１４ ｅｔ ａｌによって本質的に報告されるＮ－メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ）又はシアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）を用いて行われる。ＢｚＣＮを用いたＳＨＡＰＥについて簡潔に述べると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１ｕｌの８００ｍＭのＢｚＣＮを、１６０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１Ｕ／ｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ ＲＮａｓｅ阻害剤）中の３～６ｐｍｏｌのＲＮＡを含有する２０ｕｌの反応混合物に加え、３７℃で１分間インキュベートする。対照反応混合物は、ＢｚＣＮなしで１ｕｌのＤＭＳＯを含む。ＢｚＣＮとのインキュベーション後、ＲＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、製造業者によって指示されるように精製し（例えば、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キットを用いて）、６ｕｌの１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中で再懸濁させる。一染料系を用いて、ＢｚＣＮ付加物を検出する。ＲＮＡを、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）で標識されたプライマーでアニールする。プライマー伸長は、インキュベーション条件に対する以下の変更を伴い、製造業者の推奨に従って逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われる：４２℃で５分、５５℃で３０分、６５℃で２５分及び７５℃で１５分。２つのシーケンシングラダーは、プライマー伸長反応において０．５ｍＭのｄｄＡＴＰ又は０．５ｍＭのｄｄＣＴＰのいずれかを用いて生成される。プライマー伸長産物をエタノールで沈殿させ、洗浄して、過剰な塩を除去し、市販のサイズ標準（例えば、Ｌｉｚサイズ標準Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）と共にキャピラリー電気泳動によって分解する。
そのままの電気泳動図を、一次フラグメント分析ツール（例えば、ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析する。次に、電気泳動図の各位置におけるピークを積分する。分析される各ＲＮＡについて、各プライマー伸長反応のためのバックグラウンドが、ＢｚＣＮで処理されないＲＮＡにおいて行われる陰性対照反応のバックグラウンドに対して正規化されるように、ローディングエラー（ｌｏａｄｉｎｇ ｅｒｒｏｒ）を補正するためのｙ軸スケーリングが行われる。シグナル減衰補正が各反応についてデータに適用される。ピークは、２つのシーケンシング反応から生成されるラダーに整列される。各位置において、陰性対照のピーク面積が、ＢｚＣＮ処理されたサンプルにおけるピーク面積から差し引かれ；次に、これらの値が、差し引かれたピーク面積を、差し引かれたピーク面積の上位２％～１０％の平均で除算することにより、正規化ＳＨＡＰＥ反応性に換算される。
ＳＨＡＰＥ分析に加えて、本発明者らは、ＮＭＲ（Ｍａｒｃｈａｎｋａ ｅｔ ａｌ ２０１５）；ヒドロキシル基プロービング（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１２）；又はＤＭＳ及びＣＭＴＣ及びケトキサールの組合せ（Ｔｉｊｅｒｉｎａ ｅｔ ａｌ ２００７及びＺｉｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００１）を行う。
環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を有することが予測される。
実施例１８：環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を含む
この実施例は、環状ＲＮＡが機能的疑似らせん構造を含むことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、３９５Ｌの発現の追加を伴い、上述される方法の１つによって合成される（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造（上に示されるように、ＲＮＡ二次構造折り畳みアルゴリズムｍｆｏｌｄ及びＤｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９によって）、図１６を参照されたい。この構造は、Ｄ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）との複合体形成に必須である。
したがって、環状ＲＮＡ構造が機能的疑似構造を含むかどうかを試験するために、本発明者らは、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、ＨＤＡｇ－１６０又はＨＤＡｇ－１９５と共にインキュベートし、ＥＭＳＡアッセイを用いて結合を分析する。結合反応を、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、５％のグリセロール、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２Ｕ／ｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル溶液を含む２５ｕｌ中で行う。環状ＲＮＡを０～１１０ｎＭの範囲の濃度のＨＤＡｇタンパク質（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９によって記載されるように得られた）と共にインキュベートする。反応混合物を氷上で集めて、３７℃で１時間インキュベートし、２．５時間にわたって２４０Ｖで０．５トリス－ボレート－ＥＤＴＡ中において６％の天然ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させる。遊離及び結合ＲＮＡのレベルを、核酸染色（例えば、ゲルレッド（ｇｅｌｒｅｄ））を用いて決定する。結合は、バックグラウンドを差し引いた全レーンの強度に対する非結合ＲＮＡの強度として計算される。
環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を有することが予測される。
実施例１９：自己転写／複製
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶ複製ドメインの発現の追加（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１４によって記載されるように）、アンチゲノム複製コンピテントリボザイム及び核局在化シグナルを伴い、上述される方法の１つによって合成される。これらのＲＮＡ配列は、環状ＲＮＡが核に位置することを可能にし、ここで、宿主ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡに結合し、ＲＮＡを転写する。次に、このＲＮＡは、リボザイムを用いて自己切断される。次に、ＲＮＡは、ライゲートされ、再度自己複製される（図１７を参照されたい）。
環状ＲＮＡ（１～５マイクログラム）は、上述される技術を用いてＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトされる。ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清が補充された、高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。トランスフェクション後、ＨｅＬａ細胞をさらに４～７２時間培養し、次にトランスフェクトされた細胞からの全ＲＮＡをトランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離し、ＨＤＶドメインをコードする環状ＲＮＡの総量を決定し、本明細書に記載されるようにｑＰＣＲを用いて、対照環状ＲＮＡと比較する。
実施例２０：娘細胞内での環状ＲＮＡ保存
この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成される。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）を、ＧＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図１８を参照されたい）。
ヒト線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ－９０）を、組織培養物で処理されたプレート上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させる。細胞を、指数増殖を維持するために定期的に継代する。脂質トランスフェクション試薬（２μＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１２ウェル組織培養物で処理されたプレートの１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上述される）及び１４５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液）の混合物に加える。１５分間にわたる室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で懸濁された１×１０５個のＨｅＬａ細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間にわたるインキュベーション後、細胞は、ＢｒｄＵ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてパルスをかけられる。ＢｒｄＵ、標識期間がそれらの特定の集団の倍加時間に従って各細胞型について最適化され、例えば、ＩＭＲ－９０ヒト線維芽細胞は、２７時間の倍加時間を有し、Ｅｌａｂｄ ｅｔ ａｌ ２０１３によって記載されるように、８～９時間にわたってパルスをかけられる。
細胞をＢｒｄＵパルスの１、２、３、４、５及び１０日後の時点で収集する。細胞のサブセットをｑ－ｒｔ－ＰＣＲのために単離し、別のサブセットをＦＡＣＳ分析のために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを測定するために、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３６０］～［０３６５］に記載される実施例２及びその対応する図面に記載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。細胞を、本明細書に記載されるようにＢｒｄＵ及びＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用いて分析する。
環状ＲＮＡは、娘細胞内で持続し、娘細胞は、ＧＦＰタンパク質を発現することが予測される。
実施例２１：環状ＲＮＡ環状化
この実施例は、スプリントライゲーションを用いた環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
非天然環状ＲＮＡは、１つ以上の望ましい特性を含むように操作され得、組み換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライゲーションが線状ＲＮＡを環状化した。
環状ＲＮＡ１を、終止コドン（２６４ｎｔ）なしで三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配列（配列番号１１）を有する。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号１２）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ）なしで、スタガー要素（２Ａ配列、配列番号１３）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有することを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。
この実施例において、環状ＲＮＡを以下のように生成した。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型を、Ｔ７プロモータを有するフォワードプライマー及び２－Ｏ－メチル化ヌクレオチドをリバースプライマーと共に有する対応する配列（ＩＤＴ）を有するｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメントから増幅した。増幅されたＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。２５０～５００ｎｇの精製されたＤＮＡ鋳型をインビトロ転写に供した。線状、５’－一リン酸化インビトロ転写産物を７．５ｍＭのＧＭＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ及び７．５ｍＭのＡＴＰの存在下において、対応する配列を有する各ＤＮＡ鋳型からＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成した。約４０μｇの線状ＲＮＡを各反応において生成した。インキュベーション後、各反応をＤＮａｓｅで処理して、ＤＮＡ鋳型を除去した。インビトロ転写ＲＮＡを２．５Ｍの酢酸アンモニウムの存在下においてエタノールで沈殿させて、取り込まれないモノマーを除去した。
転写された線状ＲＮＡを、鋳型としての２０ｎｔのスプリントＤＮＡオリゴマー（配列番号１４）上でＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。スプリントＤＮＡを、線状ＲＮＡの１０ｎｔの各５’又は３’末端をアニールするように設計した。スプリントＤＮＡ（３μＭ）でアニールした後、１μＭの線状ＲＮＡを３７Ｃ又は４時間で０．５Ｕ／μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２と共にインキュベートした。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を含まない混合物を陰性対照として使用した。
線状ＲＮＡの環状化を６％の変性ＰＡＧＥにおいてＲＮＡを分離することによって監視した。よりゆっくりと移動するＲＮＡバンドは、それらの環状構造のため、変性ポリアクリルアミドゲルにおける線状ＲＮＡより環状ＲＮＡと一致する。図１９から分かるように、ＲＮＡ混合物へのリガーゼの追加（＋レーン）は、リガーゼを欠いた混合物（－レーン）中に存在する線状ＲＮＡバンドを超えるようである新たなバンドを生成した。よりゆっくりと移動するバンドは、全てのＲＮＡ混合物において見られ、これは、陰性対照と比較して、複数の構築物で行われる成功したスプリントライゲーション（例えば、環状化）を示す。
実施例２２：ＲＮＡ環状化効率
この実施例は、ＲＮＡスプリントライゲーションの環状化効率を実証する。
１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡがスプリント媒介性環状化を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライゲーションは、対照より高い効率で線状ＲＮＡを環状化した。
実施例２１に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３及び環状ＲＮＡ４をここでも使用した。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列番号１８）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子及び終止要素（三重終止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と同一の配列を有する。
この実施例において、ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（２６４ｎｔ、２７３ｎｔ、３３０ｎｔ、３３９ｎｔ、８７３ｎｔ及び７６２ｎｔ）を生成し、実施例１に記載されるように環状化した。環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分解し、線状又は環状ＲＮＡについてのゲルにおける対応するＲＮＡバンドを精製のために切除した。切除されたＲＮＡゲルバンドを破砕し、ＲＮＡを、８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。
環状化効率を以下のように計算した。溶離された環状ＲＮＡの量を、溶離された全ＲＮＡの量（環状＋線状ＲＮＡ）で除算し、結果を図２０中のグラフとして示した。
Ｔ４ ＲＮＡｓｅリガーゼ２を用いた線状ＲＮＡのライゲーションは、対照より高い効率速度で環状ＲＮＡを生成した。傾向データは、より多い構築物がより高い速度で環状化されたことを示し、例えば、約８００ｎｔを有する線状ＲＮＡが、約８０％の環状化効率を有することが示された一方、約２００～４００ｎｔを有する線状ＲＮＡは、５０％～８０％の範囲の環状化効率を有していた。
実施例２３：分解感受性を欠いた環状ＲＮＡ
この実施例は、線状ＲＮＡと比較した、ＲＮＡｓｅ Ｒによる分解に対する環状ＲＮＡの感受性を実証する。
環状ＲＮＡは、５’及び３’末端の欠如のために、線状ＲＮＡよりエキソヌクレアーゼ分解に対して抵抗性である。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より分解に対する感受性が低い。
環状ＲＮＡ５を生成し、本明細書に記載されるアッセイに使用するために実施例２２に記載されるように環状化した。
環状ＲＮＡ５の環状化を試験するために、２０ｎｇ／μｌの線状又は環状ＲＮＡ５を３０分間にわたって３７℃において、２Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｒ、線状ＲＮＡを消化するが、ラリアット又は環状ＲＮＡ構造を消化しない３’－５’エキソリボヌクレアーゼと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
エキソヌクレアーゼを欠いたレーンに存在する線状ＲＮＡバンドは、環状ＲＮＡ５レーンに存在せず（図２１を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡ５が、線状ＲＮＡ対照と比較して、エキソヌクレアーゼ処理に対するより高い抵抗性を示したことを示す。
実施例２４：環状ＲＮＡの単離及び精製
この実施例は、ＵＲＥＡゲル分離を用いた環状ＲＮＡ精製を実証する。
実施例１９及び２０に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３、環状ＲＮＡ４、環状ＲＮＡ５及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。
この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析した（図２２を参照されたい）。
単一のバンドを、可変サイズを有する環状ＲＮＡについてＰＡＧＥによって視覚化した。
実施例２５：タンパク質発現の検出
この実施例は、環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
タンパク質発現は、ｍＲＮＡから特定のタンパク質を生成するプロセスである。このプロセスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのＤＮＡの転写、続いてポリペプチド鎖へのｍＲＮＡの翻訳を含み、このポリペプチド鎖が最終的に機能的タンパク質に折り畳まれ、特定の細胞内又は細胞外の位置に標的化され得る。
以下の実施例に示されるように、タンパク質を環状ＲＮＡ配列からインビトロで発現させた。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
蛍光が検出され、発現産物が存在することが示された。したがって、環状ＲＮＡがタンパク質の発現を駆動することが示された。
実施例２６：ＩＲＥＳ非依存的発現
この実施例は、環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下で発現を駆動することを実証する。
ＩＲＥＳ又は内部リボソーム進入部位は、キャップ非依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である。環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下でＦｌａｇタンパク質の発現を駆動することが示された。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、ＩＲＥＳの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２７：キャップ非依存的発現
この実施例は、環状ＲＮＡがキャップの非存在下で発現を駆動できることを実証する。
キャップは、ｍＲＮＡの５’末端において特異的に改変されたヌクレオチドである。５’キャップは、線状ｍＲＮＡの安定性並びに翻訳開始のために有用である。環状ＲＮＡは、キャップの非存在下で産物の発現を駆動した。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを１５分間にわたって７０℃で３０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させた。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、キャップの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２８：５’－ＵＴＲなしでの発現
この実施例は、５’非翻訳領域を欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、ＲＮＡ転写産物の下流のタンパク質翻訳を促進する開始コドンの直接上流にある領域である。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の５’－非翻訳領域は、インビトロタンパク質発現に必要でなかった。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを、２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を、１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、５’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２９：３’－ＵＴＲなしでの発現
この実施例は、３’－ＵＴＲを欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンの直接下流にある領域であり、遺伝子発現に転写後に影響を与え得る調節領域を含む。３’－非翻訳領域は、ｍＲＮＡの局在化、安定性、輸送、及び翻訳効率に影響を与えることにより、遺伝子発現において役割も果たし得る。さらに、３’－ＵＴＲの構造特性並びに別のポリアデニル化のその使用が遺伝子発現において役割を果たし得る。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の３’－ＵＴＲは、インビトロタンパク質発現に必要でなかった。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、３’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例３０：終止要素（終止コドン）を用いない発現
この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳後のポリペプチド産物の生成を実証する。
タンパク質は、アミノ酸の固有の配列から構成されるポリペプチドに基づいている。各アミノ酸は、コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組によってｍＲＮＡ中でコードされる。タンパク質翻訳中、ｍＲＮＡ中の各コドンは、成長しているポリペプチド鎖中のアミノ酸の付加に対応する。終止要素又は終止コドンは、結合解放因子によってこのプロセスの終了を示し、それによりリボソームサブユニットを分離させて、アミノ酸鎖を解放する。
以下の実施例に示されるように、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡは、ローリングサークル型翻訳により、反復したポリペプチド配列から構成される大きいポリペプチド産物を生成した。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計し、翻訳開始に有利に作用するように開始コドンにおいてコザック配列を含んでいた。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２４を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、終止要素（終止コドン）の非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例３１：終止要素（終止コドン）を用いない別個のタンパク質の発現
この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡから翻訳された別個のタンパク質産物の生成を実証する。
２Ａペプチドなどのスタガー要素は、約２０ａａの短いアミノ酸配列を含み得、これは、単一のｍＲＮＡからの等モルレベルの複数の遺伝子の生成を可能にする。スタガー要素は、リボソームに、２Ａ要素のＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせて、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらすことによって機能し得る。分離は、Ｃ末端上に見られるグリシン及びプロリン残基間で起こり、上流のシストロンは、末端に加えられたいくつかのさらなる残基を有する一方、下流のシストロンは、プロリンから開始する。
以下の実施例に示されるように、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡは、大きいポリペプチドポリマーを生成し（図１６の左側のパネル：スタガーなし－環状ＲＮＡレーン）、コード領域の３’末端における２Ａ配列の包含は、同等の線状ＲＮＡ構築物によって生成されるものと同等のサイズで別個のタンパク質の生成をもたらした（図１６の右側のパネル：スタガー－環状ＲＮＡレーン）。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なり及びスタガー要素なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２５を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
実施例３２：ローリングサークル型翻訳
この実施例は、スタガー要素を用いた、環状ＲＮＡからのタンパク質の増加したインビトロ生合成を実証する。
非天然環状ＲＮＡを、スタガー要素を欠いた環状ＲＮＡを用いたタンパク質発現と比較するために、スタガー要素を含むように操作した。以下の実施例に示されるように、スタガー要素を含む環状ＲＮＡは、このような配列を欠いた以外は同一の環状ＲＮＡと比較して、タンパク質を過剰発現した。
環状ＲＮＡを、終止要素（例えば、並んだ３つの終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号２１）を用いて、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２６を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。図２７は、図２６に示される２つの例示的な環状ＲＮＡから翻訳されたタンパク質産物のウエスタンブロット分析からのシグナル強度を要約しているグラフを示し、これは、ローリングサークル型翻訳中の、終止コドンを含む環状ＲＮＡと比較して、スタガー要素を含み且つ終止コドンを含まない環状ＲＮＡからの増加したタンパク質発現を実証している。
別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
実施例３３：インビトロでの生物活性タンパク質の発現
この実施例は、環状ＲＮＡからの生物活性タンパク質のインビトロ生合成を実証する。
非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、生物活性タンパク質が網状赤血球溶解物中で環状ＲＮＡから発現された。
環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含有していた。翻訳混合物中のルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて監視した。
図２８に示されるように、対照ビヒクルＲＮＡよりはるかに高い蛍光が環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡの両方で検出され、これは、発現産物が存在していたことを示す。したがって、環状ＲＮＡが生物活性タンパク質を発現することが示された。
実施例３４：線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有する環状ＲＮＡ
この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡと比較して延長された半減期を有するように操作されることを実証する。
治療用タンパク質をコードする環状ＲＮＡは、例えば、線状ＲＮＡと比較して、延長された生物学的半減期に起因する、より高いレベルのコードされたタンパク質を生成する能力をレシピエント細胞に与えた。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、網状赤血球溶解物中でその線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有していた。
環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。
この実施例において、時間経過実験がＲＮＡ安定性を監視するために行われた。１００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物と共にインキュベートし、サンプルを１時間、５時間、１８時間及び３０時間の時点で収集した。全ＲＮＡを、フェノール系試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて溶解物から単離し、ｃＤＮＡを逆転写によって生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲ反応ミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図２９に示されるように、より高い濃度の環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより後の時点で検出され、経時的な環状ＲＮＡの濃度の低下パーセントは、線状ＲＮＡの濃度の低下パーセントより少なかった。したがって、環状ＲＮＡは、より安定しているか、又はその線状同等物と比較して増加した半減期を有していた。
実施例３５：環状ＲＮＡは、細胞内における線状ＲＮＡより長い半減期を実証した
この実施例は、環状ＲＮＡが細胞内に送達され、線状ＲＮＡと比較して細胞内での増加した半減期を有することを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較してより高いレベルで存在し、これは、環状ＲＮＡのより長い半減期を実証している。
この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、コザック、２Ａによって隣接されるＥＧＦ、終止又は非終止配列（配列番号１１、１９、２０、２１）をコードするように設計した。細胞中のＲＮＡの半減期を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。プライマー配列は、以下のとおりであった：線状又は環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＴＡＴ、Ｒ：ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣ；環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ、Ｒ：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣ。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。２４時間後、保持された環状及び線状ＲＮＡを、ｑＰＣＲを用いて測定した。環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、トランスフェクションの２４時間後に、細胞内におけるより高い濃度を有することが示され、これは、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡのものより、細胞内におけるより長い半減期を有することを示唆している（図３０Ａ及び図３０Ｂ）。
実施例３６：合成環状ＲＮＡを細胞内で翻訳し、合成環状ＲＮＡをローリングサークル型翻訳によって翻訳した
この実施例は、細胞内での合成環状ＲＮＡの翻訳を実証する。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、終止要素（配列番号１１）なしで、コザック、３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列をコードするように設計した。環状ＲＮＡがポリマーＥＧＦに翻訳された一方、線状ＲＮＡが翻訳されず、これは、細胞が合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を行ったことを実証している。
この実施例において、細胞内での線状又は環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。ドライ転写方法を用いて、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。しかしながら、図３１は、トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦタンパク質が環状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出された一方、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出されなかったことを示す。したがって、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、ローリングサークル型翻訳によって細胞内で翻訳された。
実施例３７：合成環状ＲＮＡは、細胞内における低下した免疫原性遺伝子発現を実証した
この実施例は、環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫応答を有するように操作されることを実証する。
治療用タンパク質をコードした環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、レシピエント細胞内での免疫関連遺伝子（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－β）の低下した誘導を示した。ＲＩＧ－Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ－βなどのインターフェロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ－ＰＣＲによるＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの発現によって評価した際、類似した線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された。
環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、（１）コザック、終止要素（配列番号１１）を有さない３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）（配列番号２１）によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列（配列番号１９）によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配列によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列、続いて終止要素（終止コドン）（配列番号２０）のいずれかをコードするように設計した。
この実施例において、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
使用されるプライマー配列：ＧＡＰＤＨについてのプライマー、Ｆ：ＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡ；ＲＩＧ－Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ－β、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
図３２に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
実施例３８：細胞内におけるローリングサークル型翻訳による合成環状ＲＮＡからの増加した発現
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳からの増加した発現を実証する。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）なしで、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３３に示されるように、両方の環状ＲＮＡは、機能的ルシフェラーゼ活性を有する翻訳産物を生成した。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図３３に示されるように、両方の環状ＲＮＡが細胞内でタンパク質を発現した。しかしながら、スタガー要素、例えば２Ａ配列を含み、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡは、終止要素（終止コドン）を有する環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
実施例３９：細胞内で翻訳される合成環状ＲＮＡ
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡがその線状同等物より多くの発現産物を生成したことを示す。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。細胞を、陰性対照としてＥＧＦをコードする環状ＲＮＡ（配列番号２２）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列、スタガー配列（２Ａ配列）；線状又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３４に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼにおいて翻訳された。
線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図３４に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、より高いレベルのルシフェラーゼ活性又は生成された増加したタンパク質を有していた。
実施例４０：合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳が細胞内で機能的タンパク質産物を生成した
この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）を欠き、スタガー要素を有する、合成環状ＲＮＡからの機能的タンパク質産物のローリングサークル型翻訳を実証する。さらに、この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡがその線状同等物より多い機能的タンパク質産物を発現したことを示す。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。細胞を環状ＲＮＡ ＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；線状及び環状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図２５に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼ中において翻訳された。
線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図３５に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
実施例４１：合成環状ＲＮＡが細胞内におけるＩＲＥＳ開始によって翻訳される
この実施例は、細胞内におけるＩＲＥＳによる合成環状ＲＮＡ翻訳開始を実証する。
環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）、ｎＬＵＣコザック（配列番号２５）：コザック配列、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列、スタガー配列（Ｔ２Ａ配列）、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ、スタガー配列（Ｐ２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３６に示されるように、ＩＲＥＳを有する環状ＲＮＡは、コザック配列を有する環状ＲＮＡと比較して、より高いタンパク質レベルに対応する、より高いレベルのルシフェラーゼ活性を示した。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図３６に示されるように、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳによりタンパク質発現を開始させ、コザックを有する環状ＲＮＡがタンパク質発現を開始させるより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
実施例４２：細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳
この実施例は、ＩＲＥＳによりタンパク質産生を開始させる細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳によるより多いタンパク質産生を実証する。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）を用いるか又は用いずに、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ ＩＲＥＳ ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３７に示されるように、両方の環状ＲＮＡが発現産物を生成し、ローリングサークル型翻訳を実証し、ＩＲＥＳを有し終止要素を有さない（例えば、コザック配列を有さない）環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳを有さず終止要素を有する（例えば、コザック配列を有する）環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を開始及び生成し、これは、ローリングサークル型翻訳を実証している。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図３７に示されるように、環状ＲＮＡを、両方の環状ＲＮＡから与えられるローリングサークル型方法により、細胞内でタンパク質に翻訳した。しかしながら、環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳は、ＩＲＥＳでより多いタンパク質産生を開始させ、終止要素コザック翻訳開始を有する環状ＲＮＡと比較して、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより多くのタンパク質産物を生成した。
実施例４３：環状ＲＮＡから発現される増加したタンパク質
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量のより多い発現産物を生成したことを示す。
線状及び環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）でトランスフェクトした。図２８に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有する、より多いレベルのタンパク質を生成した。
２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図３８に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でタンパク質に翻訳された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
実施例４４：合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳が細胞内で別個のタンパク質産物を生成した
この実施例は、別個のタンパク質産物が、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）の代わりにスタガー要素を有する合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳によって翻訳されたことを実証する。さらに、この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量を有するより多いタンパク質産物を発現したことを示す。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）の代わりに、スタガー要素と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞をビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３９に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図３９に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、適切な分子量を有するより高いレベルの別個のタンパク質産物を生成した。
実施例４５：疑似二本鎖、らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖及びらせん構造の両方を有していたことを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、疑似二本鎖、らせん構造を採用するように操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；８８（１３）：７４０２－１１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４３－１４，Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｄｅｃ；６０（６）：１９０２－１０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２７３５７）。
この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＯＲＦとしての３ＸＦＬＡＧでタグ化されたＮｌｕｃ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ）をコードするように設計した、ＲＮＡ二次構造を評価するために、熱力学的ＲＮＡ構造予測ツール（ＲＮＡｆｏｌｄ）を使用した（Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ）。さらに、ＲＮＡ三次構造を、ＲＮＡモデリングアルゴリズムを用いて分析した。
図４０及び４１に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似二本鎖、らせん構造を採用したようにモデル化される。
実施例４６：反復配列と連結された疑似らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、環状ＲＮＡが、反復配列と連結された疑似らせん構造を有するように設計され得ることを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、反復配列と連結された疑似らせん構造を採用するように操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ ２０１４）。
この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｎｌｕｃ及び反復配列（配列番号２６）を含むスペーサーをコードするように設計した。ＲＮＡ三次構造を評価するためにＲＮＡモデリングアルゴリズムを使用した。
図４２に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似らせん構造を採用したようにモデル化される。
実施例４７：環状化ＲＮＡは、環状であり、コンカテマーでない
この実施例は、ＲＮＡｓｅ Ｈによる環状ＲＮＡ分解が、環状ＲＮＡと一致し、コンカテマーＲＮＡと一致しない核酸分解産物を生成したことを実証する。
ＲＮＡは、リガーゼと共にインキュベートされる場合、反応しないか又は分子内若しくは分子間結合を形成することができないかのいずれかであり、これは、それぞれ環状（遊離末端がない）又はコンカテマーＲＮＡを生成する。相補的ＤＮＡプライマー及びＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼによる各タイプのＲＮＡの処理は、出発ＲＮＡ材料に応じて、特定のサイズの固有の数の分解産物を生成することが予測される。
以下の実施例に示されるように、ライゲートされたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ｈ分解によって生成されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて環状であり、コンカテマーでないことが示された。
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａを含有する環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを生成した。
ＲＮＡ（１２９９ｎｔ）の環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ／μｌの線状又は環状ＲＮＡを２０分間にわたって３７℃において、１０３７－１０４６ｎｔのＲＮＡ（ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ、配列番号５５）に対して、０．２５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレアーゼ及び０．３ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
上述される使用される線状ＲＮＡについて、ＤＮＡプライマーの結合及びＲＮＡｓｅ Ｈによるその後の切断後、２つの切断産物が１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔで得られることが予測される。コンカテマーが２５８、１０４１及び１２９９ｎｔの３つの切断産物を生成することが予測される。環状が単一の１２９９ｎｔ切断産物を生成することが予測される。
ＲＮＡｓｅエンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた線状ＲＮＡレーン中のバンドの数は、予測されるように１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔの２つのバンドを生成した一方、１２９９ｎｔの単一のバンドは、環状ＲＮＡレーンにおいて生成され（図４３を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡが実際に環状であり、コンカテマーでなかったことを示す。
実施例４８：大きい環状ＲＮＡの調製
この実施例は、約２０塩基～約６．２Ｋｂの範囲の環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。
１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、所望の機能に応じたサイズの範囲で生成された。以下の実施例に示されるように、最大で６２００ｎｔの線状ＲＮＡが環状化された。
プラスミドｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴ（６．２ｋｂ）をここで使用した。プライマーを、規則的な間隔でｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴにアニールして、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔに対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成するように設計した。示されるＤＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ転写を行って、対応するサイズの線状ＲＮＡを生成した。環状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡを用いて、これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドから生成した。
ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔ）を生成した。それらを、ＤＮＡスプリント及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。対照として、１つの反応をＴ４ ＲＮＡリガーゼなしで行った。環状化サンプルの半分をＲＮＡｓｅ Ｒで処理して、線状ＲＮＡを除去した。
環状化効率を監視するために、各サンプルを、ｑＰＣＲを用いて分析した。図４４に示されるように、環状ＲＮＡを異なる長さの様々なＤＮＡから生成した。図４５に示されるように、ＲＮＡの環状化を、環状接合部に対して、ＲＮＡｓｅ Ｒ処理及びｑＰＣＲ分析を用いて確認した。この実施例は、様々な長さの環状ＲＮＡ生成を実証する。
実施例４９：タンパク質結合部位を用いて操作される環状ＲＮＡ
この実施例は、タンパク質結合部位を有する環状ＲＮＡの生成を実証する。
この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号５６）及びガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ（配列番号５７）、続いて少なくとも１つのタンパク質結合部位を含むように設計される。特定の例では、シンドビスウイルス３’ＵＴＲからのＨｕＲ結合配列（配列番号５２）を用いて、環状ＲＮＡ免疫原性に対するタンパク質結合の影響を試験する。ＨｕＲ結合配列は、２つの要素、ＵＲＥ（Ｕリッチ要素；配列番号５０）及びＣＳＥ（保存配列要素；配列番号５１）を含む。ＨｕＲ結合配列を有さない又はＵＲＥを有する環状ＲＮＡが対照として使用される。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部をＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号５６）の前に配置する。環状ＲＮＡは、記載されるようにインビトロで生成される。図４６に示されるように、環状ＲＮＡは、ＨｕＲ結合部位を含有するように生成された。
環状ＲＮＡ免疫原性に対するＲＮＡ結合タンパク質の影響を監視するために、細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中にトランスフェクトする。翻訳効率／ＲＮＡ安定性／免疫原性を毎日最大で７２時間監視する。Ｇｌｕｃ活性を監視するために培地を収集する。ＲＮＡレベルを測定するための細胞溶解物を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって相対的遺伝子発現の測定を可能にするキットを用いて調製する。
製造業者の説明（Ｐｉｅｒｃｅ）に従ってガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキットを用いて、Ｇｌｕｃ活性を測定することにより、翻訳効率を監視する。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡは、製造業者の説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って細胞溶解物調製キットを用いて生成される。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて３連で行われる。環状ＲＮＡ安定性をＮｌｕｃに対するプライマーによって測定する。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルを定量化し、アクチン値に対して正規化する。
実施例５０：調節核酸部位を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、調節ＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
異なる細胞型は、特定のＲＮＡ配列を標的にする独自の核酸調節機構を有する。環状ＲＮＡ中のこれらの特定の配列をコードすることは、異なる細胞型における独自の特性を与え得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部位をコードするように操作された。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをコードする配列、ｍｉｒ６９２マイクロＲＮＡ結合部位（ＧＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＧＡＧＡＵ）及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し（図４７）、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
図４７に示されるように、環状ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ結合部位を用いて生成した。
実施例５１：環状ＲＮＡの自己スプライシング
この実施例は、自己スプライシングによって環状ＲＮＡを生成する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。インビトロ転写反応は、１μｇの鋳型ＤＮＡ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、１０×Ｔ７反応緩衝液、７．５ｍＭのＡＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ、７．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤及びＴ７酵素を含んでいた。転写を３７℃で４時間行った。転写されたＲＮＡは、３７℃で１５分間１ＵのＤＮａｓｅ Ｉで処理されたＤＮａｓｅであった。自己スプライシングによる環状化に有利に作用するように、さらなるＧＴＰを２ｍＭの最終濃度に加え、５５℃で１５分間インキュベートした。次に、ＲＮＡをカラム精製し、ＵＲＥＡ－ＰＡＧＥによって視覚化した。
図４８は、自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡを示す。
実施例５２：エンクリプトゲンを含むスプライシング要素を有する環状ＲＮＡ
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでおり、これらの２つのスペーサー要素は、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列（配列番号５９）の一部であるスプライシング要素を含む。
環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。
この実施例において、細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視する。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡは、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中にトランスフェクトされる。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡは、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離される。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成する。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行われる。
スプライシング要素を含む環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を評価する。
実施例５３：細胞分裂中の環状ＲＮＡの持続性
この実施例は、細胞分裂中の環状ポリリボヌクレオチドの持続性を実証する。１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、分解されずに細胞分裂を通して細胞内で持続し得る。以下の実施例に示されるように、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を発現する環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞内で７２時間にわたって監視した。
この実施例において、１３０７ｎｔの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
細胞分裂にわたる環状ＲＮＡの持続性をＨｅＬａ細胞内で監視した。９６ウェルプレート中の５０００個の細胞／ウェルは、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた懸濁液であった。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングをＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において行い、細胞計数を、０時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
環状ＲＮＡからのタンパク質の発現は、分裂細胞内で線状ＲＮＡ（トランスフェクションの４８時間後で約７ＲＬＵ）より高いレベル（トランスフェクションの４８時間後で約１０ＲＬＵ）で検出された（図４９）。環状ＲＮＡを有する細胞は、測定される全ての時点において、線状ＲＮＡと比較してより高い細胞分裂速度を有していた。この実施例は、その線状ＲＮＡ同等物より、細胞分裂中の環状ＲＮＡの増加した検出を実証する。
実施例５４：ローリングサークル型翻訳は、複数の発現配列を生成した
この実施例は、単一の構築物から複数のタンパク質を発現する環状ＲＮＡの能力を実証する。さらに、この実施例は、複数のＯＲＦをコードする環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を実証する。この実施例は、単一の構築物からの２つのタンパク質の発現をさらに実証する。
１つの環状ＲＮＡ（ｍｔＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳスペーサー）を、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（配列番号５８）及び３ＸＦＬＡＧタグを有するＧＦＰをコードするＯＲＦ及び３ＸＦＬＡＧタグを有するナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを含むようにローリングサークル型翻訳のために設計した。スタガー要素（２Ａ）は、ＧＦＰ及びＮｌｕｃ ＯＲＦに隣接していた。別の環状ＲＮＡを同様に設計したが、Ｎｌｕｃ ＯＲＦとスペーサーとの間に三重終止コドンを含んでいた。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部がＥＭＣＶ ＩＲＥＳの前に含まれていた。環状ＲＮＡを記載されるようにインビトロで生成した。
環状ＲＮＡからのタンパク質の発現をインビトロ又は細胞内で監視した。インビトロ分析の場合、環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で３時間インキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭの完全アミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（日本大阪の東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含んでいた。
インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
細胞内での分析のため、細胞内での環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いて、網状赤血球溶解物及び細胞からのサンプルをニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図５０に示されるように、ＧＦＰ及びｎＬｕｃをコードする環状ＲＮＡは、２つのタンパク質産物を生成した。三重終止を有さない環状ＲＮＡからの翻訳は、三重終止コドンを有する環状ＲＮＡより多い両方のタンパク質産物を生成した。最後に、三重終止を有する及び有さない両方の環状ＲＮＡは、それぞれ１／３．２４及び１／３．３７の比率でタンパク質を発現した。
実施例５５：環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して低下した毒性を示す
この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより毒性が低いことを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、３ＸＦＬＡＧタグを有し、且つスタガー要素（２Ａ）及び終止要素（終止コドン）によって両側が隣接されたＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環状ＲＮＡをインビトロで生成し、本明細書に記載されるように精製した。この実施例に使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有するｎＬｕｃをコードするキャップ修飾ポリＡテイルＲＮＡ又はキャップ非修飾ポリＡテイルＲＮＡであった。
細胞内のＲＮＡの毒性を監視するために、ＢＪヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ修飾ポリＡテイル線状ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングを９６時間の時点でＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において行った。１条件当たりの全細胞を、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。
図５１に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた培養物中に画像当たり約９０～１００個の細胞があった一方、線状キャップ－Ｎｌｕｃ－ポリ（Ａ）ＲＮＡでトランスフェクトされた培養物中に画像当たり約４０個のみの細胞があり、これは、環状ＲＮＡのトランスフェクションが、線状ＲＮＡと比較して、低下した毒性を実証したことを示している。
実施例５６：ストレス条件下での発現
この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより、ストレス条件下でより良好に発現されたことを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、３ＸＦＬＡＧタグを有し、且つスタガー要素によって隣接されたＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環状ＲＮＡをインビトロで生成し、記載されるように精製した。この実施例に使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有するｎＬｕｃをコードするキャップポリＡテイルＲＮＡであった。
細胞からのガウシアルシフェラーゼの発現を監視するために、ＢＪヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ－ポリＡテイル線状ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
図５２に示されるように、環状ＲＮＡは、ストレス条件下での線状ＲＮＡ（トランスフェクションの３日後の時点で約２０００ＲＬＵ及びトランスフェクションの４日後の時点で検出不能になるまで減少する）と比較して、より高いレベル（トランスフェクションの３日後の時点で約１０００ＲＬＵ及びトランスフェクションの６日後の時点で２０００ＲＬＵ超）で翻訳された。
実施例５７：選択的発現のためのリボスイッチ
この実施例は、環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡを、ＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦの発現を調節する合成リボスイッチ（配列番号６０）を含むように設計した（図４３を参照されたい）。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＣＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製した（図５３）。
テオフィリン又はテトラサイクリンは、その特定のリボスイッチの活性化を誘導して、遺伝子発現のオフスイッチをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１０ Ｍａｙ；６（５）：８０７－１４及びＯｇａｗａ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ．２０１１ Ｍａｒ；１７（３）：４７８－８８．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．２４３３１１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊａｎ １１によって記載されるように）。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現を制御することが予測される。したがって、ＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現は、テオフィリン又はテトラサイクリンの追加後に予測されない。
リボスイッチの効率が無細胞翻訳系及びＨｅＬａ細胞内で試験される。無細胞翻訳は、製造業者の推奨に従って無細胞翻訳キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌ４１４０）を使用し、ＮＬｕｃ ＯＲＦについて発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＧＦＰ ＯＲＦについて細胞イメージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて発光を測定することによって行われる。
細胞アッセイのために、ＨｅＬａ細胞／ウェルは、テオフィリン又はテトラサイクリン依存的合成リボスイッチ（ｔｈｅｏＮ５についての第１のＰＣＲフォワードプライマー、
Figure 2022523794000009
 、ｔｈｅｏＮ５についての第２のＰＣＲフォワードプライマー、
Figure 2022523794000010
 ；ｔｃ－Ｎ５についての第１のＰＣＲフォワードプライマー、
Figure 2022523794000011
 、ｔｃ－Ｎ５についての第２のＰＣＲフォワードプライマー、
Figure 2022523794000012
 ）のいずれかの制御下において、１ｎＭの、ＧＦＰ又はＮＬｕｃをコードする記載される環状ＲＮＡでトランスフェクトされて、選択的発現を評価する。脂質ベースのトランスフェクション試薬が製造業者の推奨に従って使用される。
３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間の培養後、細胞は、１ｎＭ～３ｍＭの範囲の濃度を有する、環状ＲＮＡ内でコードされるリボスイッチに応じて、テオフィリン又はテトラサイクリンを用いて及び用いずに処理される。２４時間の連続した培養後、蛍光又は発光が評価される。ＧＦＰについて、生細胞は、５％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン及び核の染色を含む蛍光ニュートラルＤＭＥＭ培地中でイメージングされる。ＮＬｕｃについて、発光は、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の説明に従ってルシフェラーゼシステムを用いて評価される。
ＮＬｕｃ（青色：チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オレンジ色：ＮＬｕｃ ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
Figure 2022523794000013
 ｅＧＦＰ（青色：チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オレンジ色：ｅＧＦＰ ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
Figure 2022523794000014
 プライマー配列
２（下線：Ｔ７プロモータ）についてのフォワードプライマー
Figure 2022523794000015
 ｔｈｅｏＮ５（オレンジ色：アプタマー；赤色：ａＩＲＥＳ；紫色：ａａＩＲＥＳ）についての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー
Figure 2022523794000016
 ＴｈｅｏＮ５ 第２のＰＣＲ
Figure 2022523794000017
 ｔｃ－Ｎ５についての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー
Figure 2022523794000018
 ｔｃ－Ｎ５についての第２のＰＣＲにおけるフォワードプライマー
Figure 2022523794000019
 全てのＰＣＲにおけるリバースプライマー
ＡＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＣＣＡＧＴＣＧＴＣＧＡＡＣ
接合部
ＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧ
スプリント
５’－ＣＣＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＡ ＴＡＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＣ －３’
実施例５８：修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが生成され、翻訳され、環状ＲＮＡの免疫効果を低下させた
この実施例は、タンパク質産物を生成した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、この実施例は、ヌクレオチド修飾を有するように操作された環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫効果を有していたことを実証する。
１つ以上の望ましい特性を含み、且つ修飾ヌクレオチドの完全又は部分的な組み込みを有するように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示されるように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し、ｎＬｕｃの発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現のｑ－ＰＣＲ）。
ＷＴ ＥＭＣＶ Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐスペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。完全な修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ハイブリッド構築物について、ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをｎＬｕｃ ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを、修飾又は非修飾ヌクレオチドのいずれかを用いて合成した。対照的に、ｎＬｕｃ ＯＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲートした。図５４Ａに示されるように、修飾環状ＲＮＡを生成した。
完全修飾又はハイブリッド修飾構築物からのｎＬｕｃの発現効率を測定するために、０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡを６時間にわたってＢＪ線維芽細胞中にトランスフェクトした。ｎＬｕｃ発現をトランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後の時点で測定した。
自然免疫応答遺伝子のレベルを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞から単離された全ＲＮＡから細胞中で監視した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図５４Ｂ及び図５４Ｃに示されるように、修飾環状ＲＮＡは、ルシフェラーゼ活性によって測定されるように翻訳された。図５５Ａ、図５５Ｂ、及び図５５Ｃに示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－βの発現の低下を示した。したがって、レシピエント細胞における免疫原性関連遺伝子の誘導は、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で減少された。
実施例５９：インビボで投与された環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、より長い半減期／増加した安定性を示した
この実施例は、環状ＲＮＡを送達する能力及びインビボの線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した安定性を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ及びＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｓｔｏｐ）と共にＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むように設計した。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに環状ＲＮＡをＮｌｕｃ ＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。動物に、製造業者の説明に従い、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された単回用量の５μｇのＲＮＡを投与した。
マウスを殺処分し、肝臓を投与の３、４及び７日後の時点で採取した（ｎ＝２匹のマウス／時点）。肝臓を採取し、ＲＮＡ安定化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で貯蔵した。組織を、マイクロチューブホモジナイザ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためにフェノール系ＲＮＡ抽出試薬を用いて抽出した。ｑＰＣＲを用いて、肝臓中の線状及び環状ＲＮＡの両方の存在を測定した。
組織におけるＲＮＡ検出をｑＰＣＲによって行った。線状及び環状ＲＮＡを検出するために、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）。環状ＲＮＡのみを検出するために、５’－３’接合物を増幅するプライマーは、線状ＲＮＡ構築物ではなく環状ＲＮＡ構築物の検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ）。
環状ＲＮＡは、注入の３、４－及び７日後の時点でマウスの肝臓中において線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図５６）。したがって、環状ＲＮＡが投与され、投与後少なくとも７日間においてインビボで検出可能であった。
実施例６０：環状ＲＮＡのインビボ発現、半減期及び非免疫原性
この実施例は、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。それは、線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した半減期を実証する。最後に、それは、環状ＲＮＡがインビボで低下した免疫効果を有することを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に２．５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、担体として脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血液サンプル（５０μｌ）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図５７Ａ及び図５７Ｂ）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中で検出された。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、６日又はそれを超える時点でバックグラウンドレベルを超えて検出されなかった（図５７Ａ及び図５７Ｂ）。
１６日目に肝臓を３匹の動物から切除し、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図５８に示されるように、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、１６日目に肝臓及び脾臓の両方において検出された。図５９に示されるように、線状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓からの免疫関連遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳの増加した発現を示した一方、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓は、１６日目に、担体でトランスフェクトされた動物と比較して、これらのマーカーＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの増加した発現を示さなかった。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、トランスフェクトされた肝臓からの環状ＲＮＡ中に存在しなかった。
この実施例は、環状ＲＮＡが注入の複数日数後に血漿中のタンパク質活性のレベルを有して、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証する。マウス血漿中のガウシアルシフェラーゼの半減期が約２０分間である場合（Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．，２００９，４（４）：５８２－５９１を参照されたい）、同様の活性レベルは、環状ＲＮＡからの連続した発現を示す。さらに、環状ＲＮＡは、免疫関連遺伝子を誘導せずに、その修飾線状ＲＮＡ同等物より長い発現プロファイルを示した。
配列表
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
Figure 2022523794000020
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：ｇｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｔｇｇａｃｃｔ
Ｔ２Ａ：ｇａｇｇｇｃａｇｇｇｇａａｇｔｃｔａｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｇｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｔｃｃｃｇｇｃｃｃａ
Ｅ２Ａ：ｃａｇｔｇｔａｃｔａａｔｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｔｇａａａｔｔｇｇｃｔｇｇａｇａｔｇｔｔｇａｇａｇｃａａｃｃｃａｇｇｔｃｃｃ
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４ ＺＫＳＣＡＮイントロン
Figure 2022523794000021
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Figure 2022523794000022
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ラッカーゼ２ ＭＣＳエクソンベクター配列６９２６ｂｐ
Figure 2022523794000023
Figure 2022523794000024
Figure 2022523794000025
Figure 2022523794000026
配列番号８（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
Figure 2022523794000027
配列番号９（リボスイッチ）
アプタザイム（テオフィリン依存性、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ２０１０ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓを参照されたい）：
Figure 2022523794000028
配列番号１０（ルシフェラーゼ）
ｎＬｕｃ：
Figure 2022523794000029
配列番号１１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022523794000030
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１２
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
Figure 2022523794000031
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号１３
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
Figure 2022523794000032
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１４
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）についてのスプリント
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＴＴ
配列番号１５
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）についてのスプリント
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣ
配列番号１６
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）についてのスプリント
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＧ
配列番号１７
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（８７３ｂｐ）
Figure 2022523794000033
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２６５：Ｔ２Ａ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
配列番号１８
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐ（７６２ｂｐ）
Figure 2022523794000034
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２１１：三重終止コドン
２１２～７５１：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
７５２～７６０：三重終止コドン
配列番号１９
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
Figure 2022523794000035
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号２０
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022523794000036
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号２１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
Figure 2022523794000037
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号２２
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（９５４ｂｐ）
Figure 2022523794000038
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～８８６：３ＸＦＡＬＧ－ＥＧＦ
８８７～９５２：Ｐ２Ａ
配列番号２３
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（１３１４ｎｔ）
Figure 2022523794000039
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
１３０４～１３１２：三重終止コドン
配列番号２４
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（１３０５ｎｔ）
Figure 2022523794000040
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
配列番号２５
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（８８２ｂｐ）
Figure 2022523794000041
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
８７２～８８０：三重終止コドン
配列番号２６
例示的な反復スペーサー配列
Figure 2022523794000042
配列番号２７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるフォワードプライマー
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣ
配列番号２８
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから０．５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるリバースプライマー
Figure 2022523794000043
配列番号２９
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから１ｋｂ鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるリバースプライマー
Figure 2022523794000044
配列番号３０
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるリバースプライマー
Figure 2022523794000045
配列番号３１
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから４ｋｂ鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるリバースプライマー
Figure 2022523794000046
配列番号３２
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるリバースプライマー
Figure 2022523794000047
配列番号３３
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから６．２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例５５に使用されるリバースプライマー
Figure 2022523794000048
配列番号３４
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例５５に使用されるフォワードｑＰＣＲプライマー
ＡＴＴＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡ
配列番号３５
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例５５に使用されるリバースｑＰＣＲプライマー
ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＴ
配列番号３６
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例５５に使用されるフォワードｑＰＣＲプライマー
ＴＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＣＡＣＡ
配列番号３７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例５５に使用されるリバースｑＰＣＲプライマー
ＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣ
配列番号３８
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例５６に使用されるフォワードプライマー配列
ＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧ
配列番号３９
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例５６に使用されるリバースプライマー配列
ＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＧ
配列番号４０
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例５６に使用されるフォワードプライマー配列
ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ
配列番号４２
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例５６に使用されるリバースプライマー配列
ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ
配列番号４２
ＭＤＡ５を検出するために実施例５６に使用されるフォワードプライマー配列
ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ
配列番号４３
ＭＤＡ５を検出するために実施例５６に使用されるリバースプライマー配列
ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ
配列番号４４
ＰＫＲを検出するために実施例５６に使用されるフォワードプライマー配列
ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ
配列番号４５
ＰＫＲを検出するために実施例５６に使用されるリバースプライマー配列
ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ
配列番号４６
ＩＦＮ－βを検出するために実施例５６に使用されるフォワードプライマー配列
ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ
配列番号４７
ＩＦＮ－βを検出するために実施例５６に使用されるリバースプライマー配列
ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
配列番号４８
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳ
Figure 2022523794000049
Figure 2022523794000050
配列番号４９
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳ
Figure 2022523794000051
Figure 2022523794000052
配列番号５０
ＵＲＥ
ＵＣＡＵＡＡＵＣＡＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＵＵＵＵＡＵＵＣＡＣＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ
配列番号５１
ＣＳＥ
ＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＡＡＣＡＵＵＵＣ
配列番号５２
ＵＲＥ／ＣＳＥ
Figure 2022523794000053
配列番号５３
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ
Figure 2022523794000054
配列番号５４
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ／ＣＳＥ
Figure 2022523794000055
配列番号５５
実施例５４に使用される相補的プライマー
ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ
配列番号５６
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ
Figure 2022523794000056
配列番号５７
Ｇｌｕｃ
Figure 2022523794000057
配列番号５８
終止突然変異を有するＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
Figure 2022523794000058
配列番号５９
スペーサー１
Figure 2022523794000059
 スペーサー２
Figure 2022523794000060
配列番号６０
Figure 2022523794000061
実施例５に使用されるガウシアルシフェラーゼＤＮＡ鋳型
Figure 2022523794000062
実施例５に使用されるＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
Figure 2022523794000063
実施例４に使用されるガウシアルシフェラーゼＯＲＦ
Figure 2022523794000064
実施例４に使用されるＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
Figure 2022523794000065

Claims (40)

  1. 医薬組成物を作製する方法であって、
    ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；
    ｂ）前記線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を得る工程と；
    ｃ）前記製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、前記製剤を処理する工程と；
    ｄ）任意選択的に、前記処理工程後に残っている前記製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
    ｅ）前記製剤をさらに処理して、医薬用途のための前記医薬組成物を生成する工程と
    を含む方法。
  2. 工程ｄ）のさらなる処理は、
    ｆ）デオキシリボヌクレオチド分子を実質的に除去するように、前記製剤を処理する工程と；
    ｇ）前記製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
    ｈ）医薬品賦形剤により前記製剤を製剤化する工程と；
    ｉ）前記製剤を濃縮する工程と；
    ｊ）前記製剤中のデオキシリボヌクレオチド分子の量を、印刷又はデジタルメディアに記録する工程と
    のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 工程ｄ）のさらなる処理は、
    ｆ）タンパク質汚染を実質的に除去するように、前記製剤を処理する工程と；
    ｇ）前記製剤中のタンパク質汚染の量を評価する工程と；
    ｈ）医薬品賦形剤により前記製剤を製剤化する工程と；
    ｉ）前記製剤を濃縮する工程と
    のうちの１つ以上を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 工程ｄ）のさらなる処理は、
    ｆ）エンドトキシンを実質的に除去するように、前記製剤を処理する工程と；
    ｇ）前記製剤中のエンドトキシンの量を評価する工程と；
    ｈ）医薬品賦形剤により前記製剤を製剤化する工程と；
    ｉ）前記製剤を濃縮する工程と
    のうちの１つ以上を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記環状化工程は、スプリントライゲーションによって行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記線状ポリリボヌクレオチド分子は、前記環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子同等物、前記環状ポリリボヌクレオチド分子の線状ポリリボヌクレオチド分子非同等物、又はそれらの組合せを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記タンパク質汚染は、酵素を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記医薬組成物は、前記製剤中の全リボヌクレオチド分子の２０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記医薬組成物は、前記製剤中の全リボヌクレオチド分子の１０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 環状ポリリボヌクレオチド分子、及び医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
  11. 前記医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の２％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含む、請求項１０に記載の医薬製剤。
  12. 前記医薬製剤は、
    （ｉ）リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まず；及び／又は
    （ｉｉ）滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含み；及び／又は
    （ｉｉｉ）滅菌医薬製剤であり、例えば、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援し；及び／又は
    （ｉｖ）ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たし；及び／又は
    （ｖ）ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たし；及び／又は
    （ｖｉ）最終的な薬剤製品の中間の医薬製剤であり；及び／又は
    （ｖｉｉ）対象への投与のための最終的な薬剤製品であり；及び／又は
    （ｖｉｉｉ）少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬの前記環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含み；及び／又は
    （ｉｘ）約９％（ｗ／ｗ）、８％（ｗ／ｗ）、７％（ｗ／ｗ）、６％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、４％（ｗ／ｗ）、３％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、若しくは０．５％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子を含み；及び／又は
    （ｘ）細胞タンパク質、細胞デオキシリボ核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、若しくはクロマトグラフィー材料から選択されるプロセス関連不純物を実質的に含まず；及び／又は
    （ｘｉ）精製前と比較して、精製後に、免疫又は炎症反応の減少したレベルの１つ以上のマーカーを有し、例えば、免疫又は炎症反応の前記１つ以上のマーカーは、（ａ）サイトカイン若しくは免疫原性関連遺伝子；及び／又は（ｂ）ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ、ＩＦＮ－β、ＯＡＳ、及びＯＡＳＬからなる群から選択される遺伝子の発現である、請求項１０又は請求項１１に記載の医薬製剤。
  13. 前記環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  14. 前記医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも８０％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  15. 前記医薬製剤は、前記製剤中の全リボヌクレオチド分子の２０％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  16. 医薬品原薬を作製する方法であって、
    ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；
    ｂ）前記複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
    ｃ）前記製剤中に残っている線状ポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
    ｄ）前記製剤が、前記製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の前記製剤を医薬品原薬として処理する工程と
    を含む方法。
  17. 医薬品製品を作製する方法であって、
    ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；
    ｂ）前記複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
    ｃ）前記製剤中の線状ポリリボヌクレオチド分子の量を測定する工程と；
    ｄ）前記製剤が、前記製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の前記製剤を医薬品製品として製剤化する工程と；
    ｅ）それが、前記医薬品製品中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、前記医薬品製品にラベルを付け、出荷する工程と
    を含む方法。
  18. 前記環状化工程は、スプリントライゲーションによって行われる、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
  19. 環状ポリリボヌクレオチド分子の前記製剤を製剤化する工程は、環状ポリリボヌクレオチド分子の前記製剤を、医薬品賦形剤と組み合わせることを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記製剤中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量についての前記参照基準は、
    （ｉ）医薬品放出規格；又は
    （ｉｉ）１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、若しくは２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子の存在；又は
    （ｉｉｉ）顕微鏡法、分光測色法、蛍光分析法、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光測色法、ＲＮＡ電気泳動、又はＲＮＡｓｅ Ｈ分析によって測定した際に、特定の量以下（例えば、測定した際に検出不能なレベル又は検出限界未満のレベル）の線状ポリリボヌクレオチド分子の存在
    であり；
    及び任意選択的に、前記医薬製剤は、前記環状ポリリボヌクレオチド分子の配列、例えば、参照環状ポリリボヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％）の配列同一性を有する配列について参照基準をさらに満たす、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記医薬品製品又は医薬品原薬は、
    （ｉ）少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、若しくは５００ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度；又は
    （ｉｉ）前記医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、若しくは９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子
    を含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子は、顕微鏡法、分光測色法、蛍光分析法、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動イメージング、ＵＶ－Ｖｉｓ分光測色法、ＲＮＡ電気泳動、ＲＮＡｓｅ Ｈ分析、ＵＶ分光学的若しくは蛍光検出器、光散乱技術、ＨＰＬＣを含む分離の方法の使用を用いるか若しくは用いない表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、分離前若しくは分離後の誘導体化方法を用いた若しくは用いないチップ若しくはゲルベースの電気泳動、線状ポリリボヌクレオチド分子の検出のために銀若しくは色素染色若しくは放射性崩壊を使用する検出方法の使用、又は顕微鏡法、視覚法若しくは分光光度計を用いる方法によって測定される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記医薬品製品又は医薬品原薬は、
    （ｉ）リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まず；及び／又は
    （ｉｉ）滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含み；及び／又は
    （ｉｉｉ）滅菌薬剤製品又は滅菌原薬であり、任意選択的に、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援し；及び／又は
    （ｉｖ）ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たし；及び／又は
    （ｖ）ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たし；及び／又は
    （ｖｉ）分光光度計によって測定した際に約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記環状ポリリボヌクレオチド分子は、少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記製剤は、
    （ｉ）前記製剤中に存在するデオキシリボヌクレオチド分子の量について、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、又は１００，０００μｇ／ｍＬ以下のデオキシリボヌクレオチド分子の存在であり；及び／又は
    （ｉｉ）前記製剤中に存在するタンパク質汚染の量について、例えば、前記環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、若しくは５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質汚染の存在である、参照基準をさらに満たす、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）又は９９％（ｗ／ｗ）は、環状ポリリボヌクレオチド分子である、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
  27. 医薬製剤中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）又は５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む、環状ポリリボヌクレオチド分子の医薬製剤。
  28. 前記医薬製剤は、
    （ｉ）リムルス変形細胞溶解物試験によって測定した際に、１０ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンを含むか、又はエンドトキシンを含まず；及び／又は
    （ｉｉ）滅菌前に、１００ＣＦＵ／１００ｍｌ未満又は１０ＣＦＵ／１００ｍｌ未満のバイオバーデンを含み；及び／又は
    （ｉｉｉ）滅菌医薬製剤であり、例えば、無菌状態で試験した際に、１００未満の生存微生物の増殖を支援し；及び／又は
    （ｉｖ）ＵＳＰ＜７１＞の標準を満たし；及び／又は
    （ｖ）ＵＳＰ＜８５＞の標準を満たし；及び／又は
    （ｖｉ）最終的な薬剤製品の中間の医薬製剤であり；及び／又は
    （ｖｉｉ）対象への投与のための最終的な薬剤製品であり；及び／又は
    （ｖｉｉｉ）少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、若しくは５００ｍｇ／ｍＬの環状ポリリボヌクレオチド分子の濃度を含み；及び／又は
    （ｉｘ）１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ、若しくは１００，０００μｇ／ｍＬ以下のデオキシリボヌクレオチド分子を含み；及び／又は
    （ｘ）前記環状ポリリボヌクレオチド分子のミリグラム（ｍｇ）当たり、０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、若しくは５００ｎｇ未満のタンパク質汚染のタンパク質汚染（例えば酵素）を含み；及び／又は
    （ｘｉ）分光光度計によって測定した際に約１．６～２．３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を含み；
    （ｘｉｉ）細胞タンパク質、細胞デオキシリボ核酸、酵素、試薬成分、ゲル成分、又はクロマトグラフィー材料から選択されるプロセス関連不純物を実質的に含まず；及び／又は
    （ｘｉｉｉ）精製前と比較して、精製後に、免疫又は炎症反応の減少したレベルの１つ以上のマーカーを有する、請求項２６又は請求項２７に記載の医薬製剤。
  29. 前記環状ポリリボヌクレオチド分子は、
    （ｉ）疑似らせん構造を含み；及び／又は
    （ｉｉ）疑似二本鎖二次構造を含み；及び／又は
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの発現配列の３’末端に、１つ以上の発現配列及びスタガー要素を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  30. 環状ポリリボヌクレオチドを、対象又は対象の細胞若しくは組織に送達する方法であって、請求項１０～１５及び２６～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１６及び１８～２５のいずれか一項に記載の医薬品原薬、又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載の医薬品製品を、前記対象の細胞又は組織に投与する工程を含み、ここで、前記環状ポリリボヌクレオチド又は前記環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物は、前記投与工程後、少なくとも３日間にわたって、前記細胞、組織、又は対象において検出される、方法。
  31. （ｉ）前記投与工程前に、前記細胞、組織又は対象中の前記環状ポリリボヌクレオチド又は前記環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在を評価する工程；及び／又は
    （ｉｉ）前記投与工程後に、前記細胞、組織又は対象中の前記環状ポリリボヌクレオチド又は前記環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在を評価する工程
    をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. （ｉ）請求項１０～１５及び２６～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１６及び１８～２５のいずれか一項に記載の医薬品原薬、又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載の医薬品製品、及び（ｉｉ）非経口で許容される希釈剤を含む非経口核酸送達系。
  33. 環状ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１０～１５及び２６～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１６及び１８～２５のいずれか一項に記載の医薬品原薬、又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載の医薬品製品を、それを必要とする対象に非経口的に投与する工程を含む方法。
  34. 環状ポリリボヌクレオチドを、対象の細胞又は組織に送達する方法であって、前記細胞又は組織に、請求項１０～１５及び２６～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１６及び１８～２５のいずれか一項に記載の医薬品原薬、又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載の医薬品製品を非経口的に投与する工程を含む方法。
  35. 請求項１０～１５及び２６～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１６及び１８～２５のいずれか一項に記載の医薬品原薬、又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載の医薬品製品は、担体を含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 請求項１０～１５及び２６～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１６及び１８～２５のいずれか一項に記載の医薬品原薬、又は請求項１７～２５のいずれか一項に記載の医薬品製品は、希釈剤を含み、任意の担体を含まない、請求項３２に記載の非経口核酸送達系、又は請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に又は局所的に行われる、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 医薬品原薬を作製する方法であって、
    ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；
    ｂ）前記複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
    ｃ）前記製剤中に残っている線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量を評価する工程と；
    ｄ）前記製剤が、前記製剤中に存在する線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の前記製剤を医薬品原薬として処理する工程と
    を含む方法。
  39. 医薬品製品を作製する方法であって、
    ａ）複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を提供する工程と；
    ｂ）前記複数の線状ポリリボヌクレオチド分子を環状化して、環状ポリリボヌクレオチド分子の製剤を提供する工程と；
    ｃ）前記製剤中の線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量を測定する工程と；
    ｄ）前記製剤が、前記製剤中に存在する線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、環状ポリリボヌクレオチド分子の前記製剤を医薬品製品として製剤化する工程と；
    ｅ）それが、前記医薬品製品中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量について、参照基準を満たす場合、前記医薬品製品にラベルを付け、出荷する工程と
    を含む方法。
  40. 前記製剤中に存在する線状及び／又はニックポリリボヌクレオチド分子の量についての前記参照基準は、
    （ａ）前記製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、若しくは０．５％（ｗ／ｗ）以下の線状ポリリボヌクレオチド分子；
    （ｂ）前記製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、若しくは０．１％（ｗ／ｗ）以下のニックポリリボヌクレオチド分子；又は
    （ｃ）前記製剤中の全リボヌクレオチド分子に対して、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、若しくは０．５％（ｗ／ｗ）以下の組み合わされた線状及びニックポリリボヌクレオチド分子
    から選択される、請求項３８又は３９に記載の方法。
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