CN117120605A - 用于产生环状多核糖核苷酸的组合物和方法 - Google Patents

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CN117120605A CN202280019420.7A CN202280019420A CN117120605A CN 117120605 A CN117120605 A CN 117120605A CN 202280019420 A CN202280019420 A CN 202280019420A CN 117120605 A CN117120605 A CN 117120605A
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斯维塔·斯里尼瓦萨·穆拉利
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德里克·托马斯·罗森赫伯
米奇卡·加布里埃尔·夏普
安德鲁·麦金利·舒梅克
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Abstract

本披露总体上涉及用于产生、纯化、和使用环状RNA的组合物和方法。

Description

用于产生环状多核糖核苷酸的组合物和方法
优先权申请的引用
根据专利合作条约提交的本国际专利申请要求于2021年3月26日提交的美国临时专利申请序列号63/166,467的权益。
序列表的并入
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过引用以其全文并入。所述ASCII副本创建于2022年3月16日，名为VL70002WO1_ST25，并且大小为192,364字节。通过引用以其全文并入本文的还有在美国临时专利申请序列号63/166,467中提交的序列表，该序列表创建于2021年3月25日，名为51484-003001_Sequence_Listing_3.25.21_ST25，并且大小为166,651字节。
背景技术
环状多核糖核苷酸是多核糖核苷酸的一个亚类，以连续环的形式存在。内源性环状多核糖核苷酸在人体组织和细胞中普遍表达。大多数内源性环状多核糖核苷酸是通过反向剪接(backsplicing)产生的，并且主要发挥非编码作用。已提出将合成的环状多核糖核苷酸(包括编码蛋白质的环状多核糖核苷酸)用于各种治疗性应用和工程应用。需要产生、纯化、和使用环状多核糖核苷酸的方法。
发明内容
本披露提供了用于产生、纯化、和使用环状RNA的组合物和方法。
在第一方面，本披露的特征在于一种多核糖核苷酸，例如线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包括以5'至3'方向可操作地连接的以下项：(A)5'自切割核酶；(B)5'退火区；(C)多核糖核苷酸负载物(cargo)；(D)3'退火区；以及(E)3'自切割核酶。该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件(A)、(B)、(C)、(D)和(E)中的任一者之外或之间的另外的元件。例如，如本文所述，元件(A)、(B)、(C)、(D)和/或(E)中的任一者可以由间隔子序列隔开。
在另一方面，本披露提供了一种多核糖核苷酸，例如具有式5'-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-3'的线性多核糖核苷酸，其中：(A)包括5'自切割核酶；(B)包括5'退火区；(C)包括多核糖核苷酸负载物；(D)包括3'退火区；以及(E)包括3'自切割核酶。
在一些实施例中，该5'自切割核酶能够在位于该5'自切割核酶的3'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该5'自切割核酶的3'端的位点处进行自切割。
在一些实施例中，该5'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状(Hammerhead)核酶、发夹状(Hairpin)核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转(Twister)核酶、扭转姐妹(Twister sister)核酶、斧头(Hatchet)核酶和手枪(Pistol)核酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶是锤头状核酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括与SEQ ID NO:24-571中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列或其有催化能力的片段。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括SEQ ID NO:24-571中的任一者的核酸序列或其有催化能力的片段。
在一些实施例中，该3'自切割核酶能够在位于该3'自切割核酶的5'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该3'自切割核酶的5'端的位点处进行自切割。
在一些实施例中，该3'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。在一些实施例中，该3'自切割核酶是丁型肝炎病毒(HDV)核酶。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括SEQ ID NO:7的核酸序列。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括与SEQ ID NO:24-571中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列或其有催化能力的片段。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括SEQ ID NO:24-571中的任一者的核酸序列或其有催化能力的片段。
在一些实施例中，该5'自切割核酶和该3'自切割核酶产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割产生游离的5'-羟基基团，并且3'自切割核酶的切割产生游离的2',3'-环磷酸基团。
在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的序列同一性。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶来自相同的自切割核酶家族。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享100％的序列同一性。
在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享低于100％、99％、95％、90％、85％、或80％的序列同一性。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶并非来自相同的自切割核酶家族。
在一些实施例中，该5'退火区具有5至100个核糖核苷酸(例如，5至80、5至50、5至30、5至20、10至100、10至80、10至50、或10至30个核糖核苷酸)。在一些实施例中，该3'退火区具有5至100个核糖核苷酸(例如，5至80、5至50、5至30、5至20、10至100、10至80、10至50、或10至30个核糖核苷酸)。
在一些实施例中，该5'退火区和该3'退火区各自包括互补区(例如，形成一对互补区)。在一些实施例中，该5'退火区包括具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的5'互补区；并且该3'退火区包括具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的3'互补区。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有在50％与100％之间的序列互补性(例如，在60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％之间、或100％的序列互补性)。
在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol(例如，低于-10kcal/mol、低于-20kcal/mol、或低于-30kcal/mol)的结合自由能。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少30℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、或至少90℃的结合Tm。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区包括不多于10个错配，例如10、9、8、7、6、5、4、3、或2个错配，或1个错配。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区不包括任何错配。
在一些实施例中，该5'退火区和该3'退火区各自包括非互补区。在一些实施例中，该5'退火区进一步包括具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的5'非互补区。在一些实施例中，该3'退火区进一步包括具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的3'非互补区。在一些实施例中，该5'非互补区位于该5'互补区的5'(例如，在该5'自切割核酶与该5'互补区之间)。在一些实施例中，该3'非互补区位于该3'互补区的3'(例如，在该3'互补区与该3'自切割核酶之间)。在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性(例如，在0％-40％、0％-30％、0％-20％、0％-10％之间、或0％的序列互补性)。在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有低于10℃的结合Tm。在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个错配。在一些实施例中，该5'退火区和该3'退火区不包括任何非互补区。
在一些实施例中，该5'退火区包括与SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该5'退火区包括SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些实施例中，该3'退火区包括与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该3'退火区包括SEQ ID NO:4的核酸序列。
在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括编码多肽的表达序列。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括与编码多肽的表达序列可操作地连接的IRES。在一些实施例中，该多肽是生物活性多肽。在一些实施例中，该多肽是例如用于人或非人动物的治疗性多肽。在一些实施例中，该多肽是具有在脊椎动物(例如，非人哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物、或鱼)、无脊椎动物(例如，昆虫、蛛形纲(arachnid)、线虫(nematode)、或软体动物)、植物(例如，单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、真核藻类)、或微生物(例如，细菌、真菌、古细菌、卵菌)的基因组中编码的序列的多肽。在一些实施例中，当与脊椎动物、无脊椎动物、或植物接触时，或当与脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞接触时，该多肽具有生物学作用。在一些实施例中，该多肽是植物修饰多肽。在一些实施例中，当与以下各者接触时，该多肽提高脊椎动物、无脊椎动物、或植物的适应度，或提高脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞的适应度。在一些实施例中，当与以下各者接触时，该多肽降低脊椎动物、无脊椎动物、或植物的适应度，或降低脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞的适应度。
在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸进一步包括在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸进一步包括在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为在5与1000个之间的多核糖核苷酸的间隔子区。在一些实施例中，间隔子区包括聚A序列。在一些实施例中，间隔子区包括聚A-C序列。
在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是至少1kb。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是1kb至20kb。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是100至约20,000个核苷酸。在一些实施例中，该线性RNA的大小是至少100、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000个核苷酸。
在另一方面，本披露提供了一种脱氧核糖核酸，该脱氧核糖核酸包括与编码本文所述的线性多核糖核苷酸的序列可操作地连接的RNA聚合酶启动子。在一些实施例中，该RNA聚合酶启动子与编码该线性多核糖核苷酸的序列是异源的。在一些实施例中，该RNA聚合酶启动子是T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、或SP6启动子。
在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸从线性多核糖核苷酸或从本文所述的脱氧核糖核酸产生。
在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是至少1kb。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是1kb至20kb。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是100至约20,000个核苷酸。在一些实施例中，该环状RNA的大小是至少100、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000个核苷酸。
在另一方面，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供线性多核糖核苷酸(例如，本文所述的前体线性多核糖核苷酸)，其中该线性多核糖核苷酸处于适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶的条件下的溶液中(例如，处于在无细胞系统中的溶液中)，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触；从而产生环状多核糖核苷酸。
在另一方面，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸(例如，本文所述的前体线性多核糖核苷酸)的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸(例如，体外转录)以产生线性多核糖核苷酸；其中该转录在适合于切割该5'自切割核酶和3'自切割核酶的条件下发生，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；任选地纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触，从而产生环状多核糖核苷酸。
在另一方面，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸(例如，本文所述的前体线性多核糖核苷酸)的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸(例如，体外转录)以产生线性多核糖核苷酸；其中该转录在适合于切割该5'自切割核酶和3'自切割核酶的条件下发生，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及其中该转录在包括连接酶的溶液中并在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下发生，从而产生环状多核糖核苷酸。
在另一方面，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸(例如，体外转录)以产生线性多核糖核苷酸，其中该转录在包含连接酶的溶液中并在适合于连接该线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下发生，从而产生环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含5'自切割核酶和3'自切割核酶。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含5'断裂内含子和3'断裂内含子(例如，用于产生环状多核糖核苷酸的自剪接构建体)。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含5'退火区和3'退火区。
在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸从脱氧核糖核酸(例如，本文所述的脱氧核糖核酸，如DNA载体、线性化DNA载体、或cDNA)产生。在一些实施例中，该脱氧核糖核酸包括与编码该线性多核糖核苷酸的序列可操作地连接的RNA聚合酶启动子。在实施例中，该RNA聚合酶启动子与编码该线性多核糖核苷酸的序列是异源的。在一些实施例中，该RNA聚合酶启动子是T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、或SP6启动子。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸通过在无细胞系统中转录(例如，体外转录)从该脱氧核糖核酸进行转录。
在一些实施例中，该连接酶相容的线性多核糖核苷酸是基本上富集的或纯的，例如，在使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触之前将其纯化。在一些实施例中，该连接酶相容的线性多核糖核苷酸通过酶纯化法或通过色谱法进行纯化。
在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸的转录在包括连接酶的溶液中进行。
在一些实施例中，该连接酶是RNA连接酶。在一些实施例中，该RNA连接酶是tRNA连接酶。在一些实施例中，该tRNA连接酶是T4连接酶、RtcB连接酶、TRL-1连接酶、和Rnl1连接酶、Rnl2连接酶、LIG1连接酶、LIG2连接酶、PNK/PNL连接酶、PF0027连接酶、thpR ligT连接酶、ytlPor连接酶、或其变体(例如，保留连接酶功能的突变性变体)。在一些实施例中，该tRNA连接酶是T4连接酶或RtcB连接酶。
在一些实施例中，该RNA连接酶是植物RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是叶绿体RNA连接酶或其变体。在实施例中，该RNA连接酶是真核藻类RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是来自古细菌的RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是细菌RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是真核RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是病毒RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是线粒体RNA连接酶或其变体。
在一些实施例中，该RNA连接酶是在表2中描述的连接酶或其变体。
在另一方面，本披露提供了一种将多核糖核苷酸负载物递送至细胞的方法，该方法包括使该细胞与本文所述的环状多核糖核苷酸接触。
在另一方面，本披露提供了一种在细胞中表达多肽的方法，该方法包括使细胞与本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，通过本文所述的方法产生的环状多核糖核苷酸)接触。在一些实施例中，该细胞是分离的细胞。在一些实施例中，将该细胞用本文所述的环状多核糖核苷酸转染。在一些实施例中，该细胞在受试者中并且向该受试者施用本文所述的环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，如本文所述制备的环状多核糖核苷酸在疗法和/或农业中用作效应子。例如，可以向受试者施用通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用、或农业组合物中)。在一些实施例中，该受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、或两栖动物)。在一些实施例中，该受试者是人。在一些实施例中，该受试者是非人哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物、有蹄类动物、肉食动物、啮齿动物、或兔类动物。在一些实施例中，该受试者是鸟、爬行动物、或两栖动物。在一些实施例中，该受试者是无脊椎动物。在一些实施例中，该受试者是植物或真核藻类。在一些实施例中，该受试者是植物，如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如，针叶树、苏铁、买麻藤类植物(gnetophyte)、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类、或苔藓植物。在实施例中，该受试者是具有农业或园艺重要性的植物，如行间作物、水果、蔬菜、树木、或观赏植物。在一些实施例中，可以将通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸递送至细胞。
定义
为了有助于对本披露的理解，下面定义了多个术语。本文定义的术语具有如与本披露相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一个/种(a、an)”和“该”并不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例来说明的一般类别。本文的术语用于描述特定的实施例，但它们的使用不应被视为限制，除非在权利要求中列出。
本文使用的术语“和/或”将被视为对在具有或不具有另一指定特征或组分的情况下多个指定特征或组分中的每一个的特定披露。因此，如在如本文中“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样地，在如“A、B、和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
如本文使用的，在值的范围内提供的任何值都包括上限和下限、以及该上限和下限内含有的任何值。
如本文使用的，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”或“环状多核糖核苷酸分子”或“环化RNA”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离的3'和/或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸分子。
如本文使用的，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状(线性)起始材料的测量。
词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”作为优选的实施例额外地披露了这种化合物、组合物、产物等用于治疗、调节等。
词语“用于……的化合物、组合物、产品等”或“化合物、组合物、产品等在制造用于……的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等中的用途”指示此类化合物、组合物、产品等将用于可在人体或动物体上实施的治疗性方法中。它们被认为是涉及治疗的方法等的实施例和权利要求的等同披露。如果实施例或权利要求因此是指“用于治疗疑似患有疾病的人或动物的化合物”，则这也被认为是披露“化合物在制造用于治疗疑似患有疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有疾病的人或动物施用化合物进行治疗的方法”。
如本文使用的，术语“疾病”、“障碍”和“病症”各自指亚健康状态，例如，典型地被或将会被医疗专业人员诊断或治疗的状态。
“异源”意指发生在与天然存在的(天然的)背景不同的背景中。“异源”多核苷酸序列指示多核苷酸序列以在该序列的天然基因组中发现的方式不同的方式使用。例如，“异源启动子”用于驱动序列的转录，该序列不是由该启动子天然转录的序列；因此，“异源启动子”序列通常通过重组核酸技术包括在表达构建体中。术语“异源”也用于指被置于与另一序列的非天然存在的关系中的给定序列；例如，异源编码或非编码核苷酸序列通常通过基因组转化技术被插入基因组中，产生经基因修饰的基因组或重组基因组。
如本文使用的，“提高受试者的适应度”或“促进受试者的适应度”是指由于施用本文所述的肽或多肽而产生的生理学的或受试生物体进行的任何活动的任何有利的改变，包括但不限于以下所希望效果中的任何一种或多种：(1)使对生物或非生物应激的耐受性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使产率或生物量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使开花时间调整约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使对有害生物或病原体的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(4)使对除草剂的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使受试生物体(例如，农业上重要的昆虫)的群体增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的繁殖速率提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的迁移提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的体重增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(9)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的代谢速率或活性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(10)使通过受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)进行的授粉(例如，在给定时间内被授粉的植物数量)提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(11)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)副产物(例如，来自蜜蜂的蜂蜜或来自蚕的蚕丝)的产量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(12)使受试生物体(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白质、脂肪酸、或氨基酸)含量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(13)使受试生物体对杀有害生物剂(例如，新烟碱(例如，吡虫啉)或有机磷杀昆虫剂(例如，硫代磷酸酯，例如，杀螟硫磷))的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(14)使受试生物体(如人或非人动物)的健康提高或使受试生物体(如人或非人动物)的疾病减少。相比于未施用调节剂的受试生物体，可以确定宿主适应度的提高。相反地，“降低受试者的适应度”是指由于施用本文所述的肽或多肽而产生的生理学的或受试生物体进行的任何活动的任何不利的改变，包括但不限于以下预期效果中的任何一种或多种：(1)使对生物或非生物应激的耐受性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使产率或生物量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使开花时间调整约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使对有害生物或病原体的抗性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(4)使对除草剂的抗性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使受试生物体(例如，农业上重要的昆虫)的群体减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的迁移降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的体重减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(9)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的代谢速率或活性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(10)使通过受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)进行的授粉(例如，在给定时间内被授粉的植物数量)降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(11)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)副产物(例如，来自蜜蜂的蜂蜜或来自蚕的蚕丝)的产量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(12)使受试生物体(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白、脂肪酸、或氨基酸)含量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(13)使受试生物体对杀有害生物剂(例如，新烟碱(例如，吡虫啉)或有机磷杀昆虫剂(例如，硫代磷酸酯，例如，杀螟硫磷))的抗性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(14)使受试生物体(如人或非人动物)的健康降低或使受试生物体(如人或非人动物)的疾病减少。相比于未施用调节剂的受试生物体，可以确定宿主适应度的降低。对本领域技术人员而言将显而易见的是，受试者的生理学、表型、或活性的某些变化(例如，植物开花时间的调整)可以被认为提高该受试者的适应度或降低该受试者的适应度，这取决于背景(例如，以适应气候或其他环境条件的变化)。例如，开花时间的延迟(例如，在给定日历日期开花的群体中的植物减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％)可以是对较晚或较凉的春季的有益适应，并因此被认为提高植物的适应度；相反，在春季较早或较暖的背景下，相同的开花时间的延迟可以被认为会降低植物的适应度。
如本文使用的，术语“线性RNA”或“线性多核糖核苷酸”或“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有5'和3'端的多核糖核苷酸分子。5'和3'端中的一者或两者可以是游离端或与另一部分连接。线性RNA包括未经历环化(例如，经预环化)并可用作环化的起始材料的RNA。
如本文使用的，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基、或核苷间键的修饰的核苷酸。
术语“药物组合物”旨在同样披露包括在药物组合物中的环状或线性多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。
如本文使用的，术语“多核苷酸”意指包括一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或RNA可以指包括经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。
如本文使用的，本文的术语“多核糖核苷酸负载物”包括含有至少一个多核糖核苷酸的任何序列。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个表达序列，其中每个表达序列编码多肽。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个非编码序列，如具有调节或催化功能的多核糖核苷酸。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括表达序列和非编码序列的组合。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个本文所述的多核糖核苷酸序列，如一个或多个调节元件、内部核糖体进入位点(IRES)元件、和/或间隔子序列。
如本文使用的，如果将核酸的元件置于载体上，使得它们可以被转录以形成前体RNA、然后可以使用本文提供的方法将该前体RNA环化成环状RNA，则该核酸的元件是“可操作地连接的”。
多脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核酸或DNA意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可检测标签(如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的脱氧核糖核苷多磷酸，如例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。这种亚基可以是A、C、G、T或U，或对一个或多个互补A、C、G、T或U有特异性或与嘌呤(即，A或G或其变体)或嘧啶(即，C、T或U或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。在一些情况下，仅举数例，多核苷酸是短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、质粒DNA(pDNA)、短发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、前体mRNA(pre-mRNA)、反义RNA(asRNA)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子是环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。多核苷酸序列的实施例包括分离和纯化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子和合成的DNA/RNA类似物。
多核苷酸(例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸)的实施例包括含有一种或多种核苷酸变体的多核苷酸，这些核苷酸变体包括一个或多个非标准核苷酸、一个或多个非天然核苷酸、一个或多个核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸部分中包括修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括较大长度的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸链)和具有硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸和β-硫代三磷酸)。在实施例中，核酸分子在碱基部分(例如，在典型地可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在典型地不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。在实施例中，核酸分子含有胺修饰的基团，如氨基烯丙基1-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许共价附接胺反应性部分，如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。本披露的寡核苷酸中的标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供更高的位/立方mm密度，更高的安全性(抵抗天然毒素的意外或有目的的合成)，光编程聚合酶的更容易区分，或更低的二级结构。在Betz K,Malyshev DA,Lavergne T,Welte W,Diederichs K,Dwyer TJ,Ordoukhanian P,RomesbergFE,Marx A.Nat.Chem.Biol.[自然-化学生物学]2012年7月；8(7):612-4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过引用并入本文中。
如本文使用的，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文使用的，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成的多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽(如抗体或胰岛素)，并且可以是缔合的或连接的。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。
如本文使用的，“前体线性多核糖核苷酸”或“前体线性RNA”是指通过在无细胞系统中转录(例如，体外转录)(例如，从本文提供的脱氧核糖核苷酸模板)创建的线性RNA分子。前体线性RNA是一种或多种自切割核酶切割之前的线性RNA。在一种或多种自切割核酶切割后，线性RNA被称为“连接酶相容的线性多核糖核苷酸”或“连接酶相容的RNA”。
如本文使用的，术语“植物修饰多肽”是指能以导致植物适应度提高或降低的方式改变植物的遗传特性(例如，增加基因表达、减少基因表达或以其他方式改变DNA或RNA的核苷酸序列)、表观遗传特性、或生物化学或生理特性的多肽。
如本文使用的，术语“调节元件”是修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，如核酸序列。
如本文使用的，“间隔子”是指提供两个相邻多核苷酸区之间的距离和/或灵活性的任何邻接的(例如，一个或多个核苷酸的)核苷酸序列。
如本文使用的，术语“序列同一性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列在最佳比对时(例如，当通过程序(如GAP或BESTFIT)使用默认参数进行比对时)共享至少某个最小百分比的序列同一性时，这些序列被称为“基本上相同的”或“基本上相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用GAP默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff和Henikoff,1992,PNAS[美国科学院院报]89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分例如使用计算机程序来确定，这些计算机程序如从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA)获得的GCG Wisconsin软件包10.3版或EmbossWin2.10.0版(使用程序“needle”)。替代性地或额外地，通过例如使用如FASTA、BLAST等的算法对数据库进行搜索来确定同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。
如本文使用的，关于RNA，“结构化”是指由RNAFold软件或类似预测工具预测与其自身或相同RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。
如本文使用的，“核酶”是指催化RNA或RNA的催化区。“自切割核酶”是能够催化在核酶序列自身内的核苷酸位点处或在核酶序列自身的末端处发生的切割反应的核酶。
如本文使用的，术语“受试者”是指生物体，如动物、植物、或微生物。在实施例中，该受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、或两栖动物)。在实施例中，该受试者是人。在实施例中，该受试者是非人哺乳动物。在实施例中，该受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物(例如，猴、猿)、有蹄类动物(例如，牛、水牛、野牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如，狗、猫)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠)、或兔类动物(例如，兔)。在实施例中，该受试者是鸟，如以下鸟类分类群的成员：鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(Paleaognathae)(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)、或鹦形目(例如鹦鹉)。在实施例中，该受试者是无脊椎动物，如节肢动物(例如，昆虫、蛛形纲、甲壳动物)、线虫、环节动物、蠕虫、或软体动物。在实施例中，该受试者是无脊椎动物农业有害生物或寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，该受试者是植物，如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如，针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类、或苔藓植物。在实施例中，该受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，该受试者是具有农业或园艺重要性的植物，如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木、以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物、和草坪草)。
如本文使用的，术语“治疗(treat或treating)”是指对受试者的疾病或障碍(例如，感染性疾病、癌症、中毒、或过敏反应)的预防性或治疗性治疗。治疗的效果可以包括如与没有治疗性治疗的情况下该疾病或障碍的状态和/或病症相比，逆转、减轻、降低疾病的严重程度，治愈疾病，抑制疾病的进展，降低该疾病、或该疾病或障碍的一种或多种症状或表现的复发的可能性，稳定(即，不恶化)该疾病或障碍的状态，和/或预防该疾病或障碍的传播。实施例包括治疗植物以控制由无脊椎有害生物或微生物(例如，细菌、真菌、或病毒)病原体引起或与之相关的疾病或不利病症。实施例包括治疗植物以增加植物的先天防御或免疫能力以耐受有害生物或病原体压力。
如本文使用的，术语“终止元件”是终止环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，如核酸序列。
如本文使用的，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白或肽的转录物产生的蛋白或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统(例如，无细胞的翻译系统，像兔网织红细胞裂解物)中。
如本文使用的，术语“翻译起始序列”是在环状或线性多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。
如本文使用的，术语“治疗性多肽”是指当向受试者施用或在受试者中表达时提供一些治疗性益处的多肽。在实施例中，通过向受试者施用治疗性肽或通过在受试者中表达治疗性多肽，将治疗性多肽用于治疗或预防受试者的疾病、障碍、或病症。在替代性的实施例中，使治疗性多肽在细胞中表达，并且向受试者施用该细胞以提供治疗性益处。
如本文使用的，“载体”意指一段DNA，它是合成的(例如，使用PCR)，或取自外来DNA片段可以或已经插入其中用于克隆和/或表达目的的病毒、质粒、或高等生物体的细胞。在一些实施例中，载体可以稳定地维持在生物体中。载体可以包括例如复制的起点、可选择标志物或报告基因，如抗生素抗性或GFP、和/或多克隆位点(MCS)。该术语包括线性DNA片段(例如，PCR产物、线性化质粒片段)、质粒载体、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等。在一个实施例中，本文提供的载体包括多克隆位点(MCS)。在另一实施例中，本文提供的载体不包括MCS。
从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
附图说明
附图旨在说明本披露的一个或多个特征、方面或实施例，而非旨在进行限制。
图1是描绘本披露的示例性DNA构建体的设计的示意图。
图2是描绘转录DNA构建体以产生连接酶相容的线性RNA和后续通过使该连接酶相容的线性RNA与RNA连接酶接触而环化的示意图。
图3是描绘环状RNA的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶位移的图片。泳道1：具有1kb、500nt RNA的梯度。泳道2：IVT产物，线性RNA。泳道3：连接后等分试样，具有高分子量环状RNA。
图4是示出1pmol HCRSV RNA和ZmHSP RNA驱动昆虫细胞提取物(ICE)和小麦胚芽提取物(WGE)中的Nanoluc荧光素酶表达的图。
图5是示出2pmol RNA驱动兔网织红细胞裂解物中的Nanoluc荧光素酶表达的图。
图6是示出环状RNA的变性PAGE凝胶位移的图片。泳道1：具有1kb、500nt RNA的梯度。泳道2：IVT产物，线性RNA。泳道3：连接后等分试样，具有高分子量环状RNA。
图7示出了使用适配体的荧光成像来检测含有Pepper适配体的环化RNA。将凝胶在含有100mM氯化钾的适配体缓冲液中孵育30min，然后用10微摩尔溴化乙锭和10微摩尔HBC525染色。溴化乙锭发出假红色信号，HBC525发出假青色信号。泳道1：具有指示的相对大小的分子量梯度。泳道2：体外转录的RNA构建体。泳道3：与RtcB RNA连接酶接触的体外转录的RNA构建体；泳道3中较高分子量的条带与环化RNA对应。
具体实施方式
总体来说，本披露提供了用于产生、纯化、和使用环状RNA的组合物和方法。
多核苷酸
本披露的特点在于环状多核糖核苷酸组合物和制备环状多核糖核苷酸的方法。
在实施例中，环状多核糖核苷酸从线性多核糖核苷酸(例如，通过连接线性多核糖核苷酸的连接酶相容的末端)产生。在实施例中，线性多核糖核苷酸从脱氧核糖核苷酸模板(例如，载体、线性化载体、或cDNA)转录。因此，本披露的特点在于可用于产生环状多核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸、和环状多核糖核苷酸组合物。
模板脱氧核糖核苷酸
本披露的特点在于用于制备环状RNA的脱氧核糖核苷酸。该脱氧核糖核苷酸包括以5'至3'方向可操作地连接的以下项：(A)5'自切割核酶；(B)5'退火区；(C)多核糖核苷酸负载物；(D)3'退火区；以及(E)3'自切割核酶。在实施例中，该脱氧核糖核苷酸包括例如在元件(A)、(B)、(C)、(D)和(E)中的任一者之外或之间的另外的元件。在实施例中，如本文所述，元件(A)、(B)、(C)、(D)和/或(E)中的任一者通过间隔子序列隔开。图1提供了示例性模板脱氧核糖核苷酸的设计。
在实施例中，该脱氧核糖核苷酸是例如环状DNA载体、线性化DNA载体、或线性DNA(例如，(例如从DNA载体产生的)cDNA)。
在一些实施例中，该脱氧核糖核酸进一步包括与编码本文所述的线性RNA的序列可操作地连接的RNA聚合酶启动子。在实施例中，该RNA聚合酶启动子与编码该线性RNA的序列是异源的。在一些实施例中，该RNA聚合酶启动子是T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP6病毒启动子、或SP3启动子。
在一些实施例中，该脱氧核糖核苷酸包括多克隆位点(MCS)。
在一些实施例中，使用该脱氧核糖核苷酸产生大小范围为约100至约20,000个核苷酸的环状RNA。在一些实施例中，该环状RNA的大小是至少100、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、或5,000个核苷酸。在一些实施例中，该环状RNA的大小不多于20,000、15,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000或4,000个核苷酸。
前体线性多核糖核苷酸
本披露的特点还在于以5'至3'方向可操作地连接的包括以下的线性多核糖核苷酸(例如，前体线性多核糖核苷酸)：(A)5'自切割核酶；(B)5'退火区；(C)多核糖核苷酸负载物；(D)3'退火区；以及(E)3'自切割核酶。该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件(A)、(B)、(C)、(D)和(E)中的任一者之外或之间的另外的元件。例如，如本文所述，元件(A)、(B)、(C)、(D)和/或(E)中的任一者可以由间隔子序列隔开。
在某些实施例中，本文提供了使用本文提供的脱氧核糖核苷酸(例如，载体、线性化载体、或cDNA)作为模板(例如，本文提供的、RNA聚合酶启动子位于编码线性RNA的区的上游的载体、线性化载体、或cDNA)通过在无细胞系统中进行转录(例如，体外转录)来生成前体线性RNA的方法。
图2是描绘用于从前体线性RNA产生环状RNA的示例性过程的示意图。例如，可以转录脱氧核糖核苷酸模板以产生前体线性RNA。在表达时，在合适的条件下，并且不按特定的顺序，5'和3'自切割核酶各自经历切割反应，从而产生连接酶相容的末端(例如，5'-羟基和2',3'-环磷酸)并且5'和3'退火区使游离端靠近。因此，前体线性多核糖核苷酸产生连接酶相容的多核糖核苷酸，其可以被连接(例如，在连接酶存在下)以产生环状多核糖核苷酸。
连接酶相容的线性多核糖核苷酸
本披露的特点还在于以5'至3'方向可操作地连接的包括以下的线性多核糖核苷酸(例如，连接酶相容的线性多核糖核苷酸)：(B)5'退火区；(C)多核糖核苷酸负载物；以及(D)3'退火区。该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件(B)、(C)、和(D)中的任一者之外或之间的另外的元件。例如，如本文所述，任何元件(B)、(C)、和/或(D)可以通过间隔子序列隔开。
在一些实施例中，该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的5’-羟基基团。在一些实施例中，该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的2’,3’-环磷酸。
在一些实施例中，并且在合适的条件下，3'退火区和5'退火区促进游离的3'和5'端的缔合(例如，通过导致热力学有利的缔合的部分或完全互补，例如杂交)。
在一些实施例中，在5'端处的游离的羟基与在3'端处的游离的2',3'-环磷酸的靠近有利于通过连接酶识别进行识别，从而改善环化的效率。
环状多核糖核苷酸
在一些实施例中，本披露提供了环状RNA。
在一些实施例中，该环状RNA包括第一退火区、多核苷酸负载物、和第二退火区。在一些实施例中，该第一退火区与该第二退火区连接，从而形成环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，该环状RNA由本文所述的脱氧核糖核苷酸模板、前体线性RNA、和/或连接酶相容的线性RNA产生(参见例如，图2)。在一些实施例中，该环状RNA通过本文所述的任一方法产生。
在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。
在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，例如，至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少1400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少100个核苷酸。
在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包括一个或多个本文其他处所述的元件。在一些实施例中，这些元件可以通过间隔子序列彼此隔开。在一些实施例中，这些元件可以通过1个核糖核苷酸、2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约80个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、约1000个核苷酸、最多约1kb、至少约1000个核苷酸、或其间任何量的核苷酸彼此隔开。在一些实施例中，一个或多个元件彼此邻接，例如，缺少间隔子元件。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个本文其他处所述的重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个本文其他处所述的修饰。在一个实施例中，环状RNA含有至少一个核苷修饰。在一个实施例中，高达100％的环状RNA的核苷被修饰。在一个实施例中，至少一个核苷修饰是尿苷修饰或腺苷修饰。
作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可以包括某些使其区别于线性RNA的特征。例如，如与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸较不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。环状多核糖核苷酸与线性RNA相比的增加的稳定性使得环状多核糖核苷酸作为产生多肽的细胞转化试剂更加有用，并且与线性RNA相比，存储更容易且时间更长。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，这些方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶(如小牛肠磷酸酶)一起孵育时，环状多核糖核苷酸较不易去磷酸化。
核酶
本文所述的多核苷酸组合物可包括一种或多种自切割核酶，例如本文所述的一种或多种自切割核酶。核酶是催化RNA或RNA的催化区。自切割核酶是能够催化在核酶序列自身内的核苷酸位点处或在核酶序列自身的末端处发生的切割反应的核酶。
示例性自切割核酶是本领域已知的和/或在本文中提供。示例性自切割核酶包括锤头状、发夹状、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。另外的示例性自切割核酶在下文和表1中描述。
在一些实施例中，本披露的多核糖核苷酸包括第一(例如，5')自切割核酶。在一些实施例中，该核酶选自本文所述的任一核酶。在一些实施例中，本披露的多核糖核苷酸包括第二(例如，3')自切割核酶。在一些实施例中，该核酶选自本文所述的任一核酶。
在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的序列同一性。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶来自相同的自切割核酶家族。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享100％的序列同一性。
在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享低于100％、99％、95％、90％、85％、或80％的序列同一性。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶并非来自相同的自切割核酶家族。
在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割产生在对应的线性多核糖核苷酸上的游离的5'-羟基残基。在一些实施例中，该5'自切割核酶能够在位于该5'自切割核酶的3'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该5'自切割核酶的3'端的位点处进行自切割。
在一些实施例中，该3'自切割核酶的切割产生在对应的线性多核糖核苷酸上的游离的3'-羟基残基。在一些实施例中，该3'自切割核酶能够在位于该3'自切割核酶的5'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该3'自切割核酶的5'端的位点处进行自切割。
以下是本披露考虑的示例性自切割核酶。该列表不应被视为限制本披露的范围。
使用RFam鉴定以下自切割核酶家族。RFam是公共数据库，其含有对非编码RNA元件和序列的广泛注释，并且原则上是管理蛋白家族成员的PFam数据库的RNA类似物。RFam数据库的区别性特征在于结合一级序列信息，RNA二级结构是家庭成员的主要预测因子。非编码RNA基于从共同的祖先的进化分为多个家族。这些进化关系通过以下来确定：为推定的RNA家族建立共有的二级结构，然后执行专门版本的多序列比对。
扭转：扭转核酶(例如，扭转P1、P5、P3)被认为是小型自切割核酶家族的成员，该家族包括锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、和glmS核酶。扭转核酶产生2',3'-环磷酸和5'羟基产物。对于扭转P1核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF03160；对于扭转P3核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF03154；并且对于扭转P5核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02684。
扭转姐妹：扭转姐妹核酶(TS)是与扭转核酶家族具有结构相似性的自切割核酶。催化产物是环2',3'磷酸和5'-羟基基团。对于扭转姐妹核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02681。
斧头：斧头核酶是通过生物信息学分析发现的自切割核酶。对于斧头核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02678。
HDV：丁型肝炎病毒(HDV)核酶是丁型肝炎病毒中的自切割核酶。对于HDV核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF00094。
手枪核酶：手枪核酶是自切割核酶。手枪核酶是通过比较基因组分析发现的。通过质谱法发现产物含有5'-羟基和2',3'-环磷酸官能团。对于手枪核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02679。
HHR 1型：锤头状核酶是在RNA分子内的特定位点处催化可逆的切割和连接反应的自切割核酶。对于HHR 1型核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF00163。
HHR 2型：锤头状核酶是在RNA分子内的特定位点处催化可逆的切割和连接反应的自切割核酶。对于HHR 2型核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02276。
HHR 3型：锤头状核酶是在RNA分子内的特定位点处催化可逆的切割和连接反应的自切割核酶。这些RNA结构基序遍布自然界。对于HHR 3型核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF00008。
HH9：锤头状核酶是在RNA分子内的特定位点处催化可逆的切割和连接反应的自切割核酶。对于HH9核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02275。
HH10：锤头状核酶是在RNA分子内的特定位点处催化可逆的切割和连接反应的自切割核酶。对于HH10核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02277。
glmS：氨基葡萄糖-6-磷酸核糖开关核酶(glmS核酶)是驻留在glmS基因的mRNA转录物的5'非翻译区(UTR)中的RNA结构。对于glmS核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF00234。
GIR1：套索加帽(Lariat capping)核酶(以前称为GIR1分支核酶)是与组I核酶具有明显的相似之处的约180nt的核酶。对于GIR1核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF01807。
CPEB3：哺乳动物CPEB3核酶是位于CPEB3基因的第二内含子中的自切割非编码RNA。对于CPEB核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF00622。
drz-Agam 1和drz-Agam 2：drz-Agam-1和drz-Agam 2核酶是通过使用限制性结构描述符发现的，并且与HDV和CPEB3核酶非常相似。对于drz-Agam 1核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF01787，并且对于drz-Agam 2核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF01788。
发夹：发夹状核酶是可以充当核酶的一小部分RNA。与锤头状核酶相似，它见于植物病毒的RNA卫星中。对于发夹状核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF00173。
RAGATH-1：使用生物信息学算法发现的RNA结构基序。这些RNA与已知的核酶(如但不限于锤头状和HDV核酶)含有很强的相似性。对于RAGATH-1核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF03152。
RAGATH-5：使用生物信息学算法发现的RNA结构基序。这些RNA与已知的核酶(如但不限于锤头状和HDV核酶)含有很强的相似性。对于RAGATH-5核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02685。
RAGATH-6：使用生物信息学算法发现的RNA结构基序。这些RNA与已知的核酶(如但不限于锤头状和HDV核酶)含有很强的相似性。对于RAGATH-6核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02686。
RAGATH-13：使用生物信息学算法发现的RNA结构基序。这些RNA与已知的核酶(如但不限于锤头状和HDV核酶)含有很强的相似性。对于RAGATH-13核酶的实例，参见rfam.xfam.org/family/RF02688。
在一些实施例中，自切割核酶是本文所述的核酶(例如来自本文所述的类别)、或表1的核酶、或其催化活性片段或部分。在一些实施例中，核酶包括与SEQ ID NO:24-571中的任一者至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。在一些实施例中，核酶包括SEQ ID NO:24-571中的任一者的序列。在实施例中，自切割核酶是表1中披露的核酶的片段，例如，含有完整核酶序列的至少20个邻接核苷酸(例如，至少20、25、30、35、40、45、50、55、或60个邻接核苷酸)并且具有完整核酶的至少30％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)的催化活性的片段。在一些实施例中，核酶包括SEQ ID NO:24-571中的任一者的催化区(例如，能够自切割的区域)，其中该区域的长度是至少10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、或50个核苷酸，或该区域在10-200个核苷酸、10-100个核苷酸、10-50个核苷酸、10-30个核苷酸、10-200个核苷酸、20-100个核苷酸、20-50个核苷酸、20-30个核苷酸之间。本披露还特别考虑了与表1中提供的每个RNA序列对应的DNA序列。
表1.示例性自切割核酶
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退火区
本文所述的多核苷酸组合物可包括两个或更多个退火区，例如两个或更多个本文所述的退火区。退火区或退火区对是含有具有在合适的条件下促进杂交的高度互补性的部分的那些。
退火区包括至少下文所述的互补区。该互补区的高度互补性促进退火区对的缔合。在第一退火区(例如，5'退火区)位于或接近线性RNA的5'端并且第二退火区(例如，3'退火区)位于或接近线性RNA的3'端的情况下，这些退火区的缔合使5'和3'末端靠近。在一些实施例中，这有利于通过5'和3'端的连接使线性RNA环化。
在实施例中，退火区进一步包括如下文所述的非互补区。可以将非互补区添加至互补区以允许RNA的末端保持灵活性、非结构化、或与互补区相比更少结构化。灵活和/或单链的游离的5'和3'端的可用性支持连接，并因此支持环化效率。
在一些实施例中，每个退火区包括5至100个核糖核苷酸(例如，5至80、5至50、5至30、5至20、10至100、10至80、10至50、或10至30个核糖核苷酸)。在一些实施例中，5'退火区包括5至100个核糖核苷酸(例如，5至80、5至50、5至30、5至20、10至100、10至80、10至50、或10至30个核糖核苷酸)。在一些实施例中，3'退火区包括5至100个核糖核苷酸。
互补区
互补区是在合适的条件下有利于与对应的互补区缔合的区。例如，一对互补区可以共享高度的序列互补性(例如，第一互补区至少部分是第二互补区的反向互补物)。当两个互补区缔合(例如，杂交)时，它们可以形成高度结构化的二级结构，如茎或茎环。
在一些实施例中，该多核糖核苷酸包括5'互补区和3'互补区。在一些实施例中，该5'互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)。在一些实施例中，该3'互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)。
在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有在50％与100％之间的序列互补性(例如，在60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％之间、或100％的序列互补性)。
在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol(例如，低于-10kcal/mol、低于-20kcal/mol、或低于-30kcal/mol)的结合自由能。
在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少30℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、或至少90℃的结合Tm。
在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区包括不多于10个错配，例如10、9、8、7、6、5、4、3、或2个错配，或1个错配(即，当该5'互补区和该3'互补区相互杂交时)。例如，错配可以是5'互补区中的核苷酸和3'互补区中的核苷酸彼此相对(即，当该5'互补区和该3'互补区杂交时)但不形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。例如，错配可以是在5'互补区或3'互补区形成扭结或凸起的未配对的核苷酸。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区不包括任何错配。
非互补区
非互补区是在合适的条件下不利于与对应的非互补区缔合的区。例如，一对非互补区可以共享低度的序列互补性(例如，第一非互补区不是第二非互补区的反向互补物)。当两个非互补区靠近时，它们不形成高度结构化的二级结构，如茎或茎环。
在一些实施例中，该多核糖核苷酸包括5'非互补区和3'非互补区。在一些实施例中，该5'非互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)。在一些实施例中，该3'非互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸(例如，5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)。
在一些实施例中，该5'非互补区位于该5'互补区的5'(例如，在该5'自切割核酶与该5'互补区之间)。在一些实施例中，该3'非互补区位于该3'互补区的3'(例如，在该3'互补区与该3'自切割核酶之间)。
在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性(例如，在0％-40％、0％-30％、0％-20％、0％-10％之间、或0％的序列互补性)。
在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能。
在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有低于10℃的结合Tm。
在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个错配。
多核糖核苷酸负载物
本文所述的多核糖核苷酸负载物包括含有至少一个多核糖核苷酸的任何序列。
例如，多核糖核苷酸负载物可以包括至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸、或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括1-20,000个核苷酸、1-10,000个核苷酸、1-5,000个核苷酸、100-20,000个核苷酸、100-10,000个核苷酸、100-5,000个核苷酸、500-20,000个核苷酸、500-10,000个核苷酸、500-5,000个核苷酸、1,000-20,000个核苷酸、1,000-10,000个核苷酸、或1,000-5,000个核苷酸。
在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括一个或多个编码(或表达)序列，其中每个编码序列编码多肽。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括一个或多个非编码序列。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物完全由一个或多个非编码序列组成。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括编码(或表达)序列和非编码序列的组合。
在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括单个编码序列的多个拷贝(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或甚至多于10个)。例如，该多核糖核苷酸可包括编码单个蛋白质的序列的多个拷贝。在其他实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个)不同的编码序列中每个编码序列的至少一个拷贝(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或甚至多于10个拷贝)。例如，该多核苷酸负载物可以包括第一编码序列的两个拷贝和第二编码序列的三个拷贝。
在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括至少一个非编码序列的一个或多个拷贝。在实施例中，至少一个非编码RNA序列包括至少一个选自由以下组成的组的RNA：RNA适配体、长非编码RNA(lncRNA)、转移RNA衍生的片段(tRF)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、和Piwi相互作用RNA(piRNA)；或这些RNA中的任一者的片段。在实施例中，至少一个非编码RNA序列包括至少一个调节RNA，例如至少一个选自由以下组成的组的RNA：微小RNA(miRNA)或miRNA前体(参见例如，美国专利号8,395,023、8,946,511、8,410,334或10,570,414)、微小RNA识别位点(参见例如，美国专利号8,334,430或10,876,126)、小干扰RNA(siRNA)或siRNA前体(如但不限于形成RNA发夹或RNA茎环或RNA茎的RNA序列)(参见例如，美国专利号8,404,927或10,378,012)、小RNA识别位点(参见例如，美国专利号9,139,838)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或ta-siRNA前体(参见例如，美国专利号8,030,473)、相位sRNA或相位RNA前体(参见例如，美国专利号8,404,928)、相位sRNA识别位点(参见例如，美国专利号9,309,512)、miRNA诱饵(参见例如，美国专利号8,946,511或10,435,686)、miRNA切割阻断剂(参见例如，美国专利号9,040,774)、顺式作用核糖开关、反式作用核糖开关、和核酶；所有这些引用的美国专利都以其全文并入本文。在实施例中，至少一个非编码RNA序列包括与靶序列(例如，由信使RNA编码或由受试者基因组的DNA编码的靶序列)互补或反义的RNA序列；这种RNA序列可用于例如通过沃森-克里克碱基配对识别靶序列并与靶序列结合。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括单个非编码序列的多个拷贝(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或甚至多于10个)。例如，该多核糖核苷酸可以包括编码单个微小RNA前体的序列的多个拷贝或指导RNA序列的多个拷贝。在其他实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10个)不同的非编码序列中每个非编码序列的至少一个拷贝(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或甚至多于10个拷贝)。在一个实例中，该多核苷酸负载物包括第一非编码序列的两个拷贝和第二非编码序列的三个拷贝。在另一实例中，该多核糖核苷酸负载物包括两个或更多个不同miRNA前体中的每个miRNA前体的至少一个拷贝。在另一实例中，该多核糖核苷酸负载物包括(a)与靶序列互补或反义的RNA序列，和(b)核酶或适配体。
在一些实施例中，如本文所述制备的环状多核糖核苷酸在疗法和/或农业中用作效应子。例如，可以向受试者施用通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用、或农业组合物中)。在另一实例中，可以将通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸递送至细胞。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如国际专利公开号WO 2019/118919(通过引用以其全文特此并入本文)中披露的任何特征或特征的任何组合。
多肽表达序列
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个表达序列(即，编码序列)，其中每个表达序列编码多肽。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种表达序列。
每个被编码的多肽可以是直链或支链的。该多肽的长度可以是从约5个至约40,000个氨基酸、约15个至约35,000个氨基酸、约20个至约30,000个氨基酸、约25个至约25,000个氨基酸、约50个至约20,000个氨基酸、约100个至约15,000个氨基酸、约200个至约10,000个氨基酸、约500个至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸、或其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸、或更少的多肽可能是有用的。
本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或非天然存在的多肽。在一些情况下，该多肽可以是参考多肽的功能性片段或变体(例如，酶的酶解活性片段或变体)。例如，该多肽可以是本文所述的任一多肽的功能活性变体，例如在指定区或整个序列上与本文所述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，该多肽可以与目的蛋白具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。
多肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标志物、抗原、治疗性多肽、或用于农业应用的多肽。
治疗性多肽可以是激素、神经递质、生长因子、酶(例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、不依赖ATP的酶、溶酶体酶、去饱和酶)、细胞因子、抗原结合多肽(例如，抗原结合抗体或抗体样片段，如单链抗体、纳米抗体或其他含有Ig重链和/或轻链的多肽)、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、干扰素、白细胞介素、和溶栓剂。
在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达非人蛋白。
用于农业应用的多肽可以是细菌素、溶素、抗微生物多肽、抗真菌多肽、富含结节C的肽、细菌性细胞调节肽、肽毒素、杀有害生物多肽(例如，杀昆虫多肽和/或杀线虫多肽)、抗原结合多肽(例如，抗原结合抗体或抗体样片段，如单链抗体、纳米抗体或其他含有Ig重链和/或轻链的多肽)、酶(例如，核酸酶、淀粉酶、纤维素酶、肽酶、脂肪酶、几丁质酶)、肽信息素、和转录因子。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体，例如抗体片段或其一部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型的，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包括多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成该抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包括一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。
在实施例中，多肽包括多个多肽，例如，一个多肽序列的多个拷贝、或多个不同的多肽序列。在实施例中，多个多肽通过接头氨基酸或间隔氨基酸连接。
在实施例中，多核苷酸负载物包括编码信号肽的序列。已经描述了许多信号肽序列，例如，Tat(双精氨酸易位)信号序列典型地是含有共有SRRxFLK“双精氨酸”基序的N末端肽序列，其用于将含有这种Tat信号肽的折叠蛋白易位跨过脂质双层。还参见例如，可在www[dot]signalpeptide[dot]de上公开获得的信号肽数据库(Signal Peptide Database)。信号肽也可用于将蛋白导向特定的细胞器；参见例如，在Spdb信号肽数据库中披露的实验确定的和计算预测的信号肽，其可在proline[dot]bic[dot]nus[dot]edu[dot]sg/spdb公开获得。
在实施例中，多核苷酸负载物包括编码细胞穿透肽(CPP)的序列。已经描述了数百个CPP序列；参见例如，细胞穿透肽的数据库CPPsite，其可在crdd[dot]osdd[dot]net/raghava/cppsite/上公开获得。常用的CPP序列的实例是可以融合到CGI肽的C末端的聚精氨酸序列，例如八精氨酸或九精氨酸。
在实施例中，多核苷酸负载物包括编码自组装肽的序列；参见例如，Miki等人(2021)Nature Communications[自然通讯],21:3412,DOI:10.1038/s41467-021-23794-6。
治疗性多肽
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码治疗性多肽的表达序列。治疗性多肽是当向受试者施用或在受试者中表达时提供一些治疗性益处的多肽。向受试者施用或在受试者中表达治疗性多肽可用于治疗或预防疾病、障碍、或病症或其症状。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种治疗性多肽。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码治疗性蛋白的表达序列。该蛋白可以治疗有需要的受试者的疾病。在一些实施例中，治疗性蛋白可补偿有需要的受试者中突变的、表达不足的、或缺少的蛋白。在一些实施例中，治疗性蛋白可靶向有需要的受试者中的细胞、组织或病毒，与有需要的受试者中的细胞、组织或病毒相互作用或结合。
治疗性多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。
治疗性多肽可以是激素、神经递质、生长因子、酶(例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、不依赖ATP的酶、溶酶体酶、去饱和酶)、细胞因子、转录因子、抗原结合多肽(例如，抗原结合抗体或抗体样片段，如单链抗体、纳米抗体或其他含有Ig重链和/或轻链的多肽)、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、干扰素、白细胞介素、溶栓剂、抗原(例如，肿瘤、病毒、或细菌抗原)、核酸酶(例如核酸内切酶，如Cas蛋白，例如Cas9)、膜蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)、跨膜受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、抗原受体、离子通道、或膜转运蛋白)、分泌蛋白、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas、TALEN、或锌指)、或基因书写蛋白(参见例如，国际专利申请公开WO/2020/047124，将其通过引用以其全文并入本文)。
在一些实施例中，治疗性多肽是抗体，例如，全长抗体、抗体片段、或其一部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型的，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包括多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成该抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包括一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。当环状多核糖核苷酸在细胞中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。
在一些实施例中，如本文所述制备的环状多核糖核苷酸在疗法和/或农业中用作效应子。例如，可以向受试者施用通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用、或农业组合物中)。在实施例中，该受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、或两栖动物)。在实施例中，该受试者是人。在实施例中，该方法受试者是非人哺乳动物。在实施例中，该受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物(例如，猴、猿)、有蹄类动物(例如，牛、水牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如，狗、猫)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠)、或兔类动物(例如，兔)。在实施例中，该受试者是鸟，如以下鸟类分类群的成员：鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)、或鹦形目(例如鹦鹉)。在实施例中，该受试者是无脊椎动物，如节肢动物(例如，昆虫、蛛形纲、甲壳动物)、线虫、环节动物、蠕虫、或软体动物。在实施例中，该受试者是无脊椎动物农业有害生物或寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，该受试者是植物，如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如，针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类、或苔藓植物。在实施例中，该受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，该受试者是具有农业或园艺重要性的植物，如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木、以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物、和草坪草)。
植物修饰多肽
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码植物修饰多肽的表达序列。植物修饰多肽是指能以导致植物适应度提高或降低的方式改变植物的遗传特性(例如，增加基因表达、减少基因表达或以其他方式改变DNA或RNA的核苷酸序列)、表观遗传特性、或生理或生物化学特性的多肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的植物修饰多肽，或一种或多种植物修饰多肽的多个拷贝。植物修饰多肽可以增加多种植物的适应度，或者可以是靶向一种或多种特定植物(例如，植物的特定物种或属)的植物修饰多肽。
本文可用的多肽的实例可以包括酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas核酸内切酶、TALEN、或锌指)、基因书写蛋白(参见例如，国际专利申请公开WO/2020/047124，将其通过引用以其全文并入本文)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。
农业多肽
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码农业多肽的表达序列。农业多肽是适合于农业用途的多肽。在实施例中，将农业多肽应用于植物或种子(例如，通过叶面喷雾、喷粉、注射、或种子包衣)或应用于植物的环境(例如，通过土壤浸透或颗粒土壤应用)，导致植物的适应度改变。农业多肽的实施例包括改变寄宿于植物或非人动物宿主中或寄宿于其上的一种或多种微生物的水平、活性或代谢的多肽，该改变导致该宿主的适应度提高。在一些实施例中，该农业多肽是植物多肽。在一些实施例中，农业多肽是昆虫多肽。在一些实施例中，当与非人脊椎动物、无脊椎动物、微生物、或植物细胞接触时，农业多肽具有生物学作用。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种农业多肽，或一种或多种农业多肽的多个拷贝。
可用于农业应用的多肽的实施例包括例如细菌素、溶素、抗微生物肽、富含结节C的肽、和细菌性细胞调节肽。此类多肽可用于改变靶微生物的水平、活性或代谢以提高昆虫(如，蜜蜂和蚕)的适应度。农业上有用的多肽的实施例包括肽毒素，如由昆虫病原细菌(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)或嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila))天然产生的那些，如本领域中已知的。农业上有用的多肽的实施例包括用于控制农业上重要的有害生物或病原体的多肽(包括小肽，如环二肽或二酮哌嗪)，例如用于控制植物疾病的抗微生物多肽或抗真菌多肽，或用于控制无脊椎有害生物(如昆虫或线虫)的杀有害生物多肽(例如，杀昆虫多肽和/或杀线虫多肽)。农业上有用的多肽的实施例包括抗体、纳米抗体、及其片段，例如，保留完整抗体或纳米抗体的至少一些(例如，至少10％)特异性结合活性的抗体或纳米抗体片段。农业上有用的多肽的实施例包括转录因子，例如，植物转录因子；参见例如，列出了在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定的转录因子家族的“AtTFDB”数据库，其可在agris-knowledgebase[dot]org/AtTFDB/上公开获得。农业上有用的多肽的实施例包括核酸酶，例如，外切核酸酶或内切核酸酶(例如，Cas核酸酶，如Cas9或Cas12a)。农业上有用的多肽的实施例进一步包括细胞穿透肽、酶(例如，淀粉酶、纤维素酶、肽酶、脂肪酶、几丁质酶)、肽信息素(例如，酵母交配信息素、无脊椎动物繁殖和幼虫信号传导信息素，参见例如Altstein(2004)Peptides[肽],25:1373-1376)。
农业上有用的多肽的实施例赋予有益的农艺性状，例如除草剂耐受性，昆虫控制，改良的产率，增加的真菌或卵菌病抗性，增加的病毒抗性，增加的线虫抗性，增加的细菌疾病抗性、植物生长和发育，改良的淀粉产量，改良的油产量，高油产量，改良的脂肪酸含量，高蛋白产量，果实成熟，增加的动物和人营养、生物聚合物的产量、环境应激抗性、药用肽和可分泌肽，改善的加工性状，改善的消化率(例如，降的低毒素的水平或降低的具有“抗营养”特性的化合物(如木质素、凝集素、和植酸盐)的水平)、酶产量、风味、氮固定、杂交种子产量、纤维产量、和生物燃料产量。农业上有用的多肽的非限制性实例包括赋予以下的多肽：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)，增加的产率(美国专利号RE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；和5,716,837)，昆虫控制(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658，5,880,275；5,763,245；5,763,241；10,017,549；10,233,217；10,487,123；10,494,408；10,494,409；10,611,806；10,612,037；10,669,317；10,827,755；11,254,950；11,267,849；11,130,965；11,136,593；和11,180,774)，真菌疾病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)，病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,730)，线虫抗性(美国专利号6,228,992)，细菌疾病抗性(美国专利号5,516,671)、植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)、淀粉产量(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)，改良的油产量(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,380,462)，高油产量(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)，改良的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)，高蛋白产量(美国专利号6,380,466)，果实成熟(美国专利号5,512,466)、增加的动物和人营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)、生物聚合物(美国专利号RE37,543；6,228,623；以及美国专利号5,958,745和6,946,588)、环境应激抗性(美国专利号6,072,103)、药物肽和可分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)，改善的加工性状(美国专利号6,476,295)，改善的消化率(美国专利号6,531,648)，低棉子糖(美国专利号6,166,292)，工业酶产量(美国专利号5,543,576)，改善的风味(美国专利号6,011,199)、氮固定(美国专利号5,229,114)、杂交种子产量(美国专利号5,689,041)、纤维产量(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834；和5,869,720)和生物燃料产量(美国专利号5,998,700)。
分泌的多肽效应子
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码分泌的多肽效应子的编码序列。可被表达的示例性分泌的多肽效应子或蛋白包括例如细胞因子和细胞因子受体，多肽激素和受体，生长因子，凝血因子，治疗性替代酶和治疗性非酶效应子，再生、修复、和纤维化因子，转化因子，和刺激细胞再生的蛋白质，其非限制性实例在本文中(例如在下表中)描述。
细胞因子和细胞因子受体：
在一些实施例中，本文所述的效应子包含表3的细胞因子或其功能变体或片段，例如，与表3中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能变体与对应的细胞因子受体结合，其Kd比对应的野生型细胞因子在相同条件下对于相同受体的Kd高或低不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，效应子包含融合蛋白，该融合蛋白包含第一区(例如，表3的细胞因子多肽或其功能变体或片段)和第二异源区。在一些实施例中，第一区是表3的第一细胞因子多肽。在一些实施例中，第二区是表3的第二细胞因子多肽，其中该第一和第二细胞因子多肽在野生型细胞中彼此形成细胞因子异二聚体。在一些实施例中，表3的多肽或其功能变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或异源信号序列。
在一些实施例中，本文所述的效应子包含与表3的细胞因子结合的抗体或其片段。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表3.示例性细胞因子和细胞因子受体
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1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上的NCBI数据库上获得，Maglott D等人Gene:a gene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.pii:gku1055。
2序列可在万维网网站“uniprot.org/uniprot/”上的Uniprot数据库上获得；UniProt:the universal protein knowledgebase in 2021.[UniProt：2021年的通用蛋白知识库]Nucleic Acids Res.[核酸研究]49:D1(2021)。
多肽激素和受体
在一些实施例中，本文所述的效应子包含表4的激素或其功能变体，例如，与表4中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能变体与对应的受体结合，其Kd比对应的野生型激素在相同条件下对于相同受体的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表4的多肽或其功能变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或异源信号序列。
在一些实施例中，本文所述的效应子包含与表4的激素结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，本文所述的效应子包含与表4的激素受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表4.示例性多肽激素和受体
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1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上的NCBI数据库上获得，Maglott D等人Gene:a gene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.pii:gku1055。
2序列可在万维网网站“uniprot.org/uniprot/”上的Uniprot数据库上获得；UniProt:the universal protein knowledgebase in 2021.[UniProt：2021年的通用蛋白知识库]Nucleic Acids Res.[核酸研究]49:D1(2021)。
生长因子：
在一些实施例中，本文所述的效应子包含表5的生长因子或其功能变体，例如，与表5中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能变体与对应的受体结合，其Kd比对应的野生型生长因子在相同条件下对于相同受体的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表5的多肽或其功能变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或异源信号序列。
在一些实施例中，本文所述的效应子包含与表5的生长因子结合的抗体或其片段。在一些实施例中，本文所述的效应子包含与表5的生长因子受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表5.示例性生长因子
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1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上的NCBI数据库上获得，MaglottD等人Gene:a gene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.pii:gku1055。
2序列可在万维网网站“uniprot.org/uniprot/”上的Uniprot数据库上获得；UniProt:the universal protein knowledgebase in 2021.[UniProt：2021年的通用蛋白知识库]Nucleic Acids Res.[核酸研究]49:D1(2021)。
凝血因子：
在一些实施例中，本文所述的效应子包含表6的多肽或其功能变体，例如，与表6中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能变体催化与对应的野生型蛋白相同的反应，例如，催化速率比野生型蛋白低或高不少于10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表6的多肽或其功能变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或异源信号序列。
表6.凝血相关的因子
1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上的NCBI数据库上获得，Maglott D等人Gene:a gene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.pii:gku1055。
2序列可在万维网网站“uniprot.org/uniprot/”上的Uniprot数据库上获得；UniProt:the universal protein knowledgebase in 2021.[UniProt：2021年的通用蛋白知识库]Nucleic Acids Res.[核酸研究]49:D1(2021)。
治疗性替代酶：
在一些实施例中，本文所述的效应子包含表7的酶或其功能变体，例如，与表7中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能变体催化与对应的野生型蛋白相同的反应，例如，催化速率比野生型蛋白低不少于或不多于10％、20％、30％、40％或50％。
表7.用于酶缺乏症的示例性酶效应子
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1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上的NCBI数据库上获得，Maglott D等人Gene:a gene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.pii:gku1055。
2序列可在万维网网站“uniprot.org/uniprot/”上的Uniprot数据库上获得；UniProt:the universal protein knowledgebase in 2021.[UniProt：2021年的通用蛋白知识库]Nucleic Acids Res.[核酸研究]49:D1(2021)。
其他非酶效应子：
在一些实施例中，本文所述的治疗性多肽包含表8的多肽或其功能变体，例如，与表8中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的多肽。
表8.示例性非酶效应子和对应的适应症
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1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上的NCBI数据库上获得，Maglott D等人Gene:a gene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.pii:gku1055。
2序列可在万维网网站“uniprot.org/uniprot/”上的Uniprot数据库上获得；UniProt:the universal protein knowledgebase in 2021.[UniProt：2021年的通用蛋白知识库]Nucleic Acids Res.[核酸研究]49:D1(2021)。
再生、修复和纤维化因子
本文所述的治疗性多肽还包括如在表9中披露的生长因子或其功能变体，例如，与表9中通过参考其NCBI蛋白质登录号披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。还包括针对此类生长因子的抗体或其片段、或促进再生和修复的miRNA。
表9
1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上获得(Maglott D等人Gene:agene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.Pii:gku1055。)
2序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/protein/”上获得
转化因子：
本文所述的治疗性多肽还包括转化因子，例如将成纤维细胞转化为分化细胞的蛋白因子，例如在表10中披露的因子或其功能变体，例如，与表10中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。
表10：指示用于通过转化成纤维细胞进行器官修复的多肽
靶标 NCBI基因登录号1 NCBI蛋白登录号2
MESP1 基因ID：55897 EAX02066
ETS2 基因ID：2114 NP_005230
HAND2 基因ID：9464 NP_068808
心肌素 基因ID：93649 NP_001139784
ESRRA 基因ID：2101 AAH92470
miR1 MI0000651 n/a
miR133 MI000450 n/a
TGFb 基因ID：7040 NP_000651.3
WNT 基因ID：7471 NP_005421
JAK 基因ID：3716 NP_001308784
NOTCH 基因ID：4851 XP_011517019
1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上获得(Maglott D等人Gene:agene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.Pii:gku1055。)
2序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/protein/”上获得
刺激细胞再生的蛋白质：
本文所述的治疗性多肽还包括刺激细胞再生的蛋白质，例如在表11中披露的蛋白质或其功能变体，例如，与表11中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的蛋白质。
表11.
靶标 基因登录号1 蛋白登录号2
MST1 NG_016454 NP_066278
STK30 基因ID：26448 NP_036103
MST2 基因ID：6788 NP_006272
SAV1 基因ID：60485 NP_068590
LATS1 基因ID：9113 NP_004681
LATS2 基因ID：26524 NP_055387
YAP1 NG_029530 NP_001123617
CDKN2b NG_023297 NP_004927
CDKN2a NG_007485 NP_478102
1序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/gene”上获得(Maglott D等人Gene:agene-centered information resource at NCBI[基因：在NCBI处以基因为中心的信息资源].Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014.Pii:gku1055。)
2序列可在万维网网站“ncbi.nlm.nih.gov/protein/”上获得
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列(编码序列)，并且被配置用于在受试者体内细胞中持续表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，一个或多个表达序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。表达序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。例如，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的时间段内的表达不会减少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的表达维持在变化不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的水平。
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施例中，IRES与一个或多个表达序列可操作地连接(例如，每个IRES与一个或多个表达序列可操作地连接)。在实施例中，IRES位于异源启动子与编码序列的5'端之间。
包括在环状多核糖核苷酸中的合适的IRES元件包括能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES元件是至少约5nt、至少约8nt、至少约9nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约40nt、至少约50nt、至少约100nt、至少约200nt、至少约250nt、至少约350nt、或至少约500nt。
在一些实施例中，IRES元件衍生自生物体的DNA，该生物体包括但不限于病毒、哺乳动物和果蝇。此类病毒DNA可以衍生自但不限于小核糖核酸病毒互补DNA(cDNA)、脑心肌炎病毒(EMCV)cDNA和脊髓灰质炎病毒cDNA。在一个实施例中，衍生IRES元件的果蝇DNA包括但不限于来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足基因。
在一些实施例中，如果存在，IRES序列是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征(Taurasyndrome)病毒、锥猎蝽(Triatoma)病毒、泰勒氏脑脊髓炎病毒(Theiler'sencephalomyelitis virus)、猿猴病毒40、红火蚁(Solenopsis invicta)病毒1、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)病毒、网状内皮组织增生病毒、福尔曼脊髓灰质炎病毒(fumanpoliovirus)1、普劳提娅失速肠病毒(Plautia stall intestine virus)、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、假桃病毒叶蝉病毒-1(Homalodisca coagulata virus-1)、人类免疫缺陷病毒1型、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人类肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖(Ectropis obliqua)小核糖核酸样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒(Hibiscus chlorotic ringspot virus)、经典猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-l、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、萨里病毒(Salivirus)、科萨病毒(Cosavirus)、副肠孤病毒(Parechovirus)、果蝇无毛、酿酒酵母(S.cerevisiae)TFIID、酿酒酵母YAP1、人c-src、人FGF-l、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁皱缩病毒(Turnip crinkle virus)、eIF4G的适配体、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)B3(CVB3)或柯萨奇病毒A(CVB1/2)。在又另一实施例中，IRES是柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES序列。在另外的实施例中，IRES是脑心肌炎病毒的IRES序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括侧接至少一个(例如，2、3、4、5或更多个)表达序列的至少一个IRES。在一些实施例中，IRES侧接至少一个(例如，2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个IRES序列，导致所得的一种或多种肽和/或一种或多种多肽的隔开。
调节元件
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个调节元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括调节元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。
调节元件可以包括位于与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调节元件可以可操作地连接至相邻的序列。与不存在调节元件时表达的产物的量相比，调节元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调节元件可以增加串联附接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一个调节元件可以增强一个或多个表达序列的表达。多个调节元件是本领域普通技术人员熟知的。
在一些实施例中，调节元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与至少一种表达序列相邻的至少一种翻译调节子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的翻译调节子。在一些实施例中，翻译调节子存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括至少一种包括调节RNA的非编码RNA序列。在一些实施例中，非编码RNA序列反式调节靶序列。在一些实施例中，靶序列包括受试者基因组的基因的核苷酸序列，其中该受试者基因组是脊椎动物、无脊椎动物、真菌、植物、或微生物的基因组。在实施例中，受试者基因组是人、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物、或鱼的基因组。在实施例中，受试者基因组是昆虫、蛛形纲、线虫、或软体动物的基因组。在实施例中，受试者基因组是单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、或真核藻类的基因组。在实施例中，受试者基因组是细菌、真菌、或古细菌的基因组。在实施例中，靶序列包含在多个受试者基因组中(例如，在给定属内的多个物种的基因组中)发现的基因的核苷酸序列。
在一些实施例中，至少一个非编码RNA序列对靶序列的反式调节是靶序列表达的上调。在一些实施例中，至少一个非编码RNA序列对靶序列的反式调节是靶序列表达的下调。在一些实施例中，至少一个非编码RNA序列对靶序列的反式调节是靶序列表达的可诱导表达。例如，可诱导表达可以通过环境条件(例如，光、温度、水、或营养可用性)、通过昼夜节律、通过内源性或外源性提供的诱导剂(例如，小RNA、配体)进行诱导。在一些实施例中，至少一个非编码RNA序列可被原核系统的生理状态(例如，生长期、转录调节状态、和细胞内代谢物浓度)诱导。例如，可以提供外源性提供的配体(例如，阿拉伯糖、鼠李糖、或IPTG)以使用诱导型启动子(例如，PBAD、Prha、和lacUV5)诱导表达。
在一些实施例中，至少一个非编码RNA序列包括选自由以下组成的组的调节RNA：小干扰RNA(siRNA)或其前体、双链RNA(dsRNA)或至少部分双链RNA(例如，包含一个或多个茎环的RNA)；发夹RNA(hpRNA)、微小RNA(miRNA)或其前体(例如pre-miRNA或pri-miRNA)；相位小干扰RNA(phasiRNA)或其前体；异染色质小干扰RNA(hcsiRNA)或其前体；以及天然反义短干扰RNA(natsiRNA)或其前体。在一些实施例中，至少一个非编码RNA序列包括指导RNA(gRNA)或其前体、或可识别且可被指导RNA结合的异源RNA序列。在一些实施例中，调节元件是微小RNA(miRNA)或miRNA结合位点、或siRNA或siRNA结合位点。
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一种农业上有用的非编码RNA序列，当提供给特定的植物组织、细胞、或细胞类型时，该非编码RNA序列赋予所希望的特征，如所希望的与植物形态学、生理学、生长、发育、产量、产品、营养特性、疾病或有害生物抗性、和/或环境或化学耐受性相关的特征。在实施例中，农业上有用的非编码RNA序列引起内源性基因的基因表达的靶向调节，例如经由反义(参见例如美国专利号5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”，包括经由miRNA、siRNA、反式作用siRNA、和相位sRNA介导的机制调节基因表达，例如，如在公开的申请US2006/0200878和US2008/0066206中以及在美国专利申请序列号11/974,469中所述)；或共抑制介导的机制。在实施例中，农业上有用的非编码RNA序列是催化RNA分子(例如，核酶或核糖开关；参见例如，US2006/0200878)，其经工程化以切割所希望的内源性mRNA产物。农业上有用的非编码RNA序列是本领域已知的，例如，调节植物细胞中的基因表达的反义定向RNA披露于美国专利号5,107,065和5,759,829中，以及调节植物中的基因表达的正义定向RNA披露于美国专利号5,283,184和5,231,020中。向植物细胞提供农业上有用的非编码RNA也可用于调节与植物相关的生物体中的基因表达，该生物体例如植物的无脊椎有害生物或感染植物的微生物病原体(例如，细菌、真菌、卵菌、或病毒)、或与植物的无脊椎有害生物相关(例如，共生)的微生物。
翻译起始序列
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列可操作地连接的翻译起始序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码多肽并且可以包括翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克(Kozak)或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区域内。
环状多核糖核苷酸可以包括多于1个起始密码子，如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一起始密码子上起始或可以在第一起始密码子的下游起始。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子的密码子，例如AUG。环状多核糖核苷酸的翻译可以起始于替代的翻译起始序列，如但不限于ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。在一些实施例中，翻译在例如应激诱导条件的选择性条件下在替代的翻译起始序列处开始。作为非限制性实例，环状多核糖核苷酸的翻译可以在替代的翻译起始序列(如ACG)处开始。作为另一非限制性实例，环状多核糖核苷酸翻译可以在替代的翻译起始序列CTG/CUG处开始。作为又另一非限制性实例，环状多核糖核苷酸翻译可以在替代的翻译起始序列GTG/GUG处开始。作为又另一非限制性实例，环状多核糖核苷酸可以在重复相关的非AUG(RAN)序列(如包括短段的重复RNA(例如，CGG、GGGGCC、CAG、CTG)的替代的翻译起始序列)处开始翻译。
终止元件
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列可操作地连接的终止元件。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可以任选地具有终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止元件，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。终止元件的排除可导致滚动圆翻译或表达产物的连续表达。
非编码序列
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个非编码序列，例如，不编码多肽的表达的序列。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个非编码序列。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸不编码多肽表达序列。
非编码序列可以是天然的或合成的序列。在一些实施例中，非编码序列可以改变细胞行为，如例如淋巴细胞行为。在一些实施例中，该非编码序列对于细胞RNA序列是反义的。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含调节核酸，该调节核酸是RNA或RNA样结构，典型地在约5-500个碱基对(bp)之间(取决于特定的RNA结构(例如，miRNA5-30bp，lncRNA 200-500bp))，并且可以具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。在实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码RNA前体的调节核酸，该RNA前体可以被加工成较小的RNA，例如miRNA前体(其可以是从约50至约1000bp)可以被加工成较小的miRNA中间体或成熟的miRNA。
长非编码RNA(lncRNA)定义为长于100个核苷酸的非蛋白编码转录物。许多lncRNA被表征为组织特异性。以与附近的蛋白编码基因相反的方向转录的反向型lncRNA占大比例(例如，占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％)并可能会调节附近基因的转录。在一个实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸包括lncRNA的正义链。在一个实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸包括lncRNA的反义链。
在实施例中，环状多核糖核苷酸编码与内源性基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或与其至少一个片段基本上互补或完全互补的调节核酸。在实施例中，调节核酸与内含子和外显子之间的边界处、在外显子之间的内部、或与外显子相邻的序列互补，从而防止特定基因的新生成的核RNA转录物成熟化为用于转录的mRNA。与特定基因互补的调节核酸可与该基因的mRNA杂交并防止其翻译。反义调节核酸可以是DNA、RNA或其衍生物或杂交体。在一些实施例中，调节核酸包括可以与参与内源性基因或外源性基因的表达调节的蛋白结合的蛋白结合位点。
在实施例中，环状多核糖核苷酸编码至少一个与目的转录物杂交的调节RNA，其中该调节RNA的长度是约5与30个之间的核苷酸，约10与30个之间的核苷酸，或约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或多于30个核苷酸。在实施例中，调节核酸与靶向转录物的序列同一性程度是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
在实施例中，环状多核糖核苷酸编码与靶基因的约5至约25个连续的核苷酸相同的微小RNA(miRNA)分子，或编码该miRNA的前体。在一些实施例中，该miRNA具有允许miRNA识别特定靶mRNA并与其结合的序列。在实施例中，miRNA序列以二核苷酸AA开始，包括含量为约30％-70％(约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％)的GC，并且与除了待引入其中的受试者(例如，哺乳动物)的基因组中的靶标之外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比，例如，如通过标准BLAST检索确定的。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一种miRNA(或miRNA前体)，例如2种、3种、4种、5种、6种或更多种miRNA或miRNA前体。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码miRNA(或其前体)的序列，该miRNA(或其前体)与靶序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸互补性。
siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体。在一些实施例中，siRNA可以充当miRNA，并且反之亦然。像siRNA一样，微小RNA使用RISC来下调靶基因，但与siRNA不同，大多数动物miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或聚A去除和mRNA降解来降低蛋白输出。已知的miRNA结合位点位于mRNA 3'UTR内；miRNA似乎靶向与从miRNA 5'端的第2-8个核苷酸几乎完全互补的位点。该区域称为种子区域。因为成熟siRNA和miRNA是可互换的，所以外源性siRNA下调具有与siRNA的种子互补性的mRNA。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，这些组织如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial Sloan KetteringCancer Center)和欧洲分子生物学实验室(European Molecule Biology Laboratory)等。已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计和产生。此外，存在增加发现有效且特异性的序列基序的机会的计算工具。
植物miRNA、它们的前体、和它们的靶基因是本领域已知的；参见例如，美国专利号8,697,949、8,946,511、和9,040,774，并且还参见可在miRbase[dot]org获得的可公开获得的微小RNA数据库“miRbase”。天然存在的miRNA或miRNA前体序列可以被工程化或对其序列进行修饰，以使所得的成熟miRNA识别所选的靶序列并与其结合；工程化植物和动物miRNA和miRNA前体两者的实例已经得到充分表明；参见例如，美国专利号8,410,334、8,536,405和9,708,620。所有引用的专利以及其中披露的miRNA和miRNA前体序列均通过引用并入本文。
间隔子序列
在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包括一个或多个间隔子序列。间隔子是指提供两个相邻多核苷酸区之间的距离和/或灵活性的任何邻接的(例如，一个或多个核苷酸的)核苷酸序列。间隔子可以存在于本文所述的任一核酸元件之间。间隔子也可存在于本文所述的核酸元件内。
例如，其中核酸包括以下元件中的任何两种或更多种：(A)5'自切割核酶；(B)5'退火区；(C)多核糖核苷酸负载物；(D)3'退火区；和/或(E)3'自切割核酶；间隔子区可以存在于任何一种或多种元件之间。如本文所述，元件(A)、(B)、(C)、(D)和/或(E)中的任一者可以通过间隔子序列隔开。例如，间隔子可以在(A)与(B)之间、(B)与(C)之间、(C)与(D)之间、和/或(D)与(E)之间。
间隔子也可存在于本文所述的核酸区内。例如，多核苷酸负载物区可以包括一个或多个间隔子。间隔子可以隔开多核苷酸负载物内的区域。
在一些实施例中，间隔子序列的长度可以是例如，至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、或至少30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度是不多于100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度是在20与50个核苷酸之间。在某些实施例中，间隔子序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施例中，在5'退火区与多核糖核苷酸负载物之间，间隔子区的长度可以是在5与1000、5与900、5与800、5与700、5与600、5与500、5与400、5与300、5与200、5与100、100与200、100与300、100与400、100与500、100与600、100与700、100与800、100与900、或100与1000个多核糖核苷酸之间。间隔子序列可以是聚A序列、聚A-C序列、聚C序列、或聚U序列。
间隔子序列可用于将IRES与相邻的结构元件隔开，以维持IRES或相邻的元件的结构和功能。可以根据IRES将间隔子特异性工程化。在一些实施例中，可以利用RNA折叠计算机软件(如RNAFold)指导载体的各种元件(包括间隔子)的设计。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括5'间隔子序列(例如，在5'退火区与多核糖核苷酸负载物之间)。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是至少10个核苷酸。在另一实施例中，5'间隔子序列的长度是至少15个核苷酸。在另外的实施例中，5'间隔子序列的长度是至少30个核苷酸。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是不多于100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是在20与50个核苷酸之间。在某些实施例中，5'间隔子序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施例中，5'间隔子序列是聚A序列。在另一实施例中，5'间隔子序列是聚A-C序列。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括3'间隔子序列(例如，在3'退火区与多核糖核苷酸负载物之间)。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是至少10个核苷酸。在另一实施例中，3'间隔子序列的长度是至少15个核苷酸。在另外的实施例中，3'间隔子序列的长度是至少30个核苷酸。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是不多于100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是在20与50个核苷酸之间。在某些实施例中，3'间隔子序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施例中，3'间隔子序列是聚A序列。在另一实施例中，5'间隔子序列是聚A-C序列。
在一个实施例中，多核糖核苷酸包括5'间隔子序列，但不包括3'间隔子序列。在另一实施例中，多核糖核苷酸包括3'间隔子序列，但不包括5'间隔子序列。在另一实施例中，多核糖核苷酸既不包括5'间隔子序列，又不包括3'间隔子序列。在另一实施例中，多核糖核苷酸不包括IRES序列。在另外的实施例中，多核糖核苷酸不包括IRES序列、5'间隔子序列或3'间隔子序列。
在一些实施例中，间隔子序列包括至少3个核糖核苷酸、至少4个核糖核苷酸、至少5个核糖核苷酸、至少约8个核糖核苷酸、至少约10个核糖核苷酸、至少约12个核糖核苷酸、至少约15个核糖核苷酸、至少约20个核糖核苷酸、至少约25个核糖核苷酸、至少约30个核糖核苷酸、至少约40个核糖核苷酸、至少约50个核糖核苷酸、至少约60个核糖核苷酸、至少约70个核糖核苷酸、至少约80个核糖核苷酸、至少约90个核糖核苷酸、至少约100个核糖核苷酸、至少约120个核糖核苷酸、至少约150个核糖核苷酸、至少约200个核糖核苷酸、至少约250个核糖核苷酸、至少约300个核糖核苷酸、至少约400个核糖核苷酸、至少约500个核糖核苷酸、至少约600个核糖核苷酸、至少约700个核糖核苷酸、至少约800个核糖核苷酸、至少约900个核糖核苷酸、或至少约100个核糖核苷酸。
连接酶
RNA连接酶是一类利用ATP催化在RNA分子的末端之间形成磷酸二酯键的酶。内源性RNA连接酶修复植物、动物、人、细菌、古细菌、和真菌细胞以及病毒中单链、双链体化RNA中的核苷酸断裂。
本披露提供了一种通过使线性RNA(例如，如本文所述的连接酶相容的线性RNA)与RNA连接酶接触来产生环状RNA的方法。
在一些实施例中，该RNA连接酶是tRNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该tRNA连接酶是T4连接酶、RtcB连接酶、TRL-1连接酶、和Rnl1连接酶、Rnl2连接酶、LIG1连接酶、LIG2连接酶、PNK/PNL连接酶、PF0027连接酶、thpR ligT连接酶、ytlPor连接酶、或其变体(例如，保留连接酶功能的突变性变体)。
在一些实施例中，该RNA连接酶是植物RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是叶绿体RNA连接酶或其变体。在实施例中，该RNA连接酶是真核藻类RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是来自古细菌的RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是细菌RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是真核RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是病毒RNA连接酶或其变体。在一些实施例中，该RNA连接酶是线粒体RNA连接酶或其变体。
在一些实施例中，该RNA连接酶是在表2中描述的连接酶或其变体。
表2：示例性tRNA连接酶
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产生方法
本披露还提供了在无细胞系统中产生环状RNA的方法。图2是描绘用于从前体线性RNA产生环状RNA的示例性过程的示意图。例如，可以在无细胞系统中转录(例如，通过体外转录)脱氧核糖核苷酸模板以产生前体线性RNA。在表达时，在合适的条件下，并且不按特定的顺序，5'和3'自切割核酶各自经历切割反应，从而产生连接酶相容的末端(例如，5'-羟基和2',3'-环磷酸)并且5'和3'退火区使游离端靠近。因此，前体线性多核糖核苷酸产生连接酶相容的多核糖核苷酸，其可以被连接(例如，在连接酶存在下)以产生环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸(例如，在无细胞系统中)的方法，该方法包括：提供线性多核糖核苷酸(例如，本文所述的前体线性多核糖核苷酸)，其中该线性多核糖核苷酸处于适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶的条件下的溶液中，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触；从而产生环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸(例如，本文所述的前体线性多核糖核苷酸)的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸以产生线性多核糖核苷酸；其中该转录在适合于切割该5'自切割核酶和3'自切割核酶的条件下发生，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；任选地纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触，从而产生环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸以产生线性多核糖核苷酸，其中该转录在包含连接酶的溶液中并在适合于连接该线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下发生，从而产生环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含5'自切割核酶和3'自切割核酶。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含5'断裂内含子和3'断裂内含子(例如，用于产生环状多核糖核苷酸的自剪接构建体)。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸包含5'退火区和3'退火区。
在一些实施例中，本披露提供了一种在无细胞系统中产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括以下的步骤：(a)使线性多核糖核苷酸经受适合于切割自切割核酶的条件，其中该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：(i)5'自切割核酶；(ii)包含5'互补区的5'退火区；(iii)多核糖核苷酸负载物；(iv)包含3'互补区的3'退火区；以及(v)3'自切割核酶；其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；并且由此该5'自切割核酶和该3'自切割核酶被切割以产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；(b)任选地纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及(c)在无细胞系统中，在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与RNA连接酶接触，任选地其中该RNA连接酶是tRNA连接酶；从而产生环状多核糖核苷酸。在实施例中，该线性多核糖核苷酸是在无细胞系统中从DNA构建体产生的。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括编码序列、非编码序列、或编码和非编码序列两者。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括在至少一个编码目的多肽的编码序列的5'并与之可操作地连接的IRES或5'UTR序列，任选地在该IRES或5'UTR序列与该至少一个编码序列之间具有插入核糖核苷酸(intervening ribonucleotide)。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括在至少一个编码目的多肽的编码序列的3'并与之可操作地连接的3'UTR序列，任选地在该3'UTR序列与至少一个编码序列之间具有插入核糖核苷酸。
合适的条件可以包括在一个或多个方面模拟生理条件的任何条件(例如，溶液或缓冲液)。在一些实施例中，合适的条件包括在0.1-100mM之间的Mg2+离子或其盐(例如，1-100mM、1-50mM、1-20mM、5-50mM、5-20mM、或5-15mM)。在一些实施例中，合适的条件包括在1-1000mM之间的K+离子或其盐，如KCl(例如，1-1000mM、1-500mM、1-200mM、50-500mM、100-500mM、或100-300mM)。在一些实施例中，合适的条件包括在1-1000mM之间的Cl-离子或其盐，如KCl(例如，1-1000mM、1-500mM、1-200mM、50-500mM、100-500mM、或100-300mM)。在一些实施例中，合适的条件包括4至10的pH(例如，5至9的pH、6至9的pH、或6.5至8.5的pH)。在一些实施例中，合适的条件包括4℃至50℃的温度(例如，10℃至40℃、15℃至40℃、20℃至40℃、或30℃至40℃)，
在一些实施例中，合适的条件包括鸟苷-5'-三磷酸(GTP)(例如，1-1000μM、1-500μM、1-200μM、50-500μM、100-500μM、或100-300μM)。在一些实施例中，合适的条件包括在0.1-100mM之间的Mn2+离子或其盐，如MnCl2(例如，0.1-100mM、0.1-50mM、0.1-20mM、0.1-10mM、0.1-5mM、0.1-2mM、0.5-50mM、0.5-20mM、0.5-15mM、0.5-5mM、0.5-2mM、或0.1-10mM)。在一些实施例中，合适的条件包括二硫苏糖醇(DTT)(例如，1-1000μM、1-500μM、1-200μM、50-500μM、100-500μM、100-300μM、0.1-100mM、0.1-50mM、0.1-20mM、0.1-10mM、0.1-5mM、0.1-2mM、0.5-50mM、0.5-20mM、0.5-15mM、0.5-5mM、0.5-2mM、或0.1-10mM)。
在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸从脱氧核糖核酸(例如，本文所述的脱氧核糖核酸，如DNA载体、线性化DNA载体、或cDNA)产生。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸通过在无细胞系统中转录(例如，体外转录)从该脱氧核糖核酸进行转录。
一锅法
在一些实施例中，在使连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触之前，不纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，在单个反应容器中、在相同的反应条件下、和/或在无任何RNA组分的中间纯化步骤的情况下进行以下步骤：线性RNA在无细胞系统中从DNA模板转录(例如，体外转录)、前体线性RNA自切割以形成连接酶相容的线性RNA、以及连接酶相容的线性RNA连接以产生环状RNA。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸在无细胞系统中的转录(例如，体外转录)在包括连接酶的溶液中进行。
在一些实施例中，本披露提供了一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸(例如，本文所述的前体线性多核糖核苷酸)的脱氧核糖核苷酸；转录该脱氧核糖核苷酸以产生该线性多核糖核苷酸；其中该转录在适合于切割该5'自切割核酶和3'自切割核酶的条件下发生，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及其中该转录在包括连接酶的溶液中并在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下发生，从而产生环状多核糖核苷酸。合适的条件包括本文之前所述的条件。
纯化的方法
本文所述的方法中可以包括一个或多个纯化步骤。例如，在一些实施例中，在使连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触之前，该连接酶相容的线性多核糖核苷酸是基本上富集的或纯的(例如，经纯化的)。在其他实施例中，在使连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触之前，不纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，纯化所得的环状RNA。
纯化可以包括从一种或多种不希望的组分(如任何未反应的起始材料、副产物、酶、或其他反应组分)分离或富集所希望的反应产物。例如，在无细胞系统中转录(例如，体外转录)和切割后该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的纯化可以包括在使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与RNA连接酶接触之前从DNA模板分离和/或富集。连接后环状RNA产物的纯化可用于从其对应的线性RNA分离和/或富集环状RNA。RNA的纯化方法是本领域技术人员已知的，并且包括酶纯化或通过色谱法。
生物反应器
在一些实施例中，本文所述的任何产生环状多核糖核苷酸的方法都可以在生物反应器中进行。生物反应器是指在其中进行涉及生物体或衍生自此类生物体的生物化学活性物质的化学过程的任何容器。特别地，生物反应器可以与本文所述的用于产生环状RNA的无细胞的方法相容。用于生物反应器的容器可以包括培养瓶、皿、或袋，其可以是单次使用的(一次性的)、可高压灭菌的、或可消毒的。生物反应器可以由玻璃制成，或者其也可以是基于聚合物的，或者其也可以由其他材料制成。
生物反应器的实例包括但不限于搅拌罐(例如，充分混合的)生物反应器和管式(例如，活塞流)生物反应器、气升式生物反应器、膜搅拌罐、旋转过滤搅拌罐、振动混合器、流化床反应器、和膜生物反应器。操作生物反应器的模式可以是间歇的或连续的过程。当试剂和产物流连续地进出系统时，生物反应器是连续的。间歇式生物反应器可以有连续的再循环流，但没有连续的试剂进料或产物收获。
本披露的一些方法针对环状多核糖核苷酸的大规模生产。对于大规模生产方法，该方法可以在1升(L)至50L或更大(例如，5L、10L、15L、20L、25L、30L、35L、40L、45L、50L、或更大)的体积中进行。在一些实施例中，该方法可以在5L至10L、5L至15L、5L至20L、5L至25L、5L至30L、5L至35L、5L至40L、5L至45L、10L至15L、10L至20L、10L至25L、20L至30L、10L至35L、10L至40L、10L至45L、10L至50L、15L至20L、15L至25L、15L至30L、15L至35L、15L至40L、15L至45L、或15至50L的体积中进行。
在一些实施例中，生物反应器可以产生至少1g的环状RNA。在一些实施例中，生物反应器可产生1-200g的环状RNA(例如，1-10g、1-20g、1-50g、10-50g、10-100g、50-100g、或50-200g的环状RNA)。在一些实施例中，产生的量是测量值/升(例如，1-200g/升)、/批或反应(例如，1-200g/批或反应)、或/单位时间(例如，1-200g/小时或/天)。
在一些实施例中，可以串联使用多于一个生物反应器以增加生产能力(例如，可以串联使用一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、或九个生物反应器)。
使用方法
在一些实施例中，如本文所述制备的环状多核糖核苷酸在疗法和/或农业中用作效应子。例如，可以向受试者施用通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用、或农业组合物中)。在一些实施例中，该受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、或两栖动物)。在一些实施例中，该受试者是人。在一些实施例中，该受试者是非人哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物、有蹄类动物、肉食动物、啮齿动物、或兔类动物。在一些实施例中，该受试者是鸟、爬行动物、或两栖动物。在一些实施例中，该受试者是无脊椎动物。在一些实施例中，该受试者是植物或真核藻类。在一些实施例中，该受试者是植物，如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如，针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类、或苔藓植物。在实施例中，该受试者是具有农业或园艺重要性的植物，如行间作物、水果、蔬菜、树木、或观赏植物。在一些实施例中，可以将通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸递送至细胞。
配制品
在本披露的一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸(例如，通过本文所述的无细胞的方法制备的环状多核糖核苷酸)可配制在组合物中，例如用于递送至细胞、植物、无脊椎动物、非人脊椎动物、或人受试者的组合物，例如农业、兽用、或药物组合物。
因此，在一些实施例中，本披露还涉及组合物，这些组合物包括环状多核糖核苷酸(例如，通过本文所述的无细胞的方法制备的环状多核糖核苷酸)和药学上可接受的载剂。在一个方面，本披露提供了药物组合物，这些药物组合物包括有效量的本文所述的多核糖核苷酸和药学上可接受的赋形剂。本披露的药物组合物可以包括如本文所述的多核糖核苷酸与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、赋形剂、或稀释剂的组合。
在一些实施例中，药学上可接受的载剂可以是药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂可以包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。药学上可接受的载剂的实例是生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，如盐、缓冲液、糖、抗氧化剂、水性或非水性载剂、防腐剂、润湿剂、表面活性剂或乳化剂、或其组合。药物组合物中的一种或多种药学上可接受的载剂的量可以基于一种或多种载剂的活性和所希望的配制品的特征(如稳定性和/或最小氧化)通过实验确定。
在一些实施例中，此类组合物可包括缓冲液，如乙酸、柠檬酸、组氨酸、硼酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、苹果酸、天冬氨酸、Tris缓冲液、HEPPSO、HEPES、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；抗细菌剂和抗真菌剂；以及防腐剂。
在某些实施例中，本披露的组合物可配制用于多种肠胃外或非肠胃外施用方式。在一个实施例中，这些组合物可配制用于输注或静脉内施用。本文披露的组合物可以提供为例如可以缓冲至所希望的pH的无菌液体制剂，例如等渗水性溶液、乳液、悬浮液、分散体、或粘性组合物。适合于口服使用的配制品可以包括液体溶液、胶囊、药袋、片剂、锭剂、和糖锭剂、在适当的液体中的粉末液体悬浮液和乳液。
本披露的药物组合物可以以适合待治疗或预防的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如受试者的状况、受试者疾病的类型和严重程度这类因素确定，尽管适当的剂量可通过临床试验确定。
在实施例中，如本披露中描述的环状多核糖核苷酸以适合农业应用的配制品提供，例如作为液体溶液或乳液、浓缩物(液体、乳液、凝胶、或固体)、粉末、颗粒、糊剂、凝胶、饵剂、或种子包衣剂或种子处理剂。将此类农业配制品的实施例应用于植物或植物的环境，例如作为叶面喷雾、喷粉应用、颗粒应用、根或土壤浸透、沟内处理、颗粒土壤处理、饵剂、水培溶液、或可注射的配制品。此类农业配制品的一些实施例包括额外的组分，如赋形剂、稀释剂、表面活性剂、铺展剂、粘合剂、安全剂、稳定剂、缓冲液、漂移控制剂、保留剂、油浓缩物、消泡剂、泡沫标志物、香味剂、载剂、或封装剂。用于农业配制品的有用佐剂包括在Compendium of Herbicide Adjuvants[除草剂佐剂概要],第13版(2016)中披露的那些，可在www[dot]herbicide-adjuvants[dot]com上在线公开获得。
实施例
本文所述的线性多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸、DNA分子、系统、方法、和其他组合物的各种实施例在以下编号的实施例集合中阐述。
1.一种线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：(A)5'自切割核酶；(B)5'退火区；(C)多核糖核苷酸负载物；(D)3'退火区；以及(E)3'自切割核酶。
2.一种线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸具有式5'-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-3'，其中：(A)包含5'自切割核酶；(B)包含5'退火区；(C)包含多核糖核苷酸负载物；(D)包含3'退火区；并且(E)包含3'自切割核酶。
3.如实施例1或2所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶能够在位于该5'自切割核酶的3'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该5'自切割核酶的3'端的位点处进行自切割。
4.如实施例1-3中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。
5.如实施例4所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶是锤头状核酶。
6.如实施例1-5中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶包含与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少85％序列同一性的区域。
7.如实施例6所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
8.如实施例1-3中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶包含与SEQ ID NO:24-571中的任一者具有至少85％序列同一性的核酸序列或其有催化能力的片段。
9.如实施例8所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶包含SEQ ID NO:24-571中的任一者的核酸序列或其有催化能力的片段。
10.如实施例1-9中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶能够在位于该3'自切割核酶的5'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该3'自切割核酶的5'端的位点处进行自切割。
11.如实施例1-10中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。
12.如实施例11所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶是丁型肝炎病毒(HDV)核酶。
13.如实施例1-11中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶包含与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少85％序列同一性的区域。
14.如实施例13所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶包含SEQ ID NO:7的核酸序列。
15.如实施例1-10中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶包含与SEQ ID NO:24-571中的任一者具有至少85％序列同一性的核酸序列或其有催化能力的片段。
16.如实施例15所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶包含SEQ ID NO:24-571中的任一者的核酸序列或其有催化能力的片段。
17.如实施例1-16中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶的和该3'自切割核酶的切割产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。
18.如实施例1-17中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶的切割产生游离的5'-羟基基团，并且3'自切割核酶的切割产生游离的2',3'-环磷酸基团。
19.如实施例17或18所述的线性多核糖核苷酸，其中该连接酶是RNA连接酶。
20.如实施例19所述的线性多核糖核苷酸，其中该RNA连接酶是tRNA连接酶。
21.如实施例20所述的线性多核糖核苷酸，其中该tRNA连接酶是T4连接酶、RtcB连接酶、TRL-1连接酶、和Rnl1连接酶、Rnl2连接酶、LIG1连接酶、LIG2连接酶、PNK/PNL连接酶、PF0027连接酶、thpR ligT连接酶、ytlPor连接酶、或其变体。
22.如实施例19所述的线性多核糖核苷酸，其中该RNA连接酶是植物RNA连接酶、叶绿体RNA连接酶、来自古细菌的RNA连接酶、细菌RNA连接酶、真核RNA连接酶、病毒RNA连接酶、或线粒体RNA连接酶、或其变体。
23.如实施例1-22中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区具有5至100个核糖核苷酸。
24.如实施例1-23中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'退火区具有5至100个核糖核苷酸。
25.如实施例1-24中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸的5’互补区；并且该3'退火区包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸的3'互补区；并且其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性；并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能；并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm。
26.如实施例25所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；并且/或者其中该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；并且/或者其中该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
27.如实施例1-26中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区包含与SEQID NO:3的核酸序列具有至少85％序列同一性的区域。
28.如实施例27所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
29.如实施例1-28中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'退火区包含与SEQID NO:4的核酸序列具有至少85％序列同一性的区域。
30.如实施例29所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'退火区包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
31.如实施例1-30中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸负载物包含编码多肽的表达序列。
32.如实施例1-31中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含与编码多肽的表达序列可操作地连接的IRES。
33.如实施例31或32所述的线性多核糖核苷酸，其中该多肽是生物活性多肽。
34.如实施例31-33中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该多肽是用于治疗性或农业应用的多肽。
35.如实施例31-34中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该多肽是具有在脊椎动物、无脊椎动物、植物、或微生物的基因组中编码的序列的多肽。
36.如实施例31-34中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中当与脊椎动物、无脊椎动物、或植物接触时，或当与脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞接触时，该多肽具有生物学作用。
37.如实施例35或36所述的线性多核糖核苷酸，其中该脊椎动物选自人、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物、或鱼。
38.如实施例35或36所述的线性多核糖核苷酸，其中该无脊椎动物选自昆虫、蛛形纲、线虫、或软体动物。
39.如实施例35或36所述的线性多核糖核苷酸，其中该植物选自单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、或真核藻类。
40.如实施例35或36所述的线性多核糖核苷酸，其中该微生物选自细菌、真菌、或古细菌。
41.如实施例1-40中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸进一步包含在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区。
42.如实施例1-41中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸进一步包含在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为在5与1000个之间的多核糖核苷酸的间隔子区。
43.如实施例41或42所述的线性多核糖核苷酸，其中该间隔子区包含聚A序列。
44.如实施例41或42所述的线性多核糖核苷酸，其中该间隔子区包含聚A-C序列。
45.如实施例1-44中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸是至少1kb。
46.如实施例1-45中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸是1kb至20kb。
47.一种脱氧核糖核酸，该脱氧核糖核酸包含与编码如实施例1-46中任一所述的线性多核糖核苷酸的序列可操作地连接的RNA聚合酶启动子。
48.如实施例47所述的脱氧核糖核酸，其中该RNA聚合酶启动子是T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、或SP6启动子。
49.一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸从如实施例1-46中任一所述的线性多核糖核苷酸或从如实施例47或48所述的脱氧核糖核酸产生。
50.如实施例46所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸是至少1kb。
51.如实施例50所述的环状多核糖核苷酸，其中该环状多核糖核苷酸是1kb至20kb。
52.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供如实施例1-46中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸处于适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶的条件下的溶液中，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触；从而产生环状多核糖核苷酸。
53.如实施例52所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸从脱氧核糖核酸产生。
54.如实施例53所述的方法，其中该脱氧核糖核酸包含与编码该线性多核糖核苷酸的序列可操作地连接的RNA聚合酶启动子。
55.如实施例54所述的方法，其中该RNA聚合酶启动子是T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、或SP6启动子。
56.如实施例53-55中任一项所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸通过在无细胞系统中转录从该脱氧核糖核酸进行转录。
57.如实施例52-56中任一项所述的方法，其中在使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触之前，纯化连接酶相容的线性多核糖核苷酸。
58.如实施例57所述的方法，其中该连接酶相容的线性多核糖核苷酸通过酶纯化法或通过色谱法进行纯化。
59.如实施例56所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸的转录在包含该连接酶的溶液中进行。
60.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码如实施例1-46中任一项所述的线性多核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸以产生线性多核糖核苷酸；其中该转录在适合于切割该5'自切割核酶和3'自切割核酶的条件下发生，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；任选地纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触，从而产生环状多核糖核苷酸。
61.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码如实施例1-46中任一项所述的线性多核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸以产生线性多核糖核苷酸；其中该转录在适合于切割该5'自切割核酶和3'自切割核酶的条件下发生，从而产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及其中该转录在包含连接酶的溶液中并在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下发生，从而产生环状多核糖核苷酸。
62.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供编码线性多核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸；在无细胞系统中转录脱氧核糖核苷酸以产生线性多核糖核苷酸，其中该转录在包含连接酶的溶液中并在适合于连接该线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下发生，从而产生环状多核糖核苷酸。
63.如实施例62所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸包含5'自切割核酶和3'自切割核酶。
64.如实施例62所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸包含5'断裂内含子和3'断裂内含子。
65.如实施例62-64中任一项所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸包含5'退火区和3'退火区。
66.如实施例60-65中任一项所述的方法，其中该脱氧核糖核酸包含与编码该线性多核糖核苷酸的序列可操作地连接的RNA聚合酶启动子。
67.如实施例66所述的方法，其中该RNA聚合酶启动子是T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、或SP6启动子。
68.如实施例52-67中任一项所述的方法，其中该连接酶是RNA连接酶。
69.如实施例68所述的方法，其中该RNA连接酶是tRNA连接酶。
70.如实施例69所述的方法，其中该tRNA连接酶是T4连接酶、RtcB连接酶、TRL-1连接酶、和Rnl1连接酶、Rnl2连接酶、LIG1连接酶、LIG2连接酶、PNK/PNL连接酶、PF0027连接酶、thpR ligT连接酶、ytlPor连接酶、或其变体。
71.如实施例68所述的方法，其中该RNA连接酶是植物RNA连接酶、叶绿体RNA连接酶、来自古细菌的RNA连接酶、细菌RNA连接酶、真核RNA连接酶、病毒RNA连接酶、或线粒体RNA连接酶、或其变体。
72.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：提供线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：5'自切割核酶；包含5'互补区的5'退火区；多核糖核苷酸负载物；包含3'互补区的3'退火区；以及3'自切割核酶；其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；以及其中该线性多核糖核苷酸处于适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶的条件下的无细胞系统中的溶液中，从而在该无细胞系统中产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使在无细胞系统中的该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触；从而产生环状多核糖核苷酸。
73.如实施例72所述的方法，其中该线性多核苷酸通过从编码该线性多核苷酸的脱氧核糖核苷酸转录来提供，任选地其中该脱氧核糖核苷酸是在无细胞系统中。
74.如实施例73所述的方法，其中该转录在包含该连接酶的溶液中进行。
75.如实施例72、73、或74所述的方法，其中该5'自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。
76.如实施例72至75中任一项所述的方法，其中该3'自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。
77.如实施例72至76中任一项所述的方法，其中该5’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且该3’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸。
78.如实施例72至77中任一项所述的方法，其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性，并且任选地其中该5'互补区和该3'互补区包括在它们之间的不多于10个错配。
79.如实施例72至78中任一项所述的方法，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且其中该3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中：该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；并且/或者该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；并且/或者该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
80.如实施例72至79中任一项所述的方法，其中该3'退火区和该5'退火区促进游离的3'和5'端的缔合。
81.如实施例72至80中任一项所述的方法，其中该多核糖核苷酸负载物包含：至少一个编码多肽的编码序列；或至少一个非编码序列；或至少一个编码多肽的编码序列和至少一个非编码序列的组合。
82.如实施例81所述的方法，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽包含在脊椎动物、无脊椎动物、植物或微生物的基因组中编码的氨基酸序列，并且/或者其中该多肽包含治疗性多肽、植物修饰多肽、或农业多肽。
83.如实施例81所述的方法，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且进一步包含选自由以下组成的组的额外的元件：内部核糖体进入位点(IRES)或5’UTR序列，其位于该编码序列的5'并与之可操作地连接，任选地在该IRES或5'UTR序列与该编码序列之间具有插入核糖核苷酸；3’UTR序列，其位于该编码序列的3'并与之可操作地连接，任选地在该3'UTR与该编码序列之间具有插入核糖核苷酸；(a)和(b)两者。
84.如实施例72至83中任一项所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸进一步包含在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区，任选地其中该间隔子区包含聚A序列或聚A-C序列。
85.如实施例72至84中任一项所述的方法，其中该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的5’-羟基基团，并且/或者该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的2',3'-环磷酸。
86.如实施例72至85中任一项所述的方法，其中该连接酶是RNA连接酶，任选地其中该RNA连接酶是tRNA连接酶。
87.如实施例86所述的方法，其中该tRNA连接酶是(a)选自由以下组成的组的连接酶：T4连接酶、RtcB连接酶、TRL-1连接酶、和Rnl1连接酶、Rnl2连接酶、LIG1连接酶、LIG2连接酶、PNK/PNL连接酶、PF0027连接酶、thpR ligT连接酶、和ytlPor连接酶；或(b)选自由以下组成的组的连接酶：植物RNA连接酶、叶绿体RNA连接酶、来自古细菌的RNA连接酶、细菌RNA连接酶、真核RNA连接酶、病毒RNA连接酶、和线粒体RNA连接酶。
88.一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸通过如实施例72至87中任一项所述的方法产生。
89.一种线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：5'自切割核酶；包含5'互补区的5'退火区；多核糖核苷酸负载物；包含3'互补区的3'退火区；以及3'自切割核酶；其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm。
90.如实施例89所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状、发夹状、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。
91.如实施例89或90所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。
92.如实施例89、90或91中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且该3’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸。
93.如实施例89至92中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性，并且任选地其中该5'互补区和该3'互补区包括在它们之间的不多于10个错配。
94.如实施例89至93中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且其中该3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中：该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；并且/或者该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；并且/或者该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
95.如实施例89至94中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含：至少一个编码多肽的编码序列；或至少一个非编码序列；或至少一个编码多肽的编码序列和至少一个非编码序列的组合。
96.如实施例95所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽包含在脊椎动物、无脊椎动物、植物或微生物的基因组中编码的氨基酸序列。
97.如实施例95所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽是治疗性多肽、植物修饰多肽、或农业多肽。
98.如实施例89至97中任一项所述的线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸进一步包含在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区，任选地其中该间隔子区包含聚A序列或聚A-C序列。
99.一种DNA分子，该DNA分子包含编码如实施例89至97中任一项所述的线性多核糖核苷酸的DNA序列，任选地进一步包含与编码该线性多核糖核苷酸的DNA序列可操作地连接的异源启动子。
100.如实施例99所述的DNA分子，其中该异源启动子是选自包含以下的组的启动子：T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、和SP6启动子。
101.一种无细胞的系统，该无细胞的系统用于生成环状RNA，该系统包含含有以下的溶液：线性多核糖核苷酸，其中该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：5'自切割核酶；包含5'互补区的5'退火区；多核糖核苷酸负载物；包含3'互补区的3'退火区；以及3'自切割核酶；其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；以及连接酶；其中该溶液的条件适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶以及通过该连接酶连接所得的连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端，从而生成环状RNA。
102.一种环状RNA，该环状RNA通过如实施例101所述的无细胞的系统生成。
103.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：使线性多核糖核苷酸经受适合于切割自切割核酶的条件，其中该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：5'自切割核酶；包含5'互补区的5'退火区；多核糖核苷酸负载物；包含3'互补区的3'退火区；以及3'自切割核酶；其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；并且由此该5'自切割核酶和该3'自切割核酶被切割以产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；任选地纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及在无细胞系统中，在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与RNA连接酶接触，任选地其中该RNA连接酶是tRNA连接酶；从而产生环状多核糖核苷酸。
104.如实施例103所述的方法，其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性，并且任选地其中该5'互补区和该3'互补区包括在它们之间的不多于10个错配。
105.如实施例103或104所述的方法，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且其中该3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中：该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；并且/或者该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；并且/或者该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
106.如实施例103、104或105中任一项所述的方法，其中该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的5’-羟基基团，并且/或者该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的2',3'-环磷酸。
实例
提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供可以如何使用、制备和评价本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹作为本披露的示例，而不旨在限制诸位发明人认为是其发明的范围。
实例1：构建体设计
本实例描述了DNA构建体(SEQ ID NO:8)的设计。图1中提供了描绘DNA构建体的设计的示意图。该构建体从5'至3'编码：能够募集用于RNA合成的RNA聚合酶的启动子(SEQ IDNO:1)；在其3'端切割的5'自切割核酶(SEQ ID NO:17)；5'退火区(SEQ ID NO:18)；内部核糖体进入位点(IRES)(SEQ ID NO:20)；编码多肽的编码区(SEQ ID NO:21)；3'退火区(SEQID NO:19)；以及在其5'端切割的3'自切割核酶(SEQ ID NO:22)。
将该DNA构建体转录以产生线性RNA(SEQ ID NO:9)，该线性RNA从5'至3'包括：在其3'端切割的5'自切割核酶(SEQ ID NO:2)；5'退火区(SEQ ID NO:3)；内部核糖体进入位点(IRES)(SEQ ID NO:5)；编码多肽的编码区(SEQ ID NO:6)；3'退火区(SEQ ID NO:4)；以及在其5'端切割的3'自切割核酶(SEQ ID NO:7)。表达后，该线性RNA自切割以产生具有游离的5'羟基和游离的3'单磷酸的连接酶相容的线性RNA(SEQ ID NO:10)。通过添加RNA连接酶使该连接酶相容的线性RNA环化。图2中提供了描绘环化的过程的示意图。
实例2：用于在无细胞系统中生成环状RNA的方法
本实例描述了一种体外生成环状RNA构建体的方法。
使用T7体外转录反应(卢西根公司(Lucigen)Ampliscribe T7 Flash，ASF3257)进行核糖核苷酸的体外转录。5'和3'锤头状核酶的后续切割产生5'-羟基和2',3'环磷酸RNA序列，其末端通过tRNA连接酶连接。将体外转录的RNA产物用DNA酶处理以去除DNA模板。然后将线性RNA进行柱纯化(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)Monarch 500μg RNA净化试剂盒，T2050)。
然后根据制造商的说明通过用RNA连接酶处理将线性RNA环化。将在水中的200μg纯化的线性模板加热至72℃持续10分钟。添加10x缓冲液和MnCl2，并将混合物在室温下冷却10分钟。添加GTP、连接酶和RNA酶抑制剂共混物，并将混合物在37℃下在干燥的空气培养箱中孵育4小时。
将连接反应混合物通过乙醇沉淀纯化并重悬于无核酸酶的水中。为了确认连接的RNA的纯度和质量，将等分试样在50％甲酰胺加载染料中加热至95℃持续3分钟，并在6％变性尿素PAGE凝胶上跑胶。线性RNA以预期的分子量迁移，同时环状RNA以高分子量移动迁移，这确认了RNA是环状的(参见图3)。
在另一实例中，环状RNA是在体外用经修饰的核苷酸生成的。使用如前一实例中所述的、具有以下修改的T7体外转录反应(卢西根公司Ampliscribe T7Flash，ASF3257)进行核糖核苷酸的体外转录。遵循制造商的说明，除了使用三磷酸假尿苷(Trilink公司，N-1019)代替UTP。如上所述对所得的体外转录的RNA进行质量控制。简言之，通过凝胶电泳分离RNA并用溴化乙锭染色。以预期大小可视化的条带指示RNA产生是成功的。例如，假尿苷取代的RNA任选地通过与RtcB连接酶接触而环化。
实例3：使用凝胶纯化的RNA纯化
本实例描述了RNA的纯化。通过PAGE凝胶纯化将连接的RNA混合物纯化。将一(1)份RNA样品与3份甲酰胺加载缓冲液(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，美国)混合，在95℃下孵育3分钟，并在冰上冷却。将样品加载到4％尿素PAGE凝胶中，不超过12ug RNA/孔。使样品在250V下跑胶2-3小时并用溴化乙锭(赛默飞世尔科技公司，美国)染色。切下高分子量环状条带，并通过在含有TE缓冲液、十二烷基硫酸钠和乙酸钠的洗脱缓冲液(赛默飞世尔科技公司，美国)中孵育3小时-过夜来纯化RNA。将洗脱的RNA通过乙醇沉淀来纯化并在20ul的无核酸酶的水(赛默飞世尔科技公司，美国)中洗脱。通过在变性PAGE凝胶上跑胶200ng并通过使用微量分光光度计进行定量来检查纯化的产物的质量。
实例4：环状RNA的确认和定量
本实例描述了环状RNA存在的确认和相对于总IVT产物的定量。使用ImageJ凝胶分析工具分析来自实例3的凝胶的像素强度，并相对于总RNA产物的强度对环状条带强度进行定量。环状RNA构成总RNA的75％。
实例5：RNA是功能性的
本实例描述了来自通过本文所述方法生成的环状RNA的功能性蛋白表达。为了确认通过本文所述的方法生成的环状RNA保持功能性，将荧光素酶的表达进行定量。根据制造商的说明，将小麦胚芽提取物(普洛麦格公司(Promega Corporation))、TNT T7昆虫细胞提取物蛋白表达系统(普洛麦格公司)、和核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司)与IRES-荧光素酶环状RNA(SEQ ID NO:10、15、16、23)一起孵育1小时。每个构建体包括选自CrTMV(SEQ ID NO:11)、HCRSV(SEQ ID NO:12)、或ZmHSP(SEQ ID NO:13)的IRES。然后使用Nano-Glo测定试剂盒(普洛麦格公司)测量荧光素酶表达。使用本文描述的方法生成的环状RNA能够驱动蛋白表达。1pmol HCRSV RNA和ZmHSP RNA驱动昆虫细胞提取物(ICE)和小麦胚芽提取物(WGE)中的Nanoluc荧光素酶表达(图4)。2pmol RNA驱动兔网织红细胞裂解物中的Nanoluc荧光素酶表达(图5)。
实例6：用于在无细胞系统中生成具有较大负载物的环状RNA的方法
本实例描述了一种用于在无细胞系统中生成并入较大的负载物的用于环化的RNA构建体的方法。使用T7体外转录反应(卢西根公司Ampliscribe T7 Flash，ASF3257)进行核糖核苷酸的体外转录。5'和3'锤头状核酶的后续切割产生5'-羟基和2',3'环磷酸RNA序列，其末端通过tRNA连接酶连接。将体外转录的RNA产物用DNA酶处理以去除DNA模板。然后将线性RNA进行柱纯化(新英格兰生物实验室公司Monarch 500μg RNA净化试剂盒，T2050)。
然后根据制造商的说明通过用RNA连接酶处理将线性RNA环化。将在水中的200微克的纯化的线性模板加热至72℃持续10分钟。添加10x缓冲液和MnCl2，并将混合物在室温下冷却10分钟。添加GTP、连接酶和RNA酶抑制剂共混物，并将混合物在37℃下在干燥的空气培养箱中孵育4小时。
将连接反应混合物通过乙醇沉淀纯化并重悬于无核酸酶的水中。为了确认连接的RNA的纯度和质量，将等分试样在50％甲酰胺加载染料中加热至95℃持续3分钟，并在6％变性尿素PAGE凝胶上跑胶。线性RNA以预期的分子量迁移，同时环状RNA以高分子量移动迁移(图6)。最终的RNA序列含有IRES元件(ZmHSP，SEQ ID NO:13)和萤火虫荧光素酶(SEQ IDNO:14)，产生长度为1850个核苷酸的最终环状RNA(SEQ ID NO:16)。
实例7：在无细胞系统中生成环状RNA
本实例描述了在无细胞系统中从线性多核糖核苷酸前体产生环状多核糖核苷酸的方法。在本实例中，该线性多核苷酸包括含有5'互补区的5'退火区和含有3'互补区的3'退火区，其中在该5'互补区和该3'互补区之间发生少于10个错配，并且其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm。
更具体地，该线性前体包括以5'至3'方向可操作地连接的以下项：(a)能够募集用于RNA合成的RNA聚合酶的异源启动子(T7启动子，SEQ ID NO:572)；(b)在其3'端切割的5'自切割核酶(经修饰的P3扭转U2A核酶，SEQ ID NO:595)；(c)5'退火区(包括来自茄子潜隐类病毒(ELVd)的环的5'这一半的核苷酸序列，SEQ ID NO:597)；(d)含有Pepper适配体序列(SEQ ID NO:599)、ZmHSP101 IRES序列(SEQ ID NO:584)、和Nanoluc开放阅读框(SEQ IDNO:592)的多核糖核苷酸负载物；(e)3'退火区(包括来自茄子潜隐类病毒(ELVd)的环的3'这一半的核苷酸序列，SEQ ID NO:598)；以及(f)在其5'端切割的3'自切割核酶(经修饰的P1扭转核酶，SEQ ID NO:596)。
使用标准分子技术在大肠杆菌中克隆构建体并验证序列。使用PCR生成了包含T7启动子和整个Cyclone DNA构建体的线性扩增子。如实例2中所述产生环状RNA：简言之，使用线性扩增子作为体外转录的模板以产生多核糖核苷酸。根据制造商的说明，使多核糖核苷酸与RtcB连接酶(新英格兰生物实验室公司(NEB)，美国马塞诸塞州比弗利(Beverly,MA,USA))接触。使用500微克RNA纯化柱(NEB)纯化多核糖核苷酸。通过变性PAGE分离多核糖核苷酸。较高分子量的多核糖核苷酸(RNA)指示环化成功。额外的验证RNA环状拓扑结构的质量控制步骤包括用核酸外切酶处理，这示出了环状RNA未被消化，确认了它们的环状拓扑结构。将含有分离的RNA的多核糖核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶额外地在含有100mM氯化钾的适配体缓冲液中孵育，并用Pepper适配体的配体HBC525染色。在485nm处的激发和在525nm处的检测允许在PAGE分析后使Pepper适配体可视化(图7)。对于已用RtcB连接酶处理的线性多核苷酸观察到的较高条带指示出线性前体的环化和所得的环状RNA中Pepper适配体的功能性。
实例8：在无细胞系统中生成环状RNA
本实例描述了在无细胞系统中从线性多核糖核苷酸前体产生环状多核糖核苷酸的方法的额外的非限制性实施例。
对如前面的实例(尤其是实例6和7)所述的生成环状RNA的方法的变化形式如下进行开发。
在一个实施例中，根据制造商的说明(除了未将RNA酶A添加到中和缓冲液N3中以外)，使用Monarch质粒微型制备试剂盒制备经序列确认的质粒DNA。所得的DNA质粒通过PCR扩增以生成当用作无细胞(体外)转录的模板时无核糖核酸酶污染的线性DNA扩增子。在实例中，将该线性DNA扩增子以最终体积60微升在体外转录过夜。在DNA酶处理后，将RtcB RNA连接酶(NEB)直接添加到无细胞的转录混合物中。除DTT外，将额外的反应组分添加至由制造商推荐的最终浓度。连接反应在37℃下进行4小时。使连接反应混合物经受乙醇沉淀，重悬于无核酸酶的水中，并任选地例如通过凝胶纯化、通过用核酸外切酶处理、或通过凝胶纯化和核酸外切酶处理的组合进行纯化；或任选地不进一步纯化。
在RNA产生和任何任选的纯化步骤之后，使用变性PAGE测量环状RNA产生效率，例如，如实例7中所述。将环状RNA相对于线性RNA前体的比率进行定量。相对于使用实例7中描述的程序观察到的环状RNA:线性RNA的比率，在实施本实例中描述的改善之后，环状RNA :线性RNA的比率增加了。
实例9.环状RNA多核苷酸负载物中包括的编码序列的翻译。
本实例描述了包括多核苷酸负载物的环状RNA的实施例，该多核苷酸负载物包括一个或多个编码序列或表达序列。
实例1中描述的环状RNA包括多核糖核苷酸负载物，该多核糖核苷酸负载物包括编码多肽(Nanoluc荧光素酶，SEQ ID NO:592)的序列。当在小麦胚芽提取物或昆虫细胞提取物中测试时，该环状RNA提供了可重复的低水平Nanoluc报告子产量。测试了对环状RNA的额外修饰，这些修饰用于提高环状RNA的稳定性和/或提高由多核糖核苷酸负载物编码的多肽的翻译效率。根据标准分子技术对编码这些环状RNA的经修饰的线性前体的DNA构建体进行克隆并进行序列验证。
这些修饰的实例包括：
(a)用5'UTR序列(例如SEQ ID NO:600、601、602、603、604、或612中的任一者)替代内部核糖体进入位点(IRES)，该5'UTR序列在编码序列的5’并且(直接地或以插入序列)与该编码序列可操作地连接；
(b)包括3'UTR序列(例如，SEQ ID NO:605、606、607、608、609、610、611或613中任一者)，该3'UTR序列在编码序列的3'并且(直接地或以插入序列)与该编码序列可操作地连接，例如，在基于实例1所述的构建体中包括在Nanoluc开放阅读框的3'并且与其可操作地连接的3'UTR；
(c)在DNA构建体中包括编码IRES或5'UTR的DNA序列以及编码3'UTR的DNA序列，该编码IRES或5'UTR的DNA序列(例如，SEQ ID NO:582、583、584、591、601、602、603、604或612中的任一者)在编码序列的5'并且与其可操作地连接，并且该编码3'UTR的DNA序列(选自SEQ ID NO:605、606、607、608、609、610、611或613)在多核苷酸负载物的3'并且与其可操作地连接。
在实例中，如在实例1-4中所述，产生、环化并纯化包括含有Nanoluc开放阅读框的多核糖核苷酸负载物的线性多核糖核苷酸。如实例5中所述，使用昆虫细胞提取物(“ICE”，普洛麦格公司)和/或小麦胚芽提取物(“WGE”，普洛麦格公司)测量翻译效率。简言之，根据制造商的说明使RNA与ICE和WGE接触1小时，并根据制造商的说明进行Nanoluc荧光素酶测定。将发光强度相对于对照RNA构建体归一化，该对照RNA构建体含有与Nanoluc ORF可操作地连接的ZmHSP101 IRES且缺少3'UTR。
实验结果示出了包括负载物序列侧翼修饰的环状RNA提供了提高的编码多肽的负载物序列的翻译效率。例如，与对照RNA构建体相比，包括(a)在负载物序列的5'并与其可操作地连接的sTNV 5'UTR(SEQ ID NO:600)，和(b)在负载物序列的3'并且与其可操作地连接的sTNV 3'UTR(SEQ ID NO:605)的环状RNA具有提高的翻译效率，即在小麦胚芽提取物中的翻译效率比对照高约5倍，并且在昆虫细胞提取物中的翻译效率比对照构建体高约1.2倍。在另一实例中，与对照RNA构建体相比，包括(a)在负载物序列的5'并与其可操作地连接的TCV 5'UTR(SEQ ID NO:612)，和(b)在负载物序列的3'并且与其可操作地连接的TCV 3'UTR(SEQ ID NO:613)的环状RNA具有提高的翻译效率，即在昆虫细胞提取物中的翻译效率比对照高约1.5倍，并且在小麦胚芽提取物中的翻译效率比对照构建体高约0.9倍。
表12.实例7、8和9中使用的序列汇总
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本申请提到的所有引用的专利和专利公开均通过引用以其全文并入本文。本文披露和要求保护的所有材料和方法都可以如通过上述披露指示的和通过实例说明的进行制备和使用，而无需进行过多实验。尽管与本发明相关的材料和方法已在实施例和说明性实例方面进行了描述，但对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的材料和方法做出替代和变化。因此，本发明的广度和范围不应受上述任一实例的限制，而应仅根据前述实施例、以下权利要求、以及它们的等同物来定义。
序列表
<110> 旗舰创业创新七公司（Flagship Pioneering Innovations VII, LLC）
<120> 用于产生环状多核糖核苷酸的组合物和方法
<130> P13751WO00
<150> 63/166,467
<151> 2021-03-26
<160> 613
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
taatacgact cactataggg aat 23
<210> 2
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
uuuccccuga ugaguccgug aggacgaaac gaguaagcuc gucgggaaa 49
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
gggaaaaaaa ugccgucggu 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
accgacggca aaaaaaaaaa 20
<210> 5
<211> 464
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
gagggcccgg aaaccuggcc cugucuucuu gacgagcauu ccuagggguc uuuccccucu 60
cgccaaagga augcaagguc uguugaaugu cgugaaggaa gcaguuccuc uggaagcuuc 120
uugaagacaa acaacgucug uagcgacccu uugcaggcag cggaaccccc caccuggcga 180
caggugccuc ugcggccaaa agccacgugu auaagauaca ccugcaaagg cggcacaacc 240
ccagugccac guugugaguu ggauaguugu ggaaagaguc aaauggcucu ccucaagcgu 300
auucaacaag gggcugaagg augcccagaa gguaccccau uguaugggau cugaucuggg 360
gccucggugc acaugcuuua cauguguuua gucgagguua aaaaaacguc uaggcccccc 420
gaaccacggg gacgugguuu uccuuugaaa aacacgauga uaau 464
<210> 6
<211> 516
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
auggucuuca cacucgaaga uuucguuggg gacuggcgac agacagccgg cuacaaccug 60
gaccaagucc uugaacaggg aggugugucc aguuuguuuc agaaucucgg gguguccgua 120
acuccgaucc aaaggauugu ccugagcggu gaaaaugggc ugaagaucga cauccauguc 180
aucaucccgu augaaggucu gagcggcgac caaaugggcc agaucgaaaa aauuuuuaag 240
gugguguacc cuguggauga ucaucacuuu aaggugaucc ugcacuaugg cacacuggua 300
aucgacgggg uuacgccgaa caugaucgac uauuucggac ggccguauga aggcaucgcc 360
guguucgacg gcaaaaagau cacuguaaca gggacccugu ggaacggcaa caaaauuauc 420
gacgagcgcc ugaucaaccc cgacggcucc cugcuguucc gaguaaccau caacggagug 480
accggcuggc ggcugugcga acgcauucug gcguaa 516
<210> 7
<211> 68
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
ggccggcaug gucccagccu ccucgcuggc gccggcuggg caacaugcuu cggcauggcg 60
aaugggac 68
<210> 8
<211> 1160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
taatacgact cactataggg aattttcccc tgatgagtcc gtgaggacga aacgagtaag 60
ctcgtcggga aaaaaatgcc gtcggtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg 120
agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg 180
aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc 240
aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa 300
gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa 360
agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta 420
ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg 480
aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca 540
cgatgataat gccaccatgg tcttcacact cgaagatttc gttggggact ggcgacagac 600
agccggctac aacctggacc aagtccttga acagggaggt gtgtccagtt tgtttcagaa 660
tctcggggtg tccgtaactc cgatccaaag gattgtcctg agcggtgaaa atgggctgaa 720
gatcgacatc catgtcatca tcccgtatga aggtctgagc ggcgaccaaa tgggccagat 780
cgaaaaaatt tttaaggtgg tgtaccctgt ggatgatcat cactttaagg tgatcctgca 840
ctatggcaca ctggtaatcg acggggttac gccgaacatg atcgactatt tcggacggcc 900
gtatgaaggc atcgccgtgt tcgacggcaa aaagatcact gtaacaggga ccctgtggaa 960
cggcaacaaa attatcgacg agcgcctgat caaccccgac ggctccctgc tgttccgagt 1020
aaccatcaac ggagtgaccg gctggcggct gtgcgaacgc attctggcgt aaaccgacgg 1080
caaaaaaaaa aaggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacatgc 1140
ttcggcatgg cgaatgggac 1160
<210> 9
<211> 1143
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
gggaauuuuc cccugaugag uccgugagga cgaaacgagu aagcucgucg ggaaaaaaau 60
gccgucggug agggcccgga aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu 120
uuccccucuc gccaaaggaa ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu 180
ggaagcuucu ugaagacaaa caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc 240
accuggcgac aggugccucu gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc 300
ggcacaaccc cagugccacg uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc 360
cucaagcgua uucaacaagg ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc 420
ugaucugggg ccucggugca caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu 480
aggccccccg aaccacgggg acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau aaugccacca 540
uggucuucac acucgaagau uucguugggg acuggcgaca gacagccggc uacaaccugg 600
accaaguccu ugaacaggga ggugugucca guuuguuuca gaaucucggg guguccguaa 660
cuccgaucca aaggauuguc cugagcggug aaaaugggcu gaagaucgac auccauguca 720
ucaucccgua ugaaggucug agcggcgacc aaaugggcca gaucgaaaaa auuuuuaagg 780
ugguguaccc uguggaugau caucacuuua aggugauccu gcacuauggc acacugguaa 840
ucgacggggu uacgccgaac augaucgacu auuucggacg gccguaugaa ggcaucgccg 900
uguucgacgg caaaaagauc acuguaacag ggacccugug gaacggcaac aaaauuaucg 960
acgagcgccu gaucaacccc gacggcuccc ugcuguuccg aguaaccauc aacggaguga 1020
ccggcuggcg gcugugcgaa cgcauucugg cguaaaccga cggcaaaaaa aaaaaggccg 1080
gcaugguccc agccuccucg cuggcgccgg cugggcaaca ugcuucggca uggcgaaugg 1140
gac 1143
<210> 10
<211> 1026
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
gggaaaaaaa ugccgucggu gagggcccgg aaaccuggcc cugucuucuu gacgagcauu 60
ccuagggguc uuuccccucu cgccaaagga augcaagguc uguugaaugu cgugaaggaa 120
gcaguuccuc uggaagcuuc uugaagacaa acaacgucug uagcgacccu uugcaggcag 180
cggaaccccc caccuggcga caggugccuc ugcggccaaa agccacgugu auaagauaca 240
ccugcaaagg cggcacaacc ccagugccac guugugaguu ggauaguugu ggaaagaguc 300
aaauggcucu ccucaagcgu auucaacaag gggcugaagg augcccagaa gguaccccau 360
uguaugggau cugaucuggg gccucggugc acaugcuuua cauguguuua gucgagguua 420
aaaaaacguc uaggcccccc gaaccacggg gacgugguuu uccuuugaaa aacacgauga 480
uaaugccacc auggucuuca cacucgaaga uuucguuggg gacuggcgac agacagccgg 540
cuacaaccug gaccaagucc uugaacaggg aggugugucc aguuuguuuc agaaucucgg 600
gguguccgua acuccgaucc aaaggauugu ccugagcggu gaaaaugggc ugaagaucga 660
cauccauguc aucaucccgu augaaggucu gagcggcgac caaaugggcc agaucgaaaa 720
aauuuuuaag gugguguacc cuguggauga ucaucacuuu aaggugaucc ugcacuaugg 780
cacacuggua aucgacgggg uuacgccgaa caugaucgac uauuucggac ggccguauga 840
aggcaucgcc guguucgacg gcaaaaagau cacuguaaca gggacccugu ggaacggcaa 900
caaaauuauc gacgagcgcc ugaucaaccc cgacggcucc cugcuguucc gaguaaccau 960
caacggagug accggcuggc ggcugugcga acgcauucug gcguaaaccg acggcaaaaa 1020
aaaaaa 1026
<210> 11
<211> 228
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
aucuaaguua gguuguaaac auauuagaga cguuguucau uuggaagagu uacgcgaguc 60
uuugugugau guagcuagua accuaaauaa uugugcguau uuuucacagu uagaugaggc 120
cguugccgag guucauaaga ccgcgguagg cgguucguuu gcuuuuugua guauaauuaa 180
auauuuguca gauaagagau uguuuagaga uuuguucuuu guuugaua 228
<210> 12
<211> 121
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
uagcuuauuu ggguucuuua ucacuguccu gauuaaggcu gaaucagaac accaucacuu 60
ccacucacac gacaguagua agacacagaa cauaguaguu aauacuggaa aguaacccac 120
c 121
<210> 13
<211> 147
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
agcacaacau uucaaccaga aacacuagcc gaagcaaauc cauuccacaa gcaccuggug 60
ggaucaucuc aucaucagaa accaagagag agauuccgug uccgcuuguu guaguagauu 120
gugaggacug aggaccgaga agcagcc 147
<210> 14
<211> 1653
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60
accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120
gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180
guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240
ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300
gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360
ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420
aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480
uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540
uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600
ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660
caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720
guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780
cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840
aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900
auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960
aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020
gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080
gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140
acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200
uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260
ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320
cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380
caccccaaca ucuucgacgc uggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440
cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500
uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560
gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620
aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653
<210> 15
<211> 790
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
gggaaaaaaa ugccgucggu aucuaaguua gguuguaaac auauuagaga cguuguucau 60
uuggaagagu uacgcgaguc uuugugugau guagcuagua accuaaauaa uugugcguau 120
uuuucacagu uagaugaggc cguugccgag guucauaaga ccgcgguagg cgguucguuu 180
gcuuuuugua guauaauuaa auauuuguca gauaagagau uguuuagaga uuuguucuuu 240
guuugauagc caccaugguc uucacacucg aagauuucgu uggggacugg cgacagacag 300
ccggcuacaa ccuggaccaa guccuugaac agggaggugu guccaguuug uuucagaauc 360
ucgggguguc cguaacuccg auccaaagga uuguccugag cggugaaaau gggcugaaga 420
ucgacaucca ugucaucauc ccguaugaag gucugagcgg cgaccaaaug ggccagaucg 480
aaaaaauuuu uaagguggug uacccugugg augaucauca cuuuaaggug auccugcacu 540
auggcacacu gguaaucgac gggguuacgc cgaacaugau cgacuauuuc ggacggccgu 600
augaaggcau cgccguguuc gacggcaaaa agaucacugu aacagggacc cuguggaacg 660
gcaacaaaau uaucgacgag cgccugauca accccgacgg cucccugcug uuccgaguaa 720
ccaucaacgg agugaccggc uggcggcugu gcgaacgcau ucuggcguaa accgacggca 780
aaaaaaaaaa 790
<210> 16
<211> 1876
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
gggaaaaaaa ugccgucggu agcacaacau uucaaccaga aacacuagcc gaagcaaauc 60
cauuccacaa gcaccuggug ggaucaucuc aucaucagaa accaagagag agauuccgug 120
uccgcuuguu guaguagauu gugaggacug aggaccgaga agcagccgcc accaaugaga 180
gaccuuuuaa aaggucucua augauggagg acgccaagaa caucaagaag ggccccgccc 240
ccuucuaccc ccuggaggac ggcaccgccg gcgagcagcu gcacaaggcc augaagcggu 300
acgcccuggu gcccggcacc aucgccuuca ccgacgccca caucgaggug gacaucaccu 360
acgccgagua cuucgagaug agcgugcggc uggccgaggc caugaagcgg uacggccuga 420
acaccaacca ccggaucgug gugugcagcg agaacagccu gcaguucuuc augcccgugc 480
ugggcgcccu guucaucggc guggccgugg cccccgccaa cgacaucuac aacgagcggg 540
agcugcugaa cagcaugggc aucagccagc ccaccguggu guucgugagc aagaagggcc 600
ugcagaagau ccugaacgug cagaagaagc ugcccaucau ccagaagauc aucaucaugg 660
acagcaagac cgacuaccag ggcuuccaga gcauguacac cuucgugacc agccaccugc 720
cccccggcuu caacgaguac gacuucgugc ccgagagcuu cgaccgggac aagaccaucg 780
cccugaucau gaacagcagc ggcagcaccg gccugcccaa gggcguggcc cugccccacc 840
ggaccgccug cgugcgguuc agccacgccc gggaccccau cuucggcaac cagaucaucc 900
ccgacaccgc cauccugagc guggugcccu uccaccacgg cuucggcaug uucaccaccc 960
ugggcuaccu gaucugcggc uuccgggugg ugcugaugua ccgguucgag gaggagcugu 1020
uccugcggag ccugcaggac uacaagaucc agagcgcccu gcuggugccc acccuguuca 1080
gcuucuucgc caagagcacc cugaucgaca aguacgaccu gagcaaccug cacgagaucg 1140
ccagcggcgg cgccccccug agcaaggagg ugggcgaggc cguggccaag cgguuccacc 1200
ugcccggcau ccggcagggc uacggccuga ccgagaccac cagcgccauc cugaucaccc 1260
ccgagggcga cgacaagccc ggcgccgugg gcaagguggu gcccuucuuc gaggccaagg 1320
ugguggaccu ggacaccggc aagacccugg gcgugaacca gcggggcgag cugugcgugc 1380
ggggccccau gaucaugagc ggcuacguga acaaccccga ggccaccaac gcccugaucg 1440
acaaggacgg cuggcugcac agcggcgaca ucgccuacug ggacgaggac gagcacuucu 1500
ucaucgugga ccggcugaag agccugauca aguacaaggg cuaccaggug gcccccgccg 1560
agcuggagag cauccugcug cagcacccca acaucuucga cgccggcgug gccggccugc 1620
ccgacgacga cgccggcgag cugcccgccg ccgugguggu gcuggagcac ggcaagacca 1680
ugaccgagaa ggagaucgug gacuacgugg ccagccaggu gaccaccgcc aagaagcugc 1740
ggggcggcgu gguguucgug gacgaggugc ccaagggccu gaccggcaag cuggacgccc 1800
ggaagauccg ggagauccug aucaaggcca agaagggcgg caagaucgcc gugugaaccg 1860
acggcaaaaa aaaaaa 1876
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
tttcccctga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtcgggaaa 49
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
gggaaaaaaa tgccgtcggt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
accgacggca aaaaaaaaaa 20
<210> 20
<211> 464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 60
cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 120
ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 180
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 240
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 300
attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 360
gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 420
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taat 464
<210> 21
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 22
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 60
aatgggac 68
<210> 23
<211> 683
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
gggaaaaaaa ugccgucggu uagcuuauuu ggguucuuua ucacuguccu gauuaaggcu 60
gaaucagaac accaucacuu ccacucacac gacaguagua agacacagaa cauaguaguu 120
aauacuggaa aguaacccac cgccaccaug gucuucacac ucgaagauuu cguuggggac 180
uggcgacaga cagccggcua caaccuggac caaguccuug aacagggagg uguguccagu 240
uuguuucaga aucucggggu guccguaacu ccgauccaaa ggauuguccu gagcggugaa 300
aaugggcuga agaucgacau ccaugucauc aucccguaug aaggucugag cggcgaccaa 360
augggccaga ucgaaaaaau uuuuaaggug guguacccug uggaugauca ucacuuuaag 420
gugauccugc acuauggcac acugguaauc gacgggguua cgccgaacau gaucgacuau 480
uucggacggc cguaugaagg caucgccgug uucgacggca aaaagaucac uguaacaggg 540
acccugugga acggcaacaa aauuaucgac gagcgccuga ucaaccccga cggcucccug 600
cuguuccgag uaaccaucaa cggagugacc ggcuggcggc ugugcgaacg cauucuggcg 660
uaaaccgacg gcaaaaaaaa aaa 683
<210> 24
<211> 61
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 24
caugcucagc ggucccaagu ccgcaucaaa gccugagggc ugcaguaaag guacugagcu 60
g 61
<210> 25
<211> 76
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 25
uuauuuagcc gucuaaaguc ggcaaugaau ugagauagca cccuguaaau uuucagggug 60
uaaacaaacu aaauga 76
<210> 26
<211> 72
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 26
uuaauugccg guugccaguc cguuaaauug ugagcagucc ggccauugug ccggauuaaa 60
caaaccaauu aa 72
<210> 27
<211> 72
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 27
uuaguuaacg guugcacguc cgauaaauug ugagcagucc cggagcaauc cgggauuaaa 60
caaacuaacu aa 72
<210> 28
<211> 74
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 28
ugauuuaggc guuccaaacc gccgcaaauu gugaggacug cucgccaaaa gcgggcagua 60
aacaaguuaa auca 74
<210> 29
<211> 80
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 29
aauucuugcg guucaaaguc cgcguaaaau ccagaugaca cauucccgua auaaacggga 60
guguguaaug aacaagaauu 80
<210> 30
<211> 73
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 30
acacccaccu guuacaaguc aggacagaag cagaguaacg guugcuuacg caaccgguaa 60
ugcuacuggg ugu 73
<210> 31
<211> 74
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 31
caauaaagcg guuacaagcc cgcaaaaaua gcagaguaau gucgcgauag cgcggcauua 60
augcagcuuu auug 74
<210> 32
<211> 72
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 32
uguuuaaugc agccaugagu auuuaauacu augaagguga uaagcuccuu guaaaguaau 60
gcagaaucga ca 72
<210> 33
<211> 57
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 33
gccguaaagc cacuaugacc ggguugcaag ucccggcugc gauaggcuga gcacggu 57
<210> 34
<211> 119
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 34
guucuaaugc agccagcacg acuuugucau agauaaaaua ucauuaauac acuauuuaca 60
cagauguaug cgauuacuag ugcugggagu ccuaagccuc cauaaaugca gaagggaac 119
<210> 35
<211> 93
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 35
ucuguaaccc caccaccgug gacauccugg cagggauaau ggccaggaug aucauggugg 60
agguccaaag uccucaaaag aggggauggc aga 93
<210> 36
<211> 84
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 36
acaauaaugc ggccucgcua ccaauacgca uuuauuagua uugguaacgu gacaguccca 60
agccuguaaa acgcagaggg uugu 84
<210> 37
<211> 57
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 37
gucguaaugc agccguugcc acgugccaag ucguggauua gaaaugcaga ggcggaa 57
<210> 38
<211> 61
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 38
gguguaaugc gacucgcuca cagagcgaca gguucacagu ccuacaaacg cagaugacac 60
c 61
<210> 39
<211> 97
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 39
agcuuaauac agguagauaa gcaagcaagg ugcggcuauc uacacggucc caacuccgua 60
aagguuagag ugacaacuaa ucgaaguaga gggagcu 97
<210> 40
<211> 52
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 40
uaaauaaugu cgccaaugga gguaucaagc ccucauaaag acagagauaa aa 52
<210> 41
<211> 73
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 41
acguuaaugu ggcuguaugu gugggugcac acacauacac uagucccaag ccuagguaaa 60
cacagaggga uug 73
<210> 42
<211> 62
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 42
aaaguaaugc aacuacaaga aauuguaucg gugacaaguc cgagauaaau gcagagucau 60
uu 62
<210> 43
<211> 56
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 43
ucuguaauga ugccgauggc gguugcaagc ccgcaggaag aaacucagag cacaga 56
<210> 44
<211> 55
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 44
acuauaaucu ugccaucguc aguuccaagc cugagugaga aaaagagagg auagu 55
<210> 45
<211> 58
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 45
acucuaaccc agcggcaauc uuuugcccgu guccgaagcc acuaaugggg acgggagu 58
<210> 46
<211> 55
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 46
ccgcuaacca ugccguggcc agucccaagc cuggauguga aaaugggagg ggcgg 55
<210> 47
<211> 60
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 47
uuuuuaauga agccacagug aucacuguga ggguccuaag ccccuaauuc agaagggaaa 60
<210> 48
<211> 68
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 48
uguguaaugc uacuaugaua gcacauugcg aaucauacgg guugcaaguc ccucaagcag 60
agcacacg 68
<210> 49
<211> 51
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 49
uuuuuaaccc agccagagac ggucacaagc ccgugaaaug gggaguggaa a 51
<210> 50
<211> 58
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 50
gcucuaaugu ggccacccga cagggugugu guuucaagcc accaacacag agaagagc 58
<210> 51
<211> 83
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 51
gguguaacac ggcuauaguc aggcauuaca agauuaaguc cugcuauaaa ggucuaaagc 60
ccuuguaaac aguggauagc acu 83
<210> 52
<211> 57
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 52
uguguaaugc gagcauugua uggucacaac uccauaauua aaaacgcaga gugcaca 57
<210> 53
<211> 56
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 53
gcuuuaacac agccaaagaa gguuccaagc ccuuuaguga aauuguggag gaaagc 56
<210> 54
<211> 67
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 54
aaaguaaugc agccgcccgc cgcgcgcggg gacgucggua gcaagcccgu guaaugcaga 60
guuuucu 67
<210> 55
<211> 61
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 55
gcuuuaaugc ggcccguuuu gauacggcag guuacaagcc cugguaaacg cagaguagag 60
c 61
<210> 56
<211> 69
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 56
uucguaaugc ggccgugcug guaacguucc agcgcgacgg ucccaagccc gaaaaacgca 60
gagggagaa 69
<210> 57
<211> 80
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 57
ccgguaaugc ggcacgcgug gucacaagcc caccgcccuu cguugagcgg aaacguucac 60
guugggacgc agagugacgg 80
<210> 58
<211> 53
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 58
ggcuuaacuc agccaacggc gguccaaagc ccgcguguaa ugaggaugga gcc 53
<210> 59
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 59
agcguaaugu agccuagucc gacuuuggac uagaggguuc acagccccuu uaauacagau 60
gacgca 66
<210> 60
<211> 81
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 60
gguguaaagc uacuaaacag gcaauacaaa aauaaguccu guuuaaaggu ucaaaguccu 60
uguaaaaaag cugaugacac g 81
<210> 61
<211> 62
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 61
ccucuaaugc ggcccggcau ggugccggac ggugguaagc ccgugcaaac gcagaaccua 60
gg 62
<210> 62
<211> 52
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 62
cucguaaugc ggcgaaccgg uggcaagccc ggugguggac gcagagccag ag 52
<210> 63
<211> 53
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 63
uccucaaugc ggcaagccgg ugacaagccc ggcgguagac gcagagucaa gga 53
<210> 64
<211> 62
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 64
uuuguaaugu ggccuaaauu uuuauuuaga acguuccaag ccguuaaaac acagaggaca 60
aa 62
<210> 65
<211> 55
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 65
cucuuaaagu ugccuaagaa cguugcaagc cguuuuacga aaaacugagc aagaa 55
<210> 66
<211> 71
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 66
auuguaaugc agcauauaga uguauuaaca ccuauauaga guucaaagcc ucuacaaaug 60
cagaugacaa u 71
<210> 67
<211> 72
<212> RNA
<213> 豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）
<400> 67
uuuuuaauca uaccaguagu cuaauuuuua gauuacugac aguccuaagu cuguaaaaaa 60
ugagaaggga aa 72
<210> 68
<211> 106
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 68
aacucagcua gggagaguau aacauucaug uugacgagac cuagacgaaa cacagaggaa 60
aauuauuaau cacuggauag uauuaguaau gacucugugu ccauga 106
<210> 69
<211> 77
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 69
uugucagcua aggagacaga aaaauuaucu acugaugaga cuuagccgaa accaccucuu 60
uuaggggugg ucuagau 77
<210> 70
<211> 85
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 70
aagucagcca ggagacuaua aaauucauac ugaugagacu ggacgaaaua ccuaguaaca 60
guuguacguu auuagguauc uauga 85
<210> 71
<211> 119
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 71
aacucagcua gggagaguag cgagcauuac guaauacuac guauuacucc aauaacauug 60
ucacugauga gaccuagacg aaacuacggu aaacauuugc aucauacugu agucugaua 119
<210> 72
<211> 76
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 72
aagacagccu aggagucuau aaaauaugug cugacgagac uaggacgaaa cuauccucag 60
uugaggauag uccacu 76
<210> 73
<211> 73
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 73
aagacagucu aggagucuau aaaauuguua cugaagagac uagaacgaaa cuucuuuaau 60
uagaagucua aca 73
<210> 74
<211> 63
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 74
aacucaacca ggagaguaua aaauguuuac ugaugagacu ggacgaaacc aauagguuua 60
aac 63
<210> 75
<211> 74
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 75
aagacaucca ggagucuaua aaauagucac ugaugagacu ggacgaaacc ucugcuauau 60
guagaggucu gauu 74
<210> 76
<211> 163
<212> RNA
<213> 韦荣氏球菌属物种（Veillonella sp.）
<400> 76
auugccugug aagguagugc auauuuuuau uauuagauca ucagaagaug acaagcaugu 60
ggggcguaag uaguauuuuu augcgggaga agaagaaugg caauuguucu aauuaguacu 120
gauaauugca aauacuauga ucgugcggac guuaaaauca ugc 163
<210> 77
<211> 176
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 77
uuauaauguu agcauaaaua caauaaaguu aaugcaguag aaauacugcg cucuuuaagg 60
ugagaauccu ugacaagcau guggggcuua uaucuauuca uacagagcaa guacguacgg 120
gaaagcuuaa aauacucauc uguaaaauag uauuagugca gacuuuaaaa ucaugc 176
<210> 78
<211> 128
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 78
acagaaaaag aagcuaaaga agcaagaaag uauuacugug agaaucagua auaagcaugu 60
ggggcuuaug ucuuaucaaa aggguggcca acuuuuagau agcauuagug cggacguuaa 120
aaucaugc 128
<210> 79
<211> 157
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 79
acauuuugug guuuuaaggg uuaauccuua agguugauaa accuugacaa gccuaugggg 60
cuacuauagu auucucuuau uacggguaag aguaucaagc auaagcgaaa uuccgugcuu 120
auguaaugcu aaguuagugc agacuuaaaa auuaggc 157
<210> 80
<211> 170
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 80
cuuguucgug agaauaggug caauugccua aaugaauguc uucagaagau gacaaaccug 60
uggggcguaa guaauaaaga gucugaaaga uugcagauaa gaguaugcac uuauuggcaa 120
uaugcauacc agaauaauuu auuaugaucg ugcggacguu aaaaucaggu 170
<210> 81
<211> 159
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 81
ucagucugug aagauagagu auacguccuc agaagaugac aaaccugugg ggcguaagua 60
aaugcauauc guauauuauu cccuugaaua cggcaauagc ggguaauauc cgagauacuc 120
guauuugugu uuauaaucgu gcagacguua aaaucaggu 159
<210> 82
<211> 78
<212> RNA
<213> 达马拉鼹鼠（Fukomys damarensis）
<400> 82
ggaggauaac agggggccac agcacaagcg uucacgucgc agccccuguc ggauucugag 60
gaaucugcga auucugca 78
<210> 83
<211> 78
<212> RNA
<213> 欧亚野猪（Sus scrofa）
<400> 83
agaggauaac uggcagccac aguagaagca uucacauugu gguccauguc agauucuggu 60
gaauuugcaa auucugcu 78
<210> 84
<211> 78
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 84
uuuaugucac ugggggccau agcggaagug uucauaucau ggccccaauc ggauuccaac 60
aaaucugaga auucugcu 78
<210> 85
<211> 77
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 85
ggguacuauu gggggaccgu agcaggagcg uucacaucgc ggucccuguc agacuauuac 60
agucugcgaa uccugcu 77
<210> 86
<211> 83
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 86
auugcagcuu agggggccau agcagaagca uucauguugc agccccuguc agguaauagc 60
ugguaauacc ugcuaauucu gau 83
<210> 87
<211> 79
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 87
auuguuuauu uugggggcca uagcagaagu guucaugucg cggccccugu cagauucuua 60
ugaaucugca aauucugcu 79
<210> 88
<211> 78
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 88
uuacccacaa cuggggccau agcagaagcg uucaugucgc ggccccuguc auauucuuac 60
aaaccuguga auucugcu 78
<210> 89
<211> 75
<212> RNA
<213> 佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma floridae）
<400> 89
cgccacuaca ugggggccac agaaggagcg uucacgucgc ggucccuguc agguguucua 60
ccugcggauc cuucu 75
<210> 90
<211> 83
<212> RNA
<213> 扬子鳄（Alligator sinensis）
<400> 90
agcaguuggc uaggggucau aguagaagug uucaugccac aaccccuguc agguaauacc 60
uaguaauacc ugcaaauucu gcu 83
<210> 91
<211> 81
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 91
agaggucaca aguccgaggc cgcggcagaa gugcucacgg cacgggcccu gucagauucc 60
agcgaaucug caaauucugc u 81
<210> 92
<211> 77
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 92
cagggguugc augaggccau agcaaaagca cucacagugc ugcccuguca gauuccaaca 60
aaucugcaaa uucugcu 77
<210> 93
<211> 83
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 93
aaugcuuuga ugggggucau agcagaagca uuaauguugu gaccccuguc agguaauacc 60
ugauaauacc ugugaauucu gcu 83
<210> 94
<211> 78
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 94
ugcacaucua ugggggccuu agcagaagca uucacgucgc agccccuguc ggauucuuaa 60
gaauuugcga auucugcu 78
<210> 95
<211> 78
<212> RNA
<213> 扬子鳄（Alligator sinensis）
<400> 95
caauuaagau gcagggccac agcagacaug uuuauguugu ggucccuguc ggauucuaau 60
gaaucugaga auucugcu 78
<210> 96
<211> 75
<212> RNA
<213> 紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）
<400> 96
acaguaaaaa aguggggcca uugaaggagc guucacgucg uggucccugu cagaugaaaa 60
ucugcgaauc cuuca 75
<210> 97
<211> 76
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 97
aguugcuaua acggccacaa cagaaauguu cacaucgugg ccccggucag auuccagcaa 60
aucugcaaau ucugcu 76
<210> 98
<211> 81
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 98
agagguuaca agugcaaggc cagagcagaa guguucacag cauagcccuu gucagauacc 60
aaugaaucug ugaauucugc u 81
<210> 99
<211> 78
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 99
agcuugcgaa ugggggccau agcagaagag uucacgucgc ggccccuguc agaguucuac 60
gaauuugcga auucugcu 78
<210> 100
<211> 78
<212> RNA
<213> 九带犰狳（Dasypus novemcinctus）
<400> 100
auagaagaua auggggccac agcagaagca uucauguugc agcccuugug agauucaagu 60
gaaucuguga auucugcu 78
<210> 101
<211> 104
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 101
uacccagcaa auccuauccc uaccuccuua agguacuggc ugaaguacga guaacuuuag 60
gaaagaucgg guaaccaacc ccgguccaau ucugacugag aagg 104
<210> 102
<211> 96
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 102
cacuggcaaa auccgauccc ugccuccacg uggcgcugcu ggaugucggu uuuggugagg 60
cuuaucaccu cagccaagac cuaaccaaag ggacgg 96
<210> 103
<211> 116
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 103
uucccaacaa cuccuauccc uaccuccucg ugacacucac uggaccgcca gcuacuuuag 60
acaagaucgg auaacccacc cugacggaua auuuggccgu uggcugacag ggcagg 116
<210> 104
<211> 133
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 104
ugcucagcaa cuccuauccc uaccuccucg ugguacuggu acgaguaugg gugguaccgg 60
uacgaguaac cuuggggaag aucggguaac caaucccggg gggggaacuu uggucguaug 120
cagacaggga agg 133
<210> 105
<211> 123
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 105
uguccaguaa cuccuauccc uaccuccccg uggugccgcc ugggguacga guaaucguag 60
gcaacauugg guaaccaacc cugacaggga aggcuccucu cuucuguaug cugacaggga 120
agg 123
<210> 106
<211> 109
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 106
ugcccagcaa cucuuauccc uacuuccucg ugguaccagc cggaaacuac gagaaaccua 60
agggaagauc ggguaaccac aaguguggcg ggggcgcaga gggggggag 109
<210> 107
<211> 92
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 107
ugcccagcac cuccuauccc ugccuccacg cgguagggaa gaucggguaa ccaaccccgg 60
ugagaaguuu ggucguaggc ugacagggaa gg 92
<210> 108
<211> 106
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 108
ugcacagcaa cuccuauccc uaucuccucg cgguacugac cgagguacga gcaaccuuag 60
ggaagaucgg guucugcaaa ccuagagcgu cuguacaugg aguagg 106
<210> 109
<211> 110
<212> RNA
<213> 中华按蚊（Anopheles sinensis）
<400> 109
uauucuugaa cuccgauccc aaccuccucg uggugcuagc ugaaguauga ucuuggaacu 60
uauuaaguuc uucagcacau ugugcaacga ucguauacca auagggacgg 110
<210> 110
<211> 135
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 110
ugccuagcaa cuccuauccc uaccucuuca ugguacugcc cgggguacug gccggaguau 60
uagcaacuca agcaauuaga gaagaucggg uaacuaaccc cggucucaac uuugaucgua 120
ugcugauaug gaagg 135
<210> 111
<211> 99
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 111
ugcccagcaa cuccaauccc uacauccgcg agguaccggu uguagacuac gagcaccgag 60
caaccggugg uaacuuuggu cguauucuga cagggaagg 99
<210> 112
<211> 76
<212> RNA
<213> 长须白蛉（Lutzomyia longipalpis）
<400> 112
gguaauccaa cuccuacuuc aaccuccacg uggugacacc ugggcaccca auuuauuggg 60
uggcuaacug aagagg 76
<210> 113
<211> 113
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 113
ugcucagcag cuccuaucuc uaccucgucg cauuacuggc cgggguccga gcaaccuuau 60
ggaaaaucgc cccaaccccg agggaaacuu uggucguaug cugacaggga agg 113
<210> 114
<211> 64
<212> RNA
<213> 麻蝇金小蜂（Trichomalopsis sarcophagae）
<400> 114
ggcguacaaa auccuaucgu gcaaccuccc cgugguguau gccggguuau gcuaaugcgg 60
aagg 64
<210> 115
<211> 76
<212> RNA
<213> 豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）
<400> 115
ggucggugaa guccuacccc caccaccacg uggugccgac uggaaacgga acuccgguuc 60
cagccaacgg gggagg 76
<210> 116
<211> 99
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 116
ugcccagcaa cuccuauccc uaccuccucg cgguaccggc cggaaacuau aaggcaaucu 60
agcgcucauc acccuucucu cucaagcaaa cacagaaga 99
<210> 117
<211> 95
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 117
cauuggcaaa auccuauucc uaccuccucg uggugcuggu ggaugagggc augcugaguc 60
ucacuagcuc aguaugucuu aacuaaaagg gaagg 95
<210> 118
<211> 95
<212> RNA
<213> 眼斑雀鳝（Lepisosteus oculatus）
<400> 118
ggcuggcaaa auccuaucac caccuccucg cggugccagg uggauacggc uggauacaac 60
uggauacaac gacucguugg aacuaacggu gaagg 95
<210> 119
<211> 96
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 119
uggccagcac cucccauccc caccuccuug ugguacuggc caggguacga gcaaccaauc 60
ccgguggaca cucuugucgu augcugacag ggaaag 96
<210> 120
<211> 126
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 120
ugcccagcaa cucuuauccc uaccuccucu uacuuccucg ugguaauggc caggguacga 60
gcaaccuuag ggaagaucgg auaaccaacc cuggugagag cucucgucgu augcuggcag 120
ggaagg 126
<210> 121
<211> 98
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 121
uaaccaggaa cuccuauccc uaccuccccg cgguacugac cgggauacga ucagucccaa 60
ucaccguggg aacuuugguc guaugcugac agggaagg 98
<210> 122
<211> 88
<212> RNA
<213> 法老按蚊（Anopheles farauti）
<400> 122
ggccggcaaa gcccgacccc caccuccucg uggugccggc uggaugcaua agacccuacc 60
cgucgugggu ugcagccaac gggggcgg 88
<210> 123
<211> 89
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 123
ugccaagaaa cuccucccca accuccucgu gguacuggcc gggcuacgag uaaccuugga 60
gaacuuuagu cguaugauga caagaaagg 89
<210> 124
<211> 97
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 124
ugcccagcaa cucuuauccc uaccuccacg ugguaccgca cagaaaaaaa aauauucaug 60
uaaaauucag cgacaaauca ugcacauaaa gggaaug 97
<210> 125
<211> 130
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 125
ugcucaguaa cuccuauccc ugaccucccc gaggugccgg cuggggugcg aacaacccaa 60
agguugaaag gcgaauucac guagccuaau gagcucaaag cgaacucagg ucgcaugcug 120
acagggaagg 130
<210> 126
<211> 80
<212> RNA
<213> 长红锥蝽（Rhodnius prolixus）
<400> 126
ugcucgguaa aaucugaucu cuaccuccuu gugguccuac caggaccuuu uaccuacuaa 60
gaauaggcca acagagacgg 80
<210> 127
<211> 102
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 127
ugcccagcaa caccaacccc uaccuccgcg gggcaccagc cggacugcau gcggcuguau 60
gcggacuaca ugggaccuuu ggucguaggc ugacagggaa gg 102
<210> 128
<211> 109
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 128
ugcccagcaa cuccuauccc uaccuccucg ugguaccggc cggaaacuau gauuagcauc 60
acggggauca ucaagaauaa uuucggaccg cacaagcuaa augggugag 109
<210> 129
<211> 97
<212> RNA
<213> 淡色按蚊（Anopheles albimanus）
<400> 129
cgucucggaa caccuaucuc uaccuccacg uggugccugc uggauuaugg ugcaugcgac 60
gguacagcuc acaugaacca uauaccgaca gagaagg 97
<210> 130
<211> 81
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 130
ugcccagcaa cuccuauccc uaccuccucg ugguacuggu uggaaacuac gcuggaauca 60
acguccgagu uccagggaag g 81
<210> 131
<211> 82
<212> RNA
<213> 淡色按蚊（Anopheles albimanus）
<400> 131
aacucggaac uccuauccuc accuccacgu ggugccggcu ggaauaugau uguauuaguc 60
uaucauauac agacgaggaa gg 82
<210> 132
<211> 108
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 132
ugcccagcaa cuccuauccc uaccuccucg ugguacuggc cgggguacga guuguugauc 60
uaagcaaccg gaaguccaug uccaugauca aagcacccau agaggaag 108
<210> 133
<211> 94
<212> RNA
<213> 斯氏按蚊（Anopheles stephensi）
<400> 133
ugcuuuagaa cuccgaucuc aaaccuccuc guggugcugg cuggaggaua auuguugcac 60
auuuuacaca acaauuauuc acugauugag acgg 94
<210> 134
<211> 94
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 134
agcccagcaa cuccuauccc uaccuccucg ugguacuggc cggcugcgaa aggccuggaa 60
aaguuucaga aaauggaguc gcuaaaaccg aagg 94
<210> 135
<211> 120
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 135
ugcccaauaa uuccuauccc uaucucccca cgaugccgcc cagaguacga guaaucaucu 60
uuccgaucuu uuccaguaau caaccccggu gagaccuugg ucguaugcug acaagaaagg 120
<210> 136
<211> 134
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 136
ugcccagcaa cuccuauccc uaccuccucg ugguacuggc cgggguacga guaaccuugg 60
ggaaguagua ggaaguagua ggaaggagua accaaccccc ggugggaacu uuggucguau 120
gcugacagga aagg 134
<210> 137
<211> 80
<212> RNA
<213> 赤拟谷盗（Tribolium castaneum）
<400> 137
uccuggcaaa aaugcucuaa accuccacgu gguucuugcu ggacaaauua guuauuagcu 60
aauuugacca auuagagcaa 80
<210> 138
<211> 89
<212> RNA
<213> 法老按蚊（Anopheles farauti）
<400> 138
gccuuuggaa cuccguuuuc uaaccuccac guggugcugg cuggaauaug gucuuuccuu 60
uauggucgau cauauacaaa uagaaacgg 89
<210> 139
<211> 105
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 139
uguucaucaa cuccuauccc uaccuccucg cgguacuguc cgggguacga gcaaccuuag 60
agaagauccc gcaacggcuu cguggcgcga gccgagaugu gcagg 105
<210> 140
<211> 104
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 140
aacccaguaa cuccgauccc uuccuucacg cggcgccggc cggggugcga ccauccgaaa 60
gguagauuaa gcuugaagcu uaggucguau guugacaggg aagg 104
<210> 141
<211> 119
<212> RNA
<213> 尖音库蚊（Culex pipiens）
<400> 141
uguucaguaa cuccgauacc cuggccuccc cgcggcgcug gccgggauac uaguaaccau 60
uggagagauc ggguaaccaa ccccgguggg aacuauggua guaugcugac aggguaagg 119
<210> 142
<211> 83
<212> RNA
<213> 表皮按蚊（Anopheles epiroticus）
<400> 142
ggccgacaaa acccucuccc aaccuccacg uggugucggc uggaaagugc cucauguaau 60
guugcauuua ccaacuggga agg 83
<210> 143
<211> 104
<212> RNA
<213> 淡色按蚊（Anopheles albimanus）
<400> 143
aaucucggaa cuccuauccc caccuccucg uggugccggc uggaauaugg uagaugugca 60
ugguauccga ccaauaucau cuuaccauau acagacgggg aagg 104
<210> 144
<211> 92
<212> RNA
<213> 埃及伊蚊（Aedes aegypti）
<400> 144
ugccaagcau cuccuauccc uaccaucucg ugguacuggc cgugguacga gccucccaga 60
ugggaacgau ggucguaugg ugacagcgaa gg 92
<210> 145
<211> 55
<212> RNA
<213> 白符跳（Folsomia candida）
<400> 145
aacaaauaua cgggugcccc cguacugaug aggccauggc aggccgaaau uugug 55
<210> 146
<211> 55
<212> RNA
<213> 温氏类芽孢杆菌（Paenibacillus wynnii）
<400> 146
cuugcuuaug gacucaguuc acugacgagc ucgugagauu cgagcgaaaa guauc 55
<210> 147
<211> 60
<212> RNA
<213> 双孢蘑菇（Agaricus bisporus）
<400> 147
gucggauuag ggcagcgguu aagcccucug augagccccu ucgcaagggc gaaauccgca 60
<210> 148
<211> 58
<212> RNA
<213> 巨桉（Eucalyptus grandis）
<400> 148
aauuaguugg gaguugaugc ugcucuccug augaggccau agcaggccga aaccaguu 58
<210> 149
<211> 58
<212> RNA
<213> 巨桉（Eucalyptus grandis）
<400> 149
aauugguugg gagcuaaugc uauucuccug acgaggccau ggcaggcuga aacuauuu 58
<210> 150
<211> 75
<212> RNA
<213> laboriosa回条蜂（Habropoda laboriosa）
<400> 150
guggcgucug gggcauggac cggcuacauc agccucacug augagucugu ggucggucuc 60
gagacgaaac gcuuc 75
<210> 151
<211> 57
<212> RNA
<213> 脱硫球茎菌属物种（Desulfobulbus sp.）
<400> 151
gugaugucug cggcugaauc ugccgcacug acgagcccau ccagggcgaa acaucca 57
<210> 152
<211> 58
<212> RNA
<213> 长角长虫兆（Orchesella cincta）
<400> 152
gacgcgucua gaagugaagc ccuucuacug augagguuau ggcagaccga aacgcaaa 58
<210> 153
<211> 58
<212> RNA
<213> 向日葵（Helianthus annuus）
<400> 153
cacuaguuga gaguugucgc ugguuuccug augaguccaa ggcaagacaa aaccagua 58
<210> 154
<211> 56
<212> RNA
<213> 柠檬胞菌属物种（Citreicella sp.）
<400> 154
cccagguacc cggauguguu uuccgggcug augaguccgu gaggacgaaa ccuggg 56
<210> 155
<211> 67
<212> RNA
<213> 绿猴（Chlorocebus sabaeus）
<400> 155
auucagucag gaguuuuuuc ugcugaugag uuccuggucu ugcuaacuuc aaagaacgaa 60
gcugcag 67
<210> 156
<211> 60
<212> RNA
<213> 松生拟层孔菌（Fomitopsis pinicola）
<400> 156
ggacggucgg ggcagcgggu aagcccccug acgaggacuu ucgcaggucc gaaaccgcug 60
<210> 157
<211> 75
<212> RNA
<213> 麻蝇金小蜂（Trichomalopsis sarcophagae）
<400> 157
ugcgcgucug aggcaggguu accaucggau gccuuacuga cgaguccacg augguaaccu 60
gggacgaaac gcaac 75
<210> 158
<211> 60
<212> RNA
<213> "葡萄（Vitis vinifera）,"
<400> 158
aacuggucaa gagcuggagu cauuccccug augaauccau gaaucaggau gaaaccaguu 60
<210> 159
<211> 57
<212> RNA
<213> 乌尔菌门暂定种（Candidatus Uhrbacteria）
<400> 159
uuuuugucuu uagauacagu aucuaaacug augaguccug uaaggacgaa acaaaag 57
<210> 160
<211> 61
<212> RNA
<213> 亚洲柑橘（Asian citrus）
<400> 160
aacgcgucuu aggcugcucu caggugcuag cugaugaguu ccaacaagaa cgaaacgcgu 60
c 61
<210> 161
<211> 79
<212> RNA
<213> 杜隧蜂（Dufourea novaeangliae）
<400> 161
caggcgucug ggguuggggu cgucuaccgu cagucccacu gacgaaucuu gguugacgau 60
ucucgagacg aaacgccau 79
<210> 162
<211> 58
<212> RNA
<213> 巨桉（Eucalyptus grandis）
<400> 162
aacuggucag gagcuuaugc uaccauccua augaggccau gguaggccga aaccaguu 58
<210> 163
<211> 58
<212> RNA
<213> 克莱门柚（Citrus clementina）
<400> 163
cacugguugg gaacugaagc cguucuccug acgagcccac gguagggcga aaccaguc 58
<210> 164
<211> 56
<212> RNA
<213> 卡氏棘口吸虫（Echinostoma caproni）
<400> 164
cuggagugau auuugcugau auuuacugau gagcuccaau aagagcgaaa cucgag 56
<210> 165
<211> 58
<212> RNA
<213> "葡萄（Vitis vinifera）,"
<400> 165
aacuaguugg gagcuagagc cauuccccuu augaguccau ggcaagacga aaccaguc 58
<210> 166
<211> 68
<212> RNA
<213> 乌尔菌门暂定种（Candidatus Uhrbacteria）
<400> 166
accacuucug ccguugagua cggcacugau gaguccauuc gauuguaaac agcaggacga 60
aaaguaaa 68
<210> 167
<211> 55
<212> RNA
<213> Taylorbacteria暂定种（Candidatus Taylorbacteria）
<400> 167
cguugcucuc ggaaugugua uuccgacuga ugaguccaaa aggacgaaag cagaa 55
<210> 168
<211> 56
<212> RNA
<213> 杂食菌门暂定种（Candidatus Omnitrophica）
<400> 168
cggcuguuuc ccgauguguu aucgggacug augaguccga aaggacgaaa cagcgu 56
<210> 169
<211> 58
<212> RNA
<213> 根瘤菌（Rhizobium）噬菌体
<400> 169
aauagguacg gggcugaugc ugccccgcug augaggccaa gcuauggccg aaaccauc 58
<210> 170
<211> 58
<212> RNA
<213> 巨桉（Eucalyptus grandis）
<400> 170
aacuggucga gaguugaugu cgcucucuug acgaggccau ggcaggucga aaccaauu 58
<210> 171
<211> 58
<212> RNA
<213> 双班蛸（Octopus bimaculoides）
<400> 171
aaugagucaa gugacgcgaa caucucugau gagacccuca aaaaggucga aauucgau 58
<210> 172
<211> 57
<212> RNA
<213> 海水派金虫（Perkinsus marinus）
<400> 172
ggugugucug gcgccguuag ccacugauga gucccugugg ugaggacgaa acacuac 57
<210> 173
<211> 56
<212> RNA
<213> cornetzi皱切叶蚁（Trachymyrmex cornetzi）
<400> 173
uauaugucag uuugcguuug cucugaggag ggcucaggaa ugagccgaaa caugua 56
<210> 174
<211> 55
<212> RNA
<213> 俭菌总门（Parcubacteria）（乔凡诺尼菌门（Giovannonibacteria））
<400> 174
ccacuguccu agagugugua cucuagcuga ugagucggaa acgacgaaac agaaa 55
<210> 175
<211> 53
<212> RNA
<213> 双班蛸（Octopus bimaculoides）
<400> 175
ccgaagucga gcugucuuaa uugaugaggc gaaggaaaau gccgaaacua cgc 53
<210> 176
<211> 74
<212> RNA
<213> 杜隧蜂（Dufourea novaeangliae）
<400> 176
cccgcgucua aggcaggguc ugcuagaaaa gccuuacuga cgaguccacu agcaugccca 60
ggacgaaacg cucc 74
<210> 177
<211> 60
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 177
uggauguaua uucaugauau aggauugcug augaguccca aagauaggac gaaacaaccg 60
<210> 178
<211> 55
<212> RNA
<213> 糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）
<400> 178
uuuguguugg gaggugugug ccucuccuga ugaauccaaa aggacgaaac acauu 55
<210> 179
<211> 99
<212> RNA
<213> 四条无刺蜂（Melipona quadrifasciata）
<400> 179
agggcgucug ggguaggagu cacugccauc aaaacacccc ccuccccccc ccccccccca 60
cugaugaguc uaggcagcga cuccgagacg aaacgcauc 99
<210> 180
<211> 58
<212> RNA
<213> 牵牛花（Ipomoea nil）
<400> 180
aacuagucgg gagcuauuga cguuccccug augagcccau gacgggacaa aaccaguu 58
<210> 181
<211> 52
<212> RNA
<213> 粗环点革菌（Punctularia strigosozonata）
<400> 181
gcucggucau cucgggcaga acccugauga gccuauaaag gcgaaacagg gc 52
<210> 182
<211> 62
<212> RNA
<213> 四条无刺蜂（Melipona quadrifasciata）
<400> 182
caagcguuuu ggggccagcc ccacugauga gucuaggcag cgacuccaag acgaaacgca 60
uc 62
<210> 183
<211> 55
<212> RNA
<213> 奧布分支杆菌（Mycobacterium obuense）
<400> 183
cugcucucca gggucacccu gcugacgagc ccgugaaagu cgggcgaaag agccc 55
<210> 184
<211> 74
<212> RNA
<213> 乔凡诺尼菌门暂定种（Candidatus Giovannonibacteria）
<400> 184
gaacgcucgc gagaugugug ucucgccuga ugagcccgcc aaaggcgggc aaguccaaaa 60
ggacgaaagc gugu 74
<210> 185
<211> 54
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<400> 185
aaugcaucca guacauccac uggcugacga guccgagaua agacgaaaug caug 54
<210> 186
<211> 59
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 186
gacaugucug ggaugcaggu acauccaacu gacgaguccc aaauacgacg aaacaugca 59
<210> 187
<211> 69
<212> RNA
<213> 白纹伊蚊（Aedes albopictus）
<400> 187
ucaaagucuu gacgaaaggc caacgggcca aaacgucaac ugaugagucc uugauggacg 60
aaacuuugu 69
<210> 188
<211> 55
<212> RNA
<213> Lloydbacteria细菌暂定种（Candidatus Lloydbacteria）
<400> 188
uugcuguaga gaagugcaug cuucuccuga cgagucggaa acgacgaaac agcac 55
<210> 189
<211> 110
<212> RNA
<213> 细菌SM23_31
<400> 189
agcagagacc gggaagggau ucucuuauua ugaaaauauu gaaaauagca ugaaacacua 60
aaccccgggg auccucccgg uaaugcagcc guagccgguc acaagcccgg 110
<210> 190
<211> 58
<212> RNA
<213> 热纤梭菌（Clostridium thermocellum）
<400> 190
uccagaguga cggaacgacu cuuccuccgg uaaugcggug gcccggucac aaguccgg 58
<210> 191
<211> 60
<212> RNA
<213> 候选分裂（Candidate division）
<400> 191
cgcagagagg ggcuaggcca uaggcuuagc ucuaaugcgg cauaccgguc ucaagcccgg 60
<210> 192
<211> 51
<212> RNA
<213> 黑冠鹤（Balearica pavonina）
<400> 192
ugcagaugga auaauuuaau gcaacuguag uuacucaggu uccaaguccu g 51
<210> 193
<211> 63
<212> RNA
<213> 螺旋体（Spirochaetes）细菌
<400> 193
ugcagagggg gccgggacgc gcgaagcgac ucggccuaau gcacaggccg gucccaaguc 60
cgg 63
<210> 194
<211> 57
<212> RNA
<213> 天门冬型梭菌（Clostridium asparagiforme）
<400> 194
cgcagagcaa cggggcagca augccccggu aaugcggggg aacgguugca accccgu 57
<210> 195
<211> 65
<212> RNA
<213> 亨氏[梭菌]（[Clostridium] hungatei）
<400> 195
ugcagauggg cggccuuaug gccguuaaug cgcucccgga uaccgggaac ccguccaaag 60
ccggg 65
<210> 196
<211> 60
<212> RNA
<213> 紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）
<400> 196
agggagggag ggguauugga accaaaccuc uuaaccaacc gucgcccguc ccaagucggg 60
<210> 197
<211> 56
<212> RNA
<213> 脱硫芽孢弯曲菌属物种（Desulfosporosinus sp.）
<400> 197
cgcagaguga ccgcccaucg cgggcgggua augcggcuag ccggucacaa gcccgg 56
<210> 198
<211> 70
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 198
cgcagagcag cggagaaacu gacuucguua augcggccug acguuuuucg ucugacgguu 60
gcaagcccgc 70
<210> 199
<211> 65
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 199
ugcagauggg cgccuucggg cguuaaugcg cugaaaccaa agguuccacc agguccaaag 60
uccug 65
<210> 200
<211> 59
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 200
ggugagcggc cccgcccgua aggacgggga cuaaaccaca aguccggucg caaguccgg 59
<210> 201
<211> 71
<212> RNA
<213> 瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）细菌
<400> 201
ugcagaguga gaaagcucau uaccguuugg ugaugggcuu uuguaaugca gagcgccggu 60
cacaaucccg g 71
<210> 202
<211> 56
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 202
cgcagaugac ggugccacca cggcaccgua augcgacaag cagguuccaa ucccug 56
<210> 203
<211> 72
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 203
ugaugagggg cggggggcca gagacccccc guuaaaucgc caugucaacc gacaugcugg 60
ucccaagccc ag 72
<210> 204
<211> 61
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 204
agugagggga ucgaucuaaa cuacuggcuu guuucgugca agucaccggu cccaaguccg 60
g 61
<210> 205
<211> 65
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 205
cgcagagcac gcccuacggg gcguaaugcg gccucaccac uggggugagc caguugcaag 60
ccugg 65
<210> 206
<211> 63
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 206
cgcagagggc agcccuucgg ggcuguaaug cacuccccac cuggggagcg gucccaaguc 60
cgc 63
<210> 207
<211> 64
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 207
cgcagaguga cgggaggguu uaucggcccu cccgguaaug cggcagcccg guucgcaagc 60
ccgg 64
<210> 208
<211> 55
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 208
cgcagaguga gccgggaaac cggcuuaaug cgggcagagg cggucacaac cccgc 55
<210> 209
<211> 219
<212> RNA
<213> 纳氏虫属物种（Naegleria sp.）
<400> 209
cuguuauugg aauuugauag uugugcgaug ggguucauac cuuaacugcc aaaacgggac 60
cccuuuuggg guauaaaucu uguaaaagga uuauauuccg uacuaaggau auuugauaau 120
auccggaaug ucuagagacu acacggcaag ccaauuggug guaugaaugg auagucccua 180
guuuuuuuua ccaucuaggu aucccauaca aaaugguaa 219
<210> 210
<211> 196
<212> RNA
<213> 钙皮黏菌（Didymium iridis）
<400> 210
uuuugguugg guugggaagu aucauggcua aucaccauga ugcaaucggg uugaacacuu 60
aauuggguua aaacgguggg ggacgauccc guaacauccg uccuaacggc gacagacugc 120
acggcccugc cucuuaggug uguucaauga acagucguuc cgaaaggaag cauccgguau 180
cccaagacaa ucaaau 196
<210> 211
<211> 200
<212> RNA
<213> 纳氏虫属物种（Naegleria sp.）
<400> 211
cuguuauuga aggacguucu agagugcgau gggguucaua ccuuuaucug ccaaaacggg 60
accucuguug agguauauau ugaauauucc guacuaagga uuuaauccgg aacgucuaga 120
gacuacacgg cagaccauug uuggugguau gaauggauag ucccuaguga accaucuagg 180
caucccauac aaaaugguua 200
<210> 212
<211> 209
<212> RNA
<213> 异叶足纲物种（Heterolobosea sp.）
<400> 212
cagcuguuuu gauacaugcu cgacuuucuu uuucucuugu gcaauggggu uuaugaguua 60
auuagccaaa acgggaccuu aaaaaggugu aaguaaccgu acuaaguucg uaagaacgga 120
augucuagag acuacacggc ugagcgauuu agcucucaua aauggauagu ccucaguaua 180
ccaucugagc aucccauaca aaaugguua 209
<210> 213
<211> 76
<212> RNA
<213> 反刍真杆菌（Eubacterium ruminantium）
<400> 213
agucgucaga gcgacuauaa auaggcuuua ggcucugagc gugccgaccg ucaauaaaag 60
gcggucagcg guagca 76
<210> 214
<211> 71
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 214
acucgacuaa gcgaguauaa aaagguuuca agcuuagagc guugauaggg auaaaaaccu 60
aucagguaac a 71
<210> 215
<211> 71
<212> RNA
<213> 冢村氏菌属（Tsukamurella）噬菌体
<400> 215
ccucgucagg gcgagguuaa auagccgcau aggcccugag cguccccgcc ccacaagggc 60
ggggggacgg g 71
<210> 216
<211> 65
<212> RNA
<213> 类芽孢杆菌属物种（Paenibacillus sp.）
<400> 216
agucggcuug gcgacuauaa auaggcuuuu ggccaagcgc gggcucccaa cucgggagua 60
uagca 65
<210> 217
<211> 69
<212> RNA
<213> 噬萘类芽孢杆菌（Paenibacillus naphthalenovorans）
<400> 217
acucgugcca gcgaguuuaa auagaccaau aggcuggcag cguuccacuc auaaagagug 60
gaggaggua 69
<210> 218
<211> 71
<212> RNA
<213> 瘤胃球菌属物种（Ruminococcus sp.）
<400> 218
aguggucaca gccacuauaa acagggcuuu aagcugugag cguugaccgu cacaacggcg 60
gucagguagu c 71
<210> 219
<211> 69
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 219
aguagucaug gcuacuauaa auagagacuu aagccaugag cguucccauc uuugugaugg 60
gaggugucu 69
<210> 220
<211> 69
<212> RNA
<213> 大头茶属（Gordonia）噬菌体
<400> 220
cgucgucuga gcgacguuaa auagccguua ggcucagagc gguacaccuc cccuauucuc 60
gggguuggg 69
<210> 221
<211> 66
<212> RNA
<213> 噬纤维素菌属（Cellulophaga）噬菌体
<400> 221
agccguugca gcggcauaaa auagguuauu aggcugcaag cguucgcccu uaauugggcg 60
guguua 66
<210> 222
<211> 65
<212> RNA
<213> 鞘氨醇杆菌属物种（Sphingobacterium sp.）
<400> 222
agucguuuga gcgacuuaaa auagguuuua agcucaaagc gccccgauaa uaaucgggag 60
uaaca 65
<210> 223
<211> 70
<212> RNA
<213> 布劳特氏菌属物种（Blautia sp.）
<400> 223
agagguugca accucuauaa auagggcuuu aaguugcaag cguucccgcu ggaaacagug 60
ggagauagcc 70
<210> 224
<211> 66
<212> RNA
<213> 毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）
<400> 224
agccguccca acggcucuaa aaaguccauu aaguugggag cguccggcag aaaugccggg 60
guugga 66
<210> 225
<211> 75
<212> RNA
<213> 梭菌目（Clostridiales）细菌
<400> 225
gcucgucugg gcgaggguaa auaguaauua ggcccagagc gucuuggcug gcagaucugc 60
cggucggggg uuuag 75
<210> 226
<211> 64
<212> RNA
<213> 短芽孢杆菌属（Brevibacillus）噬菌体
<400> 226
uaguguugcg gcacuuacaa gcccauuaag ccgcaagcgu uagcccuucc ggggcuaggu 60
uggg 64
<210> 227
<211> 74
<212> RNA
<213> 大头茶属（Gordonia）噬菌体
<400> 227
acacgacugg acguguauaa auaggcguua gguccagugc gggugauggu auugaguauu 60
uuggaaucgg ugcc 74
<210> 228
<211> 64
<212> RNA
<213> 大豆发酵芽孢杆菌（Bacillus glycinifermentans）
<400> 228
agucguggcg gcaacauuaa acaggcauua agccgccagc auuccccuua uuggggaggu 60
ugca 64
<210> 229
<211> 69
<212> RNA
<213> 大豆发酵芽孢杆菌（Bacillus glycinifermentans）
<400> 229
ggacgugacg gcggcucaaa aaagugcauu aagccgcaag aguuuccccg uuuuuggggg 60
aagguuuca 69
<210> 230
<211> 80
<212> RNA
<213> 哈尔滨产乙醇杆菌（Ethanoligenens harbinense）
<400> 230
caccguggcg gcgguguaaa acaaacauua agccgccagc gucccggaac aaggcauuuu 60
ccgauucucc ggggguugca 80
<210> 231
<211> 70
<212> RNA
<213> 梭菌目（Clostridiales）细菌
<400> 231
gcucgucugg gcgaggauaa acagcuauua agcccagagc guucugaguc uuuaagauuc 60
ggagguuuag 70
<210> 232
<211> 69
<212> RNA
<213> 芽孢杆菌属（Bacillus）噬菌体
<400> 232
agucguguga gcgacuauaa acaggcuuua ggcucacagc gucgcggggu uuaucccccg 60
uggguagca 69
<210> 233
<211> 70
<212> RNA
<213> 鞘氨醇杆菌属物种（Sphingobacterium sp.）
<400> 233
aguggauugc gccacuuuaa aaagguuuua agcguaaagc guugcaaggu uuugagccuu 60
gcagguaaca 70
<210> 234
<211> 64
<212> RNA
<213> 大豆发酵芽孢杆菌（Bacillus glycinifermentans）
<400> 234
acucgucaca gcgaguauaa agaggcauua ggcugugagc guuccccguc auggggaggu 60
ugca 64
<210> 235
<211> 67
<212> RNA
<213> 梭菌目物种（Clostridiales sp.）
<400> 235
acacguugcg ccguguauaa auagccaguu agggcgcaag cgucccggca uuuugccggg 60
ggucugg 67
<210> 236
<211> 65
<212> RNA
<213> 另枝菌属物种（Alistipes sp.）
<400> 236
agccguucgg guggcuauaa auagaccuua ggcccgaagc guggcggcac cugccgccgg 60
uggua 65
<210> 237
<211> 78
<212> RNA
<213> 表兄链球菌（Streptococcus sobrinus）
<400> 237
agucguugug gcgacuauaa ccaagcucuu uaagccacaa gcguugcuga ugagguuuca 60
uaacaucagc agguagag 78
<210> 238
<211> 67
<212> RNA
<213> 埃吉类芽孢杆菌（Paenibacillus elgii）
<400> 238
acugguucga gccaguaaaa aaaggccgau aagcucgaag cguuccacuc uuagagugga 60
ggaggca 67
<210> 239
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 239
agucguuagg gcgacuauaa acagacauua agcccuaagc guccccuacu agcuaggggg 60
guugua 66
<210> 240
<211> 69
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 240
agucgguaga gcgacuuuaa aaaggcauua ggcucuacgc guuccaggag gaaacuccug 60
gagguuguu 69
<210> 241
<211> 64
<212> RNA
<213> 韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae）细菌
<400> 241
auucgacuag acgaguauaa auagguguca ggucuagugc ggcaggguuc uucccugcau 60
caua 64
<210> 242
<211> 69
<212> RNA
<213> 韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae）细菌
<400> 242
aaucgacuag gcgauuuuaa auagguguua agccuagugc gguaagaggu auaacccucu 60
ugcgucacg 69
<210> 243
<211> 70
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 243
gcuggucacg gccaguauaa acagacauua agccgugagc gucuccuguu cugugaacgg 60
gaggguugua 70
<210> 244
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 244
acucguuagg gcgaguauaa auagccauua ggcccuaagc gucaaugaua agcucauugg 60
guugga 66
<210> 245
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 245
agucguuugg gcgacuauaa acagacgaau aagcccaaag cguuuccucg uaagaggaag 60
gacgga 66
<210> 246
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 246
agucgucuga gcgacuauaa acagaguuuu aggcucagag cgccuccccu ucgggggagg 60
guacua 66
<210> 247
<211> 79
<212> RNA
<213> 哥伦比亚芭切叶蚁（Atta colombica）
<400> 247
acucgacuag acgaguauaa acuacauuaa gccuagugcg uuauagccgu aaauaagaag 60
uaaacggcua uagguugua 79
<210> 248
<211> 70
<212> RNA
<213> 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）
<400> 248
guucgucuga gcgaacgcaa acaggccauu aagcucagag cguucacugg auucguccag 60
ugagauuggc 70
<210> 249
<211> 71
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 249
acuggacuac gccaguauaa auaggcauua agcguagugc guuccaaugu ugugaaacau 60
cggagguugu u 71
<210> 250
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 250
agucgucuaa gcgacucuaa aaaggcuuua agcuuagagc guucgcccau auugggcgag 60
guugua 66
<210> 251
<211> 73
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 251
acugguugcg gccaguauaa auagucuuua agccgcaagc guguccugga guuaaucuuc 60
cagggcggua gca 73
<210> 252
<211> 69
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 252
agucgacuaa gcgacucuaa acagcauuua ggcuuagugc guuccccugc ucacgcgggg 60
gagguaugg 69
<210> 253
<211> 78
<212> RNA
<213> 球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）
<400> 253
acucgacuaa gcgaguauaa acaggcauua ggcuuagagc guucucacgu uaucugaaug 60
augaugugag agguugca 78
<210> 254
<211> 55
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 254
acucgacagg gcgaggcuaa auagcauuua ggcccugagc ggcucccuuc gggag 55
<210> 255
<211> 58
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 255
gcucggugcg gcgagccuaa auagugccuu aggccgcacg cguuaugcau agguggca 58
<210> 256
<211> 66
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 256
acagguuugc gccuguauaa auagacauua agcgcaaagc gucccgcaau uguugcgggg 60
guugua 66
<210> 257
<211> 67
<212> RNA
<213> 奥湖甲苯单胞菌（Tolumonas auensis）
<400> 257
aagcgaaaca ggccccggag ggccugucug ccggaggugg ugcuccggua cugaugagca 60
gccuagc 67
<210> 258
<211> 69
<212> RNA
<213> 万巴氏分枝杆菌（Mycobacterium vanbaalenii）
<400> 258
ugccgaaacg ccgacucggg ucggcguccc ugggaggugg cauucucagg cugaugaugg 60
cugccgcag 69
<210> 259
<211> 77
<212> RNA
<213> 奥奈达希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）
<400> 259
aagcgaaaca agcaaggcgc uuaggugccu ugccugucug cucggcgugg uugccgagca 60
cugaugagca gccaaag 77
<210> 260
<211> 87
<212> RNA
<213> 脱硫杆菌科（Desulfobacteraceae）细菌
<400> 260
augcgaaacc gcgaucauuu ugccgccauu ggcaagguga ucgcggucau cagggugcgg 60
cgauccugau cugaugagca gccaaga 87
<210> 261
<211> 70
<212> RNA
<213> 耐碱脱硫弧菌（Desulfovibrio alkalitolerans）
<400> 261
aagcgaaacc gcccugagug ggcggucguu ccggagagac ggcgaccggg gccugaugag 60
ccagccgaau 70
<210> 262
<211> 77
<212> RNA
<213> 链霉菌属（Streptomyces）噬菌体
<400> 262
augcgaaaca ucucgccggc uggaccggug aggugucggc ccagggcggu uccugggucc 60
ugacgaugca accggga 77
<210> 263
<211> 71
<212> RNA
<213> 热原体古细菌（Thermoplasmatales archaeon）
<400> 263
agccgaaaca ggggucugug cgccccuguc caccaugggu ggugccaugg ugccgaugau 60
gguagccaca a 71
<210> 264
<211> 70
<212> RNA
<213> 类芽孢杆菌属物种（Paenibacillus sp.）
<400> 264
agccgaaacg ccucgcgaua ggaggcgucg cggggauaug gccuaccccg ccugaugaug 60
gcaggccgga 70
<210> 265
<211> 74
<212> RNA
<213> 南极海神单胞菌（Neptunomonas antarctica）
<400> 265
ccgcgaaacg cccacaccuu aacgggacgg gcgucuaucc agcguggcaa cuggguacug 60
augagcagcc acua 74
<210> 266
<211> 67
<212> RNA
<213> 哈尔滨产乙醇杆菌（Ethanoligenens harbinense）
<400> 266
agccgaaacg gggugaaagc ccuguccgcu ggggauggcc uccucgcgcu gaugauggca 60
ggccaac 67
<210> 267
<211> 84
<212> RNA
<213> 红杆菌目（Rhodobacterales）细菌
<400> 267
augcgaaacc gcauccgggg cggcgugugc cccgggugcc ggucggccgg gcgugguggc 60
ccgguccuga ugaugcagcc ggag 84
<210> 268
<211> 68
<212> RNA
<213> 小梨形菌属物种（Pirellula sp.）
<400> 268
agccgaaacg cgguagcgau ccgcgucgcc gaucgguggu ucgaucggcc ugacgauggc 60
agccaacc 68
<210> 269
<211> 74
<212> RNA
<213> 德沃斯氏菌属物种（Devosia sp.）
<400> 269
uugcgaaacg ccucccggcu ccggcugggg gcgucgucca cgggucgcgc cgugggccug 60
augagcagcg acac 74
<210> 270
<211> 77
<212> RNA
<213> 疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）细菌
<400> 270
ugccgaaacg gcuuccucgu gccccgaggu gccguccugc cgggcugagc ucccagcagc 60
ugaugaggca gcucccu 77
<210> 271
<211> 68
<212> RNA
<213> 糖丝菌属物种（Saccharothrix sp.）
<400> 271
cggcgaaacc gccuccccgg aggcggucca cgggauuggc auucccgugc ugaggaugcc 60
ugccgagc 68
<210> 272
<211> 69
<212> RNA
<213> 海单胞菌属物种（Marinomonas sp.）
<400> 272
uagcgaagcg cggcuaggua uagccgcguc aaucucgugu aguggcuaga uacugaugag 60
cagcuaaaa 69
<210> 273
<211> 75
<212> RNA
<213> 鲁杰氏菌属物种（Ruegeria sp.）
<400> 273
augcgaaacc gucccggugu ucacgccggg auggucaucg gggcguggug accccggucu 60
gaugagcagc cagaa 75
<210> 274
<211> 67
<212> RNA
<213> 贝格阿托氏菌属物种（Beggiatoa sp.）
<400> 274
aaccgaaacu ccccucacgg ggaguccgac cgggauuaau cacccggcgc ugaugaggca 60
gauuccu 67
<210> 275
<211> 65
<212> RNA
<213> 链霉菌属（Streptomyces）噬菌体
<400> 275
ugccgaaaca cccuucgggg ugucggggug ggguggcgcu caccuccuga cgauggcagc 60
cacga 65
<210> 276
<211> 69
<212> RNA
<213> 蓝绿藻菌属物种（Lachnoclostridium sp.）
<400> 276
agccgaaacg gucaguaaug accgucagcc gggaagugac ugccccggcu cugaugaugg 60
caggucaug 69
<210> 277
<211> 66
<212> RNA
<213> 织片草螺菌（Herbaspirillum seropedicae）
<400> 277
agccgaaaca uccucaaagg gugucucuca gagguggccu ccugagacug augauggcug 60
gcugug 66
<210> 278
<211> 71
<212> RNA
<213> 粘放线菌（Moritella viscosa）
<400> 278
aagcgaaaca cgucuuagug auaagucgug ucuacucagc guugugguug aguacugaug 60
agcagcaacu u 71
<210> 279
<211> 67
<212> RNA
<213> 金属还原菲维菌（Fervidicella metallireducens）
<400> 279
aaccgaaaca aggguauguc ccuugucugc ugaggauaac cucucagcac ugaugaggua 60
gguuaaa 67
<210> 280
<211> 67
<212> RNA
<213> 糖丝菌属物种（Saccharothrix sp.）
<400> 280
cggcgaaacc guccggugug gacggucccg agggcuggca ucccucggcu gaugaugccu 60
gccaaga 67
<210> 281
<211> 61
<212> RNA
<213> 链霉菌属（Streptomyces）噬菌体
<400> 281
aggcgaaacg ccgugaggcg uccggccggg ugguacccgg ucgcugauga gccagccugc 60
u 61
<210> 282
<211> 67
<212> RNA
<213> 哈尔滨产乙醇杆菌（Ethanoligenens harbinense）
<400> 282
agccgaaacg ggacuuuggu ccugucugcc gggaauggcc gcccggcacu gaggauggca 60
ggcugcu 67
<210> 283
<211> 66
<212> RNA
<213> 颤杆菌克属物种（Oscillibacter sp.）
<400> 283
agccgaaacg cccuccgggg cgucaucggg gggagcccuc ccccggucug aagauggcag 60
ggcacg 66
<210> 284
<211> 69
<212> RNA
<213> 罕见小球菌属物种（Subdoligranulum sp.）
<400> 284
agccgaaaca gcccugcggg gcugucgugc gggggcugac cgccccgugc cugaugaugg 60
caggucaag 69
<210> 285
<211> 69
<212> RNA
<213> 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）
<400> 285
aagcgaaaca caggcauucg ugccuguguc uacuggaugu cgugauccag uacugaugag 60
cagcgauag 69
<210> 286
<211> 66
<212> RNA
<213> 吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）
<400> 286
ugccgaaacc ccuuggugag gggucguucc gggguggugc ccggagccug acgacggcag 60
ccgccc 66
<210> 287
<211> 70
<212> RNA
<213> 伶俐瘤胃球菌（Ruminococcus callidus）
<400> 287
agccgaaaca gcggcagaga gccgcugucu gccggaacug gucuaccggc acugaugaug 60
gcagaccgga 70
<210> 288
<211> 65
<212> RNA
<213> 糖丝菌属物种（Saccharothrix sp.）
<400> 288
aggcgaaacc cggcuggcac cggguccgua gggcuggcau cccugcgcug augagccugc 60
caacg 65
<210> 289
<211> 67
<212> RNA
<213> 布劳特氏菌属物种（Blautia sp.）
<400> 289
agccgaaacg gggaacuuac cccguccgcu gcgggaucgc cucccggcgc ugaugaggca 60
ggcgaga 67
<210> 290
<211> 78
<212> RNA
<213> 小红卵菌属物种（Rhodovulum sp.）
<400> 290
ccgcgaaacc ccgccaggcc caucggucug gcggcggucg gccgggcgug guggcccgac 60
ccugaugagc agccggag 78
<210> 291
<211> 81
<212> RNA
<213> 地杆菌科（Geobacteraceae）细菌
<400> 291
augcgaaacg aucauuuugc cggcgucgac aaaaugaucg ucaucccggc guggcggccg 60
gggucugaug agcagccgcg g 81
<210> 292
<211> 68
<212> RNA
<213> 横须链霉菌（Streptomyces yokosukanensis）
<400> 292
cggcgaaacc cgcuggugag gcgggucgcg aagcgguggu gcgcuucgcc ugaugaugcc 60
agccagca 68
<210> 293
<211> 84
<212> RNA
<213> 内生小单胞菌属物种（Endozoicomonas sp.）
<400> 293
uugcgaaaca cucccgccgu accugucccc acagguggga gugucagucc agugugguga 60
cugggcucug augagcagcc aaag 84
<210> 294
<211> 68
<212> RNA
<213> 绿弯菌门（Chloroflexi）细菌
<400> 294
agccgaaacg ggggcaucgg cccccgucgu cccgggcagu ccacugggac cugacgaggc 60
aaagcgcg 68
<210> 295
<211> 72
<212> RNA
<213> 奥奈达希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）
<400> 295
aagcgaaacc cgccccauuc auggggcgcg gucugucuaa uguagugauu aggcacugau 60
gagcagcuaa cc 72
<210> 296
<211> 66
<212> RNA
<213> 链霉菌属（Streptomyces）噬菌体
<400> 296
aggcgaaacc acccgagagg guggucggac cgggcgguuc ccgguuccug acgaugccaa 60
ccacug 66
<210> 297
<211> 69
<212> RNA
<213> 乙醇酸脱硫棒菌（Desulfofustis glycolicus）
<400> 297
aggcgaaacg ccggggugac ccggcgucgu cggaggguga ugccuccggc cugacgaugc 60
caguuacag 69
<210> 298
<211> 68
<212> RNA
<213> 脱硫弧菌属物种（Desulfovibrio sp.）
<400> 298
aggcgaaacc guucuccucg gagcggucgg ccgggugugg uggcccggcc cugaugagcc 60
agccgcuc 68
<210> 299
<211> 76
<212> RNA
<213> 南方脱硫单胞菌（Desulfuromonas soudanensis）
<400> 299
aagcgaaacg accacccccc caggggggua gucgucgcuc ggggguggug ccccgggccu 60
gaugaugcag ccaagu 76
<210> 300
<211> 69
<212> RNA
<213> 海单胞菌属物种（Marinomonas sp.）
<400> 300
aagcgaaaca uggcucguug uagccguguc uauucagcgu aguggcuggg uacugaugag 60
cagcuaaaa 69
<210> 301
<211> 57
<212> RNA
<213> 普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）
<400> 301
gcggacacuu ucaagggcug caccgcugcc gcaaaagcaa cccuaugcca ccgcccc 57
<210> 302
<211> 54
<212> RNA
<213> 普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）
<400> 302
acggaugccu ugacgggccg caccgaacga aaagcgaccc gaucccacac cccg 54
<210> 303
<211> 53
<212> RNA
<213> 普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）
<400> 303
acggauacuc uagccggguu gcaccguuca aagcagccca gccccagccg caa 53
<210> 304
<211> 54
<212> RNA
<213> 普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）
<400> 304
ugggauaccc uagcagggcc gcaccccaga aaagcggccc cgccccacac ccgg 54
<210> 305
<211> 53
<212> RNA
<213> 粪杆菌属物种（Faecalibacterium sp.）
<400> 305
ccggauauuu uggcagggcu gcaccgggca aagcaacccc gccccacuac ccc 53
<210> 306
<211> 53
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 306
gcggacaccu cagcagggcc gcaccggaca aagcggcccc gccccaccgc cca 53
<210> 307
<211> 57
<212> RNA
<213> 粪杆菌属物种（Faecalibacterium sp.）
<400> 307
gcggaugccc uggcaggguc gcaccgcuca aacaaagcgg ccccgcccca uaacccc 57
<210> 308
<211> 52
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 308
ucggacacuc uggcagggca agcaccguau agcagccccg accaacuacc cc 52
<210> 309
<211> 54
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 309
ccggaagccc uggcagggug cgcaccggau aaagcggccc uaccucaccg gcac 54
<210> 310
<211> 247
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 310
aaaagcaccu cuuaaauagu gauccguaaa augagguuca uauaaaauuu uucacuauau 60
gcuggaaaau cuuaaagcuu uaaguaccuc aaugguaaca aucuuaaaga uauuacaaua 120
gacaaucagc aggaaaccaa cauaauucua uuauuuuuag uaggauccuc agagacuaca 180
cgugaaacac cguauuuuua uuaagaauac gcugaagaua uaguccgccc cacuucgaaa 240
gaugugg 247
<210> 311
<211> 262
<212> RNA
<213> Taylorbacteria暂定种
<400> 311
cuguuauagu ucuguuaaug caauaaaaug uaaaaacauu uugauaaacu aaauaaacaa 60
uaaucaguac acuauucaaa gcugccucgc ucuguaguaa uacaaagcag guccgcacca 120
uggcuauaug cggggaaguc uguaauuugc agaucauccg cagggaaguu cuaaaauuuu 180
uuuuagaacc ccucagagac cacacgccau gcuccagcug guuuguacca gcuggaugaa 240
gauauggucc uucguuaaag ag 262
<210> 312
<211> 428
<212> RNA
<213> 雅诺夫斯基菌门暂定种（Candidatus Yanofskybacteria）
<400> 312
caaggcggcu uguuacuugc cgcaggggcc auugagaagc aauucucaau agcaaauucg 60
acuauaugcu ggaaacuccg ccaguaucuc uagguacuau gauauuauga uauaucauag 120
ugaaaauccu aagagugaug cggacaauca gcaggcaacc ccgcucaaau uuuuggaaau 180
aaaaaagugg auuucuggga uucaggaucc ggccucgauu agagguugcc auccuuucgg 240
aaggaugccc ugaaaugcuu cccacgcaaa auccacuuuc augcuaguau aucaaauaaa 300
uaaugcacuu gucaaguguu uguuucuaaa aauuugagcg ggagaguccu caacgacuga 360
aagucgaacc aguuauauuu caaaaaaaug acuggaugau acagucugaa cuuauaggcg 420
acuauaag 428
<210> 313
<211> 501
<212> RNA
<213> 丝盘虫（Trichoplax adhaerens）
<400> 313
aagauuaaau aauauaaguu uuugacuuuu accuccggca cuuuuuuuac uauuagguuc 60
cucuuuagua gaacaaggag cggguacagg guggacgguu gaaaggccgc ccgaguuagu 120
gaugacuugg ugaaaauuuu gcucaaugcg agaacauccu caaaaaaaag gugcuuuggc 180
ucauugauua acccuaaaaa gguaccuuuu gauggcccca ugcaaaaauc cuuuuuuacg 240
ccgaaggcgc cguggacaac ucgccggggg cccaagccua ugggccccuc agagacuaaa 300
ugcagaauau cuucuauuuu uugauaggcg ccgggccccu uaacgggcgc cgaaggcgcc 360
caaugggagc caacgaccga uggcgccaua ggcgccgaag gcgccgauag aaauaaaggg 420
cccgaagcga ccgauucacc aaucggucgc uucggccgau ggaagauaaa ggaauagucc 480
gauccgacuc uaaagggucg g 501
<210> 314
<211> 307
<212> RNA
<213> 纹缘盔孢伞（Galerina marginata）
<400> 314
uugccugggu uuucuuaauu gaauucccga auuuaaaugc uaguccaagu uaaaacuugg 60
gcaagaccuu caaacugacg gggaacuccu aaagcuucag acaccaagcc uuauuccgaa 120
aggguagggu ggccagguua auagccucgg guaugguaaa agaucugaag auauuacaau 180
ggacaauccg cagccaaggc ccuaacgaag uguuucacuu cuaugggaca gguucagaga 240
cuagauggag gucggucuca uguaaaugag gcuuaaggua uaguccggcu ucaagugaaa 300
acuuguu 307
<210> 315
<211> 215
<212> RNA
<213> 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）
<400> 315
uuauauuuuu auuacuaaaa aaaaaaggga aaaaacagca aauaaaaaaa cuucuucuua 60
cuaauugcug gaaacuccug uuuaauagga caaucagcag gagccugcug uauauguuua 120
uacaguaggg uucuucagag acuacacgua agauauccua gaaucauuaa auaaauagga 180
uaaagauaua guccgcucuu aauagaaaua uuaag 215
<210> 316
<211> 564
<212> RNA
<213> 木本鸡脚棉（Gossypium arboreum）
<400> 316
cuacggacuu aauuggauug agccuuggua uggaaaccua cuaagugaua acuuucaaau 60
ucagagaaac ccuggaauga aaaaugggca auccugagcc aaauccuauu auuuuauuau 120
uuuacgaaaa uaaacaugaa caaagguuca gcaagcgaga auaagaaaaa aaggaaagga 180
uaggugcaga gacucaaugg aagcuauucu aacaaauggg guugacuguu gguaaaggaa 240
uccuuauauc gaauaucgaa acucuagaaa ggaugcaaga uauaccuauu uuuuuuauag 300
guauacuaau gaaaaacuau cucaaaaaag acguaccgaa cccguauuuu uuuuuuuauu 360
ucuauuauau gcaauaucaa uuuauauuua uaugaaaaua ugaaaaauaa aaagaauugu 420
ugugaaucga uuccaaguug aagaaagaau cgaauagaau agucauuaau caaaucauuc 480
acuccauagu cugauaaauc uuuugaaaaa cugauuaauc ggacgagaau aaagauagag 540
ucccguucua caugucaaua ucaa 564
<210> 317
<211> 227
<212> RNA
<213> 多噬棘阿米巴（Acanthamoeba polyphaga）
<400> 317
auuccuuauu gguuccuaag uauauaucga aagguauaua ugguaauagu uaaucacuau 60
uagaggaaaa auaucaauaa ggucauaguc aauccgcagc aaagcuccua aacccguuau 120
gcuagggcau ggagaauguu caacgacuaa acggaugugg gcaugaagga auuagcacuu 180
ccuaaugauu gcuuaagaua uagucuaaac ccaccaguga ugguguu 227
<210> 318
<211> 370
<212> RNA
<213> 韩国芽孢杆菌（Bacillus koreensis）
<400> 318
uucgugacgu agauuaugcu uuagcugcgu aagcaguaac aagcacaguc guccuagcug 60
guaacggcua gagaucauaa uugggugaau ugcuggaaac cccuuagagc uuucuucccc 120
acagcggagu uggaaacgac agacgcgaug gguuuaagaa gaagagagau ugggcaauca 180
gcagccgagc uccuguuccg aaaggaugga gaagguucaa cgacuaggau agaccaucua 240
aaagcuaaag cucaagauga ugaaauccau aggugaagca guagaucauc acuacuguga 300
auccgaagug cccaaccccu accgaauacg gagggugaag auauagucua gucauuuaug 360
aaaguaaaug 370
<210> 319
<211> 282
<212> RNA
<213> 长蒴黄麻（Corchorus olitorius）
<400> 319
ccacggacuu aauuaaauug gauugagcuu uggcauggua accuacuaag ugauaacuuu 60
caaauucaga gaaauccugg aaugaaaaau gggcaauccu gagucaaauc cuauuauuuc 120
acgaaaauaa acaaagguuc agcaggggag acaucuuuaa cagcugccaa ugaaucucca 180
auauauuugg uaauuuccua cuuauaguag uuaaagaagc ugaauaacaa gcauuuuaag 240
guagaagagu gcugaccugu gagguuagug gaggucgugu gg 282
<210> 320
<211> 214
<212> RNA
<213> 杂食菌门（Omnitrophica）WOR_2
<400> 320
agcgggcugu gcucaagcgc agcuuccaca ggaaacugug guugacaaag caggagaauu 60
gcuggaagcc ccucuggggu aaucagcagc cgagcccguc auuauuuugg cgggaagguu 120
cagagacuau guaccugccu cccgaaacgc aauguccgcc uauggcggaa agucguggga 180
gaagauauag uccaaguccg auaguaauau cggg 214
<210> 321
<211> 243
<212> RNA
<213> 米根霉（Rhizopus oryzae）
<400> 321
guucggagau uuguggaguu caccacgggu agguaauaag cccccucauu auuagauggg 60
gauaaucuca cuauaugccc gaaacuccua aagcccaauu uacggaaacc gugauaauaa 120
uugggauaau acaauggaca augggcagga aacagaaaau uuauucuggc uccucagaga 180
cuacauguga aacauucauu uuaaugaaug aagauauagu cccauccaug acgagauuca 240
ugg 243
<210> 322
<211> 251
<212> RNA
<213> 乌拉尔图小麦（Triticum urartu）
<400> 322
auuugaauac aauaguauug agcccaagua aaacuggaug aauugcaggg aaaacuaaaa 60
augaauuuag uuaaucugca gcgaagcuau uaucggcacc uuauuaacuu aucaguuaau 120
uuguagauaa uagaacguuc aacgacuaau cggugagcug ugcuagcaau aauccggaca 180
cgagcgucca gcagaaaaua auuaauauuu auuuucugau gaaauagucu gaacaauggu 240
gugaaucauu g 251
<210> 323
<211> 825
<212> RNA
<213> 莱氏微球黑粉菌（Microbotryum lychnidis-dioicae）
<400> 323
auuuuaggau ucauuguuug gucuugguug ggacucccuc acagugaugu ggggguaaga 60
aauuucgcua uuugcugaaa caguuuuacg uuguuaggua ucaagauaua guaaaauccu 120
agcagcaaua cucaaucagc agggagccgu cacuuuauua augcggguuc uucagagacu 180
auacgcgaga caucuuggca uaacuuuaca gccuucuaua cccuuuuaau gguuauauca 240
acacuaugag ucagcuuuuu ucuaguuagc cuuuuuuuuu ggccugucgu uuuugcucuc 300
uuuuuuagaa aaacagcccg cucauuauuu uugcuuuuau uuuucuuuuu cuuuuuacuc 360
ucuuuuucua ccggaggagu aaaaacagca gcgcuuauuu ucacucggua gaaaauaaag 420
gccaaauaag cgcccuuuuu cuguuuuuau aaagcgccuc gcccagccga gcugggcgcu 480
ucauucgccc agccgagcug cuuuucauca aagaugaagc gcccagcucg gcugggcgag 540
gcgcuuaguu uuuauuuuug cuuuuuuugu ccugcuuuuu gauuaaucaa aaaagacaaa 600
aacagcaaaa agcacaaaaa aggaaaaggc agcucggcug ggcgaggaaa aagacaaaaa 660
aauaaaaaaa aagggaaaga gcauuuaaca ccagacggau uacagcagau ucgaucccuu 720
uacaggcaaa uuaaugucug uaacuaagaa ucagcuaaga cagaucaucu cggccauaaa 780
gcgacaagau gaagauauag uccgaacuuu acucgcgaga guaag 825
<210> 324
<211> 269
<212> RNA
<213> 韧皮杆菌属暂定种（Candidatus Liberibacter）
<400> 324
auaugugguu uauguuugua aacuucauaa uagguaauga aaaaaaauug uggauguggc 60
ggaauaggua gacgcagcag acuuaauguu auugggugcc cauagagaaa ucgauggagu 120
agaacugcuc aaauucgggg aaagcuuuug caaagcuaau cccgagccaa aucuuguuau 180
ucaagagagg uguagagacu ggacgggcag caccuaaggc auuuaaaacg uuauggugaa 240
gggacagucc agaccacaaa cacugcaaa 269
<210> 325
<211> 324
<212> RNA
<213> 酪蛋白溶酶体龟孢菌（Tortispora caseinolytica）
<400> 325
agcgggucgu uuucugaaag gaaagcggcg uugcugaaag cuagguucua aaacguuggg 60
ccagucgcgc ugaaaggcgc ggcuagucgu gcauaugcac ggcgacacug ucaaauugcg 120
gcgacacccu gagagcuuca aguaccaagc uagcgucgaa agacagcuag uggccgaguu 180
aguaacccug gguacgguaa aaaccuugaa gauugggcga gcacgcagcc aaguccuacg 240
gcgcaagcua cggaugcagu ucacagacua aauggcagug ggcgaaagcu uaagauauag 300
ucgggccucu ggcgaaagcc aggu 324
<210> 326
<211> 847
<212> RNA
<213> 长孢轮枝菌（Verticillium longisporum）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (333)..(345)
<223> n是a、c、g、或u
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (510)..(517)
<223> n是a、c、g、或u
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (625)..(633)
<223> n是a、c、g、或u
<400> 326
aaaucggcgu cauuugagac gaggacuuuc gggcccgaaa ggguguccac caacgaggac 60
cguagcacgg cuuguguacc guagucuccu cggaggcgac acccucaaau ugcgggaaac 120
uccuaaagcu cacgcuccaa agccgucugu gaaagcaguu cgguggccag guuaauugcc 180
ucggguauug gaacaacgcg ugagaugcaa caauggacaa uccgcagcca agccucuaag 240
ucucuuguga cucuggguga acgugcuuca cccaguuugc ucaaggcggg aggacucaca 300
gaucgaaacc ggagucacga ccucugguca ugnnnnnnnn nnnnncuccg gugguucggc 360
gucucgauuc ugcugagucc ugguucgcgu cccagagcca aacugccucu ggcagcaccu 420
agacggagac uuaagugccg uagacggagg cuuaaguccc caacugccua acaggcgguu 480
gguucugauu caggaccagc cugagucacn nnnnnnncca gccugaguca cgagagauau 540
ggggaagguu cagagacuug acgggggugg gugaauucac ugcugcugca acaauauaaa 600
uggggagaga uccucuucuu cuucnnnnnn nnnucuucuu cuuccaacaa ccaaaccaaa 660
ccacaacuga accucaaaca agacccacaa gcucuucaaa augucccauu cuucucccuc 720
uccuguucuc gcuaacggga gcgaguaugu cgugagggau ggagguucgu cuggucaggc 780
auaaggaacg agaaugcagu ggcgugguuu gcuuaagaua aaguccgggc uuaugggaaa 840
ccauagg 847
<210> 327
<211> 365
<212> RNA
<213> 不规则丛枝菌根真菌（Rhizophagus irregularis）
<400> 327
cuauaguuuu auaagcccug aagcuauaga ugucuaucug gcuauaugcu gggaaaccca 60
cuaacuuucu auuuaaguua agaauauggu gaaguggaca aucagcaggu aacccuccuu 120
agcaaaguag ggaggcuacc ucagagacua aacgccagag ccugcaguau gaauugcauu 180
cccucugggc uaaauuggaa gggagucugg gacacuaucu ugccggguua auagaaggag 240
acggagcuau uauuguuucu ucuaaaauaa ccuuguucuu uuugauaaaa ucccgguaag 300
gugagucaaa gcaugcuguu caaucugcag guaagauaua guccgaucca aauagugaug 360
uuugg 365
<210> 328
<211> 311
<212> RNA
<213> Paludisphaera borealis
<400> 328
gcaggggacu caucaaccaa aaugguggcg ccggagggcg accuucggau gcgaaccggg 60
ugaauugcgg gaaaccuaaa ccucuguuuu gaggcacggc gauccgcagc caagccuggc 120
cgggcuuugg uggccaggaa gguucagaga cuagcggggu gagucccaac gauaaucccc 180
gccucgagcg cccggccucc cucgaaugcu ucgaggcggu cacgucaagc gguccgucaa 240
cgaccgccac gcaaccguuu cgaucgucgc aggcgaggau gagauagucc aagccccgug 300
gaaacgcggg g 311
<210> 329
<211> 346
<212> RNA
<213> 普通小麦（Triticum aestivum）
<400> 329
auucaucgau uagcugcuag auaauagcau gugacauuuu uagucgcuaa gugguaacuu 60
ccaaauucag agaaacccug gaauuaaaaa agggcaaucc ugagccaaau ccguguuuug 120
agaaaacaag ggguucucga acuagaauac aaaggagaag gauaggugua gagacucaau 180
ggaagcuguu cuaacgaauc gaguuaauua cguuguguug uuaguggaau uccgaaguga 240
guggcaucgu gccuucuuuu agagcggguc acauccaauu ucgauauggc ucaccuuuga 300
aucacuuguu gguaauuauu ccauagaaau gacuuauuag gauacg 346
<210> 330
<211> 322
<212> RNA
<213> 西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum）
<400> 330
guaauuugau uucaccgggc gucugaucga guaacugauc agagcaugac ugggugaauu 60
gcuggaacuc cuuagagccu ugauguacga caacguggcu ggaaacggug agcgugaccg 120
uucugaaaaa cgucaaggau uggacaauca gcagccaagc accuguaggg aaaccuuggu 180
gaagguucaa cgacuaggau agacgaccua auggagacuu cugaugguua ugaaauccgu 240
acuccguaaa cggcggggga agcgcccagc uccuaguaua ccuaggauga agauauaguc 300
uuaucauuag cgaaaguuaa ug 322
<210> 331
<211> 349
<212> RNA
<213> Parasitella parasitica
<400> 331
auauuugggu aaacuauaca cuugccccau auuaguuaau aacuaauaug caaaucucac 60
uauaugcugg aaacuccuua gagcuugcaa uaccuagauc ccuuugggua ucuuacccca 120
ggcgcuacgc gcccggggcu agauggugac aauuuacaag auuggacaau cagcaggaaa 180
ccaaaggaau auuaauauuc caaguuucgg cgggcccugc gggcccgccg ucaccgaacc 240
cgcgcgcuuu gcgcgcggga aaaguaggau cuucagagac uacacgugag acauccuaua 300
guauauuuga cggaugauga uauaguccaa ccuuuauuga aagaugaaa 349
<210> 332
<211> 306
<212> RNA
<213> 斑点小壶菌（Spizellomyces punctatus）
<400> 332
aagaccaugu uaugcaguga ucagcacgug cacuugcaaa gaaaguaaca uggauaggau 60
cuucuggcuc aacugcgugu ggcagagauc gucaaauugu ucggggaagc ccuuagagcu 120
caagcuacca accauugguu gaaagaccag uggggcccuu ccuagggaug guaauaaugc 180
uuugagauug gguaauccgc agccaagcuc cuaaaacuug cuuagcaagu cauggagaag 240
guucaacgac uguaaggcgu accgcgcaag cggaauauac agucuagccc cacgggaaac 300
ugugcc 306
<210> 333
<211> 302
<212> RNA
<213> 鞘丝藻属物种（Lyngbya sp.）
<400> 333
ggaaaauggu uaauauuagc ccuuuauauc aguaaugaua uaaaugcacc uccugaauug 60
cugggaaacc cuaaagcugu uuuaacgaca acauaacuag aaauagucag ugugaacguu 120
uaaaaauaaa acagaugaaa caauggguga ucagcagccg agauucuguu aaaugaauca 180
gguucaacga cuauuccaaa cggaaguaca cucaagcgag uggaaguagg agguauccug 240
uagucaaauc ucuaaauuau uacaggauaa agauauaguc uggucuuaca ugaaagugua 300
ag 302
<210> 334
<211> 288
<212> RNA
<213> 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）
<400> 334
guaagagggg augcgaauag cauuccuuua gugaugagau cgcaacacug ucaaauugcg 60
gggaguuccu aaagcucagg cuaccgccuc aggugcugaa aagcccugaa ggcaccaagg 120
uuagcaaccu uggguauggu aauaacgccu guagauacua caauggauga uccgcagcca 180
agcucuaaca aucuuuucac gauucacgag cgggguucaa cgacuagacg gcagugggcc 240
ugcaaaacag guuuaagaua uagucugcgc cuagggaaaa aucccaag 288
<210> 335
<211> 305
<212> RNA
<213> 杨盘二孢菌（Marssonina brunnea）
<400> 335
guuuguguuu uuaaauggug aauauugaau auuacaauca acuccucgug auauaaauaa 60
aagguaauga cauuagcccc uucaaaucuu ucuauaugcu ggaaacucuu aaaggcuuaa 120
guacuauaua aaauucauau uuaauuuuau aaguaaaaau cuuaaguaua ucuagacaau 180
cagcaggaaa ccaacggaua auauagauuu auucuaguag gauccucaga gacuacacga 240
aagagauggu auagcguaaa gucuguacca uuaagacaua guccaauuug uuuguaaugu 300
aacau 305
<210> 336
<211> 213
<212> RNA
<213> 俭菌总门（Parcubacteria）（雅诺夫斯基菌门（Yanofskybacteria））
<400> 336
ucgggcucau aaauaauugu gaccuaccau aguaaugugg cauggaaaaa cucucuaaau 60
ugucuggaaa ccccacucgc cuaucagcga agggcaauca gcagcgaaac cuuaagcuca 120
ucgaaaggga cguucagaga cuauaauggg agcacccgua accguaacaa aaguugggug 180
augguauagu ccgucacugc aaguaauugc aga 213
<210> 337
<211> 269
<212> RNA
<213> 黑-翠绿颤藻（Oscillatoria nigro-viridis）
<400> 337
caaaagcccu agugacauag cagcucuauc cgguaacggg uacugaaaaa ucgggugaau 60
ucaaggaaac cgcagcacuu cggguggcga caaucuugag ccaagucugg cgaaaggcag 120
cgguugcgau cgcaaguagc cggaaaggug cagagacuag agaugaggag ccuaaccaau 180
aaaucucaca gcgcccgaca uccgacgaca gaucgcacaa augauuugua gggaugauga 240
aauaguccgc ccccuucgga aacguuggg 269
<210> 338
<211> 292
<212> RNA
<213> 西伯利亚阔口罐病毒（Pithovirus sibericum）
<400> 338
ugacacgcau uugaucuuga auguguguug agcaagaccc ucaaauucag ggaaaccccu 60
aaagcuuuug aauaccaagc uuccagcgaa aguuggaggu ggccgcgagu aaaucucgua 120
ggguauggug aaaacgucaa aagauauccg ggaaaccggu aaugggcaau ccugagccaa 180
gcaaccgaaa ugccguaugg uagagguuga aggugcaacg acuugacggg ggucggucag 240
aaacgacagu uucaggcuua agguaaaguc uacuccuuag cgaaaguuaa gg 292
<210> 339
<211> 221
<212> RNA
<213> 色二孢属真菌（Diplodia seriata）
<400> 339
agaagcauuu aacucaguug agcauauauu cccacauaau gugcucauua aaccaggcug 60
uuugcuggga acucugccgc auuaaaccgg uugacaauca gcaggaacca agggguuuuu 120
uaaaauccug auggguucuu cagagacuau acgccuggcg cuuaauuauu aaagaaaaaa 180
auuaaaugau gauauagucc uucuacuauu gaaaaauugu a 221
<210> 340
<211> 359
<212> RNA
<213> 立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）
<400> 340
gcaccucgau aguaacaugu cgaguuaaau uagaaauaau uuaugggaaa uuggguuaau 60
uucaagaaaa ucuuuacacu ccaaaauuuu uucuauaugu uaagcuucaa gcuuaacaaa 120
cccacuuacg guggguugcc ucuacuuuuu cgggggugcc cagcgaagcu gggucacccg 180
augguuaaaa auuuuuggag uuaaagacaa cuugaagcga agcuaguucu gacaauaagc 240
uaauuaugga acuagaacgu ucaacgacua gugggugagu uuugucaaca auaaucccgc 300
cacgaaugcc caacaacuaa agucacagau agaaucggaa uuugugauug aaacaauua 359
<210> 341
<211> 317
<212> RNA
<213> 嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）
<400> 341
agaaggaguu uucuaugguc auccccauua agggacuaac ugacauuggc cuaaacugua 60
gugaaccuac gguuaaaaac caucaaauug cgggaaaccc cuaaaggaau cuuaaccaag 120
uaaguauggu aacauaacuu auggcacagg uaaugacucg ugguauggua aaaucaagau 180
ucauuauuca augggcaauc cgcagccaag ugccaaauau aaaauauuug guaugcaguu 240
caucgacuag acggugguug guauuauuag uuuuaauaau gcuuaagaua uagucaacac 300
cccccugaaa gggugcg 317
<210> 342
<211> 216
<212> RNA
<213> Limnohabitans属物种
<400> 342
gcagaggacu cauauuucuc aaaugugccu uacacgugga aacuguguaa gggauggugu 60
caaauucgau gaaaccuaag uguggcaaca cauauggcaa ugucgagcga agcuuagugc 120
gaaagcacuu ugaacgugua gagacuugac ggcacccacc uaaguacagc gauguauaug 180
gugaaggcaa aguccagcga gugaugaaag ucacac 216
<210> 343
<211> 334
<212> RNA
<213> 葡萄球菌属物种（Staphylococcus sp.）
<400> 343
uucagugugu agagaaaucu gcacaucgug acaguacgac uguccaacaa agaaauugaa 60
uugcuugaaa acccuaaagc cugcuugacc acaacguaga gauaaucaaa cucaagcgug 120
aagguugcga aacugcagaa aaaauaagca ggaugacaua agguuaaaac cuaaguguuu 180
uuugcaaugg gcaacuagca gccaagccua gaaauaggaa gguucaacga cuauuccucu 240
ugagggaagu acacacaagc guguggaagu gguuucgccg uaauggauaa ugccaacgga 300
aaagauauag ucugugcuug uaugaaaaua caag 334
<210> 344
<211> 383
<212> RNA
<213> 俭菌总门（Parcubacteria）（乌尔菌门（Uhrbacteria））
<400> 344
auagcgacau ucuguauaaa ucgucuuuuc gucuaaaaau uguucaauca uaugauugaa 60
cucgaccgug cugucauaaa aucuggcuau augcuggaac aucuggcauc ucccaaccau 120
caggagaaug ggagauugga gaaucucaca cuacguagua aacuacuugu aaaagauacg 180
ugaaaaugug uugagugcag auaaccagca gggaagacua agauaugaca gcgucgauuc 240
auccaaaucu uguuuauaca augaacaagu cuggcaagua ucgacguugu aaacaucauc 300
uaucuuagaa cccucagaga cuauacgccg gacuccgaug uccaucggag aagauauagu 360
ccgaaccgca uggcgacaug cag 383
<210> 345
<211> 262
<212> RNA
<213> 瘦鞘丝藻属物种（Leptolyngbya sp.）
<400> 345
cugcggacuu agaaaacuga gccuuagugg agaaaucugc uaaguggaag cucucaaacu 60
cagggaaacc uaagucuugg uugguuacuu gaccuucuga gauauggcaa uccugagcca 120
agcccuucaa aaggcgaaaa auagagggua aaguucaucc uuuaucuuuu cgauuucauc 180
cuuuugaagg gaaggugcag aggcccgacg ggagcuaccc uaacgucaag ucgaggguaa 240
agggaggguc caauccucaa ag 262
<210> 346
<211> 339
<212> RNA
<213> 长枝被孢霉（Mortierella elongata）
<400> 346
ucauauauuc auaauauuau gaauguauau uaaugauuua auuaggcaug gccggguaau 60
auaguaauau auuacuuucu uuucacuauc ugcuggaaca ccuuaagagu auuuaaaacu 120
aguucugcau gcuuucuuua augaaaagcg guaggaaaca gugacauuua aauaauuagg 180
caaucagcag gaaaccaaag auaaaagggc uuaacuuuaa gcauuaaaca cuuuuauuga 240
guaggauccu cagagacuac acgugaaaua cccuauuaag ugauuauucu uaauuauuua 300
aggguaaaga uauaguccaa ccauuaacga aaguuaaug 339
<210> 347
<211> 209
<212> RNA
<213> 戈茨曼菌门暂定种（Candidatus Gottesmanbacteria）
<400> 347
acagaaggcu caacauaugg gcuguccuga guuuaaucga aggauagaau ucggcuauau 60
cggugaaacc cuaagaccaa cguccgggua auaccgagga aagaucccga gcuugucgag 120
ggaaauccgu agagacuaua cgccgaaucc cuccgaagcu uuugagcgaa gggggaaaga 180
uauaguccga cacucucagu aaugggagg 209
<210> 348
<211> 258
<212> RNA
<213> 殊异肠球菌（Enterococcus dispar）
<400> 348
auauucgguu uguugaaauc ccauauucaa ugaccgauaa agaaauagaa aaagccauau 60
uugaauuaac uaugccaauc augagccaag ccugucggga aacugcagga aggugcaacg 120
acuagauaaa uuaaccuaag caaaagcagu cauuuauuug auugcuuuuu uuguauggcg 180
aaauauccac gagcgcuuga uaccuuaacg uuuaaggcga agguaaugau auagucugaa 240
cuuauaggaa acuauaag 258
<210> 349
<211> 345
<212> RNA
<213> 抑食金球藻（Aureococcus anophagefferens）
<400> 349
uuaguugcgu gucuauugug cgcuagucgc accguuccgc gaacugcacg ggaacggcgg 60
cggcaacauc aucgaauugc ugggaaaccu cgauaggccg gagcuacuaa aggcucgggg 120
aaacccgggu caaaucgagc uuagacgcuc gaagugaaaa ugcuucggau agaggcaauc 180
agcagccaag cgccuaaagc cgcguguauu acaguguauu acaguugggu auacauguau 240
ugcaagcggu cacggugaag guccagagac uaagugguga ugggugucgg cgcgguugac 300
cgcgccgaug cuuaagauau aguccgcccc ucuugagaga gagcu 345
<210> 350
<211> 272
<212> RNA
<213> 黑孢块菌（Tuber melanosporum）
<400> 350
caaaaaguau agguaaaccc ucugcuaguu ccuaaaggga gcaaaaccau caaauugcgg 60
gaacaucuua aagcaauuuu uaaccaagcg agaacgguaa cguauuucgu ggcgcaggua 120
augacucgcg guaagguaaa auaaaaauug auguacgaaa ggaaauagaa aauccgcagc 180
caaguucgaa auaaaauucg aaugcaguuc aucgacuaaa uguugguugg cgcaagcuua 240
aaauauaguc agaccucaau cgaaagauuu ag 272
<210> 351
<211> 203
<212> RNA
<213> 薄壁芽孢杆菌属暂定种（Candidatus Gracilibacteria）
<400> 351
agauaugauu ucugucaagg gcuacuagag aaguaauuuu cuagugaaaa uccgucaaau 60
ucggggaaac cuucauuucu aguuauagaa auauggcaau cccgagccaa gccuauuuau 120
aggaaggugu agagacuaga uggcggacau ccugauacuc aggaugaagg gauaguccag 180
accacgaacc cgaaaggggc gau 203
<210> 352
<211> 207
<212> RNA
<213> 集胞藻属物种（Synechocystis sp.）
<400> 352
cuuggcaucu caucuugcaa aaaggggcug cgcaaaagga aacuucugcg ugauuaucuc 60
ucaaauucgg ggaagccuuu caaaugguaa ucccgagcca aaccuaggaa ugcuuggugu 120
uucugggaag guguagagac uuaaugggag acacccuaac agaaaagcug agggugaaga 180
gaaaguccag accacaaacu gacagag 207
<210> 353
<211> 355
<212> RNA
<213> 俭菌总门（Parcubacteria）细菌
<400> 353
auaaaugcgu uuuauugugc gcgaauuguc acagagaagu acaugcuggu guaaucgcag 60
ccccgcguag gaaugcgcgg agaaaaacug ggugaauucg gggaagccca gccccacuuu 120
uugauaagau gccaccagua gauaaauaau uguguauuua uuugcugacg uuaguacuag 180
ucauuaucgg uuuugucaga aaguggggcu ggguaauccc gagccaauac cugacgggua 240
aaagugucag gaaaggugua gagacuagcg ggugaguccc aacgauaauc ccgccacgag 300
cgcccagcgc cuagaacagg cgaugagaua guccgucccu auugguaaca guagg 355
<210> 354
<211> 92
<212> RNA
<213> 菲氏军团菌（Legionella feeleii）
<400> 354
acggguuuac ccccgaaucg agccuugugg cccuugccaa gcaucaugua uaugagcugc 60
ucgaauaaca cuaaacacaa uccuggguaa ac 92
<210> 355
<211> 96
<212> RNA
<213> 莎士比亚军团菌（Legionella shakespearei）
<400> 355
cuugauuugc cucaucauuu cgagccuugc agcgcaagcu ggauauccuc uuugagugaa 60
ucgcucgauu aacacuaaac caaagacagg gcaaau 96
<210> 356
<211> 96
<212> RNA
<213> 沃尔特氏军团菌（Legionella waltersii）
<400> 356
auugauuugc cccccccguu ggagccuugu ggcguaagcc ugguaucgcu uuugagugag 60
ccgcucgauc aacacuaaac caaagucagg gcaagu 96
<210> 357
<211> 96
<212> RNA
<213> 詹姆斯敦军团菌（Legionella jamestowniensis）
<400> 357
acugauuugc cccugaacug agccuugagg cacuacgccu gguacugcaa ccuugcaggc 60
cgcucuacca acacuaaaca aaauaccagg gcaaau 96
<210> 358
<211> 96
<212> RNA
<213> 法氏军团菌（Legionella fallonii）
<400> 358
auugauuugc ccccucuuug agcauuucgg cuuuugccgg guaucaauuu uuuggauuga 60
gccgcucgac caacacuaaa cacaaacagg gcaaau 96
<210> 359
<211> 126
<212> RNA
<213> 黑狐蝠（Pteropus alecto）
<400> 359
caagaaaugu uucuugacca guugccugca gcugaugagc uccaguaaga gcgaaaccag 60
uucucacucc acugaaacaa uuuugaagug ugaauugguc cuguaguacu gugucagaaa 120
caacuc 126
<210> 360
<211> 126
<212> RNA
<213> 黄喉沙鸡（Pterocles gutturalis）
<400> 360
agguuuauga uguuaaacca guugccuaca gcugaugagu gccaggaaga gcgaaaccag 60
uucuguucug uuucaacagu uaugaaaagu aaggacuggu ccuguaguac uguccagcau 120
caaaau 126
<210> 361
<211> 206
<212> RNA
<213> 大劣按蚊（Anopheles dirus）
<400> 361
uagaaaugca gcacugguac ggguacggau ccgacgccuc ucguaggaua cuuaggcucu 60
ccguacccua cuccuacuca aaacgucccc gacguacaua uucguguuuc uuaucccguu 120
ucucucgauu agugauagcg uagugaucug uucacuggca ccgauaggua aaaauccuuu 180
caaaauacua uacgaaacua aaagac 206
<210> 362
<211> 150
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 362
uuguacuuau gcucugcaau gggguaggac ccggaaccuu uugaagguua cacagguucu 60
ccuauucaac uccuuuucua cuacguaucc aagcuuggau acaugggcca ucuacauccc 120
cuggaguggg cagaaacgaa acugggcuac 150
<210> 363
<211> 192
<212> RNA
<213> 库态按蚊（Anopheles culicifacies）
<400> 363
aguaaaauuu cacugguaag ggauggaucu gaaaaccuau cgaaaaucaa caaaggcucu 60
ccauauucua cuccgacuca auagaagucc ccgacguaua gaacgguaac cugucucacu 120
aaauaucuga gcuuggguau auggagaaac ccaacccuug ggaagauggg cggcuagcuu 180
ccuuucuauc cu 192
<210> 364
<211> 167
<212> RNA
<213> 催命按蚊（Anopheles funestus）
<400> 364
agcaauaccg cacugauaua gauauggauu caaagucucu ugaaggauaa uauagguucu 60
ccgucccgac ccuacuauac guccaugucg uauauacaua ucucuacaaa uaucugagcu 120
uggguauacg aggaaacccu ggagacuaga uguuccucau gcccugg 167
<210> 365
<211> 176
<212> RNA
<213> 中华按蚊（Anopheles sinensis）
<400> 365
uugaccauuu agucugacca ugggucugca aaggaacuau aagcuauccu cccccacucc 60
uacucaaugc guccgcgaag uacagaacgg cagcuugucg cuuaaauauc caagcuuggg 120
uacaugggga aacccacccc cuugggcgaa uggccggcaa ggcugaauug agagga 176
<210> 366
<211> 162
<212> RNA
<213> 黑小按蚊（Anopheles atroparvus）
<400> 366
gucuguguug gucugugaau ggggcaggau ccgacgccuc cugaaggcua cauaggcucu 60
ccuaucuaac ucauauucug guauguccaa gccauacaga ccguguacgg guucaauccc 120
aacccccugg gaggaugggg uugcacggcu aauguagaag gg 162
<210> 367
<211> 186
<212> RNA
<213> 克里斯蒂按蚊（Anopheles christyi）
<400> 367
agcaauacuu cgcugacacg ggaauggauc cgaagccucc agaaggcuaa cauaggcucu 60
ccguugccua cuccuacuaa auauucacua cauuccuaca gaacggcaac uuguuucuca 120
auuauccaaa cuugaugcaa caugcaaccc cuugggaaga uggaaggaau ggcaaaauua 180
ggcugg 186
<210> 368
<211> 181
<212> RNA
<213> 大劣按蚊（Anopheles dirus）
<400> 368
uuuacauuau gaaacacaaa ucuacaaucu ucacgccugu cgaaggaugc acaggcucuu 60
cuuacucuac uccuacucaa aacguucccg acuguaacau gucuauccgc auaucugagc 120
uuggguauac gaggaaacgc aaccccuugg gcgaauggau gauguggcua auuugagugg 180
a 181
<210> 369
<211> 164
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 369
aauaauguuu aaauucgaaa cugacuugga aaacccugua auauagacuc ucucauccaa 60
cuucuauucu uagccgucau ugguaacaug ugucaccaca uaugaguacu uagacuagau 120
ccaaacccuu gggcggaugg uggcauaugg cgaaccagga gagg 164
<210> 370
<211> 201
<212> RNA
<213> 阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis）
<400> 370
uuaaguagca aaugcaaucg gauagguuuc gaagccucuc ugagggauaa uagaggcucu 60
acuauucaac uucuaaucga acacgacccu auucguguag agugguaaca uguggauucg 120
gacuaguucg aaggguccca aagggaacac ggacuaguuc caacuccucg cacagauggu 180
ggcauauggc gaaugaggcg a 201
<210> 371
<211> 167
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 371
aucaaauuuc ugugaguugg ugugguagaa auaccgcagg agaauacucc uacucaauac 60
guccccggcg uacagagugg uaacaugucu cuccaaauau cugagcuugg guauacggga 120
aaauccaucc ucuugggagg augggugaua uggcuaaauu gagagga 167
<210> 372
<211> 208
<212> RNA
<213> 密拉斯按蚊（Anopheles melas）
<400> 372
agcaccaaau uaucugcaaa ugaguuaaua uccgacaccu ccuugaaggu uaauauagac 60
ucucuuacuc ucuuacucuu ucuccuaucc ugcgacgucc guuucguaua gugguaacau 120
guaucauagu auauucaagc auggcugcac gggcccaguc ccaaccccuu gggcggauga 180
ugguacauac auggccaacc aggagggg 208
<210> 373
<211> 180
<212> RNA
<213> 克里斯蒂按蚊（Anopheles christyi）
<400> 373
cucauuggcu ggaucaggug aagcgggacu ugucggagac auaggcucuc cuauucaauu 60
cccauacgga cacgucccag uucgugcaga guaguaacuu ggaucaucga auauccaagc 120
uuggguacac gggcuuguuc caaccccuug ggcggauggc ucauggcaaa ucaggagggc 180
<210> 374
<211> 140
<212> RNA
<213> 多斑按蚊（Anopheles maculatus）
<400> 374
gucaguauaa cacacuagua uugauauggg uccgaagccu guccaaggau aauauaggcu 60
cuccauguac uccauauauc uuagauagag cauaagggaa aacucuugga gagaugggug 120
uuuuagcuaa auugagcggu 140
<210> 375
<211> 186
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 375
auucuucugu gcucugcaau gggauaggau ccgaagcccu ucugagggau aauauaggcu 60
cucuuauuua acuccuacuc ggacaagucc cuguucgugc agaguggcaa caugugucau 120
cacauauuca agcuugagug cacggacuag uuccaacccc ucgggaaaca gagucguaau 180
aaagga 186
<210> 376
<211> 148
<212> RNA
<213> 中华按蚊（Anopheles sinensis）
<400> 376
ugaaugaguu guucugcaaa uggauugaau cacuugcccc uaucccaggg caguaugaag 60
gcguguucau uccuagaucc uacucaacac guccacgucg ugcagaaugg uagcauuuca 120
uuacgaugaa augacuaagu ugagaggg 148
<210> 377
<211> 169
<212> RNA
<213> 表皮按蚊（Anopheles epiroticus）
<400> 377
acuacuacua gcuucuugaa ggguuuugaa gccaggcucu ucuacuucua cucuucuaca 60
auuuguccuu aucguacaga gcacuaacau auauucaaau aucugagcuu ggcaaaacgg 120
cgaaacccaa ucacaacucc auggaugaaa gacauggagu uugagaggg 169
<210> 378
<211> 225
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 378
cucuuugccu caaaaguuug ccgaccgcug cucuagaagg uuaacauagg cucuccaccc 60
ccuacccuua cucaauacgu ucccgucgua cggauguccc ucaauuauuc agauguccag 120
auauccagau guacagaugu ccaauguccc ucaauuaucc aagcuugggu auaaggggaa 180
accuaacccc uugggcugau ggauugcaug gcuaaauuaa gagga 225
<210> 379
<211> 175
<212> RNA
<213> 克里斯蒂按蚊（Anopheles christyi）
<400> 379
agcaauaccc cgcuagugcg ggaauggauc caaagcuucc agaagaugaa cauacgcucu 60
ccauuccaua cuccuacuca auacguccuc ggcguacaga acaacaccau guaucucuau 120
uauccaagcu uggguaaaug gcgaaaauca uacaauuugg ggagauggga ggcag 175
<210> 380
<211> 173
<212> RNA
<213> 多斑按蚊（Anopheles maculatus）
<400> 380
aaaaacaacc aauugggcca cgcaaaacga cuuuugcaac augauacauu acaaauugga 60
acauaauacc ugucguacau aauacugaaa uaaacauacc aaauaucuga gcuuggguau 120
acggggaaac ccaaccucua gggaaaaugg gugauauggc uaaauuuacc gaa 173
<210> 381
<211> 188
<212> RNA
<213> 密拉斯按蚊（Anopheles melas）
<400> 381
gguaguucua cuggcaaugg uuggcagauu cgaaaccucu agaagguuaa caaaggcucu 60
ccaucaccga cuucuacuca auacguccuu gucguacaga augguaacau guuucuuaau 120
uauccaagcu uugguacacg gggaaaccca accccuugga cauugguugc auggcuaaau 180
ugagagga 188
<210> 382
<211> 121
<212> RNA
<213> 斯氏按蚊（Anopheles stephensi）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (105)..(121)
<223> n是a、c、g、或u
<400> 382
auuaaucugg cucuguuaau gggguaggaa ccgaagcucc ucucgggguu acacaggcuc 60
uccuacccaa cuccuauucc gucacguccu cgucguacag agugnnnnnn nnnnnnnnnn 120
n 121
<210> 383
<211> 175
<212> RNA
<213> 克里斯蒂按蚊（Anopheles christyi）
<400> 383
uacuucauau guauugcaau aagauaaguu ccguagcccc uuugagggau aauacaggcu 60
cuccaauuca acuccuaucc gaaaacgucc uaguucguac aaagauucgu caccgcuuuu 120
cuuguugacc uguucuaacc ccuugggagg uuggcgcaag gcuaaucagg agagu 175
<210> 384
<211> 167
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 384
ucuagcaaug guaagggaau ggaucuggag ccucucgaag gauaauaaag guucuauaua 60
ucauauuacu acucaacggu aacauguauc gccaaauacc cugagcuugg gaauaugaag 120
aaauucaacc acucggcagg augaggaaug uugugaagcu uggaaga 167
<210> 385
<211> 222
<212> RNA
<213> 斯氏按蚊（Anopheles stephensi）
<400> 385
ccuaaaaguu gcucuguuaa ugaaauagga uccgagacuc cuuucagggu uacacagggg 60
gguaggagag aguuucaggg uaggagaguc cuacccaacu ccuauuccgu cacguccucg 120
ucguacagag ugguaacuuu ucccaccaua uaucuaagcu uggguacacg gaccuguccc 180
aaccccuugg gcggauggug gagaaaggcu aaacaggagg ag 222
<210> 386
<211> 158
<212> RNA
<213> 大劣按蚊（Anopheles dirus）
<400> 386
uagaaaugca gcacugguaa ggguacggau ccgacgccuc ucgaaggaua ccuaggcucu 60
ccguacccua cuccuacuca aaacgucccc gauuuuccuc cugucuaacc uaagacgcgu 120
uccgcgagag aucuuagcuu augguuaguu ugguuggu 158
<210> 387
<211> 189
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 387
uucacauagg cucugcaaua agguagaacu cggaaccuau ugaaggucac acaggcucuc 60
cuacucaacu cccauucugc aacguccucg ucgugcagag ugacgagaac uaccguauau 120
ccaauauuga guacacggac uagcuccaac ccuuugaucg gguagugaug cucggcaaaa 180
gaggagggc 189
<210> 388
<211> 193
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 388
cccaguguuu uuccuuuuuc cuguuuuucc agaaaccccu cgagggauag uaccggcucu 60
uccauccaac uccuauuccg acacguccuc gucgugcaga gugguagcau gugccaccau 120
auauccuagg uuggauacac gggcuagauc caacccuucg ggcggauggu ggcauaugac 180
gaaccaggag ggg 193
<210> 389
<211> 167
<212> RNA
<213> 中华按蚊（Anopheles sinensis）
<400> 389
ucuaguagua guccuuuaac ggguuggauc cggcgccucg ugaaggcuac uauaggcucu 60
ccuucucaaa aucuauucga ugcguccgcg acguacagaa cgguaccuug ucgcccaaau 120
auccaucagu ucauccucga gcggcugucc uccauguuag gagcggc 167
<210> 390
<211> 189
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 390
agcaauacgu cgcugauaug gcaguggagc cgaagccucu agaagguuaa caaaggcuca 60
ccauccuuua cucauauucc auacguccuc aauguacaga ucgguaacau gccucucaau 120
uaucuaagcu uagcuauacg agguucuuca ugacuguucu ccauauuagg agcggcuccc 180
uccaagcgu 189
<210> 391
<211> 117
<212> RNA
<213> 阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis）
<400> 391
cucgacuugc cguucgaaca ccaugaucag gccacauaua ggcuaauuuu cuaugcuuag 60
auauacgggg aaacccaagc ccuugggcgg auggguugua uggcuaaauu gaguauu 117
<210> 392
<211> 155
<212> RNA
<213> 中华按蚊（Anopheles sinensis）
<400> 392
aguaucguua aaaccacaua uuguccuuug caaaccuucc guaccaaaau uacggagagu 60
acagaacggu agccuguugc cuaaauauuc aagcuugggu acacggggaa acccaccccc 120
uugggcgaau gggcgacaag gccgaauuga gacgg 155
<210> 393
<211> 136
<212> RNA
<213> 拇鲁斯按蚊（Anopheles merus）
<400> 393
cugagacgag gauagaucca aagguagauc cgaagaaggu uaauaaagga ucuccaaccc 60
cuacaccaac uaaauauguc cccguaguac ggcccgguaa caugugguaa cccucucagu 120
ggauguacag acccga 136
<210> 394
<211> 119
<212> RNA
<213> 表皮按蚊（Anopheles epiroticus）
<400> 394
ucaaucaugu gaaacuguua ugggauggga uccgaagccu ccagaagauu ccaucuaacu 60
ccuguuccga cacguccacg ucgugcaggg uggggcaaca uggaccuaac caggggguc 119
<210> 395
<211> 208
<212> RNA
<213> 达氏按蚊（Anopheles darlingi）
<400> 395
gcaauugguu gcucuacaaa ugagguuagg auccgaagca cuaggcuaau uuaggcucuc 60
cuccccuaac uccuacucgu cgcguccucg cggggcucau ggguucugcu cguguagagc 120
gguaacaugc cucccacacg ucugagcuug gguacacggg uaacaccaac cccuugggaa 180
gauggggggu auggcugaga cgagaggg 208
<210> 396
<211> 172
<212> RNA
<213> 斯氏按蚊（Anopheles stephensi）
<400> 396
cguagcaaua augcacuagu aagguaugga ucugaagcuu cuugaggguu aacaaaaccu 60
cuccauacgc uacuucgacu caauacgucg uacgggcgua cagaacucuc cauacauaug 120
aacuuggguc auacggggaa acccaacccc uugggaagag agauagcgag cg 172
<210> 397
<211> 193
<212> RNA
<213> 冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）
<400> 397
aacauuuuua gaucgucagc auauaauaac aauuuaacau gaggaauagc aaacacgaca 60
ucguuaauaa auauaauaaa uaguaaaggu ccuaaucacc acauugauau gugucaccac 120
auauccaagc uuggguacac gggcuugacc caaccccuug ggcggauggu ggcacauggc 180
gaaccaggag ggg 193
<210> 398
<211> 153
<212> RNA
<213> 大劣按蚊（Anopheles dirus）
<400> 398
ugcaacaacc auuucguaca ugagggaaug aaaacaagaa gagguggggu gacaaacuua 60
aagaauuuua acacuauagu agauaucuga gcuuggguau acggggaaac ccaaccccuu 120
gggaggaugg aagacauggc uaauuugaga gga 153
<210> 399
<211> 110
<212> RNA
<213> 库态按蚊（Anopheles culicifacies）
<400> 399
aucaaucguu gcucuguaag uagguguggu acuguuaaga uaagcucucc auaccguacu 60
ccuacucaau acguccucgg cguacagagc gguaacaugu cucuccaaau 110
<210> 400
<211> 201
<212> RNA
<213> 大劣按蚊（Anopheles dirus）
<400> 400
cguaucuuuc uacuauauaa ugggauaaga uccaauaccu uuugcaagcu aacgcaugcu 60
cuauuauucu cuucugucgc gacacguccc caacguacag cuugguagca uauaugauuu 120
auuuuccaag cuuggguagu ccggacaaau ggcaaucuca acguuggaga agagcuagac 180
gauauacuca acuacuucaa g 201
<210> 401
<211> 129
<212> RNA
<213> 库态按蚊（Anopheles culicifacies）
<400> 401
aaauggaucc gaagccucuc gaaggauaau ugagggcuac uccuacuuac augucucuac 60
aaauaucuga gcucggguau ucagggaaau ccaacccuuu gggaguauga uacggcugaa 120
uugagagga 129
<210> 402
<211> 129
<212> RNA
<213> 斯氏按蚊（Anopheles stephensi）
<400> 402
gcuaguucug cagcuguugu gguagcauua cugaagccuc uugcagguua acaaaggcuc 60
uccauacccu accucgacuc aauacguucc ccugucguac aaaacgguag caugucucaa 120
cggaaauga 129
<210> 403
<211> 190
<212> RNA
<213> 微小按蚊（Anopheles minimus）
<400> 403
accauaauau ccugcuaacg ggguagaaua ugaagucgcu uaaagguuac acaggcucuc 60
cuacucaacc cuuauucccc cuagcauccu cgucgugcag agcggcaacu ugaaccaucg 120
cauauccaag cuuggguacg cggguuaguu ccccuugggc ggaugguggu guaugauuaa 180
acaggaggga 190
<210> 404
<211> 183
<212> RNA
<213> 拇鲁斯按蚊（Anopheles merus）
<400> 404
uucagaucau cugcucagca auggaacagg auccgaaguu ucccugaaug auaacauagg 60
uuauccgauc uaacucguau ccagacaagu gucaguucgu uacauguguc aucacauauc 120
caagcuuaug uacacggacc uguugcaacc guucgggcgg auuguugcag ucauuugauu 180
gca 183
<210> 405
<211> 127
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 405
aacuaaguug acgaggauga gauuuaucga auuuuuucgg cggauaucuc acguaaauag 60
cacuagcguu aauaauuaac aaaacuacaa aguaauuugu aggacaaauu uaauuaugug 120
caaucua 127
<210> 406
<211> 159
<212> RNA
<213> 新丙酸[梭菌]（[Clostridium] neopropionicum）
<400> 406
uugaaaaaug aagcgccaga accgcagaua gggcgguuga cgagguagaa gugaucgaau 60
uuuucggcgg augcuucucg cccauucguu cagggacgca ggucuuucua caaauaggag 120
aagguaauuc uucugacaaa gggaaaggca acggacgaa 159
<210> 407
<211> 154
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 407
uaacauuaaa uagcgcauga acauaccuuu cguaugugac gaggaugaua guuaucgaac 60
auucagcgga uacuaucacg gugauuuagc aucgauauau auaguacaaa aaguaaaauc 120
uuuaauuacu acaaaaacua uauaaucuaa auau 154
<210> 408
<211> 178
<212> RNA
<213> 暗黑菌门（Atribacteria）细菌
<400> 408
aauugaauac aagcgccaga acuuacucaa uuugaagggc uaaguguuuu gauaagguaa 60
guugacgagg aaggaguuua ucgaaaauuc ggcggaugcu ccuggguugg ccagacccuu 120
agaaaaccug uaaaacuugu gaguaauugc aaggacagag agguuuuuau ggcaaaau 178
<210> 409
<211> 150
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 409
uuauuuaagu aagcgccagg acauuuuuuu aauguugacg aggauagaac uuaucgaaau 60
uuucggcgga ugguucuagg gaaugcuacu uccuaaaaua uugucaaaaa auaauagcga 120
uauuauaaca aaucaauauu acuagcugug 150
<210> 410
<211> 171
<212> RNA
<213> 库特氏菌属物种（Kurthia sp.）
<400> 410
aaaacaguua uagcgccagu acugaagaaa ucggacgaca aguaucuuca guagacgagg 60
uggaggagua ucgaaaguuu cggcggaugc cucccggucg acagcccgau cguaaguuca 120
ucuuuaaaau agugaaguga uucauuagac aaagagauga aauggcaaau c 171
<210> 411
<211> 148
<212> RNA
<213> 脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）
<400> 411
caauaucgga uagcgccaga ccugaacguu caggugacga ggagagagcu uaucgaagau 60
ucggcgggug gcucuaggga cugcacucua cagauaacaa agaaaaacua auugugaagu 120
uagaacaaag cgguuaucac gcagguag 148
<210> 412
<211> 189
<212> RNA
<213> Shuttleworthia satelles
<400> 412
ucaaaaacuu uagcgccaug uacccggccg cuuuucaucc cucuguauuu uuggaggaac 60
guuuuggccc ggguugacga ggugucaggu gaucgaagau ucggcggaug ccugaucgcg 120
gaugcggccg cgcauacagu ugacaaaaga uccgguaacg gagagacaaa gagacuguaa 180
ccguaugga 189
<210> 413
<211> 324
<212> RNA
<213> 拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）
<400> 413
aaucaauaaa aagcgccagg acuaagugga auuuaguuga aagugaauuu uuacaggguu 60
gguuuuuaua aaaggaauuu aguuaauagu aagcuuugau auaagcuacg cgaauagcua 120
augaaaucuu uuuaaaggaa acucgacuca cguucguucg cugaguaaau ucaacuaucc 180
aaaucgaaga uuuggaguuu cauuuacguc gacgagguug gggaguaucg aaacuucggc 240
gggugcccca cgguaucgca cuaccguaaa cgacugguaa aacugugaag ugauucacag 300
gacaaauuca gucugguguu aaaa 324
<210> 414
<211> 147
<212> RNA
<213> 芽孢杆菌属物种（Bacillus sp.）
<400> 414
gaauucuuuc uagcgccaga acuuugaaua guugacgagg auaguaguga ucgaaaauuc 60
ggcggaugcu acuacguagg gaagaugcgu uagguauguc uaaaaagcaa aaucgacauu 120
guaacaacag auguaucacu uuucaga 147
<210> 415
<211> 155
<212> RNA
<213> 还原脱硫肠状菌（Desulfotomaculum reducens）
<400> 415
uaaauaacug aagcgccaga accuuuuaca aaguaagggu ugacgaggag agggaguauc 60
gauguuucgg cggaugcccu ccggcccagu ugcggccgua aaagcagaac aaagcuggaa 120
gguaacuuuc gguacaaaaa cugcggguga cuaaa 155
<210> 416
<211> 148
<212> RNA
<213> 澳大利亚马赫氏菌（Mahella australiensis）
<400> 416
uucgauauaa aagcgccgga acucauuuug aguugacgag gucaggguuu aucgauuuuu 60
cggcgggugc ccugcggcau acggcugccg acaaagguuc cacaaaagca aaaagcgauu 120
uuugcuacaa acgggacugg gccaaaau 148
<210> 417
<211> 202
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 417
aguaaagcua uagcgccaug caccuggguc gggucgugaa caguaacgga ugaaugaaua 60
auaacuuacu gcugacacag guuaacgagg uggagagaga aucgaacaua uucggcgggu 120
gcucucccau gcaguccggg cguguuuuau accagaaaaa uaugcgggua acugcaaaac 180
aaagcuggua uaaccggaca ga 202
<210> 418
<211> 173
<212> RNA
<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）
<400> 418
agugaauaca aagcgccuga acuaaguaaa gggacggaaa cgacuuaguu gacgaggagg 60
agguuuaucg aaguaucggc ggaugccucc cgguuguuga uuaucacggc cgaaaacuug 120
augugaaaaa caaugaggug acuuauugga caaaagcauu gagaugauaa uca 173
<210> 419
<211> 197
<212> RNA
<213> 解糖热解纤维菌（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）
<400> 419
gguuuuuuca aagcgccagg accucuggaa auuauagcgc uauugccuuu gcgcauuuuu 60
uccagagguu gacgaggacu ggggagaauc gagguuuucg gcgggugccc cagcgggguu 120
uugccuuuuu cccucgcaac uuucugcuac aaaccccgga aggcaacuuc ugggacaaag 180
gcagaaagaa aaaaggc 197
<210> 420
<211> 159
<212> RNA
<213> 纤维素[梭菌]（[Clostridium] cellulosi）
<400> 420
uuaaauauua aagcgccagg accgauauaa aucgguugac gaggugggga guuaucgaaa 60
gauucggcgg gugcuccucc ggccguuagu guugcggucg uuagcucaug cuacaaaaaa 120
cgcggguaac cgcgcaaaaa aaggcugagc auucagcgc 159
<210> 421
<211> 152
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 421
aguucauuuu uagcgccagg acagcguuug ugcuguugac gagguuagag uuuaucgaaa 60
uauucggcgg augcucuagg gcuuucuacg guccuuauaa auuagcaaaa ccuagcagug 120
auguuagaac agauauaauu uugaguaguu ua 152
<210> 422
<211> 157
<212> RNA
<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
<400> 422
agagugauua aagcgccaga acuacaaauu guguaguuga cgaggaggag uuuuaucgag 60
auuucggcgg augacucccg guuauucauc auaaccgcaa gcuuuuauuu aaaucacuga 120
ggcgacuugg uggacaaaga uaaaagugug augagag 157
<210> 423
<211> 209
<212> RNA
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 423
aggaaacuua uagcgccuga acaaagcgca uacacgauug uagaggcaug uauaaucaga 60
uacaugcuga augaguguua ugaccuuugu ugacgaggag gauaguuauc gaauuuucgg 120
cggaugcuau cccggaugug gcccauucga aguucaaugu uuaaagcaua uaggugacug 180
uauguccaaa gacguugaaa uagccauaa 209
<210> 424
<211> 156
<212> RNA
<213> 格氏梭菌（Clostridium grantii）
<400> 424
auauuauagu uagcgccaga aguagugggu aaagugcuac uugacgagga uggggaguau 60
cgaaauuucg gcggaugccc cacgguauaa cacuaucgau aaacauuggc aaagcaaaga 120
agugauucuu uguacaaauu caauggagug ugaauc 156
<210> 425
<211> 153
<212> RNA
<213> 巴氏梭菌（Clostridium bartlettii）
<400> 425
aguguuuaua aagcgccaga acuuaauuuu uuaaguugac gaggucagag uuaaucgaaa 60
uaucggcgga ugcucugcgg ugugccacca ucgaaggauu ucuacaaagg gugaaagcaa 120
uuucacuaca caaaaagaaa cccaugugga uug 153
<210> 426
<211> 154
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 426
acacguucaa aagcgccggg acugcgugug caguugacga ggcggaggau gaucgaacca 60
uucggcgggu gccuccuuuu cgcgucgcgc ggaaaagagc cgaugcucaa aacccguucg 120
caaggacggc gacaaaagca cggcacgcga caca 154
<210> 427
<211> 178
<212> RNA
<213> 耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）
<400> 427
cuucuucggg cagcgcaagg ccccggcgac acgugauguc acaagccggg gagacgaggu 60
ggaggucagc gacuuuucug cggaugccuc caggccccgg ugaacgggcc uacccggcgc 120
gugcuuugcc gcucugaguc aaagacuccg gcaggcagaa ccacgcgcaa gcccggcg 178
<210> 428
<211> 167
<212> RNA
<213> 澳门假芽孢杆菌（Fictibacillus macauensis）
<400> 428
gcaauaccac aagcgccuga acuauuuucg accggaauga aaauaguuga cgaggaagag 60
gaucaucgag auuucggcgg augccucucg gaugacguca cauccguaag cuuuuauaca 120
aaccagguaa ggugacuucc uguacaaaca uaaaaguagu gacgaau 167
<210> 429
<211> 153
<212> RNA
<213> 甲基戊糖梭菌（Clostridium methylpentosum）
<400> 429
ggguacaacc aagcgccagg cccggauaca gcuccgggug acgaggugga gagugaucga 60
acagaaucgg cggaugcucu cccggucccg gcaggaggau cgucagaugg uucacaaaag 120
cgcguugcgc acaaaagagc caccccaucc cgc 153
<210> 430
<211> 158
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 430
guuauuuuuc aagcgccagg accacuauuu ucaggagguu gacgaggucu agaguuaucg 60
aaauauucgg cggaugcucu aguggcuuuu acuuaagguc aucaguauua auuaaaaacu 120
aauaguaaua uuagaacaga aguuaauauu uuaaguuu 158
<210> 431
<211> 159
<212> RNA
<213> 白蚁孢杆菌（Sporobacter termitidis）
<400> 431
uaaaauuuag aagcgccaga cuucacgcag agcgcggagu ugacgagggc gggguuuauc 60
gaaguauucg gcgggugccc cgugcugcgg uccaucagca uuacagguuu uacaaauccu 120
caagcaauug acgggacaaa auaaaccuga uugggccuu 159
<210> 432
<211> 165
<212> RNA
<213> 格氏李斯特菌（Listeria grayi）
<400> 432
aauuuaauag aagcgccaga acugaucgaa cgggguauca guugacgagg aggagauuaa 60
ucgaguuuuu ucggcgggag ucucccgguu auucauguag ccguuauguc ugaguuacaa 120
aacaagcagg cgacuguuug gacagaaagc uuagacgcau gaguu 165
<210> 433
<211> 157
<212> RNA
<213> 颤杆菌克属物种（Oscillibacter sp.）
<400> 433
cggcccauca cagcgccagc gcccgccgcc agcggcggga cgacgagggg aagggaguau 60
cgaaggauuc ggcggaugcc cuuccgugcc cacgggcgcg uacacagccg gcaaauaugc 120
gggcaaccgc aaaacaaggg ggcugugacc gugaaga 157
<210> 434
<211> 155
<212> RNA
<213> 解糖热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）
<400> 434
aacugaauaa aagcgccugg gcuuagggga aacucuaagu ugacgaggac aggguuaauc 60
gaguuaucgg cggaugcccu gcggcuuccu gcggccgaua gagaaccggg aaaaccaugg 120
gugaccauug gcauagagcg guuugagcag ggaua 155
<210> 435
<211> 171
<212> RNA
<213> 嗜盐薄壁芽孢杆菌（Gracilibacillus halophilus）
<400> 435
uauuaaugga aagcgccagg gcuaugguga acgaagaauc cauagcugac gagguggagg 60
uuuuaucgag uuugaucggc ggaugccucc cgguuguugc aucucaaccg ucacauuuuu 120
auucgaaaac augaagguaa cuuuaugaac aagaauaaaa auaagaugcc u 171
<210> 436
<211> 152
<212> RNA
<213> 嗜碱盐水球菌（Salinicoccus alkaliphilus）
<400> 436
aaaaucggaa uagcgcccgg gcagcuuugc ugcugacgag gaggacgguc aucgaucauc 60
ggcggauacc gucccggaca cugaaguguu cguuacaccg gauguuaaaa cccgcaagcg 120
auugcgggga cagagcaccg gucgauaauu gu 152
<210> 437
<211> 168
<212> RNA
<213> 布替利西柯普利卡柯伦菌（Butyricicoccus pullicaecorum）
<400> 437
ugcauaucga uagcgccaga acugcggagc agcccguuuc gcaguggacg agguaagggu 60
ugaucgaaaa uucggcggau gacccuucgg ccgcgaguga gccggucguu agcaggacgu 120
guaaaccccg ggagugaucc cggaaacaga gcgucuucgc augaccca 168
<210> 438
<211> 198
<212> RNA
<213> 厚壁菌门（Firmicutes）细菌
<400> 438
uccugcgcuu uugcgccuug ucuugacgaa aaaucucucg ccggcaggcc ggcggauauu 60
uuucuuuucc gccgccgugg gauaacgagg uggggagcga ucgaaaauuc ggcggaugcu 120
ccuccgcauc guccggaugc gcacacagcu cauaaauaug cgggagaccg caaaacagag 180
gggcugugac cggaugcg 198
<210> 439
<211> 168
<212> RNA
<213> 小基因组菌总门（Microgenomates）细菌
<400> 439
cauuguuaua uagcgugugg cccccaucug cauuggcagc ggggauacga ggagagggcu 60
agcgaauaau cugcggguac ccucaggccg aagccaagcu gucgaccuua agugugcucu 120
uaaauccuuc uggcaacaga agggacacgg gagcuugcau acagcaua 168
<210> 440
<211> 174
<212> RNA
<213> 鱼腥味锥形杆菌（Pyramidobacter piscolens）
<400> 440
gaacgaacgg aagcgccagg acugaaccgc uucucacucc gcggcgacag ucgacgagga 60
cgaaagugau cgaaccauuc ggcggaugcu uucguggcgg gcgaagggga gccaugaacc 120
uccgucacaa aaccccgggg cgacccggga acaaacggcg gaggcccuuc aaug 174
<210> 441
<211> 172
<212> RNA
<213> 芽孢杆菌属物种（Bacillus sp.）
<400> 441
uagauauaca aagcgccuga acuaagcgac ggacgaaacc augcuuaguu gacgaggagg 60
agguuuaucg aucuaucggc ggaugccucc cgguugccaa ucacaaccga cuuuagggac 120
aguuuaaagc auaaaggcaa cuuuauguac aaagacuguu acuaugauug ca 172
<210> 442
<211> 147
<212> RNA
<213> 支原体属物种（Mycoplasma sp.）
<400> 442
auuuuuguaa uagcgcaugg ccuauuuagg ugacgaggac uuacauuguc gauuuaucag 60
cggaugugua agcggagaag uuuuacuucg uaaaauaccu uaaaaaaaua aaaucaaaau 120
uauaacaaag agguauuuaa uaaaaca 147
<210> 443
<211> 297
<212> RNA
<213> 诺维氏梭菌（Clostridium novyi）
<400> 443
aauaauauua aagcgccaga acuuaaguug aguaaaugag ggaauaaagg aaacucaaac 60
uagacguuug aguaaguucg acuaacuaaa ucauagauuu aagaaguuaa ggaaacucaa 120
acuaaauguu ugaguaaguu cgccuuaacc aaaucguaga uuuggaggcu cacuuaaguu 180
gacgaggaug gggaguaucg agaauucggc ggauguccca cgguauuuau guacuaccga 240
uaacaguuag caaaucuaaa aagcgauuuu uagcacaaau cuaacuaggu acaugau 297
<210> 444
<211> 228
<212> RNA
<213> 南极类芽孢杆菌（Paenibacillus antarcticus）
<400> 444
uguauauuaa aagcgccaga acuugacuag cgcgggaugu aagauggacc gaggguaugg 60
augaguacga uccguuucgg ugccugauua caacggcaga ucaaguugac gagguggggg 120
uguucgaaau guucggcggg gaccucccgg ugaugcacca gagccgugaa ucauauacgg 180
aaaauaagcg ggcgacugcu cauacaacgu agugaugggu gcuaauua 228
<210> 445
<211> 224
<212> RNA
<213> 戈茨曼菌门暂定种（Candidatus Gottesmanbacteria）
<400> 445
cagagaacau aagcgugugg cccggcuauc auguuccucg ccgagcucgu cacaccagcc 60
gggcaagccc gguugaugcg agcgaagcga gcauaauaac cgggauacga ggaaagggcu 120
uaucggauaa aucugcgggu gcccuuuggu aguacucucu accacaacgg uaaucagaaa 180
cuccaccggu aacgguggga acaaaugauu aucggcagag ucgc 224
<210> 446
<211> 144
<212> RNA
<213> 解乳厌氧球菌（Anaerococcus lactolyticus）
<400> 446
aaaaacaaca aagcgccaga ucccuuuggg augacgaggg aggaaguuau cgaaaauucg 60
gcgggagcuu ccuggguuca cagccuuagu guuagacaaa agcagagagc aauuucugcg 120
acagagaaga cacaguggcc ucau 144
<210> 447
<211> 149
<212> RNA
<213> 肠球菌属物种（Enterococcus sp.）
<400> 447
aauauaggaa uagcgccagg ccuguuguuu caggugacga ggagagagcu uaucgaaaca 60
uucggcggau agcucuaggg gcugcacucu acaagcugga aauaaaaaau aauugcaaaa 120
uuauaacaaa gauucagcua agcagaaua 149
<210> 448
<211> 328
<212> RNA
<213> 解淀粉梭菌（Clostridium amylolyticum）
<400> 448
uacaauauaa aagcgccagg acuagaguag agccaaauua aaauuuggaa cauaugauua 60
acuuaccaug acguauggag aaguuggagc auaugauaaa aggaaacuuc uucuccgaug 120
cuaaagcuua aaaaauaaga aauaugaagc uuuagcaucu acgaagaaga aagcgaccgc 180
gccaaauuaa aauuuagagc cucugcuuua guugacgagg auggggagua ucgagucuuc 240
ggcgggugcc ccacgguagc gcacuaccgu uaacgauuga uaaagccggg aagugauuuc 300
uggaaacaac aucaaucagg uguuaaaa 328
<210> 449
<211> 84
<212> RNA
<213> 长蒴黄麻（Corchorus olitorius）
<400> 449
gcaauaacuc cgccuguggc ugcacuaaau accuaccucu gcaaccacag ccggucccaa 60
gcccggaaaa aggaggaggg uugc 84
<210> 450
<211> 92
<212> RNA
<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）
<400> 450
augauaacuc cgccugugcc auauugaaac cugagaguau auauccuuuu cggcacugcc 60
ggucccaagc ccggauaaag gaggaggguc au 92
<210> 451
<211> 74
<212> RNA
<213> 墨西哥丽脂鲤（Astyanax mexicanus）
<400> 451
uuaguaacuc ugccaaagug ucucuuuuaa ggucacuuug ccggucccaa gcccggauaa 60
aagaggaggg uuaa 74
<210> 452
<211> 81
<212> RNA
<213> 土瓶草（Cephalotus follicularis）
<400> 452
gucauaacuc cgccugugua gcaauaugua uaaccaugug uacacagccg gucccaagcc 60
cggaugaagg aggaggguga c 81
<210> 453
<211> 80
<212> RNA
<213> 博落回（Macleaya cordata）
<400> 453
uuuuuaacuc cgccaaugca aauguuaugc cauaacauuu gcauugccgg ucccaagccc 60
ggguaaagga ggagggggaa 80
<210> 454
<211> 63
<212> RNA
<213> 博落回（Macleaya cordata）
<400> 454
uuuuuaacuc cgccaaugca uaugcauugc cggucucaag cccggguaaa ggaggaggga 60
gaa 63
<210> 455
<211> 57
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 455
gcacuaaugu agcucagacc ugugacaagc caaggcuaga aaaauacaga gucgugc 57
<210> 456
<211> 56
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 456
ggccuaaugc agcauagucc ugucacaagc caggcugaaa aaugcagagu gaggca 56
<210> 457
<211> 85
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 457
gaaacccgcu aggccgacag ccucaccgcu gccgcuggug caagcccagc cgccccagac 60
cggggcgggc gcucaugggu aacag 85
<210> 458
<211> 82
<212> RNA
<213> 阿德利企鹅（Pygoscelis adeliae）
<400> 458
uuaggccguu accuacagcu gaugagcucc aagaagagcg aaaccuuuua agauaggucc 60
uguaguauug gccuaacaau cu 82
<210> 459
<211> 77
<212> RNA
<213> 刺鹩（Acanthisitta chloris）
<400> 459
auuggcuguu agcugcugcu cuugagcucc agaaagagca acacugcuua gguccugcag 60
uacuggccua caggugu 77
<210> 460
<211> 109
<212> RNA
<213> 海龟（Chelonia mydas）
<400> 460
uuaaccaguu accuacagcu gaugagcucc aggaagagcg aaaccaguuc cgcccuguuu 60
caguaguuau gaaaaguucg gacugguccu guaguacugu ccugcagca 109
<210> 461
<211> 82
<212> RNA
<213> 非洲鸵鸟（Struthio camelus）
<400> 461
uuaggcuguu accuauagcu gaugagcuuc aaaaugaaug aaaccacuua aaauaggucc 60
uguagaacua uccuuagggc ca 82
<210> 462
<211> 77
<212> RNA
<213> 金领娇鹟（Manacus vitellinus）
<400> 462
ucaggccauu gccuauaggu gaugagcucc augaagagug aaaccaguua gguccuguau 60
ugcuagccua augagca 77
<210> 463
<211> 83
<212> RNA
<213> 海龟（Chelonia mydas）
<400> 463
uugggcuaua gccuacagcu aaugagcuuc aaaaaggagc aaaagcauuu aaaauaggcc 60
cuguaguauu agccuaaucu aau 83
<210> 464
<211> 78
<212> RNA
<213> 海龟（Chelonia mydas）
<400> 464
uuaagacauu gccuacagcu gacaagcucc acaaagagca aaaccaguga ggauccugua 60
acacuguccu acagagcu 78
<210> 465
<211> 86
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 465
acguuccagu uaucuacagc ugaugagcuc aaaggagagc gaaaccggac auccuguccg 60
gucuuguagu acuggcuuag uugucu 86
<210> 466
<211> 77
<212> RNA
<213> 绒啄木鸟（Picoides pubescens）
<400> 466
cugcaccguu accugcagcc gaugagcucc aaaaagagca aaaccagcca gguccugcag 60
uacuggcugc agccuuc 77
<210> 467
<211> 77
<212> RNA
<213> 绿头鸭（Anas platyrhynchos）
<400> 467
aaugucuguu acuugaagcu gaugagcucc aaauagagca aaaccauuua gguccuauag 60
uacuggccug uaagcuu 77
<210> 468
<211> 111
<212> RNA
<213> 斑尾非洲咬鹃（Apaloderma vittatum）
<400> 468
uuaaaccagu uaccuacagc ugaugagcuc cggaaagagc aaaaccaguu cuguucuauu 60
ucagcaguua ugaaugcuaa gaacuggucc uguaguaaug uugaacaucg a 111
<210> 469
<211> 77
<212> RNA
<213> 黄喉沙鸡（Pterocles gutturalis）
<400> 469
uuaggccauu aucugcagcu gaugagcucc aagaagagca aaauccguua gguccuacaa 60
ugcuggccua auacaca 77
<210> 470
<211> 77
<212> RNA
<213> 原鸡（Gallus gallus）
<400> 470
cuuggccauu accugcagcu ggugagcucc aaaaagagcg gugccauuua ggucauguca 60
uucuggccua uauguuu 77
<210> 471
<211> 77
<212> RNA
<213> 白领姬鹟（Ficedula albicollis）
<400> 471
auugaauguu acuugcagcu gaugggcucc aaaaagagag aagccccuua gguccuguag 60
uacuggacuu gaaacau 77
<210> 472
<211> 77
<212> RNA
<213> 斑鼠鸟（Colius striatus）
<400> 472
auuggcuguu acaugcagcu agugagcucc aaaaagagug aaaccacuua gcuccuguaa 60
uucuggcuua uaagugu 77
<210> 473
<211> 77
<212> RNA
<213> 朱红蜂鸟（Calypte anna）
<400> 473
auuggccauu aucugcagcu gaugagcucc aaaaagagca ggaccacuug gauccuuuag 60
uacugcccua uaagugu 77
<210> 474
<211> 85
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 474
aauuucaguu aucugcagcu gaugagcuua aauaaaagca aaacuggaau uaauuuccag 60
uccugcagua cugguuaaua ugccu 85
<210> 475
<211> 78
<212> RNA
<213> 洋红蜂虎（Merops nubicus）
<400> 475
auuguccacu accugcagcu gaugaaccuc aaaaaagagc aaaacucccu agguccugua 60
guaguggcca guaagugu 78
<210> 476
<211> 80
<212> RNA
<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）
<400> 476
caauccaguu aucuacagcu gacgagcucu aaugagagcg aaacugggga accgguccug 60
ugguacuggc augaaagaaa 80
<210> 477
<211> 77
<212> RNA
<213> 白鹭（Egretta garzetta）
<400> 477
auuggccacu acccgcagcc ggugagcucu aaaaagagug aaaccacuug ggucuugugg 60
uauuggccga uaagcgu 77
<210> 478
<211> 83
<212> RNA
<213> 美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）
<400> 478
gcaggccauu acuugcagcu aaugaguucc acagagaaug aaaccauuug aaauuggucc 60
cugaaguacu ggccuagaaa acu 83
<210> 479
<211> 77
<212> RNA
<213> 小马岛猬（Echinops telfairi）
<400> 479
ccgagccguu gccugcagcu gaugagcucc aacaagagcg aaaccgaaca gguccugcag 60
uacggguggg gucagca 77
<210> 480
<211> 52
<212> RNA
<213> 菊苣黄斑驳病毒（Chicory yellow mottle）病毒
<400> 480
caacagcgaa gcgcgccagg gaaacacacc auguguggua uauuaucugg ca 52
<210> 481
<211> 52
<212> RNA
<213> 南芥菜花叶（Arabis mosaic）病毒
<400> 481
caacagcgaa gcggaacggc gaaacacacc uuguguggua uauuacccgu ug 52
<210> 482
<211> 50
<212> RNA
<213> 烟草环斑（Tobacco ringspot）病毒
<400> 482
aaacagagaa gucaaccaga gaaacacacg uugugguaua uuaccuggua 50
<210> 483
<211> 70
<212> RNA
<213> costatus驼切叶蚁（Cyphomyrmex costatus）
<400> 483
gauucucaac aaucgucuac cuccccgugg ugagaaucgg gaaacauuuc aaauaauggc 60
uaaagacgau 70
<210> 484
<211> 73
<212> RNA
<213> 长牡蛎（Crassostrea gigas）
<400> 484
ccugcucaaa auccuacuuc caccuccccg cggcgagcag ggggcaacgg acauuugucc 60
ggcgaacgga aga 73
<210> 485
<211> 74
<212> RNA
<213> 解糖梭菌（Clostridium saccharolyticum）样
<400> 485
gcugcucgaa acuuugcaca ccucuucgug gugagcagca ggcaacgauc uuauggucgg 60
cuaagaaugc agag 74
<210> 486
<211> 75
<212> RNA
<213> 不规则丛枝菌根真菌（Rhizophagus irregularis）
<400> 486
ccugaacgaa gcuugccacc ucuacguggu guucaggaga aacaguugua aguuaauaac 60
uggccaagag caagc 75
<210> 487
<211> 74
<212> RNA
<213> 佛罗里达弓背蚁（Camponotus floridanus）
<400> 487
gauuuuccau uauauguuua ccuccacgcg gugaaaaucg ggcaacguca aauaaauugg 60
cggcaaaaga acgu 74
<210> 488
<211> 72
<212> RNA
<213> 美孢胶膜菌（Tulasnella calospora）
<400> 488
ggggcucgau gaugcgcaca ccuccccgug gugagcccug ucaacgucgg caaggacggc 60
caagaugcgc au 72
<210> 489
<211> 72
<212> RNA
<213> 麻蝇金小蜂（Trichomalopsis sarcophagae）
<400> 489
gauguuuuga cucauucacc uccacgcggu aaguaucggg auacguugua caucaacggc 60
uaagaaauga ga 72
<210> 490
<211> 69
<212> RNA
<213> 粪杆菌属（Faecalibacterium）
<400> 490
gcuguccgaa aaugcugccu cuacguggcg gacggcaggc aacggagcgu gucuccggcu 60
aaagcauga 69
<210> 491
<211> 73
<212> RNA
<213> 短膜壳绦虫（Hymenolepis nana）
<400> 491
gggcaacgua uacucauaca ccuccacgug gugcacccug ggcaacguau auucauaugg 60
caaaaauguc uau 73
<210> 492
<211> 75
<212> RNA
<213> 梭菌目（Clostridiales）细菌
<400> 492
gcuguuugga uaaucacaca ccgaugcgag guuagcagca ggcaacacag cggaagcuau 60
ggcgaagaug caaug 75
<210> 493
<211> 75
<212> RNA
<213> 美孢胶膜菌（Tulasnella calospora）
<400> 493
gggguucgag cuguacgcgu accuccucgu ggugaacccu gggcaacgcu cugacggagc 60
ggcugaaucg cguac 75
<210> 494
<211> 68
<212> RNA
<213> 毕氏粗角猛蚁（Cerapachys biroi）
<400> 494
aacucuaaaa cguccaccuc cacgugguua gaguugggca acguuaaaca uuaacggcua 60
acggacga 68
<210> 495
<211> 69
<212> RNA
<213> 梭状梭菌（Clostridium clostridioforme）
<400> 495
gccgcccaua ggugcugccu cugcguggcg gguggcaggc aacggaggag uucuccggcu 60
aaagcacug 69
<210> 496
<211> 78
<212> RNA
<213> 肠道寄生线虫（Heligmosomoides polygyrus）
<400> 496
gcuucccgau gacggugcca ccuccacgug gugggaagcg ggcaacgggu uuggauuggc 60
gcccggcuaa gagcaccg 78
<210> 497
<211> 77
<212> RNA
<213> 丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）
<400> 497
ggguuuucaa ugaacguuca ccuucacgug gugaaacccg ggcaacguua cauucagcag 60
cggcuaagaa cguucac 77
<210> 498
<211> 70
<212> RNA
<213> 瘤胃球菌属物种（Ruminococcus sp.）
<400> 498
guuacgcaag aucaaagccu ccucgcggcg cguagcgggc aacgaauuuu cauucggcug 60
auuugaucga 70
<210> 499
<211> 79
<212> RNA
<213> costatus驼切叶蚁
<400> 499
aguuuucgaa agucguucac cuccucgugg ugaaaacugg auaacguuua aauaacugau 60
aaacggcaaa gaaacgaca 79
<210> 500
<211> 72
<212> RNA
<213> 瘤胃球菌属物种（Ruminococcus sp.）
<400> 500
gccgcacaaa aucaaagccu ccacguggcg ugcggcggac aacggaugau ugauccggcu 60
aagauugauu ga 72
<210> 501
<211> 77
<212> RNA
<213> 热带秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis tropicalis）
<400> 501
cuucuacacg uacuucgccu cuccguggcg uagaagaggc aacacuccug ggcaaccaga 60
guggcuaaga aguacac 77
<210> 502
<211> 75
<212> RNA
<213> 短膜壳绦虫（Hymenolepis nana）
<400> 502
ggggugcuag auagacuuac cuccacgcgg uguacccugg gcaacguaua cucaucauac 60
ggcaaauaag ucaau 75
<210> 503
<211> 75
<212> RNA
<213> 厌氧棍状菌属物种（Anaerotruncus sp.）
<400> 503
accgcacagg gucaaagccu ccacguggcg ugcggugggc aacggacaac ucgcucgucc 60
ggcugauuug accau 75
<210> 504
<211> 70
<212> RNA
<213> 普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）
<400> 504
gccgcucaga uaugcuaccu cuccguggug agcagcaggc aacgagaguu uucucucggc 60
uaaagcauau 70
<210> 505
<211> 75
<212> RNA
<213> 麻蝇金小蜂（Trichomalopsis sarcophagae）
<400> 505
gguucucuuu caucguucac cuccccgugg ugagaaccgg gcaacacaac auuucagagu 60
ggcaaagaaa cgauu 75
<210> 506
<211> 84
<212> RNA
<213> 麻蝇金小蜂（Trichomalopsis sarcophagae）
<400> 506
gauucucaaa agcguucacc uccucguggu gagaaucggg caacucugau guuuacgaau 60
aaaucagagg caaagaacgc guga 84
<210> 507
<211> 82
<212> RNA
<213> 格氏斯坦线虫（Steinernema glaseri）
<400> 507
ggaagacgac gagcuacacc uccacguggu gucuuccggg caacguuagg gcuucugggu 60
ccuaacggca aagacagcuc ua 82
<210> 508
<211> 83
<212> RNA
<213> 有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）
<400> 508
gguccucaua gcugccaccu ccacguggug aggaccgggc aacguuggug cuucuggagc 60
caccaacggc uaaggcagcg ugg 83
<210> 509
<211> 71
<212> RNA
<213> 层出节水霉（Gonapodya prolifera）
<400> 509
ggagcgcgau ggcccgccca ccucuacgug gugcgcucua gaaacaccag uuugguggcu 60
gagaggcggg c 71
<210> 510
<211> 71
<212> RNA
<213> 层出节水霉（Gonapodya prolifera）
<400> 510
gggguacacg gugacugccu ccucguggcg uaccccgggc aacguucgau uuucgaacgg 60
cugaagucac c 71
<210> 511
<211> 74
<212> RNA
<213> 麻蝇金小蜂（Trichomalopsis sarcophagae）
<400> 511
gauucucaau guuugcuaac cuccacgugg ugagaaucgg gcaacguuua uuuauaaacg 60
gcaaagaggc aaua 74
<210> 512
<211> 82
<212> RNA
<213> 梭菌属物种（Clostridium sp.）
<400> 512
gcuacucgga caaaucaaaa aauuacacac cucuucgugg uaagcagcag acaacgauuu 60
uaugaucggc gaagauguga ga 82
<210> 513
<211> 77
<212> RNA
<213> 梭菌目（Clostridiales）细菌
<400> 513
guugcucgaa ugcgaaugaa ucacacaccu cuccguggug agcagcaggc aaugaaguua 60
uaucauaaaa uuuuuaa 77
<210> 514
<211> 76
<212> RNA
<213> costatus驼切叶蚁
<400> 514
gguuaucgau aagcguccac cuccucgcgg ugauaaccgg gcaacguuga auucaucagc 60
ggcaaaggac gucuaa 76
<210> 515
<211> 74
<212> RNA
<213> 瘤胃球菌属物种（Ruminococcus sp.）
<400> 515
gcugcucgaa aaaugcacac cgcuacgagg ugagcagcag acaacacagc agagacugug 60
gcuaagaggc aaga 74
<210> 516
<211> 72
<212> RNA
<213> 短膜壳绦虫（Hymenolepis nana）
<400> 516
ggggugugag acagacuuac cucaacgugg uacaccccag gcaacguaua uuuaugcggc 60
aaaaaaguuu au 72
<210> 517
<211> 75
<212> RNA
<213> 布氏秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis brenneri）
<400> 517
cuucuucgac gguacuaacc ucuacgcggu gaagaagaga caacaguuuc ugaugaaacu 60
ggcuaauaag uacca 75
<210> 518
<211> 71
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 518
gcuacucaaa aaaagacagc cuccacgcgg cgagcagcgg gcaacgggaa agacccggca 60
gauagucuuu a 71
<210> 519
<211> 80
<212> RNA
<213> 粪杆菌属物种（Faecalibacterium sp.）
<400> 519
uccgcucgaa acuuugcaca ccucuacgcg gugggcggca ggcaacacag uguguagaug 60
cuguggcaaa gaaugcaaga 80
<210> 520
<211> 76
<212> RNA
<213> 瘤胃球菌属物种（Ruminococcus sp.）
<400> 520
gcugcucaga aaugcacacu gcgacuggug agcaguaggu gauguuuauc aaaggauaag 60
cggcuaagau guagaa 76
<210> 521
<211> 75
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 521
gggggacgaa gucgaacuga acaccuccau cguggugucc cccgggcaac gcuugcaaaa 60
gcggcuaacg uucag 75
<210> 522
<211> 89
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 522
gcugcucgua auaaucacac accucuccgu ggugagcagc aggcaacgau uuaagaaugu 60
augguucgau gaucggcgaa gaugugcga 89
<210> 523
<211> 71
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 523
acugcacaaa accaacagcc uucacgcggc gugcagugag caacguauag uuuuauacgg 60
ccaauguuga a 71
<210> 524
<211> 76
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 524
gccgcuuuau auuuuguaca ccucuacgug guaagcggca ggcaacguuu auuuuauaga 60
cggcuaagau gcaaaa 76
<210> 525
<211> 89
<212> RNA
<213> 陪伴粪球菌（Coprococcus comes）
<400> 525
gcugcucgaa ugaaucacac accucuuugu ggugaguagc aggcaacgau cuaagaauca 60
gggauccggu gaucggcuga gaugugaag 89
<210> 526
<211> 78
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 526
aucucacaac guuaaucgcc uccucguggc gugagaugga aacagcauau uugcaaauau 60
guuggcuaag auuaacag 78
<210> 527
<211> 45
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 527
ucccggcuga cgagucucaa acagaacgua augcgcgucc uggau 45
<210> 528
<211> 49
<212> RNA
<213> 羊裂体吸虫（Schistosoma mattheei）
<400> 528
auccaucuga ugaauccuaa aauaggacga aacaugcguc aaacuggau 49
<210> 529
<211> 45
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 529
auccaacuga ugugucuuag guaaaacgaa acacgcgucc uggau 45
<210> 530
<211> 45
<212> RNA
<213> 柯拉松血吸虫（Schistosoma curassoni）
<400> 530
acccuaauga aaagugccaa auaguacgaa acuuaagucu agggu 45
<210> 531
<211> 216
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 531
auucagcuga cgagucccaa ugucguguuu gaaugaacaa augauuccuu uguacuuguu 60
gaaugcuuga uuucgaauuc uaaauacagu acauucgcuu gugcuuaucu acuacuucuu 120
gauccaauua cguuauuucu ggaauucuua guucauacua uaacucaaag acuccuaauu 180
aucacacccg aguaggauga aacgcgcguc cugaau 216
<210> 532
<211> 68
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (33)..(55)
<223> n是a、c、g、或u
<400> 532
auccagcuga cgagucccga auaggacaaa acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngagcg 60
uucuggau 68
<210> 533
<211> 45
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 533
auccagacga cgaguccaag acaggaccaa acgcgcuuuu uguau 45
<210> 534
<211> 45
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 534
acccagauga ugagucucac auaaaacgaa acguacgucu uagau 45
<210> 535
<211> 49
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<400> 535
auccagauga cgagucccag gucgaacgaa augcgcaucc uggcuggau 49
<210> 536
<211> 46
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 536
auucuacuga cgagucccaa acaggacgag auggauuuua uagaau 46
<210> 537
<211> 48
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<400> 537
auccggauga cgaguccaaa auagggugaa auacgcguaa uccuggau 48
<210> 538
<211> 45
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 538
accuugcgga cgaguaccaa auagcacgaa acccgggucc agggu 45
<210> 539
<211> 45
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 539
auccaucuga cgagcccuaa auggggcgaa augcacaucc ugcac 45
<210> 540
<211> 46
<212> RNA
<213> 曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 540
auccagccga agaguucaaa auuuagacga aaugugcguc caggau 46
<210> 541
<211> 45
<212> RNA
<213> 曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 541
guccagccga ugaguucgaa auaggaugaa acgcacgucc ugaau 45
<210> 542
<211> 45
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 542
auucaacuga uggguucaaa auaggacgga gcucgcgucc ugaau 45
<210> 543
<211> 48
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 543
aucuagcuga cgugucucaa auagggugaa acgcgcauca aacuggau 48
<210> 544
<211> 46
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 544
gucuugcuga ggagucccac aauuggacaa aacgaucguc caguac 46
<210> 545
<211> 45
<212> RNA
<213> 羊裂体吸虫（Schistosoma mattheei）
<400> 545
auccagacga ugagucgcaa ucaggacaaa acgcgugucc ugcau 45
<210> 546
<211> 314
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 546
ucacugcuga ggagucccac aacaggguga aacgaccauc cagugcuuuc agguucucca 60
uaguggucca gcuucaaucg acucaugauu ucaacuguua aaauacuaaa ucuccacaaa 120
aacccuucug auaauucaua auagaucaga gggggguuug uggagaauuu aguauuuuaa 180
caguugaaau caugagucga uugaagcuag accaucauug aaaaccugaa agcacuggac 240
ggccauuucg uucuauuaug ggaauccuca gcagugcgca uccauaauaa uaggacgaaa 300
cggccgucca gugc 314
<210> 547
<211> 45
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 547
auucagcuga cgaguguuga auaagacgga acgugcaucc ugaau 45
<210> 548
<211> 51
<212> RNA
<213> 卡氏棘口吸虫（Echinostoma caproni）
<400> 548
gcacugcuga cgagucccag acaggacgaa acaacaacaa cuguccagug c 51
<210> 549
<211> 45
<212> RNA
<213> 柯拉松血吸虫（Schistosoma curassoni）
<400> 549
accuugguga cgagugucaa auaggacgaa acuuaggucc augau 45
<210> 550
<211> 46
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<400> 550
guaucaccga agagucccaa acuaggacga aacagcaguc uaauac 46
<210> 551
<211> 45
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 551
auucaacuaa ugaaucccaa guagaacgaa acguacgucc ugaau 45
<210> 552
<211> 141
<212> RNA
<213> 羊裂体吸虫（Schistosoma mattheei）
<400> 552
auucagcuga cgagucccac uuagcuauug aguccugaua auuacuugcu ugugcaauuu 60
cugaagagaa caucaacucu gggauguagg cacauccugc ugaugggucg caaauaggac 120
gaaacgcgcg ucaaaccgga u 141
<210> 553
<211> 45
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 553
aucuaucuga caaguccuaa auaggacuaa acgugcguuc ugaau 45
<210> 554
<211> 46
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<400> 554
gcaccgauga agaguccuaa aauaggacga aacggcuguc uggcgc 46
<210> 555
<211> 45
<212> RNA
<213> 柯拉松血吸虫（Schistosoma curassoni）
<400> 555
accuagccga cgagucugaa auaggacaaa acgugugucc uugau 45
<210> 556
<211> 46
<212> RNA
<213> 双班蛸（Octopus bimaculoides）
<400> 556
uucuggcuga cgaaacacaa caggucgaaa caccgguguc ccagaa 46
<210> 557
<211> 45
<212> RNA
<213> 曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 557
auuuagcuga uguaucccaa acaaaacgaa acacacguca ugaau 45
<210> 558
<211> 45
<212> RNA
<213> 麝猫后睾吸虫（Opisthorchis viverrini）
<400> 558
gcacugcuga ugagcucuaa uuagagcgaa acucgagucc agugc 45
<210> 559
<211> 45
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 559
auucaacuga uaagucccaa acaggaugaa auaagcaucu ugaau 45
<210> 560
<211> 49
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 560
gcauugcuga ggagucccac aauaagacga aacguccguc aaacaauac 49
<210> 561
<211> 214
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 561
auugcugagg agucccauac uaguauuuua guauuuuaga uugaauaaaa cuucauaaac 60
aaagauggau aguggcuagc aguggaaucc aggacacgcg uuucguccua uuugugacuc 120
guuagcuaga ugguccugca uuucagaguu gauguucacu cuaggacucg aacccaguac 180
cguucgcuac aaggacgaaa cgcgcguccu gaau 214
<210> 562
<211> 46
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 562
gcacuacuga ggagucccag aacaaaagga aacggccguc uagugu 46
<210> 563
<211> 46
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 563
acacugcuga agaguccuac aaugggacga aacagccguc ugguau 46
<210> 564
<211> 45
<212> RNA
<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）
<400> 564
auccaacuga caaaucccaa acaggaugaa acgcacgucc ucuau 45
<210> 565
<211> 45
<212> RNA
<213> 罗氏裂体吸虫（Schistosoma rodhaini）
<400> 565
auccaacuga ugagugucaa auaggacaaa acucuaguuc uguau 45
<210> 566
<211> 46
<212> RNA
<213> 柯拉松血吸虫（Schistosoma curassoni）
<400> 566
guauuguuga ggagucgcau accagggcga aacggccguc caauac 46
<210> 567
<211> 45
<212> RNA
<213> 马格里包氏裂体吸虫（Schistosoma margrebowiei）
<400> 567
auccgucuga caaguccuag auagaacgag acgcgcgucu uggau 45
<210> 568
<211> 55
<212> RNA
<213> 曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）
<400> 568
auccaacuga ugagucccaa auagaaccaa auaggacgaa augcaugucc uggau 55
<210> 569
<211> 108
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (21)..(85)
<223> n是a、c、g、或u
<400> 569
auccagcuga ugagucccaa nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnaggac gaaaugugca ucuuggau 108
<210> 570
<211> 46
<212> RNA
<213> 毛毕属血吸虫（Trichobilharzia regenti）
<400> 570
aucgaaauga cgagucccaa auggaacgaa acccgugucu uuugau 46
<210> 571
<211> 151
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知生物体
<400> 571
aauucauucg caaaguaauu auucuaugaa augcaaauua ucuucauaug uugugaaaca 60
uagcuuaacc acguuaaagu auaauaauau aaguuaggua ugcccuuaua aagacuuagg 120
uagcgcuaag gacuauauua uuauacuucu u 151
<210> 572
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 572
taatacgact cactataggg aat 23
<210> 573
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 573
uuuccccuga ugaguccgug aggacgaaac gaguaagcuc gucgggaaa 49
<210> 574
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 574
gggaaaaaaa ugccgucggu 20
<210> 575
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 575
accgacggca aaaaaaaaaa 20
<210> 576
<211> 464
<212> RNA
<213> 脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus）
<400> 576
gagggcccgg aaaccuggcc cugucuucuu gacgagcauu ccuagggguc uuuccccucu 60
cgccaaagga augcaagguc uguugaaugu cgugaaggaa gcaguuccuc uggaagcuuc 120
uugaagacaa acaacgucug uagcgacccu uugcaggcag cggaaccccc caccuggcga 180
caggugccuc ugcggccaaa agccacgugu auaagauaca ccugcaaagg cggcacaacc 240
ccagugccac guugugaguu ggauaguugu ggaaagaguc aaauggcucu ccucaagcgu 300
auucaacaag gggcugaagg augcccagaa gguaccccau uguaugggau cugaucuggg 360
gccucggugc acaugcuuua cauguguuua gucgagguua aaaaaacguc uaggcccccc 420
gaaccacggg gacgugguuu uccuuugaaa aacacgauga uaau 464
<210> 577
<211> 516
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 577
auggucuuca cacucgaaga uuucguuggg gacuggcgac agacagccgg cuacaaccug 60
gaccaagucc uugaacaggg aggugugucc aguuuguuuc agaaucucgg gguguccgua 120
acuccgaucc aaaggauugu ccugagcggu gaaaaugggc ugaagaucga cauccauguc 180
aucaucccgu augaaggucu gagcggcgac caaaugggcc agaucgaaaa aauuuuuaag 240
gugguguacc cuguggauga ucaucacuuu aaggugaucc ugcacuaugg cacacuggua 300
aucgacgggg uuacgccgaa caugaucgac uauuucggac ggccguauga aggcaucgcc 360
guguucgacg gcaaaaagau cacuguaaca gggacccugu ggaacggcaa caaaauuauc 420
gacgagcgcc ugaucaaccc cgacggcucc cugcuguucc gaguaaccau caacggagug 480
accggcuggc ggcugugcga acgcauucug gcguaa 516
<210> 578
<211> 68
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 578
ggccggcaug gucccagccu ccucgcuggc gccggcuggg caacaugcuu cggcauggcg 60
aaugggac 68
<210> 579
<211> 1160
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 579
taatacgact cactataggg aattttcccc tgatgagtcc gtgaggacga aacgagtaag 60
ctcgtcggga aaaaaatgcc gtcggtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg 120
agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg 180
aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc 240
aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa 300
gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa 360
agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta 420
ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg 480
aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca 540
cgatgataat gccaccatgg tcttcacact cgaagatttc gttggggact ggcgacagac 600
agccggctac aacctggacc aagtccttga acagggaggt gtgtccagtt tgtttcagaa 660
tctcggggtg tccgtaactc cgatccaaag gattgtcctg agcggtgaaa atgggctgaa 720
gatcgacatc catgtcatca tcccgtatga aggtctgagc ggcgaccaaa tgggccagat 780
cgaaaaaatt tttaaggtgg tgtaccctgt ggatgatcat cactttaagg tgatcctgca 840
ctatggcaca ctggtaatcg acggggttac gccgaacatg atcgactatt tcggacggcc 900
gtatgaaggc atcgccgtgt tcgacggcaa aaagatcact gtaacaggga ccctgtggaa 960
cggcaacaaa attatcgacg agcgcctgat caaccccgac ggctccctgc tgttccgagt 1020
aaccatcaac ggagtgaccg gctggcggct gtgcgaacgc attctggcgt aaaccgacgg 1080
caaaaaaaaa aaggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacatgc 1140
ttcggcatgg cgaatgggac 1160
<210> 580
<211> 1143
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 580
gggaauuuuc cccugaugag uccgugagga cgaaacgagu aagcucgucg ggaaaaaaau 60
gccgucggug agggcccgga aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu 120
uuccccucuc gccaaaggaa ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu 180
ggaagcuucu ugaagacaaa caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc 240
accuggcgac aggugccucu gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc 300
ggcacaaccc cagugccacg uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc 360
cucaagcgua uucaacaagg ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc 420
ugaucugggg ccucggugca caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu 480
aggccccccg aaccacgggg acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau aaugccacca 540
uggucuucac acucgaagau uucguugggg acuggcgaca gacagccggc uacaaccugg 600
accaaguccu ugaacaggga ggugugucca guuuguuuca gaaucucggg guguccguaa 660
cuccgaucca aaggauuguc cugagcggug aaaaugggcu gaagaucgac auccauguca 720
ucaucccgua ugaaggucug agcggcgacc aaaugggcca gaucgaaaaa auuuuuaagg 780
ugguguaccc uguggaugau caucacuuua aggugauccu gcacuauggc acacugguaa 840
ucgacggggu uacgccgaac augaucgacu auuucggacg gccguaugaa ggcaucgccg 900
uguucgacgg caaaaagauc acuguaacag ggacccugug gaacggcaac aaaauuaucg 960
acgagcgccu gaucaacccc gacggcuccc ugcuguuccg aguaaccauc aacggaguga 1020
ccggcuggcg gcugugcgaa cgcauucugg cguaaaccga cggcaaaaaa aaaaaggccg 1080
gcaugguccc agccuccucg cuggcgccgg cugggcaaca ugcuucggca uggcgaaugg 1140
gac 1143
<210> 581
<211> 1026
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 581
gggaaaaaaa ugccgucggu gagggcccgg aaaccuggcc cugucuucuu gacgagcauu 60
ccuagggguc uuuccccucu cgccaaagga augcaagguc uguugaaugu cgugaaggaa 120
gcaguuccuc uggaagcuuc uugaagacaa acaacgucug uagcgacccu uugcaggcag 180
cggaaccccc caccuggcga caggugccuc ugcggccaaa agccacgugu auaagauaca 240
ccugcaaagg cggcacaacc ccagugccac guugugaguu ggauaguugu ggaaagaguc 300
aaauggcucu ccucaagcgu auucaacaag gggcugaagg augcccagaa gguaccccau 360
uguaugggau cugaucuggg gccucggugc acaugcuuua cauguguuua gucgagguua 420
aaaaaacguc uaggcccccc gaaccacggg gacgugguuu uccuuugaaa aacacgauga 480
uaaugccacc auggucuuca cacucgaaga uuucguuggg gacuggcgac agacagccgg 540
cuacaaccug gaccaagucc uugaacaggg aggugugucc aguuuguuuc agaaucucgg 600
gguguccgua acuccgaucc aaaggauugu ccugagcggu gaaaaugggc ugaagaucga 660
cauccauguc aucaucccgu augaaggucu gagcggcgac caaaugggcc agaucgaaaa 720
aauuuuuaag gugguguacc cuguggauga ucaucacuuu aaggugaucc ugcacuaugg 780
cacacuggua aucgacgggg uuacgccgaa caugaucgac uauuucggac ggccguauga 840
aggcaucgcc guguucgacg gcaaaaagau cacuguaaca gggacccugu ggaacggcaa 900
caaaauuauc gacgagcgcc ugaucaaccc cgacggcucc cugcuguucc gaguaaccau 960
caacggagug accggcuggc ggcugugcga acgcauucug gcguaaaccg acggcaaaaa 1020
aaaaaa 1026
<210> 582
<211> 228
<212> RNA
<213> 未知
<220>
<223> 病毒
<400> 582
aucuaaguua gguuguaaac auauuagaga cguuguucau uuggaagagu uacgcgaguc 60
uuugugugau guagcuagua accuaaauaa uugugcguau uuuucacagu uagaugaggc 120
cguugccgag guucauaaga ccgcgguagg cgguucguuu gcuuuuugua guauaauuaa 180
auauuuguca gauaagagau uguuuagaga uuuguucuuu guuugaua 228
<210> 583
<211> 121
<212> RNA
<213> 木槿褪绿环斑病毒（Hibiscus chlorotic ringspot virus）
<400> 583
uagcuuauuu ggguucuuua ucacuguccu gauuaaggcu gaaucagaac accaucacuu 60
ccacucacac gacaguagua agacacagaa cauaguaguu aauacuggaa aguaacccac 120
c 121
<210> 584
<211> 147
<212> RNA
<213> 王蜀黍（Zea mays）
<400> 584
agcacaacau uucaaccaga aacacuagcc gaagcaaauc cauuccacaa gcaccuggug 60
ggaucaucuc aucaucagaa accaagagag agauuccgug uccgcuuguu guaguagauu 120
gugaggacug aggaccgaga agcagcc 147
<210> 585
<211> 1653
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 585
auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60
accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120
gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180
guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240
ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300
gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360
ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420
aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480
uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540
uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600
ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660
caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720
guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780
cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840
aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900
auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960
aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020
gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080
gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140
acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200
uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260
ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320
cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380
caccccaaca ucuucgacgc uggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440
cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500
uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560
gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620
aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653
<210> 586
<211> 790
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 586
gggaaaaaaa ugccgucggu aucuaaguua gguuguaaac auauuagaga cguuguucau 60
uuggaagagu uacgcgaguc uuugugugau guagcuagua accuaaauaa uugugcguau 120
uuuucacagu uagaugaggc cguugccgag guucauaaga ccgcgguagg cgguucguuu 180
gcuuuuugua guauaauuaa auauuuguca gauaagagau uguuuagaga uuuguucuuu 240
guuugauagc caccaugguc uucacacucg aagauuucgu uggggacugg cgacagacag 300
ccggcuacaa ccuggaccaa guccuugaac agggaggugu guccaguuug uuucagaauc 360
ucgggguguc cguaacuccg auccaaagga uuguccugag cggugaaaau gggcugaaga 420
ucgacaucca ugucaucauc ccguaugaag gucugagcgg cgaccaaaug ggccagaucg 480
aaaaaauuuu uaagguggug uacccugugg augaucauca cuuuaaggug auccugcacu 540
auggcacacu gguaaucgac gggguuacgc cgaacaugau cgacuauuuc ggacggccgu 600
augaaggcau cgccguguuc gacggcaaaa agaucacugu aacagggacc cuguggaacg 660
gcaacaaaau uaucgacgag cgccugauca accccgacgg cucccugcug uuccgaguaa 720
ccaucaacgg agugaccggc uggcggcugu gcgaacgcau ucuggcguaa accgacggca 780
aaaaaaaaaa 790
<210> 587
<211> 1876
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 587
gggaaaaaaa ugccgucggu agcacaacau uucaaccaga aacacuagcc gaagcaaauc 60
cauuccacaa gcaccuggug ggaucaucuc aucaucagaa accaagagag agauuccgug 120
uccgcuuguu guaguagauu gugaggacug aggaccgaga agcagccgcc accaaugaga 180
gaccuuuuaa aaggucucua augauggagg acgccaagaa caucaagaag ggccccgccc 240
ccuucuaccc ccuggaggac ggcaccgccg gcgagcagcu gcacaaggcc augaagcggu 300
acgcccuggu gcccggcacc aucgccuuca ccgacgccca caucgaggug gacaucaccu 360
acgccgagua cuucgagaug agcgugcggc uggccgaggc caugaagcgg uacggccuga 420
acaccaacca ccggaucgug gugugcagcg agaacagccu gcaguucuuc augcccgugc 480
ugggcgcccu guucaucggc guggccgugg cccccgccaa cgacaucuac aacgagcggg 540
agcugcugaa cagcaugggc aucagccagc ccaccguggu guucgugagc aagaagggcc 600
ugcagaagau ccugaacgug cagaagaagc ugcccaucau ccagaagauc aucaucaugg 660
acagcaagac cgacuaccag ggcuuccaga gcauguacac cuucgugacc agccaccugc 720
cccccggcuu caacgaguac gacuucgugc ccgagagcuu cgaccgggac aagaccaucg 780
cccugaucau gaacagcagc ggcagcaccg gccugcccaa gggcguggcc cugccccacc 840
ggaccgccug cgugcgguuc agccacgccc gggaccccau cuucggcaac cagaucaucc 900
ccgacaccgc cauccugagc guggugcccu uccaccacgg cuucggcaug uucaccaccc 960
ugggcuaccu gaucugcggc uuccgggugg ugcugaugua ccgguucgag gaggagcugu 1020
uccugcggag ccugcaggac uacaagaucc agagcgcccu gcuggugccc acccuguuca 1080
gcuucuucgc caagagcacc cugaucgaca aguacgaccu gagcaaccug cacgagaucg 1140
ccagcggcgg cgccccccug agcaaggagg ugggcgaggc cguggccaag cgguuccacc 1200
ugcccggcau ccggcagggc uacggccuga ccgagaccac cagcgccauc cugaucaccc 1260
ccgagggcga cgacaagccc ggcgccgugg gcaagguggu gcccuucuuc gaggccaagg 1320
ugguggaccu ggacaccggc aagacccugg gcgugaacca gcggggcgag cugugcgugc 1380
ggggccccau gaucaugagc ggcuacguga acaaccccga ggccaccaac gcccugaucg 1440
acaaggacgg cuggcugcac agcggcgaca ucgccuacug ggacgaggac gagcacuucu 1500
ucaucgugga ccggcugaag agccugauca aguacaaggg cuaccaggug gcccccgccg 1560
agcuggagag cauccugcug cagcacccca acaucuucga cgccggcgug gccggccugc 1620
ccgacgacga cgccggcgag cugcccgccg ccgugguggu gcuggagcac ggcaagacca 1680
ugaccgagaa ggagaucgug gacuacgugg ccagccaggu gaccaccgcc aagaagcugc 1740
ggggcggcgu gguguucgug gacgaggugc ccaagggccu gaccggcaag cuggacgccc 1800
ggaagauccg ggagauccug aucaaggcca agaagggcgg caagaucgcc gugugaaccg 1860
acggcaaaaa aaaaaa 1876
<210> 588
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 588
tttcccctga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtcgggaaa 49
<210> 589
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 589
gggaaaaaaa tgccgtcggt 20
<210> 590
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 590
accgacggca aaaaaaaaaa 20
<210> 591
<211> 464
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 591
gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 60
cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 120
ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 180
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 240
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 300
attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 360
gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 420
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taat 464
<210> 592
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 592
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 593
<211> 68
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 病毒
<400> 593
ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 60
aatgggac 68
<210> 594
<211> 683
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 594
gggaaaaaaa ugccgucggu uagcuuauuu ggguucuuua ucacuguccu gauuaaggcu 60
gaaucagaac accaucacuu ccacucacac gacaguagua agacacagaa cauaguaguu 120
aauacuggaa aguaacccac cgccaccaug gucuucacac ucgaagauuu cguuggggac 180
uggcgacaga cagccggcua caaccuggac caaguccuug aacagggagg uguguccagu 240
uuguuucaga aucucggggu guccguaacu ccgauccaaa ggauuguccu gagcggugaa 300
aaugggcuga agaucgacau ccaugucauc aucccguaug aaggucugag cggcgaccaa 360
augggccaga ucgaaaaaau uuuuaaggug guguacccug uggaugauca ucacuuuaag 420
gugauccugc acuauggcac acugguaauc gacgggguua cgccgaacau gaucgacuau 480
uucggacggc cguaugaagg caucgccgug uucgacggca aaaagaucac uguaacaggg 540
acccugugga acggcaacaa aauuaucgac gagcgccuga ucaaccccga cggcucccug 600
cuguuccgag uaaccaucaa cggagugacc ggcuggcggc ugugcgaacg cauucuggcg 660
uaaaccgacg gcaaaaaaaa aaa 683
<210> 595
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 595
ccggtcccaa gcccggataa aatccgaggg ggcgggaaac cgcctaa 47
<210> 596
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 596
aacactgcca atgccggtcc caagcccgga taaaagtgga gggaaagggg atagt 55
<210> 597
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 597
ggatgtgttc cctaggaggg tgggtgt 27
<210> 598
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 598
acacctctcc ccctcccagg tactatcccc tttc 34
<210> 599
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 599
ttggaccaat cgtggcgtgt cggcctgctt cggcaggcac tggcgccgtc cag 53
<210> 600
<211> 29
<212> DNA
<213> 卫星烟草坏死病毒
<400> 600
agtaaagaca ggaaacttta ctgactaac 29
<210> 601
<211> 122
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 病毒
<400> 601
agatatcgac ctgcctgacc aggctgagat tgcgctagcc ggcgtagttg gtatctctcg 60
cgcaagcggg tttgaaggtg cggcctatct taggggggta aattgtaact tcgcacaaag 120
gc 122
<210> 602
<211> 38
<212> DNA
<213> 烟草坏死病毒
<400> 602
gatacctaac cagtgtctca gtgattaagt aatcagct 38
<210> 603
<211> 140
<212> DNA
<213> 大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus）
<400> 603
gtgaagattg accatctcac aaaagctgtt acgtgcttgt aacacactac gcgcccgttt 60
tgtattcggg aagtagttgc gaaaacggtc cccttattgc ctgacaagct aagggccacc 120
cttctttccc caccgccatc 140
<210> 604
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成的
<400> 604
caaccacaac gctctaacgc aatcaatcta cattatatta aa 42
<210> 605
<211> 619
<212> DNA
<213> 卫星烟草坏死病毒
<400> 605
tcccagaggt tcacaatgtt agtgatgggg cgctgaaaga tgcgtagcta cccttctgga 60
gccacttcct ggtggtaagc agaaatccaa gggtacggtg gtacggtgga aagcagtccc 120
agctctgcat tgggaaccgg cttacaccca gcttagggct aaagtgtact acttgctcat 180
ttgtagtcta aatgagacgt tggcctcgac gtgtcgaggt ggcctaaggg attggaaccc 240
ctgatggtcg tagtcgaatt tcccgtgttt cattccgagt ctcttggtca taatgccatt 300
agtaggtcta gcactcaacg taacttcaaa gatatcctcc ttgcaacaag aatatgtgcg 360
ccgtctgtgt ttaaagcggt atattaagtg cgccggcata tcgttgtttg gaccagggcc 420
ccacgccggt tggtacccgg gtggcttccc ctcgttcaca gggctttagg agatgataag 480
gtatagttat tagacaaatg cggacaaacc tgaaaagctc gctagtggtg ggctggccaa 540
gcgaagaacc tcatccaggt atagttctac atgggaaatt tggtaccatc caaacttcta 600
tgaagtcctc gactacccc 619
<210> 606
<211> 221
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 病毒
<400> 606
gacaaactct ccgcctaatg tctgatgatg tgaggaacgt ggactgtgat gtggtggtgc 60
ggtaccatgg ctggtcacca tggtaatgcg tagggcaaca cagttcatta agactcactg 120
atgatggcac taggcacggt tcacccccat ccttcgggag ggctataggg ggtgaccggg 180
ttacaccacc ggaagaccgg aacattgcct ttgggcagcc c 221
<210> 607
<211> 306
<212> DNA
<213> 烟草坏死病毒
<400> 607
ttgctttcat agatccgtct tccgggagac gttaagaaga cacccgataa aaatagtaag 60
tagagttgtg gcgtgacaac ccacaactgc atctctttgc ttatctaatt acaatatatg 120
ttgacgtaca agccggatcc tgggaaacag gtttaacggg ctcactgtgg tggtgggccg 180
tcgatacact tgtatgtgcc ccaatattgg ttgtcgataa gcgtcctgac atggctccat 240
gcaacagcat gggggggtcc agagtcagtc ccctctttat ttacctagag atctctctag 300
gaaccc 306
<210> 608
<211> 869
<212> DNA
<213> 大麦黄矮病毒
<400> 608
agtgaagaca acaccactag cacaaatcgg atcctgggaa acaggcagaa cttcggttcg 60
taagctcggg taggccgtca acctaccgcc gtatcgtatt gtgtttggcc gatggaggat 120
cttcacgtta tcgccgtttg tattcttgct ttgactgtgc tctctggggt aggcgctgtt 180
ttgagttgct gccgttggtg ctgcagcaat ccttttcctc cctccctctc ttctgttcaa 240
gcaaaagact ctcgatctgt gcgagagaca atcaaaaata tcgagggagc ttcggctcag 300
tgaggggatt aacgaccccc agtaatggcc ggtcctggcg gacataaata acccgctata 360
ggacgaagtg gtagccacca ctgatcaaat ggcaaacatg cttctgtgtt gtacactgcc 420
ccggagccta ccgggtcaac aaggctatcc caccaacccg atgaaatgag ggtggagtga 480
gcggagtggg tgacttcgtg atgtacaccc gatcgtcagg attgaagacg ttaaaactcg 540
acgacctggt acaagtcgtt aaactgactc gggtggatac accacacccg gcccagcatg 600
ttggcatacc cacgatacga aacgtgggtc tcttggagcc actacctgtg atgcaaggta 660
gggtatgagt cttagcaagc tctgagccag gagatggaca taaaccatag caatccaacg 720
tgtaaccgca atggggcaaa caacaggtga accgtgtcca cgggcctggt taccgaaagg 780
aaagccagta tccaacacag caatgtgttg ggggtcacac cttcggggta ctcttaacgc 840
tgacactcga aagagcagtt cggcaaccc 869
<210> 609
<211> 183
<212> PRT
<213> 豇豆花叶病毒
<400> 609
Thr Thr Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Thr Cys Ala Thr
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Gly Thr Thr
20 25 30
Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Thr
35 40 45
Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Thr
50 55 60
Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr
65 70 75 80
Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr
85 90 95
Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Thr Gly Ala Gly
115 120 125
Cys Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr
130 135 140
Cys Gly Thr Cys Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Ala
165 170 175
Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr
180
<210> 610
<211> 41
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 610
tcgcacaaga aaataaaaga tttgtagaat caactaagaa a 41
<210> 611
<211> 22
<212> DNA
<213> 烟草花叶病毒
<400> 611
acaattacta tttacaatta ca 22
<210> 612
<211> 137
<212> DNA
<213> 芜菁皱缩病毒（Turnip crinkle virus）
<400> 612
ggtaatatat gctttctaca actctctctc actggtcctc ctactttgtc atctgattcc 60
tgaaatcaaa ccgattcaca catcctacaa cacacacgac tcatcgaagc agcaacacat 120
aagcatcaac actggaa 137
<210> 613
<211> 255
<212> DNA
<213> 芜菁皱缩病毒
<400> 613
tacggtaata gtgtagtctt ctcatcttag tagttagctc tctcttatat taagaaaaga 60
aaacaaaaac ccccaggtcg ctttattttg acctgtgtta gggaccaaaa acggtggcag 120
cactgtctag ctgcgggcat tagactggaa aactagtgct ctttgggtaa ccactaaaat 180
cccgaaaggg tgggctgtgg tgaccttccg aactaaaaga tagcctccct cctcgcgcgg 240
gggggggtcc tgccc 255

Claims (35)

1.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：
(a)提供线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：
(i)5'自切割核酶；
(ii)包含5'互补区的5'退火区；
(iii)多核糖核苷酸负载物；
(iv)包含3'互补区的3'退火区；以及
(v)3'自切割核酶；
其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；并且
其中该线性多核糖核苷酸处于适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶的条件下的无细胞系统中的溶液中，从而在该无细胞系统中产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及
(b)在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使在该无细胞系统中的该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与连接酶接触；从而产生环状多核糖核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸通过从编码该线性多核苷酸的脱氧核糖核苷酸转录来提供，任选地其中该脱氧核糖核苷酸是在该无细胞系统中。
3.如权利要求2所述的方法，其中该转录在包含该连接酶的溶液中进行。
4.如权利要求1所述的方法，其中该5'自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶、和手枪核酶。
5.如权利要求1所述的方法，其中该3'自切割核酶是选自由以下组成的组的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶、和手枪核酶。
6.如权利要求1所述的方法，其中该5’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且该3’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性，并且任选地其中该5'互补区和该3'互补区包括在它们之间的不多于10个错配。
8.如权利要求1所述的方法，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且其中该3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中：
(a)该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；和/或
(b)该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；和/或
(c)该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
9.如权利要求1所述的方法，其中该3'退火区和该5'退火区促进游离的3'和5'端的缔合。
10.如权利要求1所述的方法，其中该多核糖核苷酸负载物包含：
(a)至少一个编码多肽的编码序列；或
(b)至少一个非编码序列；或
(c)至少一个编码多肽的编码序列和至少一个非编码序列的组合。
11.如权利要求1所述的方法，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽包含在脊椎动物、无脊椎动物、植物或微生物的基因组中编码的氨基酸序列，并且/或者其中该多肽包含治疗性多肽、植物修饰多肽、或农业多肽。
12.如权利要求1所述的方法，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且进一步包含选自由以下组成的组的额外的元件：
(a)内部核糖体进入位点(IRES)或5’UTR序列，其位于该编码序列的5'并与之可操作地连接，任选地在该IRES或5'UTR序列与该编码序列之间具有插入核糖核苷酸；
(b)3’UTR序列，其位于该编码序列的3'并与之可操作地连接，任选地在该3'UTR与该编码序列之间具有插入核糖核苷酸；
(c)(a)和(b)两者。
13.如权利要求1所述的方法，其中该线性多核糖核苷酸进一步包含在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区，任选地其中该间隔子区包含聚A序列或聚A-C序列。
14.如权利要求1所述的方法，其中该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的5’-羟基基团，并且/或者该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的2',3'-环磷酸。
15.如权利要求1所述的方法，其中该连接酶是RNA连接酶，任选地其中该RNA连接酶是tRNA连接酶。
16.如权利要求15所述的方法，其中该tRNA连接酶是(a)选自由以下组成的组的连接酶：T4连接酶、RtcB连接酶、TRL-1连接酶、和Rnl1连接酶、Rnl2连接酶、LIG1连接酶、LIG2连接酶、PNK/PNL连接酶、PF0027连接酶、thpR ligT连接酶、和ytlPor连接酶；或(b)选自由以下组成的组的连接酶：植物RNA连接酶、叶绿体RNA连接酶、来自古细菌的RNA连接酶、细菌RNA连接酶、真核RNA连接酶、病毒RNA连接酶、和线粒体RNA连接酶。
17.一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸通过如权利要求1所述的方法产生。
18.一种线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：
(a)5'自切割核酶；
(b)包含5'互补区的5'退火区；
(c)多核糖核苷酸负载物；
(d)包含3'互补区的3'退火区；以及
(e)3'自切割核酶；
其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm。
19.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶、和手枪核酶。
20.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该3'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶、Varkud卫星(VS)核酶、glmS核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶、和手枪核酶。
21.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该5’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且该3’互补区具有在5与50个之间的核糖核苷酸。
22.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性，并且任选地其中该5'互补区和该3'互补区包括在它们之间的不多于10个错配。
23.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且其中该3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中：
(a)该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；和/或
(b)该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；和/或
(c)该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
24.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含：
(a)至少一个编码多肽的编码序列；或
(b)至少一个非编码序列；或
(c)至少一个编码多肽的编码序列和至少一个非编码序列的组合。
25.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽包含在脊椎动物、无脊椎动物、植物或微生物的基因组中编码的氨基酸序列。
26.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸负载物包含至少一个编码多肽的编码序列，并且其中该多肽是治疗性多肽、植物修饰多肽、或农业多肽。
27.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，该线性多核糖核苷酸进一步包含在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区，任选地其中该间隔子区包含聚A序列或聚A-C序列。
28.一种DNA分子，该DNA分子包含编码如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸的DNA序列，任选地进一步包含与编码该线性多核糖核苷酸的DNA序列可操作地连接的异源启动子。
29.如权利要求28所述的DNA分子，其中该异源启动子是选自包含以下的组的启动子：T7启动子、T6启动子、T4启动子、T3启动子、SP3启动子、和SP6启动子。
30.一种无细胞系统，该无细胞系统用于生成环状RNA，该系统包含含有以下的溶液：
(a)线性多核糖核苷酸，
其中该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：
(i)5'自切割核酶；
(ii)包含5'互补区的5'退火区；
(iii)多核糖核苷酸负载物；
(iv)包含3'互补区的3'退火区；以及
(v)3'自切割核酶；
其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；以及
(b)连接酶；
其中该溶液的条件适合于切割该5'自切割核酶和该3'自切割核酶以及通过该连接酶连接所得的连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端，从而生成环状RNA。
31.一种环状RNA，该环状RNA通过如权利要求30所述的无细胞系统生成。
32.一种产生环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括：
(a)使线性多核糖核苷酸经受适合于切割自切割核酶的条件，其中该线性多核糖核苷酸包含以5'至3'方向可操作地连接的以下项：
(i)5'自切割核酶；
(ii)包含5'互补区的5'退火区；
(iii)多核糖核苷酸负载物；
(iv)包含3'互补区的3'退火区；以及
(v)3'自切割核酶；
其中该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol的结合自由能，并且/或者其中该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃的结合Tm；并且
由此该5'自切割核酶和该3'自切割核酶被切割以产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸；
(b)任选地纯化该连接酶相容的线性多核糖核苷酸；以及
(c)在无细胞系统中，在适合于连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'和3'端的条件下，使该连接酶相容的线性多核糖核苷酸与RNA连接酶接触，任选地其中该RNA连接酶是tRNA连接酶；
从而产生环状多核糖核苷酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中该5’互补区和该3’互补区具有在50％与100％之间的序列互补性，并且任选地其中该5'互补区和该3'互补区包括在它们之间的不多于10个错配。
34.如权利要求32所述的方法，其中该5'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该5'互补区的5'的5'非互补区；并且其中该3'退火区进一步包含具有在5与50个之间的核糖核苷酸并且位于该3'互补区的3'的3'非互补区；并且其中：
(a)该5’非互补区和该3’非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性；并且/或者
(b)该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能；并且/或者
(c)该5'非互补区和该3'非互补区具有低于10℃的结合Tm。
35.如权利要求32所述的方法，其中该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的5’-羟基基团，并且/或者该连接酶相容的线性多核糖核苷酸包括游离的2',3'-环磷酸。
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