JP2019506848A - 昆虫防除の方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2015年12月31日に出願された米国仮出願第62/273,654号に対する優先権を主張し、その全開示が参照により組み込まれる。
「配列表」のハードコピーと、27キロバイトのサイズであり、2016年12月7日に作成されたInsect_Control_Sequence_Listing_ST25.txtと名付けられた配列表のコンピュータ可読形式の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
毒素及び造影剤のヒト癌細胞へのバクテリオファージMS2カプシド介在性の送達は、そのような薬剤をインビトロで真核細胞に送達するための有効な方法であることが示されている。Ashley,et al.,Cell−specific delivery of diverse cargos by bacteriophage MS2 virus−like particles.ACS nano 5:5729(2011)。そのようなバクテリオファージカプシドが、RNAi前駆体を野外の昆虫に送達するために同様の機能を果たすことができるかどうかは不明である。標的昆虫へのRNAi前駆体の有効な送達は、RNAi前駆体が昆虫によって取り込まれ、適切にプロセシングされるように、非特異的RNA分解を防止すること、容易な投与経路、及び標的昆虫内の適切な点でRNAi前駆体を放出する能力を必要とする。理想的には、RNAi前駆体及び送達システムは、経済的で、生産及び分配するのが比較的簡単でなければならない。本明細書に記載された発明は、これらのすべての基準を満たし、新しいRNAi分子の迅速な発見、プロトタイピング、及び商業規模の生産を可能にするという追加の利点を有する。
RNAi前駆体を含むVLPによるコロラドハムシ防除の効果
コロラドハムシ(別の甲虫類)のβ−アクチン遺伝子を標的とするdsRNAi前駆体を含むVLPが、裸のdsRNAi前駆体と同様に有効にβ−アクチン発現を抑制できるかどうかを決定するために、以下の研究を行った。コロラドハムシ由来のβアクチンの294bp断片(Leptinotarsa decemlineata株FreevilleアクチンmRNA、GenBank配列ID:gb|KJ577616.1、ヌクレオチド1〜294)を、pAPSE10136(配列番号1)にクローニングして非相同配列の短いループによって分離された対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む配列を有する転写物を産生することができる。このRNAは、βアクチンを標的とする294bp dsRNAi前駆体を表す。dsRNAi前駆体DNA配列は、プライマー1174(配列番号2)及び1175(配列番号3)を用いるコロラドハムシ染色体DNA由来の294bpの関心領域のPCR増幅によって産生され、このPCR産物は、ベクターにコードしたT7遺伝子1プロモーターの1つに対してセンス方向で制限エンドヌクレアーゼAsiSI及びPmeIによりPCR断片及びベクターを消化することによって、中間プラスミドに連結した。プライマー1213(配列番号4)及び1203(配列番号5)を用いたPCR増幅によって、センス鎖DNA断片からループ及びアンチセンス配列を作製した。得られたPCR断片及び中間プラスミドをPmeI及びRsrIIで消化し、一緒に連結した。T7遺伝子プロモーターから発現された短いリンカーによって連結されたβ−アクチンセンス及びアンチセンス鎖配列をコードする所望の組換えプラスミドを、制限消化スクリーニングによって同定した。所望のプラスミドpAPSE10216(配列番号6)を化学的コンピテントHTE115(DE3)細胞に形質転換し、個々のクローンをアンピシリン耐性形質転換体について選択した。
一本鎖アンチセンスRNAを含むVLPによるコロラドハムシ幼虫の防除の効果
VLPの使用によってアンチセンスRNA(ssRNAi)が標的昆虫に有効に送達され得るかどうかを試験するために、コロラドハムシ(Leptinotarsa decemlineata株、Freeville actin mRNA、GenBank配列番号:gb|KJ577616.1、ヌクレオチド1〜294)のβアクチン遺伝子の一部に対応する294bp DNA配列断片をプライマー1176(配列番号7)及び1177(配列番号8)から構築した。このプライマーをIDT(Integrated DNA Technologies、Inc.、Coralville、Iowa)から取り寄せ、同時にβアクチン配列断片の5’側AsiSI制限部位及びβアクチン配列断片の3’側PmeI制限部位を添加して、Accuprime PCRによってコロラドハムシゲノムDNA由来のβアクチン配列断片を増幅するのに使用する。得られたPCR産物をAsiSI及びPmeI制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後上流のT7プロモーターに対してアンチセンス方向で、AsiSI及びPmeIで前処理したpAPSE10136(配列番号1)に連結してpAPSE10190(配列番号9)を形成する。このプラスミドは、転写物にバクテリオファージpac部位を組み込むことによって、β−アクチンアンチセンス鎖RNA(ssRNAi)を高効率でVLPにパッケージングすることを可能にする。化学的にコンピテントなHTE115(DE3)細胞を形質転換し、VLPを発酵により産生し、続いて実施例2に記載のように単離した。次に、実施例2に記載したようにコロラドハムシ幼虫を抑制する能力についてVLPを試験した。表2は結果をまとめたものである。
Claims (16)
- 標的昆虫を防除する方法であって、バクテリオファージカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含む第1のDNA配列及びRNAi前駆体配列に結合された少なくとも1つのバクテリオファージpac配列を含むRNA転写物をコードする第2のDNA配列にて微生物宿主を形質転換することと、前記第1及び第2のDNA配列を発現するように前記微生物宿主を誘導することと、前記微生物宿主から前記カプシドタンパク質及びRNAi前駆体を含むウイルス様粒子(VLP)を単離することと、前記単離されたVLPを前記標的昆虫と接触させることとを含む、方法。
- 前記バクテリオファージカプシドタンパク質がレビウイルスから誘導される、請求項1に記載の第1のDNA配列。
- 前記レビウイルスがQβである、請求項2に記載の第1のDNA配列。
- 前記レビウイルスがMS2である、請求項2に記載の第1のDNA配列。
- 前記RNAi前駆体がsiRNAを形成する、請求項1に記載の第2のDNA配列。
- 前記RNAi前駆体がアンチセンスRNAを形成する、請求項1に記載の第2のDNA配列。
- 前記第1のDNA配列及び第2のDNA配列が別個のエピソーム上にある、請求項1に記載の微生物宿主。
- 前記第1のDNA配列及び前記第2のDNA配列が同じエピソーム上にある、請求項1に記載の微生物宿主。
- 前記第1のDNA配列及び前記第2のDNA配列のうちの一方が細菌宿主染色体に組み込まれる、請求項1に記載の微生物宿主。
- 前記第1のDNA配列及び前記第2のDNA配列の両方が細菌宿主染色体に組み込まれる、請求項1に記載の微生物宿主。
- 前記微生物宿主が細菌である、請求項1に記載の微生物宿主。
- 前記細菌がEscherichia coliである、請求項11に記載の細菌。
- 前記微生物宿主が酵母である、請求項1に記載の微生物宿主。
- 前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項13に記載の酵母。
- 前記標的昆虫がコウチュウ目昆虫を含む、請求項1に記載の標的昆虫の防除方法。
- 前記標的昆虫がコロラドハムシを含む、請求項15に記載のコウチュウ目昆虫。
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