JP2015500662A - 加水分解酵素に対して耐性があるカプシドを有するｖｌｐを用いるプロセス - Google Patents

加水分解酵素に対して耐性があるカプシドを有するｖｌｐを用いるプロセス Download PDF

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Abstract

ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのような核酸、並びに小型ペプチドを含む目的の標的カーゴ分子を封入し、続いて単離及び精製するウイルス様粒子を調製するためにヒドロラーゼに耐性があるウイルスカプシドタンパク質を使用する、新規プロセス及び組成物が記載される。１つの態様において、本開示は、少なくとも１つの異種カーゴ分子及びパッキング配列を包むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。ＶＬＰは、更にカプシドによって包み込まれた少なくとも１つのリボザイムを含む。異種カーゴ分子は、オリゴヌクレオチド、又はオリゴリボヌクレオチドを含んでもよい。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／５７８，７０６号（２０１１年１２月２１日出願）、米国仮特許出願第６１／６０７，９００号（２０１２年３月７日出願）、米国仮特許出願第６１／６６１，６８８号（２０１２年６月１９日出願）（その開示全部が、本発明において参考として含まれる）に対する優先権を主張し、そのすべての開示は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
ファイル名４５００６１＿配列表＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（容量７７キロバイト）を含み２０１２年１２月２０日に作成された、「配列表」の紙のコピー及びフロッピー（登録商標）ディスクで配列表のコンピューターに読み込み可能な形式の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ウイルス様粒子に関し、特に異種核酸を製造、区分け及び精製するためのナノコンテナのようなウイルスカプシドを用いた方法及び組成物に関する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルス外皮及び／又はウイルスカプシドを作り出す特定のウイルス構造タンパク質の発現を介してウイルスから部分的に得られた粒子であるが、ＶＬＰはウイルスゲノムを包含せず非感染性である。例えば、ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルス及び特定の他のウイルスから抽出され、ウイルス集合及びワクチン開発の研究に使用されている。
ウイルスカプシドは少なくとも１つのタンパク質、カプシドを形成するために組み立てるいくつかの複製から成る。あるウイルスにおいて、ウイルスカプシドはウイルス外皮で覆われている。そのようなウイルス外皮は、ウイルス糖タンパク質及び感染宿主細胞膜から成っており、別の方法でウイルスカプシドと接触する巨大分子からウイルスカプシドを保護する。カプシドは一般的に、ウイルスゲノム及び自然環境においてウイルスの持続に必要であるタンパク質も時々コードする核酸をカプシド形成するといわれている。新規の宿主に入るウイルスのウイルスゲノムに対して、カプシドを分解しなければならない。そのような分解は、それ自身も夾雑成分も退化するため通常は宿主によって使用される条件下で起こり、ほとんどの場合タンパク質分解を伴う。ウイルスは、それらのサイクル、すなわち、カプシド分解及びゲノム放出の欠かせない部分を可能にするためにタンパク質分解などの正常宿主工程を活用する。
従って、ペプチド結合に影響するヒドロラーゼのため、文献にはカプシド抵抗をこれまで記述しなかったことは驚くべきことではない。より大きなタンパク質である非常に限られた数の特定の特異ペプチド配列は、特定のプロテアーゼに対していくらか抵抗があることで知られているが、ペプチド配列の大部分ではない。タンパク質分解に抵抗するウイルスは、報告されていたが、これらはすべてエンベロープを持ったウイルスで、カプシドがウイルス外皮で保護する。そのようなウイルスにおいて、カプシドは記述されたプロテアーゼと接触しない、すなわち、記述されたプロテアーゼから保護する。従って、たとえあったとしても、そのような状況においてウイルスカプシドのタンパク質分解性の安定性の役割は知られていない。
タンパク質などの組み換え分子の大規模製造において、限外濾過はその単離につながる精製法で標的タンパク質より小さい分子を除去するのによく用いられる。精製法は、またしばしば沈殿、溶媒抽出、結晶化技術を伴う。これら分離技術は、クロマトグラフィーと対照的に、それらは表面でなくバルク相互作用に基づいているから、本質的に簡単で低価格である。しかし、これらの技術は典型的に簡易なシステム、並びに各タンパク質及び発現システムに必要な条件の異なる設定を明記する必要により、用途が限定されている。けれども各標準組み換え型タンパク質は、一意的な一組の結合相互作用を示し、それによってその単離過程唯一及び複体を作る。それ故に、これら簡易単離過程を用いた組み換えタンパクに対して分離効率は低い。
核酸（ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡが挙げられる）は化学的合成法を用いて大部分製造する。これらの方法は、必要とされる多くの工程及び技術的困難になりやすい反応、及び製造システムのコストの複雑性のため、一般的に複雑で高コストである。更に、複雑な合成試薬は、高価でそのためスケールメリットはバッチサイズを簡単に増やすことによって容易には得られない。
１つの態様において、本開示は、少なくとも１つの異種カーゴ分子及びパッキング配列を包むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。ＶＬＰは、更にカプシドによって包み込まれた少なくとも１つのリボザイムを含む。異種カーゴ分子は、オリゴヌクレオチド、又はオリゴリボヌクレオチドを含んでもよい。ＶＬＰは１つ以上のリボザイムを含んでもよく、リボザイムは核酸構築物を形成するためパッキング配列及びオリゴリボヌクレオチドに隣接してもよい。ＶＬＰは、複数の核酸構築物を含んでもよい。オリゴリボヌクレオチドを含むＶＬＰにおいて、オリゴリボヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡから選ばれた短いＲＮＡであってもよい。ＶＬＰは、少なくとも２つのリボザイムを含んでもよく、各リボザイムは短いＲＮＡの一端を切り取るために選ばれる。ＶＬＰは、更に少なくとも１〜１００のヌクレオチドから成るリンカー、少なくとも４０％のＡ又は少なくとも４０％のＵを含むリンカーを含んでもよく、そのリンカーはオリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列、又はオリゴリボヌクレオチド及びリボザイムを結びつける。リボザイムは、例えばハンマーヘッド型リボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選ばれてもよい。ハンマーヘッド型リボザイムは、少なくとも６つのオリゴリボヌクレオチドの連続的なヌクレオチドに対して相補的な連続した一連のヌクレオチドを有するハンマーヘッド型リボザイム変異体であってもよい。あるいは、リボザイムは、野生型肝炎デルタＶリボザイムの割合多くても約５０％の割合でオリゴリボヌクレオチドとのつながりを開裂できる変異型肝炎デルタＶリボザイムであってもよい。そのような変異型ＨＤＶリボザイムは、例えば、配列番号：１０〜１８から選ばれた核酸配列を有してもよい。
本開示によるＶＬＰは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４、又は野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４５％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質によって触媒された加水分解に対して耐性がある野生型ウイルスカプシドを含むカプシドを含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質を含んでもよい。
本開示によるＶＬＰは、ペプチド又はポリペプチドを含む異種カーゴ分子を含んでもよい。ＶＬＰは、異種カーゴペプチド又はポリペプチド分子及びウイルスカプシドを結びつけるオリゴヌクレオチドリンカーを更に含んでもよい。オリゴヌクレオチドリンカーはリボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドであってもよい。あるいは、異種カーゴ分子は、特に約１，５００Ｄａ以下の分子量を有する生物活性小分子を結びつける第１のアプタマー配列及びカプシドのパッキング配列を結びつけるための第２のアプタマー配列を含む二官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含んでもよい。ＶＬＰは、更に第１のアプタマー配列を結びつけた生物活性小分子を含んでもよい。生物活性小分子は、例えば、アトラジン、アセタミプリドホレート、プロフェノホス、イソカルボホス及びオメトエートから選ばれてもよい、除草剤又は殺虫剤を含んでもよい。
別の態様において、本開示は、短いＲＮＡ、リボザイム及びパッキング配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。短いＲＮＡは、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。核酸構築物は、４〜１００ヌクレオチド、その中で少なくとも４０％Ａ’ｓ又は少なくとも４０％Ｔ’ｓの連結ヌクレオチド配列を更に含んでもよく、その連結ヌクレオチド配列はパッキングコード配列及び短いＲＮＡコード配列に隣接する。核酸構築物は、４〜１００ヌクレオチド、その中で少なくとも４０％Ａ’ｓ又は少なくとも４０％Ｕ’ｓの連結ヌクレオチド配列を更に含んでもよく、その連結ヌクレオチド配列はリボザイム及び短いＲＮＡコード化配列に隣接する。リボザイム配列は、短いＲＮＡ及びパッキング配列に隣接してもよい。本開示は、また任意のそのような核酸構築物、及びそのようなベクトルを含む宿主細胞、並びにそのようなベクトルで安定して変形する宿主細胞を含むベクトルを含む。宿主細胞は、例えば、大腸菌細胞に限定されない細胞性細胞、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞又は酵母細胞であってもよい。宿主細胞は、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるウイルスカプシドをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクトルで更に安定して変形してもよい。第２の核酸配列は、例えば、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも４０％の配列同一を有するウイルスカプシドをコードするウイルスタンパク質をコード化してもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。本明細書中に記載されるような核酸構築物は、また野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）をコード化してもよい。そのような核酸構築物のリボザイムは、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、少なくとも６つの短いＲＮＡの連続的なヌクレオチドに対して相補的な連続した一連のヌクレオチドを有するハンマーヘッド型リボザイム変異体、肝炎デルタＶリボザイム、又は野生型肝炎デルタＶリボザイムの割合が多くても約５０％の割合で短いＲＮＡとのつながりを開裂できる変異型肝炎デルタVリボザイムであってもよい。非限定的だが例示的な変異型ＨＤＶリボザイムは、配列番号：１０〜１８から選ばれた核酸配列を有する。本開示は、また本明細書に記載された核酸構築物を含むために変形する植物又は植物組織、及び植物又は植物組織の種子又は子孫を含み、その種子又は子孫は核酸構築物を含む。
別の態様において、本開示は、ａ）少なくとも１つの異種カーゴ分子を包むウイルスカプシドをそれぞれ含む複数のウイルス様粒子、及びｂ）組成物中に存在するカプシドの１００グラム毎に４グラム未満の量中に存在する１つ以上の細胞溶解産物を提供し、その細胞溶解産物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びこれらの組み合わせから選ばれる。組成物において、カプシドは、例えば、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４５％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）を含んでもよい。組成物において、異種カーゴ分子は、オリゴリボヌクレオチドであってもよいオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴリボヌクレオチドは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選ばれてもよい。組成物において、各ウイルス様粒子は、更に少なくとも１つのリボザイムを含んでもよく、そのリボザイムは核酸構築物を形成するためパッキング配列及びオリゴリボヌクレオチドに隣接し、各ウイルス様粒子は、複数の核酸構築物を含んでもよい。そのような組成物のＶＬＰにおいて、リボザイムは、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、少なくとも６つの短いＲＮＡの連続的なヌクレオチドに対して相補的な連続した一連のヌクレオチドを有するハンマーヘッド型リボザイム変異体、肝炎デルタＶリボザイム、又は野生型肝炎デルタＶリボザイムの割合が多くても約５０％の割合で短いＲＮＡとのつながりを開裂できる変異型肝炎デルタVリボザイムであってもよい。非限定的だが例示的な変異型ＨＤＶリボザイムは、配列番号：１０〜１８から選ばれた核酸配列を有する。そのような組成物のＶＬＰは、４〜１００ヌクレオチド、その中で少なくとも４０％Ａ’ｓ又は少なくとも４０％Ｔ’ｓの連結ヌクレオチド配列を更に含んでもよく、その連結ヌクレオチド配列はパッキングコード配列及び短いＲＮＡコード配列に隣接し、又は４〜１００ヌクレオチド、その中で少なくとも４０％Ａ’ｓ又は少なくとも４０％Ｕ’ｓの連結ヌクレオチド配列を含んでもよく、その連結ヌクレオチド配列はリボザイム及び短いＲＮＡコード化配列に隣接する。リボザイム配列は、短いＲＮＡ及びパッキング配列に隣接してもよい。そのような組成物のＶＬＰは、ペプチド又はポリペプチドを含む異種カーゴ分子を含んでもよい。組成物のそのようなＶＬＰは、異種カーゴ分子及びウイルスカプシドを結びつけるオリゴヌクレオチドリンカーを更に含んでもよい。オリゴヌクレオチドリンカーはリボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドであってもよい。そのような組成物において、細胞溶解産物は、０．５グラム未満、０．２グラム未満又は０．１グラム未満の量中に存在してもよい。
別の態様において、本開示は、標的カーゴ分子を単離および精製するための方法を提供する。その方法は、（ａ）少なくとも１つの標的カーゴ分子を包むカプシド、そのカプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある、をそれぞれ含む複数のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む全細胞溶解液を得ること、（ｂ）加水分解後そのような加水分解酵素が無傷のままである前に、十分な時間および条件下で１００毎に少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、又は少なくとも９０の個々のポリペプチドは、全細胞溶解液中に存在する一方、十分な時間および条件下で１００毎に少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、又は少なくとも９０の個々のポリペプチドは、全細胞溶解液中に存在するが、開裂するためにカプシドによって包まれないペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４を用いて加水分解するためのＶＬＰを支配すること、である。その方法において、カプシドは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４５％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するウイルスカプシドタンパク質をそれぞれ含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）をそれぞれ含んでもよい。方法において、異種カーゴ分子は、オリゴリボヌクレオチド、又はペプチド若しくはポリペプチドであってもよいオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴリボヌクレオチドは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選ばれてもよい。方法において、各ウイルス様粒子は、リボザイムを更に含んでもよく、そのリボザイムは、パッキング配列及び核酸構築物を形成するためのオリゴリボヌクレオチドに隣接する。方法は、加水分解に続いてカプシドの精製を更に含んでもよい。精製は、少なくとも１つの液−液抽出工程、結晶化工程、分別沈殿工程、及び限外濾過工程を含んでもよい。本開示は、またそのような方法で製造した組成物を含んでもよい。
別の態様において、本開示は、宿主細胞の標的分子の細胞内産生に続いて全細胞溶解液の加水分解から標的分子を保護する方法を提供する。その方法は、（ａ）ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるウイルスカプシドを選択することと、（ｂ）パッキング配列及びｓｉＲＮＡ配列に隣接したリボザイムを含む核酸配列を含む第１のベクトルとともに宿主細胞に安定して核酸を導入することと、（ｃ）パッキング配列及びｓｉＲＮＡ配列に隣接されたリボザイムをカプシドで包むカプシドを発現し組み立てる形質転換細胞に対して十分な時間および条件下で細胞を維持することとを含む。その工程において、カプシドは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４５％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するウイルスカプシドタンパク質をそれぞれ含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの異種カーゴ分子を包むＶＬＰを精製する工程を提供する。その工程は、（ａ）複数のＶＬＰを含む細胞溶解物を得ることと、（ｂ）加水分解を形成するためのＶＬＰ以外の細胞溶解産物を加水分解するために十分な時間および条件下でプロテアーゼとともに細胞溶解物に接触することと、（ｃ）加水分解からＶＬＰを単離することとを含む。工程（ｃ）は（ｉ）硫酸アンモニウムとともに第１の沈殿を行い、続いて第１の沈殿物及び第１の上清を得るために第１の遠心分離を行うことと、（ｉｉ）硫酸アンモニウムとともに第１の上清に第２の沈殿を行い、続いて第２の沈殿物を得るために第２の遠心分離を行うこととを含んでもよく、その第２の沈殿物は、ＶＬＰの少なくとも約７０重量％、８０重量％又は９０重量％を含む。工程（ｃ）は（ｉ）エタノールとともに第１の沈殿を行い、続いて第１の沈殿物及び第１の上清を得るために第１の遠心分離を行うことと、（ｉｉ）硫酸アンモニウムとともに第１の上清に第２の沈殿を行い、続いて第２の沈殿物を得るために第２の遠心分離を行うこととを含んでもよく、その第２の沈殿物は、ＶＬＰの少なくとも約７０重量％、８０重量％又は９０重量％を含む。工程（ｃ）は、ＶＬＰの少なくとも約７０重量％、８０重量％又は９０重量％を含む沈殿物を得るために加水分解を超遠心機にかけることを含んでもよい。工程において、ＶＬＰは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドをそれぞれ含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４は、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４５％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）をそれぞれ含んでもよい。工程において、工程（ｂ）は少なくとも約３７℃で約３０分にわたり行われてもよい。工程は、工程（ｂ）の前に、少なくとも約３７℃で３０分にわたり少なくとも１つのヌクレアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼとともに細胞溶解物に接触することを更に含んでもよい。工程において、プロテアーゼは、例えば、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４であってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４は、例えば、プロテイナーゼＫ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓからＰｒｏｔｅａｓｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓからＰｒｏｔｅａｓｅから選ばれてもよい。工程において、ＶＬＰによって含まれた異種カーゴ分子は、オリゴリボヌクレオチド、又はペプチド若しくはポリペプチドであってもよいオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴリボヌクレオチドは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選ばれてもよい。工程において、ＶＬＰは、パッキング配列及び核酸構築物を形成するためのオリゴリボヌクレオチドに隣接した、本明細書中に記載されるようなリボザイムを更にそれぞれ含んでもよい。オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列は、少なくとも１〜１００のヌクレオチドのリンカー配列によって結びつけられてもよく、４０％を超えるＡ、４０％を超えるＵ、又は４０％を超えるＴを含んでもよい。工程は、細胞のＶＬＰの発現の後に細胞を遠心分離機にかけること、細胞を再懸濁すること、細胞を溶解させること及び上清を得るために細胞溶解物を遠心分離機にかけることによって工程（ａ）の前に細胞溶解物を調製することを更に含んでもよく、その上清は、工程（ａ）に対して細胞溶解物として用いられる。
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの異種カーゴ分子及びパッキング配列を包むカプシドを含むＶＬＰを提供す、そのカプシドは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）の変異体であるカプシドタンパク質を含む。カプシドタンパク質は、ポジション１でＡ残基が除去されることを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、ポジション１でＡ残基が除去され、ポジション２でＳ残基が除去されることを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、ポジション１でＡ残基が除去され、ポジション２でＳ残基が除去され、ポジション３でＮ残基が除去されることを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、ポジション１２９でＹ残基が除去されることを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、単一（１）１１２〜１１７セグメントのアミノ酸配列を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、単一（１）１１２〜１１７セグメントのアミノ酸配列を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、６５〜８３セグメントの１〜２残基の挿入を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、４４〜５５セグメントの１〜２残基の挿入を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、３３〜４３セグメントの単一（１）残基の挿入を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、２４〜３０セグメントの１〜２残基の挿入を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドタンパク質は、１０〜１８セグメントの単一（１）残基の挿入を有することを除いて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有する１つであってもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる第２のカプシドモノマー配列と連結したカプシドタンパク質モノマー配列を含んでもよい。カプシドは、Ｃ末端が第２のカプシドモノマー配列、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるそれらすべて、と連結される０〜６残基リンカーセグメントによりＣ末端が延長されるカプシドタンパク質モノマー配列を含んでもよい。リンカーセグメントは、例えば、−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、及び−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−を含む、−（Ｇｌｙ）ｘ（ｘ＝０〜６）などの配列を有してもよい。リンカーセグメントは、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から選ばれたＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであってもよい。カプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる第３のカプシドモノマー配列と連結したカプシドタンパク質を含んでもよい。カプシドは、Ｃ末端が第３のカプシドモノマー配列、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるそれらすべて、と連結される０〜６残基リンカーセグメントによりＣ末端が延長されるカプシドタンパク質を含んでもよい。カプシドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、カプシドはカプシドタンパク質を含むものであり、一方又は両方のリンカー配列が−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、及び−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−を含む、
−（Ｇｌｙ）ｘ（ｘ＝０〜６）である。リンカーセグメントは、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から選ばれたＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであってもよい。
そのようなカプシドタンパク質は、例えば、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。例えば、カプシドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−（ｘ＝１）であり、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−（ｘ＝２）であり、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−（ｘ＝３）であり、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは、１〜３残基によって切り捨てられたＮ末端である１つ以上の外皮タンパク質配列を含んでもよく、本明細書中に記載されているようなリンカー配列は、除去された残基の数によって延長され、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、１残基によって切り捨てられたＣ末端である１つ以上の外皮タンパク質配列を含んでもよく、本明細書中に記載されているようなリンカー配列は、１つの残基によって延長され、そのカプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、１残基及び１つの残基によって延長されたリンカー配列によって切り捨てられたＣ末端である連結された二量体の第１の外皮タンパク質配列を含んでもよく、又は連結された三量体の第１の及び／又は第２の外皮タンパク質配列が１残基によって切り捨てられたＣ末端であり、カプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、Ｎ末端切り捨て及びＣ末端切り捨てを有するカプシドタンパク質を含んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性がある。
カラー図参照
出願書類にはカラーで作成された少なくとも１枚の写真が含まれている。カラー写真を有するこの特許出願のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁より提供されるであろう。
その大腸菌宿主（ＡＴＣＣＮｏ．１５６６９）において野生型ＭＳ２バクテリオファージ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５５９７−Ｂ１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の伝播を徐々に示す光学濃度のプロット（ＯＤ、黒菱形）及びｐＨ（白四角）である。 大腸菌の増幅後に得られ、プロテイナーゼＫ及び限外濾過を用いて精製したＭＳ２バクテリオファージ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示し、９９％以上高く精製したプロテイナーゼＫ精製収率ファージ（ＭＳ２バクテリオファージ外皮タンパク質に相当する１４ｋＤａのバンド）を示すゲルである。 部分的に精製されたＭＳ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示し、ファージの完全分解及び溶解物（レーン４及び６）の１ｘ又は２ｘ限外濾過後に得られた結果を示すゲルである。 限外濾過及びプロテイナーゼＫ処理を用いて精製されたＭＳ２試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 プロテイナーゼＫ、酸性条件で沈殿、塩基性と酸性条件でエタノールを用いる沈殿物、及び限外濾過を用いて精製されたＭＳ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 プロテイナーゼＫ、酸性条件で沈殿、塩基性と酸性条件でエタノールを用いる沈殿物、及び限外濾過を用いて精製されたＭＳ２試料のＵＶスペクトルを示すグラフである。 Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（レーン１のプライマーＦ１２０１＿１２２３−Ｒ１９７９＿２００１については１．２ｋｂｐ、レーン２のプライマーＦ１２０１＿１２２３−Ｒ１９７９＿２００１については８００ｂｐ、及びレーン３のプライマーＦ１４０１＿１４２６−Ｒ１６８０＿１７０５については３０４ｂｐ）で染色した１．５％のアガロースゲルにクロマトグラフィーにより分析された、図５及び図６で記載した精製に続くＭＳ２試料から得られたＰＣＲ生成物のクロマトグラフであり、無傷のＭＳ２バクテリオファージゲノムを有する濃度を示す。 比較参照データ（菱形）及び図５及び図６で記載した精製に続くＭＳ２試料（黒四角）で徐々に得られ、高い伝染力を保持したファージを含む精製された試料を示す光学濃度のプロット（ＯＤ、黒菱形）のプロットである。 外皮特異の１９−ｍｅｒ RNAヘアピンに取り付けられた外皮タンパク質に対してＲＮＡコーディングをカプシドで包むＭＳ２カプシドの発現後のＭＳ２試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（レーン１において３０４ｂｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから１ｋｂ ｐｌｕｓ ｌａｄｄｅｒに相当する最も左のレーン）で染色した２％のアガロースゲルにクロマトグラフィーにより分析された、ＭＳ２カプシドの一片の有無に関してＭＳ２試料のＰＣＲ質問からＰＣＲ生成物のクロマトグラフであり、無傷のＭＳ２被膜遺伝子を有する濃度を示す。 ＭＳ２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の精製に対してエタノールを有する単純な沈殿後のＭＳ２試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 プロテイナーゼＫ（ＰＫ）の使用後及びＭＳ２ ＶＬＰの精製に対してエタノールを有する単純な沈殿後のＭＳ２試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ（ＣＨ）、エタノールを有する分別沈殿、及びＭＳ２ ＶＬＰの精製に対する限外濾過の使用後のＭＳ２試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 種々のヒドロラーゼ、及びＭＳ２ ＶＬＰの精製に対する硫酸アンモニウムの使用後のＭＳ２試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 ＭＳ２カプシドのカプシドに包まれたＲＮＡから得られたＲＮＡのＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムを用いてｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓに続いて製造されたＲＮＡ生成物のＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 ロング・フランキング・ハンマーヘッド型リボザイムを用いてインビトロ転写中に得られたｓｉＲＮＡ生成物のＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 ＶＬＰの精製後及びＶＬＰからＲＮＡの単離後に、ＶＬＰにおいてカプシドで包まれたＲＮＡから得られたＲＮＡ生成物のＰＡＧＥ解析の結果を示すゲルである。 ＶＬＰの精製及び懸濁、並びに培養の１時間及び４時間にわたる種々のプロテアーゼへの暴露後に、ＭＳ２カプシドを含むＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す一連のゲルである。 選ばれた腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質の配列構造である。 ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから回復させ、重みづけ配列選択、ギャップペナルティなどの初期値を有するＢＬＡＳＴ多重アラインメントを用いて整列させた完全レビウイルス科ウイルス外皮タンパク質配列の配列構造である。 ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから回復させ、重みづけ配列選択、ギャップペナルティなどの初期値を有するＢＬＡＳＴ多重アラインメントを用いて整列させた完全レビウイルス科ウイルス外皮タンパク質配列の配列構造である。 ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから回復させ、重みづけ配列選択、ギャップペナルティなどの初期値を有するＢＬＡＳＴ多重アラインメントを用いて整列させた完全レビウイルス科ウイルス外皮タンパク質配列の配列構造である。 １ＱＢＥ鎖Ｃ（アロレビウイルス外皮タンパク質モノマー）と１ＡＱ３鎖Ｂ（レビウイルス科外皮タンパク質モノマー）の主鎖重ねあわせの図解である。 図２２に示した１ＱＢＥ鎖Ｃ（アロレビウイルス外皮タンパク質モノマー）と１ＡＱ３鎖Ｂ（レビウイルス科外皮タンパク質モノマー）の主鎖重ねあわせの代替図の図解である。 図２２に示した１ＱＢＥ鎖Ｃ（アロレビウイルス外皮タンパク質モノマー）と１ＡＱ３鎖Ｂ（レビウイルス科外皮タンパク質モノマー）の主鎖重ねあわせの他の代替図の図解である。 図２２に示した１ＱＢＥ鎖Ｃ（アロレビウイルス外皮タンパク質モノマー）と１ＡＱ３鎖Ｂ（レビウイルス科外皮タンパク質モノマー）の主鎖重ねあわせの他の代替図の図解である。 ｊＦＡＴＣＡＴリジッドを用いて１ＡＱ３、２ＶＴＵ及び１ＱＢＥの構造配列アラインメントである。 ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから回復させ、重みづけ配列選択、ギャップペナルティなどの初期値を有するＢＬＡＳＴ多重アラインメントを用いて整列させた完全アロレビウイルス科ウイルス外皮タンパク質配列の配列構造である。 ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから回復させ、重みづけ配列選択、ギャップペナルティなどの初期値を有するＢＬＡＳＴ多重アラインメントを用いて整列させた完全アロレビウイルス科ウイルス外皮タンパク質配列の配列構造である。 ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから回復させ、重みづけ配列選択、ギャップペナルティなどの初期値を有するＢＬＡＳＴ多重アラインメントを用いて整列させた完全アロレビウイルス科ウイルス外皮タンパク質配列の配列構造である。 正二十面体のレビ及びアロレビウイルスカプシドを形成する１８０モノマーの他の６０を示す図解である。各モノマーの主鎖は異なる色のリボンによって表された。主鎖の水素結合は、シアン線に寄って表される。正二十面体の三回軸は、図の中央である。モノマー−モノマー接点は、水素結合によって輪郭が描かれた中央の円を埋めない。 正二十面体カプシド（茶色及び濃紺でモノマー主鎖を表しているリボン）の接点でモノマーによって囲まれた２ＭＳ２モノマー（濃い青及び淡い青に色づけられた主鎖を表しているリボン）を示す図解である。アロレビウイルスＱｂｅｔａは、残基７２及び７３（赤、下部中央）の間のレビウイルス科に対して２つの残基欠失を有する。中央の空隙は、この欠失跡の真下である（図５）。欠失はわずかに拡大する。１２６（赤中央左）でＱｂａｔａの欠失は、セグメントから偏位を除去するが、隣接したモノマーのシート間で広範囲に接触し、本質的にモノマーを所定の位置に固定する。ＭＳ２連続番号を使用する。 正二十面体カプシド（茶色及び濃紺でモノマー主鎖を表しているリボン）の接点でモノマーによって囲まれた２ＭＳ２モノマー（濃い青及び淡い青に色づけられた主鎖を表しているリボン）の図解である。アロレビウイルスＱｂａｔａは、残基１２及び１３（黄色、左上中央）の間のレビウイルス科に対して１つの残基挿入、溶媒中のカプシド外面から伸びる可動性ループ、内部のカーゴにわたるスタンド連結部の末端に広がる残基５３及び５４（黄色、左下中央）間の２つの残基の挿入を有し、残基２７及び２８の間の１つの残基挿入も、カプシドカーゴスペースにわたるβストランドコネクタの末端においてである。これらの挿入は、モノマーの折りたたみの動き又は隣同士の動きは必要ない。 正二十面体カプシド（茶色及び濃紺でモノマー主鎖を表しているリボン）の接点でモノマーによって囲まれた２ＭＳ２モノマー（濃い青及び淡い青に色づけられた主鎖を表しているリボン）の図解である。アロレビウイルスＱｂｅｔａは、残基３６及び３７（黄色、右中央）の間のレビウイルス科に対して１つの残基挿入を有する。隣接したらせんの末端の反対のループの束は、残基を挿入したが、真下の可動性ループ上の中央空間に伸ばすことができる。 緑に色づけられたＮ末端、Ｃ末端赤の全てで、組み立てられたカプシドの対称点の周りを包んだ３非共有結合腸内細菌ファージＭＳ２非共有結合二量体の主鎖リボンの図解である。
このセクション及び本明細書全体の開示において使用するときは、セクション見出しを限定するものではない。
Ａ．定義
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別に明らかに示さない限り、複数形の言及を含む。本明細書の数値範囲の記載については、その間にあるそれぞれの数も、同じ精度で明確に企図される。例えば、範囲６〜９のため、数字７及び８は６及び９のほかに考慮されており、範囲６．０〜７．０のため、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０は明示的に考慮される。
「又は」の使用は特に指定しない限り「及び／又は」を意味する。更に、用語「含む」の使用は、並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態は、限定的なものではない。
本明細書において、別に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載された動物及び細胞解剖学、細胞及び組織培養、生物化学、分子生物学、免疫学、及び微生物学と関連して用いられる命名並びに技術は、当業者にはよく知られており普通に使用されている。用語の意味および範囲は、明確でなければならないが、任意の潜在的に曖昧な事象では、本明細書において提供される定義は、任意の辞書の定義または外因性の定義を超える先例を取る。更に、文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
化学、生物化学、分子生物学、及び免疫学において多種多様の従来型技術及び道具が採用され、本明細書に記載された方法及び組み立てを実施するために利用可能であり、当業者の能力の範囲内であり、文献によく述べられている。野生型又はカーゴ分子とともに組換え型カプシドを含んでいるＶＬＰの生成及び精製するため、並びに宿主生物を変換するため及び本明細に記載された組換えタンパク質と核酸を示すためのそのような技術及び道具を含む。例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ｅｄ．１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、及びＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）１９９５を参照。これらのそれぞれの開示は、参照することで本明細書にその内容を取り入れることとする。
本明細書で使用するとき、用語「カーゴ分子」は、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド又はペプチド分子を意味し、カプシドによって包まれているか又は包まれ得る。
本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの、及び約７０ヌクレオチドしかない、好ましくはリン酸ジエステル結合によって結び付けられた約５５ヌクレオチドしかない短いポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよく、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡなどの短いＲＮＡ分子を含むが、これに限らない。
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって結び付けられた少なくとも２つのアミノ酸モノマー、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも２０のアミノ酸モノマー、及びペプチド結合によって結び付けられた約６０しかない、好ましくは約５０しかないアミノ酸モノマーを最小限に含む高分子を意味する。例えば、用語は約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、又は約６０のアミノ酸残基を有するポリマーを含む。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結び付けられた少なくとも１つのアミノ酸モノマーの鎖を含む高分子を意味し、その鎖は、少なくとも約７０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも約８０の、より好ましくは少なくとも約９０の、更に好ましくは少なくとも約１００のアミノ酸残基を含む。本明細書で使用するとき、用語は、タンパク質を含み、そのタンパク質は、１つ以上の結合されたポリペプチド鎖を含んでもよく、その結合されたポリペプチド鎖は、更に共同因子又は他のタンパク質に結合してもよいか又は結合しなくてもよい。本明細書で使用するとき、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同じ意味で用いられる。
本明細書で使用するとき、分子に関して用語「変異体」は、実質的には天然分子又は野生型分子の配列と似ている配列である。ヌクレオチド配列に関して、変異体は、１つ以上の塩基に関して変化してもよいこれらの配列を含が、遺伝子コードの退化のため、天然タンパク質の同一のアミノ酸配列を更にコードする。変異体は、自然に起こる対立遺伝子、及び分子生物学、例えば部位特異的突然変異誘発法など、において周知の技術を用いて設計されたヌクレオチド配列、及び天然タンパク質をコード化し、並びにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一般的に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、天然の（内因的な）ヌクレオチド配列のために少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又は少なくとも８０％の配列同一性を有する。本開示は、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有するヌクレオチド配列変異体も含む。
本明細書で使用するとき、特定のヌクレオチド配列に関して、用語「保存的変異体」は、参照配列と同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。遺伝子コードの退化のため、ほとんどの場合２つ以上のコドンは、各アミノ酸、極めて密接につながったタンパク質をコードするヌクレオチド配列をコーディングすることができる。更に、異なる有機体は、多くのアミノ酸、異なる有機体又は更に同じ有機体、例えば、大腸菌株に対してコドンを好み、同じアミノ酸に対して異なるコドンを好んでもよい。したがって、最小の割合の配列同一性を共有しなくても、又は厳しい条件下で互いに雑種細胞を作らなくても、第２のヌクレオチド酸配列と同じポリペプチドを本質的にコードする第１のヌクレオチド酸配列は、第２のヌクレオチド配列と実質的に同一であると考慮される。更に、通常は、メチオニンに対してコドンだけである、ＡＴＧの限られた例外で、任意の配列は、標準的な方法で機能的に同一分子を産出するために修正されてもよく、そのような修正は本開示によって含まれることが理解されるべきである。以下に記載されるように、本開示は、特に天然タンパク質のタンパク質変異体を考慮し、そのタンパク質変異体は、天然のヌクレオチド配列に対して少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも２１％、少なくとも２１％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５６％、少なくとも５９％、又は少なくとも８６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列の配列同一性又はヌクレオチド配列は、分子の規定領域内に又は完全長配列を横切って、当技術分野でよく知られ、本明細書に記載されているような従来の道具及び方法を用いて測定される。例えば、２つのアミノ酸配列、又は２つのヌクレオチド配列の配列同一性の程度は、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｄｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．，１９９０）などの位置合わせツールを用いてすぐに決定され、複数のオンライン情報源からすぐに利用可能である。最適な配列アラインメントに対してのアルゴリズムは、当技術分野において周知であり、記載されおり、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１），Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｅｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）において含んでいる。配列解析に対してのアルゴリズムも、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘなどのプログラムですぐに利用可能である。本開示の目的のためには、２つのヌクレオチド配列は、また厳しい条件下で互いに雑種細胞を作る場合、「実質的に同一」と考慮されてもよい。類似度の高い核酸配列間でのみハイブリダイゼーションを許可する高いハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーションの低塩を含む厳しい条件は、バッファの役割を果たす。厳しい条件は、配列依存性であり、環境が異なると異なるが、一般的に少なくとも６０℃の温度を含み、特定のイオン強度及びｐＨで特定配列に対して熱融点（Ｔｍ）よりも約１０℃〜１５℃低くなる。塩濃度は、一般的にｐＨ７で約０．０２モルである。
２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌのＢＬＡＳＴｐアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４〜２２６８，１９９３）を用いて測定され得る。配列同一性の割合は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較することにより測定され、その比較ウインドウ中のアミノ酸配列の部分は二つの配列の最適の整列のための基準配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。％は、同じアミノ酸が両方の配列中に生じて適合位置の数を生じる位置の数を測定し、適合位置の数を比較のウインドウ中の位置の合計数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の％を得ることにより計算される。
当業者は、アミノ酸が成熟タンパク質の機能に影響を及ぼさない類似のアミノ酸残基と置換され得る場合に、ポリペプチドが「実質的に類似」であることを認めるであろう。上述の通り「実質的に類似」シェア配列であるポリペプチド配列は、残基位置（同一ではない）が保存的アミノ酸変化を有し得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の可換性を表す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、あり、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化する核酸は、所定のタンパク質に対して推定アミノ酸配列を用いて選ばれたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリースクリーニングによって得られてもよい。プライマー伸長法を使用する従来の方法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋらに記載された）は、前駆体及びプロセシング中間体を検出するために用いられてもよい。
カーゴ分子を包むカプシドから成るウイルス様粒子（ＶＬＰ）
本明細書に記載の方法及び組成物は、ある種のウイルスカプシドが、核酸に対する商業化手続きを改善するための新たな製造方法及び精製方法で調製され及び／又は使用され得る賞賛の一部をもたらす。本明細書に記載の方法は、核酸、ペプチド、又はタンパク質を含むポリペプチドなどの異種カーゴ分子を含むために、すぐに利用可能なヒドロラーゼに対して耐性がある組み換え型ウイルスカプシドを使用する。
カプシドは、野生型カプシドに由来する野生型カプシド又は変異型カプシドであってもよい。ただし、カプシドが加水分解酵素と接触すると、カプシドがペプチド結合に従って少なくとも１つの加水分解酵素によって触媒された加水分解への耐性がある。本明細書で同じ意味で用いられるとき、細胞溶解産物であり、カプシドで包まれていないポリペプチドも含有する全細胞溶解液中に存在し、開裂するために溶解物（細胞溶解産物であり、カプシドで包まない）中に存在する個々のポリペプチド１００毎に少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、又は少なくとも９０（すなわち、個々の包まないポリペプチドが開裂される全ての少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）、更に加水分解後にそのような加水分解が無傷のままである前に存在するカプシド１００毎に少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、又は少なくとも９０に対して十分な時間および条件下でペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４を用いて加水分解を受けやすい場合、語句「加水分解への耐性」及び「加水分解酵素の耐性」は、任意のカプシドを表す。加水分解酵素は、加水分解を実施する前の細胞タンパク質の平均分子量、加水分解が約３分の２未満、約２分の１未満、約３分の１未満、約４分の１未満、又は約５分の１未満であるのに続いて、細胞株から残存する細胞タンパク質の平均分子量に対して十分な時間及び条件下で実施する。方法は、加水分解後に無傷のカプシドを精製すること、並びに加水分解及び精製前後にカプシドの重量及び全乾燥細胞物質の重量を測定することを更に含んでもよく、加水分解及び精製後に全乾燥細胞物質の重量よって分離したカプシドの重量は、加水分解及び精製前に測定した全乾燥細胞物質の重量よって分離した少なくとも２倍のカプシドの重量である。加水分解及び精製後に全乾燥細胞物質の重量よって分離したカプシドの重量は、加水分解及び精製前に測定した全乾燥細胞物質の重量よって分離したカプシドの重量より少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは１，０００倍、最も好ましくは１０，０００倍であってもよい。
加水分解酵素は、欧州委員会によって識別番号ＥＣ３に分類された加水分解反応を触媒する酵素である。例えば、エステル結合の加水分解酵素を触媒する酵素は、ＥＣ３．１から始まる識別番号を有する。グリコシド結合の加水分解酵素を触媒する酵素は、ＥＣ３．２から始まる識別番号を有する。ペプチド結合の加水分解酵素を触媒する酵素は、ＥＣ３．４から始まる識別番号を有する。タンパク質の加水分解を触媒する酵素であるプロテアーゼは、ＥＣ３．４（プロテイナーゼＫ及びスブチリシンが挙げられるが、これに限定されない）から始まる識別番号を用いて分類される。例えば、プロテイナーゼＫは識別番号ＥＣ３．４．２１．６４を有する。非限定的な例において、本開示は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓからのプロテイナーゼＫ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓからのＰｒｏｔｅａｓｅ、ペプシン及びパパインの耐性があるＶＬＰ、並びにそのようなＶＬＰを使用する方法及び工程を含む。
国際生化学分子生物学連合の命名法委員会は、また触媒する反応による酵素の命名及び分類を奨励する。それらの完全な推薦は自由で広く利用可能であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ及びｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｕｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／などにオンラインでアクセスできる。各酵素に何を置くか記述するための速記を開発したＩＵＢＭＢは、活性を有する。無差別に切り取る酵素は、広く特異性と称される。他の酵素に対する開裂パターンは、Ｘａａ｜Ｙａａと記述され、｜は切断部位、Ｘａａ＝｛開裂のＮ末端側で酵素によって選ばれた残基の組｝、及びＹａａ＝｛開裂のＣ末端側で酵素によって選ばれた残基の組｝を表す。いくつかの酵素は、これ以上の結合条件を有するので記述がより複雑になり得る。非常に特異的な反応、例えばプロトロンビンを活性トロンビンへ処理する酵素を触媒する酵素に対して、その活性が開裂記述の基礎である。特定の場合には、酵素の正確な活性は明らかでなくてもよく、そのような場合、Ｂ鎖インスリンのような標準テストタンパク質に対する開裂結果が報告される。ＥＣ３．４から始まる識別番号を有するペプチド結合の加水分解を触媒する酵素の使用に代わる方法として、酵素がＰ１ポケット結合選好のＸａａを報告するが、Ｐ１’ポケットＹａａを結合するための選好はない場合、及び反対に、酵素がＰ１’ポケット結合選好のＹａａを報告するが、Ｐ１ポケットＸａａを結合するための選好はない場合、Ｘａａ｜Ｙａａ選好を有する特異性酵素は広範囲に用いられ得る。Ｘａａ｜Ｙａａ選好を有する広く特異性の酵素が使用され得る。
本明細書でさらに詳細に記載するように、カプシドは、簡単な単離及び精製法を用いて単離され及び精製され得るように更に選ばれ及び／又は調製され得る。例えば、カプシドを簡単に抽出した非極性水非混和相の中に選択的に分離するために、カプシドは本明細書に記載されるような周囲のマトリックスよりもかなり疎水性が高く選択され又は遺伝子的に修正され得る。あるいは、カプシドは溶液から選択的に結晶化するための能力を改善するために選択され又は遺伝子的に修正されてもよい。
カプシドを用いた簡単な及び効果的な精製工程の使用は、上記明細書に記載されるように、カプシドがペプチド結合に従って少なくとも１つの加水分解酵素によって触媒された加水分解への耐性を示すように、ある種の野生型カプシドの選択又は野生型カプシドを含むタンパク質のアミノ酸配列のための修正により使用可能である。野生型ＭＳ２カプシドなどの、そのような野生型カプシドは、プロテイナーゼＫ又はスブチリシンなどのある種の安価な酵素がタンパク質分解のために用いられる精製工程に使用され得る。非限定的な例は、腸内細菌ファージＭＳ２（配列番号１、ＭＳ２野生型ゲノム； 配列番号２、ＭＳ２野生型外皮タンパク質、ＤＮＡ配列； 及び配列番号３、ＭＳ２野生型外皮タンパク質、アミノ酸配列である。
（配列番号１）全ＭＳ２ゲノム、野生型、太字で外皮タンパク質配列
（配列番号２）ＭＳ２外皮タンパク質ＤＮＡ配列、野生型：
ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ
（配列番号３）ＭＳ２外皮タンパク質、アミノ酸配列：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ
驚いたことに、エンベロープを欠いているが修正されない野生型ＭＳ２カプシドは、カプシドの高度に精製された組成物（カーゴ分子を含んでもよい）が全細胞溶解液から調製され得るように、プロテイナーゼＫ及びスブチリシンを含まれるがこれらに限定されない、種々の分類ＥＣ３．４加水分解酵素に対して耐性がある。したがって、本開示は野生型ＭＳ２カプシドタンパク質を含むウイルスカプシドを含むＶＬＰ、及び／又は野生型ＭＳ２カプシドタンパク質と相同性をもつカプシドタンパク質を提供し、ウイルスカプシドはカーゴ分子をカプシドで包む。カーゴ分子は、１つ以上の異種核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含んでもよい。したがって、これらＶＬＰは、分類ＥＣ３．４を用いて加水分解工程後に、高純度のＶＬＰの組成物、例えばＶＬＰの少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、又は少なくとも８５％を製造するために、全細胞溶解液から単離され、精製されてもよい。ＶＬＰの少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、及び９８重量％の純度を有する組成物は、明確に考慮される。
本開示は、ａ）野生型ウイルスカプシド及び野生型ウイルスカプシドで包まれた少なくとも１つの標的異種カーゴ分子をそれぞれ含む複数のウイルス様粒子、及びｂ）組成物中に存在するカプシドの１００グラムごとに４０グラム未満、３０グラム未満、２０グラム未満、１５グラム未満、１０グラム未満、好ましくは９、８、７、６、５、４、３未満、より好ましくは２グラム未満、更に好ましくは１グラム未満の量中に存在する１つ以上の細胞溶解産物を含む組成物を含み、その細胞溶解産物はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選ばれる。続いてカーゴ分子はカプシドから容易に採取できる。したがって、そのような組成物は、高純度及び／又は高い生産効率が必要とされるすべての用途に対して非常に好ましい。
本明細書に記載の加水分解酵素耐性カプシドは、ウイルス様粒子を形成するためにカーゴ分子の異なるタイプを包み込むために用いられてもよい。カーゴ分子は、任意の１つ以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ、又は核酸を生じる非天然型の任意のタイプを含む任意のオリゴヌクレオチド）、任意のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であるがこれに限定されない。オリゴヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドであるカーゴ分子は、リンカーを使用して又は使用しないでカプシドで包まれてもよい。カプシドは、例えば、オリゴリボヌクレオチドなどのヌクレオチドカーゴの存在下でカプシドタンパク質から自己集合するためトリガーされ得る。非限定的な例において、本明細書に記載されるようなカプシドは、例えば、腸内細菌ファージＭＳ２から１９−ｍｅｒパックサイトを含む合計１，８００〜２，２４８リボヌクレオチドを含有する標的異種ＲＮＡストランドなどの、標的異種ＲＮＡストランドを含んでもよく、プラスミドから転写されたそのようなＲＮＡストランドは、Ｗｅｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：１７３４−１７４０に記載されたような、カプシドタンパク質に対してプラスミドコーディングから分離する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、対象となる標的遺伝子の選択的抑制のために用いられ得るｓｉＲＮＡ分子などの短いＲＮＡ分子によって媒介された現象であり、バイオテクノロジー及び医学の多数の用途を有する。例えば、短いＲＮＡ分子は、望ましい表現型を得るための有機体において対象となる特異遺伝子を標的にするために用いられ得る。しかしながら、ｓｉＲＮＡを含む、短いＲＮＡ分子は、ＲＮＡｓｅｓの称がある偏在性酵素によって容易に分解される。本明細書のこれらの記載のような、カプシドはカプシドで包まれたＲＮＡを酵素分解から保護する。しかしながら、本明細書に記載のカプシドは、自己切断型リボザイム（シス作用）かある場合において他のＲＮＡの結合を切断する能力がある（トランス作用）か、１つ以上のリボザイムを含有するＲＮＡストランドを包んでもよい。１つ以上のリボザイムは、特に調製されたＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子などが挙げられるがこれらに限定されるものではない）を製造するためのＲＮＡ配列を特に切断するため含まれてもよい。例えば、ハンマーヘッド型リボザイム及びデルタ肝炎ウイルスリボザイムの変異型は、知られており、長いＲ配列を切断するために用いられ得る。本開示は、上記に記載されたようなパック配列（すなわち、カプシドの内壁に強い親和性を有するＲＮＡ配列）に付属した１つ以上のリボザイム、及びリボザイムに付属したパッキング配列から短いＲＮＡ配列を切断するために用いられたリボザイムをカプシドで包んでいるカプシドを含む新種のＶＬＰを記載する。
したがって、本開示は、それらをカプシドで包むために用いられたパッキング配列からｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡなどの、短い又は小さい」ＲＮＡ配列を単離するためにリボザイムの新しい使用も含む。特に別段の支持がない限り、用語短いＲＮＡは二本鎖ステム及び一本鎖ループ又はヘアピンを有する短い一本鎖及びショートヘアピン型（ステムループ）ＲＮＡ配列を含むことを理解されたい。短いＲＮＡは、わずか３０ヌクレオチド、好ましくはわずか２５ヌクレオチド、より好ましくは２２ヌクレオチドを有する任意のＲＮＡ一本鎖、又はステムにおいてわずか３０ヌクレオチド塩基対、好ましくはわずか２５ヌクレオチド塩基対、より好ましくはわずか２２ヌクレオチド塩基対を有するヘアピンＲＮＡである。
リボザイムを使用する際の課題は、ＲＮＡのカプシド化（encapsidation）を達成する前にそのような短いＲＮＡ配列をパッキング配列から単離するために高活性であることである。更に、ｓｉＲＮＡなどの短いＲＮＡ、又はヘアピンパッキング配列の三次元構造は、リボザイムの適切な機能性に干渉し得ることが発見された。これらの問題は、１）短いＲＮＡのカプシド化（encapsidation）を達成する前にパッキング配列から短いＲＮＡの遊離を回避するために、活量のより遅い割合を明示するリボザイム変異体の使用、及び／又は２）リボザイムにおけるヌクレオチドの数の増加、によって克服できる。更に、トランス作用リボザイムは、完全なリボザイムによってではなくむしろトランス作用リボザイムの標的であり、また同じＶＬＰ中にカプシドで包まれたより短い配列によって短いＲＮＡ配列が隣接するならば、短いＲＮＡのようにＶＬＰにカプシドで包まれたＲＮＡの割合を増加させるため有利に用いることができる。
１つ上の短いＲＮＡ配列は、また、特定の種類の細胞へタンパク質又は薬物分子を送達するために、外部のペプチドタグを挿入するために修正された、野生型か遺伝子的に修正されたウイルスカプシドにカプシドで包み得る。野生型カプシドは、また、特別の標的細胞ＲＮＡｉを含むことを目的として短いＲＮＡ配列をカプシドで包むために有利に用いられ得る表面タンパク質細胞受容体に対して配位子の機能を果たす外部のペプチド配列を挿入するために遺伝子的に修正されてもよい。そのような組成物は、短いＲＮＡ送達のための現在の選択肢よりも非常に単純で、安価で、より確実に製造される。
有益なＶＬＰの非限定的な例は、以下を含むＲＮＡストランドを包むカプシドを含んで調製され得る。
（ｉ）全ての一本鎖ＲＮＡスペーサーが４〜４０ヌクレオチド（配列番号３０）を有する場合、１つの一本鎖（非ハイブリダイズ）ＲＮＡスペーサーに隣接した少なくとも１つのパッキング配列及び１〜１００の同一の又は異なるｓｉＲＮＡｓ、
（ｉｉ）全ての一本鎖ＲＮＡ配列が４〜４０ヌクレオチド（配列番号２８、ＨＤＶリボザイム）を有する場合、１つの（１）リボザイム及びｓｉＲＮＡにつき１つの一本鎖（非ハイブリダイズ）ＲＮＡ配列、
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡにつき２つの（２）リボザイム、
（ｉｖ）１つの（１）Ｔ７開始部位、１つの（１）リボザイム、１つの（１）パッキング部位及び１つの（１）転写終結部位、又は
（ｖ）１つの（１）Ｔ７開始部位、１つの（１）パッキング部位、及び１つの（１）転写終結部位
（ｖｉ）ｓｉＲＮＡにつき４つの（４）リボザイム（配列番号２９）
１つ以上のリボザイムを含むＶＬＰにおいて、本開示は、リボザイムがＲＮＡを切断した後、得られた生成物を含有するＶＬＰを更に意図している。転写ターミネータを含むＶＬＰは、例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ ＦＷ，Ｍｏｆｆａｔｔ ＢＡ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｍａｙ５；１８９（１）：１１３−３０；及び Ｒ Ｓｏｕｓａ，Ｄ Ｐａｔｒａ，ＥＭ Ｌａｆｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：３１９−３３４に記載されたようなＴ７転写ターミネータを使用することができる。例えば、次の２つの配列は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対して適切な転写ターミネータである。
ＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧ（配列番号４）
又は
ＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧ （配列番号５）
本明細書に記載されたようなＶＬＰは、あるいは少なくとも１つの標的ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を包んでもよい。標的異種カーゴ分子がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である場合、オリゴヌクレオチドリンカーは標的異種カーゴ分子及びウイルスカプシドを結びつけるために使用できる。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であるカーゴ分子は、好ましくはリンカーを用いてカプシドにパッケージされる。パッケージング工程は、外皮タンパク質及び標準カーゴ分子と融合したペプチドタグの間にリンクを形成する短いＲＮＡアプタマー配列から成るリンカーによって進められる。（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈｉｎ Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９：９６４８−９６５１（２０１０）参照）オリゴヌクレオチドリンカーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどから成ってもよい。リンカーは、例えば、カプシド外皮の内部に対して結合特異性を有する第１の末端で短い配列（例えば、約２０ｎｔの長さ）、及びカーゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に対して結合特異性を有する第２の反対端で他の配列（例えば、約７０ｎｔの長さ）を有する５０−〜１００−ｍｅｒである。更に、遅いリボザイムはＲＮＡから成るリンカーに組み込まれてもよい。例えば、遅いリボザイムはパッキング配列（外皮タンパク質に結合）とアプタマー（標的タンパク質に結合）との間に組み込むことができる。活性化時に、リボザイムは標的タンパク質から外皮タンパク質を分離する。あるいは、本明細書に記載されたようなカプシドは、非共有でアプタマー−及びカプシドパック配列含有ＲＮＡストランド（例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって記述されたようなＮ末端タグ及びアプター−及びパック配列含有ＲＮＡストランド）に結合できるペプチドでタグ付けられた少なくとも１つの標的タンパク質Ｎ末端を包んでもよい。
カーゴ分子は、二分子カーゴ分子であり、本明細書に記載されたカプシドは、また１つ以上のリボザイムを含んでもよく又は含まなくてもよい二分子カーゴ分子をカプシドで包んでもよい。二分子カーゴ分子は、二官能性ポリヌクレオチドと結合したアプタマーを含んでもよい。アプタマーは、生活活性小分子、すなわち、遅い分子量（好ましくは１，５００Ｄａより遅い）を有する分子に特定の結合を示すためにＳＥＬＥＸを用いて特に選ばれた配列を有する。二官能性ポリヌクレオチドは、低分子量生物活性カーゴ分子を結合するための第１のアプタマー活性、及びカプシドのパッキング配列を結合するための第２のアプタマー活性の両方を有する。生物活性カーゴ分子と結合した二官能性ポリヌクレオチドは、次にカプシドと結合され得る二分子カーゴ分子を形成する。そのようなカーゴ分子は、生物活性小分子と結合するために用いられ、したがってＶＬＰに小分子を充填する。したがって、本開示は、またそのような合成二分子カーゴ分子と結合したカプシドを含むＶＬＰを含む。ＲＮＡアプタマーと結合することによってＶＬＰに充填される低分子量生物活性の例は、Ｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｏｐｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、ｌ：ｐ．９−１９によって記載されたような、アトラジン（除草剤）、アセタミプリドホレート、プロフェノホス、イソカルボホス及びオメトエート（殺虫剤）を含む。
ＲＮＡアプタマーと結合することによってＶＬＰに充填される低分子量生物活性の例は、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ｐａｒｔ１：Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）ＩＳＢＮ９７８−１−８４７５５−１３８−２によってリストアップされた他の中の、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、カンバ（（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）、パラコート（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−４，４’ビピリジニウムジクロリド）、オリザリン（４−（ジプロピルアミノ）−３．５−ジニトロベンゼンスルホンアミド）、ＤＣＭＵ（３−（３，４−ジクロロフェニル）−１．１−ジメチル尿素）、トリフルラリン（２，６−ジニトロ−Ｎ，Ｎ−ジプロピル−４−（トリフルオロメチル）アニリン）、イマザピック（−メチル−２−［４−メチル−５−オキソ−４−（プロパン−２−イル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール-２-イル］ピリジン−３−カルボン酸）、アミノピラリド（４−アミノ−３，６−ジクロロピリジン−２−カルボン酸）、クロピラリド（３，６−ジクロロ−２−ピリジンカルボン酸）、メトラクロール（（ＲＳ）−２−クロロ−Ｎ−（２−エチル−フェニル）−Ｎ−（１−メトキシプロパン−２−イル）アセトアミド）、ペンディメタリン（３，４−ジメチル−２，６−ジニトロ−Ｎ−ペンタン−３−イル−アニリン）、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロ−２−ピリジンカルボン酸）、プロパニル（Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）プロピオンアミド）、トリクロピル［（３，５，６−トリクロロ−２−ピリジニル）オキシ］酢酸）、及びアトラジン（２−クロロ−４−（エチルアミノ）−６−（イソプロピルアミノ）−ｓ−トリアジン）などの除草剤を含む。例えば、アトラジンを結びつけるＲＮＡアプタマーは、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ６：ｐ．４６４−４７０によって記載された。
ＲＮＡアプタマーは、また例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ｐａｒｔ２：Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）ＩＳＢＮ９７８−１−８４７５５−１３７−５によってリストアップされた他の中のプロパルギット（２−（４−ターシャリ−ブチルフェノキシ）シクロヘキシル＝プロプ−２−イン−１−スルホン酸塩）、クロルピリホス（Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−３，５，６−トリクロロピリジン−２−イル＝ホスホロチオエート）、ホスメット（２−ジメトキシホスフィノチオイルチオメチル）イソインドリン−１，３−ジオン）、ペルメトリン（３−フェノキシベンジル（１ＲＳ）−ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−３−（２，２−ジクロロビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシラート）、ダイアジノン（Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−［４−メチル−６−（プロパン−２−イル）ピリミジン−２−イル］ホスホロチオエート）、チルパラチオン（Ｏ，Ｏ−ジメチルＯ−（４−ニトロフェニル）ホスホロチオエート）、アセタミプリド（Ｎ−［（６−クロロ−３−ピリジル）メチル］−Ｎ’−シアノ−Ｎ−メチル−アセトアミジン）、及びクロロサロニル（２，４，５，６−テトラクロロイソフタロニトリル）などの防かび剤、キャプタン（（３ａＲ、７ａＳ）−２−［（トリクロロメチル）スルファニル］−３ａ，４，７，７ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン）、ボスカリド（２−クロロ−Ｎ−（４’−クロロビフェニル−２−イル）ニコチンアミド）、イプロジオン（３−（３，５−ジクロロフェニル）−Ｎ−イソプロピル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−カルボアミド）、アゾキシストロビン（メチル（２Ｅ）−２−（２−｛［６−（２−シアノフェノキシ）ピリミジン−４−イル］オキシ｝フェニル）−３−メトキシアクリレート）、ピラクロストロビン（メチル２−［１−（４−クロロフェニル）ピラゾール−３−イルオキシメチル］−Ｎ−メトキシカルバニラート）、シプロジニル（４−シクロプロピル−６−メチル−Ｎ−フェニルピリミジン−２−アミン）、などの殺虫剤を結びつけるために用いられ得る。例えば、ＳＥＬＥＸを用いて組み立てられたＲＮＡアプタマーと同じような方法で組み込まれたＤＮＡアプタマーを用いてＳｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏｐｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，１：ｐ．９−１９によって例示されたように、アプタマーはアセタミプリド、ホレート、プロフェノホス、イソカルボホス及びオメトエートを結合するために記載された。
これらの除草剤、殺虫剤又は防かび剤は、生物活性小分子、すなわち、低分子量、好ましくは１，５００Ｄａより下を有する分子である。サイズが小さいため、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＲＮＡ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｃａｐｓｉｄｓ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１：ｐ．６７−７６によって例示されたように、本開示のＶＬＰを形成するカプシドを透過することができる。そのようなＶＬＰが精製前か精製後かに形成された後に、これらの生物活性小分子は、生物活性小分子を結合するためにＳＥＬＥＸを用いて設計されたアプタマーをカプシドで包む本開示のＶＬＰに添加される。例えば、これらの生物活性小分子の添加は、例えば、それらを３０分〜１０時間の間室温でＶＬＰの溶解及び培養に添加することによって行われる。これらの生物活性小分子は、粒子対称軸において細孔を通り抜けて拡散してＶＬＰに入り、包み込まれたアプタマーへのその結合によって内部に保持される。生物活性小分子をＶＬＰに充填するために用いられた好適な溶媒は、水などの極性の範囲であり、水−エタノールは、例えば、イソオクタン、トルエン、ジクロロメタン、又はクロロホルムなどの非極性と混合する。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＳ２ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７．９７（２）：ｐ．２２４−３４によって記載されたように、ＶＬＰの分解に対する非極性溶媒の使用は、Ａｅｒｏｓｏｌ ＯＴのような界面活性剤の助けを借りて行われる。生物活性小分子を充填するために非極性溶媒の使用は、ほとんどの場合、極性溶媒のその溶解性が悪いので好ましい。
ｓｉＲＮＡ及び生物活性小分子の両方をカプシドで包むＶＬＰは、例えば、標的植物、標的昆虫又は標的真菌が、生物活性小分子に耐性であるこれらの場合において、２つの生物活性原料の間で相乗効果が達成される用途において好ましい。そのような場合、Ｓａｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，ＵＳ ２０１１／０２９６５５６によって例示されたように、ｓｉＲＮＡは生物活性小分子への耐性を植物、昆虫又は真菌に与える生物学的経路をターゲットにするために設計される。
あるいは、二官能性ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコード化してもよく、カーゴ分子は、小さい（低分子量）タンパク質又はペプチドであってもよい。したがって、二分子カーゴ分子は、低分子生理活性タンパク質又はペプチドを結合する能力があり得る。そのような二分子カーゴ分子は、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｓｓｈＲＮＡ又はｌｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコード化するポリヌクレオチドと結合し、及び生理活性タンパク質又はペプチドカーゴ分子を結合するための第１のアプタマー活性及びカプシドのパッキング配列を結合するための第２のアプタマー活性を有する、生物学的活性タンパク質又はペプチドを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、タンパク質又はペプチドカーゴ分子と結合し、カプシドのパッキング配列と結合する能力がある。
上述の二官能性ポリヌクレオチドは、１つ以上のリボザイム配列を任意に含んでもよい。上述の二官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含むＶＬＰは、１つ以上のリボザイムを任意に含んでもよい。本開示は、また、少なくとも１つのリボザイムがアプタマーを含む構成要素にカーゴ分子を切断するために二分子カーゴ分子に反応してから、カプシド及び二分子カーゴ分子の反応生成物を含むＶＬＰを含む。
本明細書に記載のＶＬＰは、１つ以上のカーゴ分子、及び必要に応じて任意のリンカー、パッキング配列、１つ以上のリボザイム、又はタグをカプシドで包む組み立てられた加水分解酵素耐性カプシドを有するＶＬＰを製造する任意の入手可能な方法によって組み立てられてもよい。例えば、カプシド及びカーゴ分子は、任意の発現系で共発現させてもよい。１つ以上のカプシドタンパク質、１つ以上のカーゴ分子、及び必要に応じて任意のリンカー、パッキング配列、リボザイム又はタグをコード化する組換えＤＮＡは、そのようなベクターを特定の細胞に取り込むのに、及び組換え配列を発現する細胞を生成するために安定した細胞に核酸を導入するのに有用な任意の手順によって１つ以上の発現ベクターとともにトランスフェクションによって宿主細胞、例えば、細菌性細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、及び動物細胞（昆虫及び哺乳動物を含む）に容易に伝播し得る。
宿主細胞は、真核生物起源、例えば、植物、哺乳動物、昆虫、酵母又は菌類起源であることが好ましいが、非真核生物宿主細胞もまた用いられてもよい。適切な発現系は、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はＶＬＰ成分に対してコード配列を含有するコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリア（例えば、大腸菌）などの微生物を含むが、これらに限定されない。非限定的な例において、ＭＳ２カプシドタンパク質を用いるＶＬＰに対して、大腸菌の発現は、適切な発現系である。
本開示は、本明細書に記載されるような核酸構築物を用いて形質転換した、及びカプシド外皮タンパク質、カーゴ分子及び必要に応じて任意のリンカー、パッキング配列、１つ以上のリボザイム、又はタグを発現する植物細胞を明確に意図している。植物細胞を含み、トランスジェニック細胞を調製する細胞を形質転換するための手段は、当技術分野において周知である。ベクター、プラスミド、コスミッド、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）及びＤＮＡ断片は、細胞を形質転換するために用いられ、一般的に認められたような、プロモータ、エンハンサー、及び／又はポリリンカーを含むであろう。明確に意図するトランスジェニック細胞は、トウモロコシ、大豆、小麦、野菜、穀物、マメ科植物、果樹など、又は本明細書に記載されるようなＶＬＰの導入から利益を得る任意の植物から採取した細胞を含むが、これらに限定されないが、トランスジェニック植物細胞を含む。また、植物、本明細書に記載されるような形質転換した細胞から採取した植物組織、及び種子又は植物の子孫又は植物組織が意図されている。
組み立てられたＶＬＰの発現は、例えば、ＶＬＰの全構成要素をコード化する配列を含む少なくとも１つの発現ベクターを構築することによって得ることができる。２つのベクターは時々用いられる。カーゴ分子及び必要に応じて任意のリンカー、パッキング配列、１つ以上のリボザイム、又はタグをコード化する配列を含む第１のベクター、及びカプシドタンパク質をコード化する配列を含む第２のベクター。ｓｉＲＮＡを含む例示的なＶＬＰを生成するための例示的な工程において、２つのベクターは、実施例において更に詳述されるように、ＶＬＰの生成に対して宿主細胞に共発現されてもよい。コード配列並びに転写及び翻訳制御配列を含有するそのような発現ベクターを構築する方法及び道具は、当技術分野において周知である。一度構築したベクターはまた、当技術分野において周知の技術を用いて宿主細胞に移し、次いで、従来の技術の全てを使用して、発生するためのＶＬＰの発現及び組み立てのために十分な時間、培養条件下で細胞を維持する。したがって、本開示は、任意のそのようなベクター、及びそのようなベクター、並びにＶＬＰを含有する細胞によって形質転換した細胞を含有する宿主細胞を含む。
ＶＬＰが宿主細胞で発現され、組み立てられたとき、それらを単離し、ウイルス精製に対して当技術分野において周知の任意の方法を用いて精製され得る。例えば、細胞はプロテイナーゼＫ又はスブチリシンなどの少なくとも１つのペプチド結合ヒドロラーゼカテゴリーＥＣ３．４を用いて加水分解を行う従来の細胞溶解の技術及び剤、及び細胞溶解物を用いて溶解することができるが、これに限定されない。加水分解の後に細胞溶解物に残存する無傷のカプシドは、従来のタンパク質単離技術を用いて除去され精製され得る。
カプシドの精製、ＶＬＰ又はタンパク質は、また当技術分野において一般的に周知の方法を含んでもよい。例えば、次のカプシド発現及び細胞溶解、得られた溶解物は、１つ以上の単離又は精製工程を行うことができる。そのような工程は、例えば、酵素の脂肪分解、ＤＮＡ加水分解、及びタンパク質分解工程を含んでもよい。タンパク質分解工程は、例えば、エンド−及びエキソプロテアーゼの混合を用いて実行してもよい。例えば、ほとんどの細胞成分の細胞溶解及び加水分解後に、それらのカーゴ分子を有するそのようなカプシドは、例えば、適切な非極性水非混和性溶媒の中の抽出によって、又は適切な溶媒からの結晶化によって周囲のマトリックスから分離することができる。例えば、加水分解及び／又はタンパク質分解工程は、小さい水溶性分子の中に溶解物マトリックス中に含有するカプシドから混入物質を形質転換する。その後、疎水性カプシドは、１，３−ビス（トリフルオロメチル）ベンゼンなどの有機相に抽出されてもよい。カプシド、ＶＬＰ又はタンパク質の精製は、例えば、少なくとも１つの液−液抽出工程、少なくとも１つの分別沈殿工程、又は少なくとも１つの結晶化工程を含んでもよい。液−液抽出は、例えば、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、クロロホルム、ジクロロメタン、又は四塩化炭素などの非混和性非水非極性溶媒の使用を含んでもよい。精製は少なくとも１つの結晶化工程を含んでもよい。１つ以上の加水分解工程、及び特に１つ以上のタンパク質分解工程の使用は、カーゴ分子を用いた現在の分離工程で観察された特定の問題を排除する。そのカーゴ分子は、主にカーゴ分子とそれらが産生される細胞培養から生成された成分との間に起こる結合相互作用の多く及びさまざまな程度から得られる。本明細書に記載のカプシドは、加水分解後に得られるマトリックスが周囲のマトリックスから任意のカーゴ分子を安全に分割する無傷のカプシドを含むような加水分解工程に抵抗する。それによって現在の精製工程を妨害する困難な結合相互作用を中断する。
精製の後に、カプシドはタンパク質若しくはポリペプチド、ペプチド、又は本明細書に記載されるような核酸分子であり得る、カーゴ分子を得るために開くことができる。カプシドは当技術分野において周知のいくつかの可能な手順の任意の１つを使用して開くことができる。例えば、５０℃以上の水溶液中で加熱することを含む、凍結融解を繰り返す、ホルムアミドなどの変性剤とともにインキュベートする、１つ以上のタンパク質分解酵素でインキュベートすることによる、又は任意のこれらの手順の組み合わせによる。
加水分解酵素に耐性であリ、本開示によるＶＬＰ及び方法において有用であるカプシドタンパク質は、野生型ＭＳ２カプシドタンパク質の変異体であり、又は野生型ＭＳ２カプシドタンパク質に由来することができる。カプシドタンパク質は、例えば、野生型ＭＳ２カプシドアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列の少なくとも１つの置換基、欠失又は挿入を含んでもよい。そのようなカプシドタンパク質は、天然に存在する変異体であってもよいか、一般的に変異体又は修正されたカプシドタンパク質が、本明細書に記載されるようなペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に耐性である非エンベロープカプシドを形成することを提供する、従来の技術を使用してＭＳ２カプシドタンパク質を修正することによって得ることができる。
本明細書に記載されるような加水分解に耐性であるカプシドの中に組み立てることができる遺伝子的に修正されたＭＳ２カプシドタンパク質は、本明細書及び本明細書中以下の実施例に記載されるような加水分解への耐性を保持するタンパク質を産生するために物理化学及び生物化学において従来の及び周知の原理に従ってアミノ酸配列の中で選択修正することによって操作できる。
例えば、機能タンパク質の形状又はグローバルな折り目が、タンパク質のアミノ酸配列によって決められること、及び折り目がタンパク質の機能を定義することは周知の事実である。グローバルな折り目は1つ以上のフォールディングドメインから成っている。２つ以上のフォールディングドメインがグローバルな折り目に存在すると、一般的にドメインはドメイン界面に沿って一緒に、ゆるく又はきつく結びつく。ドメインの折り目は、密集して、最初にドメイン形状に関与する明確に定義された二次構造要素のフォールディングコアに分解され、一般的に旋回構造及びループ構造から成るより移動性の外層は、フォールディングコアとの相互作用並びに隣接するドメイン及び他の分子（溶媒と他のタンパク質を含む）との相互作用に影響される。パブリックドメインにおいて溶解したタンパク質の構造のＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＳＣＯＰ）ｄａｔａｂａｓｅ（Ａｌｅｘｅｙ Ｇ Ｍｕｒｚｉｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ（１９９６）６，３８６−３９４)は、ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕにオンラインで維持されており、新しい溶解した構造がパブリックドメインデータベース （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｆ．Ｃ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｔ．Ｆ．Ｋｏｅｔｚｌｅ，Ｇ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｅ．Ｍｅｙｅｒ Ｊｒ．，Ｍ．Ｄ．Ｂｒｉｃｅ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｏ．Ｋｅｎｎａｒｄ，Ｔ．Ｓｈｉｍａｎｏｕｃｈｉ，Ｍ．Ｔａｓｕｍｉ，”Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ：Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｂａｓｅｄ Ａｒｃｈｉｖａｌ Ｆｉｌｅ Ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，” Ｊ．ｏｆ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２（１９７７）：５３５），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に入ると定期的に拡張される。進化的に離れた族の一員は、同じ形状及び非常によく似た機能を有しているが、一般にわずか３０％の同一残基を位相的に及び／又は機能的に等価位置で保持する。同じ族において、離れたメンバーの配列は、互いに（例えば、ｌｅｖｉ−及びａｌｌｏｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅカプシドタンパク質）関して変わらないそれらの残基のわずか２０％を有する。折り目及び／又は機能を維持するための重大な残基を使わない限り、コア残基 （Ｐｅｔｅｒ Ｏ．Ｏｌｉｎｓ，Ｓ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂａｕｅｒ，Ｓａｒａｈ Ｂｒａｆｏｒｄ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｋｒｉｓ Ｓｔｅｒｂｅｎｚ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｏ．Ｐｏｌａｚｚｉ，Ｍａｉｒｅ Ｈ．Ｃａｐａｒｏｎ，Ｂａｒｂａｒａ Ｋ．Ｋｌｅｉｎ，Ａｌａｎ Ｍ．Ｅａｓｔｏｎ，Ｋｕｍｎａｎ Ｐａｉｋ，Ｊｏｎ Ａ．Ｋｌｏｖｅｒ，Ｂａｒｒｅｔｔ Ｒ．Ｔｈｉｅｌｅ，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｐ．ＭｃＫｅａｒｎ（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０，２３７５４−２３７６０；Ｙｉｑｉｎｇ Ｆｅｎｇ，Ｂａｒｂａｒａ Ｋ．Ｋｌｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．ＭｃＷｈｅｒｔｅｒ（１９９６），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５９，５２４−５４１；Ｄａｌｅ Ｒｅｎｎｅｌｌ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｅ．Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｌａｒｒｙ Ｗ．Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ａｎｔｈｏｎｙ Ｒ．Ｐｏｔｅｅｔｅｌ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２，６７−８７）、１つ以上の残基の挿入／欠失（Ｙｉｑｉｎｇ Ｆｅｎｇ，Ｂａｒｂａｒａ Ｋ．Ｋｌｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．ＭｃＷｈｅｒｔｅｒ（１９９６），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５９，５２４−５４１）、配列の置換（Ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｃ−ｍｐｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ，ＵＳ ６０６６３１８）、Ｎ末端又はＣ末端又は両方（それ自身のコピー又は他のペプチド又はタンパク質）（Ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｇ−ｃｓｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ，ＵＳ２００４０１７１１１５；Ｐｌｅｖｋａ，Ｐ．，Ｔａｒｓ，Ｋ．，Ｌｉｌｊａｓ，Ｌ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１７：１７３）を介する連鎖又は共有結合修飾、例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、ＳＵＭＯ化）又はペプチジルの添加又は非ペプチドアフィニティー標識であっても、タンパク質の折り目及び機能は定向突然変異又はランダム変異によって変わるため非常に耐性がある。
したがって、本開示による並びに任意の方法及び工程に使用されたようなＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、１６％、２１％、４０％、４１％、５２％、５３％、５６％、５９％又は少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むこれらを含み、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性である。例えば、そのようなＶＬＰは、上述のように配列番号３）とともに少なくとも５２％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むＶＬＰを含む。また配列番号３に対して少なくとも５３％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むＶＬＰも含まれ、その配列番号３はＦＲカプシドタンパク質を無視しないで、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）に対して５３％の配列同一性を示しているが、上述のように実質的に得ることができる。また構造が１ＡＱ３（ｖａｎ ｄｅｎ Ｗｏｒｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．，Ｖａｌｅｇａｒｄ，Ｋ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｗａｌｔｏｎ，Ｃ．，Ｆｒｉｄｂｏｒｇ，Ｋ．，Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，Ｐ．Ｇ．，Ｌｉｌｊａｓ，Ｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１３４５−１３５１）、１ＧＡＶ（Ｔａｒｓ，Ｋ．，Ｂｕｎｄｕｌｅ，Ｍ．，Ｆｒｉｄｂｏｒｇ，Ｋ．，Ｌｉｌｊａｓ，Ｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：７５９−７７３）、１ＦＲＳ（Ｌｉｌｊａｓ，Ｌ．，Ｆｒｉｄｂｏｒｇ，Ｋ．，Ｖａｌｅｇａｒｄ，Ｋ．，Ｂｕｎｄｕｌｅ，Ｍ．，Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：２７９−２９０）及び２ＶＴＵ（Ｐｌｅｖｋａ，Ｐ．，Ｔａｒｓ，Ｋ．，Ｌｉｌｊａｓ，Ｌ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１７：１７３１）（上述に記載のＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ鑑定者）と判明したとき、全３つの配列がまとめて考えられるので、配列位置の５６％だけ同一配列及びバックボーンオーバーレイについて位相的に等価位置を有すると考えられるとき、配列番号３に対して少なくとも５６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むＶＬＰも含まれる。またＧＡウイルスカプシドタンパク質の配列と比較してＭＳ２ウイルスカプシドタンパク質の配列が５９％であると考えられる場合、配列番号３に対して少なくとも５９％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むＶＬＰも含まれる。またＦＲカプシドタンパク質の配列と比較してＭＳ２ウイルスカプシドタンパク質の配列が８６％であると考えられる場合、配列番号３に対して少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むＶＬＰも含まれる。したがって、本開示によるＶＬＰは、アラインメントにしっかり固定した有効な構造に基づいて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列とともに少なくとも１５％、１６％、又は２１％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含むこれらを含み、ペプチド結合加水分解酵素分類ＥＣ３．４によって触媒された加水分解に対して耐性である。
したがって、ＶＬＰは本明細書に記載されるような任意のＭＳ２カプシドタンパク質変異体を含む。本明細書に記載されたものと一致する遺伝子的に修正したカプシドタンパク質は、例えば、野生型ＭＳ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換基、欠失又は挿入を有する少なくとも１つのカプシドタンパク質をコード化する少なくとも１つのＤＮＡプラスミドを組み立てること、各プラスミドの多重コピーを作ること、プラスミドで細胞株を形質転換すること、核酸をカプシドで包むカプシドを発現する及び組み立てるために形質転換細胞に対して十分な時間および条件下で細胞を維持すること、細胞溶解物を形成するために細胞を溶解すること、少なくとも１つのペプチド結合加水分解酵素、分類ＥＣ３．４を用いて加水分解するために細胞溶解物を支配すること、及び野生型カプシドタンパク質に対して少なくとも１つの加水分解酵素に対する耐性の増加を有するカプシドを得るために加水分解後に細胞溶解物にとどまる無傷のカプシドを除去することによって産生することができる。得られた無傷のカプシドの精製後、各カプシドタンパク質に対するアミノ酸配列は、当技術分野において周知の方法にしたがって決定されてもよい。
両方のセッティングで用いられた精製工程が同じマトリックス組成物を有するので、本明細書に記載の特殊なカプシドは、改善された収率を提供するために研究開発及び産業製造施設で用いることができる。そのような同じ組成物を有すると、研究と開発の両方及び製造工程において同じ細胞株を用いて依存する。しかしながら、研究と開発の両方及び製造段階において用いられるタンパク質分解工程後、異なる細胞株を用いるためマトリックス組成物の差は、大きく減少する。この特徴は、最小限の製造収率ペナルティとともに両方の段階で両方の異なる細胞株の使用を可能にする。
実施例
以下の非限定的な実施例は、本開示の様々な態様を例示するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために本出願人によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい方法を構成するために考慮され得ることは当業者に理解されるであろう。しかしながら、本開示を考慮すると、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、又は同様の結果のように得ながら、記載された具体例で多くの変化が起こることを理解すべきである。したがって、実施例は例示のためだけのものであり、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明を有効にし、記述するために必要な程度まで、引用された全ての文献は、本明細書に参考として組み込まれる。
実施例Ａ：ＭＳ２バクテリオファージの増殖
ＭＳ２バクテリオファージ（ＡＴＴＣ Ｎｏ．１５５９７−Ｂ１，ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及び大腸菌（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５６６９）は、ＡＴＣＣから得られ、Ｓｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載された方法を使用して増殖させた。６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ）及びｐＨは、反応の間ずっと追跡した。ＯＤｉは、宿主との接種後すぐのＯＤを表している。感染は２．３時間で行われた。Ｌｎ（ＯＤ／ＯＤｉ）は、左軸（全菱形）で表し、ｐＨは右軸（白四角）で表した。この実験は宿主の接種後５．３時間で終了した。得られた溶解物を、２，０００ｇで遠心分離し、残りの細菌及び細菌の破片を除去するために０．２ｕｍの膜を通して濾過した。
実施例Ｂ：プロテイナーゼＫ及び限外濾過を使用したＭＳ２バクテリアファージの精製
ＭＳ２バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図２に示す。
実施例Ａの終わりに得られた８ｍＬの溶解物（レーン１の試料、図２）を３００ｋＤａの膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹからＶｉｖａｓｐｉｎ２）を通して濾過し、濾液を１００ｋＤａの膜を通して濾過し、そこから１ｍＬの濃縮水（レーン２の試料、図２）が得られた。この濃縮水を二等分に分割した。半分（対照）にｐＨ＝７．５で２０６μＬ、２０ｍＭのＣａＣｌ２の水溶液を添加した。後の半分（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）に、ｐＨ＝７．５で２０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液２０６μＬに溶解した０．１５ｍｇのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した。両方のチューブを３７℃でインキュベートし、１時間後にそれらを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン３の対照試料、図２、及びレーン５のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ試料、図２。次いで、各生成物を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、１００ｋＤａの膜を通して濾過した。各濃縮水（１５０μＬ）をＤＩ水で２ｍＬに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。各生成物に対してもう一度希釈及び限外濾過を繰り返した。次いで、各濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン４の対照試料、図２、及びレーン６のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ試料、図２。１４ｋＤａのバンドは、ＭＳ２バクテリアファージの外皮タンパク質に相当する。３０ｋＤａのバンドは対照実験からプロテイナーゼＫ．に相当し、非常に不純なファージを生み出す。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ実験からの生成物は、９９％より高い純度のファージを含有する生成物を生み出す。
実施例Ｃ：ＭＳ２バクテリオファージの分解
ＭＳ２バクテリアファージの処理は次の通り行われた。処理中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図3に示す。実施例Ａの終わりに得られた４ｍＬの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。レロン１１での抽出後の水溶液の試料は、採取され、分析された（レーン１のサンプル、図３）。２０ｍＭのＣａＣｌ２の水溶液３７０μＬを部分的に精製されたファージ溶液（１３０μＬ）に添加した。混合物を３７℃でインキュベートし、１時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン２の試料、図３。インキュベーション生成物を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（１５０μＬ）をＤＩ水で２ｍＬに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン３の試料、図３。ファージの完全分解を示している、１０ｋＤａ以下の弱いバンドのみ観測した。
実施例Ｄ：限外濾過を使用したＭＳ２バクテリアファージの精製
ＭＳ２バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図３に示す。実施例４の終わりに得られた４ｍＬの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。部分的に精製されたファージを含有する水溶液を、脱イオン水で２ｍＬに希釈し、３００ｋＤａの膜を通して濾過し、濾液を１００ｋＤａの膜を通して濾過し、そこから１５０μＬの濃縮水が得られた。次いで、濃縮水を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（１５０μＬ）の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン４の試料、図３。混合物を３７℃でインキュベートし、１時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン５の試料、図３。次いで、生成物を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（１５０μＬ）をＤＩ水で２ｍＬに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン６の試料、図３。１００ｋＤａ以下の分子量でタンパク質を透過する膜によって維持された１４ｋＤａのＭＳ２’ｓ外皮タンパク質は、明確に視認でき、無傷のＭＳ２カプシドの存在を示している。９９％より高い純度のファージを含有する生成物を得た。
実施例Ｅ：プロテイナーゼＫを使用したＭＳ２バクテリアファージの精製、及び限外濾過
ＭＳ２バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図４に示す。
実施例４の終わりに得られた４ｍＬの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。部分的に精製されたファージを含有する水溶液を、脱イオン水で２ｍＬに希釈し、１００ｋＤａの膜を通して濾過し、そこから１５０μＬの濃縮水が得られた。次いで、濃縮水を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（１５０μＬ）の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン1の試料、図４。２０ｍＭのＣａＣｌ２の水溶液３７０μＬに溶解されたプロテイナーゼＫの０．１５ｇを濃縮水（１３０μＬ）に添加した。混合物を３７℃でインキュベートし、１時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン２の試料、図４。次いで、生成物を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン３の試料、図４。９９％より高い純度のファージを含有する生成物を得た。
実施例Ｆ：プロテイナーゼＫを用いたＭＳ２バクテリアファージの精製、酸性条件での沈殿物、塩基性及び酸性条件でのエタノールを用いた沈殿、及び限外濾過
ＭＳ２バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図５に示す。実施例５０の終わりに得られた４ｍＬの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。フレロン１１での抽出後の水溶液の試料は、採取され、分析された（レーン１のサンプル、図５）。２０ｍＭのＣａＣｌ２の水溶液１．２４ｍＬに溶解された０．９ｍｇのプロテイナーゼＫを部分的に精製されたファージ溶液（１．２ｍＬ）に添加した。混合物を３７℃でインキュベートし、１時間後にプロテイナーゼＫを不活性化するためにエタノールに０．２Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）溶液６０μＬを添加した。次いで、混合物を氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン２の試料、図５。０．１％のリン酸水溶液の０．６８ｍＬを、液体のｐＨを４までもたらすために氷水浴に激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は３０分間０℃に保ち、４℃で１６，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を室温に到達させ、１％のＮａＯＨ１３０μＬを液体のｐＨを８までもたらすために添加した。上清を氷水浴に１５分間入れ、１％の酢酸１．３ｍＬを液体のｐＨを４までもたらすために０℃で激しい撹拌でゆっくり添加した。０℃で１．５ｍＬのエタノールを、液体中のエタノール濃度を３４％までもたらすために激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は３０分間０℃に保ち、４℃で１６，０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを２００μＬの脱イオン水に再懸濁し、２０μＬの試料を採取し、分析した。レーン３、図５。残り（１８０μＬ）を脱イオン（ＤＩ）水で２ｍＬに希釈し、１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（１５０μＬ）をＤＩ水で２ｍＬに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン４の試料、図５。１００ｋＤａ以下の分子量でタンパク質を透過する膜によって維持された１４ｋＤａのＭＳ２’ｓ外皮タンパク質は、明確に視認でき、無傷のＭＳ２カプシドの存在と一致する。同じ濃縮水でＵＶスペクトルは、図６に示され、それはＧ．Ｆ．Ｒｏｈｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒ．Ｇ．Ｋｒｕｅｇｅｒ，（１９７０）Ｊ．Ｖｉｒｏ．，６（３）：２６により発行された結果と一致する。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）サイズ排除クロマトグラフィーを、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭのＮａＣｌでトリス緩衝食塩水を使用して同じ濃縮水上で実行した。それはカラムの空隙容量でのみ２８０ｎｍの吸光度を示した。６００ｋＤ〜２ｋＤのタンパク質に対する溶出量に吸光度はなかった。この試験は無傷のファージ粒子と一致する。ＲＮＡをＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）及びＤＮＡ−ｆｒｅｅ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して同じ濃縮水の別の試料から単離し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写した。次いで、ＭＳ２ゲノムの３つの異なる部分の有無をＰＣＲ実験で識別した。次の一対のプライマーを使用し、各プライマーはＭＳ２ゲノムの最初及び最後のベースの位置を指定し、それぞれｆｏｒｗａｒｄ（Ｆ）及びｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）：Ｆ１００１＿１０２１−Ｒ２１８０＿２２０１，Ｆ１２０１＿１２２３−Ｒ１９７９＿２００１，Ｆ１４０１＿１４２６−Ｒ１６８０＿１７０５。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を増幅に用いた。Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅで染色した１．５％のアガロースゲルにクロマトグラフィーで分析された、図９に示すようなＰＣＲ生成物（レーン１のプライマーＦ１２０１＿１２２３−Ｒ１９７９＿２００１に対して１．２ｋｂｐ、レーン２のプライマーＦ１２０１＿１２２３−Ｒ１９７９＿２００１に対して８００ｂｐ、及びレーン３のプライマーＦ１４０１＿１４２６−Ｒ１６８０＿１７０５に対して３０４ｂｐ）は、無傷のＭＳ２バクテリアファージゲノムと一致した。また、感染性試験を以下のように同じ濃縮水上で実行した。濃縮水５μＬを用いて、それがＯＤ（６００ｎｍ）＝０．２２に達した時点で、実施例Ａに記載されたような細菌培養物の１ｍＬを感染させた。図７に示すように、感染後１時間はＯＤ（６００ｎｍ）は０．６２であり及び更に２時間後は０．２１に下がったが、同じ時間中対照試料は、感染後１時間はＯＤ（６００ｎｍ）の０．８２及び更に２時間後は１．２に達した。この試験は濃縮水の高い感染性のファージを示し、したがって精製工程は単離するために使用し、その安全性に妥協しなかったことを証明した。結論として、９９％より高い純度のＭＳ２バクテリアファージを含有する生成物を得た。
実施例Ｇ：異なる外因性プロテイナーゼを使用したＭＳ２バクテリアファージの精製、及び限外濾過
異なる外因性プロテイナーゼを使用したＭＳ２バクテリアファージの精製は、実施例Ｅに記載されるようにプロテイナーゼＫ以外のプロテイナーゼを使用したことを除いて実質的に試みられた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ（Ｐ５３８０，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）からのプロテアーゼによって進められたタンパク質分解後に、ＭＳ２バクテリアファージを正常に精製した。しかしながら、ｐＨ６でｐｏｒｃｉｎｅ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ（Ｐ６８８７，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）からのペプシンを用いたタンパク質分解反応は、ＭＳ２バクテリアファージを有意に分解するために見出された。一方、ｐＨ６でｐａｐａｙａ ｌａｔｅｘ（Ｐ３１２５，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）からのパパインを用いたタンパク質分解反応は、ＭＳ２バクテリアファージを広範囲にわたって分解しなかった。実施例Ｈ：特定の１９−ｍｅｒ ＲＮＡヘアピンに付属のその外皮タンパク質をコード化するＲＮＡをカプシドで包むＭＳ２カプシドの産出
ＭＳ２カプシドの産出は次の通り行われた。得られた結果を図８に示す。次のＤＮＡ配列、コード化ＭＳ２外皮タンパク質及びその特別のＲＮＡ１９−ｍｅｒパック部位は、ｐＤＥＳＴ１４＿Ａ２５２ Ｐｌａｍｓｍｉｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化された。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴ（配列番号６）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞は、そのようなプラスミドを用いて形質転換された。プラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）は、ＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８まで３７℃でアンピシリンを含有するＬＢ培地の７５０ｍＬに増殖させた。次いで、誘導前試料を採取し、分析した。レーン１の試料、図８。次いで、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、週末濃度１ｍＭに添加した。誘導後４時間、４０分間３，０００ｇ及び４℃で遠心分離によって細胞を採取した。次いで、試料を採取し、分析した。レーン２の試料、図８。
実施例Ｉ：特定の１９−ｍｅｒ ＲＮＡヘアピンに付属のその外皮タンパク質をコード化するＲＮＡをカプシドで包むＭＳ２カプシドの精製及び特性評価
ＭＳ２カプシドの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図８に示す。培養物の１１５ｍＬと同等である実施例Ｈからのベレットの画分は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、細胞を溶解させるため超音波で分解した。細胞残屑は、１６，０００ｇで遠心分離によって除去される。得られた細胞溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。２０ｍＭのＣａＣｌ２の水溶液１．０５ｍＬに溶解された０．３ｍｇのプロテイナーゼＫを部分的に精製されたＭＳ２カプシド溶液（１．０５ｍＬ）に添加した。混合物を３７℃でインキュベートし、２．５時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン３の試料、図８。１５分後、０．１％のリン酸水溶液の０．１４ｍＬを、４．１まで液体のｐＨをもたらすために氷水浴に激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は３０分間０℃に保ち、４℃で１６，０００ｇで２０分間遠心分離した。１％のＮａＯＨの１００μＬを０℃で保つ上清に７．９まで液体のｐＨをもたらすために添加した。次いで、０℃で０．５ｍＬのエタノールを、液体中のエタノール濃度を２０％までもたらすために激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は３０分間０℃に保ち、４℃で１６，０００ｇで２０分間遠心分離した。７まで溶液のｐＨを調節するために１％の酢酸を添加した後、上清をＶｉｖａｓｐｉｎ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）３００ｋＤａ膜を通して濾過し、そこから１５０μLの濃縮水を得た。次いで、濃縮水をリン酸緩衝生理食塩水で２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（１５０μＬ）の希釈及び限外濾過を４回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン４の試料、図８。１００ｋＤａ以下の分子量でタンパク質を透過する膜によって維持された１４ｋＤａのＭＳ２’ｓ外皮タンパク質は、明確に視認でき、無傷のＭＳ２カプシドの存在と一致する。ＲＮＡをＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）及びＤＮＡ−ｆｒｅｅ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して同じ濃縮水の別の試料から単離し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写した。次いで、ＭＳ２カプシドの部分の有無をＰＣＲ実験で識別した。Ｆ１４０１＿１４２６−Ｒ１６８０＿１７０５。次の一対のプライマーを使用し、各プライマーはＭＳ２ゲノムの最初及び最後のベースの位置を指定し、それぞれｆｏｒｗａｒｄ（Ｆ）及びｒｅｖｅｒｓｅ（Ｒ）：Ｆ１４０１＿１４２６−Ｒ１６８０＿１７０５。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を増幅に用いた。図１０に示すような（レーン１の３０４ｂｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの１ｋｂ ｐｌｕｓ ｌａｄｄｅｒに相当する最左のレーン）、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅで染色した２％のアガロースゲルにクロマトグラフィーで分析された、ＰＣＲ生成物は、無傷のＭＳ２被膜遺伝子と一致した。結論として、９９％より高い純度のＭＳ２カプシドを含有する生成物を得た。
実施例Ｊ：ＭＳ２ウイルス様粒子の精製のためのエタノールを用いた単純な沈殿
ＭＳ２ ＶＬＰの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図１１に示す。実施例Ｈと同一の実験から得たベレットの６分の１を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、細胞を溶解させるため超音波で分解した。細胞残屑は、１６，０００ｇで遠心分離によって除去される。得られた細胞溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。次いで、試料を採取し、分析した。レーン１の試料、図１１。ＭＳ２ファージの外皮タンパク質と一致する約１４ｋＤａの強いバンドを見出した。他のバンド−不純物−高分子量の大部分は、試料重量の約２７％を示す。２０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液の１．３６ｍＬを部分的に精製されたＭＳ２ ＶＬＰ溶液（１．３５ｍＬ）に添加し、氷水浴に入れた。１５分後、１０％の酢酸水溶液の５０ｍＬを、４．１まで液体のｐＨをもたらすために添加した。次いで、同じ温度及び激しい撹拌で、１．４４ｍＬのエタノールをゆっくり添加した。液体は３０分間０℃に保ち、４℃で１６，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及びｐＨ７．５まで調製した１０ｍＭのＭｇＣｌ２から成る水性緩衝液の２ｍＬに懸濁させた。次いで、試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン２の試料、図１１。この試料の不純物は試料重量の約２４％を示した。希釈した試料はＶｉｖａｓｐｉｎ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）１００ｋＤａ膜を通して濾過し、そこから２００μLの濃縮水を得た。次いで、濃縮水を同じバッファで２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（２００μＬ）の希釈及び限外濾過を４回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン３の試料、図１１。この試料の不純物は試料重量の約９，７％を示した。結論として、９９％より高い純度のＭＳ２ ＶＬＰを含有する生成物を得た。
実施例Ｋ：プロテイナーゼＫ（ＰＫ）及びＭＳ２ ＶＬＰの精製のためのエタノールを有する単純な沈殿
ＭＳ２ ＶＬＰの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料上で実行した。得られた結果を図１２に示す。実施例Ｈと同一の実験から得たベレットの６分の１を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、細胞を溶解させるため超音波で分解した。細胞残屑は、１６，０００ｇで遠心分離によって除去される。得られた細胞溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びＳｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン（フレロン１１）を用いた抽出によって部分的に精製された。次いで、試料を採取し、分析した。レーン１の試料、図１２。ＭＳ２ファージの外皮タンパク質と一致する約１４ｋＤａの強いバンドを見出した。他のバンド−不純物−高分子量の大部分は、試料重量の約２６％を示す。２０ｍＭのＣａＣｌ２の水溶液１．３６ｍＬに溶解された０．６ｍｇのプロテイナーゼＫを部分的に精製されたＭＳ２ ＶＬＰ溶液（１．３５ｍＬ）に添加した。混合物を３７℃でインキュベートし、２．５時間後に氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン２の試料、図１２。この試料の不純物は試料重量の約１４％を示した。１５分後、１０％の酢酸水溶液の約５０ｍＬを、４．１まで液体のｐＨをもたらすため氷水浴に添加した。次いで、同じ温度及び激しい撹拌で、１．５４ｍＬのエタノールをゆっくり添加した。液体は３０分間０℃に保ち、４℃で１６，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及びｐＨ７．５まで調製した１０ｍＭのＭｇＣｌ２から成る水性緩衝液の２ｍＬに懸濁させた。次いで、試料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン３の試料、図１２。この試料の不純物は試料重量の約１０％を示した。希釈した試料はＶｉｖａｓｐｉｎ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）１００ｋＤａ膜を通して濾過し、そこから２００μLの濃縮水を得た。次いで、濃縮水を同じバッファで２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａの膜を通して濾過した。濃縮水（２００μＬ）の希釈及び限外濾過を４回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。レーン４の試料、図１２。この試料の不純物は試料重量の約５．１％を示した。結論として、約９５％の純度のＭＳ２ ＶＬＰを含有する生成物を得た。
実施例Ｌ：ＭＳ２ ＶＬＰを精製するための構成的加水分解（ＣＨ）、エタノールによる分別沈殿及び限外濾過
ＭＳ２ ＶＬＰの精製を以下のように実施した。試料を、精製の際に取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料に行った。得られた結果を図１３に示す。実施例Ｈと同様の実験により得られたペレットの６分の１を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞片を１６，０００ｇでの遠心分離により除去した。得られた細胞溶解物を、Ｓｔｒａｕｓｓ ＆ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４に記載されているように、硫酸アンモニウムの使用による沈殿及びトリクロロフルオロメタン（Ｆｒｅｏｎ １１）の使用による抽出によって部分的に精製した。部分的に精製されたＭＳ２ ＶＬＰ溶液（１．３５ｍＬ）に、１．３６ｍＬの２０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液を加えた。混合物を、（構成的ヒドロラーゼが作用することを可能にするため）３７℃で２．５時間インキュベートし、その後、氷水浴の中に入れた。試料を取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１３のレーン１が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約１２％を表した。１５分後、約１２０μＬの１％水酸化ナトリウム水溶液を氷／水浴に加えて、液体のｐＨを７．８６にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、０．８１ｍＬのエタノールをゆっくりと加えた。液体を０℃で３０分間保持し、１６，０００ｇにより４℃で２０分間遠心分離した。約１００μＬの１０％酢酸水溶液を、氷／水浴中で激しく撹拌しながら上澄みにゆっくりと加え、液体のｐＨを４．０１にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、１．３ｍＬのエタノールをゆっくりと加えた。液体を０℃で３０分間保持し、１６，０００ｇにより４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有し、ｐＨ７．５に調整された２ｍＬの緩衝水溶液に懸濁した。希釈された試料をＶｉｖａｓｐｉｎ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）１００ｋＤａ膜で濾過し、２００μＬの濃縮液（retentate）を得た。次に濃縮水を同じ緩衝液で２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａ膜で濾過した。濃縮液（２００μＬ）の希釈及び限外濾過を更に４回繰り返した。濃縮水の試料を取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１３のレーン３が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約４．７％を表した。結論として、得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約９５％より高い純度で含有した。
実施例Ｍ：ＭＳ２ ＶＬＰを精製するためのプロテイナーゼＫ（ＰＫ）、エタノールによる分別沈殿及び限外濾過
ＭＳ２ ＶＬＰの精製を以下のように実施した。試料を、精製の際に取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料に行った。得られた結果を図１３に示す。実施例Ｈと同様の実験により得られたペレットの６分の１を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞片を１６，０００ｇでの遠心分離により除去した。得られた細胞溶解物を、Ｓｔｒａｕｓｓ ＆ Ｓｉｎｓｈｅｉｍｅｒ（１９６３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ７：４３−５４に記載されているように、硫酸アンモニウムの使用による沈殿及びトリクロロフルオロメタン（Ｆｒｅｏｎ １１）の使用による抽出によって部分的に精製した。部分的に精製されたＭＳ２ ＶＬＰ溶液（１．３５ｍＬ）に、１．３６ｍＬの２０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液に溶解した０．３ｍｇのプロテイナーゼＫを加えた。混合物を、３７℃で２．５時間インキュベートし、その後、氷水浴の中に入れた。試料を取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１３のレーン２が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約８．１％を表した。１５分後、約１２０μＬの１％水酸化ナトリウム水溶液を氷／水浴に加えて、液体のｐＨを７．８６にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、０．８１ｍＬのエタノールをゆっくりと加えた。液体を０℃で３０分間保持し、１６，０００ｇにより４℃で２０分間遠心分離した。約１００μＬの１０％酢酸水溶液を、氷／水浴中の上澄みに加え、液体のｐＨを４．０１にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、１．３ｍＬのエタノールをゆっくりと加えた。液体を０℃で３０分間保持し、１６，０００ｇにより４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有し、ｐＨ７．５に調整された２ｍＬの緩衝水溶液に懸濁した。希釈された試料をＶｉｖａｓｐｉｎ ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）１００ｋＤａ膜で濾過し、２００μＬの濃縮液を得た。次に濃縮水を同じ緩衝液で２ｍＬに希釈し、同じ１００ｋＤａ膜で濾過した。濃縮液（２００μＬ）の希釈及び限外濾過を更に４回繰り返した。濃縮水の試料を取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１３のレーン４が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約０．９％を表した。結論として、得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約９９％より高い純度で含有した。
実施例Ｎ：ＭＳ２ ＶＬＰの精製のための多様なヒドロラーゼ及び硫酸アンモニウムによる分別沈殿の使用
ＭＳ２ ＶＬＰの精製を以下のように実施した。試料を、精製の際に取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を試料に行った。得られた結果を図１４に示す。実施例Ｈと同様の実験により得られたペレットの６分の１を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞片を１６，０００ｇでの遠心分離により除去した。上澄みの試料を取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン１が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約７０％を表した。実施例Ｈと同様の実験から得られたペレットの他の４つの同様の画分を、同じ方法で処理した。
容量がそれぞれ３．７ｍＬの得られた５つの遠心分離細胞溶解物を、以下のように５つの異なる方法で更に処理した。第１の遠心分離細胞溶解物を、氷水浴に１５分間入れ、０．１グラムの硫酸アンモニウムを加えた。混合物を、硫酸アンモニウムの完全な溶解が達成されるまでボルテックスした（vortexed）。液体を０℃で２時間保持し、１６，０００ｇにより４℃で３０分間遠心分離した。０．４グラムの硫酸アンモニウムを上澄みに加え、硫酸アンモニウムの完全な溶解が達成されるまでボルテックスした。液体を０℃で２時間保持し、１６，０００ｇにより４℃で３０分間遠心分離した。精製されたＭＳ２ ＶＬＰペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有し、ｐＨ７．５に調整された０．２ｍＬの緩衝水溶液に懸濁した。第２遠心分離細胞溶解物を３７℃で５時間インキュベートし、氷水浴に第１遠心分離細胞溶解物と同じ時間にわたって入れ、続いて第１遠心分離細胞溶解物と同様の方法により処理した。０．１５ｍｇのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を第３遠心分離細胞溶解物に加えた。次にこれを３７℃で５時間インキュベートし、氷水浴に第１遠心分離細胞溶解物と同じ時間にわたって入れ、続いて第１遠心分離細胞溶解物と同様の方法により処理した。第４遠心分離細胞溶解物を３７℃で２時間インキュベートした。次に０．１５ｍｇのＰＫを加えた。これを３７℃で更に３時間インキュベートし、氷水浴に第１遠心分離細胞溶解物と同じ時間にわたって入れ、続いて第１遠心分離細胞溶解物と同様の方法により処理した。
５００単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び３５単位の、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ（カンジダルゴサ）のリパーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、第５遠心分離細胞溶解物に加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に１５単位の、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．（バチルス属）のα−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃で更に１時間インキュベートした。次に０．１５ｍｇのＰＫを加えた。混合物を３７℃で更に３時間インキュベートし、氷水浴に第１遠心分離細胞溶解物と同じ時間にわたって入れ、続いて第１遠心分離細胞溶解物と同様の方法により処理した。
試料を第２遠心分離細胞溶解物から５時間のインキュベーションの後で取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン２が試料である。試料を第３遠心分離細胞溶解物から５時間のインキュベーションの後で取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン３が試料である。 試料を第４遠心分離細胞溶解物から５時間のインキュベーションの後で取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン４が試料である。試料を第５遠心分離細胞溶解物から５時間のインキュベーションの後で取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン５が試料である。
試料を第１遠心分離細胞溶解物の精製されたＭＳ２ ＶＬＰ懸濁液から取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン６が試料である。得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約８８％の純度で含有した。この試料のタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）は、１８．５ｍｇ／ｍＬであった。この試料の２００：１の希釈を２６０ｎｍにより１ｃｍのセルで測定した光学濃度（ＯＤ−２６０ｎｍ）は、０．５５３であり、ＯＤ−２８０ｎｍは０．３０３であった。これらの測定値は、培養物１リットルあたり約９ｍｇのＲＮＡ収量と一致している。
試料を第２遠心分離細胞溶解物の精製されたＭＳ２ ＶＬＰ懸濁液から取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン７が試料である。得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約７５％の純度で含有した。試料のタンパク質濃度は２５．４ｍｇ／ｍＬであった。この試料の２００：１の希釈を２６０ｎｍにより１ｃｍセルで測定した光学濃度（ＯＤ−２６０ｎｍ）は、０．７８４であり、ＯＤ−２８０ｎｍは０．４５３であった。これらの測定値は、培養物１リットルあたり約１１ｍｇのＲＮＡ収量と一致している。
試料を第３遠心分離細胞溶解物の精製されたＭＳ２ ＶＬＰ懸濁液から取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン８が試料である。得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約９４．３％の純度で含有した。試料のタンパク質濃度は２１．０ｍｇ／ｍＬであった。この試料の２００：１の希釈を２６０ｎｍにより１ｃｍセルで測定した光学濃度（ＯＤ−２６０ｎｍ）は、０．６３２であり、ＯＤ−２８０ｎｍは０．３２１であった。これらの測定値は、培養物１リットルあたり約１０ｍｇのＲＮＡ収量と一致している。
試料を第４遠心分離細胞溶解物の精製されたＭＳ２ ＶＬＰ懸濁液から取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン９が試料である。得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約９５．６％の純度で含有した。試料のタンパク質濃度は１９．４ｍｇ／ｍＬであった。この試料の２００：１の希釈を２６０ｎｍにより１ｃｍセルで測定した光学濃度（ＯＤ−２６０ｎｍ）は、０．６６６であり、ＯＤ−２８０ｎｍは０．３５３であった。これらの測定値は、培養物１リットルあたり約１１ｍｇのＲＮＡ収量と一致している。
試料を第５遠心分離細胞溶解物の精製されたＭＳ２ ＶＬＰ懸濁液から取り出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した：図１４のレーン１０が試料である。得られた生成物は、ＭＳ２ ＶＬＰを約９６％の純度で含有した。試料のタンパク質濃度は１９．８ｍｇ／ｍＬであった。この試料の２００：１の希釈を２６０ｎｍにより１ｃｍセルで測定した光学濃度（ＯＤ−２６０ｎｍ）は、０．６６１であり、ＯＤ−２８０ｎｍは０．３５４であった。これらの測定値は、培養物１リットルあたり約１１ｍｇのＲＮＡ収量と一致している。
実施例Ｏ：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合しているＨＤＶリボザイムを標的にするｓｈＲＮＡを包むＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列の配列Ａ（配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ 配列Ａ（配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｂ（配列番号８）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンした。転写ターミネーターも、配列Ｂ（配列番号８）の３’末端にクローンした（示されず）。配列Ｂ（配列番号８）は、ｓｈＲＮＡヘアピン、ｓｈＲＮＡヘアピンの３’末端を切断するように設計された肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム及びＭＳ２の特異的ＲＮＡ１９−ｍｅｒをコードし、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンした。
配列Ｔ７−Ｒｚ６
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号８）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号１０４）及び配列Ｂ（配列番号１０５）を含有する、２つのプラスミドにより形質転換した。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する３２ｍＬのＬＢ培地において３７ｏで増殖させた。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達したとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにした。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取した。ＲＮＡを、実施例Ｚに記載されているように精製ＶＬＰから抽出し、実施例ＡＡに記載されているように分析した。図１６のｓｈＲＮＡのレーンにおいて観察されたように、コード化されたｓｈＲＮＡで予測された同じ分子量のバンドが観察された。
実施例Ｐ：長ハンマーヘッドリボザイムにより５’末端でフランクされ、ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合しているＨＤＶリボザイムにより３’末端でフランクされているｓｉＧＦＰをコードする転写物と、第２ＨＤＶリボザイムとを使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列の配列Ａ（配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ 配列Ａ（配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｃ（配列番号９）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンする。転写ターミネーターも、配列Ｃ（配列番号９）の３’末端にクローンする（示されず）。配列Ｃ（配列番号９）は、Ｔ７プロモーター、ｓｉＲＮＡヘアピンの５’末端を切断するように設計されたハンマーヘッドリボザイム、ｓｉＲＮＡヘアピン、ｓｉＲＮＡヘアピンの３’末端を切断するように設計された肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム及びＭＳ２の特異的ＲＮＡ１９−ｍｅｒをコードし、別のＨＤＶリボザイムをプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンする。
配列Ｔ７−Ｒｚ１２
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＣＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号９）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号１０４）及び配列Ｃ（配列番号１０６）を含有する２つのプラスミドにより形質転換する。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する３２ｍＬのＬＢ培地において３７ｏで増殖させる。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達するとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにする。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取する。
実施例Ｑ：ｓｈＲＮＡをコードする転写物及びＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している遅発性ＨＤＶリボザイムを使用するＭＳ２カプシドの産生
それぞれ異なるカーゴを包むＭＳ２カプシドを産生する幾つかの実験を、実施例Ｏに記載されているように実施する。しかし、配列Ｂ（配列番号８）に含まれるＨＤＶリボザイム配列の代わりに、遅い反応速度定数を有するｓｉＲＮＡの３’末端を切断する突然変異体を、それぞれの実験において使用する。遅発性ＨＤＶリボザイムを含有する以下の配列を、それぞれの実験において配列Ｂの代わりに使用する。
配列Ａ１６Ｇ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１２）
配列Ｇ３９Ｕ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１３）
配列Ａ７８Ｇ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１４）
配列Ｃ２１Ｕ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１５）
配列Ｇ２５Ａ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１６）
配列Ａ７８Ｕ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１７）
配列Ｇ７４Ｃ：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号１８）
実施例Ｒ：一方の長ハンマーヘッドリボザイムにより５’末端がフランクされ、ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している他方の長ハンマーヘッドリボザイムにより３’末端がフランクされているｓｈＧＦＰ及びＨＤＶリボザイムをコードする転写物使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列の配列Ａ（配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ
以下のＤＮＡ配列の配列Ｄ（配列番号１９）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンする。転写ターミネーターも、配列Ｄ（配列番号１９）の３’末端にクローンする（示されず）。配列Ｄ（配列番号１９）は、Ｔ７プロモーター、ｓｉＲＮＡヘアピンの５’末端を切断するように設計されたハンマーヘッドリボザイム、ｓｉＲＮＡヘアピン、ｓｉＲＮＡヘアピンの３’末端を切断するように設計されたハンマーヘッドリボザイム、ＭＳ２の特異的ＲＮＡ１９−ｍｅｒ及びＨＤＶリボザイムをコードする。
配列Ｔ７−Ｒｚ１５：
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＣＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号１９）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号７）及び配列Ｄ（配列番号１９）を含有する２つのプラスミドにより形質転換する。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７°で増殖させる。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達したとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにする。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取する。試料を、誘導の前及び分析のための採取時に取り出す。
実施例Ｓ：ｓｈＲＮＡをコードする及びＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している長ハンマーヘッドリボザイムをコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
それぞれ異なるカーゴを包むＭＳ２カプシドを産生する幾つかの実験を、実施例Ｏに記載されているように実施する。しかし、配列Ｂ（配列番号８）に含まれるＨＤＶリボザイム配列の代わりに、ｓｉＲＮＡの３’末端をハイブリダイズし、切断するように設計された長ハンマーヘッドリボザイム配を、それぞれの実験において使用する。長ハンマーヘッドリボザイムを含有する以下の配列を、それぞれの実験において配列Ｂ（配列番号８）の代わりに使用する。
実施例に記載された実験データは、本開示の良好に切断するＲＮＡ鎖がハンマーヘッドリボザイム配列を含むものであり、リボザイム配列の適切な折り畳みが、全鎖のｓｈＲＮＡ（「ヘアピン」）セクションの折り畳みよりも熱力学的に好ましいという結論を支持する。上記の配列それぞれの熱力学的パラメーターを計算して、どの配列が良好に切断する及び切断しないかを決定した。
実施例Ｔ：ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに５’末端が結合している長ハンマーヘッドリボザイム及び３’末端が結合しているトランス作用ＨＤＶリボザイムによりフランクされているｓｉＲＮＡをコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列（配列Ａ；配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ （配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｅ（配列番号２６）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンする。転写ターミネーターも、配列Ｅ（配列番号２６）の３’末端にクローンした（示されず）。配列Ｅ（配列番号２６）は、ＢａｍＨＩ制限部位、Ｔ７プロモーター及び開始配列、高感度緑色蛍光タンパク質に対するｓｈｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＰＦ）の３’末端をトランス様式で切断するように設計されたＨＤＶリボザイム、ＡＴＡＴスペーサー、ｓｉＥＧＦＰヘアピンの５’末端を切断するように設計された長ハンマーヘッドリボザイム、ｓｉＥＧＦＰヘアピン、ｓｉＥＧＦＰヘアピンの３’末端をトランス様式で切断するＨＤＶリボザイムに相補的な配列、ＭＳ２の特異的なＲＮＡ１９−ｍｅｒ及びＰａｃＩ制限部位をコードする。
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号２６）
ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を５’及び３’末端にそれぞれ付加して、ｐＡＣＹＣ１８４へのクローニングを促進する（示されず）。
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号１０４）及び配列Ｅ（配列番号２６）を含有する２つのプラスミドにより形質転換する。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７°で増殖させる。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達するとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにする。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取する。試料を、誘導の前及び分析のための採取時に取り出す。
実施例Ｕ：ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している長ハンマーヘッドリボザイムによりフランクされているＧＦＰを標的にする３つの異なるｓｉＲＮＡをコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列（配列Ａ；配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ（配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｆ（配列番号２７）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンする。転写ターミネーターも、配列Ｆ（配列番号２７）の３’末端にクローンした（示されず）。配列Ｆ（配列番号２７）は、Ｔ７プロモーター及び開始配列、高感度緑色蛍光タンパク質に対するｓｈｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＰＦ）の５’末端を切断するように設計された３つのハンマーヘッドリボザイム、３つの異なるｓｉＥＧＦＰヘアピン、ｓｉＥＧＦＰヘアピンの３’末端を切断するように設計された３つの長ハンマーヘッドリボザイム、ＭＳ２の特異的なＲＮＡ１９−ｍｅｒをコードする。
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号２７）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号７）、他方が配列Ｆ（配列番号２７）を含有する、２つのプラスミドにより形質転換する。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７°で増殖させる。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達するとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにする。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取する。試料を、誘導の前及び分析のための採取時に取り出す。
実施例Ｖ：ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している５’末端に位置するスペーサー及び３’末端に位置するＨＤＶリボザイムによりフランクされているＧＦＰを標的にする３つの異なるｓｉＲＮＡをコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列（配列Ａ；配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ （配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｇ（配列番号２８）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンする。転写ターミネーターも、配列Ｇ（配列番号２８）の３’末端にクローンした（示されず）。配列Ｇ（配列番号２８）は、ＢａｍＨＩ制限部位、Ｔ７プロモーター及び開始配列、高感度緑色蛍光タンパク質に対するｓｈｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＰＦ）の５’末端の３つのスペーサー、３つの異なるｓｉＥＧＦＰヘアピン、ｓｉＥＧＦＰヘアピンの３’末端を切断するように設計された３つのＨＤＶリボザイム、ＭＳ２の特異的ＲＮＡ１９−ｍｅｒ及びＰａｃＩ制限部位をコードする。
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号９２８）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号７）及び配列Ｇ（配列番号２８）を含有する２つのプラスミドにより形質転換する。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７°で増殖させる。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達するとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにする。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取する。試料を、誘導の前及び分析のための採取時に取り出す。
実施例Ｗ：ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している３’末端に位置する長ハンマーヘッドリボザイム及び５’末端に位置するＨＤＶリボザイムによりそれぞれフランクされているＧＦＰを標的にするｓｉＲＮＡの２本の鎖をコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列（配列Ａ；配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンする。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ（配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｈ（配列番号２９）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンした。転写ターミネーターも、配列Ｈの３’末端にクローンした（示されず）。
配列Ｔ７−Ｒｚ８
ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＣＡＣＧＧＴＡＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧ（配列番号２９）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号１０４）及び配列Ｈ（配列番号１２６）を含有する、２つのプラスミドにより形質転換した。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７ｏで増殖させた。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達するとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにした。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取した。
実施例Ｘ：ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに結合している３’末端及び５’末端に位置するスペーサーによりフランクされている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を標的にする２つの異なるｓｉＲＮＡをコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施する。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列（配列Ａ；配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンした。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ （配列番号７）
以下のＤＮＡ配列の配列Ｉ（配列番号３０）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンした。転写ターミネーターも、配列Ｉ（配列番号３０）の３’末端にクローンした（示されず）。配列Ｉ（配列番号３０）は、Ｔ７プロモーター及び開始配列、緑色蛍光タンパク質に対するｓｈｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＰＦ）の末端を隔てる３つのスペーサー、２つの異なるｓｉＧＦＰヘアピン、ＭＳ２の特異的ＲＮＡ１９−ｍｅｒをコードする。
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号７）及び配列Ｉ（配列番号３０）を含有する２つのプラスミドにより形質転換する。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７°で増殖させる。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達するとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにする。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取する。試料を、誘導の前及び分析のための採取時に取り出す。
実施例Ｙ：実施例Ｏ〜Ｘにより得られたＭＳ２ ＶＬＰの精製
実施例Ｏ〜Ｘにより得られたＭＳ２カプシドを、実施例Ｎに概説された手順の使用により精製する。
実施例Ｚ：実施例Ｎにより得られたＭＳ２カプシドに包まれているＲＮＡの単離
実施例Ｎに記載されているように精製されたＭＳ２カプシドに包まれているＲＮＡを、製造会社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から供給されたプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬の使用によりそれぞれの実験において抽出した。得られたＲＮＡを、ホルムアミドにおいて９５℃で５分間加熱して変性させ、８％のポリアクリルアミド、８モルの尿素、１．０８％のＴｒｉｓ塩基、０．５５％のホウ酸及び０．０９３％のＥＤＴＡから構成される１７．６ｃｍ×３８ｃｍ×０．０４ｃｍ（幅、長さ、高さ）のゲルにおける電気泳動により分析した。処理緩衝液は、ゲルと同じ濃度のＴｒｉｓ塩基、ホウ酸及びＥＤＴＡを有した。電力は約４０Ｗで送った。ゲルを、２５％のホルムアミド、１９％のイソプロパノール及び１５ｍＭのＴｒｉｓをｐＨ８で含有する水性混合物中のＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ染料（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の０．０２５％溶液の使用により染色した。得られた結果を図１５に示す。図１５のＲＮＡ電気泳動のレーン番号は、図１４のタンパク質電気泳動と同じレーン番号を参照する。単一ＲＮＡバンドを各レーンにおいて観察することができ、それぞれの場合に回収された高純度ＲＮＡと一致しうる。
実施例ＡＡ：ＨＤＶリボザイムは、インビトロ転写の際にｓｈＲＮＡを産生した。
作成物Ｔ７−Ｒｚ２をインビトロ転写に使用した。この作成物をｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローンした。Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、このプラスミドの使用により形質転換した。プラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリンを含有するＬＢ培地において３７℃で増殖させ、ＯＤ（６００ｎｍ）を０．８に等しくした。プラスミドを、製造会社の使用説明書に従ってＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の使用により単離した。ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、単離したプラスミドをこの作成物に導入した制限部位で切断した。消化の後、テンプレートを、１．５％アガロースゲルにおける電気泳動により精製し、製造会社の使用説明書に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により単離した。逆転写を、製造会社の使用説明書に従ってＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７ Ｋｉｔの使用により行った。ＲＮＡ産物を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）変性１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を７０℃で作動して電気泳動した。ＲＮＡバンドを、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の使用により可視化した。ゲル画像化を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ４．０．１ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用により行った。
テンプレートＴ７−Ｒｚ２は、Ｔ７プロモーター、ｓｈＲＮＡヘアピン、ｓｈＲＮＡヘアピンの３’末端を切断するように設計されたＨＤＶリボザイム、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴスペーサー及びＮｃｏＩ制限部位を以下のようにコードした。
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号３１）
結果は、ＨＤＶリボザイムが切断することを示す。最上部のバンドは、非切断転写物であり、その下の２つのバンドは、ＲＮＡの予測された切断片であった。
図１６のゲルは、最も左側のレーンにＲＮＡマーカーのセット、次のレーンに４９ヌクレオチドｓｈＲＮＡマーカー、第３のレーンにインビトロ転写し、３７℃で１時間作動したＴ７−Ｒｚ２作成物の切断、並びに第４の最も右側のレーンにインビトロ転写し、３７℃で１時間作動し、４２℃で更に１時間インキュベートしたＴ７−Ｒｚ２作成物の切断を示す。
３つの最も強力なバンドのうちで最も遅いものは、３７／４２よりも３７でより高い強度を有した加えて、２つのより早いバンドは、３７より３７／４２でより高い強度を有した。最後のレーンにおける最低分子量バンドは、４９ヌクレオチドｓｈＲＮＡ基準よりも僅かに遅く作動し、このことはＴ７Ｒｚ２において得られた５１ヌクレオチドｓｈＲＮＡから予測された。まとめると、図１６に示されている結果は、ＨＤＶリボザイムがＴ７−Ｒｚ２を切断するという仮説と一致している。
実施例ＢＢ：長フランキングハンマーヘッドリボザイムは、インビボ転写の際に短フランキングハンマーヘッドリボザイムにより有意に高い程度で切断する。
作成物Ｔ７−Ｒｚ１及びＴ７−Ｒｚ４をインビトロ転写に使用した。Ｔ７−Ｒｚ１は、共通リボザイムを含み、すなわち、６対未満のハイブリダイズヌクレオチドに切断されるＲＮＡとハイブリダイズする幹を有するものを含む。Ｔ７−Ｒｚ４は、切断されるｓｉＲＮＡとハイブリダイズする長い幹を有する、すなわち、６対を超えるハイブリダイズヌクレオチドを有する幹を有するフランキングリボザイムを含む。
作成物Ｔ７−Ｒｚ１は、Ｔ７プロモーター、ｓｉＲＮＡに相補的な５つのヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡヘアピンの５’末端を切断するように設計されたハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム、ｓｉＲＮＡヘアピン、ｓｉＲＮＡに相補的な５つのヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡヘアピンの３’末端を切断するように設計されたＨＨリボザイム及びＮｃｏＩ制限部位をコードする。
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧ（配列番号３２）
作成物Ｔ７−Ｒｚ４は、ｓｉＲＮＡとハイブリダイズする１２個のヌクレオチドを有する５’末端を切断するように設計されたＨＨリボザイム及びｓｉＲＮＡとハイブリダイズする２３個のヌクレオチドを有する３’末端を切断するように設計されたＨＨリボザイムによりフランクされているａｎｓｉＲＮＡをコードする。
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号３３）
インビトロ転写実験及び分析を、実施例Ｙと類似の方法でこれらの作成物により実施した。図１７に示されているように、作成物Ｔ７−Ｒｚ１により得られた結果は、リボザイムが非常に低い程度で切断するという仮説と一致した。図１７に示されている作成物Ｔ７−Ｒｚ４により得られた結果は、リボザイムが有意な程度で切断するという仮説と一致した。
実施例ＣＣ：ＭＳ２ １９−ｍｅｒＲＮＡヘアピンに５’末端が結合している長ハンマーヘッドリボザイム及び３’末端が結合している別の長ハンマーヘッドリボザイムによりフランクされているＥＧＦＰに対するｓｈＲＮＡをコードする転写物を使用するＭＳ２カプシドの産生
ＭＳ２カプシドの産生を以下のように実施した。ＭＳ２のコートタンパク質をコードする以下のＤＮＡ配列（配列Ａ；配列番号７）を、ｐＤＥＳＴ１４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドにクローンした。
ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧ（配列番号７）
以下のＤＮＡ配列（作成物Ｔ７−Ｒｚ４）をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローンした。転写ターミネーターも、作成物Ｔ７−Ｒｚ４の３’末端にクローンした（示されず）。
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧ（配列番号３３）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の細胞を、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質転換体を選択するために、一方が配列Ａ（配列番号７）及び作成物Ｔ７−Ｒｚ４（配列番号３３）を含有する、２つのプラスミドにより形質転換した。カプシド産生では、これらの形質転換体を、アンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含有する７５０ｍＬのＬＢ培地において３７°で増殖させた。培養密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．８に達したとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、最終濃度を１ｍＭにした。細胞を、誘導の４時間後に、３，０００ｇによる４℃で４０分間の遠心分離によって採取した。試料を、誘導の前及び分析のための採取時に取り出した。
実施例ＤＤ：実施例ＣＣにより得られたウイルス様粒子の精製
実施例ＣＣにおいて産生されたウイルス様粒子の精製を、実施例Ｎに記載されたとおりに実施した。
実施例ＥＥ：実施例ＤＤにより得られたウイルス様粒子におけるＲＮＡの単離
実施例ＤＤに記載されているように精製されたウイルス様粒子に包まれているＲＮＡを、製造会社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から供給されたプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬の使用により抽出した。得られたＲＮＡを、ホルムアミドにおいて９５℃で５分間加熱して変性させ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）変性１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を７０℃で作動して電気泳動することにより分析した。ＲＮＡバンドを、水溶液１ｍＬあたり０．５μｇの臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の使用により可視化した。得られた結果を図１８のレーン３に示す。レーン１は、分子基準のセットを示す。レーン２は、４９個のヌクレオチド長さの化学的に合成されたｓｈＲＮＡを示す。
実施例ＦＦ：実施例ＤＤにより得られたＭＳ２カプシドを含むウイルス様粒子は、Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ ａｌｂｕｍ（エンギオドンチウム・アルブム）、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（リケニホルミス）からのプロテイナーゼＫ、ブタ胃粘膜からのペプシン及びパパイヤラテックスからのパパインに耐性がある。
２５０ｍＬの培養物から得られ、実施例ＤＤに記載されたように精製された、ＭＳ２カプシドを含むウイルス様粒子を、４００μＬの２０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液にｐＨ＝７．５で懸濁した。
この懸濁液の６６μＬのアリコートを、２０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ３０８６及び４６５６ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン１Ｂ及び６にそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。この実験セットを陰性対照として使用した。
２μｇの、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのプロテアーゼを、２０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ３６１及び３２４ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン１及び７にそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。この実験セットを別の陰性対照として使用した。
２μｇの、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼを、ＭＳ２カプシド懸濁液を含むウイルス様粒子の別の６６μＬのアリコートに加え、２０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ２９４０及び３０１２ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン２及び８にそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。この実験セットを使用して、ウイルス様粒子を形成するＭＳ２カプシドのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼに対するタンパク質分解安定性について試験した。１０％未満の分解が観察された。
ＭＳ２カプシド懸濁液を含むウイルス様粒子の別の６６μＬのアリコートを、２０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、９５℃で１０分間の加熱及び１０分間のウエットアイス（wet icｅ）による冷却の３サイクルに付して、ウイルス様粒子の解体を達成した。次に、２μｇのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼをこの懸濁液に加え、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ２６０１及び３０３３ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン３及び９にそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。解体された粒子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼにより有意な程度で分解された。この実験セットを陽性対照として使用した。
０．００２ｍＬの２０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液にｐＨ７．５で溶解した２μｇのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼを、実施例ＣＣにおける４１ｍＬの細胞培養物から得た０．２４８ｍＬの細菌細胞溶解物に加え、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ３１９２及び４８３７ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン４及び１０にそれぞれ示す。図１９の最後のレーンは、Ｌと標識されており、未処理細菌細胞溶解物を示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。ＭＳ２カプシドタンパク質以外のタンパク質の９０％超が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼにより分解された。この実験セットを別の陽性対照として使用した。
この５つの実験セットは、本開示のウイルス様粒子を形成するＭＳ２カプシドがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）からのプロテアーゼによるタンパク質分解に耐性があることを実証している。
２μｇの、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのプロテアーゼを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び５ｍＭの酢酸カリウム水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ９７６及び１００３ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン２Ｂ及び７Ｂにそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。この実験セットを別の陰性対照として使用した。
２μｇの、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼを、ＭＳ２カプシド懸濁液を含むウイルス様粒子の別の６６μＬのアリコートに加え、１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び５ｍＭの酢酸カリウム水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ３１４４及び３７２７ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン３Ｂ及び８Ｂにそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。この実験セットを使用して、ウイルス様粒子を形成するＭＳ２カプシドのＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼに対するタンパク質分解安定性について試験した。１０％未満の分解が観察された。
ＭＳ２カプシド懸濁液を含むウイルス様粒子の別の６６μＬのアリコートを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び５ｍＭの酢酸カリウム水溶液によりｐＨ＝７．５で希釈して０．２５ｍＬにし、９５℃で１０分間の加熱及び１０分間のウエットアイスによる冷却の３サイクルに付して、ウイルス様粒子の解体を達成した。次に、２μｇのＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼをこの懸濁液に加え、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ１７６９及び１７８５ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン４Ｂ及び９Ｂにそれぞれ示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。解体された粒子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼにより分解された。この実験セットを陽性対照として使用した。
０．００２ｍＬの１０ｍＭ 酢酸ナトリウム及び５ｍＭの酢酸カリウム水溶液にｐＨ７．５で溶解した２μｇのＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼを、実施例ＣＣにおける４１ｍＬの細胞培養物から得た０．２４８ｍＬの細菌細胞溶解物に加え、３７℃でインキュベートした。試料を、タンパク質濃度及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析のために、インキュベーションの１時間及び４時間後に取り出した。これらの２つの試料におけるタンパク質濃度は、それぞれ３６９６及び４０７８ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、図１９のレーン６Ｂ及び１０Ｂにそれぞれ示す。図１９の最後のレーンは、Ｌと標識されており、未処理細菌細胞溶解物を示す。同じ量のタンパク質を各レーンに装填した（４μｇ）。ＭＳ２カプシドタンパク質以外のタンパク質の９０％超が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼにより分解された。この実験セットを別の陽性対照として使用した。
この４つの実験セットは、本開示のウイルス様粒子を形成するＭＳ２カプシドがＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケニフォルミス）からのプロテアーゼによるタンパク質分解に耐性があることを実証している。
追加の同等の３つの実験のセットは、本開示のウイルス様粒子を形成するＭＳ２カプシドが、以下の３つのプロテアーゼ：Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ ａｌｂｕｍ（エンギオドンチウム・アルブム）からのプロテイナーゼＫ、ブタ胃粘膜からのペプシン（ＣＡＳ番号９００１−７５−６）及びパパイヤラテックス（ＣＡＳ番号９００１−７３−４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのパパインのいずれかによるタンパク質分解に耐性があることを実証している。それぞれのプロテアーゼを製造会社の使用説明書に従って使用した。プロテイナーゼＫをｐＨ＝７．５で使用し、ペプシンをｐＨ＝１．６で使用し、パパインをｐＨ＝６．６で使用した。
実施例ＧＧ：カプシドコートタンパク質変種
ＭＳ２ウイルスカプシドタンパク質（配列番号３）は、単一の折り畳みドメインを有し、レビウイルス科及びアロレビウイルス科カプシドタンパク質を含む、スーパーファミリーｄ．８５の折り畳みファミリーｄ．８５．１（ＲＮＡバクテリオファージカプシドタンパク質に属する。このファミリーのそれぞれのカプシドモノマーは、６本鎖ベータシート、続く２つのへリックスから構成される（時々、ねじれを有する長へリックスとして記載される）。１８０個のモノマーが非共有的に組み立てられて、カプシド内面を向いている連続ベータ−シート層及びカプシド外面にアルファ−へリックスを有する二十面体（ほぼ球状）のウイルスカプシドを形成する。Ｘ線結晶構造が、腸内細菌ファージＭＳ２、ＧＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列アイデンティファイアーＰ０７２３４）及びＦＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列アイデンティファイアーＰ０３６１４）ウイルスカプシド、並びに１つのＭＳ２の１つのＣ末端が別の全てのｄ．８１．１ファミリーレビウイルス科コートタンパク質のＮ末端と縮合しているＭＳ２二量体から形成されるＭＳ２のカプシドのために解明され、パブリックドメインに配置された。これらの構造のＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋアンデンティファイアーは、それぞれ１ＡＱ３（配列番号３４）、１ＧＡＶ（配列番号３５）、１ＦＲＳ（配列番号３６）及び２ＶＴＵ（配列番号３７）であり、これらのアラインメントを図２０に示す。この本明細書に記載されている全てのアラインメントにおいて、残基の番号付けは、連続した残基番号付けであり、例えば配列番号３は、大部分のＰＤＢ構造に使用されているように、細胞により除去されるリードＭｅｔ（Ｍ）残基の０から開始している。
ＭＳ２ウイルスカプシドタンパク質の配列は、ＧＡ及びＦＲウイルスカプシドタンパク質に対してそれぞれ５９％及び８７％の同一性がある。３つの配列を全て一緒に考慮すると、僅か５６％の配列位置が同一配列を有し、主鎖オーバーレイに関して位相幾何学的等価位置を有する。ＧＡ及びＦＲウイルスカプシドモノマーに対するＭＳ２ウイルスカプシドタンパク質の主鎖立体配座の平均二乗偏差は、１Ａ未満である１ＧＡＶモノマー０に対する１ＡＱ３モノマーＡの主鎖平均二乗偏差は、０．８９オングストロームである。１ＦＲＳモノマーＡに対する１ＡＱ３モノマーＡの主鎖平均二乗偏差は、０．３７オングストロームである。比較を、タンパク質構造ツールの標準的なワークベンチにおけるＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋサイトで入手可能な、タンパク質の構造研究をする実務者に良く知られているツールである、フリーウェアユーティリティーｊＦＡＴＣＡＴ剛性（Ｐｒｌｉｃ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，２９８３−２９８５（２０１０）；ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｄｏ；ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｄｏ）を使用して行った。これらのタンパク質の全体的な折り畳みは、同一であった。挿入又は欠失はない。結晶学的非対称単位のタンパク質をそれぞれ個別に精製する。非対称単位内の組成的に同一の異なるタンパク質は、一般に、１オングストローム以上の主鎖平均二乗偏差を有するが、コアの位相幾何学的に等価なＣａｌｐｈａ原子は、約０．４５オングストローム未満で異なる傾向がある（Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ａｒｔｈｕｒ Ｍ Ｌｅｓｋ（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ ５，８２３−８２６）。例えば、１ＡＱ３モノマーＡ及び１ＡＱ３モノマーＢは、主にＬｙｓ６６−Ｔｒｐ８２領域における立体配座の差によって、１．７２Ａの平均二乗偏差を有する（（ｊＦＡＴＣＡＴ剛性）。
十分な数の折り畳みファミリーが同定されると、ファミリー内でほとんど又は全く突然変異しない配列内の位相幾何学的に等価な残基位置である保存残基の鮮明な像が現れる。非保存位置は、特に側鎖が空間的近接者の側鎖に対して詰める場合、おそらく折り畳みにおける空間的近接者の協調的突然変異と一緒に、ファミリーの折り畳みを妨げることなく配列毎に突然変異すると予測することができる。保存残基は、タンパク質の安定した折り畳み、機能又はプロセッシングにとって、例えばタンパク質分解性消化にとって重要でありうる。幾つかは同時発生的に保存されうる。ＧｅｎＢａｎｋ（Ｄｅｎｎｉｓ Ａ．Ｂｅｎｓｏｎ，Ｉｌｅｎｅ Ｋａｒｓｃｈ−Ｍｉｚｒａｃｈｉ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｊａｍｅｓ Ｏｓｔｅｌｌ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌ．Ｗｈｅｅｌｅｒ（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，Ｄ３４−Ｄ３８）は、現在、３５３個のレビウイルス科コートタンパク質配列を保持する。図２１に示されているアラインメント表は、網羅的タンパク質配列ベータベースＵｎｉＰｒｏｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，（Ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｒｅｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐａｃｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０：Ｄ７１−Ｄ７５（２０１２）），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）（下記の表１を参照すること）から検索され、ＢＬＡＳＴ（閾値＝１０、自動重み付けアレイ選択、フィルタリングなし、ギャップ可能）により整列された４０個の完全レビウイルス科コートタンパク質配列の複数アラインメントを示す。ｅｆ１０８４６５を除く全ての配列をＵｎｉＰｒｏｔから取得した。ｅｆ１０８４６５はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）からのものであった。アラインメント表において、星印（＊）は、保存残基を示し、ｘは、側鎖溶媒露出度、水素結合要件及び主査立体配座制約に基づいて計算される置換可能性である。これらのファミリーメンバーの配列における５７個の残基は保存されている又は配列の４５％は互いに同一である。これらの配列の幾つかは、配列番号３のＣ末端Ｔｙｒ１２９残基の後に追加の残基を有し、他は、配列番号３に関してＮ末端から１〜２つの残基が除去されている。折り畳み内に挿入又は欠失はない。

配列番号３４ １ＡＱ３ 腸内細菌ファージＭＳ２コートタンパク質 Ｔ５９Ｓ
ＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＳＩ
ＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳ
ＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号３５ １ＧＡＶ 腸内細菌ファージＧＡコートタンパク質 Ａ５９Ｔ Ｇ７９Ｖ
ＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫ
ＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＧＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＥＡ
ＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号３６ １ＦＲＳ 腸内細菌ファージＦＲコートタンパク質
＞ｓｐ｜Ｐ０３６１４｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＦＲ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ｆｒ ＰＥ＝１ ＳＶ＝４
ＡＳＮＦＥＥＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＫＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＮＮＲＫＹＴＶ
ＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＶＱＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＭＮＭＥＬＴＩＰＶＦＡＴＮＤＤＣＡＬＩＶＫＡＬＱＧＴＦＫＴＧＮＰＩＡＴ
ＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号３７ ２ＶＴＵ 腸内細菌ファージＭＳ２コートタンパク質共有二量体
ｓｐ｜Ｐ０３６１２｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
ＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩ
ＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳ
ＡＩＡＡＮＳＧＩＹＡＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳ
ＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬ
ＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号３８（配列番号３８） Ｇ４ＷＺＵ０ Ｇ４ＷＺＵ０＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ ３２９８５２
＞ｓｐ｜Ｐ０３６１２｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴ
ＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＬＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰ
ＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号３９
Ｄ０Ｕ１Ｄ６ Ｄ０Ｕ１Ｄ６＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２
＞ｔｒ｜Ｄ０Ｕ１Ｄ６｜Ｄ０Ｕ１Ｄ６＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージＭＳ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＬＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４０
Ｃ０Ｍ２Ｕ４ Ｃ０Ｍ２Ｕ４＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２Ｕ４｜Ｃ０Ｍ２Ｕ４＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＬＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４１
Ｃ０Ｍ２Ｓ８ Ｃ０Ｍ２Ｓ８＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２Ｓ８｜Ｃ０Ｍ２Ｓ８＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＶＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４２
Ｃ０Ｍ２１２ Ｃ０Ｍ２１２＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２１２｜Ｃ０Ｍ２１２＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＰＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４３
Ｃ０Ｍ１Ｍ２ Ｃ０Ｍ１Ｍ２＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ１Ｍ２｜Ｃ０Ｍ１Ｍ２＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＡＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４４
Ｃ０Ｍ２Ｌ４ Ｃ０Ｍ２Ｌ４＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２Ｌ４｜Ｃ０Ｍ２Ｌ４＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＸＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４５
Ｃ０Ｍ２２０ Ｃ０Ｍ２２０＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２２０｜Ｃ０Ｍ２２０＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＸＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４６
Ｑ２Ｖ０Ｓ８ Ｑ２Ｖ０Ｓ８＿ＢＰＢＯ１１１６ 腸内細菌ファージｂｏ１ １２０１４
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｖ０Ｓ８｜Ｑ２Ｖ０Ｓ８＿ＢＰＢＯ１ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＢＯ１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＰＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４７
Ｃ０Ｍ２１６ Ｃ０Ｍ２１６＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２１６｜Ｃ０Ｍ２１６＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＤＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４８
Ｃ０Ｍ１Ｙ０ Ｃ０Ｍ１Ｙ０＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ１Ｙ０｜Ｃ０Ｍ１Ｙ０＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＸＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号４９
Ｄ０Ｕ１Ｅ４ Ｄ０Ｕ１Ｅ４＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｄ０Ｕ１Ｅ４｜Ｄ０Ｕ１Ｅ４＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＬＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＰＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５０
Ｃ０Ｍ３０９ Ｃ０Ｍ３０９＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ３０９｜Ｃ０Ｍ３０９＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＳＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５１
Ｃ０Ｍ３２５ Ｃ０Ｍ３２５＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ３２５｜Ｃ０Ｍ３２５＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＶＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＸＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５２
Ｑ９Ｔ１Ｃ７ Ｑ９Ｔ１Ｃ７＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ１２ １１０６７９
＞ｔｒ｜Ｑ９Ｔ１Ｃ７｜Ｑ９Ｔ１Ｃ７＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ Ｍ１２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＸＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＡＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５３
Ｃ０Ｍ２Ｚ１ Ｃ０Ｍ２Ｚ１＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２Ｚ１｜Ｃ０Ｍ２Ｚ１＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＶＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＸ

配列番号５４
Ｃ０Ｍ１Ｎ８ Ｃ０Ｍ１Ｎ８＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２Ｚ１｜Ｃ０Ｍ２Ｚ１＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＶＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＸ

配列番号５５
Ｊ９ＱＢＷ２ Ｊ９ＱＢＷ２＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｊ９ＱＢＷ２｜Ｊ９ＱＢＷ２＿ＢＰＭＳ２ カプシドタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＱＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＤＤＣＡＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５６
Ｃ８ＸＰＣ９ Ｃ８ＸＰＣ９＿ＢＰＭＳ２１１３ 腸内細菌ファージｍｓ２ ３２９８５２
＞ｔｒ｜Ｃ８ＸＰＣ９｜Ｃ８ＸＰＣ９＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＱＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＤＤＣＡＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５７
Ｃ０Ｍ２Ｙ４ Ｃ０Ｍ２Ｙ４＿ＢＰＭＳ２１１５ 腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ２Ｙ４｜Ｃ０Ｍ２Ｙ４＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質（フラグメント） ＯＳ＝腸内細菌ファージＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＶＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５８Ｐ６９１７１ ＣＯＡＴ＿ＢＰＺＲ１１５ 腸内細菌ファージｚｒ ３３２９４２
＞ｓｐ｜Ｐ６９１７１｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＺＲ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＺＲ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＮＤＧＧＴＧＮＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号５９
Ｐ６９１７０ ＣＯＡＴ＿ＢＰＲ１７１１６ 腸内細菌ファージｒ１７ １２０２６
＞ｓｐ｜Ｐ６９１７０｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＲ１７ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ Ｒ１７ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＮＤＧＧＴＧＮＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６０
Ｐ０３６１２ ＣＯＡＴ＿ＢＰＭＳ２ 腸内細菌ファージｍｓ２ ３２９８５２
＞ｓｐ｜Ｐ０３６１２｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６１
Ｃ０Ｍ１Ｌ４ Ｃ０Ｍ１Ｌ４＿ＢＰＭＳ２１１６腸内細菌ファージｍｓ２ １２０２２ 遺伝子ｍｓ２ｇ２
＞ｔｒ｜Ｃ０Ｍ１Ｌ４｜Ｃ０Ｍ１Ｌ４＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ＭＳ２ｇ２ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６２
Ｃ８ＸＰＤ７ Ｃ８ＸＰＤ７＿ＢＰＭＳ２１１６ 腸内細菌ファージｍｓ２ ３２９８５２ 遺伝子ｃｐ
＞ｔｒ｜Ｃ８ＸＰＤ７｜Ｃ８ＸＰＤ７＿ＢＰＭＳ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＭＳ２ ＧＮ＝ｃｐ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６３
Ｑ２Ｖ０Ｔ１ Ｑ２Ｖ０Ｔ１＿ＢＰＺＲ１１６ 腸内細菌ファージｚｒ ３３２９４２
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｖ０Ｔ１｜Ｑ２Ｖ０Ｔ１＿ＢＰＺＲ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＺＲ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６４
Ｑ９ＭＣＤ７ Ｑ９ＭＣＤ７＿ＢＰＪＰ５１１５ 腸内細菌ファージｊｐ５０１ １２０２０
＞ｔｒ｜Ｑ９ＭＣＤ７｜Ｑ９ＭＣＤ７＿ＢＰＪＰ５ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＪＰ５０１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＳＮＦＴＥＦＶＬＶＤＮＧＥＴＧＮＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＤＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＡＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＡＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６５
Ｐ０３６１１ ＣＯＡＴ＿ＢＰＦ２１１５ 腸内細菌ファージｆ２ １２０１６
＞ｓｐ｜Ｐ０３６１１｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＦ２ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ｆ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＮＤＧＧＴＧＮＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＬＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号６６
Ｐ３４７００ ＣＯＡＴ＿ＢＰＪＰ３１１５ 腸内細菌ファージｊｐ３４ １２０１９
＞ｓｐ｜Ｐ３４７００｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＪＰ３ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＪＰ３４ ＰＥ＝３ ＳＶ＝２
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号６７
Ｑ２Ｖ０Ｕ０ Ｑ２Ｖ０Ｕ０＿ＢＰＢＺ１１１５ 腸内細菌ファージｊｐ５００ ３３２９３９
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｖ０Ｕ０｜Ｑ２Ｖ０Ｕ０＿ＢＰＢＺ１ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＪＰ５００ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号６８
Ｑ２Ｖ０Ｔ７ Ｑ２Ｖ０Ｔ７＿ＢＰＢＺ１１１５ 腸内細菌ファージｓｄ ３３２９４０
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｖ０Ｔ７｜Ｑ２Ｖ０Ｔ７＿ＢＰＢＺ１ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＳＤ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＩＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＴＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号６９
Ｑ９ＭＢＬ２ Ｑ９ＭＢＬ２＿ＢＰＫＵ１１１５ 腸内細菌ファージｋｕ１ １２０２１
＞ｔｒ｜Ｑ９ＭＢＬ２｜Ｑ９ＭＢＬ２＿ＢＰＫＵ１ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＫＵ１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＳＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＦＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＬＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＩＧＮＰＶＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７０
Ｐ０７２３４ ＣＯＡＴ＿ＢＰＧＡ１１５ 腸内細菌ファージｇａ １２０１８
＞ｓｐ｜Ｐ０７２３４｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＧＡ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＧＡ ＰＥ＝１ ＳＶ＝３
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＡＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＧＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＥＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７１
Ｃ８ＹＪＧ７ Ｃ８ＹＪＧ７＿ＢＰＢＺ１１１５ 腸内細菌ファージｂｚ１３ ３２９８５３
＞ｔｒ｜Ｃ８ＹＪＧ７｜Ｃ８ＹＪＧ７＿ＢＰＢＺ１ カプシドタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＢＺ１３ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＥＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７２
Ｃ８ＹＪＨ１ Ｃ８ＹＪＨ１＿ＢＰＢＺ１１１５ 腸内細菌ファージｂｚ１３ ３２９８５３
＞ｔｒ｜Ｃ８ＹＪＨ１｜Ｃ８ＹＪＨ１＿ＢＰＢＺ１ カプシドタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＢＺ１３ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＴＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＬＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＩＧＮＰＶＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７３
Ｃ８ＹＪＨ５ Ｃ８ＹＪＨ５＿ＢＰＢＺ１１１５ 腸内細菌ファージｂｚ１３ ３２９８５３
＞ｔｒ｜Ｃ８ＹＪＨ５｜Ｃ８ＹＪＨ５＿ＢＰＢＺ１ カプシドタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージＢＺ１３ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＤＰＩＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７４
Ｑ２Ｖ０Ｔ４ Ｑ２Ｖ０Ｔ４＿ＢＰＴＨ１１１５ 腸内細菌ファージｔｈ１ １２０２９
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｖ０Ｔ４｜Ｑ２Ｖ０Ｔ４＿ＢＰＴＨ１ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＴＨ１ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７５
Ｑ２Ｖ０Ｕ３ Ｑ２Ｖ０Ｕ３＿ＢＰＢＺ１１１６ 腸内細菌ファージｔｌ２ ３３２９３８
＞ｔｒ｜Ｑ２Ｖ０Ｕ３｜Ｑ２Ｖ０Ｕ３＿ＢＰＢＺ１ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ＴＬ２ ＰＥ＝４ ＳＶ＝１
ＭＡＴＬＲＳＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＮＶＴＶＶＰＶＳＮＡＮＧＶＡＥＷＬＳＮＮＳＲＳＱＡＹＲＶＴＡＳＹＲＡＳＧＡＤＫＲＫＹＴＩＫＬＥＶＰＫＩＶＴＱＶＶＮＧＶＥＬＰＶＳＡＷＫＡＹＡＳＩＤＬＴＩＰＩＦＡＡＴＤＤＶＴＶＩＳＫＳＬＡＧＬＦＫＶＧＮＰＩＡＤＡＩＳＳＱＳＧＦＹＡ

配列番号７６
Ｐ０３６１４ ＣＯＡＴ＿ＢＰＦＲ１１６ 腸内細菌ファージｆｒ １２０１７
＞ｓｐ｜Ｐ０３６１４｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＦＲ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ ｆｒ ＰＥ＝１ ＳＶ＝４
ＭＡＳＮＦＥＥＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＫＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＮＮＲＫＹＴＶＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＶＱＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＭＮＭＥＬＴＩＰＶＦＡＴＮＤＤＣＡＬＩＶＫＡＬＱＧＴＦＫＴＧＮＰＩＡＴＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号７７
ｅｆ１０８４６５ 腸内細菌ファージｒ１７ ３２９８５２
ｇｉ｜１３２４２４６１６｜ｇｂ｜ＡＢＯ３３４６５．１｜ コートタンパク質 ［腸内細菌ファージＭＳ２］
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ

配列番号７８ １ＱＢＥ
＞ｓｐ｜Ｐ０３６１５｜ＣＯＡＴ＿ＢＰＱＢＥ コートタンパク質 ＯＳ＝腸内細菌ファージ Ｑｂｅｔａ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮ
ＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＡＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩ
ＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
更に、アミノ酸残基は、これらの側鎖の同定により識別される。これらは、２つの例外を除いて、共通の主鎖及び可能な主鎖立体配座の共通セットを有する（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ １３９５−１４００（１９９６））。グリシンは、主鎖立体配座に安定して折り畳まれ、その側鎖が単一の水素原子からなるので、他のアミノ酸を拒否する。プロリン側鎖は、そのアミド水素の排除を介して主鎖窒素に供給結合している硬直した環に環化され、プロリンを、他のアミノ酸に対して小さな主鎖立体配座サブセットに制約し、水素結合供給体としての能力を排除する。
例えば配列番号３のアミノ酸のカプシドへの組み立てのためのドメイン折り畳み及びドメイン会合は、二次構造単位を確定する主鎖水素結合パターン、局所構造を安定化する又は二次構造単位（例えば、へリックス、鎖、コイル、ループ、ターン若しくは可動性末端）を一緒に結合する、側鎖と主鎖原子の間の水素結合、局所構造を安定化する又は二次構造単位（例えば、へリックス、鎖、コイル、ループ、ターン若しくは可動性末端）を一緒に結合する、異なる側鎖の原子の間の水素結合、並びにファンデルワールス相互作用を介して折り畳みをエネルギー的に安定化すること及び不安定化と局所展開をもたらしうる折り畳みへの溶媒の浸透を予防することの両方に機能する、疎水性側鎖原子の緊密なパッキングによって安定化される。残りの残基の側鎖は、ドメイン折り畳み維持又はドメイン間相互作用に参加しない。これらの主鎖立体配座が、ドメイン折り畳みに参加するためにＧｌｙ又はシスＰｒｏのみにより満たされる特別な要件を有さない限り、これらの残基は、最終ドメイン折り畳み又はその表面の全体的な位相に有意な影響を与えることなく単一又は群として突然変異され、既知構造に実施される表面利用能計算により（例えば、Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ ＆ Ｂｒａｕｎ，ＪＭＢ；Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍ；Ｊ Ｃｏｍｐ Ｃｈｅｍ １９，３１９（１９９８）を参照すること）、続いて既知構造の水素結合分析により明確にクラスとして同定されうる（全てタンパク質構造及び機能の研究における従来の技術である）。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋからの２つのＭＳ２カプシド構造、例えば、Ｃ末端をＮ末端に縮合して一本鎖タンパク質２ドメインタンパク質を形成する２つのＭＳ２カプシドタンパク質モノマーにより形成される安定した六面体カプシドのＲＮＡと２つのＶＴＵを含有する二十面体カプシドの１ＡＱ３を使用して、１７個の残基（Ａｌａ１、Ｓｅｒ２、Ｔｈｒ５、Ｇｌｎ６、Ａｌａ２１、Ａｌａ５３、Ｖａｌ６７、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７１、Ｖａｌ７２、Ｖａｌ７５、Ｓｅｒ９９、Ｇｌｕ１０２、Ｌｙｓ１１３、Ａｓｐ１１４、Ｇｌｙ１１５、Ｔｙｒ１２９）が同定され、これらは、高度に溶媒和された側鎖位置を有し（Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ ＆ Ｂｒａｕｎサーバ ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ、１．４Ａ溶媒プローブ、勾配なし、残基１つあたり２つの部位／エネルギー）、カプシドの他の部分との水素結合に参加せず（水素結合基準を０．５Ａ及び３０°緩和した、広く使用されているフリーウエアソフトウエア可視化パッケージＣｈｉｍｅｒａ（ＥＲＩＣ Ｆ．ＰＥＴＴＥＲＳＥＮ，ＴＨＯＭＡＳ Ｄ．ＧＯＤＤＡＲＤ，ＣＯＮＲＡＤ Ｃ．ＨＵＡＮＧ，ＧＲＥＧＯＲＹ Ｓ．ＣＯＵＣＨ，ＤＡＮＩＥＬ Ｍ．ＧＲＥＥＮＢＬＡＴＴ，ＥＬＡＩＮＥ Ｃ．ＭＥＮＧ，ＴＨＯＭＡＳ Ｅ．ＦＥＲＲＩＮ（２００４ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｃｈｅｍ ２５，１６０５−１６１２）により計算される水素結合）、並びにそれらの主鎖立体配座は、プロリンを除いた全てのアミノ酸残基により許可される。これらの１７個の残基のサブセットを、ＧＡ及びＦＲカプシド配列、並びに腸内細菌ファージＧＡ又はＦＲカプシド配列において突然変異した残基が無視される、腸内細菌ファージＭＳ２の構造的アラインメントと比較すると、モノマーの構造若しくは機能又は安定したカプシドの中に組み立てられる能力に影響を及ぼすことなく突然変異に感受性があると推定される６つ位置が残ったままである。これは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）に５２％の配列同一性を表す。
二次構造要素（へリックス、鎖、水素結合パターンを確定するターン及び構造化ループ、例えばオメガループ）内の残基の挿入及び／又は欠失は、これらの要素が確定された水素結合若しくは疎水性パッキングパターンを失う原因となる又は元のタンパク質配列の安定性、形状及び／若しくは機能を変えうる水素結合若しくは疎水性パッキングパターンに変化を強要する。このことは、パッキングを妨げ、折り畳みの包括的安定性に影響を与えうる。他方、表面曝露を有するが、（頻繁に、構造化要素に対して側鎖を詰め込むこと若しくは溶媒から隣接構造化要素の相互作用面を遮蔽することを介して又はカプシド、カーゴの場合に）残りのタンパク質折り畳みに重量な安定化を提供しない非構造化ループ、ランダムコイル及びＮとＣ末端は、（１）結合再構造化要素の有意な再位置決めが必要ない場合の残基欠失、（２）残基の付加が、折り畳みにおける構造化要素の相対的な配置を有意に変えない又はタンパク質環境において水素結合供給体若しくは受容体と水素結合する能力を満たす残基の曝露表面を有意に覆うことがない場合のアミノ酸残基の挿入、或いは（３）有用な部分、例えば、蛍光体、リン光性基、ポリエチレングリコール、アフィニティータグ、レポーター基などに共有結合しうる天然に生じるアミノ酸突然変異又は非天然残基の突然変異の組み込みのための優れた候補である。当然のことながら、そのような挿入、欠失及び突然変異は、単一の適切な要素に同時に又は組み合わされて生じることができ、これらの組み込みは、改善された特徴を有するタンパク質を生じることができる。挿入及び／又は欠失のために最適なスポットを識別する直接的な方法は、挿入及び／又は欠失に緊密に関連する配列の複数のアラインメントを走査することである。Ｎ及びＣ末端の付加及び欠失の他に、既知のレビウイルス科コートタンパク質配列は、互いに挿入又は欠失を有さない。これは、挿入及び／又は欠失が発生できないことを意味しない。単に、構造／機能がより遠いメンバー又は折り畳みファミリーを検査しなければならないということである。
最も簡素な複数アラインメントアルゴリズムは、通常、パブリックドメイン配列及び構造データベースによって公衆が利用することができる。これらのアルゴリズムは、配列空間が高い同一性％、例えば９０％から低い同一性％、例えば２０％の連続配列範囲により混んでいる場合、非常に低い同一性％を共有する配列を正確に整列させることができる。これらのアルゴリズムは、同じ折り畳みを有する配列のクラスターを、これらのクラスターが低い同一性％を共有する場合に正確に整列させることに失敗する傾向があるが、そのようなクラスターを、それぞれのクラスターの１つ以上のメンバーのＸ線結晶構造が解明され、十分に精査される場合に、成功裏に明確に整列させることができる。折り畳みが緊密に関連するが、配列の関連が離れている二次構造要素の主鎖原子を最適に重ね合わせることにより、これらの配列の１対１の対応が緊密に定義され、直接的な配列アラインメントプロトコールにより連続的に生成される高い同一性％のクラスターを、主鎖重ね合わせによりもたらされる対アラインメント及び生成された折り畳みファミリーの正確な網羅的配列アラインメントに固定することができ、折り畳みファミリーメンバーの位相幾何学的に意味のあるアラインメントをもたらす（Ａｒｔｈｕｒ Ｍ Ｌｅｓｋ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌｅｖｉｔｔ，Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８６），Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １，７７−７８）。網羅的配列アラインメントを検査することによって、どの折り畳みがその形態又は機能を損ねることなく挿入及び／又は欠失を許容するかという包括的な像を見ることができる。
アロレビウイルス科コートタンパク質は、レビウイルス科コートタンパク質（折り畳みファミリーｄ．８５．１）と同じ折り畳みファミリーに属し、１８０個のモノマーから構成される二十面体カプシドの中に組み立てられる。ＵｎｉＰｒｏｔに寄託されているアロレビウイルス科コートタンパク質の配列の複数アラインメントを、図２７のアラインメント表に示す。アロレビウイルス科コートタンパク質配列の６０パーセント（６０％）が保存されている。レビ及びアロレビウイルス科のコートタンパク質は、両方とも約１３０個のアミノ酸残基の長さであるが、同一残基の率が低く、約２０％であるので、複数配列アラインメントアルゴリズムは、典型的には、レビウイルス科配列に対するアロレビウイルス科配列の正確なアラインメントに失敗する。このことを認識する簡潔な方法は、配列を逆転させ、次に同じプロトコールを使用して、逆転した配列を整列させることである。配列と逆転配列の複数アラインメントは、一致しない。この難点は、代表的な構造を検査することによって回避することができる。アロレビウイルス科Ｑｂｅｔａ（ＰＤＢ番号１ＱＢＥ）（配列番号７８、下記を参照すること）のＸ線結晶構造が、パブリックドメインデータベースのＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に寄託されている。１ＱＢＥの別個に精製されたモノマーを、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋのｊＦＡＴＣＡＴ比較ツールの使用により｛Ｃａｌｐｈａ｝原子の間の平均二乗偏差を最小限にすることによって、１ＡＱ３の別個に精製されたモノマーに当て嵌めた。平均二乗偏差は図２２〜２５に示され、添付の図の説明に記載されているように、二次構造要素を連結するＮ末端残基１〜３及びセグメント８〜１８、２６〜２８、５０〜５５及び６７〜７６（番号付けは、ＭＳ構造１ＡＱ３における位相幾何学的に等価な残基を参照する）の主鎖配置における鎖に主に起因して、どの別個に精製されたモノマーが比較されたかに応じて、２．３３〜２．７６オングストロームの範囲である。１ＡＱ３の別個に精製されたモノマーのｊＦＡＴＣＡＴにより測定された主鎖平均二乗偏差は、同じ領域の立体配座の差に起因して１．７２Ａである。位相幾何学的アラインメントが表に示されており、水素結合パターンによる二次構造指定（ＤＳＳＰ，Ｗ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｋａｂｓｃｈ ＆ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｓａｎｄｅｒ（１９８３），Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２，２５７７−２６３６）が１ＡＱ３のために示されており、精製された主鎖立体配座が実質的に異なるので又セグメントの移動性が大きすぎて精製の際に電子密度に局在化できないので最大偏差を示すセグメントは、小文字で提供されている。結晶環境下で主鎖可動性を示す領域も、挿入及び／又は欠失の優れた候補であり、それは、これらの残基と残りの折り畳みとの相互作用が折り畳み安定にとって重要な場合、電子密度が局在化されるからである。追加すると、２ＶＴＵと同じ情報は、変化に適応するように最良に適合されたセグメントの更なる洞察を提供する。これらの比較は、１ＡＱ３対２ＶＴＵ対１ＱＢＥのアラインメントを示す図２６に記号的に捕らえられている。
１ＡＱ３及び１ＱＢＥモノマーの検査は以下の洞察を提供し、図２８〜１及びこれらの対応する説明を参照してさらに例示されている。全ての残基番号は、１ＡＱ３のモノマーに対して提示されている。
このことは、配列番号３の腸内細菌ファージＭＳ２コートタンパク質の折り畳みが、１ＱＢＥの腸内細菌ファージＭＳ２コートタンパク質Ｑｂｅｔａの配列に対して２５％の同一性及びここで参照される全てのアロレビウイルス科コートタンパク質配列の保存残基に対して１６％の同一性まで下がって保存されることも意味する。カプシドの他の部分との水素結合に参加せず、その主鎖立体配座がプロリンを除く全てのアミノ酸残基により許可されている側鎖の、先に計算され高度に溶媒和された側鎖位置の１つだけが、保存されたままであり、（配列番号３の番号付けでは）Ｙ１２９である。その主鎖位置及び側鎖パッキングは、縮合ＭＳ２二量体（２ＶＴＵ）により形成される六面体腸内細菌ファージＭＳ２カプシド構造において実質的に変化している。この最後の変化を考慮すると、閾値アミノ酸配列同一性パーセントは１５％になる。図２６及び図２７のアラインメント表を参照すること（明確化のために１ＡＱ３対２ＶＴＵ対１ＱＢＥ及びアロレビの複数配列アラインメント表）。この段落における全ての類似性パーセントは、構造アンカードアラインメントの文脈においてのみ有効である。
Ｎ末端残基１〜３は、Ｃ末端残基１２９と水の水素結合潜在性を満たすことができ、逆の場合も同じであり、したがって、これらの残基の幾つか又は全てを欠失して、切断タンパク質を有する安定したＶＬＰを形成するこが可能であるべきである。図３２は、組み立てられたカプシドにおける対称点の周りに詰められた３つの非共有腸内細菌ファージＭＳ２非共有二量体の主鎖リボン図を示す。全てのＮ末端は緑色に着色され、Ｃ末端は赤色に着色されている。末端の近接は、モノマーの配列を単一鎖に縮合して、共有二量体を形成できることを意味し、これは、１つのモノマーを次々と付加すること、すなわち（モノマー残基１〜１２９−モノマー残基１〜１２９）からなる単一タンパク質鎖を作り出すことにより又は関連する鎖方向（ＮからＣ末端へ）が連鎖モノマーからの連続ペプチド鎖の形成を可能にする限り、モノマー配列の間に追加の結合残基を付加することにより（モノマー残基１〜１２９−リンカー残基−モノマー残基１〜１２９）、２ＶＴＵにすることができる。リンカー残基の付加のないモノマー−モノマー連鎖が解決される（ＰＤＢ番号２ＶＴＵ）。２ＶＴＵにおいて、それぞれの非共有二量体は、操作されて単一のタンパク質になるが、Ｃａｌｐｈａの残基２及び１２９は、およそ６オングストローム離れており、折り畳みを妨げることなく結合セグメントと結合するほど近くはなく（Ｃａｌｐｈａ間の距離は、ペプチド単位の共鳴形態のため、約３．８オングストロームに制約されている）、幾つかのモノマーでは、これらの主鎖は互いに水素結合する。それぞれの二量体のベータシート側（共有又は非共有）は、カプシドの内壁を形成する。ベータシートの形状は、シートの湾曲により確定されうる（Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊｉｒｉ Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，Ｍａｒｔｉｎ Ｋａｒｐｌｕｓ（１９８５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８６，６５１−６６３）。２ＶＴＵにおける密結合は、ベータシートを下側局面に制約し、二十面体ではなく六面体のカプシドを生じる。０〜６つの残基のモノマーの間へのリンカーの組み込みは、共有二量体が二十面体カプシドと同じ要件に緩和されることを可能にするのに十分な可動性をもたらし、物理的特性は、二十面体非共有カプシド構造により緊密に関連する可能性がある。一般に、リンカーは１〜６つの残基である。しかし、例えば、２ＶＴＵの共有二量体は、実際には、第２コピーにＳｅｒ２の欠失を有する。そのような場合、リンカーの長さは０でありうる。
リンカーのために選択される残基は、大量の原子が比較的小さい体積に詰め込まれることによる引き起こされうる立体歪みを回避するため、小さい側鎖を有するべきである。歪みは、より小さい主鎖立体配座空間を有するアミノ酸残基、例えばＰｒｏを選択することによって、最小化することができる。歪みを回避することは、より素早く又はより効率的に折り畳むタンパク質と解釈することができる。嵩高で荷電された側鎖、特に長いループの中央にあるものは、プロテアーゼの結合標的になる傾向がある。Ｇｌｙ含有リンカーが好ましい。
図３２から、１つのモノマーのＣ末端は、近隣非共有二量体において参加するモノマーのＮ末端に結合することができること及び安定した二十面体カプシドは、リンカーが適切な長さ及び可動性のものであり、カプシド環境においてプロテアーゼにより利用可能な潜在的な切断部位を含有しない限り、依然として形成されうることも、明らかである。事実、３つのモノマーを適切なリンカーに結合し、依然としてこのセクションのカプシドを形成することができる。図３２の褐色、灰色及びミディアムブルー（medium blue）のモノマーもカプシドの非対称単位である。適切な結合セグメントが末端にある３つのモノマー連鎖末端も、安定した二十面体カプシドを形成することができる。
Ｎ末端残基１〜３は、Ｃ末端残基１２９と水の水素結合潜在性を満たすことができ、逆の場合も同じであり、したがって、これらの残基の幾つか若しくは全てを欠失して、切断タンパク質を有する又は代替的に連鎖タンパク質における欠失の数により延長された対応する潜在的な隣リンカーの長さを有する、安定したＶＬＰを形成することが可能であるべきである。
したがって、本開示は、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）の変種であり、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドタンパク質を含むカプシドを含むＶＬＰを包含する。例えば、ＶＬＰは、１位のＡ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、１位のＡ残基が欠失している及び２位のＳ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、１位のＡ残基が欠失している、２位のＳ残基が欠失している及び３位のＮ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、１２９位のＹ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、１１２〜１１７セグメントに単一のアミノ酸欠失を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、１１２〜１１７セグメントに単一のアミノ酸欠失を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、６５〜８３セグメントに１〜２つの残基挿入を有し、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、カプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、４４〜５５セグメントに１〜２つの残基挿入を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、３３〜４３セグメントに単一のアミノ酸残基挿入を有し、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、カプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、２４〜３０セグメントに１〜２つの残基挿入を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列であるが、１０〜１８セグメントに単一の残基挿入を有するカプシドタンパク質を含むことができる。ＶＬＰは、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第２カプシドモノマー配列と連鎖しているカプシドタンパク質モノマー配列を含むことができる。ＶＬＰは、Ｃ末端が第２カプシドモノマー配列と連鎖している０〜６個の残基リンカー配列によりＣ末端が延長されているカプシドタンパク質モノマー配列を含むことができ、全ては、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる。安定したリンカー配列には、−（Ｇｌｙ）ｘ−（ここでｘは０〜６である）又は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−などであるがこれらの限定されないＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーが含まれるが、これらに限定されない。ＶＬＰは、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第３カプシドモノマー配列と連鎖しているカプシドタンパク質モノマー配列を更に含むことができる。ここで、カプシドタンパク質において、Ｃ末端は、Ｃ末端が第３カプシドモノマー配列と連鎖している０〜６個の残基リンカー配列により延長されることができ、全ては、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる。一方又は両方のリンカー配列は、−（Ｇｌｙ）ｘ−（ここでｘ＝０〜６）から又は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙから選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーから選択されうる。例えば、一方又は両方のリンカー配列において、リンカーは−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ｘは１、２又は３である。ＶＬＰは、１〜３つの残基によりＮ末端が切断されている１つ以上のコートタンパク質配列を含むことができ、ここで、リンカー配列は欠失した残基の数により延長され、リンカー配列は−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ｘ＝０〜６である。例えば、ＶＬＰは、１つの残基によりＣ末端が切断されている１つ以上のコートタンパク質配列を含むことができ、リンカー配列は１つの残基により延長され、ここで、リンカー配列は−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ｘ＝０〜６である。ＶＬＰは、２つのコートタンパク質配列を含むことができ、ここで、連鎖二量体における第１コートタンパク質配列は、１つの残基によりＣ末端が切断されており、リンカー配列は、１つの残基により延長されているか又は連鎖二量体における第１及び／若しくは第２コートタンパク質配列は、１つの残基によりＣ末端が切断されており、リンカー配列は−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ｘ＝０〜６である。
本明細書に引用されている全ての特許及び出版物は、下記のリストを含んでそれらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
参考文献

Claims (133)

  1. 少なくとも１つの異種カーゴ分子及びパッキング配列を封入するカプシドを含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  2. カプシドに封入された少なくとも１つのリボザイムを更に含む、請求項１に記載のＶＬＰ。
  3. 異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載のＶＬＰ。
  4. 異種カーゴ分子がオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項３に記載のＶＬＰ。
  5. リボザイムが、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成する、請求項４に記載のＶＬＰ。
  6. 複数の核酸構築物を含む、請求項５に記載のＶＬＰ。
  7. オリゴリボヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選択される短ＲＮＡである、請求項４に記載のＶＬＰ。
  8. 少なくとも２つのリボザイムを含み、それぞれのリボザイムが短ＲＮＡの一端を切断するために選択される、請求項７に記載のＶＬＰ。
  9. 少なくとも１〜１００個のヌクレオチドからなるリンカーを更に含み、リンカーが少なくとも４０％のＡ又は少なくとも４０％のＵを含み、リンカーが、オリゴリボヌクレオチドとパッキング配列又はオリゴリボヌクレオチドとリボザイムを結合させる、請求項４に記載のＶＬＰ。
  10. リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選択される、請求項２に記載のＶＬＰ。
  11. リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、請求項２に記載のＶＬＰ。
  12. リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で約５０％の速度でオリゴリボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイムである、請求項２に記載のＶＬＰ。
  13. リボザイムが、配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、請求項２に記載のＶＬＰ。
  14. カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある野生型ウイルスカプシドを含む、請求項１に記載のＶＬＰ。
  15. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  16. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４１％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  17. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  18. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも５２％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  19. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも５３％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  20. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも５６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  21. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも５９％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  22. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも８６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  23. カプシドが、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質を含む、請求項１に記載のＶＬＰ。
  24. カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも１５％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  25. カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも１６％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  26. カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも２１％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  27. 異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１に記載のＶＬＰ。
  28. 異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを更に含む、請求項２７に記載のＶＬＰ。
  29. オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである、請求項２８に記載のＶＬＰ。
  30. 異種カーゴ分子が、約１，５００Ｄａ以下の分子量を有する生体活性小分子に特異的に結合する第１アパタマー（apatamer）配列及びカプシドのパッキング配列に結合する第２アパタマー配列を含む二官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含む、請求項１に記載のＶＬＰ。
  31. 第１アプタマー配列に結合している生体活性小分子を更に含む、請求項３０に記載のＶＬＰ。
  32. 生体活性小分子が、及び除草剤又は殺虫剤を含む、請求項３１に記載のＶＬＰ。
  33. 生体活性小分子が、アトラジン、アセタミプリドホレート（acetamipridphorate）、
    プロフェノホス（profenofos）、イソカルボホス（isocarbophos）及びオメトエートアス（omethoateas）からなる群から選択される、請求項３２に記載のＶＬＰ。
  34. 短ＲＮＡ、リボザイム及びパッキング配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物。
  35. 短ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項３４に記載の核酸構築物。
  36. 少なくとも４０％がＡであるか、少なくとも４０％がＴであるか又は少なくとも４０％がＵである、４〜１００個のヌクレオチドの結合ヌクレオチド配列を更に含み、結合ヌクレオチド配列が、パッキングコード配列により及びｓｉＲＮＡコード配列によりフランクされている、請求項３４に記載の核酸構築物。
  37. リボザイムが、短ＲＮＡ及びパッキング配列によりフランクされている、請求項３４に記載の核酸構築物。
  38. 短ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項３７に記載の核酸構築物。
  39. 請求項３４に記載の核酸構築物を含むベクター。
  40. 請求項３９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  41. 宿主細胞がベクターにより安定して形質移入されている、請求項４０に記載の宿主細胞。
  42. 細菌細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  43. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  44. 植物細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  45. 哺乳類細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  46. 真菌細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  47. 酵母細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  48. 宿主細胞が、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるウイルスカプシドをコードする第２核酸配列を含む第２ベクターにより安定して更に形質移入されている、請求項４０に記載の宿主細胞。
  49. 第２核酸配列が、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するウイルスカプシドをコードするウイルスタンパク質をコードし、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項４０に記載の宿主細胞。
  50. 核酸配列が、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）をコードする、請求項４０に記載の宿主細胞。
  51. リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、請求項３４に記載の核酸構築物。
  52. リボザイムが、短ＲＮＡの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的な核酸の隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、請求項３４に記載の核酸構築物。
  53. リボザイムが肝炎デルタＶリボザイムである、請求項３４に記載の核酸構築物。
  54. リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で５０％の速度で短ＲＮＡとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイム又は配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、請求項３４に記載の核酸構築物。
  55. 請求項３４に記載の核酸構築物を含有するように形質転換された、植物又は植物組織。
  56. 種又は子孫が核酸構築物を含む、請求項５５に記載の植物又は植物組織の種又は子孫。
  57. ａ）少なくとも１つの異種カーゴ分子を封入するウイルスカプシドをそれぞれ含む複数のウイルス様粒子と、ｂ）組成物に存在するカプシド１００グラムあたり４グラム未満の量で存在する１つ以上の細胞溶解産物とを含み、細胞溶解産物が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選択される、組成物。
  58. カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項５７に記載の組成物。
  59. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項５７に記載の組成物。
  60. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）を含む、請求項５７に記載の組成物。
  61. 異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項５７に記載の組成物。
  62. 異種カーゴ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項５７に記載の組成物。
  63. それぞれのウイルス様粒子が、少なくとも１つのリボザイムを更に含み、リボザイムが、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成する、請求項６２に記載の組成物。
  64. それぞれのウイルス様粒子が複数の核酸構築物を含む、請求項６３に記載の組成物。
  65. リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選択される、請求項６３に記載の組成物。
  66. リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、請求項６３に記載の組成物。
  67. リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で約５０％の速度でオリゴリボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイム又は配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、請求項６３に記載の組成物。
  68. オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列が、長さが１〜１００個のヌクレオチドのヌクレオチド配列により結合されており、そのような結合配列が、４０％を超えるＡ又は４０％超えるＵを含む、請求項６３に記載の組成物。
  69. 異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項５７に記載の組成物。
  70. 異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを更に含む、請求項６９に記載の組成物。
  71. オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである、請求項７０に記載の組成物。
  72. 細胞溶解産物が０．５グラム未満の量で存在する、請求項５７に記載の組成物。
  73. 細胞溶解産物が０．２グラム未満の量で存在する、請求項５７に記載の組成物。
  74. 細胞溶解産物が０．１グラム未満の量で存在する、請求項５７に記載の組成物。
  75. 標的カーゴ分子を単離及び精製する方法であって、（ａ）少なくとも１つの標的カーゴ分子を封入するカプシドをそれぞれ含む複数のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む全細胞溶解物を得ることであり、カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があること、（ｂ）ＶＬＰを、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼを使用する加水分解に、全細胞溶解物に存在するが、カプシドにより封入されていない個別のポリペプチド１００個あたり、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個又は少なくとも９０個が切断されるが、そのような加水分解の前の全細胞溶解物に存在するカプシド１００個あたり少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個又は少なくとも９０個が、加水分解の後に無傷のまま残るのに十分な時間及び条件下で付すことを含む、方法。
  76. カプシドが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するウイルスカプシドタンパク質をそれぞれ含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項７５に記載の方法。
  77. カプシドが、それぞれ野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）を含む、請求項７５に記載の方法。
  78. 標的カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項７５に記載の方法。
  79. 標的カーゴ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項７５に記載の方法。
  80. それぞれのウイルス様粒子が、リボザイムを更に含み、リボザイムが、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成する、請求項７５に記載の方法。
  81. 加水分解の後にカプシドの精製を更に含む、請求項７５に記載の方法。
  82. 精製が、液−液抽出工程、結晶化工程、分別沈殿工程及び限外濾過工程の少なくとも１つを含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 標的カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項７５に記載の方法。
  84. 請求項７５に記載の方法により生成される組成物。
  85. 宿主細胞における標的細胞の細胞内産生の後で、全細胞溶解物における加水分解から標的分子を保護する方法であって、（ａ）カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるウイルスカプシドを選択すること、（ｂ）ウイルスカプシドを形成するウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む第１ベクターと、パッキング配列及びｓｉＲＮＡ配列によりフランクされているリボザイムを含む核酸配列を含む第２ベクターにより、宿主細胞を安定的に形質移入すること、並びに（ｃ）パッキング配列及びｓｉＲＮＡ配列によりフランクされているリボザイムを包むカプシドを発現及び組み立てるために、形質転換された細胞にとって十分な時間及び条件下で細胞を維持することを含む、方法。
  86. 少なくとも１つの異種カーゴ分子を封入するＶＬＰを精製するプロセスであって、（ａ）複数のＶＬＰを含む細胞溶解物を得ること、（ｂ）細胞溶解物を、ＶＬＰ以外の細胞溶解産物を加水分解するのに十分な時間及び条件下でプロテアーゼと接触させて、加水分解物を形成すること、並びに（ｃ）加水分解物からＶＬＰを単離することを含む、プロセス。
  87. 工程（ｃ）が、（ｉ）硫酸アンモニウムによる第１沈殿、続いて第１遠心分離を実施して、第１沈殿物及び第１上澄みを得ること、並びに（ｉｉ）硫酸アンモニウムによる第１上澄みに対する第２沈殿、続いて第２遠心分離を実施して、第２沈殿物を得ることを含み、第２沈殿物が少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む、請求項８６に記載のプロセス。
  88. 工程（ｃ）が、（ｉ）エタノールによる第１沈殿、続いて第１遠心分離を実施して、第１沈殿物及び第１上澄みを得ること、並びに（ｉｉ）硫酸アンモニウムによる第１上澄みに対する第２沈殿、続いて第２遠心分離を実施して、第２沈殿物を得ることを含み、第２沈殿物が少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む、請求項８６に記載のプロセス。
  89. 工程（ｃ）が、加水分解物を超遠心分離して、少なくとも約９０重量％のＶＬＰを含む沈殿物を得ることを含む、請求項８６に記載のプロセス。
  90. ＶＬＰが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドをそれぞれ含む、請求項８６に記載のプロセス。
  91. ＶＬＰが、野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含む及びカテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドをそれぞれ含む、請求項８６に記載のプロセス。
  92. ＶＬＰが、それぞれ野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシドタンパク質（配列番号３）を含む、請求項８６に記載のプロセス。
  93. 工程（ｂ）が、約３７℃で少なくとも約３０分間実施される、請求項８６に記載のプロセス。
  94. 工程（ｂ）の前に、細胞溶解物をヌクレアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼの少なくとも１つと約３７℃で少なくとも約３０分間接触させることを更に含む、請求項８６に記載のプロセス。
  95. プロテアーゼが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼである、請求項８６に記載のプロセス。
  96. プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リケンフォルミス）のプロテアーゼ、ペプシン及びパパインから選択される、請求項８６に記載のプロセス。
  97. 異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項８６に記載のプロセス。
  98. 異種カーゴ分子がオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項８６に記載のプロセス。
  99. オリゴリボヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓｈＲＮＡ、ｌｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選択される短ＲＮＡである、請求項９８に記載のプロセス。
  100. ＶＬＰが、パッキング配列及びオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成するリボザイムをそれぞれ更に含む、請求項８６に記載のプロセス。
  101. リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタＶリボザイムから選択される、請求項１００に記載のプロセス。
  102. リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも６個の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、請求項１００に記載のプロセス。
  103. リボザイムが、野生型肝炎デルタＶリボザイムの速度の最大で約５０％の速度でオリゴリボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタＶリボザイムである、請求項１００に記載のプロセス。
  104. リボザイムが、配列番号１０〜１８から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタＶ（ＨＤＶ）リボザイムである、請求項１００に記載のプロセス。
  105. オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列が、少なくとも１〜１００個のヌクレオチドの、４０％を超えるＡ又は４０％超えるＵを含むリンカー配列により結合されている、請求項１００に記載のプロセス。
  106. 異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項８６に記載のプロセス。
  107. ＶＬＰが、異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーをそれぞれ更に含む、請求項１０６に記載のプロセス。
  108. オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである、請求項１０７に記載のプロセス。
  109. 工程（ａ）の前に、細胞におけるＶＬＰの発現に続いて細胞を遠心分離すること、細胞を再懸濁すること、細胞を溶解し、細胞溶解物を遠心分離して、上澄みを得ることによる細胞溶解物の調製を更に含み、上澄みが工程（ａ）に細胞溶解物として使用される、請求項８６に記載のプロセス。
  110. カプシドが、１位のＡ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  111. カプシドが、１位のＡ残基が欠失している及び２位のＳ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  112. カプシドが、１位のＡ残基が欠失している、２位のＳ残基が欠失している及び３位のＮ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  113. カプシドが、１２９位のＹ残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  114. カプシドが、１１２〜１１７セグメントに単一のアミノ酸欠失を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  115. カプシドが、１１２〜１１７セグメントに単一のアミノ酸欠失を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  116. カプシドが、６５〜８３セグメントに１〜２つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  117. カプシドが、４４〜５５セグメントに１〜２つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  118. カプシドが、３３〜４３セグメントに単一の残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  119. カプシドが、２４〜３０セグメントに１〜２つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  120. カプシドが、１０〜１８セグメントに単一の残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージＭＳ２カプシド（配列番号３）のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
  121. カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第２カプシドモノマー配列と連鎖しているカプシドタンパク質モノマー配列を含む、請求項１に記載のＶＬＰ。
  122. カプシドが、Ｃ末端が第２カプシドモノマー配列と連鎖している０〜６個の残基リンカーセグメントによりＣ末端が延長されているカプシドタンパク質モノマー配列を含み、全てが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる、請求項１に記載のＶＬＰ。
  123. リンカー配列が、−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６であるか又は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、請求項１２２に記載のＶＬＰ。
  124. カプシドが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第３カプシドモノマー配列と連鎖しているカプシドタンパク質を含む、請求項１２２に記載のＶＬＰ。
  125. カプシドが、Ｃ末端が第３カプシドモノマー配列と連鎖している０〜６個の残基リンカーセグメントによりＣ末端が延長されているカプシドタンパクを含み、全てが、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる、請求項１２２に記載のＶＬＰ。
  126. カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６であるか又は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及び−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−から選択されるＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであり、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、請求項１２５に記載のＶＬＰ。
  127. カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−、ｘ＝１であり、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、請求項１２５に記載のＶＬＰ。
  128. カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−、ｘ＝２であり、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、請求項１２５に記載のＶＬＰ。
  129. カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−、ｘ＝３であり、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、請求項１３４に記載のＶＬＰ。
  130. １つ以上のコートタンパク質配列が、１〜３つの残基によりＮ末端切断されており、リンカー配列が、欠失された残基の数により延長され、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  131. １つ以上のコートタンパク質配列が、１つの残基によりＣ末端切断されており、リンカー配列が、１つの残基により延長され、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  132. 連鎖二量体における第１コートタンパク質配列が、１つの残基によりＣ末端切断されており、リンカー配列が、１つの残基により延長されている、或いは連鎖三量体における第１及び／又は第２コートタンパク質配列が、１つの残基によりＣ末端切断され、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−（Ｇｌｙ）ｘ−であり、ここでｘ＝０〜６である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  133. Ｎ及びＣ末端切断を含有し、カテゴリーＥＣ３．４のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請求項１に記載のＶＬＰ。
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