JP5084103B2 - ハプテン担体抱合体およびその用法 - Google Patents

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Description

本発明は、医学、公衆衛生、免疫学、分子生物学およびウィルス学の分野に属する。
依存性薬物乱用による障害は、社会的・経済的両方の悪結果をもたらす、特異的、区別的な一連のいくつかの事象を伴う。そのような悪結果としては、死亡、疾病、暴力、失業、生産性の低下、人間関係および家族の崩壊、および、ＨＩＶやその他の性病の蔓延が挙げられる。薬物乱用（煙草を除く）によって米国にもたらされた経済的コストは、信頼できるデータが入手可能な最近年の１９９２年では推定額９８０億ドルであった（「１９９２年の米国におけるアルコールと薬物乱用の経済的コスト」、国立薬物乱用研究所）。これらのコストとしては、犯罪（５９１億ドル）、早死に（１４６億ドル）、生産性の悪化／労働災害（１４２億ドル）、福祉（１０４億ドル）、医療（５５億ドル）、および、交通事故が挙げられる。これらのコストは主に政府（４６％）、および、薬物乱用者とその家族（４４％）が負担する。薬物乱用は依然として社会における重大問題であることはよく認識されている。１９９２年の調査の３年後の１９９５年に、国立薬物乱用研究所は、薬物乱用の社会に及ぼすコストは千百億ドルになると推定した。
薬物乱用は、薬物の使用自体がユーザーに有害作用を及ぼす可能性がある。しかしながら、これらの薬物に対する依存性が、このような薬物使用に関連する問題の中心であり、かつ、依存症患者の治療を不能とし、また、社会における薬物常習の発生頻度を減退させることを不能とする原因となっていることが認められている。
世界でもっとも広く使用される依存性薬物は煙草である。ニコチンは煙草の葉から得られるアルカロイドであるが、これが、煙草の主な依存性誘発成分である。１９９９年、米国では４千６百５十万人の成人が現に喫煙しているスモーカーであった。米国において、紙巻煙草喫煙は予防可能な死亡の単一主要原因となっている。疾病コントロール予防センターによれば、米国における年間４３万の死亡件数は、紙巻煙草喫煙によるものと想定されるそうである。肺癌、冠状動脈疾患、慢性肺疾患および脳卒中がその主要死因である。喫煙は個人にとって危険であるばかりでなく、驚くべき社会的コストをもたらす。１９９３年の、喫煙によるとされるコストの推定値は５百億ドルを越えており、また、喫煙関連の不能によって被る生産性および収入の損失によるコストは、年間４７０億ドルと推定された。従って、ニコチン依存に関連する全経済的コストは、他の全ての種類の依存性薬剤の合計コストよりも大きい。
近年行動学的・薬理学的治療が進歩しているが、それにも拘わらず、禁煙しようと努める喫煙者の多くは失敗する（総覧については、フィオーレ（Ｆｉｏｒｅ）等著、「喫煙および煙草依存の治療、臨床実施ガイドライン」、米国保健福祉省、公衆衛生局、２０００年を参照）。ニコチンガム、吸引剤、鼻腔噴霧剤、または、経皮パッチのいずれかの剤形によるニコチン代替療法が最近用いられる一つの処方である。ニコチン経皮パッチ単独治療の効力は、プラシーボ対照の二重盲検治験において疑問視されている（ジョセフ（Ｊｏｓｅｐｈ）等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９９）、３４０：１１５７−１１５８、ジョレンビー（Ｊｏｒｅｎｂｙ）等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９９）、３４０：６８５−６９１）。さらに、ニコチンガムの副作用、例えば、口内刺激、顎筋の凝り、食欲不振、悪心、しゃっくり・感覚異常・かゆみ、発赤、不眠、消化器障害、傾眠、いらだち、眩暈、および、ニコチンパッチの場合の発汗が観察された。抗うつ剤ビュープロピオンによる治療は、１２ヶ月間において禁欲率を約３０％に迄上昇させることがある（ジョレンビー、上記）。
ニコチンおよびその他の薬剤に対する依存症の治療・予防に対する新規の解決法が求められているのは明らかである。薬剤の行動学的作用を修飾する免疫学的戦略が１９７４年以来の主題となっている。アカゲザルにおいて、モルフィン−６−半コハク酸−ＢＳＡによる能動免疫、および、それによって得られた抗体による受動免疫の両方によって、ヘロイン自己投与の低下がもたらされた（ボネーゼ（Ｂｏｎｅｓｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ２５２：７０８−７１０（１９７４）、キリアン（Ｋｉｌｌｉａｎ）等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．９：３４７−３５２（１９７８））。免疫化は、コカイン依存に対しても有効であることが判明した。ラットにおいて、能動免疫は、その後のコカイン投与作用の低下をもたらし（カレラ（Ｃａｒｒｅｒａ）等、Ｎａｔｕｒｅ３７９：７２７−７３０（１９９５））、かつ、能動、受動免疫は両方とも自己投与を遮断することが明らかにされた（フォックス（Ｆｏｘ）等、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１２９−１１３２（１９９６））。より近年においては、コカイン依存症ラットにおいて、ＧＮＣ−ＫＬＨ抱合体による免疫化は自己投与を遮断し（カレラ（Ｃａｒｒｅｒａ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６２０２−６２０６１９９２（２０００））、かつ、ＧＮＤ−ＫＬＨ抱合体による免疫化、また、抗コカインモノクロナール抗体の移送は両方ともコカイン作用を阻止した（カレラ（Ｃａｒｒｅｒａ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：１９８８−１９９２（２００１））。
抗体をフェンシクリジン（ＰＣＰ）に対して誘発したところ、脳ＰＣＰ濃度の低下、行動作用の低下において有効性を示し、かつ、類似の能力を示してＰＣＰ類縁体の生理作用を阻止した（ハーディン（Ｈａｒｄｉｎ）等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８５：１１１３−１１２２（１９９８）、プロクシュ（Ｐｒｏｋｓｃｈ）等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：８３１−８３７（２０００））。ラットにおいてメタアンフェタミンに対して抗体を誘発したところここでも好成績を挙げた（バーネスブレーク（Ｂｙｒｎｅｓ−Ｂｌａｋｅ）等、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：３２９−３３８（２００１））。米国特許第５，２５６，４０９号は、デシプラミン／イミプラミン・クラスの薬剤から得られた一つのハプテンと、ノルトリプチリン／アミトリプチリン・クラスの薬剤から得られたもう一つのハプテンに結合される担体タンパク質を含むワクチンを開示する。
従って、薬剤に対して免疫反応を誘発することは可能であり、その抗体が薬剤作用を阻止することは可能であり、かつ、動物モデルは、薬物乱用・依存の治療に対する一般的解決法としてワクチン接種が有効であることを実証した。免疫反応を生成することは、薬剤が中枢神経系に進入することを防止することによって薬剤の作用を阻止すると考えられている（カレラ（Ｃａｒｒｅｒａ）等、Ｎａｔｕｒｅ３７９：７２７−７３０（１９９５））。薬剤服用に関連する報酬が低下するので、依存性個体の薬剤服用に対する動機付けがもはやなされなくなるわけである。
薬剤の依存作用は、それらが脳にもたらす作用によって引き起こされるので、血清中の抗体は、薬剤の脳へ向けての輸送を下げることが可能でなければならない。サーニィ（Ｃｅｒｎｙ）（国際公開第９２／０３１６３）は、薬剤乱用阻止のために使用されるワクチンと免疫血清を記述した。このワクチンは、担体タンパク質に結合されるハプテンから成る。同公開にはまた、薬剤に対する抗体の生産法、および、薬剤を服用するヒトにおける解毒のための抗体使用法についても開示されている。
ニコチン、コカイン、ヘロインおよび乱用される薬の多くは、それ自体には免疫原性の無いハプテンである。ハプテンのタンパク質担体に対する結合は典型的にはハプテンの免疫原性を強調する。
いくつかの異なるニコチンハプテン、担体および結合法がこれまでに記述されている。マツシタ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９７４）５７：１００６−１０１０）、および、カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）等（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０４：３３１−３４０）は、リンカーを介してニコチンの６位の位置で牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に抱合されるニコチンハプテンを調製した。別の場所で、カストロ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７５）６７：５８３−５８９）は、２種のニコチンアルブミン抱合体、Ｎ−スクシニル−６−アミノ−（＋／−）−ニコチン−ＢＳＡおよび６−（シグマ−アミノカプラミド）−（＋／−）−ニコチン−ＢＳＡを開示した。ノグチ（Ｎｏｇｕｃｈｉ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９７５）８３：８３−８６）は、ニコチンがニコチンの１位の位置で抱合される、ニコチンＢＳＡ抱合体を調製した。ランゴン（Ｌａｎｇｏｎｅ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７３）１２：５０２５−５０３０、および、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８２）８４：６２８−６３５）は、ハプテン誘導体Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンを調製し、これを、牛血清アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンに抱合させた。ランゴン等（上記）の手法に従って、アバッド（Ａｂａｄ）等（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）６５：３２２７−３２３１）は、ニコチンハプテンの、３’−（ヒドロキシメチル）−ニコチン・ヘミスクシネートを合成し、これを、マウスの免疫化のために牛血清アルブミンに結合させ、ニコチンに対するモノクロナール抗体を生産した。イソムラ（Ｉｓｏｍｕｒａ）等（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００１）６６：４１１５−４１２１）は、ニコチンの１’位において、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびＢＳＡと結合するニコチン抱合体を合成した。このＫＬＨに対する抱合体を用いて、マウスを免疫化し、ニコチンに対するモノクロナール抗体を生産した。スウェンソン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ）等（国際公開９９／６１０５４）は、ピリジン環を介して抱合されるニコチンハプテンを開示し、さらにＫＬＨに対して抱合されるニコチンハプテン、および、これらの抱合体使用によるニコチン特異的ＩｇＧ抗体の誘導を開示した。フロイントの完全アジュバントの存在下に投与した場合、１：３０００から１：１５５００の、ニコチン特異的ＥＬＩＳＡによる抗体価が測定されたが、一方、フロイントのアジュバントの不在下では、１：５００から１：３０００の抗体価が検出された。エニファー（Ｅｎｎｉｆａｒ）等（米国特許第６，２３２，０８２号）は、ピロリジン環を介して結合されるニコチンハプテンと、組み換え緑膿菌体外毒素Ａ（ｒＥＰＡ）に抱合させたニコチンハプテン、および、これらの抱合体をフロイントの完全アジュバントの存在下に投与した場合のニコチン特異的ＩｇＧ抗体の誘導を開示した。スウェイン（Ｓｗａｉｎ）等（米国特許第５，８７６，７２７号）は、ニコチンのＢＳＡに対する結合、および、マウスにおいて、その抱合体を、フロイントの完全アジュバントとの混合液として与えた場合の、ニコチン特異的ＩｇＧ抗体の誘発を開示した。
ニコチンに対するワクチン療法の実行可能性は原理的には明らかにされている（ヒエダ（Ｈｉｅｄａ）等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９９７）２８８：１０７６−１０８１、ヒエダ（Ｈｉｅｄａ）等、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍ．（１９９９）１４３：１５０−１５７、ヒエダ（Ｈｉｅｄａ）等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．（２０００）２２：８０９−８１９、ペンテル（Ｐｅｎｔｅｌ）等、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．（２０００）６５：１９１−１９８、マリン（Ｍａｌｉｎ）等、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．（２００１）６８：８７−９２）。ニコチンと、ＫＬＨまたはｒＥＰＡとの共有結合抱合体を生産し、フロイントの完全アジュバントの存在下にマウスまたはラットに注入し、ニコチン特異的ＩｇＧ抗体を誘発した。ワクチン効力は、異なるいくつかの方法で証明された。ニコチンによる免疫誘発後において、ラットの、ニコチンＫＬＨまたはニコチンｒＥＰＡによって免疫化したグループを、担体のみによって免疫化した対照グループを比較すると、より多くのニコチンが血清中に結合状態で残存し、脳におけるニコチン濃度はより低かった。免疫化によってまた、ニコチンと関連する心理薬学的活動は低下した。すなわち、免疫化動物では、歩行活動、ドーパミン放出（スウェンソン等、国際公開第９９／６１０５４号）、および、ニコチン禁断症状解除に対するニコチン作用に対してより感受性が低かった。
前述の従来技術によって、ニコチンに対する免疫反応を誘発するのにフロイントの完全アジュバントを含むワクチン組成物の有効性が実証されている。フロイントの完全アジュバントは、利用可能なアジュバントの内もっとも強力なものの一つであるが、その副作用によってヒトへの使用は認可されていない。従って、フロイントの完全アジュバントを用いることなく、ニコチンに対して強力な免疫反応を誘発することのできるワクチン組成物に対しては需要が存在する。さらに、ＢＳＡは、動物モデルでは担体として使用されて好成績を挙げてきたけれども、ヒトのワクチン組成物として使用するには適当でない可能性がある。なぜなら、プリオン病（クロイツフェルトヤコブ病の変種）を伝染させる危険性のような有害反応の危険性があるからである。さらに、ニコチンに対して効果的なワクチン開発において克服すべき問題点となるのが、脳によって吸収されるニコチンを速やかに減少させることが可能な免疫反応の必要である。紙巻煙草からのニコチンは、粘膜表面、特に口や肺の粘膜表面によって取り込まれて、血液を介して脳に輸送される。もしもニコチン特異的抗体が、脳へのニコチン輸送低下において好成績を挙げることが可能であるのなら、これらの抗体は、吸引後数秒以内に脳に提示される、動脈の、高いニコチン濃度それ自体を克服するに違いない（ヒエダ等１９９９、上記）。従って、血液におけるニコチン特異的抗体、これは主にＩｇＧサブタイプから成るが、この抗体の高濃度が求められる。粘膜表面では、ＩｇＡ抗体が主要サブタイプとなる。従って、血中の抗体に加えてさらに、ＩｇＡサブタイプの特異的抗体が肺において得られるならば、それは、喫煙中に吸引されたニコチンがまだ血中に循環を開始する前に、そのニコチンを中和するに際して有利であると考えられる。
コレラ毒素は従来技術において既知の担体であるが、これは、特に、鼻腔内投与の後でＩｇＡ抗体を誘発することが可能である。コレラ毒素はまたアジュバントとしても作用するから、ワクチン組成物におけるフロイントの完全アジュバントの必要を解除する。しかしながら、コレラ毒素を粘膜アジュバントとして投与すると、主にＴＨ２型免疫反応を刺激し、インターロイキン４の濃度上昇、および、それに関連して全体的および特異的ＩｇＥ抗体濃度の増加を伴う（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）等、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：５２６７−５２７２）。コレラ毒素存在下に鼻腔免疫した後では、ＩｇＥ関連炎症反応がマウスの肺において発生した（シメッカ（Ｓｉｍｅｃｋａ）等、（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６８：６７２−６７９、ホッジ（Ｈｏｄｇｅ）等、（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９：２３２８−２３３８）。コレラ毒素の存在下における鼻腔免疫化は有望であるにも拘わらず、気道炎症によって特徴付けられる有害な免疫病理反応を発生させる可能性もある（ホッジ等、（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９：２３２８−２３３８）。
従って、毒素のアジュバントを使用することなく、耐性の低い担体タンパク質を使用することなく、また、ある状況下では、病理的可能性を持つＴＨ２免疫反応を刺激することなく、ハプテンに対する免疫反応を刺激することの可能な担体システムに対しては需要がある。これらの特異的条件を満たす新規担体システムは、取り分け、近年性急に求められている依存症の治療に好適な、新規抱合体および組成物の調製に向けて使用が可能である。
我々は、コア粒子に付着した複数のハプテンが、高度に秩序化された繰り返しから成るハプテン列（アレイ）を形成し、それが、ハプテンに対する免疫反応、特に抗体を誘発することにおいて驚くほど有効であることを見出した。第１付着部位を含むコア粒子、および、第２付着部位を含むハプテンは、前記第１および第２付着部位を介して結合し、前記規則的な反復性ハプテンアレイを形成する。第１および第２部位間の相互作用は、直接であってもよいし、あるいは、少なくとも１種の他の分子、例えば、リンカーを含んでもよい。
一つの実施態様では、第１付着部位は、当然のことながら、コア粒子の中に存在する。別態様として、第１付着部位は、化学的結合または組み換え技術によって付加される。好ましい第１付着部位としては、アミノ基、カルボキシル基、または、スルフヒドリル基が挙げられる。第１付着部位を含む好ましいアミノ酸は、リジン、アルギニン、システイン、アスパルテート、グルタメート、チロシンおよびヒスチジンから選ばれる。特に好ましいのはリジン残基である。
ハプテン上の好適な第２付着部位は、アミン、アミド、カルボキシル、および、スルフヒドリル基である。コア粒子のタンパク質分子の反応基と共有結合を形成することによって、ペプチド同士／タンパク質同士の架橋結合、または、タンパク質と誘導派生分子の抱合体形成を実現するためにこれまでに開発された化合物は多種多様である。
本発明による、第１付着部位を有するコア粒子は、規則的な反復アレイの形成に好適な全ての粒子を含む。いくつかの実施態様では、そのようなコア粒子としては、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）、バクテリオファージ、バクテリオファージウィルス様粒子、ピルス繊毛等が挙げられる。ある実施態様では、これは、ＨｂｃＡｇ ＶＬＰ、バクテリオファージＶＬＰ、および、Ｉ型ピルス繊毛である。本発明はまた、規則的な反復構造を依然として形成が可能なコア粒子の変形も提供する。変形としては、コア粒子の組み換え・天然形態、および、突然変異形態が挙げられる。ある実施態様では、コア粒子の突然変異形は、第１付着部位の型、または、前記部位の数が祖形とは異なるものを含む。コア粒子におけるリジン残基の数の変更は特に好ましい。
ある実施態様では、本発明の抱合体は、毒素、ホルモンおよび薬剤−といってもそれらに限定されるわけではないが−を含む各種分子に対して免疫反応を誘発するのに好適なハプテンを含む。より好ましいのは薬剤であり、さらに好ましいのは、乱用または依存性薬剤である。本発明の薬剤は、コア粒子の第１付着部位に対して、直接に、または、少なくとも１種の結合分子を介して結合される第２付着部位を含む。一つの実施態様では、ハプテンは、コカイン、例えば、サクシニル化ノルコカインに対して免疫反応を誘発するのに好適である。
本発明の好適な実施態様は、ニコチンハプテン抱合体である。本発明の抱合体として好適なニコチンハプテンは、ニコチンのピリジン環またはピロリジン環のいずれかの位置に結合される、少なくとも１種の、好ましくは１種の側鎖を有することが可能である。当業者であれば、ニコチンハプテンの好適な誘導体をどのようにして生産したらよいかは既知である。例えば、ニコチンを３’位置において化学的に誘導体形成し、無水コハク酸のような試薬と反応させて、Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンを形成するのに好適なヒドロキシル残基を供給するようにしてもよい。このニコチン誘導体は、活性化試薬ＥＤＣを用いて、コア粒子のアミノ酸、例えば、リシンに結合させてもよい。さらに好ましい実施態様では、Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンをＥＤＣによって活性化し、得られた活性化カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシニミドによって安定化させることも可能である。その他の実施態様では、ハプテンは、２当量のジイソプロピルエチラミンの存在下に塩化メチレンにおいて無水コハク酸によるノルニコチンのアシル化によって生産してもよい。次に、このニコチンハプテンを、本発明のコア粒子に、活性化試薬、例えば、ＨＡＴＵによって結合する。本発明の抱合体および組成物にとって好適な、その他のハプテンの合成法および過程も提供される。
本発明は、免疫反応誘発に使用するのが好適な、コア粒子とハプテンを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、ワクチン組成物、および、それに添加される製薬的に受容可能な賦形剤またはアジュバントを含む、または、含まない組成物を含む。免疫化のための方法が提供される。より好ましいのは鼻腔内免疫化である。
本発明の組成物は、抗体の生産を含む免疫反応を誘発する。従って、別の実施態様では、本発明は、このようなハプテンに対する抗体の生産法を提供する。本発明の抗体は、疾病の治療または予防において有用であり、例えば、疾病、すなわち、動物の組織または循環における１種以上のハプテンの存在と関連する疾病の診断法におけるハプテンの検出にとって有用である。
関連実施態様において、本発明は、毒素、ホルモンレベルの調整不良、薬剤中毒、または、薬物依存等−ただしそれらに限定されないが−による中毒を含む疾病、障害または病態の予防または治療に有用である。本発明のハプテン担体抱合体による免疫化は、ハプテンに対する免疫反応をもたらし、そのために、免疫分子、特に、抗体がハプテンに結合するようになる。抗体の受動的輸送もまた、疾病の治療・予防にとって有用である。依存症の治療もまた、依存症と関連するその他の疾病および病態の治療に有用である。
我々は、ウィルス様粒子に付着したニコチンハプテン抱合体は、ニコチンに対して高度の特異性を持つＩｇＧ抗体を誘発することを見出した。従って、本発明は、規則的な反復ＶＬＰ−ニコチン抱合体に基づく、ニコチン依存症に対する療法を提供する。この療法は、ワクチン接種動物において、高い抗体価の抗ニコチン抗体を誘発することが可能である。高い抗体価は、アジュバント不在下においても誘発され、ＩｇＧサブタイプのみならずＩｇＡサブタイプをも含む。さらに、この療法は、驚くべきことに、炎症のような、病理的な可能性のある免疫反応の誘発には関わらない。本発明の治療組成物は、少なくとも１種のニコチンハプテンおよびＶＬＰ、または、少なくとも１種のニコチンハプテンおよび、ＨｂｃＡｇまたは線毛のような、別種コア粒子とを含む。
上記から、本発明は、本発明の前記抱合体および組成物の使用を含む治療法・予防法の実施を含む。この方法は、薬剤、ホルモンおよび毒素と関連する疾病、障害および病態の治療と予防に有用である。
本発明のさらにもう一つの実施態様では、製薬組成物が、ニコチン依存症の治療、ニコチン禁断症状の寛解、禁煙の促進、または、喫煙再発予防のために提供される。この組成物は、本発明のワクチン組成物と更なる薬剤の、治療的に有用な併用を含む。一つの実施態様では、この更なる薬剤は、抗うつ剤、ニコチン受容体モジュレータ、カンナビノイド受容体拮抗剤、オピオイド受容体拮抗剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、抗不安薬、または、これら薬物の併用から成るグループから選ばれる。
本発明のその他の実施態様は、本発明の抱合体、組成物、および、方法を利用する診断およびスクリーニングに好適なキットである。本発明のその他の実施態様は、当業者であれば、従来技術で既知の事柄、本発明に関する下記の図と説明、および、請求項を参照すれば明白であろう。
前記一般的説明および下記の詳細な説明は、説明と例示のためのみのものであって、特許請求項で主張される発明のさらに詳細な説明を与えることを意図するものである。
定義
下記の定義は、関連技術において通常の錬度を持つ当業者によって普通に理解される概念の要約であり、下記の発明の理解を助けるために提供されるものであって、本発明の限界であると受け取ってはならない。
アジュバント：本明細書で用いる用語「アジュバント」とは、免疫反応の非特異的刺激物質、または、本発明のそれぞれワクチンおよび製薬組成物と併用されると、さらに一段と免疫反応を強化する堆積物を宿主の中に生成する物質を指す。様々のアジュバントの使用が可能である。例としては、フロイントの完全および不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、および、ムラミルジペプチド修飾剤が挙げられる。それ以外のアジュバントとしては、水酸化アルミニウムのような鉱物性ゲル、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性物質、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブムのような、有用な可能性のあるヒト用アジュバントが挙げられる。このようなアジュバントもまた従来技術においてよく知られている。本発明の組成物と共に投与が可能な、その他のアジュバントとしては、モノフォスロリル脂質免疫修飾剤、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、および、ビロソームアジュバント技法が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。このアジュバントはまた、上記物質の混合物を含むことも可能である。
南アメリカの木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ（バラ科キラヤ）の樹皮から得られる、アジュバント活性を有する、免疫活性を持つサポニン分画は従来技術において既知である。例えば、ＱＳ２１−これは一名ＱＡ２１とも呼ばれる−は、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ樹木からＨｐｌｃ精製した分画であるが、その生産法が、（ＱＡ２１として）米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。Ｑｕｉｌｌａｊａサポニンも、アジュバントとして、スコット（Ｓｃｏｔｔ）等、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８５、７７：４０９に開示されている。モノスフォリル脂質Ａおよびその誘導体は従来技術において既知である。好ましい誘導体は、３デ−０−アシル化モノフォスフォリル脂質Ａである。それ以外の、好ましいアジュバントが国際公開第ＷＯ００／００４６２号に記述されている。なお、引用することによりこの開示を本明細書に含める。
しかしながら、本発明の一つの有利な特質は、本発明の組成物の高い免疫原性である。既に本明細書において概略触れたように、あるいは、本明細書の進行につれて明らかになるように、後述の別態様または好ましい態様では、アジュバントを欠くワクチンおよび製薬組成物が提供される。これらによって、薬物依存症、好ましくはニコチン依存症治療用ワクチンおよび製薬組成物が得られるが、アジュバントは副作用を起こす可能性があるのでアジュバントを欠いており、そのために優れた安全特性を持つ。薬物依存症、好ましくはニコチン依存症処置用のワクチンおよび製薬組成物という文脈で本明細書で使用される場合「欠如する」という用語は、アジュバント無しで使用されるワクチンおよび製薬組成物を指す。
動物：本明細書で用いる用語「動物」とは、例えば、ヒト、羊、大鹿、鹿、ミュール鹿、ミンク、哺乳類、猿、馬、牛、豚、山羊、犬、猫、ラット、マウス、鳥類、鶏、爬虫類、魚類、昆虫、および、蜘蛛形類が挙げられる。
抗体：本明細書で用いる用語「抗体」とは、エピトープまたは抗原決定基に結合することの可能な分子を指す。本用語は、全ての抗体および、１本鎖抗体を含む、その、抗原結合性フラグメントを含むことを意味する。もっとも好ましい抗体は、ヒトの、抗原結合性抗体断片であって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’とＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、および、ＶＬまたはＶＨドメインのどちらかを含む断片が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。抗体は、鳥類および哺乳類を含む全ての動物起源のものであってよい。好ましくは、抗体は、哺乳類、例えば、ヒト、ネズミ類、兎、山羊、モルモット、駱駝、馬等、または、他の適当な動物、例えば、鶏由来のものである。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号に記述されているように、１種以上のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入され、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。なお、上記特許の開示全体を引用することにより本明細書に含める。
能動免疫：本明細書で使用する場合、「能動免疫」という用語は、免疫原、ワクチン、抗原またはハプテン・担体抱合体の投与によって、個体、通常は動物に発生する免疫反応の誘発を指す。それとは対照的に、受動免疫とは、免疫分子または細胞を個体に移送することによって、その個体に免疫を付与することを指す。
アルファウィルス：本明細書で用いる用語「アルファウィルス」とは、アルファウィルス属の中に含まれる全てのＲＮＡウィルスを指す。この属のメンバーに関する記載は、ストラウスおよびストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｕｓｓ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１−５６２（１９９４）に含まれる。アルファウィルスの例としては、アウラウィルス、ベバルウィルス、カバスーウィルス、チクングニャウィルス、イースター馬脳炎ウィルス、フォートモーガン・ウィルス、ゲターウィルス、キジラガークウィルス、マヨアロウィルス、ミドルバーグウィルス、ムカンボウィルス、ンヅムウィルス、ピクスナウィルス、トナテウィルス、トリニティーウィルス、ウナウィルス、西部馬脳炎ウィルス、ワタロアウィルス、シンドビスウィルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウィルス（ＳＦＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウィルス（ＶＥＥ）、および、ロスリバーウィルスが挙げられる。
抗原：本明細書で用いる用語「抗原」とは、抗体による、または、ＭＨＣ分子によって提示された場合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による結合が可能な分子を指す。抗原はさらに、免疫系によって認識されることが可能であり、および／または、体液性免疫反応および／または、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の活性化を招く細胞性免疫反応の誘発が可能である。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合においては、抗原が、Ｔｈ細胞エピトープを含む、または、Ｔｈ細胞エピトープに結合され、かつ、アジュバントに溶解して投与されることを必要とするかも知れない。抗原は、１個以上のエピトープを持つことが可能である（Ｂおよび／またはＴ細胞エピトープ）。上に言及した特異的反応は、抗原は、好ましくは、対応する抗体あるいはＴＣＲと、通常高度に選択的な方法で反応するが、他の抗原によって誘発された、多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことを示すのを意図する。本発明で使用される抗原はまた、いくつかの個別の抗原の、複数の混合物であってもよい。
抗原決定基：本明細書で用いる用語「抗原決定基」とは、Ｂリンパ球またはＴリンパ球のどちらかによって特異的に認識される、抗原の部分を指すことを意味する。抗原決定基に対して反応するＢリンパ球は抗体を産生する。一方、Ｔリンパ球は、増殖と、細胞性および／または体液性免疫の仲介にとって決定的に重要なエフェクター機能を確立することによって抗原決定基に対して反応する。
結合：本明細書で用いる用語「結合」とは、第１および第２付着部位に適用される場合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド結合を介して実現される、第１および第２付着部位間の結合を指す。結合の性格は、共有的、イオン性、疎水性、極性、または、それらの全ての併用であってよいが、好ましくは結合の性格は共有的である。
付着部位、第１：本明細書で用いる用語「第１付着部位」とは、抗原または抗原決定基上に配置される第２付着部位が結合可能な、コア粒子の要素を指す。この第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次的代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルフォニルフロリド）、または、それらの併用、または、それらの化学的反応基であってもよい。反復形態の非天然性分子骨格の表面には、複数の第１付着部位が存在する。
（ａ）付着部位、第２：本明細書で用いる用語「第２付着部位」とは、非天然性分子骨格表面上の第１付着部位が結合し得る、ハプテンと関連する要素を指す。ハプテンの第２付着部位は、どのような化学的機能基を含んでもよいが、好ましくは、アミン、アミド、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル、アルデヒド、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジアゾニウム、または、ヒドラジドであり、または、第１付着部位と特異的に反応することが可能なそれ以外の化学的機能基を含む。さらに、第２付着部位は、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次的代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルフォニルフロリド）、または、それらの併用、または、それらの化学的反応基を含んでもよい。少なくとも一の第２付着部位がハプテン上に存在する。従って、少なくとも一の第２付着部位を持つ、この「ハプテン」という用語は、少なくともハプテンと第２付着部位とを含むハプテン構築体を指す。しかしながら、特に、ハプテン内に天然には見られない第２付着部位に対しては、このハプテンは、ハプテンと第２付着部位とを連結させるリンカーを含む、あるいは、より好ましくは、既に第２付着部位を備える、または、含む。
結合：本明細書で用いる用語「結合」とは、例えば、化学的結合による共有的な結合または付着、または、例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合等の非共有的な結合または付着を指す。共有的な結合としては、例えば、エステル、エーテル、フォスフォエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素硫黄結合、炭素リン結合等であってもよい。「結合」という用語は、「結合」、「融合」および「付着」のような用語よりも広く、これらの用語を含む。
コア粒子：本明細書で用いる用語「コア粒子」とは、第１付着部位の付着に対して基盤となる、固有の繰り返し組織を有する剛性構造を指す。本発明で使用されるコア粒子は、合成プロセスの産物であってもよいし、あるいは、生物学的プロセスの産物であってもよい。
コート蛋白（単数または複数）：本明細書で使用する場合、「コート蛋白（単複）」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのカプシドアッセンブリーの内部に組み込まれることの可能な、バクテリオファージまたはＲＮＡファージの蛋白（単複）を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコート蛋白遺伝子の特異的遺伝子産物を指す場合は、「ＣＰ」という用語が使用される。例えば、ＲＮＡファージＱβのコート蛋白遺伝子の特異的遺伝子産物は「Ｑβ ＣＰ」と呼ばれるが、一方、バクテリオファージＱｂの「コート蛋白」は、「Ｑβ ＣＰ」のみならずＡ１補助蛋白も含む。バクテリオファージＱβのカプシドは、主にＱβ ＣＰによって構成されるが、少量のＡ１蛋白を有する。同様に、ＶＬＰ Ｑβコート蛋白は、主にＱβ ＣＰを含むが、少量のＡ１蛋白を有する。
抱合体：本明細書で用いる用語「抱合体」とは、（ａ）ＶＬＰのようなコア粒子１個以上と、（ｂ）本明細書の別部分で記述される、有機分子、ハプテン、抗原、または、抗原決定基の１個以上との間に形成され、要素（ａ）と要素（ｂ）とが相互に結合し合う抱合産物を指す。
組成物：本明細書で用いる用語「組成物」とは、各種要素または成分を混合する、または、組み合わせて得られる生成物を指す。
疾病、障害、状態：本明細書で用いる「疾病」または「障害」とは、腫瘍、癌、アレルギー、依存症、自己免疫、中毒、または、最適な精神または肉体機能の故障を含む、個人の不快状態の全てを指す。本明細書で使用される「状態」とは、疾病・障害を含むのみならず、生理的状態をも指す。例えば、生殖機能は生理的状態であって、疾病でも障害でもない。従って、生殖機能を低下させることによって妊娠を防止するのに好適な本発明の組成物は、状態（生殖性）の処置として記載されることはあるが、障害または疾病の治療としては記載されない。その他の状態は当業者には理解される。
有効量：本明細書で用いる「有効量」は、所望の生物学的作用を実現するのに必要な、または、十分な量を指す。組成物の有効量とは、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当業者によって常例に従って決定が可能である。例えば、免疫系欠陥を治療するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、それによって抗原暴露に際し抗原特異的免疫反応の発生をもたらすのに必要な量としてよい。この用語はまた「十分量」とも同義である。
いずれの場合であっても、ある特定の用途における有効量は、処置される疾病または状態、投与される特定の組成物、被験者のサイズ、および／または、疾病または状態の重度に応じて変動することがあり得る。当該分野において通常の熟練度を有する当業者であれば、本発明の特定の組成物について、余計な実験を要することなく、その有効量を経験的に確定することが可能である。
エピトープ：本明細書で用いる用語「エピトープ」とは、個別の抗体またはＴ細胞受容体によって認識される基本要素または最小単位、従って、前記抗体またはＴ細胞受容体が結合する、特定のドメイン、領域、または分子構造を指す。一つの抗原が多数のエピトープから成ることがある一方で、ハプテンは通常僅か数個のエピトープしか持たない。
融合：本明細書で使用する場合、「融合」という用語は、異なる起源を持つ複数のアミノ酸配列が、そのコードヌクレオチド配列の読み枠に一致した結合をすることによって１本のポリペプチド鎖に結合することを指す。「融合」という用語は、１本のポリペプチド鎖の末端の一つに対する融合ばかりでなく、内部的融合、すなわち、そのポリペプチド鎖内部に、異なる起源の配列が挿入されることを明らかに含む。
ハプテン：本明細書で用いる用語「ハプテン」とは、それ自体では免疫反応を惹起することはできないが、一旦担体分子に付着されると免疫反応を惹起することが可能な低分子量有機化合物を指す。本発明の抱合体、組成物および方法に使用される典型的ハプテンは、薬剤、ホルモンおよび毒素を含むが、ただしこれら特定のハプテンに限定されない。
ヘテロ配列：本明細書で用いる用語「ヘテロ配列」とは、普通はその核酸または蛋白と共に認められないが、通常、特定の性質を付与するために、その配列に人工的に添加される、核酸または蛋白の第２の配列を指す。一つの例として、組み換えカプシド蛋白に対して、その蛋白の精製のために、または、第１付着部位とするために、ヘテロのアミノ酸が添加されることがある。
単離：本明細書で用いる用語「単離」が一つの分子に関して使用される時は、その用語は、その分子が、本来の環境から外れて取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物の中に本来的に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その本来の状態の共存物質から分離されると、「単離」されていることになる。さらに、ベクターの中に含まれる組み換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のためには、単離していると考えられる。単離ＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の、インビボまたはインビトロのＲＮＡ複製産物を含む。さらに、単離核酸分子は、合成的に生成された分子を含む。さらにまた、組み換え宿主細胞に含まれるベクター分子も単離している。従って、「単離された」分子は必ずしも「精製されている」必要はない。
免疫反応：本明細書で用いる用語「免疫反応」とは、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球、および／または、抗原提示細胞の活性化または増殖を招く、体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応を指す。しかしながら、ある場合においては、免疫反応は強度が低く、本発明に従って少なくとも１種の物質を用いた場合にのみ検出可能となることがある。「免疫原性」とは、生物の免疫系を刺激するのに使用される因子であって、その免疫系の１種以上の機能を上昇させ、その免疫原因子に向けさせるように刺激するのに使用される因子を指す。「免疫原性ポリペプチド」とは、アジュバントの存在・不在を問わず、単独であれ、担体に結合した状態であれ、細胞性および／または体液性免疫反応を惹起するポリペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞が活性化される。
免疫反応を「強化する」物質とは、その物質の添加無しに測定された同じ免疫反応と比較して、その物質の添加によって何らかの形で、より大きくなる、または、強調される、または、偏倚される免疫反応が観察される物質を指す。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性は、免疫化の際に、強化物質を用いた場合、また、用いない場合に得られるサンプルに対して、例えば、５１Ｃｒ放出アッセーを用いて測定することが可能である。ＣＴＬの溶解活性が、その物質を用いない場合のＣＴＬ溶解活性に比べて強化される、その物質の量は、抗原に対する動物の免疫反応を強化するのに十分な量と言われる。好ましい実施態様では、免疫反応は、少なくとも約２倍、さらに好ましくは約３倍以上強化される。分泌されるサイトカインの量や種類も変化させられてよい。別に、誘発される抗体の量またはサブタイプが変化させられてもよい。
免疫化：本明細書で用いる用語「免疫化する」または「免疫化」、または、関連用語は、標的抗原またはエピトープに対して実質的な免疫反応（抗体および／または、エフェクターＣＴＬのような細胞性免疫を含む）を呈する能力を付与することを指す。これらの用語は、完全な免疫が形成されることを要求せず、むしろ、実質的に基礎値よりも大きな免疫反応が形成されることを要求する。例えば、本発明の方法を運用した後に、標的抗原に対して細胞性および／または体液性免疫反応が生じたならば、その哺乳動物は、その標的抗原に対して免疫化されたと考えられる。
免疫療法：本明細書で用いる用語「免疫療法」とは、疾病、障害または状態の治療用組成物を指す。さらに詳細には、この用語は、ワクチン接種、または、免疫分子の移送によって有益な免疫反応が形成される治療法を指すのに用いられる。
免疫有効量：本明細書で用いる用語「免疫有効量」とは、組成物がある個体に導入された場合に、その個体に免疫反応を誘発するのに十分な、その組成物の量を指す。能動免疫と結びつけた場合、この用語は、「免疫原性有効量」と同義である。ある組成物の、免疫的に効果的であるために必要な量は、組成物の中に含まれる他の成分の存在（例えばアジュバント）、抗原、免疫化ルート、個体、以前の免疫または生理状態等を含む多数の因子に従って変動する。
個体：本明細書で用いる用語「個体」とは、多細胞生物を指し、植物と動物の両方を含む。好ましい多細胞生物は動物であり、さらに好ましいのは脊椎動物であり、それよりさらに好ましいのは哺乳動物であり、もっとも好ましいのはヒトである。
低量または検出不能：本明細書で用いる用語「低量または検出不能」とは、遺伝子の発現レベルに関して使用される時は、遺伝子が最大に誘発された場合よりも著しく低い（例えば、少なくとも５倍低い）か、または、下記の実施例のセクションで用いられる方法では簡単には検出されない発現レベルを指す。
レクチン：本明細書で用いる場合、特に豆類植物の種子から得られるが、そればかりでなく他の多くの植物および動物供給源から得られる蛋白で、特定の単糖またはオリゴ糖に対する結合部位を持つ蛋白である。例としては、糖蛋白研究において分析および調製剤として広く用いられるコンカナバリンＡおよび小麦胚アグルチニンが挙げられる。
天然起源：本明細書で用いる用語「天然起源」とは、その全体または部分が合成ではなく、天然に存在する、または、天然に生産されることを意味する。
非天然：本明細書で用いる場合、この用語は、一般に、天然によらないこと、さらに具体的には、この用語は、人の手によることを意味する。
非天然起源：本明細書で用いる用語「非天然起源」とは、一般に、合成による、または、天然由来のものではないことを意味し、さらに具体的には、この用語は、人の手によることを意味する。
非天然分子骨格：本明細書で用いる用語「非天然分子骨格」とは、第１付着部位から成る、剛性な反復アレイを実現するのに使用される、人の手によって製造される全ての産物を指す。理想的には、と言って必ずしもそうでなくともよいが、これらの第１付着部位は幾何学的順序に並べられる。この非天然分子骨格は、有機的であっても、非有機的であってもよく、また、その一部または全部が、化学的合成されてもよいしまたは生物学的プロセスを通じて合成されてもよい。この非天然分子骨格は、（ａ）天然または非天然どちらかの起源を持つコア粒子、および、（ｂ）少なくとも一の共有結合によって、コア粒子に接続される少なくとも一の第１付着部位から成る。特定の実施態様では、この非天然分子骨格は、ウィルス、ウィルス様粒子、細菌の線毛、ウィルスカプシド粒子、ファージ、その組み換え形態、または、合成粒子であってもよい。
ニコチンハプテン：本明細書で用いられる用語「ニコチンハプテン」とは、鏡像異性体的に純粋な（Ｓ）−形または（Ｒ）−形、または、それらの混合物のいずれかのニコチンを指し、これは、少なくとも一の第２付着部位を含み、そのために、担体の第１付着部位に、直接または架橋リンカーを介して連結することが可能となる誘導体形成を実現し得る。好ましくは、このニコチンハプテンは、ただ一つの付着部位を含むように誘導体形成される。この誘導体形成によって、ニコチンハプテン−担体抱合体の整列性と反復性がさらに増し、担体に対するニコチンハプテンの結合を確実に指令・調節ができるようになる。
規則的な反復性抗原または抗原決定基アレイ：本明細書で用いる用語「規則的な反復性抗原または抗原決定基アレイ」とは、抗原または抗原決定基が、非天然分子骨格に対して均一に空間的に配置されることによって特徴付けられる、抗原または抗原決定基の反復パターンを指す。本発明の一つの実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。好適な、規則的な、反復性の抗原または抗原決定基アレイの典型的で好ましい例としては、好ましくは０．５から３０ナノメーターの間隔、より好ましくは５から１５ナノメーターの間隔を持つ、抗原または抗原決定基の、準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つアレイである。
受動免疫：本明細書で用いる用語「受動免疫」とは、外因的に生産された免疫分子（例えば抗体）または細胞（例えばＴ細胞）を、どのルートからでもよいから、動物に投与することによって実現される免疫性の付与を指す。受動免疫は、免疫原、ワクチン、抗原またはハプテン−担体抱合体を個体に導入して免疫反応を惹起することによって免疫性が得られる「能動」免疫とは異なる。
線毛：本明細書で用いる用語「線毛」（単数形は「ｐｉｌｕｓ」（「ピルス」））とは、規則的な反復パターンに組織化される、蛋白モノマー（例えばピリンモノマー）から構成される、細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに、線毛は、細菌細胞の宿主細胞表面受容体への付着、細胞間遺伝子交換、および、細胞対細胞認識のような過程に与る構造である。線毛の例としては、１型線毛、Ｐ−線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ−線毛、および、９８７Ｐ−線毛が挙げられる。さらにその他の線毛の例が、本明細書の別の場所に記載されている。
線毛様構造：本明細書で用いる用語「線毛様構造」とは、線毛と似た特徴を持ち、かつ、蛋白モノマーから構成される構造を指す。「線毛様構造」の一つの例は、事実上天然の線毛のものと同一の、規則的な反復性アレイを形成することをしない、修飾されたピリン蛋白を発現する細菌細胞によって形成される構造である。
ポリペプチド：本明細書で用いる用語「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合という名でも知られる）によって直線的に結合されるモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。これは、アミノ酸から成る１本の分子鎖を示し、その産物の特定の長さを指定しない。従って、ペプチド類、ジペプチド類、トリペプチド類、オリゴペプチド類および蛋白類は、このポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、糖付加、アセチル化、リン酸化等の発現後修飾も指すことが意図される。組み換えまたは誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドはまた、化学合成を含めた、いずれの方法で生成されてもよい。
蛋白：本明細書で用いる蛋白という用語は、一般に、約５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、２０００個以上のアミノ酸から成るサイズを持つポリペプチドを指す。蛋白は、一般にある定義された三次元構造を持ち−ただし必ずしも持つ必要はない、ペプチドやポリペプチドに対してよく折り畳み体と呼ばれる。反対に、ペプチドやポリペプチドは、多くの場合定義された三次元構造を持たず、むしろ多様なコンフォメーションを取ることが可能で、非折り畳み体と呼ばれる。一方、ペプチドも三次元構造を取ることが可能である。蛋白の、この定義された三次元構造は、第２付着部位によって仲介され、特に第１付着部位と第２付着部位との間の化学的架橋リンカーによる化学的架橋結合によって仲介されるコア粒子と抗原との間の結合にとっては特に重要である。アミノ酸リンカーも、本発明のいくつかの点で蛋白の構造特性に密接に関わっている。
精製：本明細書で用いる用語「精製」とは、分子に関して用いられ、精製された分子の濃度は、自然な環境において、または、その分子が生産、発見または合成される環境下で、その分子と関連する分子に対して相対的に増加することを意味する。天然で関連する分子としては、蛋白、核酸、脂質および糖が挙げられるが、一般に、水、バッファー、および、精製される分子の完全性を維持するために、またはその精製を促進するために添加される試薬を含まない。例えば、ｍＲＮＡを、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーの際に、たとえ水性溶媒で希釈したとしても、自然では関連する核酸およびその他の生物分子がカラムに結合せず、対象ｍＲＮＡ分子から分離された場合、ｍＲＮＡ分子は、このクロマトグラフィーによって精製されたことになる。この定義によれば、物質の純度は、その混入物質に対する相対値として考えた場合、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または、１００％であってもよい。
受容体：本明細書で用いる用語「受容体」とは、リガンドと呼ばれる別の分子と相互作用を持つことが可能な、蛋白または糖蛋白、または、それらの断片を指す。リガンドは、生化学的または化学的化合物であれば、どのクラスのものであってもよい。この受容体は、必ずしも膜結合蛋白である必要はない。例えば、マルトース結合性蛋白またはレチノール結合性蛋白のような可溶性蛋白も受容体である。
残基：本明細書で用いる用語「残基」とは、ポリペプチドバックボーンまたは側鎖における特定のアミノ酸を意味する。
組み換え宿主細胞：本明細書で用いる用語「組み換え宿主細胞」とは、本発明の１種以上の核酸分子が導入された宿主細胞を指す。
組み換えウィルス：本明細書で用いる用語「組み換えウィルス」とは、人の手によって遺伝的に修飾されたウィルスを指す。この語句は、従来技術で既知の全てのウィルスをカバーする。さらに具体的には、この語句は、人の手によって遺伝的に修飾されたアルファウィルス、もっとも具体的には、この語句は、人の手によって遺伝的に修飾されたシンビスウィルスを指す。
ＲＮＡファージ、ＲＮＡバクテリオファージ−本明細書で用いる用語「ＲＮＡバクテリオファージ」、または、その縮小形である「ＲＮＡファージ」とは、細菌に感染するＲＮＡウィルス、好ましくは、細菌に感染する１本鎖の陽性センスＲＮＡウィルスを指す。
自己抗原：本明細書の用いる用語「自己抗原」とは、宿主のＤＮＡによってコードされる蛋白を指し、かつ、宿主のＤＮＡによってコードされる蛋白またはＲＮＡによって生成される産物は自己と定義される。さらに、２種または数種の自己分子の結合によって生ずる蛋白、または、高い相同性を持つ（＞９５％、好ましくは＞９７％、さらに好ましくは＞９９％）、２種の、上に定義した自己分子を持つ自己分子および蛋白の一部を表す蛋白も、自己と見なしてよい。
ワクチン：本明細書で用いる用語「ワクチン」とは、本発明の組成物を含み、かつ、動物に投与可能な形態として存在する処方を指す。典型的には、このワクチンは、本発明の組成物がその中に懸濁または溶解される、通例の生食液、または、緩衝された水溶液溶媒を含む。この形態において、本発明の組成物は、状態の予防、寛解、またはその他の方法で治療のために好適に使用することが可能である。宿主に導入されると、このワクチンは、抗体および／またはサイトカインの生産、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、および／または、その他の細胞反応含む−ただしそれらに限定されない−免疫反応を惹起することが可能である。要すれば随意に、本発明のワクチンは、本発明の化合物に対して、小比率、または、大比率として存在が可能なアジュバントをさらに含む。
ベクター：本明細書で用いる用語「ベクター」とは、遺伝物質を宿主細胞に伝達するために使用される媒介物（例えば、プラスミドまたはウィルス）を指す。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかによって構成されてもよい。
ウィルス様粒子：本明細書で用いる用語「ウィルス様粒子」とは、ウィルス粒子に類似の構造を指す。さらに、本発明によるウィルス様粒子は、ウィルスゲノムの全部または一部、特に、ウィルスゲノムの複製および感染成分を欠くために、複製せず、かつ、非感染的である。本発明によるウィルス様粒子は、そのゲノムとは異なる核酸を含んでもよい。
バクテリオファージのウィルス様粒子：本明細書で用いる用語「バクテリオファージのウィルス様粒子」とは、バクテリオファージの構造と類似して、非複製的で、非感染的で、かつ、そのバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子（単複）を少なくとも欠如する、かつ、典型的には、宿主への付着または侵入を担当する蛋白（単複）をコードする遺伝子（単複）をさらに欠如するウィルス様粒子を指す。本発明によるウィルス様粒子は、ウィルスゲノムの全てまたは一部、特に、ウィルスゲノムの複製および感染成分を欠如する。本発明によるウィルス様粒子は、そのウィルスのゲノムとは異なる核酸を含んでもよい。本発明によるウィルス様粒子の、典型的で好ましい実施態様は、対応するウィルス、バクテリオファージ、または、ＲＮＡファージのウィルス性カプシドのようなウィルスカプシドである。「ウィルスカプシド」または「カプシド」という用語は、本明細書では相互交換的に使用されるが、ウィルス蛋白サブユニットによって構成される巨大分子アッセンブリーを指す。典型的には、かつ、好ましくは、ウィルス蛋白サブユニットは集結して、それぞれ、ウィルスカプシドおよびカプシドに成る。カプシドは、典型的には球形または管状の、固有の反復組織を持つ構造を有する。例えば、ＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのカプシドは、正二十面体対称の球形を有する。本明細書で使用される「カプシド様構造」という用語は、上に定義した意味でのカプシド形態に類似はするが、典型的な対称集合体から偏倚し、一方、十分な程度の秩序と反復性を維持する、ウィルス蛋白サブユニットから構成される巨大分子アッセンブリーを指す。
バクテリオファージのウィルス様粒子：本明細書で用いる用語「バクテリオファージのウィルス様粒子」とは、バクテリオファージの構造と類似して、非複製的で、非感染的で、かつ、そのバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子（単複）を少なくとも欠如する、かつ、典型的には、宿主への付着または侵入を担当する蛋白（単複）をコードする遺伝子（単複）をさらに欠如するウィルス様粒子を指す。しかしながら、この定義は、前述の遺伝子（単複）が依然として存在するが、不活性であり、そのために、非複製的・非感染的バクテリオファージのウィルス様粒子となる、そのようなバクテリオファージのウィルス様粒子をさらに含む。
ＲＮＡファージコート蛋白のＶＬＰ：ＲＮＡファージコート蛋白の１８０個のサブユニットから成る自己集結アッセンブリーから形成され、要すれば随意に宿主のＲＮＡを含むカプシド構造を、「ＲＮＡファージコート蛋白のＶＬＰ」と呼ぶ。具体的例は、Ｑβコート蛋白のＶＬＰである。この特定の場合では、Ｑβコート蛋白のＶＬＰは、Ｑβ ＣＰサブユニットのみから集結構成されてもよく（例えば、ＴＡＡ終止コドンを含み、それによって、さらに長いＡ１蛋白の全ての発現が抑制遮断される、Ｑβ ＣＰ遺伝子の発現によって形成される、コズロフスカ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ）Ｔ．Ｍ．等、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ３９：９−１５（１９９６）参照）、または、カプシドアッセンブリーの中にさらにＡ１蛋白サブユニットを含んでもよい。
ウィルス粒子：本明細書で用いる用語「ウィルス粒子」とは、ウィルスの形態学的形を指す。あるウィルスタイプは、蛋白のカプシドによって囲まれるゲノムを含むが、またあるものは、さらに別の構造（例えば、エンベロープ、尾部等）を有する。
一つの（Ｏｎｅ）、ある一つの（Ａ、Ａｎ、不定冠詞）：「ｏｎｅ」、「ａ」または「ａｎ」という用語が本開示で使用される場合、それらは、別様に指示しない限り、「少なくとも一つの」、または、「１個以上」を意味する。
本明細書において何かの数値を参照して使用する場合、「約」という用語は、言及した数値の±１０％の値を意味する（例えば、「約５０℃」は、４５℃を含む４５℃から５５℃を含む５５℃までの温度範囲を含む、同様に、「約１００ｍＭ」は、９０ｍＭを含む９０ｍＭから１１０ｍＭを含む１１０ｍＭまでの範囲を含む）。
概観
一つの局面において、本発明は、規則的な反復性ハプテン−担体抱合体の形を取る１個以上のハプテンと担体から成る抱合体、および、そのような抱合体の製造法を提供する。本発明はまた、少なくとも一の、上記の本発明の抱合体、および、少なくとも一のその他の組成物、好適には、少なくとも１種の賦形剤または担体、および、特に、少なくとも１種の製薬的に受容可能な賦形剤または担体とを含む組成物を提供する。本発明の抱合体および組成物に好適に使用されるハプテンは、毒素、および、薬物、特に、ニコチンのような依存性薬物を含むが、ただしそれらに限定されない。本発明の抱合体および組成物は、ハプテンに対抗する免疫反応を誘発するのに有用である。このような免疫反応は、治療、予防、および、診断目的にのために有用な抗体を産生するのに利用が可能である。免疫反応は、乱用薬物に対する依存性、および、その結果招来される薬物依存関連性疾患の予防・治療に有用である可能性がある。
本発明の抱合体は、ハプテンの、高度に秩序化された反復性アレイを含む。本発明のこの局面による抱合体アレイは、第１付着部位を含む（ａ）コア粒子、および、第２付着部位を含む（ｂ）ハプテンであって、要素（ａ）と要素（ｂ）とは、第１および第２付着部位を介して結合されて、前記規則的な反復性ハプテンアレイを形成する、そのような要素（ａ）と（ｂ）とを含む。
本発明の抱合体および組成物に好適に使用されるコア粒子は、天然性であっても、または、非天然性であってもよい。本発明の天然コア粒子としては、ウィルス粒子、ウィルス様粒子、および、線毛が挙げられる。これらの天然コア粒子の蛋白は、天然でも、または、組み換えでもよい。コア粒子上の第１付着部位は天然に発生してもよいし、あるいは、化学的または組み換え手段によって導入されてもよい。本発明のハプテンは、各種の分子、例えば、毒素、ホルモンおよび薬物、特に、乱用薬物および／または依存性薬物を含む分子−と言ってそれらに限定されない−に対して免疫反応を誘発するのに好適なものである。ハプテン上の第２付着部位は、天然に生じてもよいし、または、導入されてもよい。第１および第２部位間の相互作用は直接であってもよいし、少なくとも一の他の分子、例えば、リンカーを含んでもよい。リンカーは架橋結合性分子を含む。
本発明の抱合体および組成物は、ハプテンに対する免疫反応、特に、抗体を誘発する点において驚くほど効果的である。従って、それら抱合体および組成物は、各種薬物、ホルモンまたは毒素と関連する疾病、障害または状態に対する治療または予防用として動物を免疫化するのに好適な組成物に加えると有用である。本発明の抱合体および組成物による免疫化によって生産される抗体はまた、治療・予防目的のためにも有用である。
その他の実施態様として、本発明は、本発明の抱合体および組成物を利用した、病気の治療・予防法を提供する。また別の実施態様では、本発明は、診断とスクリーニング用に好適なキットを提供する。
規則的な反復抗原または抗原決定基アレイから成る組成物、および、その製造法
本発明は、規則的な反復性ハプテンアレイを含む、抱合体および抱合体の組成物を提供する。さらに、本発明は、好都合にも、開業医師が、様々な目的のために、好ましくは、有機分子に対する免疫反応誘発のために、規則的な反復性ハプテンアレイを構築することを可能とする。
本発明の抱合体は、二つの要素、（１）非天然の分子骨格、および、（２）ハプテンであって、前記第１付着部位に対して少なくとも一の結合を介して連結することの可能な、少なくとも一の第２付着部位を備えるハプテンを事実上含む、また別態様として、その二つの要素から成る。
この非天然分子骨格は、（ａ）コア粒子であって、（１）非天然起源のコア粒子、および、（２）天然起源のコア粒子から成るグループから選ばれるコア粒子、および、（ｂ）少なくとも一の第１付着部位であって、少なくとも一の共有結合によって前記コア粒子に接続される第１付着部位を含む、または、別態様として、それらの要素から成る。本発明の抱合体、組成物および方法で使用されるハプテンは、（ａ）付着部位であって、天然では前記ハプテンとは共存しない付着部位、および、（ｂ）付着部位であって、天然では前記抗原または抗原決定基と共存する付着部位から成るグループから選ばれる、少なくとも一の第２付着部位を有する。
本発明は、第２付着部位を、少なくとも一の結合を介して、第１付着部位に連結させることによって、規則的な反復性ハプテンアレイを実現する。従って、ハプテンと非天然の分子骨格は、第１付着部位と第２付着部位とのこの連結を通じて結び付けられて、規則的な反復性抗原アレイを形成する。
開業医は、ハプテンと第２付着部位を、非天然分子骨格に結合する全てのハプテンの配置が、または、ある実施態様では、コア粒子が、均一となるように細かく具体的に設計してもよい。例えば、ハプテン上に単一の第２付着部位を配置して、そうすることによって、非天然分子骨格に付着する全てのハプテンが斉一的に配置されるよう、設計を通じて確保するようにしてもよい。上記から、本発明は、定義された順序で、反復パターンを形成する方法で、どのようなハプテンでも非天然分子骨格上に配置する好適な手段を提供する。
当該分野において通常の熟練度を有する当業者には明らかなように、本発明のいくつかの実施態様は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、前核および真核細胞における組み換え蛋白の発現といった、組み換え核酸技術の使用を含む。このような方法論は当業者にはよく知られており、また、公刊された臨床検査法マニュアルの中に好都合に見出される（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．等編、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（１９８９）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．等編、「分子生物学における最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｈ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９７））。組織培養細胞系統を用いて研究するための基本的実験技術（セリス（Ｃｅｌｉｓ）Ｊ．編、「細胞生物学（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版、（１９９８））、および、抗体技法（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）Ｅ．およびレイン（Ｌａｎｅ）Ｄ．，「抗体−実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、（１９８８）、ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）Ｍ．Ｐ．，「蛋白精製ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、（１９９０）、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）Ｒ．Ｋ．，「蛋白精製、原理と実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９４））も、文献に十分に記述されている。なお、これら全てを、引用することにより本明細書に含める。
さらに、本発明の実施に必要な、有機分子をアミノ酸に結合させる技法、および、適当な第２付着部位を含むハプテン誘導体を製造する手段は、当業者にはよく知られている。このような方法論は、化学の教科書や出版物に見出すことが可能であり、その例を下記に挙げ、引用することによって本明細書に含める。すなわち、米国特許第５，８７６，７２７号、国際公開ＷＯ９９／６１０５４、イソムラ（Ｉｓｏｍｕｒａ）Ｓ．等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：４１１５−４１２１（２００１）、マツシタ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ）Ｈ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５７：１００６−１０１０（１９７４）、ランゴン（Ｌａｎｇｏｎｅ）Ｊ．Ｌ．およびバンブナキス（Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ）Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８４：６２８−６４０（１９８２）、ウォン（Ｗｏｎｇ）、「蛋白抱合体および架橋結合の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ）」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、フロリダ（１９９１）。
コア粒子および非天然分子骨格
一つの実施態様では、本発明は、規則的な反復性のハプテンアレイの形成法を提供する。本発明により、この形成は、１個以上のハプテンが第１および第２付着部位を介してコア粒子に連結することによって起こる。
従って、本発明の、いくつかの抱合体および組成物の一つの要素は、コア粒子および第１付着部位を含む、または、から成る、非天然分子骨格である。さらに具体的には、この非天然分子骨格は、（ａ）天然または非天然起源のコア粒子、および、（ｂ）少なくとも一の第１付着部位であって、少なくとも一の共有結合によってコア粒子に接続される第１付着部位を含む、または、から成る。
コア粒子。本発明の一つの実施態様では、コア粒子は、合成ポリマー、脂質ミセル、または、金属である。このようなコア粒子は従来技術で既知であり、本発明の非天然分子骨格を製造するための基礎を与える。例を挙げると、合成ポリマーまたは金属コア粒子は、米国特許第５，７７０，３８０号、５，３３４，３９４号に開示されている。これらの開示全体を引用することにより本明細書に含める。好適な金属としては、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀、白金が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。適当なセラミック材料としては、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミ、酸化ルテニウム、および、酸化スズが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。本実施態様のコア粒子は、炭素および、ポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロースを含む適当なポリマーを含む−ただしそれらに限定されない−有機材料から製造が可能である。ナノ結晶粒子の場合は、酸化スズ、二酸化チタンまたは炭素（ダイアモンド）から製造される粒子が有用である。本発明で使用される脂質ミセルは、従来技術的で既知のいかなる手段によって調製してもよい。例えば、そのような手段としてベセルおよびミラー（Ｂａｉｓｅｌｌｅ ａｎｄ Ｍｉｌｌａｒ）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．４：３５５−３６１（１９７５）、または、コルチ（Ｃｏｒｔｉ）等、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、３８：１９７−２１４（１９８１）、または、ロペス（Ｌｏｐｅｚ）等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：３１４−３１８（１９９８）、または、トプチーバおよびカレジン（Ｔｏｐｃｈｉｅｖａ ａｎｄ Ｋａｒｅｚｉｎ）、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．２１３：２９−３５（１９９９）、または、モレイン（Ｍｏｒｅｉｎ）等、Ｎａｔｕｒｅ、３０８：４５７−４６０（１９８４）がある。
本発明の一つの実施態様では、コア粒子は、天然性でも、非天然性であってもよい、生物過程を通じて生産される。例えば、ウィルス、および、細菌の線毛または線毛様構造は、規則的な反復性の構造に組織化される蛋白から形成される。従って、本発明は、ウィルス、ウィルス様粒子、細菌の線毛、ファージ、ウィルスのカプシド粒子またはその断片を含む−ただしそれらに限定されない−有用なコア粒子を含む抱合体、組成物、および、方法を含む。いくつかのこのような実施態様では、蛋白質は組換え体であってもよい。
いくつかの実施態様では、非天然分子骨格のコア粒子は、ウィルス、細菌の線毛、細菌のピリンから形成される構造、バクテリオファージ、ウィルス様粒子、ウィルスのカプシド粒子またはその組換え体を含む。規則的な反復性の、コートおよび／またはコア蛋白構造を持つものであれば、従来技術で既知のいかなるウィルスも、本発明の方法、抱合体および組成物において、非天然分子骨格として使用するために選択することが可能である。適当なウィルスの例としては、シンドビスおよびその他のアルファウィルス、ラブドウィルス（例えば、水泡性口内炎ウィルス）、ピコルナウィルス（例えば、ヒトライノウィルス、アイチウィルス）、トガウィルス（例えば、風疹ウィルス）、オルソミクソウィルス（例えば、トゴトウィルス、バトケンウィルス、家禽ペストウィルス）、ポリオーマウィルス（例えば、ポリオーマウィルスＢＫ、ポリオーマウィルスＪＣ、鳥類ポリオーマウィルスＢＦＤＶ）、パルボウィルス、ロタウィルス、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７、バクテリオファージＡＰ２０５、ノーウォークウィルス、口蹄疫ウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、煙草モザイクウィルス、フロックハウスウィルス、および、ヒトパピローマウィルス（例えば、バックマンおよびジンカーナーゲル（Ｂａｃｋｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ． ａｎｄ Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７：５５３−５５８（１９９６）の表１参照）が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。本発明の、より具体的な例示の実施態様においては、コア粒子は、ロタウィルスの組み換え蛋白、ノーウォークウィルスの組み換え蛋白、アルファウィルスの組み換え蛋白、細菌の線毛または線毛様構造を形成する組み換え蛋白、口蹄疫ウィルスの組み換え蛋白、レトロウィルスの組み換え蛋白、Ｂ型肝炎ウィルスの組み換え蛋白（例えば、ＨＢｃＡｇ）、煙草モザイクウィルスの組み換え蛋白、フロックハウスウィルスの組み換え蛋白、および、ヒトパピローマウィルスの組み換え蛋白、を含む、または、から成る。
本発明の抱合体、組成物および方法において用いられるコア粒子はさらに、複数の蛋白であって、相互に連結して、規則的な反復性の抗原または抗原決定基アレイを形成する能力を持つ複数の蛋白の１個以上の断片、および、それらの変種、を含む、または、から成る。例えば、国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号に説明されているように、コア粒子は、アミノ酸配列の特定性および類似性において、かつ、配列長において、野生型粒子とは著明に異なる、ヒトＨＢｃＡｇという変形種から形成されてもよい。例えば、ハクガンやアヒルに感染するＢ型肝炎ウィルスのＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、蛋白の軸揃えが困難な、ウィルス感染哺乳動物のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列とは相当に異なる。しかしながら、いずれのウィルスも、規則的な反復性ハプテンアレイを形成するのに好適なコア構造を形成する能力を保持する。同様に、ＨＢｃＡｇは、Ｎ−末端のリーダー配列の除去後、さらに配列に欠失、置換または添加を経た後も、ウィルスに通常見られる、マルチマー粒子を形成する能力を保持することが可能である。蛋白がこのような構造を形成するかどうかを判断するのに使用が可能な方法としては、ゲルろ過、アガロースゲル電気泳動、蔗糖勾配遠心、および、電子顕微鏡検査が挙げられる（例えば、コッシェル（Ｋｏｓｃｈｅｌ）Ｍ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２１５３−２１６０（１９９９））。
第１付着部位。天然であれ、非天然であれ、本発明の抱合体、組成物および方法において使用されるコア粒子は、一般に、少なくとも一の共有結合によって天然または非天然のコア粒子に付着される第１付着部位を含む成分を有する。第１付着部位を含む、この要素は、コア粒子に対して、非ランダムな方法で、すなわち、規則的な反復性の抗原アレイを実現するための核形成部位を与える方法で結合する。理想的には、と言って必ずそうでなければならないと言うのではないが、この要素は、コア粒子に対して幾何学的な秩序で連結する。第１付着部位は、コア粒子の天然の一部、例えば、第２付着部位と結合するのに好適な、表面露出性のアミノ酸残基であってもよい。例えば、リシンやシステインは、そのアミノ酸上の反応基を介して非ペプチド結合を形成することが可能である。別態様として、第１付着部位を含む要素は、化学的結合、または、組み換え分子の設計を通じてコア粒子内に導入することも可能である。第１付着部位は、少なくとも一の共有結合によってコア粒子に結合される限り、どのような要素であっても、または、そのような要素の上に存在するものであってもよい。
第１付着部位、を含む、または、から成る要素は、蛋白、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸（すなわち、蛋白、ポリペプチドまたはペプチドの残基）、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次的代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルフォニルフロリド）、またはそれらの併用、または、それらの化学的反応基であってもよい。さらに具体的な実施態様では、第１付着部位は、抗原、抗体または抗体断片、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、受容体、受容体リガンド、リガンド、リガンド結合蛋白、相互作用を持つジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基に反応する化学基、カルボキシル基、カルボキシル基に反応する化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基に反応する化学基、または、それらの併合を含む。
一つの実施態様では、本発明は、ウィルスの遺伝子工学を利用して、規則的な反復性ウィルスエンベロープ蛋白と、ヘテロ蛋白、ペプチド、抗原決定基、または、好みの反応性アミノ酸残基を含む第１付着部位を含む要素との間に融合を実現する。その他の、当業者に既知の遺伝子操作が、非天然分子骨格の構築に含まれる。例えば、組み換えウィルスの複製能力を遺伝的突然変異によって制限することが望ましい。第１付着部位蛋白を含む蛋白との融合のために選択されたウィルス蛋白は、組織的な反復性の構造を持たなければならない。そのような組織的反復的構造は、ウィルス表面において、０．５−３０ｎｍ、好ましくは５−１５ｎｍの間隔を有する準結晶組織を含む。このタイプの融合蛋白の形成は、ウィルスの表面に、第１付着部位の、複数の、規則的で反復性の組織をもたらす。従って、それから得られる第１付着部位の規則的な反復性組織は、天然のウィルス蛋白の正常組織を反映する。
従来技術において通常の錬度を有する当業者ならば理解されるように、第１付着部位は、選択の抗原または抗原決定基を非天然分子骨格に特異的に付着させるのに役立つ、適当な蛋白、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然または合成ポリマー、二次代謝産物、または、それらの併合であってもよいし、または、それらの一部であってもよい。一つの実施態様では、付着部位は、当業者によって選択される一つの蛋白、または、ペプチドである。例えば、第１付着部位は、リガンド、受容体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ＨＡまたはＴ７タグのようなエピトープ、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、免疫グロブチンドメイン、および、第１付着部位として有用と考えられる、従来技術で既知の、他のアミノ酸であってもよい。
さらに、従来技術において通常の錬度を有する当業者であれば、本発明の別の実施態様では、第１付着部位は、カプシド蛋白に対してフレーム合致融合を構築する際に利用される第１付着部位（すなわち、蛋白またはポリペプチド）を担う要素の形成に対して二次的に創成されてもよいことが理解されるであろう。例えば、蛋白を利用して、既知のアミノ酸配列を持つエンベロープ蛋白へ融合させて特定の方法で糖付加させ、その結果付加された糖機能基が、抗原の第２付着部位となるレクチンに結合することによってウィルス骨格の第１付着部位になってもよい。別に、配列が生体内でビオチニル化し、そのビオチン機能基が本発明の第１付着部位になってもよいし、あるいは、その配列が、インビトロにおいて特定のアミノ酸残基の化学的修飾を受け、その修飾が第１付着部位となってもよい。
本発明の一つの特定の実施態様では、第１付着部位は、Ｂ型肝炎カプシド（コア）蛋白（ＨＢｃＡｇ）に対してフレーム合致融合されるＪＵＮ−ＦＯＳロイシンジッパー蛋白ドメインである。しかしながら、当該分野において通常の熟練度を有する当業者には、その他のウィルス性カプシド蛋白でも、本発明の非天然分子骨格の中に第１付着部位を配するための融合蛋白構築体として利用が可能であることは明白であろう。例えば、本発明の他の実施態様では、第１付着部位は、ＨＢｃＡｇに対してフレーム合致融合されるリシンまたはシステイン残基であるように選択される。しかしながら、全ての当業者において、他のウィルスカプシド、またはウィルス様粒子でも、本発明の非天然分子骨格の中に第１付着部位を配するための融合蛋白構築体として利用が可能であることは明白であろう。
ウィルス粒子。本発明の一つの実施態様では、コア粒子は組み換えアルファウィルスであり、さらに具体的には、組み換えシンドビスウィルスである。従来から、アルファウィルス族の内のいくつかのメンバー、すなわち、シンドビスウィルス（ジオン（Ｘｉｏｎｇ）Ｃ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１１８８−１１９１（１９８９）、シュレジンガー（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８−２２（１９９３））、セムリキ森ウィルス（ＳＦＶ）（リレストローム（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ）Ｐ．およびガロフ（Ｇａｒｏｆｆ）Ｈ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３５６−１３６１（１９９１））および、その他のウィルス（デービス（Ｄａｖｉｓ）Ｎ．Ｌ．等Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７１：１８９−２０４（１９８９））が、各種蛋白のウィルス系発現ベクターとして使用するために（ランドストローム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ）Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８−５８２（１９９７）、リレストローム（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ）Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５−５００（１９９４））、また、ワクチン開発の候補として相当の注目を浴びている。ヘテロ蛋白の発現、および、ワクチン開発用のアルファウィルスの使用法は既に開示されている（例えば、米国特許第５，７６６，６０２、５，７９２，４６２、５，７３９，０２６、５，７８９，２４５、および、５，８１４，４８２号を参照されたい）。これら全ての開示の全体を引用することにより本明細書に含める。本発明のアルファウィルス骨格の構築は、引用することによって本明細書に含めた、前述の論文に記述されるような、組み換えＤＮＡ技術において一般的に知られる手段によって実行されてもよい。抗原または抗原決定基付着用ウィルス系コア粒子製造のためには、多様な組み換え宿主細胞の利用が可能である。
パッケージされたＲＮＡ配列も、宿主細胞の感染に使用することが可能である。これらパッケージされたＲＮＡ配列は、培養液に加えることによって宿主細胞に導入することが可能である。例えば、非感染性アルファウィルス粒子の調製法が、「シンドビス発現系（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｃ版（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバート、カリフォルニア、カタログ番号Ｋ７５０−１）を含めた、いくつかの情報源に記述されている。
ウィルス系コア粒子生産のために哺乳類細胞を組み換え宿主細胞として使用する場合、一般にこれらの細胞は組織培養で育成させる。細胞を培養する方法は、従来技術においてよく知られる（例えば、セリス（Ｃｅｌｉｓ）Ｊ．編、「細胞生物学（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２版、（１９９８）、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．等編、「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．等編、「分子生物学における最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）Ｒ．「動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）を参照）。
従って、本発明は、ウィルス、ウィルス様粒子、ファージ、ウィルスカプシド粒子または、その組換え体、を含む、または、から成るウィルス系コア粒子を含む。熟練した専門家であれば、このようなコア粒子を生産し、それに対して第１付着部位を付着させる知識を持つ。コア粒子用として、Ｂ型肝炎ウィルス様粒子の生産、特に、ＨＢｃＡｇおよび麻疹ウィルスカプシド粒子から集結されたもの、または、自己集結されたものの生産が、国際公開第ＷＯ００／３２２２７号の実施例１７から２２に記述される。なお、この開示を引用することにより本明細書に含めることを明言する。この実施態様では、ＪＵＮロイシンジッパー蛋白ドメイン、または、ＦＯＳロイシンジッパー蛋白ドメインが、本発明の非天然分子骨格の第１付着部位として使用されてもよい。当業者であれば、反応性リシン残基とフレーム合致融合したペプチド、および、遺伝的に融合されたシステイン残基を担う抗原を、それぞれ、第１および第２付着部位として担うＢ型肝炎ウィルス粒子を構築する方法を存知していよう。
他の実施態様では、本発明の組成物に使用されるコア粒子は、Ｂ型肝炎ウィルスカプシド（コア）蛋白（ＨＢｃＡｇ）、ＨＢｃＡｇの断片、または、ウィルス様粒子を形成することが可能であって、かつ、遊離のシステイン残基を除去する、または、その数を減ずるように修飾された他の蛋白またはペプチドから構成される。ジョウ（Ｚｈｏｕ）等（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３−５３９８（１９９２））は、天然に存在するシステイン残基を除去するように修飾されたＨＢｃＡｇでも、連結し、マルチマー構造を形成する能力を保持することを明らかにした。従って、本発明の組成物において使用するのに好適なコア粒子は、その内の天然に存在するシステイン残基の１個以上が除去されるか、または、他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換されるかしている、ＨＢｃＡｇ修飾体、または、その断片を含む。ある好ましい実施態様では、ＨＢｃＡｇは、配列番号１に記述されるアミノ酸配列、または、配列番号１の配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９９％または１００％、同一であるアミノ酸配列を有する。本発明の一つの実施態様では、配列番号１に示すアミノ酸配列、または、その一部を含むＨＢｃＡｇ修飾体を用いて、非天然分子骨格を調製する。特に、本発明の実施において使用するのが好適なＨＢｃＡｇ修飾体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を持つ蛋白の、４８、６１、１０７および１８５位置に対応する位置におけるシステイン残基の１個以上のものが、欠失された、または、他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された蛋白を含む。当業者であれば理解されるように、配列番号１に示したものとは異なるアミノ酸配列を持つＨＢｃＡｇ変種の、同様位置におけるシステイン残基も、欠失したり、または、他のアミノ酸残基によって置換することが可能である。次に、この修飾されたＨＢｃＡｇ変種を用いて、本発明のワクチン組成物を調製することが可能である。
ある状況下では（例えば、ヘテロの二重機能性架橋試薬を用いて、抗原または抗原決定基を非天然分子骨格に付着させる場合）、ＨＢｃＡｇにおける遊離システイン残基の存在は、毒素成分のコア粒子への共有結合を実現するのみならず、モノマーを架橋して未定義の分子種の形成をもたらすことが考えられる。
さらに、多くの場合、この毒素成分は、本発明の組成物に対して実施されるアッセーでは検出されない。これは、非天然分子骨格に対して毒素成分を共有的に結合させることは、一群の様々な分子種の形成をもたらすが、その中において、毒素成分は、ＨＢｃＡｇの様々のシステイン残基に、または、場合によってはシステイン残基ではない、結合されるためである。言い換えれば、各ＨＢｃＡｇの各遊離システイン残基が、毒素成分に共有的に結合するわけではない。さらに、多くの場合、特定のＨＢｃＡｇのシステイン残基はいずれも毒素成分に結合されない。従って、毒素成分の存在は、それらが、分子の混合集団の中に存在するために検出が困難となることがある。しかしながら、ある個体に対して、毒素成分を含むＨＢｃＡｇを投与することは、重大な有害反応をもたらす可能性がある。
遊離システイン残基が、いくつかの化学的副反応に関与する可能性のあることは従来技術においてよく知られる。このような副反応としては、ジスルフィド交換、例えば、他の物質との併合治療において注入または形成された化学物質または代謝産物との反応、および、ＵＶ光暴露による核種との反応が挙げられる。特に、ＨＢｃＡｇは、核酸と結合する強い傾向を持つことを考えれば、有毒な付加物が生産される可能性がある。抗原−カプシド抱合体におけるこのような有毒産物の検出は、遊離システインおよびヘテロ二重機能性架橋リンカーを含むＨＢｃＡｇを用いて調製したカプシドでは困難であろう。なぜなら、広範囲の分子量を持つ、一連の分布の産物が生成されるからである。有毒付加物は、多数の分子種の間に分布し、それら分子種は個々にはそれぞれ低濃度で存在するが、一緒になると有毒レベルに達する。
前述の見地から、ワクチン組成物において、天然に存在するシステイン残基を除去するように修飾されたＨＢｃＡｇを使用することの利点の一つは、抗原または抗原決定基を非天然分子骨格に付着させる際に、有毒分子種が結合することのできる部位の数が減少させられる、または、全く取り除かれることである。さらに、高濃度の架橋リンカーを用いることによって、ＨＢｃＡｇモノマーから成る、複数の未定義の架橋分子種（すなわち、架橋されたＨｂｃＡｇモノマーから成る多種混合物）を生成するという欠点を被ることなく、高度に修飾された粒子を生産することが可能になる。
本発明の実施に用いて好適な、いくつかの天然のＨＢｃＡｇが既に特定されている。ユアン（Ｙｕａｎ）等（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２−１０１２８（１９９９））は、例えば、配列番号１の位置９７に対応する位置のイソロイシン残基が、ロイシン残基、または、フェニルアラニン残基のいずれかによって置換される変種を記述する。いくつかのＨＢｃＡｇ変種、および、いくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆物質変種のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ報告書、ＡＡＦ１２１２４０、ＡＦ１２１２３９、Ｘ８５２９７、Ｘ０２４９６、Ｘ８５３０５、Ｘ８５３０３、ＡＦ１５１７３５、Ｘ８５２５９、Ｘ８５２８６、Ｘ８５２６０、Ｘ８５３１７、Ｘ８５２９８、ＡＦ０４３５９３、Ｍ２０７０６、Ｘ８５２９５、Ｘ８０９２５、Ｘ８５２８４、Ｘ８５２７５、Ｘ７２７０２、Ｘ８５２９１、Ｘ６５２５８、Ｘ８５３０２、Ｍ３２１３８、Ｘ８５２９３、Ｘ８５３１５、Ｕ９５５５１、Ｘ８５２５６、Ｘ８５３１６、Ｘ８５２９６、ＡＢ０３３５５９、Ｘ５９７９５、Ｘ８５２９、Ｘ８５３０７、Ｘ６５２５７、Ｘ８５３１１、Ｘ８５３０１、Ｘ８５３１４、Ｘ８５２８７、Ｘ８５２７２、Ｘ８５３１９、ＡＢ０１０２８９、Ｘ８５２８５、ＡＢ０１０２８９、ＡＦ１２１２４２、Ｍ９０５２０、Ｐ０３１５３、ＡＦ１１０９９９、および、Ｍ９５５８９に開示される。これらそれぞれの開示を引用することにより本明細書に含める。これらのＨＢｃＡｇ変種は、いくつかの位置におけるアミノ酸残基において、配列番号１の位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２および１８３に配されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において異なる。
本発明の組成物に使用して好適で、かつ、本明細書の開示によって修飾されてもよい、さらに別のＨＢｃＡｇが、国際公開第ＷＯ００／１９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８、および、ＷＯ００／２１４４７８号に記述されている。これら全体を引用することによって本明細書に含める。
本発明に用いて好適なＨＢｃＡｇは、それらが連結して、規則的な反復性の抗原アレイを形成することが可能である限り、どの生物から得られたものであってもよい。一般に、加工処理されたＨＢｃＡｇ（すなわち、リーダー配列を欠如するもの）が、本発明のワクチン組成物には使用される。本発明は、ワクチン組成物のみならず、非天然分子骨格の調製のために前述のＨＢｃＡｇ変種を用いるそれら組成物の用法も含む。さらに、本発明の範囲内には、連結してダイマーまたはマルチマー構造を形成することが可能な、その他のＨＢｃＡｇ変種も含まれる。従って、本発明は、配列番号１、および、要すれば、Ｎ−末端リーダー配列を取り除くように処理された形の蛋白を含む、前記配列で示したアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または、約９９％同一のアミノ酸配列、を含む、または、から成るＨＢｃＡｇポリペプチドを含むワクチン組成を含む。
あるポリペプチドのアミノ酸配列が、前述のアミノ酸配列の一つ、または、その一部に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または、約９９％同一のアミノ酸配列であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ベストフィットプログラムを用いることによって好都合に確定することが可能である。ある特定の配列が、本発明による参照アミノ酸配列に対して、例えば、約９５％同一であるかどうかを確定するためにベストフィット、または、その他の配列合わせプログラムを用いる場合、同一性パーセントが、参照アミノ酸配列の全長に渡って計算され、かつ、参照配列のアミノ酸残基全数に対し最大５％までの相同性ギャップが許容されるようにパラメータが設定される。このようにして、配列番号１のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列と、他のＨＢｃＡｇ配列と比較することが可能である。比較的相似な蛋白同士を比較する場合には、配列番号１の特定位置に対応する位置に配される、ＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸残基を参照し、配列番号１に示すアミノ酸配列のその位置にあるアミノ酸残基を参照する。これらのＨＢｃＡｇ変種間の相同性は、Ｂ型肝炎ウィスルの間では、多くの場合、哺乳類に感染するほどに十分に高いものであるから、当業者であれば、配列番号１に示すアミノ酸配列と、ある特定のＨＢｃＡｇの配列の両方を点検して、「対応する」アミノ酸残基を特定するのにほとんど困難を覚えることはないであろう。例えば、配列番号１と、ウッドチャックに感染するウィルスから得られたＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を比較した場合、後者の配列には、配列番号１のアミノ酸残基１５５と１５６の間に、３個のアミノ酸残基から成る挿入体が存在することがすぐに明らかになる。
しかしながら、配列合わせが困難な場合、当業者であれば、配列の中の特定のアミノ酸またはモチーフの重要性を認識するであろう。例えば、ヒトウィルス由来のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、アヒルウィルスと、合わせるのが困難なほど異なっているが、当業者であれば、保存されたシステイン残基は、本発明のワクチン組成に含める前に、他のアミノ酸残基によって置換するか、または、欠失させることが可能であることを認識するであろう。
一つの実施態様では、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白の４８と１０７位置におけるシステイン残基は、欠失されるか、別のアミノ酸残基によって置換されるが、６１位置のシステインはそのまま残される。さらに、この修飾されたポリペプチドが、本発明のワクチン組成物を調製するのに使用される。
本発明のために使用が可能な、好ましいＢ型肝炎ウィルス様粒子の調製法が、例えば、国際公開第ＷＯ００／３２２２７号に、特に、実施例１７から１９、および、２１から２４に開示されている。また、国際公開第ＷＯ０１／８５２０８号に、特に、実施例１７から１９、２１から２４、３１と４１に、かつ、国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号に開示されている。後者の出願では、特に、実施例２３、２４、３１および５１が参照される。これらの文書を全て引用することにより本明細書に含めることを明言する。
後述するように、国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号の実施例３１では、溶媒に接触可能な４８および１０７位置のシステイン残基が、例えば、部位指向性突然変異によって取り除かれる。さらに、この発明者達は、国際公開ＷＯ０２／０５６９０５号（この全体を引用することにより本明細書に含める）に記述するように構築した、Ｃｙｓ−４８−Ｓｅｒ，Ｃｙｓ−１０７−Ｓｅｒ ＨＢｃＡｇ二重突然変異株が、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）において発現が可能であることを見出した。
前述したように、遊離システイン残基の除去は、有毒成分がＨＢｃＡｇに結合する可能性のある部位の数を減らし、さらに、同じまたは隣接ＨＢｃＡｇ分子のリシンとシステイン残基同士の架橋結合の起こる可能性のある部位を除去することになる。６１位置のシステインは、ダイマー形成に関与し、別のＨＢｃＡｇの６１位置のシステインとジスルフィド架橋を形成するものであるが、これは、本発明のＨＢｃＡｇダイマーおよびマルチマーの安定化のために、通常は、そのまま残される。（１）遊離システイン残基を含むＨＢｃＡｇ、および、（２）遊離システイン残基を、ヨードアセタミドによって無反応性としたＨＢｃＡｇを用いて実施した架橋実験から、ＨＢｃＡｇの遊離システイン残基が、ＨＢｃＡｇ同士の架橋を担当していることが示された。すなわち、ヘテロ二重機能性架橋リンカー由来のリシン側鎖と、遊離システイン残基の間の反応によって架橋が形成された。さらにまた、ＨＢｃＡｇサブユニット同士の架橋結合は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解されない、未定義の大きさの高分子量分子種の形成をもたらすことが判明した。
抗原または抗原決定基を、リシン残基を介して非天然分子骨格に結合させる場合、配列番号１の７および９６位置に相当する位置に天然に存在するリシン残基の内の一つ、または、両方を、および、ＨＢｃＡｇ変種に存在するその他のリシン残基を、置換または欠失させることは有利である可能性がある。これらリシン残基を除去することは、規則的なアレイを破壊する可能性のある抗原または抗原決定基の結合部位を除去することになるから、最終的なワクチン組成の品質性と均一性を向上させることになる。
多くの場合、配列番号１の７および９６位置に対応する位置の、天然に存在するリシン残基の両方を除去する場合、別のリシンが、抗原または抗原決定基の付着部位としてＨＢｃＡｂに導入される。このようなリシン残基の挿入法が、例えば、国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号の実施例２３に記載される。この開示の全体を引用することにより本明細書に含める。配列番号１の７および９６位置に対応する位置に天然に存在するリシン残基の両方を変更し、かつ、ヘテロ二重機能性架橋結合媒介物を用いて、抗原または抗原決定基を非天然分子骨格に付着させようとする場合、リシン残基をＨＢｃＡｇに導入するのが有利である。
ＨＢｃＡｇのＣ末端は、この蛋白の核局在を指示することが明らかにされている（エックハルト（Ｅｃｋｈａｒｄｔ）等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７５−５８２（１９９１））。さらに、蛋白のこの領域は、ＨＢｃＡｇに、核酸に結合する能力を付与すると考えられている。
いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、核酸結合活性を持つＨＢｃＡｇ（例えば、天然に存在するＨＢｃＡｇ核酸結合ドメインを含むもの）を含む。１個以上の核酸結合ドメインを含むＨＢｃＡｇが、強化されたＴ細胞刺激活性を示すワクチン組成物を調製するには有用である。従って、本発明のワクチン組成物は、核酸結合活性を持つＨＢｃＡｇを含む組成物を含む。さらに、ワクチン組成物の他に、ＨＢｃＡｇが核酸に結合されるワクチンプロトコールにおけるそのような組成物の使用法も含まれる。上記ＨＢｃＡｇは、個体への投与前に、核酸に結合してもよいし、投与後に核酸に結合してもよい。
本発明の実施の際に用いると好適な、その他のＨＢｃＡｇは、Ｎ−およびＣ−末端平滑化突然変異株、および、そのアミノ酸配列が、前記平滑化突然変異株に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または、約９９％同一であるアミノ酸配列、を含む、または、から成る。
前述したように、本発明のいくつかの実施態様では、一つのリシンが、第１付着部位として、非天然分子骨格を形成するポリペプチドに導入される。好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物は、修飾された配列番号１であって、位置７９と８０に対応するアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１１）から成るアミノ酸配列を有するペプチドで置換され、位置４８と１０７のシステイン残基が除去されるか、他のアミノ酸残基によって置換されるかし、一方、位置６１のシステインはそのまま残されるように修飾された配列番号１の、アミノ酸１−１４４、または、アミノ酸１−１４９、または、アミノ酸１−１８５、を含む、または、から成るＨＢｃＡｇを用いて調製される。
本発明はさらに、配列番号１に示したものとは異なるアミノ酸配列であって、配列番号１の対応位置に存在しないシステイン残基が除去されるアミノ酸配列、を含む、または、から成る、ＨＢｃＡｇの断片を含む。
本発明のワクチン組成物は、異なる複数のＨＢｃＡｇの混合物を含む。従って、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列の異なるＨＢｃＡｇから成ってもよい。例えば、ワクチン組成物は、「野生型」のＨＢｃＡｇ、および、１個以上のアミノ酸残基が変更された（例えば、欠失、挿入または置換された）修飾ＨＢｃＡｇを含むように調製することも可能である。本発明はさらに、他の蛋白に融合されたＨＢｃＡｇを用いて非天然分子骨格が調製されたワクチン組成を含む。前述したように、このような融合蛋白の一つの例はＨＢｃＡｇ／ＦＯＳ融合である。本発明のワクチン組成物に使用して好適なＨＢｃＡｇ融合蛋白のその他の例としては、ＨＢｃＡｇダイマーおよびマルチマーの形成および／または安定化を助けるアミノ酸配列が添加された融合蛋白が挙げられる。この、追加のアミノ酸配列は、ＨＢｃＡｇのＣ−末端に融合されてもよい。このような融合蛋白の一つの例は、ＨＢｃＡｇと、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセスセレビシエ、酵母）のＧＣＮ４螺旋との融合である。これは、ＨＢｃＡｇダイマーおよびマルイマーを調製・安定化するのに使用が可能な、非共有的相互作用によってホモダイマーを形成する。
一つの実施態様では、本発明は、ＨＢｃＡｇまたはその断片を含むＨＢｃＡｇ融合蛋白であって、ＧＣＮ４ポリペプチド（ＰＡＡＬＫＲＡＲＮＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ（配列番号１２））がそのＣ末端に融合される融合蛋白を用いて調製されるワクチン組成物を提供する。このＧＣＮ４ポリペプチドはまた、ＨＢｃＡｇのＮ−末端に融合させてもよい。
本発明のワクチン組成物を調製するのに、ＨＢｃＡｇ／ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメイン融合蛋白を使用することも可能である。ＳＨ３ドメインは、蛋白結合パートナーの特異的なプロリン富裕配列と相互作用を持つ能力を与えるいくつかの蛋白に見られる比較的小型のドメインである（マックファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，１１：２２９−２３８（１９９９））。ＨＢｃＡｇ／ＳＨ３はいくつかの方法で使用が可能である。先ず、ＳＨ３は、抗原または抗原決定基の第２付着部位と相互作用を持つ第１付着部位を形成することが可能である。同様に、プロリン富裕アミノ酸配列をＨＢｃＡｇに付加して、抗原または抗原決定基のＳＨ３ドメイン第２付着部位に対する第１付着部位として用いることも可能である。第二に、ＳＨ３は、ＨＢｃＡｇに導入されたプロリン富裕領域と連結することが可能である。従って、ＳＨ３ドメインとプロリン富裕ＳＨ３相互作用部位を、同じまたは異なるＨＢｃＡｇのいずれかに挿入し、これを用いて、本発明のダイマーおよびマルチマーを形成・安定化させることが可能である。
前述の例によって実証されたように、当業者ならば、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ由来ムテインから、どのようにしてコア粒子と第１付着部位を含む分子骨格を形成したらよいかを知るであろう。従来技術で既知の技術と通例の実験手法を用いることによって、通常の錬度を持つ当業者ならば、どうしたら他のウィルスを使って同様に分子骨格を形成したらよいかを理解するであろう。
本明細書の他の場所で示したように、ウィルスカプシドは、（１）ハプテンの提示のために、かつ、（２）本発明のワクチン組成物の調製のために使用される。特に、本発明の実施にとって有用なのは、本明細書では「コート蛋白」とも呼ばれる、ウィルスカプシド蛋白であり、これは、発現されると、カプシドまたはカプシド様構造を形成する。従って、これらカプシド蛋白は、コア粒子と非天然分子骨格を形成することが可能である。一般に、これらカプシドまたはカプシド様構造は、ハプテン決定基の提示、および、本発明のワクチン組成物の調製に使用が可能な、規則的な反復性のアレイを形成する。
１個以上の（例えば、１、２、３、４，５個等）ハプテンを、いくつかの手段の内のどれかを用いて、ウィルスのカプシドまたはカプシド様構造（例えば、バクテリオファージコート蛋白）を形成する蛋白、また、その他の蛋白の１種以上（例えば、１，２，３，４，５種等）に対して付着させる。例えば、複数のハプテンが、第１および第２付着部位を用いてコア粒子に付着される。さらに、１個以上の（例えば、１、２、３、４、５等）のヘテロ二重機能架橋リンカーを用いて、複数のハプテン決定基を、ウィルスカプシドまたはカプシド様構造を形成する１種以上の蛋白に付着させることが可能である。
ウィルスカプシド蛋白またはその断片を用いて、例えば、本発明のコア粒子およびワクチン組成を調製することが可能である。バクテリオファージＱβコート蛋白は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組み換え技術を用いて発現させることが可能である。さらに、このように発現されると、これらの蛋白は自発的に、ウィルス様粒子であるカプシドを形成する。それに加えて、これらのカプシドは、ハプテン提示および本発明の組成物の調製に使用が可能な、規則的な反復性の抗原アレイを形成する。実施例１に後述するように、バクテリオファージＱβコート蛋白を用いてハプテンに対して免疫反応を惹起するワクチン組成物を調製することが可能である。
好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換え蛋白またはその断片、を事実上含む、または、から成る。好ましくは、ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ，ｆ）バクテリオファージＭＳ２，ｇ）バクテリオファージＭ１１，ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および、ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５から成るグループから選ばれる。
本発明の別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＱβの、または、ＲＮＡファージｆｒの、または、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え蛋白またはその断片、を含む、事実上から成る、または、から成る。
本発明のさらに好ましい実施態様では、組み換え蛋白は、ＲＮＡファージのコート蛋白、を含む、または、事実上から成る。
本発明の組成物の調製に使用が可能なバクテリオファージコート蛋白の具体例としては、ＲＮＡバクテリオファージの下記のようなコート蛋白が挙げられる。すなわち、バクテリオファージＱβ（配列番号３、ＰＩＲデータベース、アクセス番号、Ｑβ ＣＰに関してＶＣＢＰＱＢ、および、配列番号４、アクセス番号、Ｑβ Ａ１蛋白に関してＡＡＡ１６６６３）、バクテリオファージＲ１７（配列番号２４、ＰＩＲアクセス番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号２５、ＰＩＲアクセス番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号２６、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号２７、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号、ＳＰ ＣＰに関してＣＡＡ３０３７４、および、配列番号２８、アクセス番号、ＳＰ Ａ１蛋白に関してＮＰ６９５０２６）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号２９、ＰＩＲ、アクセス番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号３０、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号、ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号３１、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号３２、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号３３、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号１３）、バクテリオファージＡＰ２０５（配列番号１４）である。当業者であればすぐに認識するように、カプシドまたはカプシド様構造を形成する蛋白であればどのような蛋白でも、本発明のワクチン組成物の調製に使用が可能である。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１蛋白（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセス番号ＡＡＡ１６６６３（配列番号４））、または、そのＣ末端から約１００、約１５０、または、約１８０個ものアミノ酸を欠失させた、Ｃ末端平滑形も、Ｑβコート蛋白のカプシドアッセンブリーの中に取り込むことが可能である。このＡ１蛋白はまた、第２付着部位を含むハプテンの付着のための、第１付着部位を含む要素に融合されてもよい。一般に、カプシドアッセンブリーにおいて、Ｑβ ＣＰに対するＡ１蛋白のパーセンテージは、カプシド形成を確保するために、限られる。
Ｑβコートは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されるとカプシドに自発的に組み上がることが判明している（コズロフスカ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ）ＴＭ等、Ｇｅｎｅ、１３７：１３３−１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウィルス様粒子は、直径２５ｎｍおよびＴ＝３の擬似対称性を持つ正二十面体のファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造も解決されている。カプシドは、コート蛋白の１８０コピーを含み、これらは、ジスルフィド架橋によって共有的なペンタマーとヘキサマーとして結合される（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ）Ｒ等、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４：５４３−５５５４（１９９６））。その他のＲＮＡファージコート蛋白も、細菌宿主における発現の際に自発的組み立てを行うことが示されている（カステライン（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ）ＲＡ等、Ｇｅｎｅ，２３：２４５−２５４（１９８３）、コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）ＴＭ等、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ、２８７：４５２−４５５（１９８６）、アジン（Ａｄｈｉｎ）ＭＲ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：２３８−２４２（１９８９）、ニー（Ｎｉ）ＣＺ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：２４８５−２４９３（１９９６）、プリアーノ（Ｐｒｉａｎｏ）Ｃ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３−２９７（１９９５））。Ｑβファージカプシドは、コート蛋白の他に、所謂読み過ごし蛋白Ａ１および熟成蛋白Ａ２を含む。Ａ１は、ＵＧＡ終止コドンにおける抑圧によって生成され、３２９ａａの長さを持つ。本発明で使用されるファージＱβ組み換えコート蛋白のカプシドは、Ａ２溶解蛋白を欠如し、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコート蛋白は、ＲＮＡ結合蛋白であり、ウィルスの生活環において翻訳リプレッサーとして働くレプリカーゼ遺伝子の、リボソーム結合部位の主幹ループと相互作用を持つ。この相互作用の配列と構造要素は既知である（ウィザレル（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ）ＧＷおよびウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）ＯＣ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：７１−７６（１９８９）、リム（Ｌｉｍ）Ｆ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９−３１８４５（１９９６））。この主幹ループとＲＮＡは、全体として、ウィルス集合・組み立てに関与することが知られている（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ）Ｒ．等、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４：５４３−５５５４（１９９６））。
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されると、Ｑβコート蛋白のＮ末端メチオニンは、通常は除去される。これは、ストール（Ｓｔｏｌｌ）Ｅ．等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０−９９３（１９７７）に記述される、Ｎ末端のＥｄｍａｎ配列において観察されている方法と同じである。Ｎ末端メチオニンが除去されているＱβコート蛋白から構成されるＶＬＰ、または、Ｎ末端メチオニンが分断される、または、存在するＱβコートの混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
本発明による、さらに好ましい、ＲＮＡファージの、特に、Ｑβの、ウィルス様粒子が国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号に開示されている。この開示の全体を引用することにより本明細書に含める。
さらに、ＲＮＡファージコート蛋白も、細菌宿主において発現されると自発的に組み上がることが示されている（カステライン（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ）ＲＡ等、Ｇｅｎｅ，２３：２４５−２５４（１９８３）、コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）ＴＭ等、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ２８７：４５２−４５５（１９８６）、アジン（Ａｄｈｉｎ）ＭＲ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：２３８−２４２（１９８９）、ニー（Ｎｉ）ＣＺ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：２４８５−２４９３（１９９６）、プリアーノ（Ｐｒｉａｎｏ）Ｃ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３−２９７（１９９５））。Ｑβファージカプシドは、コート蛋白の他に、所謂読み過ごし蛋白Ａ１と熟成蛋白Ａ２を含む。Ａ１は、ＵＧＡ終止コドンにおける抑圧によって生成され、３２９ａａの長さを持つ。本発明で使用されるファージＱβ組み換えコート蛋白のカプシドは、Ａ２溶菌蛋白を欠如し、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコート蛋白は、ＲＮＡ結合蛋白であり、ウィルスの生活環において翻訳リプレッサーとして働くレプリカーゼ遺伝子の、リボソーム結合部位の主幹ループと相互作用を持つ。この相互作用の配列と構造要素は既知である（ウィザレル（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ）ＧＷおよびウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）ＯＣ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：７１−７６（１９８９）、リム（Ｌｉｍ）Ｆ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９−３１８４５（１９９６））。この主幹ループとＲＮＡは、全体として、ウィルス集合・組み立てに関与することが知られている（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ）Ｒ．等、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４：５４３−５５５４（１９９６））。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換え蛋白またはその断片を含む、その断片から事実上構成される、または、その断片から構成される。この場合、組み換え蛋白は、ＲＮＡファージの変異コート蛋白、を含む、事実上から成る、または、から成る。別の好ましい実施態様では、変異コート蛋白は、少なくとも一のリシン残基を、より好ましくは少なくとも２個のリシン残基を、置換によって除去することによって、または、置換によって少なくとも一のリシン残基を付加することによって、修飾される。別態様として、変異コート蛋白は、少なくとも一のリシン残基を、より好ましくは少なくとも２個のリシン残基を、置換によって除去することによって、または、少なくとも一のリシン残基を、より好ましくは少なくとも２個のリシン残基を、挿入によって付加することによって、修飾される。
別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組み換え蛋白またはその断片、を含む、事実上から成る、または、から成る。この場合、組み換え蛋白は、配列番号３のアミノ酸配列を有するコート蛋白、または、配列番号３および、配列番号４または配列番号４の突然変異体のアミノ酸配列を持つコート蛋白同士の混合物であって、Ｎ末端のメチオニンが好ましくは分断される蛋白を含む、蛋白から事実上構成される、または、蛋白から構成される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換え蛋白またはその断片を含む、事実上それから構成される、または、それから構成される。この場合、組み換え蛋白は、突然変異Ｑβコート蛋白を含む、事実上それから構成される、または、それから構成される。別の好ましい実施態様では、変異コート蛋白は、少なくとも一のリシン残基を、置換によって除去することによって、または、置換によって少なくとも一のリシン残基を付加することによって、修飾される。別態様として、変異コート蛋白は、少なくとも一のリシン残基を、欠失することによって、または、少なくとも一のリシン残基を、挿入によって付加することによって、修飾される。
Ｑβコート蛋白から成るカプシド表面には４個のリシン残基が露出する。露出リシン残基がアルギニンに置換されたＱβ突然変異株も、本発明に使用が可能である。下記のＱβコート突然変異株およびＱβ ＶＬＰも従って本発明の実施において使用が可能である。すなわち、「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ，配列番号６）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ，配列番号７）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ，Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ，配列番号８）、「Ｑβ−２５１」（配列番号９）、および、「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ，Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ，配列番号１０）。従って、本発明のさらに好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、変異Ｑβコート蛋白の組み換え蛋白であって、ａ）配列番号６のアミノ酸配列、ｂ）配列番号７のアミノ酸配列、ｃ）配列番号８のアミノ酸配列、ｄ）配列番号９のアミノ酸配列、および、ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列から成るグループから選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白を含む組み換え蛋白を含む、蛋白から事実上構成される、または、蛋白から構成される。前述のＱβコート蛋白、変異Ｑβコート蛋白ＶＬＰ、および、カプシド、それぞれの、構築、発現および精製は国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号に記述される。このことに関連して、特に前述の出願の実施例１８を参照されたい。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換え蛋白、または、その断片を含む、事実上それから構成される、または、それから構成される。この場合、組み換え蛋白は、前述のＱβ突然変異株および対応するＡ１蛋白の内のいずれか一つの混合物を含む、事実上混合物から構成される、または、混合物から構成される。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え蛋白またはその断片を含む、事実上それから構成される、または、それから構成される。
ＡＰ２０５のゲノムは、熟成蛋白、コート蛋白、レプリカーゼ、関連ファージには無い２個のオープンフレーム、溶菌遺伝子、および、熟成蛋白の翻訳に一役演じるオープンフレームから成る（クロービンズ（Ｋｌｏｖｉｎｓ）Ｊ．等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３−３３（２００２））。ＡＰ２０５のコート蛋白は、ｐＱｂ１０の誘導体であり（コズロフスカ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ）Ｔ．Ｍ．等、Ｇｅｎｅ，１３７：１３３−３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号１５）から発現させることが可能である。別に、ＡＰ２０５は、ｐＱｂ１８５に導入し、同ベクターのリボソーム結合部位の下流においてクローンしてもよい。どちらの方法でも、実施例１０で記述する通りの蛋白の発現およびカプシド形成が実現される。ベクターｐＱｂ１０とｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクターから誘導されたベクターであり、これらのベクターでクローンされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御される（コズロフスカ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ）Ｔ．Ｍ．等、Ｇｅｎｅ，１３７：１３３−３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号１５）は、下記の配列において、ＸｂａＩ部位の下流で、ＡＰ２０５コート蛋白のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に、ＡＰ２０５リボソーム結合部位と考えられる部位を含む。その配列は、ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ（配列番号１６）。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流で、開始コドンの上流にシャインダルガルノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧ ＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ（配列番号１７）、シャインダルガルノ配列には下線を施す）。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート蛋白またはその断片、を含む、事実上から成る、または、から成る。
従って、本発明の、この好ましい実施態様は、カプシドを形成するＡＰ２０５コート蛋白を含む。この蛋白は、組み換え技術によって発現される、または、天然供給源から調製される。細菌において自発性に生産されるＡＰ２０５コート蛋白は、電子顕微鏡検査（ＥＭ）および免疫核酸によって裏付けられるように、カプシドを形成する。ＡＰ２０５コート蛋白（配列番号１４）によって形成されるカプシドの構造的特徴、および、ＡＰ２０５ＲＮＡファージのコート蛋白の構造的特徴は、ＥＭで観察するとほとんど区別がつかない。ＡＰ２０５のＶＬＰは極めて免疫原性が高く、抗原および／または抗原決定基と結合すると、抗原および／または抗原決定基を反復的に提示するワクチン構築体を形成することが可能である。このように提示される抗原に対しては高い抗体価が誘発されるが、これは、結合抗原および／または抗原決定基が、抗体分子と接触して相互作用を持つようになっていて、免疫原性を持つことを示す。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異コート蛋白またはその断片、を含む、から本質的に成る、または、から成る。
アミノ酸５におけるプロリンをトレオニンに置換したＡＰ２０５コート蛋白（配列番号１８）を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの組み上げ可能な突然変異形も本発明の実施に使用が可能であり、本発明のさらに別の好ましい実施態様をもたらす。これらのＶＬＰ、天然起源から得られたＡＰ２０５ ＶＬＰ、または、ＡＰ２０５ウィルス粒子は抗原に結合すると、本発明に従って抗原の規則的な反復性のアレイを生産する。
ＡＰ２０５ Ｐ５−Ｔ変異コート蛋白は、ｐＱｂ１８５から直接得られ、かつ、Ｑβコート蛋白遺伝子の代わりに変異ＡＰ２０５コート蛋白遺伝子を含むプラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号１９）から発現させることが可能である。ＡＰ２０５コート蛋白発現用ベクターは、そのＡＰ２０５コート蛋白の発現のためにＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトされる。
それぞれコート蛋白および変異コート蛋白を発現させ、ＶＬＰに自発的に組み上げるための方法が、実施例９および１０に記述される。適当なＥ．ｃｏｌｉ株としては、Ｅ．ｃｏｌｉＫ８０２，ＪＭ１０９、ＲＲ１が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。適当なベクター、株、および、それらの組み合わせは、それぞれコート蛋白および変異コート蛋白の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験し、さらに、カプシド形成および組み立てを、要すれば先ずカプシドをゲルろ過によって精製し、次に、免疫拡散アッセー（オクタロニー試験）または電子顕微鏡検査（コズロフスカ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ）Ｔ．Ｍ．等、Ｇｅｎｅ，１３７：１３３−３７（１９９３））によって調べることによって特定することが可能である。
ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現させたＡＰ２０５コート蛋白は、Ｅ．ｃｏｌｉ原形質の処理によって、最初のメチオニンアミノ酸を欠如することがある。ＡＰ２０５ ＶＬＰの分断形、または、非分断形、または、それらの混合物は、本発明のさらに別の好ましい実施態様である。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート蛋白またはその断片、および、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異コート蛋白またはその断片の混合物、を含む、事実上から成る、または、から成る。
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート蛋白または組み換え変異コート蛋白の断片、を含む、事実上から成る、または、から成る。
それぞれ、ＶＬＰおよびカプシドに集結・組立が可能な組み換えＡＰ２０５コート蛋白断片も、本発明の実施において有用である。これらの断片は、それぞれ、コート蛋白および変異コート蛋白の内部における、または、末端における欠失によって生成されてもよい。コート蛋白および変異コート蛋白配列の中への抗原配列の挿入、または、コート蛋白および変異コート蛋白配列への抗原配列の融合であって、ＶＬＰへの集結・組立と適合する挿入・融合も、本発明のさらに別の実施態様であり、これらは、それぞれ、キメラＡＰ２０５コート蛋白および粒子の実現をもたらす。コート蛋白に対する挿入、欠失および融合の結果、および、それがＶＬＰへの集結・組立と適合するかどうかは、電子顕微鏡検査によって確定することが可能である。
前述の、ＡＰ２０５コート蛋白、コート蛋白断片およびキメラコート蛋白によって形成される粒子は、画分工程と沈殿との組み合わせ、および、精製工程と、例えば、セファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラムによるゲルろ過との組み合わせ、および、それらの組み合わせによって純粋な形として単離することが可能である。ウィルス様粒子の、その他の分離法は従来技術で既知であり、それらを用いて、バクテリオファージＡＰ２０５のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することが可能である。例えば、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離するために超遠心を用いる用法が、米国特許第４，９１８，１６６号に記述される。この全体を引用することにより本明細書に含める。
本発明によれば、１個以上のハプテンを、ＲＮＡファージコート蛋白のカプシドの１個のサブユニットに付着させてよい。ＲＮＡファージのコート蛋白から成るカプシド、特に、Ｑβカプシドのサブユニット１個当たり数個のハプテンを結合させることができると、それは、高密度のハプテンアレイの生成を可能とする。ハプテンを、例えば、主要免疫優勢領域（ＭＩＲ，国際公開第ＷＯ００／３２２２７号）のリシン残基を持つように修飾されたＨＢｃＡｇのように、化学架橋によって、ハプテンを共有的に付着させる場合には、その他のウィルスカプシドの使用も可能である。ＨＢｃＡｇのスパイク（ＭＩＲに対応）間の距離は５０オングストローム（ワイン（Ｗｙｎｎｅ）ＳＡ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，３：７７１−７８０（１９９９））であり、従って、５０Ａよりも短い距離を持つハプテンアレイを生成することはできない。
Ｑβコート蛋白のカプシドは、その表面にある一定の数のリシン残基を提示し、かつ、３個のリシン残基をカプシドの内方に向けて、ＲＮＡと相互作用を持つようにし、他の４個のリシンは、カプシドの外方に露出するような一定の空間配置を持つ。これらの定められた性質は、ハプテンを粒子の外側に付着させるには好都合であるが、リシン残基がＲＮＡと相互作用を持つ内部に対しては好都合ではない。他のＲＮＡファージコート蛋白のカプシドも、その表面に一定数のリシン残基を持ち、また、これらリシン残基の一定の空間配置を持つ。ＲＮＡファージから得られるカプシドに関する別の利点は、細菌におけるそれらの発現歩留まりの高さであり、これは、何とか賄えるコストで大量の材料の生産を可能とする。
Ｑβコート蛋白のカプシドのさらに別の特質は安定性である。Ｑβサブユニットは、互いに、サブユニット同士を共有的に結合するジスルフィド架橋によって結合されている。Ｑβカプシド蛋白はまた、有機溶媒や変性剤に対して異常な耐性を示す。驚くべきことに、我々は、約３０％もの高濃度のＤＭＳＯやアセトニトリル、約１Ｍもの高濃度のグアニジニウムでも、安定性や、カプシドのハプテンアレイ形成能に影響を及ぼすことなく使用が可能であることを観察した。従って、これらの有機溶媒を使用して、疎水性分子、例えば、ホルモン、薬剤および毒素を結合させることが可能である。Ｑβコート蛋白カプシドの高い安定性は、哺乳類、特にヒトの免疫化およびワクチン接種に関連して重要な特質である。カプシドの有機溶媒に対する耐性によって、水性バッファーに溶解しないハプテン同士の結合が可能になる。
ＲＮＡファージＭＳ−２のコート蛋白のＮ末端βヘアピンにシステイン残基を挿入することが米国特許第５，６９８，４２４号に記述されている。この全体を、引用することにより本明細書に含める。しかしながら、我々は、カプシドに遊離システイン残基が露出しているために、ジスルフィド架橋形成によって、カプシドのオリゴマー化が起こることを認めた。前記米国特許で考察されているその他の付着法は、抗原とＱβ粒子の間のジスルフィド架橋形成を含む。このような付着は、スルフヒドリル機能基含有分子に対して不安定である。
Ｑβ上のシステイン残基によって形成される最初のジスルフィド架橋と、遊離スルフヒドリル残基を含む抗原との間の相互作用により、ハプテン以外のスルフヒドリル含有分子種が放出される。これらの新規に形成されたスルフヒドリル含有分子種は、再び、粒子上に存在する他のジスルフイド架橋と反応し、このようにして平衡を確立する。粒子上に形成されるジスルフィド架橋と反応する際に、ハプテンは、粒子のシステイン残基と、または、その粒子において最初のジスルフィド架橋を形成したが、今や去りつつある基分子のシステイン残基と、ジスルフィド架橋を形成する。さらに、記述される他の付着法、すなわち、ヘテロ二重機能性架橋リンカーであって、一方は、Ｑβ粒子のシステインと反応し、他方は抗原のリシン残基と反応するリンカーでは、抗原の粒子に対する方向性がでたらめになる。
我々はさらに、ＱβおよびＦｒコート蛋白のカプシドと違って、米国特許第５，６９８，４２４号に記述される組み換えＭＳ−２は、事実上核酸から遊離し、一方、ＲＮＡは、前述の２個のカプシドの内部にパッケージされていることを認めた。
我々は、様々のハプテン濃度を持つ、頑丈なハプテンアレイの形成を可能とする、新規の発明組成物を記述する。我々は、ハプテンをＶＬＰに付着させることによって極めて高いエピトープ密度が実現されることを示す。さらに、ハプテンの密度および間隔は、適当な第１付着部位を有する残基の数とタイプに変更をもたらすことによって修飾が可能である。例えば国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号は、野生型Ｑβコート蛋白で観察されるものよりも高い密度のアレイを入手するのに好適な、さらにリシン残基を追加したＱβ変異コート蛋白を開示する。さらに、前述の出願は、いくつかのハプテンを適当な間隔を置いて同時提示するのに適当な組成物、および、副分子を添加すると、適当な好ましいやり方で可溶性を強調し、あるいは、カプシドを修飾する組成物を開示する。ウィルス様粒子であるカプシドを形成する、その他のＱβコート蛋白変異が国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５に開示されているが、これは、本発明の組成物の生成にも好適である。特に、ハプテンおよびＱβハプテン抗原アレイの可溶性が、Ｑβウィルス様粒子に付着されるハプテン残基の数に制限を課すような場合には、リシン残基が、リシン残基と同じ反応性を持たないアルギニンに置換された突然変異株を使用することが可能である。これらの組成物を調製する場合には、高濃度のハプテン、または、第２付着部位を含むように修飾されたハプテンを用いることによって、野生型Ｑβウィルス様粒子を用いた場合に見られるような、高い数の付着ハプテンを持つが不溶性となり得る粒子を生成することなく、変異Ｑβウィルス様粒子上のリシン残基において完全な反応を実行することが可能である。
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が確定されている（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ）Ｒ．等、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４：５４３−５５４（１９９６））。この情報を用いて、当業者ならば、簡単に表面露出残基を特定し、１個以上の反応性アミノ酸残基を挿入可能となるようにバクテリオファージコート蛋白を修飾することが可能であろう。従って、当業者ならば、本発明の実施に使用が可能なバクテリオファージコート蛋白の修飾形を簡単に生成し、特定することが可能であろう。従って、カプシドまたはカプシド様構造（例えば、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７，バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ，バクテリオファージＳＰ、および、バクテリオファージＭＳ２のコート蛋白）を形成する蛋白の変種を用いても、本発明のワクチン組成物を調製することは可能であろう。
前述の蛋白変種の配列は、野生型配列とは異なるけれども、その変種蛋白は、一般に、カプシドまたはカプシド様構造を形成する能力を保持する。従って、本発明はさらに、ワクチン組成物の調製法、ワクチン組成物を調製するのに使用される個々の蛋白サブユニットのみならず、カプシドまたはカプシド様構造を形成する蛋白の変種を含むワクチン組成物をも含む。従って、本発明の範囲に含まれるものは、規則的な反復性のハプテンアレイを形成し、かつ、カプシドまたはカプシド様構造を連結・形成する能力を保持する、野生型蛋白の変形物（例えば、カプシドまたはカプシド様構造を形成する蛋白の変種）である。通常、ＣおよびＮ末端平滑化変種は、粒子様ウィルスを形成する能力を保持する。そのため、欠失、付加または置換、キメラ形、天然に起こる変種を含む変形体は、本発明の好適な成分である。
細菌線毛およびピリン蛋白。別の実施態様では、本発明のコア粒子は、細菌線毛または線毛様粒子、を含む、または、好ましくはから成る。このピリ粒子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．および、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａを含む生物によって生産される。一つの好ましい実施態様では、ピリン蛋白またはその断片は、ａ）１型ピリン蛋白、ｂ）Ｐ−ピリン蛋白から成るグループから選ばれる。別の実施態様では、ピリン蛋白は組み換え蛋白であり、または、線毛または線毛様粒子は、組み換え蛋白と非組み換え蛋白の混合物を含む。さらに別の実施態様では、この線毛または線毛様粒子は、Ｉ型ピリン蛋白またはその一部を含む。さらに別の実施態様では、ピリン蛋白は、変異蛋白であり、好ましくは、少なくとも一のリシン残基が、置換によって、置換による少なくとも一のリシン残基の付加によって、少なくとも一のリシン残基の欠失によって、または、挿入による少なくとも一のリシン残基の付加によって、除去されることによって修飾される。一つの好ましい実施態様では、Ｉ型ピリン蛋白は、配列番号２に記述されるアミノ酸配列を有する。さらに別の局面では、本発明は、コア粒子が細菌の線毛または線毛様粒子、を含む、または、好ましくはから成る、本発明の抱合体、および、製薬的に受容可能な担体を含む組成物を提供する。
別の実施態様では、細菌ピリン、細菌ピリンの一部、または、細菌ピリンまたはその一部を含む融合蛋白を用いて、本発明のワクチン組成物を調製する。ピリン蛋白の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、および、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって生産されるピリンが挙げられる。本発明による使用が好適なピリン蛋白のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ報告書ＡＪ０００６３６、ＡＪ１３２３６４、ＡＦ２２９６４６、ＡＦ０５１８１４、ＡＦ０５１８１５，および、Ｘ００９８１に記述されている。これらの全体開示を、引用することにより本明細書に含める。
細菌のピリン蛋白は、一般に処理されて、同蛋白を細菌の原形質辺縁に輸送する前に、Ｎ末端のリーダー配列が除去される。さらに、当業者ならば認識されるように、本発明のワクチン組成物を調製するのに用いられる細菌のピリン蛋白は、一般に天然にあるリーダー配列を持たない。
本発明に用いて好適なピリン蛋白の一つの具体的例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰ−ピリンである（ＧｅｎＢａｎｋ報告書ＡＦ２３７４８２）。本発明に用いて好適なＥ．ｃｏｌｉの１型ピリンは、ＧｅｎＢａｎｋ報告書Ｐ０４１２８に記述されるアミノ酸配列（配列番号２）を持つピリンである。これは、ＧｅｎＢａｎｋ報告書Ｍ２７６０３に記述されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる。これらのＧｅｎＢａｎｋ報告書の全開示を、引用することによって本明細書に含める。上に参照した蛋白の成熟形の場合も、一般に、本発明のワクチン組成物の調製に使用が可能である。
本発明の実施に用いて好適な細菌ピリンまたはピリン部分は、一般に、連結して非天然の分子骨格を形成することが可能である。インビトロにおいて線毛および線毛様構造を調製する方法は従来技術で既知である。例えば、バリット（Ｂｕｌｌｉｔｔ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１２８９０−１２８９５（１９９６）は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰ−線毛サブユニットの再構築を記述する。さらに、エシュダット（Ｅｓｈｄａｔ）等（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８：３０８−３１４（１９８１））は、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛の解離、および、線毛の再構築に好適な方法を記述する。手短に言うと、これらの方法は下記のようになる。線毛を、飽和塩酸グアニジンにて３７℃でインキュベーションして解離する。次に、ピリン蛋白をクロマトグラフィーで精製し、その後、ピリンダイマーを、５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド（ｐＨ８．０）に対して塩析して形成する。エシュダット等はまた、ピリンダイマーは、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）に対して塩析を行うと線毛を形成することを見出した。
さらに、例えば、通例の遺伝子工学および蛋白修飾法を用いて、ピリン蛋白を、第２付着部位と通じてハプテンが結合することの可能な第１付着部位を含むように修飾することが可能である。別態様として、ハプテンは、これらの蛋白の中に天然に存在するアミノ酸残基に対して、第２付着部位を介して直接結合させることも可能である。これら修飾されたピリン蛋白は、本発明の免疫化組成の中に使用されてもよい。
本発明の組成物を調製するのに用いられる細菌のピリン蛋白は、本明細書でＨＢｃＡｇについて記述したのと同じやり方で修飾されてもよい。例えば、システインおよびリシン残基は、除去するか、または、他のアミノ酸残基と置換し、第１付着部位をこれらの蛋白に付加してもよい。さらに、ピリン蛋白は、修飾形として発現させるか、または、発現後化学的に修飾してもよい。同様に、本来の線毛を細菌から収集し、次に化学的に修飾してもよい。
別の実施態様では、線毛または線毛様構造は細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）から収集し、これを用いて本発明のワクチン組成物を形成する。ワクチン組成物を調製するのに好適な線毛の一つの例は、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛であるが、これは、配列番号２に記述されるアミノ酸配列を持つピリンモノマーから形成される。
細菌の線毛採取法にはいくつかが従来技術で知られている。例えば、バリットおよびマコウスキー（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：６２３−６３２（１９９８））は、Ｅ．ｃｏｌｉからＰ−線毛を採取するための線毛生成法を記述する。この方法によれば、線毛は、Ｐ−線毛プラスミドを含む線毛高増殖Ｅ．ｃｏｌｉから線毛を刈り取り、可溶化とＭｇＣｌ２（１．０Ｍ）沈殿から成るサイクルによって精製する。国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号は、本来的に線毛を成育させる細菌、または、線毛成育を担当するｆｉｍオペロンをコードするベクターを導入させた細菌からＩ型線毛を採取し精製する方法を開示する。
一旦採取されると、線毛または線毛様構造は様々な方法で修飾が可能である。例えば、第１付着部位を、ハプテンが第２付着部位を介して付着されるように、線毛に付加することも可能である。言い換えれば、細菌の線毛または線毛様構造は、採取し、修飾して、非天然の分子骨格を形成することが可能である。
線毛または線毛様構造は、非天然の第１付着部位を持たないハプテンの付着によって修飾することも可能である。例えば、抗原または抗原決定基を、天然に発生するシステイン残基またはリシン残基に結合させることが可能である。この場合、天然に発生するアミノ酸残基の高度の秩序と反復性が、抗原または抗原決定基の、線毛または線毛様構造への結合をガイドする。例えば、線毛または線毛様構造は、ヘテロ二重機能性架橋結合因子を介してハプテンの第２付着部位に結合させることが可能である。
生物によって天然に合成される構造（例えば、線毛）を用いて本発明のワクチン組成物を調製する場合、その生物を、所望の特徴を持つ構造を生産するように遺伝工学的に加工することはしばしば有利な場合がある。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛を用いる場合、その線毛を採取するＥ．ｃｏｌｉを、特定の特質を持つ構造を生産するように修飾してもよい。ピリン蛋白の可能な修飾の実際例としては、１個以上のリシン残基の挿入、１個以上の天然に存在するリシン残基の欠失または置換、および、１個以上の天然に存在するシステイン残基の欠失または置換（例えば、配列番号２の位置４４と８４におけるシステイン残基）が挙げられる。
さらに、その他の修飾をピリン遺伝子に対して施して、リシン残基以外に第１付着部位（例えば、ＦＯＳまたはＪＵＮドメイン）を含む発現産物をもたらすようにすることも可能である。もちろん、適当な第１付着部位は、一般に、ピリン蛋白が、本発明のワクチン組成物の使用に好適な線毛または線毛様構造を形成するのを妨げないような部位に限定される。組み換えピリン蛋白の線毛形成能力は、電子顕微鏡検査を含むいくつかの方法で確定が可能である。
細菌細胞に本来存在するピリン遺伝子は、インビボで（例えば、相同組み換え）修飾することが可能であり、あるいは、特定の特質を持つピリン遺伝子を、それらの細胞の中に導入することが可能である。例えば、ピリン遺伝子は、複製可能なクローニングベクター、または、細菌染色体に挿入されるベクターの成分として、細菌細胞の中に導入することが可能である。挿入されたピリン遺伝子はまた、発現制御配列（例えば、ｌａｃオペレーター）と結合されてもよい。
多くの場合、本発明のワクチン組成物に使用される線毛または線毛様構造は、単一タイプのピリンサブユニットから構成される。しかしながら、本発明の組成物は、ヘテロのピリンサブユニットから形成される線毛または線毛様構造をも含む。同一サブユニットから構成される線毛または線毛様構造は一般に、それらが高度に秩序だった反復性の抗原アレイを提示する構造を形成することが期待されるので使用するのである。
第２付着部位。規則的な反復性のアレイを備える分子骨格の調製は、高いエピトープ密度を持つ、ＲＮＡファージコート蛋白から成るカプシドを含む本発明の組成物によって実現される。ハプテンの性質、ハプテン上の第２付着部位の性質と配置は、従来技術において通常の錬度を有する当業者によっても理解されるように、本発明の抱合体を構築するのに利用可能な手段に、および、これら抱合体の、免疫反応誘発の有効性に影響を及ぼす重要な因子である。
第２付着部位を設計するための要件は、それが融合される、挿入される、一般に遺伝子工学的に加工され、付着される位置の選択である。熟練した専門家であれば、第２付着部位の位置を選択する際にどうしたら案内を見出せるかを知るであろうし、また、この決定に関連して多くの要因を考慮することが可能であろう。ハプテンの化学的および／または結晶構造が、結合に好適な、分子上のドメインまたは機能基の入手可能性に関する情報を提供することもある。溶媒に対する、反応性機能基またはドメインの接触可能性が、第１付着部位に対する化学的結合の速度論的条件における制限因子と成る場合もある。スルフヒドリル残基のような、結合に好適な基が利用できなければならない。一般に、ハプテンによる免疫化が、それ自体も自己抗原となる可能性のある、前記ハプテンと、受容体のような、その天然のリガンドとの相互作用を抑制することを目的としている場合には、第２付着部位は、天然のリガンドとの相互作用部位に対する抗体の産生を可能とするように付加される。従って、第２付着部位の位置は、第２付着部位、または、リンカー、または、第２付着部位を含むアミノ酸リンカーによる立体配置的妨害が回避されるように選ばれる。さらに別の実施態様では、その天然のリガンドに対して自己抗原となる可能性のあるハプテンの相互作用部位とは別の部位に向けられる抗体反応が望まれる。このような実施態様では、第２付着部位は、前記ハプテンと、その天然のリガンドとの相互作用部位に対する抗体の生成を防止するように選ばれる。その他の、考慮すべき要因としては、ハプテンの性質、ｐＩのようなその生化学的性質、電荷分布、追加修飾が挙げられる。一般に、屈曲性のあるリンカーが好まれる。
第２付着部位の位置を選択する際の、その他の基準としては、ハプテンのオリゴマー化状態、オリゴマー化の部位、補助因子の存在、ハプテンの化学的反応性、および、ハプテン構造の各部位を明らかにする実験的証拠の利用可能性と、ハプテンの修飾がハプテンの機能および、前記ハプテンを認識する抗体の生成に干渉しない配列、および、好ましくはハプテン機能を阻害する配列が挙げられる。
ハプテン付着の一つの方法は、ＶＬＰに対するポリペプチドリンカーを含む。特に、ＲＮＡファージコート蛋白から成るカプシドに対しては、ＲＮＡファージコート蛋白のカプシドの表面に存在するリシン残基の、ポリペプチドリンカーの、例えば、システイン残基に見られるような、スルフヒドリル基との結合がある。同様に、ハプテン上の遊離スルフヒドリル基も効果的な付着部位となり得る。第２付着部位として機能するため、酸化されたスルフヒドリル基を還元状態にしなければならない場合、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはβ−メルカプトエタノールによって還元を実現することが可能である。
本発明の一つの好ましい実施態様では、ハプテンは、ＲＮＡファージコート蛋白から成るカプシド表面上のリシン残基と反応が可能な第２付着部位を含むような方法で合成される。
本発明によれば、ＲＮＡファージコート蛋白から成るカプシド上のエピトープ密度は、架橋リンカーおよびその他の反応条件を選ぶことによって修飾することが可能である。例えば、架橋リンカーＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳおよびＳＭＰＨでは高密度のエピトープの実現を可能とする。誘導体形成も、反応基の高濃度に積極的に影響されるから、反応条件を操作することによって、ＲＮＡファージカプシド蛋白に、特にＱβ蛋白に結合される抗原の数を調節することが可能である。さらに、コア粒子上の第１付着部位の数は、ハプレンアレイの密度に影響を及ぼすもう一つの要因である。本発明の一つの実施態様では、我々は、さらに高密度のアレイを獲得するのに好適な、リシン残基を別に加えたＱβ変異コート蛋白を提供する。
架橋結合。ハプテンのコア粒子に対する結合法は、当該分野において通常の熟練度を有する当業者の、十分運用知識に内のことであり、そのような実務家を助けるために多数の参考文献が存在する（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．等編、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（１９８９）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．等編、「分子生物学における最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｈ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９７））、（セリス（Ｃｅｌｉｓ）Ｊ．編、「細胞生物学（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第２版、（１９９８））、（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）Ｅ．およびレイン（Ｌａｎｅ）Ｄ．，「抗体−実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、（１９８８）参照）。なお、これら全てを、引用することにより本明細書に含める。
コア粒子とハプテンの間の結合を実現するための様々な方法が、本明細書に記述されており、またさらに国際公開第ＷＯ０２／０５６９０５号にも記載される。方法は、それぞれ、本発明の第１および第２付着部位に利用されるＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパー蛋白ドメインを含む。
本発明の好ましい実施態様は、化学的架橋結合によって、非天然分子骨格をハプテンに結合させることを含む。誘導体分子、例えば、ハプテンに対する蛋白／ペプチドの架橋結合、または、蛋白の抱合を促進するために広範な化合物が開発されている。そのような化合物としては、カルボン酸由来の活性エステル（活性化化合物）、無水混合物、ハロゲン化アシル、アジ化アシル、ハロゲン化アルキル、Ｎ−マレイミド、イミノエステル、イソシアネート、および、イソチオシアネートが挙げられるが、ただし、それらに限定されない。また、これらは当業者には既知のものである。これらは、蛋白分子の反応基と共有結合を形成することが可能である。活性基に応じて、反応基は、蛋白分子におけるリシン残基のアミノ基、または、担体蛋白または担体蛋白修飾分子におけるチオール基であり、これは、反応すると、アミド、アミン、チオエーテル、アミジンウレア、または、チオウレアの結合形成を実現する。当業者ならば、さらに好適な活性基を、例えば、「蛋白抱合および架橋結合の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」（ウォン（Ｗｏｎｇ）（１９９１）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，フロリダ）のような一般的な参考テキストの中に特定することが可能であろう。大抵の試薬は、リシンの側鎖基と積極的に反応する。
いくつかの実施態様では、抗原は、ヘテロ二重機能架橋リンカーによる化学的架橋結合によってコア粒子に付着される。いくつかのヘテロ二重機能架橋リンカーが従来技術において知られている。ある実施態様では、ヘテロ二重機能架橋リンカーは、コア粒子のリシン残基の側鎖アミノ基を反応が可能な機能基と、ハプテン上に存在するシステイン残基またはスルフヒドリル基と反応が可能な機能基とを含む。これらは、還元によって反応可能とさせられ、加工され、または、ハプテンに付着され、また随意に還元によって反応可能とさせられる。誘導体形成と呼ばれる過程の第１工程は、コア粒子を架橋結合と反応させることである。この反応の産物は、活性化されたコア粒子であり、これは活性化担体とも呼ばれる。第２の工程では、未反応架橋リンカーが、ゲルろ過または塩析などの通例法を用いて除去される。第３工程では、抗原がこの活性化コア粒子と反応させられる。この工程は結合工程と呼ばれる。未反応抗原は、要すれば随意に、第４工程において取り除かれる。
別の実施態様では、ハプテンが、第１付着部位と架橋結合するのに好適な活動的な機能基を持つように誘導体形成されて、活性化ハプテンを生成する。このような誘導体形成は、単離されたハプテン上で、または、化学的合成によって行ってもよい。次に、この活性化ハプテンを、結合が起こるようにコア粒子と反応させる。
いくつかのヘテロ二重機能性架橋リンカーが従来技術で知られている。そのようなものとしては、架橋リンカーＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ，Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ，ＳＩＡ、および、その他の架橋リンカー、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ化学会社（ロックフォード、イリノイ州、米国）から入手が可能なもので、一方の機能基は、アミノ基に対して反応性を持ち、もう一方の機能基は、ＳＨ残基に対して反応性を持つ架橋リンカーが挙げられる。前述の架橋リンカーは全て、チオエーテル結合の形成を実現する。本発明の実施に好適な、別のクラスの架橋リンカーは、結合時に、ハプテンとコア粒子の間にジスルフィド結合を導入するという特徴を持つ。このクラスに属する架橋リンカーとしては、例えば、ＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が挙げられる。架橋リンカーを備えるコア粒子の誘導体形成の程度は、有機化学分野における反応理論からよく知られるように、反応に与る各成員の濃度、試薬相互間の過剰の程度、ｐＨ、温度、および、イオン強度のような実験条件を変えることによって影響される。結合の程度、すなわち、担体当たりのハプテンの量は、ワクチンの要件に適合するように、前述の実験条件を変えることによって調整することが可能である。ハプテンの可溶性が、各サブユニットに結合可能な抗原量に制限を課すことがあり、得られたワクチンが不溶の場合には、サブユニット当たりの抗原量を減らすのが有利である。
ある特定の実施態様では、化学的仲介因子は、ヘテロ二重機能架橋結合因子、ε−マレイミドカプロイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（タニモリ（Ｔａｎｉｍｏｒｉ）等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．４：８１２（１９８１）、フジワラ（Ｆｕｊｉｗａｒａ）等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４５：１９５（１９８１））である。この因子は、（１）アミノ基と反応するスクシニミド基、および、（２）ＳＨ基と反応するマレイミド基を含む。第１付着部位の異種蛋白またはポリペプチドは、このヘテロ二重機能性架橋結合因子のスクシミド部分に対する反応基となる、１個以上のリシン残基を含むように加工されてもよい。一旦、この異種蛋白のリシン残基に化学的に結合されると、ヘテロ二重機能性架橋結合因子のマレイミド基は、抗原または抗原決定基上のシステイン残基のＳＨ基と反応するために利用可能となる。この場合、抗原または抗原決定基の調製において、第２付着部位としてのスルフヒドリル残基を次のように加工する必要がある。すなわち、スルフヒドリル残基が、非天然の分子骨格の第１付着部位に結合した架橋結合因子上の遊離マレイミド機能基と反応可能となるように加工することである。従って、この場合、ヘテロ二重機能性架橋結合因子は、非天然分子骨格の第１付着部位に結合し、その骨格を、抗原または抗原決定基の第２結合部位に接続する。
ハプテンをコア粒子に結合するその他の方法としては、ハプテンがカルボジイミド化合物によってコア粒子に架橋結合される方法が挙げられる。この方法は、カルボジイミドＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸）を含む。これは、反応において、随意に、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドＮＨＳと共に使用してもよい。ある方法では、ＥＤＣは、遊離カルボン酸を含むハプテンと混合され、次に蛋白担体に付加される。別の方法では、コア粒子のアミン基またはカルボキシル基に対して反応性を持つ機能基を有するホモ二重機能性架橋リンカー、例えば、グルタールアルデヒド、ＤＳＧ，ＢＭ［ＰＥＯ］４，ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ化学会社、ロックフォード、イリノイ州、米国）、または、その他の、既知のホモ二重機能性架橋リンカーを用いて、ハプテンをコア粒子に付着させる。
ハプテンを、それぞれ、コア粒子およびウィルス様粒子に付着させるのに好適な、さらに別の方法および架橋リンカー、および、結合反応、化学的架橋リンカーの用法および化学的架橋結合過程に関する案内が、ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）Ｇ．Ｔ．の「生物物質抱合体技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．サンディエゴ、カリフォルニア州、米国に載っている。
コア粒子をハプテンに結合させるさらに別の方法としては、コア粒子をビオチニル化し、ハプテンをストレプトアビジンに結合させる方法、あるいは、ハプテンとコア粒子の両方をビオチニル化する方法が挙げられる。この場合、ハプテンは先ずストレプトアビジンまたはアビジンに結合されるが、その際、次工程にて添加されるコア粒子が結合するための、遊離の結合部位が依然として利用可能となるように、ストレプトアビジンに対する抗原の比率を調整する。別に、全ての成分を、「一つ鍋」の反応として混合してもよい。受容体およびリガンドの可溶形同士が利用可能で、コア粒子またはハプテンに架橋結合が可能な、その他の、リガンド−受容体ペアも、ハプテンをコア粒子に結合するための結合仲介因子として使用が可能である。
ハプテン。一つの局面において、本発明は、ハプテンに対して免疫化するのに好適な、規則的な、反復性のハプテンアレイを提供する。好ましいハプテンは、ホルモン、薬剤および有毒化合物である。さらに好ましいのは、薬剤、特に依存性薬剤である。前記薬剤、ホルモン、および、有毒化合物に対する免疫反応は、前記化合物に対して暴露される危険性を持つ個体を保護するために、実際に暴露されている個体に対する治療法として、または、依存症を予防または治療するために使用が可能である。
代表的なホルモンとしては、プロゲストロン、テストステロン、エストロゲン、メラニン刺激ホルモン、コルチゾン、卵胞刺激ホルモン、アドレナリン、および、ノルアドレナリンが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。前記ホルモンに対する免疫反応は、メラノーマ、生殖器の癌、例えば、乳癌、卵巣癌、子宮癌、睾丸癌、および子宮頸癌に対して、また、避妊のようなホルモンレベルの変更が望ましい状態において使用されてもよい。
代表的有毒化合物としては、有毒植物、動物、および微生物の天然産物が挙げられ−ただしこれらに限定されない、そのようなものとして、アフラトキシン、シグアテラトキシンおよびテトロドトキシンが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。人工的に、または、代謝の結果生産される代表的有毒化合物としては、抗生物質（例えば、バンコマイシン等）、抗癌化合物（例えば、ビンブラスチン等）、化学戦争薬剤（例えば、ボツリヌストキシン、サリン、タブン、ソマン、ＶＸ等）が挙げられる。本発明のある局面は、一般に使用される薬剤の有毒代謝産物に対して抗体を生産し、そうすることによって、個体が、有毒代謝産物に関連する副作用を被ることなく、薬剤の治療作用を受容できるようにすることである。
薬剤依存、特に、娯楽薬剤依存症に対する治療用組成物および方法のためにどんな抗原または抗原決定基を選択すべきかは、このような障害を治療する医学に堪能な当業者には既知であろう。このような抗原または抗原決定基の代表的例としては、例えば、コデイン、フェンタニル、ヘロイン、モルフィネ、オピオイド、モルフィネ、および、阿片のようなオピオイドおよびモルフィネ誘導体、ジアゼパンのような弛緩薬、アンフェタミン、コカイン、ＭＤＭＡ（メチレンジオキシメタンフェタミン）、メタンフェタミン、メチルフェニデート、および、ニコチンのような興奮剤、ＰＣＰ、ＬＳＤ，メスカリン、および、シロシビンのような幻覚誘発剤、ハシッシおよびマリファナのようなカンナビノイドが挙げられるが、また同様に、デジプラミン／イミプラミンクラスの薬剤、および、ノルトリプチリン／アミトリプチリンクラスの薬剤も含まれる。ニコチン依存症に対する治療はまた、ノルニコチンおよびコチニンを含むニコチン代謝産物をも標的とする。これらの代謝産物はいずれも、ニコチンよりも長い半減期を持ち、ニコチン同様の薬理学的、神経薬理学的作用を持ち、依存症を引き起こす可能性がある。
前述の実施態様では、免疫化ハプテンは、ホルモン、薬剤またはトキシンの全分子を含む必要はない。興味の薬剤、ホルモンまたはトキシンに対する適当な免疫反応は、その薬剤、ホルモンまたはトキシン、または、関連化学構造の断片を用いることによって発生させてもよい。
本発明は、担体に対するハプテン結合について様々の部位および手段を実現しており、それらは、本発明の前記部分で、また、実施例を参照しながら、いずれでも具体的に説明されている。結合の、好ましい部位および手段は、以前の経験、理論、および、通例の実験手続きに基づいて決定されてよい。
ニコチンおよびニコチン代謝産物。ニコチンに好適な免疫反応は、ピリジンまたはピロリジン環を介して、コア粒子に結合されるハプテンによって生成されてもよい。ある実施態様では、６−（カルボキシメチルウレイド）−（±）−ニコチン（ＣＭＵＮｉｃ）抱合体が６−アミノ−（±）−ニコチンから合成される。すなわち、６−アミノ−（±）−ニコチンをエチルイソシアノアセテートと反応させて、６−（カルボキシエチルウレイド）−（±）−ニコチンを形成し、水酸化リチウムで加水分解して、記述のＣＭＵＮｉｃを形成する（ヒエダ（Ｈｉｅｄａ）等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：８０９−８１９（２０００））。この参考文献全体を本申請書に含める。ハプテンは、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌによって活性化が可能な、末端のカルボキシル基を介してコア粒子に抱合される。別の実施態様では、６−アミノ−（±）−ニコチンは、国際公開第ＷＯ９９／６１０５４号に記載されているように、担体蛋白に結合される。なお、この開示の全体を引用することにより本明細書に含める。
本発明の別の実施態様では、カシュマンとカスティノーリ（Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｃａｓｔｉｇｎｏｌｉ）（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：１２６８−１２７１（１９７２））の記述する方法で、トランス−３’−アミノメチルニコチン抱合体が、トランス−３’−ヒドロキシメチルニコチンアルコールから、トシル酸塩を仲介にして調製される。なお、前記開示の全体を引用することにより本明細書に含める。ハプテンは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＡＣ）を用いてリンカーのカルボン酸基を活性化することによって、コハク酸を介してコア粒子に抱合される。
関連実施態様では、ニコチンハプテンに対する３’−結合が、先ず、トランス−３’−ヒドロキシメチオニンを生成し、これを無水コハク酸と反応させて、コハク酸化ヒドロキシメチルニコチン（Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチン）生成することによって実行される。次に、この産物を、ランゴンおよびヴァンブナキス（Ｌａｎｇｏｎｅ ＆ ＶａｎＶｕｎａｋｉｓ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８４：６２９−６４１（１９８２）の記述する方法に従って、ＥＤＡＣおよびコア粒子と混合してカルボジイミド活性化結合を発生させる。なお、この開示全体を本明細書に含める。別の実施態様では、トランス−４’−カルボキシコチニンを、ＥＤＡＣによって同様に活性化して蛋白担体に結合させる。
ある実施態様では、ニコチンハプテンは、１位窒素を介してアミノエチルピリジニウム誘導体、Ｓ−１−（ｂ−アミノエチル）ニコチニウム・クロリド・ジクロリドに変換して結合される。すなわち、後者を、ノグチ（Ｎｏｇｕｃｈｉ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８３：８３−８６（１９７８））の記述する通りに、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）−カルボジイミド・メト−ｐ−トルエンスルフォネートの存在下にコア粒子と結合させる。なお、この引用文献の全体を本明細書に含める。関連実施態様では、コチニンは、同じ一般的方法によって、すなわち、Ｓ−１−（ｂ−アミノエチル）コチニウム・クロリド・ヒドロクロリドを形成することによってコア粒子に抱合される。
ある実施態様では、ニコチンハプテンは、イソムラ（Ｉｓｏｍｕｒａ）等（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：４１１５−４１２１（２００１））の記述する通りに、１’位においてＮ−［１−オキソ−６−［（２Ｓ）−２−（３−ピリジル）−１−ピロリジニル］ヘキシル］−β−アラニンを形成することによって結合される。なお、参照文献の全体を本明細書に含める。次に、この活性化ハプテンを蛋白担体に結合させる。他の三つの実施態様では、抱合体が、蛋白コア粒子の第１付着部位と、コチニンハプテン、４−オキソ−４−［［６−［（５Ｓ）−２−オキソ−５−（３−ピリジニル）−１−ピロリジニル］］ヘキシル］アミノ］−ブタノイン酸、または、ノルニコチンハプテン、（２Ｓ）−２−（３−ピリジニル）−１−ピロリジンブタノイン酸・フェニルメチルエステル、または、（２Ｒ）−２−（３−ピリジニル）−１−ピロリジンブタノイン酸・フェニルメチルエステルとの間に形成される。
ある実施態様では、ビェルケ（Ｂｊｅｒｋｅ）等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９６：２３９−２４６（１９８７））の記述する通りに、コチニン４’−カルボン酸が、担体にリシン部位で共有的に結合される。この参照文献の全体を本明細書に含める。
ニコチンハプテンは、ニコチンの６位で結合することによってリンカーを介して担体蛋白に抱合されてもよい。この線に沿って、下記のハプテンが本発明の実施態様で使用される。すなわち、Ｎ−スクシニル−６−アミノ−（＋／−）−ニコチン、６−（σ−アミノカプラミド）−（＋／−）−ニコチン、および、６−（σ−アミノカプラミド）−（＋／−）−ニコチンである。これらは既に記述されている（カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：３３１−３４０（１９８０）、カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６７：５８３−５８９（１９７５）、カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）等、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍ．５１：３９３−４０４（１９８６））。これらの全体を引用することにより本明細書に含める。
本発明の別の実施態様では、ニコチンハプテンは、米国特許第６，２３２，０８２号に記載されているように、３’、４’または５’位において、アミノメチルニコチンのスクシニル化、ＥＤＣによる活性化、その後の担体との混合によって抱合される。なお、この参照文献の全体を引用することにより本明細書に含める。他の実施態様では、アミノメチルニコチンは、ポリグルタミン酸―ＡＤＨを介してコア粒子に抱合される。別の実施態様では、抱合体は、３’、４’または５’位において誘導体形成されたアセチルニコチンおよびアルデヒドニコチンから形成される。
他の実施態様では、ハプテン・担体抱合体は、５−（１−メチル−２−ピロリジニル）−２−または３−ピリジニル−抱合体、および、５−（Ｎ−メチル−２−ピロリジニル）−２−または３−ピリジニル−抱合体を含む、ニコチンの５−および６−結合を含む。このような抱合体の構築法が、国際公開第ＷＯ９９／６１０５４号に記載される。この参照文献の全体を本明細書に含める。別の実施態様では、５−および６−アミノニコチンを開始物質として利用し、これを、アミノ基の所で誘導体形成し、アミンおよびカルボン酸を含む好適な反応基で終わる、典型的には炭素鎖を付加する。こうすると、このハプテンは、本発明のコア粒子に対して抱合させるのに好適となる。他の実施態様では、５−または６−ブロモニコチンが、アルキンとの反応に好適な開始物質として使用される。この反応は、アミンおよびカルボン酸を含む、結合に好適な機能基に終止する鎖を持つ、不飽和炭素グループを付加することになり、これが、コア粒子への抱合を可能とする。
本発明の他の実施態様は、スウェイン（Ｓｗａｉｎ）等（国際公開ＷＯ９８／１４２１６）の記載するように、ニコチンの１，２，４，５，６または１’位において抱合されるニコチンハプテンを含む。なお、この開示の全体を引用することにより本申請書に含める。
本発明の別の実施態様は、ジャンダ（Ｊａｎｄａ）等（国際公開ＷＯ０２／０５８６３５）の記載するようなニコチンハプテン含有抱合体を含む。
さらに別の実施態様は、メジュラー（Ｍｅｉｊｌｅｒ）等（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５：７１６４−７１６５（２００３））の記載するような、コンフォーメーションに制限を課せられたニコチンハプテンを含む。
コカインおよび関連薬剤。本発明は、コア粒子に抱合されたコカインを含む抱合体、組成物および方法を提供する。あるグループの実施態様では、ベンゾイルコカインおよびベンゾイルエゴグニンのジアゾニウム塩が、担体蛋白と結合される。他の実施態様では、コカインおよびノルコカインのパラ−イミノエステルがコア粒子に抱合される。この実施態様に好適なハプテンが米国特許第３，８８，８６６、４，１２３，４３１、および、４，１９７，２３７号に記載されている。この参照文献の全体を本明細書に含める。各種コカイン誘導体のフェニル環のパラ位置を用いたコカイン抱合体は、アミドボンドの導入による加水分解に対して安定性が強化される。
本発明の別の実施態様は、米国特許第５，８７６，７２７号に記載されるコカインハプテンを含む。この参照文献全体を本明細書に含める。
ある実施態様では、本発明の抱合体の前駆物質が、２当量のジイソプロピルエチルアミンの存在下に、エクゴニンメチルエステルを、ＤＭＦに溶解した臭化ブロモアセチルによってアシル化して合成される。次に、この生成物を、チオール化担体蛋白のチオール基に結合させて抱合体を得る。
別の実施態様では、本発明の抱合体の前駆物質が、ＤＭＦに溶解した無水コハク酸によって、１当量のトリエチルアミンの存在下に、エクゴニンメチルエステルをスクシニル化することによって合成される。次に、この生成物を、担体蛋白のリシン残基のアミノ基に結合させて抱合体を得る。ある実施態様では、本発明の抱合体の前駆物質は、２当量のトリエチルアミンの存在下に、ノルコカインを、塩化メチレンに溶解した無水コハク酸と反応させることによって合成される。別の実施態様では、本発明の抱合体の前駆物質は、ノルコカインモノ活性化コハク酸溶液とトリエチルアミンを反応させてスクシニル化ノルコカインを形成することによって合成される。いずれの場合にしても、得られたスクシニルノルコカインは、少なくとも２種の異性体、すなわち、スクシニル基のエキソ形とエンド形の混合物である。これらの実施態様では、次に、スクシニルノルコカインは、ＥＤＣによって、担体蛋白のリシン残基のεアミノ基に結合され、抱合体が得られる。別の実施態様では、結合反応は、あらかじめ活性化されたスクシニル化ノルコカイン誘導体を用いて実施される。すなわち、中間体を分離し、その特徴を調べることが可能である。このあらかじめ活性化されたスクシニル化ノルコカイン誘導体は、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルフォン酸ナトリウム塩を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＤＭＦの存在下に、スクシニル化ノルコカインと反応させることによって合成される。この生成物を、担体蛋白のリシン残基のアミノ基に抱合させて抱合体を得る。
別の実施態様では、本発明の化合物は、スクシニル化ノルコカインを、クロロギ酸エチル、Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）およびＤＭＦの存在下に、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドと反応させることによって合成される。次に、この生成物を、担体蛋白のリシン残基のアミノ基と結合させて抱合体を得る。
ある実施態様では、本発明の化合物は、塩化チオニールをスクシニル化ノルニコチンと反応させることによって合成される。次に、この生成物を、担体蛋白に抱合させて抱合体を得る。別の実施態様では、本発明の化合物は、カルピノ（Ｃａｒｐｉｎｏ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４３９７−４３９８（１９９３））が概説するように、スクシニル化ノルニコチンを、ＤＭＦおよびジイソプロピルエチルアミンにおいて、ＨＡＴＵと反応させることによって合成される。なお、この参照文献の全体を本明細書に含める。生成物は、担体蛋白を含む水溶液に添加されて抱合体が得られる。
別の実施態様では、本発明の化合物は、スクシニル化ノルニコチンを、ＤＭＦおよびジイソプロピルアミンにおいて、ＰｙＢｒｏＰと反応させることによって合成される。この生成物は、担体蛋白を含む水溶液に添加されて抱合体が得られる。関連実施態様では、担体蛋白が、ホウ酸バッファー中で無水コハク酸によってスクシニル化される。次に、この生成物はＥＤＣの存在下にノルコカインに結合されて、抱合体が得られる。
別の実施態様では、ベンゾイルエクゴニン中のコカインの遊離酸を還元して対応する第一アルコールへ変換する反応が、ホウ酸塩−ジメチルスルフィド複合体によって実現される。このアルコールは、ＤＭＦ中で無水コハク酸と反応し、次に、その生成物は、ＥＤＣの存在下に遊離アミノ酸と抱合されて、抱合体が得られる。
別の実施態様では、本発明の化合物は、ＥＤＣの存在下に、ベンゾイルエクゴニンを、担体蛋白のリシン残基のアミノ基に抱合させることによって合成されて、抱合体を得る。
ある実施態様では、抱合体の前駆物質は、２当量のジイソプロピルエチルアミンの存在下に、ノルニコチンラセミ体を、無水コハク酸の塩化メチレン液にてアシル化することによって合成される。次に、この反応の生成物は、ＨＡＴＵによって、担体蛋白のリシン残基に対して結合され、抱合体が得られる。別の実施態様では、無水メタノールに溶解した（Ｓ）−（−）−ニコチンのピリジン窒素を、エチル３−ブロモブチレート、５−ブロモ吉草酸、６−ブロモヘキサン酸、または、８−ブロモオクタン酸によって選択的にアルキル化して、ＨＡＴＵによって担体蛋白に抱合させるのに好適な産物を生成する。
組成物、ワクチン、および、その投与法、および、治療法
本明細書で論じたとおり、本発明は、疾病または状態の予防および／または治療のために使用が可能な組成物を提供する。本発明はさらに、個体における疾病または状態を予防／治療のためのワクチン接種法を提供する。ある好ましい実施態様では、組成物は、有機分子に結合する、抗体を含む免疫分子の生産をもたらす免疫反応を刺激する。本発明はさらに、個体における疾病または状態を予防／治療するためのワクチン接種法を提供する。
免疫反応の性質またはタイプは、本開示の制限的要因とはならない。治療的または予防的免疫反応の所望の結果は、疾病によって、従来技術でよく知られる原理によって変動することがある。例えば、吸引薬剤（例えば、ニコチン、コカイン）に対するワクチンは、高抗体価の血清ＩｇＧを誘発し、同時にまたｓＩｇＡ抗体を呼吸上皮に分泌させ、そうすることによってニコチンを気道および血流内に結合させるように設計される。一方、注入による薬剤乱用（例えばヘロイン）を標的とする場合は、ｓＩｇＡ抗体の抗体価は恐らく関与の程度はより低い。しかしながら、注入による薬剤乱用に対するワクチン接種法においても、高い血清抗体価と同時にｓＩｇＡを産生するものは、血清抗体価が十分なものである限り、有効と言えよう。
本発明は、疾病または状態または依存症を治療または予防するのに十分なワクチンを含む。本発明はさらに、症状の数、重度または持続時間を低下させるワクチン、および、ある集団において、症状を持つ個体数を低下させるのに有効なワクチン組成物を含む。本発明は、ある病気に対する総合的な治療介護における一局面において病気の治療を助ける、免疫系に対する作用を持つ組成物を含む。依存症の極めて複雑な性質に徴するならば、本発明は、薬物依存症に対する治療を補佐するものであるが、精神病学的、行動学的、社会学的および法学的介入と共存する組成物を含む。
さらに、疾病に応じて、また、従来技術で既知の原理に従って、異なるタイプの免疫系を刺激することが好ましい。例えば、ある特定の抗原に対しては、ある免疫反応の方が別の免疫反応よりも適当であることは従来技術でよく知られる。実際、免疫反応の内のあるものは不適当であり、病的炎症のような病的現象の原因となり得る。
免疫反応の性質は、抗原の性質、体内への導入ルート、用量、用量処方、抗原の反復性、宿主の背景、および、免疫系のシグナル伝達要因によって影響されることがある。このような知識は従来技術でよく知られる。免疫反応は、このようなものであるから、既知の理論および通例の実験の両方を運用することによって、上手く適合するように形を整えなければならない。
さらに、本発明は、一つの薬剤、または、複数の薬剤に対するワクチン治療進行の間、様々なコア粒子の使用を実現する。例えば、線毛のようなコア粒子に対して強い免疫反応を呈した個体には、同じハプテンを含むが、コア粒子は別の組成物で免疫化することが可能である。
本発明の働きに関して、理論や、何かの機械論的説明に縛られることを望むものではないが、本発明の抱合体は、免疫反応を惹起する製薬組成物の成分として、特にワクチンとして、斬新で、驚くべき利点を提供する。ＢＳＡ，キーホールリンペットヘモシアニン、テタヌストキソイド、細菌外膜蛋白、コレラトキシン、および、シュードモナスアエルギノーサ・エキソトキシンＡを含む、従来技術で既知の、他の担体は、個体によっては、特にヒトには使用が不適当である場合がある。前述の担体は、アレルギー反応を誘発したり、病的な免疫反応（例えば、コレラトキシン、ＫＬＨ、ＢＳＡ）を刺激したりすることがある。前述の担体は、現在ではヒトに対する使用が不適当と見なされているフロイントの完全アジュバントの存在を必要とする場合がある。現在のワクチンの成分となっている担体がいくつかある（例えば、テタヌストキソイド、コレラトキシン、エキソトキシンＡ）。それであるから、個体は、これらの担体に対してあらかじめ高度の免疫を有していることがあり、そのため、抗原−担体抱合体による免疫化によって、新規の抗原に対してよりも、担体に対してより大きな免疫反応が誘発されることがある。そのために、個別的にも、全体としても、本発明の抱合体および組成物は、前述の担体蛋白に対する有用な改善となる。本発明は、フロイントの完全アジュバントを使用することの無い、また、全く病的免疫反応の兆候を呈することの無い、免疫反応刺激用のニコチン−Ｑβ ＶＬＰ抱合体組成物の使用法を明らかにする。
本発明の実施態様の用法では、コア粒子に抱合されるハプテンが、抗原提示細胞によって取り上げられ、それによってＴ細胞が刺激され、これが免疫反応の誘発を助ける。Ｔヘルパー細胞の反応は、１型（ＴＨ１）および２型（ＴＨ２）ヘルパー細胞反応に分けられる（ロマニャーニ（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：２６３−２６６（１９９７））。ＴＨ１細胞は、インターフェロン−ガンマと、Ｂ細胞を駆動してＩｇＧ１−３抗体を生産させる他のサイトカインを分泌する。一方、ＴＨ２細胞によって生産される重要なサイトカインはＩＬ−４であり、これは、Ｂ細胞を駆動してＩｇＧ４およびＩｇＥを生産させる。多くの実験系において、ＴＨ１およびＴＨ２反応の発達は相互に排他的である。なぜなら、ＴＨ１細胞はＴＨ２細胞の誘発を抑制し、逆もまた真だからである。従って、強力なＴＨ１反応を駆動する抗原は、同時に、ＴＨ２反応の発達を抑圧し、従って、ＩｇＥ抗体の生産を抑圧する。興味あることに、ほとんど全てのウィルスは、宿主においてＴＨ１反応を誘発するのに、ＩｇＥ抗体の生産を駆動することはできない（クーテリエ（Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒ）等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：６４−６９（１９８７））。ＩｇＥアイソタイプの抗体は、アレルギー反応において重要な成分である。マスト細胞は、ＩｇＥ抗体をその表面に結合させ、そのマスト細胞表面に結合するＩｇＥ分子に対して特異的抗原が結合すると、ヒスタミンや、その他のアレルギー反応の仲介物質を放出する。ＴＨ１反応において典型的なアイソタイプパターンは、生きているウィルスに限定されることなく、不活性化された、または、組み換えウィルス粒子に対しても観察される（ローマン（Ｌｏ−Ｍａｎ）等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１４０１−１４０７（１９９８））。従って、本発明のプロセスを用いることによって（例えば、アルファワクチン技術）、ウィルス粒子を各種ハプテンで装飾し、これを免疫化のために使用することが可能である。この結果得られる、ハプテンの「ウィルス構造」のために、ＴＨ１反応が惹起され、「保護的」ＩｇＧ１−３抗体が生産され、アレルギー反応の原因となるＩｇＥ抗体の生産は阻止される。従って、本発明は、好みの免疫反応、特にＴＨ１型反応を誘発することが可能な組成物を実現する。さらに、本発明は、興味のハプテンに対して別のワクチンによって誘発されたアレルギー反応に対抗する、本発明の組成物の使用法を実現する。
本発明のさらにもう一つの特質は、ハプテンが、Ｔ細胞があろうとあるまいと、効率的免疫反応を誘発することが可能な、規則的、反復的アレイ上に提示が可能であることである。本発明のこの特質は特に有利である。
単離された蛋白と違って、ウィルスは、Ｔ細胞の援助がある場合でも、無い場合でも、全くアジュバントが無くとも、速やかに、効率的な免疫反応を誘発する（バックマンおよびジンカーナーゲル（Ｂａｃｈｍａｎｎ ＆ Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウィルスは多くの場合ほとんど蛋白から構成されていないけれども、単離された蛋白質よりもはるかに強力な免疫反応を駆動することが可能である。Ｂ細胞反応にとっては、ウィルスの免疫原性の一つの決定的に重要な因子は、表面エピトープの反復性と規則性であることが知られる。多くのウィルスは、エピトープの規則的なアレイを提示する擬似結晶性の表面を示し、これが、Ｂ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンと効率的に架橋する（Ｂａｃｈｍａｎｎ ＆ Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７：５５３−５５８（１９９６））。このＢ細胞上の表面免疫グロブリンとの架橋は、細胞周期の進行とＩｇＭ抗体の生産を直接に誘発する強力な活性化シグナルとなる。さらにこのように駆動されたＢ細胞は、Ｔヘルパー細胞を活性化することが可能であり、Ｔヘルパー細胞の方は、Ｂ細胞においてＩｇＭからＩｇＧ抗体生産への切り替え、および、長命なＢ細胞記憶−これが全てのワクチン接種の目的である−の発生を誘発する（バックマンおよびジンカーナーゲル（Ｂａｃｈｍａｎｎ ＆ Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。本発明は、免疫化に用いられるハプテンの反復性の程度をハプテンをコア粒子に結合させることによって増し、それによってワクチン接種効率を向上させるための一つの方法を提供する。以前に注記したように、本発明は、第１付着部位の数、および／または、第１付着部位の配置を変更するように修飾されたコア粒子を含む組成物を提供する。
当該分野において通常の熟練度を有する当業者であれば理解されるように、本発明の抱合体をある個体に投与する場合には、その組成物の効力を向上させるために望ましい、塩、バッファー、アジュバント、および、その他の物質、賦形剤または担体を含む組成物として存在することがある。製薬組成物を調製する際に使用が好適な、または、受容できる材料の例は、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の「製薬科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（オソル（Ｏｓｏｌ）Ａ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））を含む数多くの情報源に供給されている。
本発明の組成物は、もしもその投与が、レシピエント個体によって容認可能である場合、「製薬学的に受容可能」であると言われる。さらに、本発明の組成物は、「治療的有効量」において投与される（すなわち、所望の生理作用をもたらす量）。
本発明の組成物は、従来技術で既知の各種の方法によって投与されてよいが、通常は、注入、輸液、吸引、経口投与、または、その他の適当な物理的方法によって投与される。別に、組成物は、筋肉内、静脈内、経粘膜的、経皮的、または、皮下に投与されてもよい。投与用組成物は、滅菌した、水性の（例えば、生理的食塩水）、または、非水性の溶液および懸濁液を含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、および、オレイン酸エチルのような、注入可能な有機エステルがある。皮膚の浸透性を増すために、および、抗原吸収を強化するために、担体または密封包帯を用いることも可能である。
ある特定の実施態様では、ニコチン依存症のヒトが、５から５００μｇ、好ましくは２５から２００μｇ、さらに好ましくは５０から１００μｇ、もっとも好ましくは１００μｇのＮｉｃ−Ｑβ抱合体により、３週間ブースト（追加抗原）、および、再び６週間ブースト、より好ましくは４週間ブースト、および、再び８週間ブーストによって免疫化される。免疫化のルートは、筋肉内、皮下、皮内、経皮、または、静脈内注入を含むことが可能である。免疫化の２週間後、免疫化を、本明細書の別の箇所で記載されるキットによりモニターする。得られた免疫反応はニコチンに対して特異的であり、高濃度の血清ＩｇＧを含み、かつ、ニコチンの脳摂取を抑制するのに十分である。得られた免疫反応は持続的で、従って、その個人は、ニコチンから快適な作用を経験せず、ニコチンの使用を止める。当業者であれば、測定された免疫反応から、ニコチン特異的ＩｇＧレベルを維持するために追加の免疫化が必要かどうかを知るであろう。本発明の別の実施態様では、本発明のニコチン−ハプテン担体抱合体が、経鼻腔ワクチン接種によって投与される。このタイプの投与は、実施例にて示されるように、ＩｇＡを含む高い抗体価を実現する。
本発明のさらに別の実施態様では、製薬組成物が、ニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、禁煙を促進しまたは喫煙再開を予防するために提供されるが、この組成物は、本発明のワクチン組成物と、更なる薬剤との治療に効果的な組み合わせを含む。ある実施態様では、更なる薬剤は、抗うつ剤、ニコチン受容体修飾剤、カンナビノイド受容体拮抗剤、オピオイド受容体拮抗剤、モノアミンオキダーゼ阻害剤、抗不安剤、または、これら薬剤の任意の併用から成るグループから選択される。好ましくは、更なる薬剤は、ブプロピオン、ドキセピン、デシプラミン、クロミプラミン、イミプラミン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、フェネルジン、トラニルシプロミン、アモキサピン、マプロチリン、トラゾドン、ベンラファキシン、ミルタザピン、それらの製薬的に活性な塩、および、それらの光学的異性体から成るグループから選ばれる抗うつ剤である。非常に好ましい実施態様では、抗うつ剤は、ブプロピオンか、製薬的に受容可能なその塩か、または、ノルプチリンか、製薬的に受容可能なその塩である。
別の実施態様では、更なる薬剤は、メカミラミン、ＳＳＲ５９１８１３、アマンタジン、ペンピジン、ジヒドロ−ベータ−エリスロイジン、ヘキサメソニウム、エリソジン、クロリソンダミン、カンシル酸トリメタファン、塩化ツボクラリン、ｄ−ツボクラリン、バレニクリン、その製薬的に受容可能な塩および光学的異性体から成るグループから選ばれる、ニコチン受容体修飾剤である。非常に好ましい実施態様では、ニコチン受容体修飾剤は、メカミラミンまたは、製薬的に受容可能なその塩である。別の好ましい実施態様では、ニコチン受容体修飾剤は、バレニクリンまたは、製薬的に受容可能なその塩である。
ある実施態様では、本発明は、煙草依存症またはニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、喫煙再開を予防し、禁煙を促進するための方法を含み、その方法は、患者に、本発明のワクチン組成物および更なる薬剤を投与する工程を含む。好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、鼻腔内に、経口的に、皮下に、経皮的に、皮内に、または、静脈内に投与され、その場合、前記更なる薬剤は、経口的に、または、経皮パッチを通じて投与される。さらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物は、Ｑβウィルス様粒子に抱合されたＯ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンを含む。
抗うつ剤、ニコチン受容体作用剤および拮抗剤、カンナビノイドおよびオピオイド受容体拮抗剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤および抗不安剤は、禁煙時に見られるいくつかの症状、例えば、禁断症状、切望、うつ、苛立ち、アネルギア、動機欠如、食欲変化、悪心、および、嗜眠を解除することが可能である。これらは主に脳の受容体に直接作用する。さらに、禁煙に伴う体重増加は、ある数の人々にとっては重大な関心事である。ワクチン接種は、ニコチンの脳への摂取を抑制し、従って、その報酬効果も抑制する。ワクチン接種は、禁断症状を抑制はしないが、一時的再煙時のニコチン依存症の強化を抑制する。従って、ワクチン接種と、抗うつ剤、ニコチン受容体拮抗剤、カンナビノイド受容体拮抗剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤および抗不安剤、および、さらに体重増加を抑制する薬剤を併用するならば、それは、禁煙および喫煙再開防止の助けには有利である。
ニコチン禁断症状を治療し、禁煙を助けるために抗うつ剤が使用される。このような抗うつ剤の一つはブプロピオンであり、商品名ＺｙｂａｎでブプロピオンＨＣｌの持続放出処方が、禁煙補助剤として市販されている。ブプロピオンの作用機構は、ドーパミンおよび／またはノルエピネフィリンの、神経再吸収の抑制を含むと考えられている。ドーパミンは、ニコチンのような依存性物質の報酬効果と関連するので、ノルエピネフィリン摂取の抑制は、禁断症状の減退を誘発すると考えられる。ブプロピオンと製薬的に受容可能なその塩を生産する方法が、米国特許第３，８１９，７０６、および、３，８８５，０４６号に開示されている。光学的に純粋な（＋）−ブプロピオンと同じく純粋な（−）−ブプロピオンの製法が開示されている（カスタルディ（Ｃａｓｔａｌｄｉ）Ｇ．等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８７、５２：３０１８、ムッソー（Ｍｕｓｓｏ）等、１９９３、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，５：４９５−５００）。
本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、ブプロピオン、好ましくは塩酸ブプロピオン投与の併用治療を意図する。投与されるブプロピオンの量は、１日当たり約１５０ｍｇの初回用量を６日間、その後は、１日当たり３００ｍｇの用量を供給するように処方される。
ノルトリプチリンは、うつを治療するのに使用され、また、従来から、禁煙支援において活性のあることが示されている（ダコスタ（ｄａＣｏｓｔａ）等、２００２、Ｃｈｅｓｔ，１２２：４０３−４０８）。ノルトリプチリンの製法は当業者には既知である。本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、ノルトリプチリンの投与から成る併用治療を意図する。ノルトリプチリンは、１日当たり１０−１５０ｍｇの用量で、もっとも好ましくは７５ｍｇの用量で投与される。
ワクチン接種の併用の考えられる、さらに別の抗うつ剤としては、ドキセピン、フルオキセチン、デシプラミン、クロミプラミン、イミプラミン、アミトリプチリン、トリミプラミン、フルボキサミン、プロキセチン、セトラリン、フェネルジン、トラニルシプロミン、アモキサピン、マプロチリン、トラゾドン、ベンラファキシン、ミルトラザピン、それらの製薬的に活性な塩、または、その光学的異性体が挙げられる。
ニコチン受容体作用剤および拮抗剤は、受容体をブロックすることによって喫煙によって感受される報酬を減衰させる。
酒石酸バレニクリンは、その他のニコチン受容体修飾剤である。酒石酸バレニクリン（７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ［２，３−ｈ］［３］ベンザゼピン（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオネート）は、ニコチンの禁断症状の重度を下げる。その合成は、国際公開第ＷＯ０１／６２７３６号に記載される。本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、バレニクリン、好ましくは酒石酸バレニクリンの投与から成る併用治療を意図する。バレニクチンの用量は、１日２回１ｍｇである。
（５ａＳ、８Ｓ，１０ａＲ）−５ａ，６，９，１０−テトラヒドロ，７Ｈ，１１Ｈ−８，１０ａ−メタノピリド［２’，３’：５，６］ピラノ−［２，３−ｄ］アゼピン（ＳＳＲ５９１８１３）は、アルファ４ベータ２ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプに高い親和性で結合する化合物である。誘導体の合成が米国特許第６５３８００３号に記載される。本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、ＳＳＲ５９１８１３の投与から成る併用治療を意図する。ＳＳＲ５９１８１３の用量は、１日当たり１ｍｇから５００ｍｇの用量を供給するように処方される。
本発明の好ましい実施態様では、ニコチン受容体拮抗剤メカミラミン塩酸、または、製薬的に受容可能なその塩が、ニコチンＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチンＱｂ抱合体によるワクチン接種と組み合わせて、禁煙または再発防止支援のために被験者に投与される。メカミラミン塩酸は、ニコチンの生理的、行動的、および、強化作用を阻止することが明らかにされている。メカミラミン塩酸は、１日当たり約１ｍｇから約２５ｍｇの用量を供給するように処方される。
その他の、特定のニコチン拮抗剤としては、アマンタジン、ペンピジン、ジヒドロ−ベータ−エリスロイジン、ヘキサメソニウム、エリソジン、クロリソンダミン、カンシル酸トリメタファン、塩化ツボクラリン、ｄ−ツボクラリン、それらの製薬的に受容可能な塩またはその光学的異性体が挙げられる。
中枢性カンナビノイド受容体拮抗剤も禁煙支援に使用される。そのようなカンナビノイド受容体拮抗剤は、Ｎ−ピペリジノ−５−（４−クロロ−フェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチルピラゾール−３−カルボキサミドであり、下記ではリモナバントと言う。その合成、および、その物質を含む製薬組成が、特許出願、ＥＰ−５７６’３５７、ＥＰ−６５６’３５４、ＷＯ９６／０２２４８およびＷＯ０３／０４０１０５に開示される。リモナバントの効力は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）等（Ｂｅｈａｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，１３，４５１−６３）に記載されている。
本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、リモナバントの投与から成る併用治療を意図する。投与されるリモナバントの量は、１日当たり５から４０ｍｇ、好ましくは１日当たり２０ｍｇの用量を供給するように処方される。
さらに別の実施態様では、ナルトレキソンのようなオピオイド拮抗剤が、ニコチンに対するワクチン接種と併用して使用が可能である。禁煙におけるナルトレキソンおよび関連化合物の使用は、米国特許出願第６００４９７０号に記載されている。典型的用量は、１２．５ｍｇと１５０ｍｇの間である。
抗不安剤も、ニコチン禁断症状の治療のために投与されている。抗不安剤は、禁煙治療時に起こる軽度の不安症状に対する処置、アルコール中毒の治療、および、その他の物質乱用の治療に使用される。抗不安剤イソバレラミドは、禁煙のための使用が従来から推奨されている（バラドリン（Ｂａｌａｄｒｉｎ）等、国際公開ＷＯ９４／２８８８８）。それ以外の抗不安剤としては、ブスピロン、ヒドロキシジンおよびメプロバメートが挙げられる。ブスピロンは、１日当たり約５ｍｇから約６０ｍｇの用量範囲で投与される。
薬剤禁断症状の治療にはモノアミンオキシダーゼ阻害剤が記載されている（国際公開ＷＯ９２／２１３３３およびＷＯ０１／１２１７６）。モノアミンオキシダーゼＡの再帰可能選択的阻害剤、モノアミンオキダーゼＢの再帰可能選択的阻害剤、または、モノアミンオキシダーゼＡおよびＢの再帰可能混合阻害剤は、禁断症状を低減させる活性を有する。再帰可能モノアミンオキシダーゼＡ阻害剤の中では、ベフロキサトン、モクロベミド、ブロファロミン、フェノキサチン、エスプロン、ベフォール、ＲＳ８３５９（三共）、Ｔ７９４（タナベ）、ＫＰ９（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ、米国）、Ｅ２０１１（エーザイ）、トロキサトン、ピルリンドール、アミフラビン、セルクロレミン、および、バジナプリンが挙げられる。モノアミンオキシダーゼＢの再帰可能選択的阻害剤としては、ラザベミド、ミラセミド、カロキサゾン、ＩＦＯ、デプレニル、ＡＧＮ−１１３５、ＭＤＬ７２１４５、および、Ｊ−５０８が挙げられる。肥満症治療のための、ベフロキサトンまたは３−［４−（４，４，４−トリフルオロ−３Ｒ−ヒドロキシブトキシ）フェニル］５（Ｒ）−メトキシメチル−２−オキサゾリジノンの用法は国際公開ＷＯ０１／１２１７６に記載されている。デプレニル異性体セレゲリンの用法は国際公開ＷＯ９２／２１３３３に記載されている。
禁煙に有用なさらに別の化合物はクロニジンである（グーレイ（Ｇｏｕｒｌａｙ）等、Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ，２００３）。本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、クロニジン、好ましくはクロニジン塩酸の投与から成る併用治療を意図する。
禁煙に有用なさらに別の化合物はシブトラミンである。シブトラミンは、人々の減量支援においてＦＤＡの承認を得たが、セロトニンとノルエピネフィリン摂取を抑制する。好ましくは、シブトラミンは、塩酸一水塩形として投与される。投与される用量は、１日当たり１から２０ｍｇ、好ましくは１日当たり１０または１５ｍｇである。本発明の好ましい実施態様は、被験者の禁煙または再発防止を支援するために、ニコチン−ＶＬＰ抱合体、好ましくはニコチン−Ｑｂ抱合体によるワクチン接種、および、シブトラミン、好ましくはシブトラミン塩酸の投与から成る併用治療を意図する。
前述の薬剤は全て、錠剤またはゲルカプセルとして経口的に、または、経皮パッチとして投与されてよい。錠剤、ゲルカプセル、および、経皮パッチの処方は、従来文献に記載される。
禁煙も、抗うつ剤および抗不安剤の併用によって治療されている（グレーザー（Ｇｌａｚｅｒ）米国特許第４，７８８，１８９号、または、ニコチン受容体拮抗剤および抗うつ剤または抗不安剤との併用（カリー（Ｃａｒｙ）、国際公開ＷＯ９９／１７８０３）。
本発明のさらに別の実施態様は、本発明の組成物による免疫化によって生産される免疫分子を含む。免疫分子は、抗体とＴ細胞受容体を含む。このような免疫分子は、ワクチン接種された個体において、標的ハプテンを結合させるのに有用である。免疫分子はまた、本発明の組成物に対して免疫化されていない別の個体に移送されて、「受動的に」免疫を移送するのにも有用である可能性がある。ある実施態様では、免疫分子は抗体である。毒素、ホルモンまたは薬剤を結合させるのに好適なモノクロナール抗体は、個体に移送されると治療または予防を実現する可能性がある。ニコチンおよびその他の依存性薬剤に対する抗体は、依存性行動の一時的寛解をもたらす可能性がある。その他の実施態様では、抗体は、中毒の危険性のある個体、または、有毒因子に急性に暴露された個体に投与されてもよい。
別の実施態様では、抗体は、シクロスポリン、または、その他の免疫抑制剤、または、後天的免疫不全障害、例えば、ＨＩＶ感染で観察されるような免疫不全の個体に移送される。ＨＩＶ感染は、乱用薬剤、特に注射薬剤への依存と関連して起こることが多い。これは、注射薬剤は、個体が、ＨＩＶ感染を獲得する危険度を増すからである（例えば、注射針の共用、売春）。従って、依存性行動の治療は、ＨＩＶが人口の内の未感染個体へ伝播するのを防止するのに有益である。
受動免疫を利用する実施態様では、ある一定規模のヒトドナーを、経験的に定めた、最適免疫化処方によって、本発明の抱合体で免疫化する。様々な時期に、ドナーを静脈穿刺によって流血させ、抗コカイン抗体の抗体価をＥＬＩＳＡにて定量する。多数のドナーからの抗免疫性血漿をプールし、冷却アルコール分画からＩｇＧ分画を単離する。この抗体標本を緩衝化し、安定化し、保存し、かつ、必要に応じて、ヒト使用のための高免疫抗体製剤として標準化する。高ハプテン抗体のレベルはＥＬＩＳＡまたは他の抗体によるアッセイによって標準化される。
精製された抗体の適当な用量が、患者の筋肉内に、皮下に、または、静脈内に注入される。ある実施態様では、抗体は、活発な免疫を惹起するために、異なる解剖的部位に、抱合体ワクチンとして投与される。適当な用量は、高免疫抗体製剤の注入後２４時間または他の適当な時点で、末端患者集団におけるレシピエントの血清レベルを、ＥＬＩＳＡによって、または、他の抗体によるアッセイによって、および／または、ハプテン作用抑制における各種用量の有効性を定量することによって、確定される。
受動的に移送される免疫グロブリンは、患者におけるホルモン、毒素、または、薬剤の作用を抑制する。ヒトのドナー、ポリクロナール抗体、および、ドナープールにおける多数のドナーの利用は、患者による免疫反応が抗体に移送される確率を制限する。
本発明の別の実施態様は、本発明の組成物の生産プロセス、および、前記組成物による医学的治療法を含む。依存症治療に当たっては、精神学的、社会学的、かつ、法学的療法を含めた多様な解決法が共同療法として好適である。依存症の共同治療に有用な薬理学的薬剤としては、デシプラミン、ブプレノルピン、ナロキソン、ハロペリドール、クロルプロアジン、ブロモクリピチン、イボゲイン、マジンドール、抗うつ剤および、当業者には明らかなその他の薬剤が挙げられる。
キット
本発明はまた、キットとして、本発明の組成物による免疫化によってもたらされた抗体を使用して、免疫検定法（例えばＥＬＩＳＡ）によるハプテンの検出を実現する。関連実施態様では、反復性の、規則的なハプテンアレイが、結合アッセイにおいてハプテンに対する抗体の検出に有用である可能性がある。
いくつかの特定の実施態様では、本発明の組成物は、アッセイにおける、または、疾病、状態または障害の診断または検出を実行する、産業規模のセッテイングにおける検出に用いられるキットにまとめられる。本発明によるこのようなキットは、ハプテン−コア粒子抱合体、および、その抱合体に向けられる免疫分子を含む、１種以上の、前述の抱合体または組成物を含む、少なくとも一の容器を含んでよい。本発明の別のキットは、本発明の抱合体および組成物による、本発明の方法によって生産された本発明の、または、当業者に馴染み深い免疫化法によって生産された、１種以上の抗体を含んでいてもよい。本発明のキットは要すれば随意に、少なくともさらに一つの容器をふくんでもよい。この容器は、例えば、１種以上の抗原、１種以上のハプテン、１種以上のコア粒子、１種以上の、本発明の抱合体／組成物、１種以上の、製薬的に受容可能な担体または賦形剤、１種以上のバッファー、１種以上の蛋白、１種以上の核酸分子等を含んでもよい。
本発明は、前述の方法で使用が可能なキットを提供する。ある実施態様では、キットは、本発明の方法によって生産される抗体、好ましくは精製抗体を、１個以上の容器に含む。ある特定の実施態様では、本発明のキットは、キットに含まれる抗体に対して特異的に免疫反応を呈する、実質的に単離されたハプテンを含む。好ましくは、本発明のキットはさらに、興味のハプテンとは反応しない対照抗体を含む。別の特定の実施態様では、本発明のキットは、抗体の、興味のハプテンに対する結合を検出する手段を含む（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、または、発光性化合物であってもよいし、または、第１抗体を認識する第２抗体が検出可能な基質に抱合されてもよい）。
本発明の別の特定の実施態様では、キットは、ニコチンに対して特異的な抗体を含む血清をスクリニーングするのに使用される診断キットである。このようなキットは、ニコチンに向けられたＩｇＡ，ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの抗体であって、本発明のニコチンＱβ ＶＬＰ抱合体によってヒトを免疫化することによって得られる抗体を含む。このキットは、ニコチンと反応しない対照抗体、実質的に単離されたニコチン、コチニンおよびノルニコチンハプテン、および、ハプテン欠如の精製コア粒子を含む。さらにこのキットは、前記抗体のニコチンハプテンに対する結合を検出する手段を含む（例えば、抗体は、フローサイトメトリーによって検出が可能なフルオレセンまたはローダミンのような蛍光化合物に、または、ＥＬＩＳＡで使用されるＨＲＰに抱合されてもよい）。ある特定の実施態様では、キットは、固相支持体に付着されるニコチンを含む。本発明は、各種免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの抗体価がＥＬＩＳＡにて定量される、このキットの用法を実現する。キットにて提供される、抗ニコチンＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧ抗体が、患者血清中の抗体の、相対的抗体価を評価するための対照となる。血清の抗体、および、キットの抗体をニコチンハプテンに結合させ、未結合の血清成分を洗って除去した後、前記抗体を、リポーター分子に抱合された免疫グロブリンサブタイプに対して特異的な抗体と反応させる。未結合の標識抗体を除去するために追加の洗浄工程を行った後、固相に連結するリポーターの量を、適当な蛍光性、発光性、または、比色性基質の存在下に定量する（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）。
上記キットの使用によって、本発明は、ニコチンに対する免疫化の進行をモニターする方法を提供する。免疫化されたヒトにおいて、ニコチンに対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体が、かつ、ニコチンに対するＩｇＥ抗体の欠如が−この抗体の存在はアレルギー反応の発達を示す−免疫化の過程を通じてモニターされる。もしも免疫反応が、ハプテンではなくむしろ主にコア粒子に向けられているのであれば、別のコア粒子を持つ、またある実施態様では別のハプテンを持つ、別のニコチン抱合体が利用される。
ある実施態様では、キットは、ニコチン−コア粒子抱合体が付着する固相支持体を含む。この実施態様では、ある個体の血清中の抗体の、コア粒子上に提示された抗原への結合は、リポーター標識抗体の結合によって検出が可能である。
前述のアッセイにおける固体表面試薬は、既知の技術によって、蛋白材料と固相支持体材料に付着させるように調製される。例えば、ポリマービーズ、ディップスティック、９６−ウェルプレート、または、ろ紙材料である。これらの付着法は、一般に、蛋白の、支持体に対する非特異的吸着、または、固相支持体上の化学的反応基、例えば、活性化カルボキシル、ヒドロキシルまたはアルデヒド基に対する、蛋白の、典型的には、遊離アミノ基による共有結合を含む。別に、ストレプトアビジンでコートされたプレートを、ビオチニル化抗原（単複）と組み合わせて使用することも可能である。
上記から、本発明は、診断法を実行するためのアッセイシステムまたはキットを提供する。このキットは一般的に、結合した組み換え抗原、および、結合した、抗抗原抗体を検出するための、リポーター標識抗体を含む。本発明の、その他の好適なキットは当業者の理解するところである。
関連分野において通常の錬度を有する当業者ならば、本明細書に記述された方法および用途について、他に適当な修飾および適応が簡単に明らかとなり、かつ、本発明の範囲や、その実施態様のいずれからも逸脱することなく実行が可能であることが理解されよう。今や本発明を詳細に記述したのであるから、本発明は、下記の実施例を参照することによってさらに明瞭に理解されることであろう。これらの実施例は、しかし、例示のためにのみここに含めたのであり、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１ ニコチン−Ｑβ抱合体の結合過程
ＶＬＰに結合させるのに好適なニコチン誘導体を、ランゴン等（１９８２、上記）に従って合成した。トランス−４’−カルボキシコチニンは、商業的供給源から入手可能である。トランス−４’−カルボキシコチニンのメチルエステルを、トランス−４’−カルボキシコチニンをメタノール硫酸と反応させて生成した。この溶液を、重炭酸ナトリムで中和し、クロロフォルムで抽出し、回転蒸発器にて濃縮し、エーテル−アセトンから再結晶させた。次に、エーテルに溶解した無水リチウム・アルミニウムによってこのメチルエステルを還元すると、トランス−３’−ヒドロキシメチルニコチンが得られた。次に、Ｏ’−スクシニル−ヒドロキシメチルニコチンを、ベンゼンに溶解した無水コハク酸を添加して生成した。この溶液を回転蒸発器にて濃縮した。次に、カルボキシル基の活性化を、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）の添加によって実現し、Ｏ’−スクシニル−ヒドロキシメチルニコチン（下記では、「Ｓｕｃ−Ｎｉｃ」と短縮）のＮ−ヒドロキシスクシニミド・エステルを得た。
Ｑβ ＣＰ ＶＬＰ（配列番号３）を、Ｈｅｐｅｓ緩衝生食液ＨＢＳ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）にて塩析した。ニコチン誘導体Ｓｕｃ−Ｎｉｃを、１２１ｍＭの濃度でＨＢＳに溶解した。これを、Ｑβ ＣＰ ＶＬＰ溶液（０．１４ｍＭ）に、１ｘ、５ｘ、５０ｘ、１００ｘ、および、５００ｘモル過剰に加え、振とう器上にて室温で２時間インキュベートした。次に、反応液を、ＨＢＳ、ｐＨ８．０（カットオフ、１００００ダルトン）に対して塩析し、液体窒素にて瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。ニコチン誘導体ｓｕｃ−ｎｉｃは、アミド結合形成下に、Ｑβ表面のリシンと反応した。得られた、共有結合による抱合体を、本明細書では「Ｎｉｃ−Ｑβ」と名づける。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、Ｓｕｃ−Ｎｉｃのモル過剰が増すにつれて、Ｑβモノマーバンドが、より高い分子量に変位することが示された（図１Ａ）。結合産物の中にニコチンの存在することが、抗ニコチン抗血清によるウェスタンブロットによって確認された。未結合Ｑβコントロール、および、１ｘおよび５ｘ過剰濃度のニコチンと結合したＱβは、抗ニコチン反応バンドを示さなかったが、５０ｘ、１００ｘおよび５００ｘのバンドは、明らかに、ニコチンのＱβに対する共有結合を示した（図１Ｂ）。これは、ウェルにニコチン−ＢＳＡをコートし、抗ニコチン抗血清検出によるＥＬＩＳＡによって確認された。５００倍過剰ニコチンと結合したＱβは、５０倍過剰で生産されたワクチンに比較して用いた場合より高い吸収が得られた。
実施例２ Ｎｉｃ−Ｑβによるマウスの免疫化、および、抗ニコチン抗体の抗体価測定
Ａ．マウスの免疫化
１０週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｓｕｃ−Ｎｉｃの５００ｘ過剰による結合由来のニコチン−Ｑβ（Ｎｉｃ−Ｑβ）３０μｇでワクチン摂取した。ワクチンは、滅菌ＰＢＳにて希釈し、ミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を添加して、または、添加無しで、鼻腔内に、または、静脈内に注入した。第１回免疫化後１４日目に、マウスに追加免疫化を行った（表１）。２９日目、血清中のニコチン特異的抗体の抗体価をＥＬＩＳＡによって定量した。
表１ マウスの免疫化スキーム
Figure 0005084103
Ｂ．ＥＬＩＳＡ
血清は、ニコチン特異的ＥＬＩＳＡにて分析した。マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）を、コーティングバッファー（ｐＨ９．６）中でＢＳＡ（ＮＡＢ０３）に結合させた５μｇ／ｍｌにて一晩コートした。洗浄およびＰＢＳに溶解させた２％ＢＳＡにてブロックした後、２％ＢＳＡ／１％ＦＣＳ／ＰＢＳにて様々な希釈度で希釈した。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗い（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）、マウス抗体サブクラスに対して特異的な、ＨＲＰＯ標識抗体を加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを洗い、クエン酸バッファーに溶解した発色基質ＯＰＤを加えた。５分後、発色反応を５％Ｈ２ＳＯ４にて停止させた。
４５０ｎｍにおける光学的密度をＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて読み取った。ＩｇＥの検出には、血清を、あらかじめエッペンドルフ管中にて、振とう器の上で３０分プロテインＧとインキュベートし、それからＥＬＩＳＡプレートに加えた。
Ｎｉｃ−Ｑβワクチンは、ニコチン特異的ＩｇＧ抗体を誘発した（図３Ａ）。ＥＬＩＳＡ抗体価を全ＩｇＧ反応について計算した（図３Ｂ、表２）。ＥＬＩＳＡ抗体価は、ＥＬＩＳＡにおいて、最大値の半分の光学的密度信号（ＯＤ５０％）を与える、血清の希釈度と定義した。ミョウバンを伴う皮下ルートの場合、Ｎｉｃ−Ｑβによって得られたＩｇＧの平均抗体価は１３２２８であった。鼻腔内ルートの場合、ニコチン−Ｑβ抗体価は３８０５２であった。
ＩｇＧサブタイプとＩｇＥもＥＬＩＳＡで測定し、抗体価を定量した（図３、図４、表ＩＩ）。試験したいずれの条件でも、背景（免疫前血清）を有意に上回るＩｇＥ反応は検出されなかった。ＩｇＧ２ａのＩｇＧ１抗体価に対する比率は、Ｔｈ１介在性免疫反応を示す。２．１という比率が、ミョウバン無しのＮｉｃ−Ｑβ皮下によって免疫化されたマウスにおいて測定され、これは、鼻腔に投与された場合に２．６に強調された。予想通り、ミョウバンは、免疫反応をよりＴｈ２型反応の方に押しやり、０．４という比率をもたらした。注目すべきことに、Ｎｉｃ−Ｑβワクチンも高いＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３抗体価を誘発した。相当量の、抗ニコチンＩｇＡ抗体が血清中に認められた（図５）。これは、粘膜表面におけるＩｇＡの存在を示す。
鼻腔内免疫化によって高いニコチン抗体価が得られたことは特に注目に値する。
表２ ワクチン接種マウスにおけるニコチン特異的抗体の抗体価
Figure 0005084103
実施例３ ラットの血漿および脳におけるニコチン分布の評価
数群のラットを、ニコチン−ＶＬＰワクチンによって免疫化し、２１日目に追加免疫した。一つのグループは、３５日目に第二の追加免疫を受けた。最後の追加免疫の７から１０日後に、ラットを麻酔し、血液採取のためにカテーテルを股動脈・静脈に、ニコチン投与のために他方の脚の頚静脈に設置した。３μＣｉの３Ｈ−（−）−ニコチンを含むニコチン０．０３ｍｇ／ｋｇを、頚静脈から、１ｍｌ／ｋｇ０．９％生食液で、１０秒間注入した。この放射標識は、ごく少量の血液からニコチン濃度の推定を可能とするために添加したものである。これは、ニコチン投与後最初の９０秒間の、ニコチンからコチニンへの代謝はラットでは無視できるからである。血液（０．３ｍｌ）を、１５秒置きに９０秒まで、両側の股動脈・静脈カテーテルから取り出し、直ちに遠心し、アッセイのために血清分離した。ラットは３分で断頭にて殺し、脳を素早く取り出し、水で洗い、アッセイまで−２０℃で保存した。血清中の３Ｈ−ニコチンの測定のために、１００μｌの血清を液体シンチレーション液と混合した。脳サンプルは、抽出前に、５倍容量のＮａＯＨで消化し、シンチレーション液の添加後に分析した。
ワクチン接種によるニコチン特異的抗体は、血清中の３Ｈ−ニコチンに結合することが可能であるが、脳への拡散は抑制または低下した。従って、脳のニコチン濃度の低下、血漿ニコチン濃度の上昇が測定された。
実施例４ ニコチンハプテンのＨｂｃＡｇ−Ｌｙｓに対する化学的結合
Ｏ−スクシニル−ヒドロキシメチルニコチンは、実施例１に記載する通りに調製し、ＥＤＣおよびＮＨＳとインキュベートして活性化Ｎ−ヒドロキシスクシナミドエステル（Ｓｕｃ−ｎｉｃ）を生成した。精製ＨｂｃＡｇ−Ｌｙｓ ＶＬＰは、係属出願の米国特許出願第１０／０５０，９０２号に記載される通りに調製した。ＨＢＳに溶解させたＳｕｃ−Ｎｉｃ溶液を、１ｘ、５ｘ、５０ｘ、１００ｘおよび５００ｘモル過剰で、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの９５％純度溶液に加え（２ｍｇ／ｍｌ）、室温で２時間インキュベートした。反応終了後、混合物を、ＨＢＳ、ｐＨ８．０に対して一晩塩析し、液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と抗ニコチン抗血清によるウェスタンブロットでモニターした。ニコチン装飾粒子をげっ歯類に注入し、ニコチンに対する免疫反応を誘発した。
実施例５ ニコチンハプテンの、大腸菌１型線毛に対する化学的結合
Ｉ型線毛は、２００２年１月１８日登録の、継続中の米国出願１０／０５０，９０２に記載されている通りに、ベクターｐＦＩＭＡＩＣＤＦＧＫによって形質変換されたＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株から調製し、遠心で精製した。この開示の全体を引用することにより本明細書に含める。ＨＢＳに溶解した活性化ハプテンＳｕｃ−Ｎｉｃを、１ｘ、５ｘ、５０ｘ、１００ｘおよび５００ｘモル過剰で、Ｉ型線毛粒子の９５％純度溶液（２ｍｇ／ｍｌ）に加え、室温で２時間インキュベートした。反応終了後、混合物を、ＨＢＳ、ｐＨ８．０に対して塩析し、液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と抗ニコチン抗血清によるウェスタンブロットでモニターした。ニコチン装飾粒子をげっ歯類に注入し、ニコチンに対する免疫反応を誘発した。
実施例６ ニコチン依存症の治療に好適な複数ハプテンワクチンの合成
ニコチン、および、製薬的に活性な代謝産物コチニンおよびノルニコチンの複数のエピトープを標的するように設計された、ニコチン依存症に対するワクチンを調製した。６−（カルボキシメチルウレイド）−（±）−ニコチン（ＣＭＵＮｉｃ）、トランス−３’−アミノメチルニコチン・スクシネート、Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチン、トランス−４’−カルボキシコチニン、Ｎ−［１−オキソ−６−［（２５）−２−（３−ピリジル）−１−ピロリジニル］ヘキシル］−β−アラニン、４−オキソー４−［［６−［（５Ｓ）−２−オキソ−５−（３−ピリジニル）−１−ピロリジニル］］ヘキシル］アミノ］−ブタン酸、（２Ｓ）−２−（３−ピリジニル）−１−ピロリジンブタン酸・フェニルメチルエステル、（２Ｒ）−２−（３−ピリジニル）−１−ピロリジンブタン酸・フェニルメチルエステル、コチニン４’−カルボン酸、Ｎ−スクシニル−６−アミノ−（＋／−）−ニコチン、６−（σ−アミノカプラミド）−（＋／−）−ニコチン−および６−（σ−アミノカプラミド）−（＋／−）−ニコチン−抱合体、スクシニル化３’、４’および５’アミノメチルニコチン、５および６アミノニコチン、および、アセチルニコチンの３’、４’および５’アセチル誘導体の、ＨＢＳに溶解させたそれぞれ１２０ｍＭ溶液。この溶液をＥＤＣおよびＮＨＳと混合して、活性化体を形成し、これを、別々の反応として、別の場所で記述したように、Ｑβ ＶＬＰに対して１０−１００モル過剰になるように添加した。
Ｓ−１−（ｂ−アミノエチル）ニコチニウムクロリドジクロリド、および、Ｓ−１−（ｂ−アミノエチル）コチニウムクロリドヒドロクロリドの個々の溶液を、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルフォネートによってＱβ ＶＬＰに結合させた。
これらの抱合体の選択から、ニコチンハプテンＱβ ＶＬＰ抱合体の内から８種、コチニンＱβ ＶＬＰ抱合体、および、ノルニコチン抱合体Ｑβ ＶＬＰを混合してワクチン組成物を形成し、これを、各個体にワクチン接種するのに用いた。２回の投与後、ＨＢｃ−Ｌｙｓ ＶＬＰ抱合体に結合した平行ハプテンによって３回追加免疫した。
実施例７ コカインＶＬＰ−ハプテン抱合体の合成
米国特許第５，８７６，７２７号に記載してある通り、塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解した、ノルコカイン塩酸（１ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）およびトリエチラミン（０．８６ｍｌ、６．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、無水コハク酸（６１４ｍｇ、６．１４ｍｍｏｌ）で処理し、混合液を４５℃で一晩加熱した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をリリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶出液として２：１のクロロフォルム：メタノール）にて精製した。これによって、スクシニル化ノルコカインが濃密なシロップとして得られた（１．０ｇ、８４％）（３β−（ベンゾイルオキシ）−８−スクシノイル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−２β−カルボン酸メチルエステル）。蒸留水（１ｍｌ）に溶解させたこの酸（１４ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）に０℃で、ＥＤＣ（１０．４ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、ＰＢＳ（１ｍｌ）に溶解させたＱβ ＶＬＰの溶液を滴下し、混合液を一晩で周囲温まで暖まるにまかせた。抱合体は、ＰＢＳに対して塩析して精製し、抱合の程度を、質量分光分析によって分析した。得られた抱合体を用いて個体を免疫した。
理解を明らかにするために、具体例や実施例に基づいて、詳細に渡って本発明を十分に説明してきたのであるから、当業者には、本発明の範囲を侵すことなく、広範な、等価的条件、処方、および、その他の変数内で、本発明を修飾または変更することによって同じものが実行可能であること、および、そのような修飾や変更は、付属の特許請求項の範囲の中に含まれるように意図されていることは明白であろう。
本明細書に言及された全ての公刊物、特許、および、特許出願は、本発明の関わる当業者の錬度を示すものであり、各個別の公刊物、特許または特許出願が、参照することによって特異的に、個別的に本明細書に含められると示したのと同じ程度に、参照することによって本明細書に含められる。
実施例８ マウスの血漿および脳におけるニコチン分布の評価
４から５匹のマウスから成る複数群を、実施例１に記述した通りに調製されたニコチン−ＶＬＰワクチン６０μｇによって免疫化し、３５日目と６３日目同じ量のワクチンで追加免疫した。最後の追加免疫の１４日後に、マウスの尾の基部に、５μＣｉの３Ｈ−（−）−ニコチンを含む（−）−ニコチン水素酒石酸塩７５０ｎｇを静注した。ニコチンの量は０．０３ｍｇ／ｋｇに相当し、これは、一人の喫煙者が２本の紙巻煙草から摂取するニコチンと等価的である。放射標識は、ごく少量の血液からニコチン濃度の推定を可能とするために添加された。５分後、マウスはＣＯ２にて屠殺した。血液を、心臓穿刺によって取り出し、血清を調製した。脳を直ちに解剖し、付着する血液を取り除き、重量を測定した。血清中の３Ｈ−ニコチンの測定のために、５０μｌの血清を液体シンチレーション液と混合した。脳サンプルは、２ｍｌの組織可溶化装置（Ｓｅｒｖａ）で完全に溶解し、シンチレーション液の添加後に分析した。放射活性から、血清および脳内のニコチン濃度を計算した（図７）。
ワクチン接種によって誘発されたニコチン特異的抗体は、血清中の３Ｈ−ニコチンに結合することが可能であるが、脳への拡散は抑制または低下した。従って、脳のニコチン濃度の低下、血漿ニコチン濃度の上昇が測定された。ニコチン−ＶＬＰワクチンは、ミョウバン無添加の場合、脳のニコチン摂取を５６％抑制することができ、ミョウバンの存在下では６８％抑制することができた（図７）。
さらに別の免疫化スケジュールも、例えば、０日目に免疫化、１４日目に追加免疫でも、ニコチンの脳内摂取を著明に低下させることができた。一般に、高い抗ニコチン抗体価は、高いワクチン効率と相関していた。
実施例９ ＡＰ２０５のコート蛋白遺伝子
ＡＰ２０５のコート蛋白（ＣＰ）のｃＤＮＡ（配列番号９０）を、ファージＡＰ２０５ＲＮＡから、逆転写酵素ＰＣＲ技術によって２本のｃＤＮＡ断片を生成し、市販のプラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローンし配列決定してまとめた。逆転写酵素技術は、関連分野の当業者には既知である。プラスミドｐ２０５−２４６に含まれる第１断片は、ＣＰ配列上流の２６９ヌクレオチド、および、ＣＰの最初の２４個のＮ末端アミノ酸をコードする７４個のヌクレオチドを含んでいた。２番目の断片は、プラスミドｐ２０５−２６２に含まれるものであるが、ＣＰのアミノ酸１２−１３１をコードする３６４個のヌクレオチドと、ＣＰ配列下流のさらに１６２個のヌクレオチドを含んでいた。ｐ２０５−２４６とｐ２０５−２６２の両方とも、Ｊ．Ｋｌｏｖｉｎｓから寛大にも恵与されたものである。
プラスミド２８３．−５８は、プラスミドｐ２０５−２４６およびｐ２０５−２６２からの両ＣＰ断片を融合して、全長のＣＰ配列とするために、２工程ＰＣＲによって設計された。
プラスミドｐＱｂ１８５にクローニングするためのＮｃｏＩ部位を含む上流プライマーｐ１．４４、または、プラスミドｐＱｂ１０にクローニングするためのＸｂａＩ部位を含むｐ１．４５、および、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む下流プライマーｐ１．４６を用いた（制限酵素の認識配列には下線を施す）。
p1.44 5'-NNCC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3'（配列番号５）
p1.45 5'-NNTCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3' （配列番号２０）
p1.46 5'-NNAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3' （配列番号２１）
さらに２個のプライマー、ｐ２０５−２６２に含まれる断片の５’末端にアニールするｐ１．４７、および、プラスミドｐ２０５−２４６に含まれる断片の３’末端にアニールするｐ１．４８を、最初のＰＣＲにおいて断片の増幅に用いた。プライマーｐ１．４７およびｐ１．４８は、互いに相補的である。
p1.47: 5'-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTG-3' （配列番号２２）
p1.48: 5'-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGAGTTGGATCACTC-3' （配列番号２３）
最初の２回のＰＣＲ反応では、２個の断片が生成された。第１断片は、プライマーｐ１．４５とｐ１．４８で、鋳型ｐ２０５−２４６で生成された。第２断片は、プライマーｐ１．４７とｐ１．４６で、鋳型ｐ２０５−２６２で生成された。両断片とも、プライマー組み合わせｐ１．４５とｐ１．４６、または、ｐ１．４４とｐ１．４６で、第２ＰＣＲ反応で、スプライス重複伸長反応、鋳型として使用された。ＰＣＲ反応産物は、それぞれ、ＸｂａＩまたはＮｃｏＩにて、また、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ制限部位を持つものとして、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファンオペロンプロモーターの制御下に、２種のｐＧＥＭ−由来発現ベクター、ｐＱｂ１０またはｐＱｂ１８５にクローンした。
２種のプラスミドが得られた。ｐＱｂ１０においてｗｔＡＰ２０５ ＣＰ（配列番号１４）をコードする遺伝子を含むｐＡＰ２８３−５８（配列番号１５）、および、ｐＱｂ１８５において、突然変異Ｐｒｏ５−＞Ｔｈｒ（配列番号１８）を含むｐＡＰ２８１−３２（配列番号１９）である。コート蛋白配列は、ＤＮＡ配列決定法によって確認された。ＰＡＰ２８３−５８は、ＣＰのＡＴＧコドンの上流、ＸｂａＩ部位の下流に４９個のヌクレオチドを含み、かつ、コート蛋白ｍＲＮＡの、元々のリボソーム結合部位と考えられる配列を含む。
実施例１０ 組み換えＡＰ２０５ＶＬＰの発現と精製
Ａ．組み換えＡＰ２０５ＶＬＰの発現
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ２８３−５８にて形質変換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む、５ｍｌのＬＢ培養液に単一コロニーを接種し、振とうせず、３７℃で１６−２４時間インキュベートした。
調製した接種体を、２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００−３００ｍｌのＬＢ培養液で１：１００に希釈し、振とうせずに３７℃で一晩インキュベートした。得られた、第２接種体を、０．２％のグルコースとバッファー用のリン酸を含む２ＴＹ培養液にて１：５０に希釈し、振とう器上で３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心で収集し、−８０℃で凍結した。
Ｂ．組み換えＡＰ２０５ＶＬＰの精製
溶液およびバッファー
１．溶菌バッファー
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５ｍＭのＥＤＴＡを含む。０．１％
ｔｒｉｔｏｎＸ１００およびＰＭＳＦ、ｍｌ当たり５μｇ
２．ＳＡＳ
硫酸アンモニウム飽和水溶液
３．バッファーＮＥＴ
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む
４．ＰＥＧ
４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００、ＮＥＴに溶解
溶菌
凍結細胞を、２ｍｌ／ｇ細胞で溶菌バッファーに再懸濁した。この混合物を、２２ｋＨで１５秒間で５回超音波処理した。１分間の間隔時には溶液を氷上にて冷却した。次に、溶菌体を、Ｆ３４−６−３８ローター（Ｅｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて１２０００ｒｐｍにて２０分遠心した。後述の遠心工程は全て、別様に言及しない限り、同じローターにて行った。上清を４℃で保存し、一方、細胞デブリは、２回、溶菌バッファーで洗浄した。遠心後、溶菌物の上清、および、洗浄分画は合わせてプールした。
硫酸アンモニウム沈殿を用いて、ＡＰ２０５ ＶＬＰをさらに精製することが可能である。第１工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが沈殿しない硫酸アンモニウム濃度を選んだ。得られたペレットは廃棄した。次の工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが定量的に沈殿する硫酸アンモニウム濃度を選び、ＡＰ２０５ ＶＬＰを、遠心（１４０００ｒｐｍ、２０分）により、この沈殿工程のペレットから分離した。得られたペレットをＮＥＴバッファーに溶解した。
クロマトグラフィー
プールした上清から得られたカプシド蛋白を、セファロース４Ｂカラム（２．８ｘ７０ｃｍ）に負荷し、ＮＥＴバッファーにより４ｍｌ／時／分画にて溶出した。分画２８−４０を集め、６０％飽和にて硫酸アンモニウムで沈殿させた。この分画を、沈殿前に、ＡＰ２０５に対して特異的な抗血清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにて分析した。遠心によって分離したペレットは、ＮＥＴバッファーに再度溶解し、セファローズ２Ｂカラム（２．３ｘ６５ｃｍ）に負荷し、３ｍｌ／時／分画にて溶出した。分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、分画４４−５０を採取し、プールし、６０％飽和にて硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心によって分離されたペレットをＮＥＴバッファーに再度溶解し、セファロース６Ｂカラム（２．５ｘ４７ｃｍ）にて精製し、３ｍｌ／時／分画にて溶出した。この分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、分画２３−２７を採取し、塩濃度を０．５Ｍに調整し、４０％保存水溶液から最終濃度１３．３％まで加えたＰＥＧ６０００で沈殿させた。遠心によって分離されたペレットをＮＥＴバッファーに再度溶解し、上と同じセファローズ２Ｂカラムに負荷し、同様にして溶出した。分画４３−５３を採取し、６０％飽和にて硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心によって分離したペレットを再度水に溶解したが、得られた蛋白溶液は、水に対して広範に塩析された。細胞１グラム当たり約１０ｍｇ精製蛋白を単離することができた。電子顕微鏡によりウィルス様粒子を調べたところ、それらはファージ粒子と同一であることが示された。
図１は、Ｎｉｃ−Ｑβ抱合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの分析を示す。ニコチン誘導体Ｓｕｃ−Ｎｉｃを、様々の濃度（１ｘ、５ｘ、５０ｘ、および、５００ｘモル過剰）でＱβに結合させた。反応液の分液を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、クーマッシー青で染めた（Ａ）。平行なゲル移動軌跡から、蛋白をニトロセルロースに転送し、ニコチン−コレラトキシンに対して惹起させた抗血清にて検出し、次に、ＨＲＰＯ−抱合山羊抗マウスＩｇＧとＥＣＬ検出を行った（Ｂ）。左辺縁に分子量マーカーを示す。 図２は、ニコチン特異的ＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体価を示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストした。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度を示す（Ａ）。抗体価は、最大値の半分の光学密度を与える希釈度から計算した（Ｂ）。 図３Ａは、ニコチン特異的ＩｇＧサブタイプを示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストし、また、ＩｇＧのサブタイプ、ＩｇＧ１に対して特異的な二次抗体にて検出した。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度が示されている。３匹のマウスの平均を示す。 図３Ｂは、ニコチン特異的ＩｇＧサブタイプを示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストし、また、ＩｇＧのサブタイプ、ＩｇＧ２ａに対して特異的な二次抗体にて検出した。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度が示されている。３匹のマウスの平均を示す。 図３Ｃは、ニコチン特異的ＩｇＧサブタイプを示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストし、また、ＩｇＧのサブタイプ、ＩｇＧ２ｂに対して特異的な二次抗体にて検出した。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度が示されている。３匹のマウスの平均を示す。 図３Ｄは、ニコチン特異的ＩｇＧサブタイプを示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストし、また、ＩｇＧのサブタイプ、ＩｇＧ３（Ｄ）に対して特異的な二次抗体にて検出した。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度が示されている。３匹のマウスの平均を示す。 図４は、ニコチン特異的ＩｇＥ抗体を示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストし、また、ＩｇＥサブタイプに対して特異的な二次抗体にて検出した。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度が示されている。各グループ当たり３匹のマウスの平均を示す。 図５は、ニコチン特異的ＩｇＡ抗体を示す。ワクチン接種されたマウスの血清について、そのＢＳＡに結合するニコチンに対する反応性をＥＬＩＳＡにてテストし、また、ＩｇＡサブタイプに対して特異的な二次抗体にて検出した。各血清希釈において得られた４５０ｎｍにおける光学密度が示されている。各グループ当たり３匹のマウスの平均を示す。 図６Ａは、ニコチン−ＶＬＰワクチン接種の効力を示す。マウスをニコチン−ＶＬＰにて免疫化し、３Ｈ−ニコチンの注入後、血清および脳の中のニコチン濃度を測定した。グループ当たり４または５匹のマウスの平均が示されている。 図６Ｂは、ニコチン−ＶＬＰワクチン接種の効力を示す。マウスをニコチン−ＶＬＰにて免疫化し、３Ｈ−ニコチンの注入後、血清および脳の中のニコチン濃度を測定した。グループ当たり４または５匹のマウスの平均が示されている。

Claims (42)

  1. ハプテン−担体抱合体であって、
    ａ．少なくとも一の第１付着部位を含む担体、および、
    ｂ．少なくとも一の第２付着部位を有する、少なくとも一のニコチンハプテンを含み、
    前記担体は、コア粒子であり、
    前記第２付着部位は、少なくとも一の共有非ペプチド結合を介して前記第１付着部位に結合して、規則的で、反復性のハプテン−担体抱合体を形成することが可能であり、
    前記コア粒子は、ＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはそれから成るウィルス様粒子であり、
    前記組み換えタンパク質は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、又は配列番号４及び配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物を含むか、あるいはそれから成っており、前記ニコチンハプテンは、
    （ａ）６−（カルボキシメチルウレイド）−（±）−ニコチン（ＣＭＵＮｉｃ）、
    （ｂ）トランス−３’−アミノメチルニコチンスクシネート、
    （ｃ）Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチン、
    （ｄ）トランス−４’−カルボキシコチニン、
    （ｅ）Ｎ−［１−オキソ−６−［（２５）−２−（３−ピリジル）−１−ピロリジニル］ヘキシル］−β−アラニン、
    （ｆ）６−（シグマ−アミノカプラミド）−（±）−ニコチン、
    （ｇ）３’アミノメチルニコチン、
    （ｈ）４’アミノメチルニコチン、
    （ｉ）５’アミノメチルニコチン、
    （ｊ）５アミノニコチン、
    （ｋ）６アミノニコチン、および
    （ｌ）Ｓ−１−（ｂ−アミノエチル）ニコチニウムクロリド
    からなる群から選択される、抱合体。
  2. 前記第１付着部位は、
    （ａ）アミノ基、
    （ｂ）カルボキシル基、
    （ｃ）スルフヒドリル基、
    （ｄ）ヒドロキシ基、
    （ｅ）グアニジニル基、または、
    （ｆ）ヒスチジニル基
    を含む、請求項１に記載の抱合体。
  3. 前記少なくとも一の第１付着部位は、リジン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、ヒスチジン残基、および、チロシン残基から選択される、請求項１又は２に記載の抱合体。
  4. 前記少なくとも一の第１付着部位はリジン残基である、請求項１から３の何れか一項に記載の抱合体。
  5. 前記ニコチンハプテンは、Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の抱合体。
  6. 前記ニコチンハプテンは、Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンから形成される、請求項１から４の何れか一項に記載の抱合体。
  7. 前記第２付着部位は、
    （ａ）アミン、
    （ｂ）アミド、
    （ｃ）カルボキシル、
    （ｄ）スルフヒドリル、
    （ｅ）ヒドロキシル、
    （ｆ）アルデヒド、
    （ｇ）ジアゾニウム、
    （ｈ）アルシルハロゲニド、
    （ｉ）ヒドラジン、
    （ｊ）ビニール、
    （ｋ）マレイミド、
    （ｌ）スクシンイミド、および、
    （ｍ）ヒドラジド、
    からなる群から選択される活性基を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の抱合体。
  8. 前記第２付着部位がアミドを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の抱合体。
  9. 前記第２付着部位は、前記Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンのＯ−スクシニル部分と第１付着部位との反応によって形成され、リジン残基が前記第１付着部分である、請求項１から８の何れか一項に記載の抱合体。
  10. 前記抱合体は、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質を含むウィルス様粒子に抱合されたＯ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の抱合体。
  11. 前記ウィルス様粒子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から成るか、あるいは配列番号４又はその変異体及び配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物から成る、請求項１から１０の何れか一項に記載の抱合体。
  12. 前記ウィルス様粒子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から成る、請求項１から１０の何れか一項に記載の抱合体。
  13. 前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子であり、前記ＲＮＡファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるコートタンパク質を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の抱合体。
  14. 前記第１付着部位はリジン残基であって、前記第１付着部位は前記コア粒子に天然に存在する、請求項１３に記載の抱合体。
  15. 請求項１から１４の何れか一項に記載の抱合体と、製薬学的に受容可能な担体とを含む製薬組成物。
  16. 前記製薬組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の製薬組成物。
  17. 前記製薬組成物がアジュバントを含まない、請求項１５に記載の製薬組成物。
  18. 請求項１から１４の何れか一項に記載の抱合体を含むワクチン組成物であって、更にアジュバンドを含むワクチン組成物。
  19. 請求項１から１４の何れか一項に記載の抱合体を含むワクチン組成物であって、アジュバンドは含まないワクチン組成物。
  20. ニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、禁煙を促進し、または、再発を防止するための製薬組成物であって、請求項１８又は１９に記載のワクチン組成物と更なる薬剤との治療上有効な組み合わせを含む製薬組成物。
  21. 前記更なる薬剤は、
    （ｎ）抗うつ剤、
    （ｏ）ニコチン受容体モジュレータ、
    （ｐ）カンナビノイド受容体拮抗剤、
    （ｑ）オピオイド受容体拮抗剤、
    （ｒ）モノアミンオキシダーゼ阻害剤、および、
    （ｓ）抗不安剤
    からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記更なる薬剤は、ブプロピオン、ドキセピン、デシプラミン、クロミプラミン、イミプラミン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、フェネルジン、トラニルシプロミン、アモキサピン、マプロチリン、トラゾドン、ベンラファキシン、ミルタザピン、それらの製薬学的に活性な塩、および、それらの光学的異性体からなる群から選択される抗うつ剤である、請求項２０に記載の組成物。
  23. 前記抗うつ剤は、ブプロピオンまたはその製薬学的に受容可能な塩、またはノルトリプチリン、またはその製薬学的に受容可能な塩のいずれかである、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記更なる薬剤は、メカミラミン、（５ａＳ、８Ｓ，１０ａＲ）−５ａ，６，９，１０−テトラヒドロ，７Ｈ，１１Ｈ−８，１０ａ−メタノピリド［２’，３’：５，６］ピラノ−［２，３−ｄ］アゼピン（ＳＳＲ５９１８１３）、アマンタジン、ペンピジン、ジヒドロ−ベータ−エリスロイジン、ヘキサメソニウム、エリソジン、クロリソンダミン、カンシル酸トリメタファン、塩化ツボクラリン、ｄ−ツボクラリン、バレニクリン、それらの製薬的に受容可能な塩およびそれらの光学的異性体からなる群から選択されるニコチン受容体モジュレータである、請求項２０に記載の組成物。
  25. 前記ニコチン受容体モジュレータは、メカミラミンまたはその製薬学的に受容可能な塩、または酒石酸バレニクリンである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記更なる薬剤は、（ａ）カンナビノイド受容体拮抗剤であり、前記カンナビノイド拮抗剤はリモナバントであるか、（ｂ）ヒドロキシジン、メプロバメート、ブスピロン、それらの製薬学的塩およびそれらの光学的異性体からなる群から選択される抗不安薬であるか、（ｃ）クロニジンであるか、または（ｄ）シブトラミンである、請求項２０に記載の組成物。
  27. 動物において薬物に対する免疫反応を誘発する方法に使用するための、免疫学的有効量の請求項１から１４の何れか一項に記載の抱合体であり、前記薬物がニコチンである抱合体であって、
    前記方法が、前記抱合体の前記有効量を動物に投与し、前記動物が、前記薬物に対して免疫反応を生ずることを可能とし、前記抱合体は、前記動物に対して、鼻腔内、経口、皮下、経皮、筋肉内、または静脈内からなる群から選択されるルートを通じて投与されることを含んで成る、抱合体。
  28. 請求項２７に定義の方法に使用するための抱合体であって、前記方法が１回を越える免疫化を含み、前記免疫化が同じルートによる、請求項２７に記載の抱合体。
  29. 請求項２７に定義の方法に使用するための抱合体であって、前記方法が１回を越える免疫化を含み、前記免疫化が別々のルートによる、請求項２７に記載の抱合体。
  30. 前記薬物がニコチンである、請求項２７から２９の何れか一項に記載の抱合体。
  31. 動物においてニコチンに対する免疫反応を誘発する医薬の製造における、請求項１から１４の何れか一項に記載の免疫学的有効量の抱合体の使用であって、前記使用が請求項２７から３０の何れか一項にさらに定義されている使用。
  32. 動物におけるニコチン依存症を治療または予防する方法に使用するための免疫学的有効量のニコチンハプテン−担体抱合体であって、
    ａ．少なくとも一の第１付着部位を有するウィルス様粒子担体、および、
    ｂ．少なくとも一の第２付着部位を有する少なくとも一のニコチンハプテン
    を含んでなり、前記ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはそれから成っており、前記組み換えタンパク質は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、又は配列番号４及び配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物を含むか、あるいはそれから成り、
    前記第２付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して前記第１付着部位に結合して、規則的で、反復性のニコチンハプテン−担体抱合体を形成することが可能であり、前記第２付着部位は少なくとも一の非ペプチド結合を介して前記第１付着部位に結合が可能であり、
    前記方法は前記動物に対して免疫学的有効量の前記抱合体を投与することを含み、前記抱合体は前記動物に鼻腔内、経口、皮下、経皮、筋肉内、または静脈内に投与され、前記ニコチンハプテンは、
    （ａ）６−（カルボキシメチルウレイド）−（±）−ニコチン（ＣＭＵＮｉｃ）、
    （ｂ）トランス−３’−アミノメチルニコチンスクシネート、
    （ｃ）Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチン、
    （ｄ）トランス−４’−カルボキシコチニン、
    （ｅ）Ｎ−［１−オキソ−６−［（２５）−２−（３−ピリジル）−１−ピロリジニル］ヘキシル］−β−アラニン、
    （ｆ）６−（シグマ−アミノカプラミド）−（±）−ニコチン、
    （ｇ）３’アミノメチルニコチン、
    （ｈ）４’アミノメチルニコチン、
    （ｉ）５’アミノメチルニコチン、
    （ｊ）５アミノニコチン、
    （ｋ）６アミノニコチン、および
    （ｌ）Ｓ−１−（ｂ−アミノエチル）ニコチニウムクロリド
    からなる群から選択される、ニコチンハプテン−担体抱合体。
  33. 前記動物はヒトである、請求項３２に記載のニコチンハプテン−担体抱合体。
  34. 動物におけるニコチン依存症を治療または予防するための医薬の製造における、請求項３２又は３３に定義のニコチンハプテン−担体抱合体の使用であって、前記医薬は前記抱合体の免疫学的有効量を動物に投与するものであり、前記医薬は前記動物に鼻腔内、経口、皮下、経皮、筋肉内、または、静脈内に投与される使用。
  35. 前記動物はヒトである、請求項３４に記載の使用。
  36. 煙草依存症またはニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、再発を防止しまたは禁煙を促進する方法に使用するための請求項１８又は１９に記載のワクチン組成物と更なる薬剤であって、前記方法がワクチン組成物と更なる薬剤を患者に投与する工程を含む、ワクチン組成物と更なる薬剤。
  37. 前記組成物は前記患者に鼻腔内、経口、皮下、経皮、筋肉内、または静脈内に投与される、請求項３６に記載のワクチン組成物と更なる薬剤。
  38. 患者における煙草依存症またはニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、再発を防止しまたは禁煙を促進する医薬の製造における、請求項１８又は１９に記載のワクチン組成物と更なる薬剤の使用であって、前記医薬は鼻腔内、経口、皮下、経皮、筋肉内、または、静脈内に投与される、使用。
  39. 前記更なる薬剤は請求項２１から２６の何れか一項に定義のものである、請求項３８に記載の使用。
  40. 請求項１８又は１９に記載のワクチン組成物を含む、煙草依存症またはニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、再発を防止しまたは禁煙を促進するための医薬であって、請求項２１から２６の何れか一項に定義の更なる薬剤と併用される医薬。
  41. 患者の鼻腔内、経口、皮下、経皮、筋肉内、または静脈内に投与される、請求項４０に記載の医薬。
  42. 煙草依存症またはニコチン依存症を治療し、ニコチン禁断症状を寛解し、再発を防止しまたは禁煙を促進するための医薬であって、請求項１８又は１９に記載のワクチン組成物と請求項２１から２６の何れか一項に定義の更なる薬剤を含んで成る医薬。
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