CN114907255A - 一种利他林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利他林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。利他林人工半抗原的分子结构式如式（Ⅰ），利他林人工抗原的分子结构式如式（Ⅱ）。所述应用是所述利他林人工抗原在制备抗利他林抗体中的应用。本发明的利他林人工半抗原最大程度地保留了利他林的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的利他林人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗利他林抗体，经免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体，可用于对利他林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

一种利他林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种利他林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
利他林是一种中枢大脑的兴奋剂，可增进脑部的兴奋、清醒和降低身体疲劳的感觉，使病人的脑部随时保持清醒的状态。此药可用来治疗成年人的昏睡症。此药用于小孩主要是治疗过动儿或注意力不集中人群，亦可用来治疗轻微到中度的沮丧。
利他林最常见的副作用为:体重下降(9%)、食欲减少(26%)，恶心(12%)，呕吐(10%)、头痛(13%)，失眠(13%)，较严重的副作用为:心跳突然地加快或增强、幻觉、皮肤发红、身体出现不正常青紫色的瘀伤、性情改变、胸口痛、喉咙酸痛、想睡觉、关节痛、癫痫发作等等。
目前，对利他灵的检测主要依靠红外光谱（IR）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS)、液相色谱四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF LC/MS）、核磁共振氢谱（H NMR）、核磁共振碳谱（13CNMR）、核磁共振氟谱（19F NMR）等方法，存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括利他林在内的大多数小分子化合物（分子量小于1000），不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物（即人工抗原），人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。
现有技术中还未有利他林人工半抗原、人工抗原的相关报道。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的对于对利他灵的检测存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求的缺陷，提供了一种利他林人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用以克服上述缺陷。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的在于提供了一种利他林人工半抗原，其分子结构式如（Ⅰ）所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
本发明中的利他林人工半抗原其通过将利他林的特征结构进行修饰，在远离其主要活性基团的端位上引入了新的活性基团，这样既可以最大限度的保留其特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点，可作为抗原决定簇。
本发明的第二个目的在于提供了如上所述利他林人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）将利他林与碱溶液反应，发生水解反应，然后调节pH至酸性，经萃、干燥、浓缩后得白色粉末状产物A；
（2）将白色粉末状产物A、甘氨酸乙酯盐酸盐以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，搅拌反应，反应产物经萃取、干燥、浓缩后得红棕色油状产物B；
（3）将产物B与碱溶液反应，发生水解反应，然后调节pH至酸性，经萃、干燥、浓缩后得利他林半抗原Ⅰ。
本发明中的所涉及到的利他林人工半抗原的制备方法的关键因素在于在利他林酸的羧基上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留利他林的特征结构。
作为优选，所述步骤（1）以及步骤（3）中所用的碱溶液为氢氧化钠水溶液；
室温下搅拌反应2.5~3小时。
作为优选，所述步骤（2）中色粉末状产物A、甘氨酸乙酯盐酸盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐三者的摩尔比为1:1.35~1.5:2.5~3；
室温下搅拌反应18~20小时。
作为优选，所述利他林人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）将利他林溶于甲醇中，再加入四氢呋喃和1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应2.5~3小时，反应结束后调节pH=2~3，用水-乙酸乙酯萃取，取有机相，得白色固体产物A；
（2）将白色固体产物A、甘氨酸乙酯盐酸盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1.35~1.5:2.5~3混合，室温下搅拌反应18~20小时，反应产物经水-二氯甲烷萃取，取有机相，得红棕色油状产物B；
（3）将产物B溶于甲醇中，加入四氢呋喃和1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应2.5~3小时，反应结束后用1N的盐酸调节pH=2~3，用水-乙酸乙酯萃取，取有机相，得利他林半抗原。
本发明的第三个目的在于提供了一种利他林人工抗原，其分子结构式如（Ⅱ）所示：
Figure 978344DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
其中，所述BGG为牛丙种球蛋白。
本发明的第四个目的在于提供了如上所述利他林人工抗原的制备方法，
包括以下步骤：
通过活泼酯法使上述利他林人工半抗原与牛丙种球蛋白结合，获得所述的利他林人工抗原。
作为优选，具体步骤如下：
（a）将权利要求1所述利他林人工半抗原、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按摩尔比1:1~2:1~2混合于N,N-二甲基甲酰胺中，20~30℃下搅拌反应18~19小时，反应结束后离心取上清液；
（b）将所述上清液滴加到牛丙种蛋白溶液中，将所得混合液置于3~5℃环境下静置过夜，经透析、离心取上清，获得如权利要求2所述的利他林人工抗原。
作为优选，步骤（b）中，所述牛丙种蛋白溶液的浓度为5mg/mL；
上清液与牛丙种蛋白溶液的体积比为1:5。
如未作特殊说明，本发明中所述牛丙种球蛋白溶液是将牛丙种球蛋白溶于磷酸根离子浓度为0.01 mol/L、pH =7.2~7.4的PBS缓冲液中制成的。
本发明选用牛丙种球蛋白（BGG）作为大分子载体，与牛血清蛋白（BSA）相比具有以下优点：①牛丙种球蛋白能够结合更多的利他林人工半抗原，免疫原性较好；②从实验看，牛丙种球蛋白与利他林人工半抗原的结合更稳定，牛血清蛋白与利他林人工半抗原结合后，利他林人工半抗原容易在后续处理中脱离，从而使最终的人工抗原在长期保存中容易产生沉淀，稳定性差；③用牛丙种球蛋白与利他林人工半抗原结合后形成的利他林人工抗原，经动物免疫得到的抗利他林抗体的特异性更好。
本发明的第五个目的在于提供了所述利他林人工半抗原或者所述利他林人工抗原在制备抗利他林抗体中的应用。
本发明的第六个目的在于提供了一种抗利他林抗体，其为所述利他林人工抗原经动物免疫得到的、可与利他林发生特异性免疫反应的球蛋白。
试验发现，将所述利他林人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1:70000。表明本发明的利他林人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗利他林抗体，该抗利他林抗体可用于利他林的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的利他林人工半抗原最大程度地保留了利他林的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的利他林人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗利他林抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:70000，可用于对利他林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明利他林人工抗原Ⅱ的制备流程图；
其中，Pyridine表示吡啶，NHS表示N-羟基丁二酰亚胺，EDC.HCl表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，THF表示四氢呋喃， DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，BGG表示牛丙种球蛋白，下同。
图2为本发明利他林人工半抗原Ⅰ的液相色谱图；
其中，mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟。
图3为本发明利他林半抗原的ESI-MS分析谱图；
其中，Intens.表示信号强度；m/z表示荷质比。
图4为牛丙种球蛋白、利他林人工半抗原Ⅰ、利他林人工抗原Ⅱ的紫外扫描图；
其中，Abs表示紫外-可见吸收光谱，WL（nm）表示波长（nm）。
图5为对比例1利他林人工抗原Ⅲ的制备流程图；
其中，DCC表示环己基碳酰二亚胺，BSA表示牛血清蛋白。
图6为对比例2利他林人工抗原Ⅳ的制备流程图。
图7为对比例3利他林人工抗原Ⅴ的制备流程图。
图8为对比例4利他林人工抗原Ⅶ的制备流程图。
图9为对比例5利他林人工抗原Ⅷ的制备流程图。
图10为对比例6利他林人工抗原Ⅸ的制备流程图。
图11为对比例7利他林人工抗原Ⅹ的制备流程图。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图1），包括以下步骤：
（1）人工半抗原的制备：
①称取200mg（0.914mmol）利他林于100ml单口圆底烧瓶中，加入8ml甲醇溶解，再加入9ml四氢呋喃和22ml 1N的NaOH水溶液，加入搅拌子，室温搅拌反应3小时；反应结束后用1N的盐酸调pH=3，用3×30ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后得到126mg白色固体产物A；
对该白色固体产物A进行TLC检测，层析液为95%乙醇：1,4-二氧六环：二氯甲烷：氨水=8：1：10：1（v/v），产物Rf=0.2。
②将126mg（0.575mmol）白色固体产物A溶于16ml的吡啶中，置于50ml单口圆底烧瓶中，此时为白色浊液，加入120mg（0.86mmol）甘氨酸乙酯盐酸盐和294mg（1.538mmol）1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl），此时为黄色浊液，室温搅拌反应18小时；反应结束后，向反应液中加入25ml的PBS溶液，转入125ml的分液漏斗中， 用3×25ml的二氯甲烷进行萃取，收集有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后得108mg（0.355mmol）红棕色油状产物B；
对红棕色油状产物B进行TLC检测，层析液为95%乙醇：1,4-二氧六环：二氯甲烷：氨水=8：1：10：1（v/v），产物Rf=0.9；
③将108mg（0.355mmol）产物B溶于4ml甲醇和5ml四氢呋喃的混合液中，并加入13.5ml 1NNaOH水溶液，室温搅拌反应3小时；反应结束后滴加1N的盐酸调pH=3，用2×30ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，经干燥，过滤，转干后得到产物82mg。
从图2可以看出经过纯化得到的利他林人工半抗原Ⅰ的纯度达到99%以上，从图3可以看出本实施例得到的利他林人工半抗原的分子离子峰的质荷比（m/z）为276，与其理论分子量吻合，可以确定步骤③得到的最终化合物就是本发明所设计的利他林人工半抗原Ⅰ。
（2）利他林人工抗原的制备：
④将82mg（0.297mmol）利他林人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入4.1ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、51mg(0.446mmol) N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 和92mg(0.446mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，20℃搅拌反应18小时，反应结束后以8000转每分钟离心5分钟，取上清液，备用。
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠、43.875g（0.75mol）氯化钠、1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠，用双蒸水溶解并定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L、 pH=7.2-7.4的PBS缓冲液。
⑥称取0.100g牛丙种球蛋白溶于20ml 步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑦在室温下快速搅拌，将步骤④的上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中并快速搅拌，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后以8000转每分钟、4℃离心5分钟，取上清液即得到人工抗原：利他林-牛丙种球蛋白偶联物（如式Ⅱ）。利他林人工抗原制备前后的紫外扫描图见图4。
图4中，曲线a为利他林人工半抗原Ⅰ的紫外扫描图，曲线b为牛丙种球蛋白的紫外扫描图，曲线c为利他林人工抗原Ⅱ的紫外扫描图。利他林人工半抗原Ⅰ的最大吸收波长为290nm，利他林人工抗原Ⅱ的最大吸收波长为285nm，与利他林人工半抗原Ⅰ、牛丙种球蛋白相比，利他林人工抗原Ⅱ的最大吸收波长出现明显变化。可以证明利他林人工半抗原与牛丙种球蛋白偶联成功。
实施例2
（1）人工半抗原的制备：
步骤①如实施例1所示。
②将113mg（0.516mmol）白色固体产物A溶于16ml的吡啶中，置于50ml单口圆底烧瓶中，此时为白色浊液，加入97mg（0.696mmol）甘氨酸乙酯盐酸盐和245mg（1.29mmol）1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl），此时为黄色浊液，室温搅拌反应20小时；反应结束后，向反应液中加入25ml的PBS溶液，转入125ml的分液漏斗中， 用3×25ml的二氯甲烷进行萃取，收集有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后得红棕色油状产物B；
步骤③如实施例1所示。
（2）利他林人工抗原的制备：
④将65mg（0.235mmol）利他林人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入3.3ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、27mg(0.235mmol) N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 和48mg(0.235mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，30℃搅拌反应19小时，反应结束后以8000转每分钟离心5分钟，取上清液，备用。
步骤⑤~⑧如实施例1所示。
实施例3
（1）人工半抗原的制备：
步骤①~③如实施例1所示。
（2）利他林人工抗原的制备：
④将75mg（0.272mmol）利他林人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入4.1ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、62mg(0.544mmol) N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 和112mg(0.544mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，20℃搅拌反应18小时，反应结束后以8000转每分钟离心5分钟，取上清液，备用。
步骤⑤~⑧如实施例1所示。
对比例1
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图5），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
①-③与实施例1相同。
(2) 利他林人工抗原的制备：
④-⑧与实施例1相似，只是将牛丙种蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅰ进行偶联，最后得到利他林人工抗原Ⅲ。
对比例2
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图6），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
①-③与实施例1相同。
(2) 利他林人工抗原的制备：
④将80mg（0.290mmol）利他林人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入4ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF），再加入40μL（0.290mmol）三乙胺和38μL （0.290 mmol）氯甲酸异丁酯 ，30℃搅拌反应19小时，反应结束后以8000转每分钟、4℃离心5分钟，弃沉淀，取上清液。
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH=7.2-7.4的PBS缓冲液。
⑥称取0.100g牛丙种球蛋白溶于20ml步骤⑤的PBS缓冲液中，得牛丙种球蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到步骤⑥的牛丙种球蛋白溶液，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后以8000转每分钟、4℃离心5分钟，取上清液，即得到利他林人工抗原Ⅳ。
对比例3
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图7），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
①-③与实施例1相同。
(2) 利他林人工抗原的制备：
④-⑧与对比例2相似；只是将牛丙种蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅰ进行偶联，最后得到利他林人工抗原Ⅴ。
对比例4
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图8），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
① 将100mg（0.429mmol）利他林置于25ml单口圆底烧瓶中，加入3ml苯溶解，置于0℃冰水混合浴中，缓慢滴加入89μL（0.644mmol）三氟乙酸酐，缓慢升温至室温搅拌反应1小时，然后升温至80℃回流搅拌反应3小时；结束反应，冷却至室温，取出转子，减压蒸干溶剂得到产物150mg，直接进入下一步反应。
②将150mg（按理论值0.429计算）上步产物置于50ml单口圆底烧瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，接着加入86mg（0.860mmol）丁二酸酐，转入冰水浴中，每隔30分钟加入114mg（0.855mmol）无水三氯化铝，共加3次，待固体基本溶解后转入40℃油浴中，回流搅拌反应18小时，此时有红棕色络合物产生并黏于瓶底；反应结束后向反应液中加入5ml蒸馏水，残渣缓慢溶解，此时溶液为淡黄色浊液，加入0.13ml浓盐酸，取有机相依次用10ml蒸馏水、10ml5%的碳酸氢钠溶液、10ml饱和氯化钠溶液洗涤。收集有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、减压浓缩得黄色油状物125mg。将该黄色油状物用薄层色谱（溶剂和洗脱机为无水乙醇，层析液为95%乙醇：1,4-二氧六环：二氯甲烷：氨水=8：1：10：1，Rf=0.4）分离后得淡黄色油状物65mg（0.157mmol），即利他林半抗原Ⅵ。
(2) 利他林人工抗原的制备：
③将65mg（0.157mmol）利他林人工半抗原置于25ml圆底烧瓶中，加入3.25ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、27mg(0.235mmol) N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 和49mg(0.238mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，20℃搅拌反应18小时，反应结束后以8000转每分钟、4℃离心5分钟，取上清液，备用。
④称取25g碳酸钠，用双蒸水溶解并定容至5.0L，用2N的氢氧化钠水溶液调pH=12±0.05制得碱性透析液。
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、 pH=7.4的PBS。
⑥称取0.085g牛丙种球蛋白溶于17ml 步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑦室温下，将步骤③的上清液缓慢滴加入到快速搅拌的步骤⑥的牛丙种球蛋白溶液中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述碱性透析液透析两天，每天1次，再用PBS透析7次，透析结束后以8000转每分钟、4℃离心10分钟，取上清液即得到利他林人工抗原Ⅶ。
对比例5
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图9），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
①-②与对比例4相同。
（2）利他林人工抗原的制备：
③-⑧与对比例4相似，只是将牛丙种蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅵ进行偶联，得到利他林人工抗原Ⅷ。
对比例6
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图10），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
①-②与对比例4相同。
（2）利他林人工抗原的制备：
③将80mg（0.193mmol）利他林人工半抗原置于25ml圆底烧瓶中，加入4ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF），再加入27 （0.193mmol）三乙胺和25μL（0.193mmol）氯甲酸异丁酯 ，30℃搅拌反应19小时，反应结束后，以8000转每分钟、4℃离心5分钟，取上清液。
④称取25g碳酸钠，用双蒸水溶解并定容至5.0L，用2N的氢氧化钠水溶液调pH=12±0.05制得碱性透析液。
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、 pH=7.4的PBS。
⑥称取0.100g牛丙种球蛋白溶于20ml 步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑦室温下，将步骤③的上清液缓慢滴加入到快速搅拌的步骤⑥的牛丙种球蛋白溶液中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液。⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述碱性透析液透析两天，每天1次，再用PBS透析7次，透析结束后以8000转每分钟、4℃离心10分钟，取上清液即得到利他林人工抗原Ⅸ。
对比例7
本实施一种利他林人工抗原的制备方法（反应历程如图11），包括以下步骤：
(1) 利他林人工半抗原的制备：
①-②与对比例4相同。
（2）利他林人工抗原的制备：
③-⑧与对比例6相似，只是将牛丙种蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅵ进行偶联得到利他林人工抗原Ⅹ。
检测例 利他林人工抗原的性能测定
（1）利他林人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用步骤⑤的PBS缓冲液配制配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的利他林人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知利他林半抗原的最大吸收波长为290nm，在290nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数（即摩尔吸收系数）的计算公式为：ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：：用步骤⑤的PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛丙种球蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液（用PBS缓冲液配制）按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将偶联物（即利他林人工抗原）用PBS稀释到100μg/ml，在285nm处测得吸光值A1，以PBS为空白测得吸光值A2，则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol)，150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3 为牛丙种球蛋白浓度（μg/ml）。
采用牛血清蛋白作载体时，偶联比的计算式为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)；其中，65000为牛血清蛋白的分子量。
表1 各利他林人工抗原的偶联比和半抗原的摩尔吸收系数
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的结合比都是有影响的。
（2）动物免疫
将制备的各利他林人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2 各免疫血清的效价检测结果
Figure 456337DEST_PATH_IMAGE004
由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例利他林人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。而利用利他林人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1:70000，完全可用于免疫分析中，能为利他林的检测提供更加方便快速准确的途径。

Claims (10)

1.一种利他林人工半抗原，其特征在于，
其分子结构式如（Ⅰ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
2.如权利要求1所述利他林人工半抗原的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
（1）将利他林与碱溶液反应，发生水解反应，然后调节pH至酸性，经萃取、干燥、浓缩后得白色粉末状产物A；
（2）将白色粉末状产物A、甘氨酸乙酯盐酸盐以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，搅拌反应，反应产物经萃取、干燥、浓缩后得红棕色油状产物B；
（3）将产物B与碱溶液反应，发生水解反应，然后调节pH至酸性，经萃取、干燥、浓缩后得利他林半抗原Ⅰ。
3.根据权利要求2所述的利他林人工半抗原的制备方法，其特征在于，
所述步骤（1）以及步骤（3）中所用的碱溶液为氢氧化钠水溶液；
室温下搅拌反应2.5~3小时。
4.根据权利要求2所述的利他林人工半抗原的制备方法，其特征在于，
所述步骤（2）中色粉末状产物A、甘氨酸乙酯盐酸盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐三者的摩尔比为1:1.35~1.5:2.5~3；
室温下搅拌反应18~20小时。
5.一种利他林人工抗原，其特征在于，
其分子结构式如（Ⅱ）所示：
Figure 326046DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
其中，所述BGG为牛丙种球蛋白。
6.如权利要求5所述利他林人工抗原的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：通过活泼酯法使权利要求1所述的利他林人工半抗原与牛丙种球蛋白结合，获得所述的利他林人工抗原。
7.根据权利要去6所述的利他林人工抗原的制备方法，其特征在于，
具体步骤如下：
（a）将权利要求1所述利他林人工半抗原、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按摩尔比1:1~2:1~2混合于N,N-二甲基甲酰胺中，20~30℃下搅拌反应18~19小时，反应结束后离心取上清液；
（b）将所述上清液滴加到牛丙种蛋白溶液中，将所得混合液置于3~5℃环境下静置过夜，经透析、离心取上清，获得如权利要求2所述的利他林人工抗原。
8.根据权利要去7所述的利他林人工抗原的制备方法，其特征在于，
步骤（b）中，所述牛丙种蛋白溶液的浓度为5mg/mL；
上清液与牛丙种蛋白溶液的体积比为1:5。
9.如权利要求1所述利他林人工半抗原或者权利要求5所述利他林人工抗原在制备抗利他林抗体中的应用。
10.一种抗利他林抗体，其特征在于，
其为由权利要求5所述利他林人工抗原经动物免疫得到的、可与利他林发生特异性免疫反应的球蛋白。
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