CN115991674A - 一种阿立哌唑人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿立哌唑人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。阿立哌唑人工半抗原的分子结构式如式Ⅰ,阿立哌唑人工抗原的分子结构式如式Ⅲ。本发明还公开了阿立哌唑人工抗原在制备抗阿立哌唑抗体中的应用。本发明的阿立哌唑人工半抗原最大程度地保留了阿立哌唑的特征结构,且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团,可作为抗原决定簇;进一步制备获得的阿立哌唑人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗阿立哌唑抗体,经免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体,可用于对阿立哌唑进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域,具体涉及一种阿立哌唑人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
阿立哌唑,英文名为Aripiprazole,是第二代抗精神分裂症药物,对神经系统具有双向调节作用,是DA递质的稳定剂。用于治疗各类型的精神分裂症。国外临床试验表明,本品对精神分裂症的阳性和阴性症状均有明显疗效,也能改善伴发的情感症状,降低精神分裂症的复发率。
报道的较常见(>10%)的药物不良反应有:焦虑、头痛、失眠、头晕、思睡、恶心呕吐、尿失禁、颈硬;偶见(1%~10%)的有:静坐不能、便秘、皮疹、咳嗽、鼻塞;少见(<1%)的有:震颤、发热、骨痛、肌痛、视物模糊。
目前,对阿立哌唑常用检测分析方法主要有:气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(LC-MS)等。这些仪器分析方法具有极高的灵敏度和精密度,但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员,不适用于批量样品的筛选检测和现场即时检测。近年发展起来的免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、适合大规模检测等优点,已被广泛应用于各类违禁品等的检测。而要建立阿立哌唑的免疫检测方法,必须获得具有抗原活性的阿立哌唑完全抗原。
发明内容
本发明提供了一种阿立哌唑人工半抗原,该阿立哌唑人工半抗原是利用阿立哌唑的一种代谢物作为前体,通过化学修饰制得的,它最大程度地保留了阿立哌唑的特征结构,且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团,可作为抗原决定簇。
为实现上述技术目的,本发明通过以下技术方案实现:
本发明的第一个目的是提供一种阿立哌唑人工半抗原,其分子结构式如式Ⅰ所示:
本发明第二个目的在于提供所述阿立哌唑人工半抗原的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)式II所示的羟基阿立哌唑和三乙胺、二碳酸二叔丁酯进行酰化反应,制得式A所示的化合物;
(2)式A所示的化合物和溴乙酸乙酯和氢化钠进行取代反应,制得式B所示的化合物;
(3)式B所示的化合物在三氟乙酸中脱保护基,制得式C所示的化合物;
(4)式C所示的化合物和碱溶液进行水解反应,再调节pH值至酸性,制得式I所示的阿立哌唑半抗原。
所述方法的反应式如下:
式II所示的羟基阿立哌唑为阿立哌唑的代谢产物且两者具有相同的特征官能团,因此可使用羟基阿立哌唑进行阿立哌唑人工半抗原的合成。
所述步骤(1)中,所述羟基阿立哌唑、三乙胺、二碳酸二叔丁酯的物质的量之比优选为1:2~2.5:1.05~1.2;
所述步骤(2)中,所述式A所示的化合物、溴乙酸乙酯、氢化钠的物质的量之比优选为1:2~2.2:1.5~2;
步骤(2)的反应温度优选为加热至回流反应
所述步骤(4)中的碱溶液优选为NaOH水溶液。
进一步,所述方法优选按以下步骤进行:
(1)将式II所示的羟基阿立哌唑溶于四氢呋喃中,置于0℃的冰水浴中,加入三乙胺,再逐滴滴加二碳酸二叔丁酯的四氢呋喃溶液,室温搅拌反应4~5小时;反应结束后将反应液减压蒸干得式A所示的化合物;
所述羟基阿立哌唑、三乙胺、二碳酸二叔丁酯的物质的量之比为1:2~2.5:1.05~1.2;
所述四氢呋喃的总体积用量以羟基阿立哌唑的物质的量计为10~30mL/mmol;
(2)将式A所示的化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺中,再加入溴乙酸乙酯和氢化钠,65℃油浴下回流搅拌反应18~20小时,反应结束后将反应液减压蒸干,用水-二氯甲烷萃取,取有机相,干燥、浓缩得式B所示的化合物;
所述式A所示的化合物、溴乙酸乙酯、氢化钠的物质的量之比为1:2~2.2:1.5~2;
所述N,N-二甲基甲酰胺的体积用量以式A所示的化合物的物质的量计为10~30mL/mmol;
(3)将式B所示的化合物溶于三氟乙酸和二氯甲烷中,室温搅拌反应5~6小时,反应结束后,将反应液减压蒸干得式C所示的化合物;
所述三氟乙酸的用量为过量,一般三氟乙酸的体积用量以式B所示的化合物的质量计为10~20mL/g;
所述二氯己烷的体积用量以式B所示的化合物的质量计为10~20mL/g;
(4)将式C所示的化合物溶于甲醇中,再加入四氢呋喃和1N的氢氧化钠水溶液,室温下搅拌反应3~5小时,反应结束后调节pH=3,用水-乙酸乙酯萃取,取有机相,干燥、浓缩得到固体产物,再经薄层色谱纯化,制得式I所示的阿立哌唑半抗原;
所述1N的氢氧化钠水溶液的体积用量一般以式C所示的化合物的质量计为35~50mL/g;
所述甲醇的体积用量一般以式C所示的化合物的质量计为15~30mL/g;
所述四氢呋喃的体积用量一般以式C所示的化合物的质量计为10~25mL/g;
一般用1N的盐酸调溶液pH=3;
所述薄层色谱的层析液为95vol%乙醇、1,4-二氧六环、二氯甲烷、氨水的体积比为8:1:10:1的混合液。
通过上述方法,在阿立哌唑半抗原Ⅰ的羧基上引入连接臂,在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留阿立哌唑的特征结构,且不占有阿立哌唑的活性位点,制得的对应的人工抗原与抗体有更高的特异性。
本发明还提供一种阿立哌唑人工抗原,其分子结构式如式Ⅲ所示:
式(Ⅲ)中,BGG为牛丙种球蛋白。
本发明还提供所述阿立哌唑人工抗原Ⅲ的制备方法,包括:将式I所示的阿立哌唑人工半抗原与牛丙种球蛋白通过活泼酯法结合,制得式III所示的阿立哌唑人工抗原。
进一步,采用活泼酯法制备式III所示的阿立哌唑人工抗原时,所述方法包括以下步骤:
(a)将式I所示的阿立哌唑人工半抗原、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按物质的量之比为1:1~2:1~2混合,在20~30℃下搅拌反应18~20小时,反应结束后离心取上清液;
反应中优选加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂;所述N,N-二甲基甲酰胺的体积用量一般以式I所示的阿立哌唑人工半抗原的物质的量计为20~40mL/mmol。
(b)将所述上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中,混匀后将所得混合液置于3~5℃下静置过夜(通常静置15~24小时),经透析、离心取上清液,制得所述式III所示的阿立哌唑人工抗原。
进一步,本发明中所述牛丙种球蛋白溶液是将牛丙种球蛋白溶于0.01M、pH=7.2-7.4的PBS缓冲液中制成的。
所述步骤(b)中,所述牛丙种球蛋白溶液的浓度为5mg/mL,上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5。
本发明选用牛丙种球蛋白(BGG)为白色或乳白色粉末,无味或稍有特异香气和味道,易溶于水。其水溶液遇酸会产生酪蛋白沉淀。它作为大分子载体,具有以下优点:①牛丙种球蛋白能够结合更多的阿立哌唑人工半抗原,免疫原性较好;②从实验看,牛丙种球蛋白与阿立哌唑人工半抗原的结合更稳定;③用牛丙种球蛋白与阿立哌唑人工半抗原结合后形成的阿立哌唑人工抗原,经动物免疫得到的抗阿立哌唑抗体的特异性更好。
本发明还提供了所述阿立哌唑人工抗原在制备抗阿立哌唑抗体中的应用。
本发明还提供一种抗阿立哌唑抗体,是由所述阿立哌唑人工抗原经动物免疫得到的、可与阿立哌唑发生特异性免疫反应的球蛋白。
本发明还提供所述抗阿立哌唑抗体在检测阿立哌唑中的应用。
本发明还可提供一种用于检测阿立哌唑的试剂,所述试剂包括所述抗阿立哌唑抗体。
本发明还提供一种用于检测阿立哌唑的试剂盒,所述试剂盒包括所述抗阿立哌唑抗体。
试验发现,将式Ⅲ所示的阿立哌唑人工抗原免疫新西兰白兔,获得的免疫血清的效价为1:70000,结果表明本发明的阿立哌唑人工抗原可经过免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗阿立哌唑抗体,该抗阿立哌唑抗体可用于阿立哌唑的免疫检测和分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明的阿立哌唑人工半抗原最大程度地保留了阿立哌唑的特征结构,且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团,可作为抗原决定簇;进一步制备获得的阿立哌唑人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗阿立哌唑抗体,经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价可以满足需要,可用于对阿立哌唑进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明阿立哌唑人工抗原的反应式。
其中,(BOC)2O表示二碳酸二叔丁酯,THF表示四氢呋喃,TEA表示三乙胺,DMF表示N,N-二甲基甲酰胺,TFA表示三氟乙酸,DCM表示二氯甲烷,NHS表示N-羟基丁二酰亚胺,DCC表示环己基碳酰二亚胺,BGG-NH2表示牛丙种球蛋白(BGG上自由氨基的数量很多,这里只用一个表示),下同。
图2为实施例1制得的式I所示的阿立哌唑人工半抗原的液相色谱图。
其中,mAU表示毫吸光度单位,min表示分钟。
图3为实施例1制得的式I所示的阿立哌唑半抗原的ESI-MS分析谱图。
其中,Intens.表示信号强度;m/z表示荷质比。
图4为牛丙种球蛋白(BGG)、阿立哌唑人工半抗原(I)、阿立哌唑人工抗原(III)IRS谱图。
图5为对比例1阿立哌唑人工抗原Ⅳ的制备流程图。
其中,BSA表示牛血清蛋白(BSA上自由氨基的数量很多,这里只用一个表示),下同。
图6为对比例2阿立哌唑人工抗原Ⅴ的制备流程图。
图7为对比例3阿立哌唑人工抗原Ⅵ的制备流程图。
图8为对比例4阿立哌唑人工抗原Ⅷ的制备流程图。
图9为对比例5阿立哌唑人工抗原Ⅸ的制备流程图。
图10为对比例6阿立哌唑人工抗原Ⅹ的制备流程图。
图11为对比例7阿立哌唑人工抗原Ⅺ的制备流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明,但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
本实施一种阿立哌唑人工抗原的制备方法(反应式如图1),包括以下步骤:
(1)人工半抗原(式I)的制备:
①称取200mg(0.432mmol)羟基阿立哌唑置于25mL单口圆底烧瓶中,加入5mL四氢呋喃溶解,置于0℃的冰水浴中充分搅拌,加入120μL(0.864mmol)三乙胺,再逐滴加入109μL(0.475mmol)二碳酸二叔丁酯的2mL四氢呋喃溶液,室温搅拌反应4小时。结束反应,将反应液减压蒸干得淡黄色油状物A262mg,无需纯化直接进入下一步反应。
②将上步淡黄色油状物A 262mg(0.432mmol)(按理论值计算)置于25mL单口圆底烧瓶中,加入5mLN,N-二甲基甲酰胺溶解,再加入96μL(0.862mmol)溴乙酸乙酯和31mg(0.775mmol)氢化钠,置于65℃油浴中回流搅拌反应18小时。TLC检测基本完全反应,层析液为乙酸乙酯:石油醚=1:10(v/v),产物Rf=0.8。停止反应,将反应液减压蒸干,向反应残渣中加入20mL水,用20mL×3的二氯甲烷萃取,合并有机相,有机相分别用20mL纯化水和20mL饱和的食盐水洗涤,取有机相,用无水硫酸镁干燥15分钟,过滤减压蒸干得到黄色油状物B,产量243mg,不纯,直接进入下一步反应。
③将上步得到的黄色油状物B243mg置于25mL单口圆底烧瓶中,加入3mL三氟乙酸和3mL二氯甲烷溶解,室温搅拌反应5小时。结束反应,减压蒸干溶剂得黄色油状物C,产量215mg。
④将上步黄色油状物C 215mg置于50mL单口圆底烧瓶中,加入4.4mL的甲醇、3.3mL四氢呋喃和8.6mL 1N的NaOH水溶液,加入搅拌子,室温搅拌反应4小时。TLC检测原料已完全反应,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1(v/v),产物Rf=0.4。停止反应,用1N的盐酸调溶液pH=3,此时有大量的沉淀产生,用30mL×3乙酸乙酯萃取,合并有机相,分别用30mL纯化水和30mL饱和食盐水洗涤有机相,收集有机相,加入无水硫酸镁干燥15分钟,过滤、减压蒸干得到淡黄色固体产物212mg;
⑤将该淡黄色固体212mg用薄层色谱(溶剂和洗脱剂为无水乙醇,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1,Rf=0.4)分离后得淡黄色固体148mg(0.284mmol),即阿立哌唑人工半抗原(式I)。
制得的阿立哌唑人工半抗原(式I)的液相色谱图如图2所示,ESI-MS分析谱图如图3所示,从图2可以看出经过纯化得到的阿立哌唑人工半抗原Ⅰ的纯度达到99%以上,从图3可以看出本实施例得到的阿立哌唑人工半抗原的分子离子峰的质荷比(m/z)为522,与其理论分子量吻合,可以确定步骤⑤得到的最终化合物就是本发明所设计的阿立哌唑人工半抗原(式I)。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅲ的制备:
⑥将148mg(0.284mmol)阿立哌唑人工半抗原Ⅰ置于25mL圆底烧瓶中,加入7.4mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)、47mg(0.413mmol)N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和85mg(0.413mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC),20℃搅拌反应18小时。TLC检测基本完全反应,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1(v/v),产物Rf=0.1-0.2。停止反应,将反应液以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液,备用。
⑦称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠、43.875g(0.75mol)氯化钠、1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠,用双蒸水溶解并定容至5.0L,得到0.01M、pH=7.2-7.4的PBS缓冲液。
⑧称取0.185g牛丙种球蛋白溶于37mL步骤⑦的PBS缓冲液中,得到浓度为5mg/mL的牛丙种球蛋白溶液。
⑨在室温下,将步骤⑥的上清液滴加到快速搅拌的⑧的牛丙种球蛋白溶液中继续搅拌0.5小时,上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5,得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时,得到人工抗原混合液。
⑩将人工抗原混合液移入透析袋中,用步骤⑦的PBS缓冲液透析7次,透析结束后以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液即得到人工抗原:阿立哌唑-牛丙种球蛋白偶联物(如式Ⅲ)。牛丙种球蛋白(BGG)、阿立哌唑人工半抗原(I)、阿立哌唑人工抗原(III)IRS谱图的IRS谱图见图4。
图4中,三条曲线分别为BGG、阿立哌唑人工半抗原Ⅰ、阿立哌唑人工抗原Ⅲ的红外吸收光谱,从图中可以看出BGG和阿立哌唑人工抗原Ⅲ具有相似的吸收曲线,这是BGG中氨基酸产生的特征峰,说明阿立哌唑人工抗原Ⅲ中确实含有BGG,而阿立哌唑人工半抗原Ⅰ与阿立哌唑人工抗原Ⅲ在1200cm-1处有相似的吸收,说明阿立哌唑人工抗原Ⅲ中有阿立哌唑人工半抗原Ⅰ存在。据此可以证明阿立哌唑人工抗原Ⅲ偶联成功。
对比例1
制备阿立哌唑人工抗原(式IV),反应式如图5所示,包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅰ的制备:
①-⑤与实施例1相同。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅳ的制备:
⑥-⑩与实施例1相似,只是将牛丙种蛋白(BSA)替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅰ进行偶联,最后得到阿立哌唑人工抗原Ⅳ。
对比例2
制备阿立哌唑人工抗原(式V),反应式如图6所示,包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅰ的制备:
①-⑤与实施例1相同。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅴ的制备:
⑥将100mg(0.192mmol)阿立哌唑人工半抗原Ⅰ置于50mL圆底烧瓶中,加入5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),再加入27μL(0.192mmol)三乙胺和25μL(0.192mmol)氯甲酸异丁酯,30℃搅拌反应19小时。TLC检测基本完全反应,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1(v/v),产物Rf=0.1-0.2。反应结束后将反应液以8000RPM、4℃离心5分钟,弃沉淀,取上清液。
⑦称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠,43.875g(0.75mol)氯化钠,1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L,得到0.01M、pH=7.2-7.4的PBS缓冲液。
⑧称取0.100g牛丙种球蛋白溶于20mL步骤⑦的PBS缓冲液中,得5mg/mL的牛丙种球蛋白溶液。
⑨在快速搅拌下,将步骤⑥的上清液缓慢滴加到步骤⑧的牛丙种球蛋白溶液中,上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5,得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时,得到人工抗原混合液。
⑩将人工抗原混合液移入透析袋中,用步骤⑦的PBS缓冲液透析7次,透析结束后以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液,即得到阿立哌唑人工抗原Ⅴ。
对比例3
制备阿立哌唑人工抗原(式VI),反应式如图7,包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅰ的制备:
①-⑤与实施例1相同。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅵ的制备:
⑥-⑩与对比例2相似;只是将牛丙种蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅰ进行偶联,最后得到阿立哌唑人工抗原Ⅵ。
对比例4
制备阿立哌唑人工抗原(式Ⅷ),反应式如图8,包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅶ的制备:
①称取200mg(0.432mmol)羟基阿立哌唑置于25mL单口圆底烧瓶中,加入5mL四氢呋喃溶解,置于0℃的冰水浴中搅拌,加入120μL(0.864mmol)三乙胺,再逐滴加入109μL(0.475mmol)二碳酸二叔丁酯的2mL四氢呋喃溶液,室温搅拌反应4小时。结束反应,将反应液减压蒸干得淡黄色油状物A257mg,无需纯化直接进入下一步反应。
②将上步淡黄色油状物A257mg(0.432mmol)(按理论值计算)置于50mL单口圆底烧瓶中,加入20mL二氯甲烷溶解,再加入173mg(1.73mmol)丁二酸酐、180μL(1.30mmol)三乙胺和20mg的DMAP,在41℃油浴下搅拌反应18小时。经TLC检测反应基本完全,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1(v/v),产物Rf=0.4,。停止反应,将反应液冷却至室温,减压蒸干得到的棕色油状物。
③将该棕色油状物用薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1(v/v),Rf=0.4)分离后得淡黄色固体D234mg(0.352mmol)。
④将上步淡黄色固体D234mg(0.352mmol)置于25mL单口圆底烧瓶中,加入3mL三氟乙酸和3mL二氯甲烷溶解,室温搅拌反应5小时。结束反应,减压蒸干溶剂得黄色油状物,该黄色油状物经薄层色谱(溶剂和洗脱机为无水乙醇,层析液为95%乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1(v/v),Rf=0.3)分离得另一黄色油状物108mg(0.192mmol),即阿立哌唑人工半抗原Ⅶ。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅷ的制备:
⑤将108mg(0.192mmol)阿立哌唑人工半抗原Ⅶ置于25mL单口圆底烧瓶中,加入5.4mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解,再加入44mg(0.384mmol)N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、79mg(0.384mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC),20℃搅拌反应18小时,反应结束后将反应液以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液,备用。
⑥称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠,43.875g(0.75mol)氯化钠,1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L,得到0.01M、pH=7.2-7.4的PBS缓冲液。
⑦称取0.135g牛丙种球蛋白溶于27mL步骤⑥的PBS缓冲液中,得到浓度为5mg/mL的牛丙种球蛋白溶液。
⑧室温下,将步骤⑤的上清液缓慢滴加入到快速搅拌的步骤⑦的牛丙种球蛋白溶液中,上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5,得到的混合液在4℃条件下静置反应18小时,得到人工抗原混合液。
⑨将人工抗原混合液移入透析袋中,用步骤⑥的PBS透析7次,透析结束后以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液即得到阿立哌唑人工抗原Ⅷ。
对比例5
制备阿立哌唑人工抗原Ⅸ,反应式如图9所示,包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅶ的制备:
①-④与对比例4相同。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅸ的制备:
⑤-⑨与对比例4相似,只是将牛丙种球蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅶ进行偶联,得到阿立哌唑人工抗原Ⅸ。
对比例6
制备阿立哌唑人工抗原Ⅹ,反应式如图10所示,包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅶ的制备:
①-④与对比例4相同。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅹ的制备:
⑤将100mg(0.177mmol)阿立哌唑人工半抗原Ⅶ置于25mL圆底烧瓶中,加入5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),再加入25μL(0.177mmol)三乙胺和23μL(0.177mmol)氯甲酸异丁酯,30℃搅拌反应19小时,反应结束后,以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液。
⑥称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠,43.875g(0.75mol)氯化钠,1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L,得到0.01M、pH=7.4的PBS缓冲液。
⑦称取0.125g牛丙种球蛋白溶于25mL步骤⑥的PBS缓冲液中,得到浓度为5mg/mL的牛丙种球蛋白溶液。
⑧室温下,将步骤⑤的上清液缓慢滴加入到快速搅拌的步骤⑦的牛丙种球蛋白溶液中,上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5,得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时,得到人工抗原混合液。
⑨将人工抗原混合液移入透析袋中用步骤⑥的PBS透析7次,透析结束后以8000RPM、4℃离心5分钟,取上清液即得到阿立哌唑人工抗原Ⅹ。
对比例7
本实施一种阿立哌唑人工抗原Ⅺ的制备方法(反应历程如图11),包括以下步骤:
(1)阿立哌唑人工半抗原Ⅶ的制备:
①-④与对比例4相同。
(2)阿立哌唑人工抗原Ⅺ的制备:
⑤-⑨与对比例6相似,只是将牛丙种蛋白替换为牛血清蛋白与人工半抗原Ⅶ进行偶联得到阿立哌唑人工抗原Ⅺ。
检测例阿立哌唑人工抗原的性能测定
(1)阿立哌唑人工抗原的鉴定:
摩尔吸收系数ε:用PBS缓冲液配制配制浓度为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL的阿立哌唑人工半抗原溶液,通过紫外扫描图可知阿立哌唑半抗原的最大吸收波长为290nm,在290nm处测吸光值,每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为:ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定:用PBS缓冲液配制浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL的牛丙种球蛋白溶液各1mL,加入3mL考马斯亮蓝染色液,立即混匀,30℃水浴温热5分钟,每个浓度做平行样,在655nm处测吸光值,绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释,在655nm处测得人工抗原的吸光值,从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定:配制100μg/mL的牛丙种球蛋白PBS溶液,将偶联物(即阿立哌唑人工抗原)用PBS稀释到100μg/mL,在285nm处测得吸光值A1,以PBS为空白测得吸光值A2,则偶联比率γ为:γ=[(A1-A2)/ε]/(100×10-3/150000)。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),150000为牛丙种球蛋白的分子量,100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(μg/mL)。
采用牛血清蛋白作载体时,偶联比的计算式为:γ=[(A1-A2)/ε]/(100×10-3/66430);其中,66430为牛血清蛋白的分子量。
各阿立哌唑人工抗原的偶联比和对应的半抗原的摩尔吸收系数结果见表1所示。
表1各阿立哌唑人工抗原的偶联比和对应的半抗原的摩尔吸收系数
编号 | 人工抗原 | 偶联比 | 偶联物蛋白浓度 | 摩尔吸收系数 |
实施例1 | Ⅲ | 17 | 3.241mg/mL | 5224.46 |
对比例1 | Ⅳ | 15 | 3.536mg/mL | 5224.46 |
对比例2 | Ⅴ | 15 | 2.832mg/mL | 5224.46 |
对比例3 | Ⅵ | 13 | 3.115mg/mL | 5224.46 |
对比例4 | Ⅷ | 11 | 2.592mg/mL | 5118.45 |
对比例5 | Ⅸ | 19 | 3.141mg/mL | 5118.45 |
对比例6 | Ⅹ | 9 | 2.317mg/mL | 5118.45 |
对比例7 | Ⅺ | 10 | 2.622mg/mL | 5118.45 |
由表1可见,人工半抗原的结构,人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白偶联时的结合比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的8种阿立哌唑人工抗原免疫新西兰白兔,得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价,检测结果见表2。
表2各免疫血清的效价检测结果
编号 | 阿立哌唑人工抗原 | 免疫血清效价 |
实施例1 | Ⅲ | 1:70000 |
对比例1 | Ⅳ | 1:56000 |
对比例2 | Ⅴ | 1:50000 |
对比例3 | Ⅵ | 1:30000 |
对比例4 | Ⅷ | 1:28000 |
对比例5 | Ⅸ | 1:25000 |
对比例6 | Ⅹ | 1:8000 |
对比例7 | Ⅺ | 1:10000 |
由表2可见,与实施例1相比,利用各对比例阿立哌唑人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清,其效价均不能满足需要,不能用于免疫分析中。而利用阿立哌唑人工抗原Ⅲ进行动物免疫获得的免疫血清,其效价达1:70000,完全可用于免疫分析中,能为阿立哌唑的检测提供更加方便、快速、准确的途径。
Claims (10)
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于所述步骤(1)中,所述羟基阿立哌唑、三乙胺、二碳酸二叔丁酯的物质的量之比为1:2~2.5:1.05~1.2;
所述步骤(2)中,所述式A所示的化合物、溴乙酸乙酯、氢化钠的物质的量之比为1:2~2.2:1.5~2;
步骤(2)的反应温度为60~70℃;
所述步骤(4)中的碱溶液为NaOH水溶液。
5.如权利要求4所述的阿立哌唑人工抗原的制备方法,其特征在于,所述方法为:将权利要求1所述的式I所示的阿立哌唑人工半抗原与牛丙种球蛋白通过活泼酯法结合,制得式III所示的阿立哌唑人工抗原。
6.如权利要求5所述的阿立哌唑人工抗原的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)将式I所示的阿立哌唑人工半抗原、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按物质的量之比为1:1~2:1~2混合,在20~30℃下搅拌反应18~20小时,反应结束后离心取上清液;
(b)将所述上清液滴加到牛丙种球蛋白溶液中,混匀后将所得混合液置于3~5℃下静置过夜,经透析、离心取上清液,制得所述式III所示的阿立哌唑人工抗原。
7.如权利要求6所述的阿立哌唑人工抗原的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)中,所述牛丙种球蛋白溶液的浓度为5mg/mL;
上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5。
8.如权利要求1所述的阿立哌唑半抗原或者权利要求4所述的阿立哌唑人工抗原在制备抗阿立哌唑抗体中的应用。
9.一种抗阿立哌唑抗体,其特征在于,所述抗阿立哌唑抗体是由权利要求4所述的阿立哌唑人工抗原经动物免疫得到的、可与阿立哌唑发生特异性免疫反应的球蛋白。
10.如权利要求9所述的抗阿立哌唑抗体在检测阿立哌唑中的应用。
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