CN117417322A - 一种替来他明人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种替来他明人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种替来他明人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。替来他明人工半抗原的分子结构式如式Ⅰ，替来他明人工抗原的分子结构式如式Ⅱ。本发明还公开了替来他明人工抗原在制备抗替来他明抗体中的应用。本发明的替来他明人工半抗原最大程度地保留了替来他明的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的替来他明人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗替来他明抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:85000，可用于对替来他明进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

一种替来他明人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种替来他明人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
替来他明(tiletamine)是一种白色粉末状物质，是一种分离麻醉剂，主要用于封闭麻醉及全身麻醉，也可用作兽用麻醉药。替来他明在兽医实践中相当受欢迎，对猫和犬的麻醉护理有效，可搭配唑拉西泮补充作用，能迅速使肌肉松弛，引起浅表性痛觉和内脏的痛觉消失，并且不引起呼吸中枢抑制。
根据现有资料显示，替来他明是一种苯环己哌啶类药物，具有抗焦虑、镇静、抗惊厥和肌肉松弛作用。替来他明虽然应用方便，但可能引起的不良反应也不少，主要不良反应是苏醒期产生幻觉、恶梦等精神运动性反应，个别病人可出现复视、视物变形，甚至失明。滥用替来他明会给人带来很大危害，短期可使说话迷糊，并能引起幻觉、情绪抑郁、镇静、催眠，甚至昏睡，长期滥用可使人记忆力衰退及认知能力障碍，并会导致心功能受损害，亦可给人带来躯体和心理依赖，甚至成瘾而不能自拔。出于监管目的，需要开发一种快速检测替来他明的方法。
目前，对替来他明的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵、检测费时、并且需要专业技术人员进行操作等缺点，不能达到现代检测对快速、准确的要求。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括替来他明在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。因此，高效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键。
发明内容
本发明提供了一种替来他明人工半抗原，该替来他明人工半抗原最大程度地保留了替来他明的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
为实现上述技术目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是提供一种替来他明人工半抗原，其分子结构式如Ⅰ所示：
本发明的第二个目的是提供所述替来他明人工半抗原的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)替来他明和5-溴戊酸乙酯进行取代反应，制得式A所示的化合物；
(2)式A所示的化合物进行水解反应，调节pH值为酸性，制得式I所示的替来他明人工半抗原；
所述方法的反应式如下式所示：
进一步，所述方法优选按以下步骤进行：
(1)替来他明溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在NaH作用下，加入5-溴戊酸乙酯，加热至60～70℃，进行取代反应，反应结束后，所得反应液后处理制得式A所示的化合物；
所述替来他明、氢化钠的物质的量之比为1：3～4；
所述替来他明、5-溴戊酸乙酯的物质的量之比为1:1～2，优选1:1.5。
所述N,N-二甲基甲酰的体积用量一般以替来他明的物质的量计为3～10mL/mmol。
所述取代反应的反应时间一般为10～30h，优选15～20h。
所述步骤(1)的反应液后处理步骤一般为：反应结束后，反应液蒸除溶剂，残渣用乙酸乙酯提取，取有机相干燥、过滤、蒸除溶剂，得到的油状物再用薄层层析法纯化，制得式A所示的化合物
薄层层析法的层析液为体积比1：4的乙酸乙酯、石油醚混合溶剂，产物Rf＝0.3；
在该反应条件下，替来他明较易溶于N,N-二甲基甲酰胺，氢化钠作为催化剂能加快反应进程，淡黄色油状物A的得率和纯度都较高，且后处理程序较为简单。
(2)式A所示的化合物用四氢呋喃和无水甲醇溶解，加入1N氢氧化钠水溶液，室温下快速搅拌，进行水解反应，反应结束后调节pH＝4～5，所得反应液后处理制得式I所示的替来他明人工半抗原；
水解反应的反应时间优选4～6小时，
所述式A所示的化合物、1N氢氧化钠水溶液中NaOH的物质的量之比一般为1：10～50；
所述无水甲醇的体积用量一般以式A所示的化合物的质量计为10～20mL/g；
所述四氢呋喃的体积用量一般以式D所示的化合物的质量计为8～20mL/g；
反应结束后一般用1N盐酸调节pH＝4～5。
所述步骤(1)的反应液后处理步骤一般为：反应液用二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，过滤，滤液蒸除溶剂，得到的油状物用薄层层析法纯化，制得式I所示的替来他明人工半抗原
所述薄层层析法采用的层析液为体积分数95％乙醇、1,4-二氧六环、二氯甲烷、氨水体积比8:1:10:1的混合溶剂，产物Rf＝0.5。
氨水的质量分数为25～28％。
在该反应条件下，淡黄色油状物A较易水解，后续处理程序较为简单，较易提纯。
通过上述方法，在替来他明的烃链亚氨基上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留替来他明的特征结构，且该修饰位点尽量远离替来他明的特征官能团，最大限度的使其特征部位裸露在外，以避免对特异性抗原决定簇的干扰，最大限度地被免疫机体识别。
与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，该连接臂长度适宜，确保了替来他明半抗原小分子能充分暴露在载体表面，尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对替来他明的特异性和亲合力更强。
本发明的第三个目的在于提供一种替来他明人工抗原，其分子结构式如Ⅱ所示：
式Ⅱ中，BSA为牛血清蛋白。
本发明的第四个目的在于提供所述替来他明人工抗原的制备方法，所述方法为：将式I所示的替来他明人工半抗原与牛血清蛋白通过混合酸酐法结合，制得式II所示的替来他明人工抗原。
具体地，采用混合酸酐法制备替来他明人工抗原时，所述方法包括以下步骤：
(a)将式I所示的替来他明人工半抗原、氯甲酸异丁酯、三乙胺在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，0～5℃下(一般在冰浴下)搅拌反应2～4小时，反应结束后离心取上清液；
所述式I所示的替来他明人工半抗原、氯甲酸异丁酯、三乙胺的物质的量之比为1:1.5～2.5：1～1.5，优选为1:2:1。
所述DMF溶剂的体积用量以式I所示的替来他明人工半抗原的质量计为30～80mL/g，优选50mL/g。
(b)将所述上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，将所得混合液置于3～5℃下静置过夜(通常静置10～24小时)，经透析、离心取上清液，获得式II所示的替来他明人工抗原。
如未作特殊说明，本发明中所述牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于0.01M、pH＝7.2～7.4的PBS缓冲液中制成的。
步骤(b)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/mL，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:5～6。
本发明选用牛血清蛋白(BSA)作为大分子载体，与牛丙种蛋白(BGG)相比具有以下优点：①牛血清蛋白是最常用的载体蛋白质，有更强的免疫原性，拥有众多抗原决定簇，易引起更强的免疫应答；②牛血清蛋白分子中含有大量的赖氨酸，有更多的自由氨基酸存在，且在不同PH值和离子强度下能保持更大的溶解度，在用有机溶剂(如二甲基甲酰胺)溶解时，其活性基团仍呈可溶状态，因此不易造成蛋白沉淀等现象；③牛血清蛋白有许多赖氨酸残基，含有上百个伯胺和羧基基团可以成为与戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和EDC等交联试剂交联的靶点，易与半抗原偶联，偶联效率高，且不易产生多克隆抗体，更易提高抗体的特异性，用牛血清蛋白与替来他明人工半抗原结合后形成的替来他明人工抗原，经动物免疫得到的抗替来他明抗体的特异性更好。
本发明还提供了所述替来他明人工抗原在制备抗替来他明抗体中的应用。
本发明的第五个目的在于提供所述替来他明人工半抗原或替来他明人工抗原在制备抗替来他明抗体中的应用。
本发明的第六个目的在于提供一种抗替来他明抗体，是由所述替来他明人工抗原经动物免疫得到的、可与替来他明发生特异性免疫反应的球蛋白。
本发明的第七个目的在于提供所述抗替来他明抗体在检测替来他明中的应用。
本发明的第八个目的在于可提供一种用于检测替来他明的试剂，所述试剂包括所述抗替来他明抗体。
本发明的第九个目的在于提供一种用于检测替来他明的试剂盒，所述试剂盒包括所述抗替来他明抗体。
试验发现，将所述替来他明人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1:85000。表明本发明的替来他明人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗替来他明抗体，该抗替来他明抗体可用于替来他明的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的替来他明人工半抗原最大程度地保留了替来他明的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的替来他明人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗替来他明抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:85000，可用于对替来他明进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明替来他明人工抗原Ⅱ的制备反应式。
其中，NaH表示氢化钠，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，THF表示四氢呋喃，MeOH表示无水甲醇，RT表示室温，BSA表示牛血清蛋白，Et3N表示三乙胺，下同。
图2为本发明实施例1制得的替来他明人工半抗原Ⅰ的液相色谱图。
其中，谱图横坐标是时间,单位min；纵坐标是响应值,单位是mAU。
图3为本发明实施例1制得的替来他明人工半抗原Ⅰ的质谱图。
其中，Relative Abundance表示相对丰度；m/z表示荷质比。
图4为替来他明人工半抗原Ⅰ、替来他明人工抗原Ⅱ，牛血清蛋白的紫外扫描图。
其中，Abs表示紫外-可见吸收光谱，WL(nm)表示波长(nm)。
图5为对比例1替来他明人工抗原Ⅳ的制备反应式。
其中，Pyridine表示吡啶,DCC表示N,N'-二环己基碳二亚胺，下同。
图6为对比例2替来他明人工抗原Ⅴ的制备反应式。
其中，BGG表示牛丙种蛋白。
图7为对比例3替来他明人工抗原Ⅵ的制备反应式。
图8为对比例4替来他明人工抗原Ⅶ的制备反应式。
图9为对比例5替来他明人工抗原Ⅷ的制备反应式。
图10为对比例6替来他明人工抗原Ⅸ的制备反应式。
图11为对比例7替来他明人工抗原Ⅹ的制备反应式。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例和对比例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
本实施一种替来他明人工抗原Ⅱ的制备方法(反应式如图1)，包括以下步骤：
(1)人工半抗原Ⅰ的制备：
①将200mg(0.896mmol)替来他明用5ml N,N-二甲基甲酰胺溶解，置于50ml圆底烧瓶中，加入108mg(2.688mmol)60％氢化钠，室温搅拌反应0.5小时，加入213μL(1.344mmol)5-溴戊酸乙酯，加热至65℃回流反应17hrs，反应结束后，直接转干，用20ml×3乙酸乙酯提取残渣3次，合并有机相，干燥、过滤、转干得到268mg黄色油状物，进一步用薄层层析法纯化获得196mg淡黄色油状物A。溶剂和洗脱剂为无水乙醇；
对该淡黄色油状物A进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚体积比＝1：4，产物Rf＝0.3；
薄层层析法采用的层析液为乙酸乙酯：石油醚体积比＝1：4，产物Rf＝0.3。
②将196mg(0.558mmol)淡黄色油状物A用2.35ml四氢呋喃和2.94ml无水甲醇溶解，加入19.6ml 1N氢氧化钠水溶液，室温下快速搅拌反应5小时，用1N盐酸水溶液调pH＝4～5，用30ml×3二氯甲烷萃取3次，合并有机相，干燥，过滤，转干，用薄层层析法纯化获得168mg替来他明人工半抗原Ⅰ。溶剂和洗脱剂为无水乙醇；
对该替来他明人工半抗原Ⅰ进行TLC检测，层析液为95vol％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:25wt％氨水体积比＝8:1:10:1，产物Rf＝0.5；
薄层层析法采用的层析液为95vol％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:25wt％氨水体积比＝8:1:10:1，产物Rf＝0.5；
替来他明人工半抗原Ⅰ的液相色谱图见图2(紫外检测器，波长285nm)，替来他明人工半抗原Ⅰ的质谱图见图3。
从图2可以看出经过纯化得到的替来他明人工半抗原的纯度达到99.9％以上，从图3可以看出本实施例得到的替来他明人工半抗原的M+H峰的质荷比(m/z)为324.45，与其理论相对分子量323吻合，它的其他三个主要碎片离子峰的质荷比(m/z)分别为294.18、310.14，与其两个主要碎片的理论分子量293、309吻合，综合以上数据可以初步确定步骤②得到的最终化合物就是本发明所设计的替来他明人工半抗原Ⅰ。
(2)替来他明人工抗原Ⅱ的制备：
③将168mg(0.520mmol)替来他明人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入8.4mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入72.2μL(0.520mmol)三乙胺，置于冰浴中搅拌30min，接着加入134.9μL(1.04mmol)氯甲酸异丁酯，冰浴搅拌反应2h，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、PH＝7.4的PBS缓冲液。
⑤称取0.21g牛血清蛋白溶于42ml步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析9次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原Ⅱ：替来他明-牛血清蛋白偶联物。替来他明人工抗原Ⅱ制备前后的紫外扫描图见图4。
图4中，曲线a为替来他明人工半抗原Ⅰ的紫外扫描图，曲线b为替来他明人工抗原Ⅱ的紫外扫描图，曲线c为牛血清蛋白的紫外扫描图。替来他明人工半抗原Ⅰ的最大吸收波长为285nm，替来他明人工抗原Ⅱ的最大吸收波长为273nm，牛血清蛋白的最大吸收波长为280nm。与替来他明人工半抗原Ⅰ、牛血清蛋白相比，替来他明人工抗原Ⅱ的最大吸收波长出现明显变化，说明替来他明人工半抗原Ⅰ与牛血清蛋白偶联成功。
对比例1
本实施一种替来他明人工抗原Ⅳ的制备方法(反应式如图5)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅲ的制备：
①将200mg(0.896mmol)替来他明用20ml吡啶溶解，置于50ml圆底烧瓶中，加入134.3mg(1.343mmol)丁二酸酐，100℃回流反应17小时，反应结束后，直接转干，得到288mg浅黄色油状物，用薄层层析法纯化获得190mg替来他明人工半抗原Ⅲ。溶剂和洗脱剂为无水乙醇；
对替来他明人工半抗原Ⅲ进行TLC检测，层析液为95vol％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:25wt％氨水体积比＝8:1:10:1，产物Rf＝0.5；
薄层层析法采用的层析液为95vol％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:25wt％氨水体积比＝8:1:10:1，产物Rf＝0.5。
(2)替来他明人工抗原Ⅳ的制备：
②取190mg(0.588mmol)替来他明人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入9.5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入101mg(0.882mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和182mg(0.882mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜，反应结束离心取上清液，备用。
③称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、PH＝7.4的PBS缓冲液。
④称取0.24g牛血清蛋白溶于48ml步骤⑥的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑤在快速搅拌下，将步骤②的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑥将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤③的PBS缓冲液透析9次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原Ⅳ：替来他明-牛血清蛋白偶联物。
对比例2
本实施一种替来他明人工抗原Ⅴ的制备方法(反应式如图6)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅲ的制备：
①与对比例1相同。
(2)替来他明人工抗原Ⅴ的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与替来他明人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤②-⑥与对比例1相同，得到替来他明人工抗原Ⅴ。
对比例3
本实施一种替来他明人工抗原Ⅵ的制备方法(反应式如图7)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅲ的制备：
①与对比例1相同。
(2)替来他明人工抗原Ⅵ的制备：
②称取190mg(0.588mmol)替来他明人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入9.5ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入81.7μL(0.588mmol)三乙胺，冰浴搅拌30min，接着加入152.6μL(1.176mmol)氯甲酸异丁酯，冰浴继续搅拌反应2h，反应结束后离心，取上清液，备用。
③-⑥与对比例1相同；得到替来他明人工抗原Ⅵ。
对比例4
本实施一种替来他明人工抗原Ⅶ的制备方法(反应式如图8)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅲ的制备：
①与对比例1相同。
(2)替来他明人工抗原Ⅶ的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与替来他明人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤②-⑥与对比例3相同，得到替来他明人工抗原Ⅶ。
对比例5
本实施一种替来他明人工抗原Ⅷ的制备方法(反应式如图9)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅰ的制备：
①-②与实施例1相同。
(2)替来他明人工抗原Ⅷ的制备：
③称取168mg(0.520mmol)替来他明人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶中，加入8.4mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入90mg(0.78mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和161mg(0.78mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲液。
⑤称取0.210g牛血清蛋白溶于42ml PBS缓冲液中，得到5mg/ml牛血清蛋白溶液。
⑥在快速搅拌下，将上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，即得到人工抗原混合液。
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析9次，透析结束后离心，取上清液，即得替来他明人工抗原Ⅷ。
对比例6
本实施一种替来他明人工抗原Ⅸ的制备方法(反应式如图10)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅰ的制备：
①-②与实施例1相同。
(2)替来他明人工抗原Ⅸ的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与替来他明人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤③-⑦与对比例5相同，得到替来他明人工抗原Ⅸ。
对比例7
本实施一种替来他明人工抗原Ⅹ的制备方法(反应式如图11)，包括以下步骤：
(1)替来他明人工半抗原Ⅰ的制备：
①-②与实施例1相同。
(2)替来他明人工抗原Ⅹ的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与替来他明人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤③-⑦与实施例1相同，得到替来他明人工抗原Ⅹ。
检测例替来他明人工抗原的性能测定
(1)替来他明人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的替来他明人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知替来他明人工半抗原的最大吸收波长为285nm，在285nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml的牛血清蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将替来他明人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释，在655nm处测得替来他明人工抗原的吸光值，从曲线上读取替来他明人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物(即替来他明人工抗原)用PBS稀释到100μg/ml，在285nm处测得吸光值A1，以PBS为空白测得吸光值A2，则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/66000)。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，66000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)。
采用牛丙种蛋白作载体时，偶联比的计算式为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/43000)；其中，43000为牛丙种蛋白的分子量。
表1各替来他明人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
编号 人工抗原 偶联比 偶联物蛋白浓度 摩尔吸收系数
实施例1 Ⅱ 32 3.688mg/ml 6088.12
对比例1 Ⅳ 14 3.324mg/ml 6116.28
对比例2 Ⅴ 6 1.687mg/ml 6116.28
对比例3 Ⅵ 12 2.654mg/ml 6116.28
对比例4 Ⅶ 16 0.452mg/ml 6116.28
对比例5 Ⅷ 4 3.188mg/ml 6088.12
对比例6 Ⅸ 20 3.618mg/ml 6088.12
对比例7 Ⅹ 9 1.066mg/ml 6088.12
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的结合比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的各替来他明人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2各免疫血清的效价检测结果
编号 替来他明人工抗原 免疫血清效价
实施例1 Ⅱ 1:85000
对比例1 Ⅳ 1:10000
对比例2 Ⅴ 1:6800
对比例3 Ⅵ 1:18000
对比例4 Ⅶ /
对比例5 Ⅷ 1:16000
对比例6 Ⅸ 1:18000
对比例7 Ⅹ 1:14000
由表2可见，与实施例1相比，利用各对比例替来他明人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。其中对比例4得到的替来他明人工抗原Ⅶ透析过程立即出现大量沉淀，对比例2得到的替来他明人工抗原Ⅴ较为浑浊，冷冻保存后出现大量沉淀，稳定性很差，故不能作为免疫抗原，而利用实施例1替来他明人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1:85000，完全可用于免疫分析中，能为替来他明的检测提供更加方便快速准确的途径。

Claims (10)

1.一种替来他明人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如Ⅰ所示：
2.如权利要求1所述替来他明人工半抗原的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)替来他明和5-溴戊酸乙酯进行取代反应，制得式A所示的化合物；
(2)式A所示的化合物进行水解反应，调节pH值为酸性，制得式I所示的替来他明人工半抗原；
所述方法的反应式如下式所示：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：
(1)替来他明溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在NaH作用下，加入5-溴戊酸乙酯，加热至60～70℃，进行取代反应，反应结束后，所得反应液后处理制得式A所示的化合物；
(2)式A所示的化合物用四氢呋喃和无水甲醇溶解，加入1N氢氧化钠水溶液，室温下快速搅拌，进行水解反应，反应结束后调节pH＝4～5，所得反应液后处理制得式I所示的替来他明人工半抗原。
4.一种替来他明人工抗原，其特征在于，其分子结构式如Ⅱ所示：
式Ⅱ中，BSA为牛血清蛋白。
5.如权利要求4所述的替来他明人工抗原的制备方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的式I所示的替来他明人工半抗原与牛血清蛋白通过混合酸酐法结合，制得式II所示的替来他明人工抗原。
6.如权利要求5所述的替来他明人工抗原的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)将式I所示的替来他明人工半抗原、氯甲酸异丁酯、三乙胺在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，0～5℃下搅拌反应2～4小时，反应结束后离心取上清液；
所述式I所示的替来他明人工半抗原、氯甲酸异丁酯、三乙胺的物质的量之比为1:1.5～2.5：1～1.5；
(b)将所述上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，将所得混合液置于3～5℃下静置过夜，经透析、离心取上清液，获得式II所示的替来他明人工抗原。
7.如权利要求1所述的替来他明半抗原或者权利要求4所述的替来他明人工抗原在制备抗替来他明抗体中的应用。
8.一种抗替来他明抗体，其特征在于，所述抗替来他明抗体是由权利要求4所述的替来他明人工抗原经动物免疫得到的、可与替来他明发生特异性免疫反应的球蛋白。
9.如权利要求8所述的抗替来他明抗体在检测替来他明中的应用。
10.一种用于检测替来他明的试剂盒，所述试剂盒包括所述如权利要求8所述的抗替来他明抗体。
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