CN108047071B - 一种卡西酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及卡西酮类人工抗原结构领域，具体而言，涉及一种卡西酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。一种卡西酮人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如下所示：
Figure DDA0001498809300000011
本发明提供的卡西酮人工半抗原，在卡西酮的N位上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留卡西酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对卡西酮的特异性和亲合力更强。

Description

一种卡西酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及卡西酮类人工抗原结构领域，具体而言，涉及一种卡西酮 人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
卡西酮(Cathinone)，又名benzoylethanamine(在以色列市场上又叫 hagigat)，是一种在阿拉伯茶中发现的一元胺生物碱，化学上与之相似的有： 麻黄碱，阿拉伯茶碱和其他安他非命。卡西酮能引起多巴胺释放，可能是 使阿拉伯茶产生刺激性影响的原因。
约1993年，U.S.Drug Enforcement Administration将卡西酮加入药物控 制条例的第一类药物。
目前，对卡西酮的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱 法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检 测费高，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准 确的要求。
免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体 特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析 方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化 合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括卡西酮在内的大多 数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位 而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。 通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基 团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)， 人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生 特异性抗体。
现有技术中还未有卡西酮人工半抗原、人工抗原的相关报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卡西酮人工半抗原，该卡西酮人工半抗原 最大程度地保留了卡西酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的 活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的卡西酮人工抗原可免疫 获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗卡西酮抗体。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种卡西酮人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如下所示：
Figure BDA0001498809280000021
本发明提供的卡西酮人工半抗原，在卡西酮的N位上引入连接臂，在 该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留卡西酮的特征结构，且具有可 以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可 能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对卡西酮的 特异性和亲合力更强。
而对于现有的4-甲基甲卡西酮类人工抗原的结构来说，其用于检测的 是4-甲基甲卡西酮类化合物。一般来讲，卡西酮类化合物包括卡西酮、甲 卡西酮和4-甲基甲卡西酮。因此，本发明提供的卡西酮人工抗原的检测 范围更广。
进一步地，本发明还提供了所述的卡西酮人工半抗原的制备方法，包 括以下步骤：
(a)Boc-L-丙氨酸与三氯甲基碳酸酯反应，得到
Figure BDA0001498809280000031
(b)
Figure BDA0001498809280000032
与苯反应，得到
Figure BDA0001498809280000033
(c)
Figure BDA0001498809280000034
先与NaH在溶剂的存在下反应，然后加入溴戊 酸乙酯反应，得到
Figure BDA0001498809280000035
(d)
Figure BDA0001498809280000036
在碱性条件下进行水 解，得到所述卡西酮人工半抗原。
进一步地，在步骤(a)中，Boc-L-丙氨酸与三氯甲基碳酸酯的摩尔比 为1:0.4～0.5，该反应是在溶剂中以及催化剂的条件下进行。
进一步地，在步骤(a)中，所述溶剂为乙酸乙酯，所述催化剂为三乙 胺，反应的温度为18-25℃，反应完成后，经过滤、浓缩和重结晶，得到
Figure BDA0001498809280000041
进一步地，在步骤(a)中，所述催化剂添加的方式为滴加，搅拌反应 2.5-3.5小时。
进一步地，在步骤(a)中，采用二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，得 白色晶体
Figure BDA0001498809280000042
在该反应条件下，白色晶体
Figure BDA0001498809280000043
的得率较高，后处理程序较为简 单，较易提纯。
另外，反应产物用二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，可以除去反应产 生的副产物，以达到大致提纯的目的。
进一步地，在步骤(b)中，反应是在催化剂的条件下进行，该催化剂 为无水三氯化铝，所述无水三氯化铝的摩尔添加量为
Figure BDA0001498809280000044
的4.5～5倍。
进一步地，在步骤(b)中，
Figure BDA0001498809280000045
先用苯溶解后，再分次加入催化 剂进行反应。
Figure BDA0001498809280000052
用苯溶解后，得到悬浮液；一般分三次加入催化剂， 每次间隔时间为25-35分钟，在室温下搅拌过夜，完成反应。
进一步地，在步骤(b)中，反应结束后，反应混合物倒入冰水中搅拌， 加入甲苯分层，水层用碱溶液中和，再用乙醚萃取，分出有机相，有机相 经洗涤、干燥和过滤，干燥得到黄色固体
Figure BDA0001498809280000053
在该反应条件下，黄色固体的得率较高，后处理程序较为简单，较易 提纯。
优选地，反应产物的洗涤依次用0.1M盐酸水溶液、双蒸水、饱和碳 酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液进行。采用如上酸洗、水洗、碱洗、再盐洗 的程序可以除去反应体系中偏碱，偏酸的副产物或者杂质，以达到大致提 纯的目的。
进一步地，在步骤(c)中，
Figure BDA0001498809280000054
与NaH按摩尔比1:4.5～5 混合，加入溶剂，反应后，按黄色固体
Figure BDA0001498809280000055
与溴戊酸乙酯摩尔 比为1:1.1～1.5加入溴戊酸乙酯，于65±2℃下搅拌反应2-5小时，经转干、 萃取，得到的有机相再经干燥、过滤、转干，得棕黄色油状产物
Figure BDA0001498809280000051
进一步地，加入溶剂后反应是在室温搅拌反应25-35分钟。
进一步地，在步骤(c)中，所述溶剂为DMF。
进一步地，在步骤(c)中，采用乙酸乙酯和水进行萃取。
优选地，黄色固体
Figure BDA0001498809280000063
与NaH摩尔比1:4.5～5，最优选为 1:5。黄色固体
Figure BDA0001498809280000064
与溴戊酸乙酯摩尔比为1:1.1～1.5，最优选 为1:1.5。
进一步地，步骤(d)具体步骤为：
Figure BDA0001498809280000061
用THF和无水甲醇溶解，加入 1mol/L的NaOH水溶液进行水解；
其中，
Figure BDA0001498809280000062
THF、无水甲醇与 1mol/L的NaOH水溶液的比例为：100±5mg：2.07±0.05ml：2.65±0.05ml： 9.9±0.1ml。
进一步地，所述水解反应的温度为18-25℃，反应的时间为3-5小时。
进一步地，反应结束后，调节pH＝4～5，萃取得到的有机相经干燥、过 滤、转干和纯化后得到所述卡西酮人工半抗原。
进一步地，该步骤所用的萃取剂为二氯甲烷，萃取2-4次。
进一步地，纯化采用薄层层析法进行。
通过上述方法，在卡西酮的N位上引入连接臂，在该修饰位点上引入 连接臂能最大程度地保留卡西酮的特征结构。
与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可 能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对卡西酮的 特异性和亲合力更强。
本发明还提供了一种卡西酮人工抗原，其分子结构式如下所示：
Figure BDA0001498809280000071
其中，R为牛丙种球蛋白或牛血清白蛋白。
进一步地，本发明还提供了所述的卡西酮人工抗原的制备方法，将上 述的卡西酮人工半抗原通过混合酸酐法或N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法与 目标蛋白结合得到。
目标蛋白为牛丙种球蛋白或牛血清白蛋白。
进一步地，所述混合酸酐法的步骤如下：
(a)将所述卡西酮人工半抗原、三乙胺、氯甲酸异丁酯按摩尔比 1:1～1.2:1～1.3混合，20～30℃下搅拌反应18～19小时，反应结束后离心取上 清液；
(b)将所述上清液滴加到蛋白溶液中，将所得混合液置于3～5℃下静 置过夜，经透析、离心取上清，即可。
进一步地，步骤(b)中，所述蛋白溶液的浓度为3-8mg/ml，所述上清 液与所述蛋白溶液的体积比为1:5～6。
如未作特殊说明，本发明中蛋白溶液是将目标蛋白牛丙种球蛋白或牛 血清白蛋白溶于钠离子浓度为0.1～0.2mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2～7.4) 中制成的。
优选地，R为牛丙种球蛋白。
本发明选用牛丙种球蛋白(BGG)作为大分子载体，与牛血清蛋白 (BSA)相比具有以下优点：
①牛丙种球蛋白能够结合更多的卡西酮人工半抗原，免疫原性较好；
②从实验看，牛丙种球蛋白与卡西酮人工半抗原的结合更稳定，牛血 清蛋白与卡西酮人工半抗原结合后，卡西酮人工半抗原容易在后续处理中 脱离，从而使最终的人工抗原在长期保存中容易产生沉淀，稳定性差；
③用牛丙种球蛋白与卡西酮人工半抗原结合后形成的卡西酮人工抗 原，经动物免疫得到的抗卡西酮体的特异性更好。
本发明还提供了一种抗卡西酮体，由上述卡西酮人工抗原经动物免疫 得到的，且与所述卡西酮人工抗原发生特异性免疫反应的球蛋白。
本发明还提供了上述的抗卡西酮抗体在检测卡西酮中的应用。
试验发现，将卡西酮人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效 价为1:80000，表明本发明的卡西酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏 度高、特异性强的抗卡西酮抗体，该抗卡西酮抗体可用于卡西酮的免疫检 测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的一种卡西酮人工半抗原，该卡西酮人工半抗原最 大程度地保留了卡西酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活 性基团，可作为抗原决定簇。
(2)本发明提供的卡西酮人工半抗原的制备方法，得到的卡西酮人 工半抗原的纯度达到99.9％及以上，纯度高。
(3)本发明提供的卡西酮人工抗原的制备方法，采用混合酸酐法，经 过活化反应，得到的卡西酮人工抗原亲和力高，特异性强。
(4)本发明提供的卡西酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、 特异性强的抗卡西酮抗体，相比于其他卡西酮人工抗原，免疫血清效价提 升15倍以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对 实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例提供的卡西酮人工抗原的制备流程图；
图2为本发明实施例提供的卡西酮人工半抗原的液相色谱图；
图3为本发明实施例提供的卡西酮人工半抗原的质谱图；
图4为牛丙种球蛋白、卡西酮人工半抗原、卡西酮人工抗原的紫外扫 描图；
图5为对比例1卡西酮人工抗原的制备流程图；
图6为对比例2卡西酮人工抗原的制备流程图；
图7为对比例3卡西酮人工抗原的制备流程图；
图8为对比例4卡西酮人工抗原的制备流程图；
图9为对比例5卡西酮人工抗原的制备流程图；
图10为对比例6卡西酮人工抗原的制备流程图；
图11为对比例7卡西酮人工抗原的制备流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技 术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明 的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的 常规产品。
实施例1
本实施例提供一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图1)，具 体包括以下步骤：
(1)人工半抗原的制备：
①将1.0g(5.285mmol)Boc-L-丙氨酸与627mg(2.114mmol)三氯 甲基碳酸酯加入100ml圆底烧瓶中，接着加入100ml干燥的乙酸乙酯做溶 剂，在室温下滴加0.81ml三乙胺，室温下搅拌反应3小时；反应结束后， 用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残余物用二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结 晶，去掉母液，得420mg白色晶体A；
对该白色晶体A进行TLC检测，层析液为石油醚:乙酸乙酯＝1:1，产 物Rf＝0.7～0.8；
②将420mg(3.652mmol)白色晶体A溶于16ml苯中，向此混悬液 中分三次逐渐加入2.44g(18.26mmol)无水三氯化铝，每次间隔时间为30 分钟，在室温下搅拌反应过夜，刚开始出现不溶物，溶液呈无色状，随着 反应进行，溶液逐渐变黄，最后成黑褐色状；停止反应，向反应混合物中 加入20ml甲苯和40ml纯化水，用分液漏斗分出水相和有机相，收集水相，水相用1mol/L NaOH水溶液调pH＝7，再用乙醚萃取，乙醚相依次用 0.1mol/L盐酸水溶液、双蒸水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤， 用无水硫酸钠干燥、过滤、转干，得到140mg黄色固体产物B；
对该黄色固体产物B进行TLC检测，层析液为95％乙醇：1,4-二氧六 环：二氯甲烷：氨水＝8：1：10：1，产物Rf＝0.8～0.9；
③140mg(0.94mmol)黄色固体B溶于7ml DMF中，加入112mg (4.70mmol)NaH，室温搅拌反应30分钟，加入221μL(1.41mmol)溴戊 酸乙酯，于65℃下搅拌反应3小时，油泵转干，用10ml乙酸乙酯提取、 过滤、转干，得298mg棕黄色油状物C；
④得到的298mg(1.197mmol)棕黄色油状物C用6.2ml THF和7.9ml 无水MeOH溶解，加入29.5ml 1mol/L的NaOH水溶液，室温下快速搅拌 反应4小时；反应结束后，用1M的盐酸调pH＝5，用二氯甲烷萃取，合并 二氯甲烷相，用无水硫酸镁干燥、过滤、转干，薄层层析法纯化得到180mg 卡西酮人工半抗原。
薄层色谱采用的层析液为95％乙醇：1,4-二氧六环：二氯甲烷：氨水 ＝8：1：10：1，产物Rf＝0.4～0.5。
卡西酮人工半抗原的液相色谱图见图2(紫外检测器，波长210nm)， 图2中，AU表示吸光度单位；卡西酮半抗原的质谱图见图3，其中，Relative Abundance表示相对丰度，m/z表示荷质比。
从图2可以看出经过纯化得到的卡西酮人工半抗原的纯度达到99.9％ 以上，从图3可以看出本实施例得到的卡西酮人工半抗原的分子离子峰的 质荷比(m/z)为248.16，与其理论分子量249.16吻合，它的其他三个主 要碎片离子峰的质荷比(m/z)分别为77.11、148.19、203.19，与其三个主 要碎片的理论分子量78、149、204吻合，综合以上数据可以确定步骤④得 到的最终化合物就是本发明所设计的卡西酮人工半抗原Ⅰ。
(2)卡西酮人工抗原的制备：
⑤将180mg(0.722mmol)卡西酮人工半抗原置于50ml圆底烧瓶中， 加入9ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入73.2mg(0.722mmol)三乙 胺和98.6mg(0.722mmol)氯甲酸异丁酯，20℃搅拌反应18小时，反应结 束后离心，取上清液，备用。
⑥称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯 化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L， 得到钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑦称取0.250g牛丙种球蛋白溶于50ml步骤⑥的PBS缓冲液中，得到 浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑧在快速搅拌下，将步骤⑤的上清液缓慢滴加到牛丙种球蛋白溶液 中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件 下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑨将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑥的PBS缓冲液透析9次， 透析结束后离心取上清液即得到卡西酮人工抗原：卡西酮-牛丙种球蛋白偶 联物(如式Ⅱ)。卡西酮人工抗原制备前后的紫外扫描图见图4，其中，Abs 表示紫外-可见吸收光谱，WL(nm)表示波长(nm)。
图4中，曲线a为卡西酮人工半抗原的紫外扫描图，曲线b为卡西酮 人工抗原的紫外扫描图，曲线c为牛丙种球蛋白的紫外扫描图。卡西酮人 工半抗原的最大吸收波长为290nm，卡西酮人工抗原的最大吸收波长为 278nm，与卡西酮半抗原、牛丙种球蛋白相比，卡西酮人工抗原的最大吸 收波长出现明显变化。
实施例2
本实施例提供一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图1)，具 体包括以下步骤：
(1)人工半抗原的制备：
①将1.0g(5.285mmol)Boc-L-丙氨酸与784mg(2.642mmol)三氯 甲基碳酸酯加入100ml圆底烧瓶中，接着加入100ml干燥的乙酸乙酯做溶 剂，在室温下滴加0.81ml三乙胺，室温下搅拌反应3小时；反应结束后， 用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残余物用二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结 晶，去掉母液，得398mg白色晶体A；
对该白色晶体A进行TLC检测，层析液为石油醚:乙酸乙酯＝1:1，产 物Rf＝0.7～0.8；
②将398mg(3.461mmol)白色晶体A溶于16ml苯中，向此混悬液 中分三次逐渐加入2.079g(15.574mmol)无水三氯化铝，每次间隔时间为 30分钟，在室温下搅拌反应过夜，刚开始出现不溶物，溶液呈无色状，随 着反应进行，溶液逐渐变黄，最后成黑褐色状；停止反应，向反应混合物 中加入20ml甲苯和40ml纯化水，用分液漏斗分出水相和有机相，收集水相，水相用1mol/L NaOH水溶液调pH＝7，再用乙醚萃取，乙醚相依次用 0.1mol/L盐酸水溶液、双蒸水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤， 用无水硫酸钠干燥、过滤、转干，得到119mg黄色固体产物B；
对该黄色固体产物进行TLC检测，层析液为95％乙醇:1,4-二氧六环: 二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.8～0.9；
③119mg(0.799mmol)黄色固体B溶于5.95mlDMF中，86.29mgNaH (3.596mmol)，室温搅拌反应30分钟，加入139.6μL(0.879mmol)溴戊 酸乙酯，于65℃下搅拌反应3小时，油泵转干，用10ml乙酸乙酯提取、 过滤、转干，得234mg棕黄色油状产物C；
④得到的234mg棕黄色油状产物C用4.87ml THF和6.2ml无水 MeOH溶解，加入23.2ml 1mol/L的NaOH水溶液，室温下快速搅拌反应4 小时；反应结束后，用1mol/L的盐酸调pH＝5，用二氯甲烷萃取，合并有 机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、转干，薄层层析法纯化得到102mg卡西 酮人工半抗原Ⅰ。薄层色谱采用的层析液为95％乙醇：1，4-二氧六环：二 氯甲烷：氨水＝8：1：10：1，产物Rf＝0.4～0.5。
检测，纯化得到的卡西酮人工半抗原的纯度达到99.9％。
(2)卡西酮人工抗原的制备：
⑤将102mg(0.409mmol)卡西酮人工半抗原置于50ml圆底烧瓶中， 加入5.1ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入41.48mg(0.491mmol)三 乙胺和55.87mg(0.409mmol)氯甲酸异丁酯，20℃搅拌反应18小时，反 应结束后离心，取上清液，备用。
⑥称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol)氯 化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L， 得到钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑦称取0.25g牛丙种球蛋白溶于50ml步骤⑥的PBS缓冲液中，得到 浓度为5mg/ml的牛丙种球蛋白溶液。
⑧在快速搅拌下，将步骤⑤的上清液缓慢滴加到牛丙种球蛋白溶液 中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1:6，得到的混合液在4℃条件 下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑨将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑥的PBS缓冲液透析9次， 透析结束后离心取上清液即得到卡西酮人工抗原：卡西酮-牛丙种球蛋白偶 联物(如式Ⅱ)。
卡西酮人工抗原制备前后的紫外扫描结果同实施例1。
对比例1
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图5)，包括以下步骤：
卡西酮人工半抗原的制备：
①将1.0g(5.285mmol)Boc-L-丙氨酸与627mg(2.114mmol)三氯 甲基碳酸酯加入100ml圆底烧瓶中，接着加入100ml干燥的乙酸乙酯作溶 剂，在室温下滴加0.81ml三乙胺，室温下搅拌反应3小时；反应结束后， 用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残余物用二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结 晶，去掉母液，得450mg白色晶体A；
对该白色晶体A进行TLC检测，层析液为石油醚：乙酸乙酯＝1：1， 产物Rf＝0.7～0.8；
②将450mg(3.913mmol)白色晶体A溶于16ml苯中，向此混悬液 中分三次逐渐加入2.61g(19.56mmol)无水三氯化铝，每次间隔时间为30 分钟，在室温下搅拌反应过夜，刚开始出现不溶物，溶液呈无色状，随着 反应进行，溶液逐渐变黄，最后成黑褐色状；停止反应，向反应混合物中 加入20ml甲苯和40ml纯化水，用分液漏斗分出水相和有机相，收集水相，水相用1mol/L NaOH水溶液调pH＝7，再用乙醚萃取，乙醚相依次用 0.1mol/L盐酸水溶液、双蒸水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤， 用无水硫酸钠干燥、过滤、转干，得到164mg黄色固体产物B；
对该黄色固体产物B进行TLC检测，层析液为95％乙醇：1，4-二氧 六环：二氯甲烷：氨水＝8：1：10：1，产物Rf＝0.8～0.9；
③将164mg(1.101mmol)黄色固体产物B与165mg(1.652mmol) 丁二酸酐溶于8.2ml无水吡啶中，100℃回流搅拌反应20小时；反应结束 后减压蒸馏，薄层层析法纯化得到86mg卡西酮半抗原(如式Ⅲ)；
对式Ⅲ卡西酮半抗原进行TLC检测，层析液为95％乙醇：1，4-二氧 六环:二氯甲烷：氨水＝8：1：10：1，产物Rf＝0.4～0.5。
(2)制备卡西酮人工抗原：
④将86mg(0.363mmol)卡西酮半抗原Ⅲ于50ml圆底烧瓶中，加入 4.3ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入60mg(0.523mmol)N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)和107mg(0.524mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)，室温搅拌反应 过夜，反应结束离心取上清液，备用。
⑤称取14.5g(0.0405mol)十二水磷酸氢二钠，43.875g(0.75mol) 氯化钠，1.495g(0.00958mol)二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L， 得到钠离子浓度为0.17mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取0.25g牛血清蛋白溶于50ml步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓 度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中， 上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5，得到的混合液在4℃条件下静 置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析9 次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：卡西酮-牛血清蛋白偶联物 (如式Ⅳ)。其中，图5中，BSA表示牛血清蛋白。
对比例2
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图6)，包括以下步骤：
(1)卡西酮人工半抗原的制备：与对比例1相同。
(2)卡西酮人工抗原的制备：
采用牛丙种球蛋白作载体，与卡西酮人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步 骤与对比例1相同，得到卡西酮人工抗原Ⅴ。
对比例3
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图7)，包括以下步骤：
(1)卡西酮人工半抗原的制备：①与对比例1相同。
(2)卡西酮人工抗原的制备：
②称取86mg(0.345mmol)卡西酮人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶 中，加入4.3mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入34.8mg(0.345mmol)三 乙胺和46.8mg(0.345mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应 结束后离心，取上清液，备用。
③-⑥与对比例1相同；得到卡西酮人工抗原Ⅵ。
对比例4
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图8)，包括以下步骤：
(1)卡西酮人工半抗原的制备：①与对比例1相同。
(2)卡西酮人工抗原的制备：②与对比例3相同。
③-⑥与对比例2相同；得到卡西酮人工抗原Ⅶ。
对比例5
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图9)，包括以下步骤：
(1)卡西酮人工半抗原的制备：①-③与实施例1相同。
(2)卡西酮人工抗原的制备：
④称取55mg(0.221mmol)卡西酮人工半抗原Ⅰ置于50ml圆底烧瓶 中，加入2.75mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入25.7mg(0.221mmol)N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)和45.23mg(0.221mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC)， 室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二 氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取70mg牛血清蛋白溶于14ml PBS缓冲液中，得到牛血清蛋白溶 液。
⑦在快速搅拌下，将上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与 牛血清蛋白溶液的体积比为1:5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过 夜，既得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析9次，透 析结束后离心，取上清液，即得卡西酮人工抗原Ⅷ。
对比例6
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图10)，包括以下步骤：
(1)卡西酮人工半抗原的制备：①-③与实施例1相同。
(2)卡西酮人工抗原的制备：
采用牛丙种球蛋白作载体，与卡西酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步 骤与对比例5相同，得到卡西酮人工抗原Ⅸ。
对比例7
一种卡西酮人工抗原的制备方法(制备流程见图11)，包括以下步骤：
(1)卡西酮人工半抗原的制备：①-③与实施例1相同。
(2)卡西酮人工抗原的制备：④-⑤与实施例1相同。
⑥称取0.30g牛血清蛋白溶于60ml PBS缓冲液中，得到牛血清蛋白溶 液，备用。
⑦-⑧与对比例5相同，得卡西酮人工抗原Ⅹ。
实验例
卡西酮人工抗原的性能测定
(1)卡西酮人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用步骤⑤的PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、 10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的卡西酮人工半抗原溶液，通过紫 外扫描图可知卡西酮半抗原的最大吸收波长为290nm，在290nm处测吸光 值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数(即摩尔吸收系数)的计算公式为： ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：用步骤⑤的PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml 的牛丙种球蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃ 水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓 度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比 例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液 的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将偶联物(即 卡西酮人工抗原)用PBS稀释到100μg/ml，在278nm处测得吸光值A1， 以PBS为空白测得吸光值A2，则偶联比率γ为：γ＝[(A1－ A2)/ε]/(100×10-3/150000)。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，150000为牛丙种球蛋白的分子量， 100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。
采用牛血清蛋白作载体时，偶联比的计算式为：γ＝[(A1－ A2)/ε]/(100×10-3/65000)；其中，65000为牛血清蛋白的分子量。
得到的结果如表1所示。
表1各卡西酮人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
Figure BDA0001498809280000181
Figure BDA0001498809280000191
由表1可见，人工半抗原的结构、人工半抗原的活化方法以及载体蛋 白的结构对人工半抗原与载体蛋白交联时的结合比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的各卡西酮人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经 ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2各免疫血清的效价检测结果
编号 卡西酮人工抗原 免疫血清效价
实施例1 Ⅱ 1:80000
实施例2 Ⅱ 1:80000
对比例1 Ⅳ 1:2500
对比例2 Ⅴ 1:2600
对比例3 Ⅵ 1:3500
对比例4 Ⅶ 1:3200
对比例5 Ⅷ 1:6000
对比例6 Ⅸ 1:5000
对比例7 Ⅹ /
由表2可见，与实施例1和实施例2相比，利用各对比例卡西酮人工 抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。 其中对比例7得到的卡西酮人工抗原Ⅹ较为浑浊，冷冻保存后出现大量沉 淀，稳定性很差，故不能作为免疫抗原。而本发明提供的卡西酮人工抗原 Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1:80000，完全可用于免疫分 析中，为卡西酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
综上可知，本发明提供的卡西酮人工半抗原，最大程度地保留了卡西 酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原 决定簇；进一步制备获得的卡西酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度 高、特异性强的抗卡西酮抗体。
本发明中，DMF表示N，N-二甲基甲酰胺，DCC表示二环己基碳二 亚胺，THF表示四氢呋喃，BSA表示牛血清蛋白，BGG表示牛丙种球蛋 白。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背 离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此， 这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修 改。

Claims (17)

1.一种卡西酮人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)Boc-L-丙氨酸与三氯甲基碳酸酯反应，得到
Figure FDA0002422015810000011
(b)
Figure FDA0002422015810000012
与苯反应，得到
Figure FDA0002422015810000013
(c)
Figure FDA0002422015810000014
先与NaH在溶剂的存在下反应，然后加入溴戊酸乙酯反应，得到
Figure FDA0002422015810000015
(d)
Figure FDA0002422015810000016
在碱性条件下进行水解，得到所述卡西酮人工半抗原；
所述卡西酮人工半抗原的分子结构式如下所示：
Figure FDA0002422015810000017
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，Boc-L-丙氨酸与三氯甲基碳酸酯的摩尔比为1:0.4～0.5，该反应是在溶剂中以及催化剂的条件下进行。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为乙酸乙酯，所述催化剂为三乙胺，反应的温度为18-25℃，反应完成后，经过滤、浓缩和重结晶，得到
Figure FDA0002422015810000021
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，得白色晶体
Figure FDA0002422015810000022
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，反应是在催化剂的条件下进行，该催化剂为无水三氯化铝，所述无水三氯化铝的摩尔添加量为
Figure FDA0002422015810000023
的4.5～5倍。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
Figure FDA0002422015810000024
先用苯溶解后，再分次加入催化剂进行反应。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，反应结束后，反应混合物倒入冰水中搅拌，加入甲苯分层，水层用碱溶液中和，再用乙醚萃取，分出有机相，有机相经洗涤、干燥和过滤，干燥得到黄色固体
Figure FDA0002422015810000025
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(c)中，
Figure FDA0002422015810000031
与NaH按摩尔比1:4.5～5混合，加入溶剂，反应后，按黄色固体
Figure FDA0002422015810000032
与溴戊酸乙酯摩尔比为1:1.1～1.5加入溴戊酸乙酯，于65±2℃下搅拌反应2-5小时，经转干、萃取，得到的有机相再经干燥、过滤、转干，得棕黄色油状产物
Figure FDA0002422015810000033
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为DMF。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，采用乙酸乙酯和水进行萃取。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(d)具体步骤为：
Figure FDA0002422015810000034
用THF和无水甲醇溶解，加入1mol/L的NaOH水溶液进行水解；
其中，
Figure FDA0002422015810000035
THF、无水甲醇与1mol/L的NaOH水溶液的比例为：100±5mg：2.07±0.05ml：2.65±0.05ml：9.9±0.1ml。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述水解反应的温度为18-25℃，反应的时间为3-5小时。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，反应结束后，调节pH＝4～5，萃取得到的有机相经干燥、过滤、转干和纯化后得到所述卡西酮人工半抗原。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，该步骤所用的萃取剂为二氯甲烷，萃取2-4次。
15.卡西酮人工抗原的制备方法，其特征在于，根据权利要求1-14任一项所述的方法制备卡西酮人工半抗原；
将所述卡西酮人工半抗原通过混合酸酐法或N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法与牛丙种球蛋白或牛血清白蛋白结合得到；
所述卡西酮人工抗原的分子结构式如下所示：
Figure FDA0002422015810000041
其中，R为牛丙种球蛋白或牛血清白蛋白。
16.根据权利要求15所述的卡西酮人工抗原的制备方法，其特征在于，所述混合酸酐法的步骤如下：
(a)将所述卡西酮人工半抗原、三乙胺、氯甲酸异丁酯按摩尔比1:1～1.2:1～1.3混合，20～30℃下搅拌反应18～19小时，反应结束后离心取上清液；
(b)将所述上清液滴加到蛋白溶液中，将所得混合液置于3～5℃下静置过夜，经透析、离心取上清，即可。
17.根据权利要求16所述的卡西酮人工抗原的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述蛋白溶液的浓度为3-8mg/ml，所述上清液与所述蛋白溶液的体积比为1:5～6。
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