CN105301253B - 富集t‑2毒素的免疫磁珠及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种富集T‑2毒素的免疫磁珠及其制备方法和应用，它是以羧基磁珠为载体，T‑2毒素单克隆抗体为识别中间体，经过活化‑偶联‑洗涤‑封闭的过程制备出偶联有T‑2毒素单克隆抗体的免疫磁珠，在合适的缓冲液中于一定条件下孵育可以高效捕捉、富集检测样本中的T‑2毒素。本发明富集T‑2毒素的免疫磁珠具有浓缩待测样品中T‑2毒素浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。

Description

富集T-2毒素的免疫磁珠及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及T-2毒素样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种富集T-2毒素的免疫磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
T-2毒素(T-2toxin)是A类单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种，在自然界中广泛存在，其产生菌为镰孢菌属、木霉菌、胶枝霉菌和青霉菌等霉菌，主要污染小麦、大麦、玉米等谷物及其制品。T-2毒素在动物体内代谢缓慢，主要危害造血组织和免疫器官，可造成免疫系统损伤及血液毒性，能够抑制动物细胞DNA、RNA及蛋白质合成，诱导细胞凋亡，引起白细胞缺乏等症状。人类误食大量污染该类毒素的谷物后，除表现呕吐、腹痛、腹泻等急性症状外，还可导致白细胞缺乏、坏死性咽峡炎、骨髓发育不良、食管和胃黏膜坏死等，严重的可导致死亡。我国GB 21693-2008《配合饲料中T-2毒素的允许量》中规定猪配合饲料和禽配合饲料中T-2毒素的允许量≤1mg/kg。
目前食品中T-2毒素的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。
免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagnetic bead，IMB)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(IMB)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来IMB以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。
在分离真菌毒素方面，IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。IMB对目的毒素的富集具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团，从而减少漏检，减少安全隐患。
本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集T-2毒素的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对T-2毒素的富集能力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及饲料中T-2毒素的分离与富集，可以进一步提高快速检测T-2毒素的效率。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种富集T-2毒素的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决T-2毒素样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种富集T-2毒素的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有T-2毒素单克隆抗体；所述T-2毒素单克隆抗体是用T-2毒素人工抗原免疫白鼠所得到的；所述T-2毒素人工抗原是T-2毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：
所述T-2毒素人工抗原是按照如下方法制备得到的：
将12mg T-2毒素半抗原溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将30mg二环己基碳二亚胺(DCC)和30mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于0.2mL DMF后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，称为A液；
将50mg载体蛋白溶于3.8mL PBS缓冲液(pH 7.2)中，称为B液；
将A液加入到B液中，室温搅拌24h，离心取上清液，将得到的产物透析，得到所述T-2毒素人工抗原。
所述T-2毒素半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
所述T-2毒素半抗原是按照如下方法制备得到的：Ⅰ、将100mg T-2毒素加乙腈溶解，再加入200μL乙酸和200mg重铬酸吡啶盐，70℃反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙腈，加水-乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，上硅胶柱，用三氯甲烷/甲醇(10:1)洗脱分离，得到中间产物；Ⅱ、将中间产物加3mL乙醇溶解后，再加入50mg碳酸钾和5mL含有200mg氨基丙酸的水溶液，60℃反应12h，停止反应，加水-乙酸乙酯萃取，除去有机相，水相加稀盐酸调节pH到4，加乙酸乙酯萃取，除去水相，有机相干燥蒸干，乙醚重结晶，得到T-2毒素半抗原。
本发明还提供了一种上述免疫磁珠的制备方法，是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与T-2毒素单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化T-2毒素的免疫磁珠；
上述免疫磁珠的制备方法具体描述如下：
(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；
(3)偶联：将T-2毒素单克隆抗体溶解到60μL pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μL含50mmol/L乙醇胺的pH8.0的PBS溶液反应15min封闭磁珠；
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％吐温-20的PBS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％BSA、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的PBS溶液中，2-8℃保存备用。
本发明同时提供了上述免疫磁珠在富集净化T-2毒素中的应用。
实验证明，本发明富集T-2毒素的免疫磁珠对T-2毒素有很高的富集率和回收率，对T-2毒素的富集率为40ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获40ng T-2毒素)，对T-2毒素的回收率达到85％以上。本发明富集T-2毒素的免疫磁珠可以高效、准确、可靠、快速、简便地把待检样品中的T-2毒素富集起来，以便进一步应用于化学分析仪器检测(HPLC，高效液相色谱法)、酶联免疫吸附法检测和胶体金测试条的快速测试，具有浓缩待测样品中T-2毒素浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。
附图说明
图1 T-2毒素半抗原合成路线图
图2 T-2毒素半抗原核磁共振氢谱图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1富集T-2毒素的免疫磁珠的制备
本实施例给出了由T-2毒素单克隆抗体和含羧基的免疫磁珠偶联得到的偶联物作为富集T-2毒素的免疫磁珠的制备方法。该方法包括：
一、T-2毒素单克隆抗体的制备
1、T-2毒素半抗原的合成(合成路线见附图1)及鉴定
将100mg T-2毒素加乙腈溶解，再加入200μL乙酸和200mg重铬酸吡啶盐，70℃反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙腈，加水-乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，上硅胶柱，用三氯甲烷/甲醇(10:1)洗脱分离，得到中间产物。
将上述中间产物加3mL乙醇溶解后，再加入50mg碳酸钾和5mL含有200mg氨基丙酸的水溶液，60℃反应12h，停止反应，加水-乙酸乙酯萃取，除去有机相，水相加稀盐酸调节pH到4，加乙酸乙酯萃取，除去水相，有机相干燥蒸干，乙醚重结晶，得到T-2毒素半抗原原。
取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见附图2。1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，5.37(d,1H,C＝CH)，4.83(s,1H,CH-O)，4.43(s,1H,-CH-O-OC-)，4.13(m,2H,CH2)，3.9(d,1H,CH)，3.29(m,1H,-CH-)，2.59(m,2H,-CH2-)，1.69(t,2H,-CH2-)，1.04(s,3H,-CH3)。图谱中化学位移δ＝11的为羧基氢，化学位移δ＝1.6、2.3的为氨基丙酸上的氢，说明间隔臂偶联成功，T-2毒素半抗原结构正确。
2、T-2毒素人工抗原的合成及鉴定
将12mg T-2毒素半抗原溶于1mL DMF中，将30mg DCC和30mg NHS溶于0.2mL DMF后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，称为A液；
将50mg BSA溶于3.8mL PBS缓冲液(pH 7.2)中，称为B液；
将A液逐滴缓慢滴加到B液中，室温搅拌24h，离心取上清液转移到透析袋中，用0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液；透析后，离心除去残余的沉淀，取上清液得到T-2毒素人工抗原，分装后-20℃保存。
按合成T-2毒素人工抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。偶联物T-2毒素半抗原-BSA的最大吸收峰与T-2毒素半抗原、BSA的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明T-2毒素半抗原-BSA的合成是成功的。经计算，半抗原与BSA的结合比为15:1。
3、T-2毒素单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤细胞的获得
1)首次免疫：将T-2毒素半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；
2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；
3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；
4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。
(2)单克隆抗体的制备
1)细胞复苏：取出T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到T-2毒素单克隆抗体溶液(-20℃保存)。
(3)单克隆抗体效价的测定
用竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(10000～50000)。
竞争ELISA方法：用T-2人工抗原包被酶标板，加入T-2标准品溶液、辣根过氧化物酶标记的T-2毒素单克隆抗体，25℃反应10min，倒出孔内液体，用去离子水洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应5min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。
(4)单克隆抗体特异性的测定
抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。
本实验将T-2毒素、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉素做系列稀释，分别与单克隆抗体进行竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC50，然后按下式计算交叉反应率：
结果显示各类似物的交叉反应率为：T-2毒素100％、赭曲霉毒素A＜1％、黄曲霉毒素B1＜1％、黄曲霉毒素M1＜1％、呕吐毒素＜1％、玉米赤霉烯酮＜1％、展青霉素＜1％。本发明抗体对赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉素等其他真菌毒素无交叉反应，只针对T-2毒素有特异性结合。
二、免疫磁珠的制备
该过程以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与T-2毒素单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化T-2毒素的免疫磁珠。具体步骤如下：
(1)清洗：取100μL羧基磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8μm，含量是0.15eq/g)于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；
(3)偶联：将T-2毒素单克隆抗体溶解到60μL pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μL含50mmol/L乙醇胺的pH8.0的PBS溶液反应15min封闭磁珠；
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％BSA、0.1％吐温-20的PBS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％BSA、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的PBS溶液(浓度为10mg/mL)中，2-8℃保存备用。
实施例2免疫磁珠的特性检测
取按照实施例1制备的富集T-2毒素的免疫磁珠0.1mL(浓度为10mg/mL)于10mL离心管中，用5mL去离子水润洗磁珠2次，磁分离后移除上清；然后加入1mL待测样品(将T-2毒素标准品用PBS缓冲液分别配制成浓度为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL的T-2毒素溶液作为待测样品，并以PBS缓冲液作为空白待测样品)，混匀，25℃捕获20min，期间5min混匀一下磁珠；磁分离后移除上清，用5mL去离子水润洗磁珠2次，除去干扰杂质。最后加入1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用HPLC法按照GB/T28718-2012检测待测样品中T-2毒素的含量。结果见表1。
表1免疫磁珠的特性检测结果
标准品量(ng) 0 10 20 30 40 50 60
检测结果(ng) 0 9.35 18.36 26.76 36.12 36.95 42.36
回收率(％) — 93.5 91.8 89.2 90.3 73.9 70.6
结果表明：①空白待测样品用洗脱液洗脱，未检出T-2毒素；②当标准品量在10ng～40ng之间时，用洗脱液洗脱出的T-2毒素分别为9.35ng、18.36ng、26.76ng、36.12ng，回收率均达到了85％以上；③当标准品量大于40ng时，免疫磁珠偶联上的T-2毒素趋向饱和，回收率反而下降。说明富集T-2毒素的免疫磁珠对T-2毒素的富集率为40ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获40ng T-2毒素)，对T-2毒素的回收率达到85％以上。
实施例3免疫磁珠的使用方法
1、样品前处理
谷物、饲料样品：用均质器均质样品；称取5g(精确到0.01g)样品至样品瓶中，加入1.5g氯化钠和30mL 60％甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min，或者摇床震荡20min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77℉)离心5min；吸取5mL离心上清液，加入5mL去离子水，混匀，待用。
2、免疫磁珠捕获
取T-2毒素免疫磁珠0.2mL于10mL离心管中，用5mL去离子水润洗2次，每次用磁分离架分离洗液(每次在磁分离架上静置3min，确保磁珠全部吸附)；向润洗好的T-2毒素免疫磁珠中加入处理好的样品5mL，混匀，25℃捕获20min，期间5min混匀一下磁珠；用磁分离架分离免疫磁珠，用5mL去离子水润洗免疫磁珠2次(方法同前)。
3、免疫磁珠洗脱
用1mL甲醇洗免疫磁珠，混匀，静置1min，用磁分离架分离免疫磁珠，回收甲醇液，即为富集净化后的T-2毒素样品，可应用于化学分析仪器检测(HPLC，高效液相色谱法)、酶联免疫吸附法检测或胶体金测试条的快速测试。

Claims (3)

1.一种富集T-2毒素的免疫磁珠的制备方法，其是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠与T-2毒素单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化T-2毒素的免疫磁珠，其特征在于：所述T-2毒素单克隆抗体是用T-2毒素人工抗原免疫白鼠所得到的，所述T-2毒素人工抗原是T-2毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，所述T-2毒素半抗原是按照如下方法制备得到的：
Ⅰ、将100mg T-2毒素加乙腈溶解，再加入200μL乙酸和200mg重铬酸吡啶盐，70℃反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙腈，加水-乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，上硅胶柱，用三氯甲烷/甲醇＝10:1洗脱分离，得到中间产物；
Ⅱ、将中间产物加3mL乙醇溶解后，再加入50mg碳酸钾和5mL含有200mg氨基丙酸的水溶液，60℃反应12h，停止反应，加水-乙酸乙酯萃取，除去有机相，水相加稀盐酸调节pH到4，加乙酸乙酯萃取，除去水相，有机相干燥蒸干，乙醚重结晶，得到T-2毒素半抗原，其分子结构式为：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述T-2毒素人工抗原是按照如下方法制备得到的：将12mg T-2毒素半抗原溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，将30mg二环己基碳二亚胺和30mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.2mL N,N-二甲基甲酰胺后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，称为A液；将50mg载体蛋白溶于3.8mL pH 7.2的PBS缓冲液中，称为B液；将A液加入到B液中，室温搅拌24h，离心取上清液，将得到的产物透析，得到所述T-2毒素人工抗原，其分子结构式为：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；
(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；
(3)偶联：将T-2毒素单克隆抗体溶解到60μL pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；
(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μL含50mmol/L乙醇胺的pH8.0的PBS溶液反应15min封闭磁珠；
(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白、0.1％吐温-20的PBS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％牛血清白蛋白、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的PBS溶液中，2-8℃保存备用。
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