CN101555234A

CN101555234A - 氰脲三酰胺半抗原、人工抗原和抗体制备方法及应用

Info

Publication number: CN101555234A
Application number: CNA2009100383756A
Authority: CN
Inventors: 雷红涛; 孙远明; 宋利军; 沈玉栋; 杨金易; 张挺; 王弘; 徐晓艳; 柳春红
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2009-10-14

Abstract

本发明公开了一种氰脲三酰胺半抗原、人工抗原和抗体制备方法及应用。以2，4－二氨基－6－氯－1，3，5－三嗪为原料，在碱性条件下与氨基酸或巯基酸反应生成含羧基的半抗原；然后通过活泼酯法或者混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫动物后，获得氰脲三酰胺特异性抗体。所述抗体可用于氰脲三酰胺免疫检测，实现氰脲三酰胺安全监控。

Description

氰脲三酰胺半抗原、人工抗原和抗体制备方法及应用

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及氰脲三酰胺快速检测技术的核心试剂半抗原、人工抗原和抗体制备方法及应用。

背景技术

氰脲三酰胺，又名蜜胺，1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲，是制造氰脲三酰胺-甲醛树脂(密胺塑料)的原料，常用于制造日用器皿、装饰贴面板、织物整理剂等。在中国，日常生活中氰脲三酰胺-甲醛树脂(即密胺塑料)最常见的应用是一类被称为“美耐皿(又称密胺碗)”的塑料碗碟。这类器皿的物理性质非常类似陶瓷，坚硬不变形但又不像陶瓷那样易碎。常常标有“不可以在微波炉中使用”的警示，因为氰脲三酰胺-甲醛树脂(即密胺塑料)受热后有可能散发毒性。氰脲三酰胺还可以与乙醚配合作纸张处理剂，在一些涂料中作交联剂，以及阻燃化学处理剂等。

食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用凯氏定氮法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于氰脲三酰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子，有时被不法分子用于食品、饲料造假，已经发生过重大食品安全事故。氰脲三酰胺被摄入人体后，通过小肠吸收进入血液循环并最终进入肾脏，形成肾结石，尤其对于哺乳期的婴儿，更容易造成结石。

氰脲三酰胺的检测目前主要采用仪器检测的方法。主要方法有：GC-MS法、Spectra-Quad在线检测、超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱-二极管阵列法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-四极杆质谱联用、固相萃取与高效液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)等。这些仪器方法价格昂贵，且方法操作复杂，需受过专门训练的人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。目前非常缺乏特异性强、灵敏度高、且操作简单方便、适宜快速的现场检测和大规模普查要求的氰脲三酰胺检测方法。因此，目前我国相应的氰脲三酰胺检测技术并不很完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测方法和产品，例如免疫检测方法。

免疫检测方法，包括胶体金免疫层析、ELISA是目前食品安全快速检测的两种重要方法，已经在食品安全监控中发挥着越来越明显的作用。但建立氰脲三酰胺的免疫检测方法必须首先制备出氰脲三酰胺半抗原、抗原及抗体，然后才能利用这些试剂建立免疫检测方法。目前并无关于氰脲三酰胺半抗原、抗原及抗体制备的相关技术报道。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种氰脲三酰胺半抗原，及其制备方法。

本发明的另一个目的是提供氰脲三酰胺抗原及其制备方法。

本发明还有一个目的是提供氰脲三酰胺抗体及其制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供一种氰脲三酰胺半抗原，具有式(I)或式(II)所示结构：

其中，式(I)或式(II)中n＝1～6。

所述半抗原的制备方法包括以下步骤：

(1)2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和氨基酸或含巯基的羧酸物质混合物在反应溶剂中溶解，加入缚酸剂，于40～80℃反应5～48h，减压蒸除溶剂得浓缩物；

(2)浓缩物溶于5～10％的碳酸氢钠水溶液中，用有机溶剂洗涤后得到水相，水相酸化至pH为1～6，收集沉淀得所述半抗原。

式(I)所示半抗原的合成路线如下：

具体操作是：按投料比6∶1～1∶1将2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和氨基丙酸装入圆底烧瓶中，加入少量四氢呋喃或乙醇或丙酮或吡啶等反应溶剂溶解反应物，再加入2～3倍于氨基丙酸物质的量的三乙胺或者KOH等缚酸剂，40～80℃反应5～48h，减压蒸除溶剂，浓缩物溶于5～10％的碳酸氢钠水溶液中，用正己烷或二氯甲烷或石油醚等有机溶剂洗涤2次，水相用醋酸或盐酸酸化至pH值为1～6，收集沉淀，得半抗原。

式(II)所示半抗原的合成路线如下：

具体操作是：按投料比6∶1～1∶1将2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和巯基丙酸装入圆底烧瓶中，加入少量四氢呋喃或乙醇或丙酮或吡啶等反应溶剂溶解反应物，再加入2～3倍于巯基丙酸物质的量的三乙胺或者KOH等缚酸剂，40～80℃反应5～48h，减压蒸除溶剂，浓缩物溶于5～10％的碳酸氢钠水溶液中，用正己烷或二氯甲烷或石油醚等有机溶剂洗涤2次，水相用醋酸或盐酸酸化至pH 1～6，收集沉淀，得半抗原。

本发明同时提供了一种氰脲三酰胺抗原，具有式(III)或式(IV)所示结构：

其中，式(III)或式(IV)中n＝1～6，优选n＝5。

所述氰脲三酰胺抗原的制备方法是将氰脲三酰胺半抗原与载体物质偶联获得，可采用活泼脂法或混合酸酐法；

活泼脂法包括以下步骤：

(1)将半抗原溶解于二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3.5-5h，离心除去沉淀得上清；

(2)将上清滴入pH值为7.4～9.55、含有10mg/mL载体蛋白的碳酸缓冲液中，反应2～4h，用0.85％的生理盐水透析3天得所述抗原。

混合酸酐法包括以下步骤：

(1)将半抗原溶于二甲基甲酰胺或二氧六环中，加入氯甲酸异丁酯，搅拌反应0.5h，得甲液；

(2)将载体蛋白溶于pH值为7.4～9.55的0.1mol/L碳酸缓冲液中，蛋白终浓度为10mg/mL，得乙液；

(3)将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，反应液用0.85％的生理盐水透析3天得抗原。

所述载体蛋白可为BSA、KLH、CONA、THY、OVA或BTG。

本发明同时提供了氰脲三酰胺抗体的制备方法，是将所述氰脲三酰胺抗原免疫动物后采集血清或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞制备得到。

制备步骤如下：用所得人工抗原免疫Balb/c小鼠或新西兰兔，免疫剂量为1mg/Kg，背部皮下注射，每隔15天加强免疫一次，第4次后耳缘静脉采血测定效价和特异性，待效价和特异性合格后，采集血清获得多克隆抗体；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，细胞分泌获得单克隆抗体。

抗体用辛酸-硫酸铵法或Protein G/A亲和纯化。

所述氰脲三酰胺抗体可应用于食品、水、包装材料或环境中的氰脲三酰胺残留检测。

本发明的有益效果是通过设计合理的合成路线，成功合成氰脲三酰胺半抗原、抗原，免疫动物制备得到特异性抗体。所述抗体可用于简单快捷方便的氰脲三酰胺免疫检测，包括胶体金免疫层析、ELISA等食品安全快速检测方法，实现氰脲三酰胺安全监控。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1半抗原1合成

以含6个碳原子的6-氨基己酸作为原料，将5.4mmol的2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和0.9mmol的6-氨基己酸装入圆底烧瓶中，加入100mL丙酮，再加入2.7mmoL氢氧化钾，40℃反应48h，减压蒸除溶剂得浓缩物，浓缩物溶于25mL 10％的碳酸氢钠水溶液中，用正己烷洗涤2次，然后水相用浓醋酸酸化至pH 2，收集沉淀，得半抗原(CAAT-AC6)。

半抗原鉴定结果：

MS(EI)，m/z(％)：240(M⁺，11.68)，181(50.88)，167(17.28)，153(39.01)，139(100)，126(31.09)。对C₉H₁₆O₂N₆进行HRMS，理论值2401329，实测值240.1329。IR(KBr)v_max/cm^-1：3492(s)，3409(s)，3331(s)，3159(s)，2937(s)，2860(w)，1642(vs，doublet)，1553(s)，1473(s)，1442(s)，1371(s)，1309(w)，1165(w)，811(w)。¹H NMR(DMSO-d₆，600MHz，δ/ppm)：1.56-1.45(m，4H)，1.32-1.25(m，2H)，2.21(t，J＝7.35，7.35Hz，2H)，3.25(dd，J＝12.97，6.65Hz，2H)；7.85-8.18(br，4H)。¹³C NMR(MeOH-d₆，150MHz，δ/ppm)：177.4(C-1)，41.6(C-6)，34.8(C-2)，30.09(C-5)，27.2(C-4)，25.6(C-3)。

实施例2半抗原2合成

以含3个碳原子的氨基丙酸作为原料举例：将5.4mmol的2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和5.4mmol的氨基丙酸装入圆底烧瓶中，加入100mL乙醇，再加入10.8mmoL三乙胺，70℃反应9h，减压蒸除溶剂得浓缩物，浓缩物溶于25mL 5％的碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷洗涤2次，然后水相用盐酸酸化至pH值为1，收集沉淀，得半抗原3-(4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-氨基)-丙酸(英文名：3-(4，6-diamino-1，3，5-triazin-2-ylthio)propanoic acid)，命名为M-a-3-BSA。

实施例3半抗原3合成

以含3个碳原子的3-巯基丙酸作为原料，将5.4mmol的2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和1.8mmol的3-巯基丙酸装入圆底烧瓶中，加入100mL四氢呋喃，再加入4.5mmoL氢氧化钾，60℃反应38h，减压蒸除溶剂得浓缩物，浓缩物溶于25mL 6％的碳酸氢钠水溶液中，用石油醚洗涤2次，然后水相用盐酸酸化至pH值为2，收集沉淀，得半抗原。

其它长度碳链的氨基酸或者巯基酸为原料时，合成方法同实施例1～3。

实施例4活泼酯法制备抗原

将0.20mmol的实施例1～3制备的半抗原溶解于1.0mL的二氧六环中，然后加入0.3～0.4mmol的二环己基碳二亚胺和0.3～0.4mmol N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3.5～5h，离心除去沉淀，将上清滴入5mLpH为8.0的碳酸缓冲液中，缓冲液中含有10mg/mL的载体蛋白，载体蛋白可为BSA或KLH或CONA或THY或OVA、BTG；反应2h后，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

实施例5活泼酯法制备抗原

将0.20mmol的实施例1～3制备的半抗原溶解于1.0mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入0.3～0.4mmol的二环己基碳二亚胺和0.3～0.4mmol N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3.5～5h，离心除去沉淀，将上清滴入5mL pH值为9.55的碳酸缓冲液中，缓冲液中含有10mg/mL的载体蛋白，载体蛋白可为BSA或KLH或CONA或THY或OVA、BTG；反应3h后，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

实施例6活泼酯法制备抗原

将0.20mmol的实施例1～3制备的半抗原溶解于1.0mL的二甲基甲酰胺中，然后加入0.3～0.4mmol的二环己基碳二亚胺和0.3～0.4mmol N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3.5～5h，离心除去沉淀，将上清滴入5mL pH为8的碳酸缓冲液中，缓冲液中含有10mg/mL的载体蛋白，载体蛋白可为BSA或KLH或CONA或THY或OVA、BTG；反应4h后，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3天，得人工抗原。

实施例7混合酸酐法制备抗原

将0.1mmol半抗原溶于1.5mL二氧六环中，加入0.15～0.2mmol氯甲酸异丁酯，搅拌反应0.5～2h，此为甲液；将50mg载体蛋白溶于4mL 0.1mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙液；载体蛋白可为BSA或KLH或CONA或THY或OVA、BTG。将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

实施例8混合酸酐法制备抗原

将0.1mmol半抗原溶于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.15mmol氯甲酸异丁酯，搅拌反应0.5h，此为甲液；将50mg载体蛋白溶于5mL 0.1mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙液；载体蛋白可为BSA或KLH或CONA或THY或OVA、BTG。将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

人工抗原使用时，免疫原载体蛋白和检测抗原载体蛋白不能相同。

其他手臂长度的人工抗原制备方法同此实施例。

实施例9动物免疫和抗体制备

人工抗原M-a-3-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫剂量为1mg/Kg，背部皮下注射，每隔15d加强免疫一次，第4次后耳缘静脉采血测定效价和特异性，待效价和特异性合格后，进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，细胞分泌获得单克隆抗体。

多克隆抗体制备方法是将动物换成兔子，直接采集血清即可。

实施例6抗体纯化

采用辛酸-硫酸铵法或者Protein G/A进行。辛酸-硫酸铵法是常规方法，每毫升兔血清中加入75μL辛酸，每毫升小鼠腹水中加入33μL；Protein G/A按照商品说明书进行即可。

实施例7ELISA法检测

在酶标板上，按照1μg/mL的浓度包被人工抗原，人工抗原的载体蛋白和免疫原的载体蛋白不同，譬如人工抗原M-a-3-BSA免疫动物，则检测时包被抗原载体换用OVA；包被条件采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液，37℃孵育3h，洗涤；然后用5％的脱脂奶粉封闭1h，洗涤；加入待检样品和合适浓度的抗体，反应1h，洗涤；然后加入合适浓度的酶标二抗，反应1h，洗涤；加入显色底物，读数，其吸光值大小与浓度成反比。同时用氰脲三酰胺标准品作标准曲线，即可定量检测样品中的氰脲三酰胺。

Claims

1、一种氰脲三酰胺半抗原，其特征在于具有式(I)或式(II)所示结构：

其中，式(I)或式(II)中n＝1～6。

2、一种权利要求1所述氰脲三酰胺半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3、根据权利要求2所述氰脲三酰胺半抗原的制备方法，其特征在于步骤(1)所述2，4-二氨基-6-氯-1，3，5-三嗪和氨基酸或含巯基的羧酸物质的物质的量比为6∶1～1∶1；所述反应溶剂为四氢呋喃、乙醇、丙酮或吡啶中的任意一种；所述缚酸剂为三乙胺或氢氧化钾，用量为氨基酸物质的量的2～3倍；步骤(2)所述有机溶剂为正己烷、二氯甲烷或石油醚的任意一种；所述酸化采用醋酸或盐酸。

4、一种氰脲三酰胺人工抗原，其特征在于具有式(III)或式(IV)所示结构：

其中，式(III)或式(IV)中n＝1～6。

5、一种权利要求4所述氰脲三酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于是将氰脲三酰胺半抗原与载体物质偶联获得，包括以下步骤：

(1)将半抗原溶解于二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3.5～5h，离心除去沉淀得上清；

6、一种权利要求4所述氰脲三酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将半抗原溶于二甲基甲酰胺或二氧六环中，加入氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应0.5～2h，得甲液；

(3)将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃搅拌反应过夜，反应液用0.85％的生理盐水透析3天得抗原。

7、根据权利要求5或6所述氰脲三酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于所述载体蛋白可为BSA、KLH、CONA、THY、OVA或BTG。

8、一种氰脲三酰胺抗体的制备方法，其特征在于采用氰脲三酰胺抗原免疫动物，采集血清获得多克隆抗体；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，细胞分泌获得单克隆抗体。

9、根据权利要求8所述的氰脲三酰胺抗体，其特征在于所述抗体用辛酸-硫酸铵法或Protein G/A亲和纯化得到。

10、一种权利要求8所述氰脲三酰胺抗体的应用，其特征在于所述抗体可应用于食品、饲料、水、包装材料或环境中的氰脲三酰胺残留检测。