CN102798711B - 荧光增白剂vbl检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光增白剂VBL检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板，浓度为1-3μg/mL的荧光增白剂VBL特异性抗体，且所述荧光增白剂VBL特异性抗原与荧光增白剂VBL特异性抗体溶液的用量比为1：1。本发明还公开了一种荧光增白剂VBL检测试剂盒制备方法。本发明的试剂盒在检测荧光增白剂VBL时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的荧光增白剂VBL。

Description

荧光增白剂VBL检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于荧光增白剂VBL含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

荧光增白剂VBL（C.I.荧光增白剂85），化学名称为4,4'-双[(4-羟乙胺基-6-苯胺基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸钠，属二苯乙烯三嗪型增白剂，荧光强度为100%±5%，色光为青光微紫，易溶于水，中性，具有优良的匀染性和渗染性，能提高物质的白度和光泽，广泛用于纸张、塑料制品、洗涤剂、纺织品等。

长期以来，荧光增白剂的安全性颇受争议，有资料显示荧光增白剂是低毒的，也有资料显示荧光增白剂的分子结构稳定，不易被分解，在生物体内长期累积，会使细胞发生变异，产生潜在的致癌因素。因此，在未充分评估荧光增白剂的安全性的情况下，并不是所有荧光增白剂都被允许使用，欧盟、美国、日本、中国等许多国家对荧光增白剂都有一定的监管，相关法规如欧盟2002/72/EC指令、美国联邦法规21CFR178.3297和GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》都制定了允许用于生产塑料食品接触材料和制品的添加剂清单，对允许使用的荧光增白剂的最大添加量进行限制。鉴于此，建立相关产品的荧光增白剂的快速检测方法，开展定期监测和安全性评估，对于规范行业发展，保证产品质量，保护消费者身体健康和保护环境等具有深远的意义。而荧光增白剂VBL做为允许添加的荧光增白剂中的一种，也亟需一种合适的快速检测方法。

目前，国内外对荧光增白剂的检测方法包括以下几种：紫外灯直接照射观测法、色谱法、色谱质谱联用法。其中，紫外灯直接照射观测法只是一种简单的判断，不能鉴别荧光增白剂的种类；色谱法和色谱质谱联用法具有特异性高、结果准确的优点，但是这两种方法的缺点是样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且需要昂贵的实验室设备，检测成本高。

发明内容

基于此，本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种荧光增白剂VBL检测试剂盒和一种荧光增白剂VBL检测试剂盒制备方法，该试剂盒在检测荧光增白剂VBL时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。

本发明的第一个目的在于提供一种荧光增白剂VBL检测试剂盒，其技术方案如下：一种荧光增白剂VBL检测试剂盒，主要包括：

1）包被荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂VBL特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2）荧光增白剂VBL特异性抗体溶液：该荧光增白剂VBL特异性抗体的浓度为1-3μg/mL；

所述荧光增白剂VBL特异性抗原与荧光增白剂VBL特异性抗体溶液的用量比为1：1。

在其中一个实施例中，所述荧光增白剂VBL检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度浓度按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

在其中一个实施例中，所述荧光增白剂VBL特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述荧光增白剂VBL特异性抗体的浓度为2μg/mL。

在其中一个实施例中，所述荧光增白剂VBL检测试剂盒还包括荧光增白剂VBL标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

在其中一个实施例中，所述特异性荧光增白剂VBL特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述荧光增白剂VBL特异性抗原为荧光增白剂VBL与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述荧光增白剂VBL标准品溶液浓度分别为1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、1×10⁰μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。

本发明的第二个目的在于提供一种荧光增白剂VBL检测试剂盒制备方法，主要包括以下步骤：

1）制备包被荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板：将荧光增白剂VBL和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，加入甲磺酰氯作为活化试剂进行反应，使荧光增白剂VBL的醇羟基转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化对荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入液氨反应，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原；将荧光增白剂VBL特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂VBL特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2）制备荧光增白剂VBL特异性抗体：以步骤1中合成的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂VBL单克隆抗体；所述荧光增白剂VBL特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。

在其中一个实施例中，上述步骤1）中，制备荧光增白剂VBL特异性抗原的方法优选为：将荧光增白剂VBL0.87g,和三乙胺1.01g分散于100mL干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入0.5mL甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌反应，使荧光增白剂VBL的醇羟基转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化对荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌反应，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原。

在其中一个实施例中，上述步骤2）为：以步骤1中合成的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.4mg/mL，剂量为120μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5~10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂VBL特异性抗原溶液腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价，取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7~10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂VBL单克隆抗体。

本发明的荧光增白剂VBL检测原理为：

将荧光增白剂VBL抗原吸附于固相载体上，加入样品或荧光增白剂VBL的标准溶液及荧光增白剂VBL抗体工作液，待测样品中荧光增白剂VBL和固相载体上包被的荧光增白剂VBL抗原竞争结合荧光增白剂VBL抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中荧光增白剂VBL的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出荧光增白剂VBL浓度范围。

下面对前述技术方案的优点进行说明：

本发明的荧光增白剂VBL检测试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测荧光增白剂VBL，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的荧光增白剂VBL。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。

实施例1

本实施例所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒的主要组成成份如下：

1）荧光增白剂VBL特异性抗原工作液；

通过以下方法制得：将荧光增白剂VBL0.87g,即1.0mmol和三乙胺1.01g,即10mmol分散于100mL干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入0.5L，即6.46mmol甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌反应3.5h，荧光增白剂VBL的醇羟基可转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化对荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌反应5h，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。

2）荧光增白剂VBL特异性抗体工作液；

通过以下方法制得：将合成得到的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原的磷酸盐缓冲溶液（0.01M，pH7.4）乳化，抗原浓度为0.4mg/mL，剂量为120μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原的磷酸盐缓冲溶液（0.01M，pH7.4）乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5~10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂VBL特异性抗原的磷酸盐缓冲溶液（0.01M，pH7.4）腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的制备与纯化：Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞7~10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4℃冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法：每1份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液（浓度0.05mol/L,pH4.0），用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH值至4.5，在4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40μL/mL；在4℃静止3h，离心（10140r/min,30min），取上清液，保持在4℃环境中，30min内加入（NH₄)₂SO₄使其终浓度为0.277g/mL，静止1h，4℃离心（10140r/min，30min），弃上清液，得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。

3）辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

4）荧光增白剂VBL标准品溶液6瓶；

浓度分别为：1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、1×10⁰μg/L；

5）酶标板；

96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；

6）底物显色剂；

由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；

7）洗涤液；

为含有重量比为0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；

8）终止液；

为2mol/L的硫酸溶液；

9）封闭液；

为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；

10）浓缩样品稀释液；

为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（即磷酸根浓度为0.01M/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液）；

11）自封袋；

由商业公司提供。

实施例2

间接竞争ELISA方法的建立。

采用间接竞争ELISA法检测荧光增白剂85单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下：

1）用2μg/mL的荧光增白剂VBL特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用300μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；

2）加入荧光增白剂VBL标准品溶液（浓度分别为：1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、1×10⁰μg/L）或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的荧光增白剂VBL特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；

3）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；100μL/孔，37℃温育1h；

4）洗涤拍干，每孔加入50μL显色液B液、10μL显色液A液显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5mi n内读完数据），测定OD值。

以抑制率I%为纵坐标，以荧光增白剂VBL浓度的对数1g[荧光增白剂VBL(ng/mL)]为横坐标，绘制荧光增白剂VBL竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中荧光增白剂VBL的实际含量。

抑制率计算公式如下：

$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——（样本溶液的平均吸光度值）

B_O——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）

B_N——（参比空白对照平均吸光度值）

实施例3

试剂盒灵敏度、特异性、准确度。

1.灵敏度测定。

利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立荧光增白剂VBL检测的标准工作曲线。荧光增白剂VBL单克隆抗体在1μg/L～1×10⁵μg/L范围内有良好的线性，IC₅₀=857.9ng/mL，最低检测限为0.324ng/mL，检测范围（抑制20%～80%之间）为2.817ng/mL～1212.182μg/mL。纸和塑料制品的检测限为0.162ng/mm²，食品样品的检测限为0.162ng/g，日化产品的检测限为30ng/g。

2.特异性测定。

采用实施例2的间接竞争ELISA法测定荧光增白剂VBL结构类似物2-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪、2-苯胺基-1,3,5-三嗪、2-氨基-4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪、二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐、2-（3'-磺酸基）苯氨基-4-苯胺基-1,3,5-三嗪）与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度（1×10⁷μg/L、1×10⁶μg/L、1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L）的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例3，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对荧光增白剂VBL的IC₅₀值与单克隆抗体对各类似物的IC₅₀值的比值得到交叉反应率（CR%），公式如下：

结果表明荧光增白剂VBL单克隆抗体与2-（3'磺酸基）苯氨基-4-苯胺基-1,3,5-三嗪的交叉反应率为4.5%，与2-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪、2-苯胺基-1,3,5-三嗪、2-氨基-4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪、二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐的交叉反应率均检测不到具体数值，为少于0.02%。

3.准确度测定。

向空白纸制品、塑料制品和食品样品中添加0.1μg/mL和10μg/mL的荧光增白剂VBL，日用产品样品中添加100μg/mL和1000μg/mL的荧光增白剂VBL，重复三次，每次做三个平行，采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率，然后将抑制率（三个平行的平均值）代入标准曲线回归方程，算出含量，并计算回收率。

回收率公式如下：

结果表明纸制品的回收率为89.2%～101.4%，塑料制品的回收率为93.4%～103.7%，食品的回收率为84.6%～97.5%，日用产品的回收率为89.3%～98.6%。

实施例4

检测纸制品中的荧光增白剂VBL的迁移。

1.样品的前处理。

将纸制品测得面积后，按每平方厘米2mL的量注入蒸馏水，或采用全部浸泡的方法，其面积以纸制品的二面计算，在室温（>20℃）浸泡2h后，取50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂VBL的残留。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂VBL的含量，见下表1。

表1纸制品中荧光增白剂VBL的迁移量。

实施例5

检测塑料制品中荧光增白剂VBL的迁移。

1.样品的前处理。

1.1空心制品。

按测得的样品体积准确量取蒸馏水加入空心制品中，在室温（>20℃）浸泡2h。大于1.1L的塑料容器也可裁成试片进行测定。可盛放溶剂的塑料薄膜袋应浸泡无文字图案的内壁部分，可将袋口张开置于适当大小的烧杯中，加入适量蒸馏水依法浸泡。复合食品包装袋则按每平方厘米2mL计，注入蒸馏水依上法浸泡。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。

1.2扁平制品。

扁平制品测得其面积后，按每平方厘米2mL的量注入蒸馏水依法浸泡。或可采用全部浸泡的方法，其面积应以二面计算。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。

1.3板材、薄膜、和试片。

同上述扁平制品的前处理方法。

1.4橡胶制品。

橡胶制品按接触面积每平方厘米加2mL蒸馏水，无法计算接触面积的，按每克样品加20mL蒸馏水。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。

1.5滴塑垫片。

能整片剥落的按每平方厘米2mL加蒸馏水。不能整片剥落的取边缘较厚的部分剪成宽0.3～0.5cm，长1.5～2.5cm的条状，称重。按每克样品加60mL蒸馏水。在室温（>20℃）浸泡2h，取50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂VBL的残留。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂VBL的含量，见下表2。

表2塑料制品中荧光增白剂VBL的迁移量。

实施例6

检测食品中荧光增白剂VBL。

1.样品的前处理。

用均质器将样品均质，称取10g（精确至0.01g）样品加入适量的超纯水中，超纯水量以完全浸泡样品为准，用超声波萃取15min后，以10 000r/min离心10min，用滤纸过滤，将过滤后的样液过经10mL甲醇和10mL去离子水活化的strata-X-AW（3mL，60mg）固相萃取柱，控制流速不大于1mL/min，然后分别用3mL去离子水和3mL甲醇淋洗，最后用6mL2%氨水甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液在50℃水浴中氮吹至近干后，加入2mL超纯水溶解，取50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂VBL的残留。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂VBL的含量，见下表3。

表3食品中荧光增白剂VBL的含量。

实施例7

检测日化产品中荧光增白剂VBL。

1.样品的前处理。

称取混匀后的样品（洗涤剂或化妆品）2g（精确至0.01g）样品于500mL容量瓶中，加入约100mL超纯水后，超声波溶解，定容（定容前可加入少量甲醇消除产生的泡沫），取过滤后的样液5mL过经10mL甲醇和10mL去离子水活化的strata-X-AW（3mL，60mg）固相萃取柱，控制流速不大于1mL/min，然后分别用3mL去离子水和3mL甲醇淋洗，最后用6mL2%氨水甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液在50℃水浴中氮吹至近干后，加入2mL超纯水溶解，取50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂VBL的残留。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂VBL的含量，见下表4。

表4日化产品中荧光增白剂VBL的含量。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种荧光增白剂VBL检测试剂盒，其特征在于，主要包括：

1)包被荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂VBL特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2)荧光增白剂VBL特异性抗体溶液：该荧光增白剂VBL特异性抗体的浓度为1-3μg/mL；

所述荧光增白剂VBL特异性抗原与荧光增白剂VBL特异性抗体溶液的用量比为1：1；

所述包被荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板由以下方法制得：将荧光增白剂VBL和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，加入甲磺酰氯作为活化试剂进行反应，使荧光增白剂VBL的醇羟基转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化的荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入液氨反应，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原；将荧光增白剂VBL特异性抗原包被于酶标板中，即得；

所述荧光增白剂VBL特异性抗体由以下方法制得：以上述合成的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂VBL单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

3.根据权利要求1或2所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒，其特征在于，所述荧光增白剂VBL特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述荧光增白剂VBL特异性抗体的浓度为2μg/mL。

4.根据权利要求1所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒，其特征在于，还包括荧光增白剂VBL标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

5.根据权利要求4所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒，其特征在于，所述荧光增白剂VBL特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述荧光增白剂VBL特异性抗原为荧光增白剂VBL与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；所述荧光增白剂VBL标准品溶液浓度分别为1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、1×10⁰μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5％脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。

6.一种荧光增白剂VBL检测试剂盒制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)制备包被荧光增白剂VBL特异性抗原的酶标板：将荧光增白剂VBL和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中，加入甲磺酰氯作为活化试剂进行反应，使荧光增白剂VBL的醇羟基转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化的荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入液氨反应，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原；将荧光增白剂VBL特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂VBL特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2)制备荧光增白剂VBL特异性抗体：以步骤1)中合成的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂VBL单克隆抗体；所述荧光增白剂VBL特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。

7.根据权利要求6所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备荧光增白剂VBL特异性抗原的具体方法为：将荧光增白剂VBL0.87g,和三乙胺1.01g分散于100mL干燥二氯甲烷中，零摄氏度下加入0.5mL甲磺酰氯作为活化试剂，室温搅拌反应，使荧光增白剂VBL的醇羟基转化成甲磺酯基；随后将甲磺酯化的荧光增白剂VBL加入无水乙醇中，加入20倍量的液氨，回流搅拌反应，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂VBL的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到荧光增白剂VBL特异性抗原。

8.根据权利要求6所述的荧光增白剂VBL检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤2)为：

以步骤1)中合成的荧光增白剂VBL特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.4mg/mL，剂量为120μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂VBL特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5～10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂VBL特异性抗原溶液腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价，取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/c小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7～10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂VBL单克隆抗体。