CN102798713B - 食品红10检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品红10检测试剂盒,属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL食品红10特异性抗原的酶标板,浓度为1-3μg/mL的食品红10特异性抗体,且所述食品红10特异性抗原与食品红10特异性抗体溶液的用量比为1:1。本发明还公开了一种食品红10检测试剂盒制备方法。本发明的试剂盒在检测食品红10时可一次连续检测多个样品,具有便捷,快速,灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的食品红10。
Description
技术领域
本发明涉及一种添加剂检测技术,具体来说,特别是涉及一种用于食品红10含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
食品红10,又名酸性红1或红2G,化学名称为8-乙酰氨基-2-苯偶氮基-1-萘酚基-3,6-二磺酸二钠盐,属偶氮类着色剂,易溶于水,具有优良的匀染性和渗染性,用作工业染色剂。英国常用于海鲜酱、腊肠、年糕、辣酱、红醋、牛肉干等食品的着色,2007年欧洲食品安全局相关研究机构对食品红10色素重新进行了安全评估,发现该色素在肠内能够转化为苯胺,后者为具有遗传毒性,借此推断食品红10色素具有潜在的致癌作用,因而撤消了日容许摄入量,禁止在食品中使用,我国、美国、加拿大、日本、澳大利亚等多国都明确禁止食品中使用食品红10;而且,随着化妆品中着色剂导致的皮肤病急剧增加,很多国家如美国、欧盟、日本等均对化妆品中着色剂的种类、使用范围和用量有严格的规定,我国《化妆品卫生规范》(2007版)规定食品红10为限用着色剂。因此,快速检测食品红10在食品和化妆品中的含量是非常必要的。
发明内容
基于此,本发明提供一种食品红10检测试剂盒和一种食品红10试剂盒制备方法,该试剂盒在检测食品红10时可一次连续检测多个样品,具有便捷,快速,灵敏、成本低的特点。
本发明的第一个目的在于提供一种食品红10检测试剂盒,其技术方案如下:一种食品红10检测试剂盒,主要包括:
1)包被食品红10特异性抗原的酶标板:所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3μg/mL;
2)食品红10特异性抗体溶液:该食品红10特异性抗体的浓度为1-3μg/mL;
所述食品红10特异性抗原与食品红10特异性抗体溶液的用量比为1:1。
在其中一个实施例中,所述食品红10检测试剂盒还包括有酶标二抗,所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。
在其中一个实施例中,所述食品红10特异性抗原的浓度为2μg/mL;所述食品红10特异性抗体的浓度为2μg/mL。
在其中一个实施例中,所述食品红10检测试剂盒还包括食品红10标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。
在其中一个实施例中,所述特异性食品红10特异性抗体是鼠源单克隆抗体;所述食品红10特异性抗原为食品红10与载体蛋白的偶联物;所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种;所述食品红10标准品溶液浓度分别为1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L、1×100μg/L;所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成,所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲,所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺;所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液;所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述浓缩样品稀释液为0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。
本发明的第二个目的在于提供一种食品红10检测试剂盒制备方法,主要包括以下步骤:
1)制备包被食品红10特异性抗原的酶标板:将食品红10和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中,零摄氏度下加入甲磺酰氯作为活化试剂,室温搅拌,食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基;随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中,加入液氨,回流搅拌h,制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合,再与牛血清白蛋白混合,室温搅拌,偶联制备得到食品红10特异性抗原;将食品红10特异性抗原包被于酶标板中,所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3μg/mL;
2)制备食品红10特异性抗体:以步骤1)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫;免疫后,取血清效价高的小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合;采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株;并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠,将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中,收集腹水,经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化,得到纯化的食品红10单克隆抗体;所述食品红10特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。
在其中一个实施例中,上述步骤1)中,制备食品红10特异性抗原的方法优选为:将0.87g食品红10和1.01g三乙胺分散于100mL干燥二氯甲烷中,零摄氏度下加入0.5mL甲磺酰氯作为活化试剂,室温搅拌3.5h,食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基;随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中,加入20倍量的液氨,回流搅拌5h,制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合,再与牛血清白蛋白混合,室温搅拌1h,偶联制备得到食品红10特异性抗原。
在其中一个实施例中,上述步骤2)为:以步骤1)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化,抗原浓度为0.4mg/mL,剂量为120μg/只,以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化,剂量同初次免疫。初次免疫两周后,每间隔10天加强免疫一次,共免疫5-10次,当抗体效价不再升高时,进行最后一次免疫,最后一次不加免疫佐剂直接用食品红10特异性抗原水溶液腹腔注射,剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠,在无菌条件下,取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株;并取Balb/C小鼠,于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏,剂量为0.5mL/只;将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中,剂量为0.5mL/只;接种杂交瘤细胞7~10天后,收集腹水,反复收集数次;存于4℃冰箱保存;经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化,得到纯化的食品红10单克隆抗体。
本发明的食品红10检测原理为:
将食品红10特异性抗原吸附于固相载体上,加入样品或食品红10的标准溶液及食品红10特异性抗体工作液,待测样品中食品红10和固相载体上包被的食品红10特异性抗原竞争结合食品红10特异性抗体,孵育后,加入酶标二抗进行酶活性的放大作用,孵育,显色后终止,测定样品的吸光度,该值与样品中食品红10的量呈负相关,与标准曲线比较即可得出食品红10浓度范围。
下面对前述技术方案的优点进行说明:
本发明的食品红10检测试剂盒,利用竞争酶联免疫测定法检测食品红10,具有特异性高,结果准确且前处理简单,对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时,本试剂盒中的试剂以工作液形式提供,操作简单、快捷,为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的食品红10。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细说明,但不对本发明的内容造成任何限制。实施例1
本实施例所述的食品红10检测试剂盒的主要组成成份如下:
1)食品红10特异性抗原工作液;
通过以下方法制得:将0.87g,即1.0mmol食品红10和1.01g,即10mmol三乙胺分散于100mL干燥二氯甲烷中,零摄氏度下加入0.5mL,即6.46mmol甲磺酰氯作为活化试剂,室温搅拌3.5h,食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基;随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中,加入20倍量的液氨,回流搅拌5h,制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合,再与牛血清白蛋白混合,室温搅拌1h,偶联制备得到食品红10特异性抗原,并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。
2)食品红10特异性抗体工作液;
通过以下方法制得:将合成得到的食品红10特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化,抗原浓度为0.4mg/mL,剂量为120μg/只,以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化,剂量同初次免疫。初次免疫两周后,每间隔10天加强免疫一次,共免疫5-10次,当抗体效价不再升高时,进行最后一次免疫,最后一次不加免疫佐剂直接用食品红10特异性抗原的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液腹腔注射,剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠,在无菌条件下,取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
单克隆抗体的制备与纯化:Balb/C小鼠,于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏,剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中,剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞7~10天后,收集腹水,反复收集数次。存于4℃冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法:每1份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液(浓度0.05mol/L,pH4.0),用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH值至4.5,在4℃下搅拌30min,期间缓慢加入辛酸,按稀释前腹水体积计算40μL/mL;在4℃静止3h,离心(10140r/min,30min),取上清液,保持在4℃环境中,30min内加入(NH4)2SO4使其终浓度为0.277g/mL,静止1h,4℃离心(10140r/min,30min),弃上清液,得到单克隆抗体沉淀,并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。
3)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗;
由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗;
4)食品红10标准品溶液6瓶;
浓度分别为:1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L、1×100μg/L;
5)酶标板;
96孔聚苯乙烯酶标板,由商业公司提供;
6)底物显色剂;
由显色剂A和显色剂B组成,显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液,显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液;
7)洗涤液;
为含有重量比为0.05%-0.5%吐温-20的0.01M,pH为7.4的磷酸盐缓冲液;
8)终止液;
为2mol/L的硫酸溶液;
9)封闭液;
为含5%脱脂奶粉的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;
10)浓缩样品稀释液;
为0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液(即磷酸根浓度为0.01M/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液);
11)自封袋;
由商业公司提供。
实施例2
间接竞争ELISA方法的建立。
采用间接竞争ELISA法检测食品红10单克隆抗体的竞争抑制率,方法如下:
1)用2μg/mL的食品红10特异性抗原包被96孔酶标板,100μL/孔,放置于4℃冰箱包被过夜,用250μL/孔封闭液(即5%脱脂奶粉)封闭后用洗涤液洗涤,并拍干;
2)加入食品红10标准品溶液(浓度分别为:1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L、1×100μg/L)或样品溶液50μL,再加入浓度为2μg/mL的食品红10特异性抗体工作液50μL,混合均匀,37℃温育1h;
3)洗涤拍干后,加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液,100μL/孔,37℃温育1h;
4)洗涤拍干,每孔加入50μL显色液B液、10μL显色液A液显色15min,加入浓度为2mol/L的硫酸溶液,50μL/孔,终止反应,设定酶标仪于450nm处(优选用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据),测定OD值。
以抑制率I%为纵坐标,以食品红10浓度的对数1g[食品红10(ng/mL)]为横坐标,绘制食品红10竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中食品红10的实际含量。
抑制率计算公式如下:
其中:I——抑制率
B——(样本溶液的平均吸光度值)
B0——(0μg/L标准溶液的平均吸光度值)
BN——(参比空白对照平均吸光度值)
实施例3
试剂盒灵敏度、特异性、准确度。
1.灵敏度测定。
利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立食品红10检测的标准工作曲线。食品红10单克隆抗体在1μg/L~1×105μg/L范围内有良好的线性,IC50=951.4ng/mL,最低检测限为0.428ng/mL,检测范围(抑制20%~80%之间)为1.859ng/mL~1000.28μg/mL。食品的检测限为0.214ng/g,化妆品的检测限为20ng/g。
2.特异性测定。
采用实施例2的间接竞争ELISA法测定食品红10结构类似物(1-乙酰氨基萘、2-苯偶氮萘、4-(乙酰基氨基)-2-萘二磺酸钠盐、1-(乙酰基氨基)-7-(苯基偶氮)萘、4-(乙酰基氨基)-6-(苯基偶氮)-2-萘磺酸钠盐)与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度(1×107μg/L、1×106μg/L、1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L)的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中,具体步骤同实施例2,分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对食品红10的IC50值与单克隆抗体对各类似物的IC50值的比值得到交叉反应率(CR%),公式如下:
结果表明食品红10单克隆抗体与食品红10结构类似物(1-乙酰氨基萘、2-苯偶氮萘、4-(乙酰基氨基)-2-萘二磺酸钠盐、1-(乙酰基氨基)-7-(苯基偶氮)萘、4-(乙酰基氨基)-6-(苯基偶氮)-2-萘磺酸钠盐)的交叉反应率均测不到具体数值,少于0.02%。
3.准确度测定。
向化妆品和食品样品中添加0.1μg/mL和10μg/mL,的食品红10,重复三次,每次做三个平行,采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率,然后将抑制率(三个平行的平均值)代入标准曲线回归方程,算出含量,并计算回收率。
回收率公式如下:
结果表明化妆品的回收率为91.6%~103.1%,食品的回收率为86.3%~98.7%。
实施例4
检测食品中的食品红10。
1.样品的前处理。
汽水饮料及配置酒类取20.0g,加热驱除二氧化碳或乙醇;固体样品粉碎后取样品10.0g加30mL水温热溶解;试样溶液用0.2g/mL柠檬酸溶液调pH值到6,水浴加热至60℃。将1g聚酰胺粉加入少许水调成粥状,加入到试样溶液中,搅拌均匀,以G3漏斗抽滤,用pH4的水洗3次,然后用甲醇-甲酸(体积比为3:2)混合溶液洗涤3~5次,再用水洗至中性,用30mL乙醇-氨水-水(体积比为7:2:1)混合溶液分3~5次解吸,收集解吸液,加乙酸中和,蒸发至近干,用水定容至5mL,取50μL进行分析。
2.间接竞争ELISA法检测样品中食品红10含量。
采用实施例2的方法进行检测,根据测定结果,计算出抑制率,代入标准曲线方程求出食品红10的含量,见下表1。
表1食品中食品红10的含量。
实施例5
检测化妆品中食品红10。
1.样品的前处理。
1.1粉状类化妆品(眼影等)样品。
准确称取0.2g(精确至0.001g)样品于10mL具塞比色管中,加入1mL甲醇,超声20s,然后加水定容至10mL,于漩涡振荡器上振荡2min,70℃超声提取20min。取部分溶液于2mL塑料离心管中,15000r/min离心5min,取上清液50μL进行分析。
1.2膏、霜类(唇膏、唇彩等)样品。
准确称取0.2g(精确至0.001g)样品于10mL具塞比色管中,加入2mL三氯甲烷,漩涡振荡10s,超声至试样完全分散,再加入10mL水,漩涡振荡2min,超声提取30min。取部分上层溶液于2mL塑料离心管中,15000r/min离心5min,取上清液50μL进行分析。
2.间接竞争ELISA法检测样品中食品红10的含量。
采用实施例2的方法进行检测,根据测定结果,计算出抑制率,代入标准曲线方程求出食品红10的含量,见下表2。
表2化妆品中食品红10的含量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种食品红10检测试剂盒,其特征在于,主要包括:
1)包被食品红10特异性抗原的酶标板:所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3μg/mL;
2)食品红10特异性抗体溶液:该食品红10特异性抗体的浓度为1-3μg/mL;
所述食品红10特异性抗原与食品红10特异性抗体溶液的用量比为1:1;
所述包被食品红10特异性抗原的酶标板通过以下方法制备:将食品红10和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中,零摄氏度下加入甲磺酰氯作为活化试剂,室温搅拌,食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基;随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中,加入液氨,回流搅拌h,制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合,再与牛血清白蛋白混合,室温搅拌,偶联制备得到食品红10特异性抗原;将食品红10特异性抗原包被于酶标板中,即得;
所述食品红10特异性抗体通过以下方法制备:以上述合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫;免疫后,取血清效价高的小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合;采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株;并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠,将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中,收集腹水,经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化,得到纯化的食品红10单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的食品红10检测试剂盒,其特征在于,还包括有酶标二抗,所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。
3.根据权利要求1或2所述的食品红10检测试剂盒,其特征在于,所述食品红10特异性抗原的浓度为2μg/mL;所述食品红10特异性抗体的浓度为2μg/mL。
4.根据权利要求1所述的食品红10检测试剂盒,其特征在于,还包括食品红10标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。
5.根据权利要求4所述的食品红10检测试剂盒,其特征在于,所述食品红10特异性抗体是鼠源单克隆抗体;所述食品红10特异性抗原为食品红10与载体蛋白的偶联物;所述载体蛋白为牛血清白蛋白;所述食品红10标准品溶液浓度分别为1×105μg/L、1×104μg/L、1×103μg/L、1×102μg/L、1×101μg/L、1×100μg/L;所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成,所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲,所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺;所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液;所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述浓缩样品稀释液为0.01M,pH7.4的磷酸盐缓冲液;所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。
6.一种食品红10检测试剂盒制备方法,其特征在于,主要包括以下步骤:
1)制备包被食品红10特异性抗原的酶标板:将食品红10和三乙胺分散于干燥二氯甲烷中,零摄氏度下加入甲磺酰氯作为活化试剂,室温搅拌,食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基;随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中,加入液氨,回流搅拌h,制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合,再与牛血清白蛋白混合,室温搅拌,偶联制备得到食品红10特异性抗原;将食品红10特异性抗原包被于酶标板中,所述酶标板的每个微孔内食品红10特异性抗原的浓度为1-3μg/mL;
2)制备食品红10特异性抗体:以步骤1)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫;免疫后,取血清效价高的小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合;采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株;并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠,将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中,收集腹水,经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化,得到纯化的食品红10单克隆抗体;所述食品红10特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。
7.根据权利要求6所述的食品红10检测试剂盒制备方法,其特征在于,步骤1)中,制备食品红10特异性抗原的具体方法为:将0.87g食品红10和1.01g三乙胺分散于100mL干燥二氯甲烷中,零摄氏度下加入0.5mL甲磺酰氯作为活化试剂,室温搅拌3.5h,食品红10的醇羟基可转化成甲磺酯基;随后将甲磺酯化食品红10加入无水乙醇中,加入20倍量的液氨,回流搅拌5h,制得能够与蛋白质偶联的食品红10的半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合,再与牛血清白蛋白混合,室温搅拌1h,偶联制备得到食品红10特异性抗原。
8.根据权利要求6所述的食品红10检测试剂盒制备方法,其特征在于,步骤2)为:以步骤1)中合成的食品红10特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫;首次免疫使用完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化,抗原浓度为0.4mg/mL,剂量为120μg/只,以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与食品红10特异性抗原溶液乳化,剂量同初次免疫;初次免疫两周后,每间隔10天加强免疫一次,共免疫5-10次,当抗体效价不再升高时,进行最后一次免疫,最后一次不加免疫佐剂直接用食品红10特异性抗原水溶液腹腔注射,剂量同初次免疫;尾部取血检测血清效价;取血清效价高的小鼠,在无菌条件下,取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合;采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株;并取Balb/c小鼠,于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏,剂量为0.5mL/只;将细胞浓度为1.5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中,剂量为0.5mL/只;接种杂交瘤细胞7~10天后,收集腹水,反复收集数次;存于4℃冰箱保存;经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化,得到纯化的食品红10单克隆抗体。
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