CN103308685B - 壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为0.25-2.5μg/mL壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的酶标板，浓度为0.25-2.5μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液，且所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原与壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的用量为1:1。本发明还公开了一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备和使用方法。本发明的试剂盒在检测壬基酚聚氧乙烯醚时可以快速检测壬基酚聚氧乙烯醚在化妆品和涂料中的含量，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。

Description

壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及一种化工添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于壬基酚聚氧乙烯醚含量检测的酶联免疫试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术

壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol ethoxylate，NPE），是壬基酚的衍生物，烷基酚聚氧乙烯醚类化合物，是广泛使用的非离子表面活性剂，易溶于水和醇，有各种不同的亲水亲油平衡值。壬基酚聚氧乙烯醚具有有良好的渗透能力、乳化能力，能抗酸、抗碱、抗硬水、抗还原、抗氧化等性能，在洗涤剂、印染、化工有广泛的用途。壬基酚聚氧乙烯醚在自然环境中会分解成壬基酚。壬基酚是一种公认的环境激素，它能模拟雌激素，对生物的性发育产生影响，并且干扰生物的内分泌，对生殖系统具有毒性。美国、加拿大、日本、澳大利亚等多国都明确禁止化妆品中使用壬基酚聚氧乙烯醚，我国也鼓励将日化等使用其他化学品替换有毒有害原料（产品）壬基酚聚氧乙烯醚。因此，快速检测壬基酚聚氧乙烯醚在化妆品和涂料中的含量是非常必要的。

发明内容

基于此，本发明提供一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒和一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备和使用方法，可以快速检测壬基酚聚氧乙烯醚在化妆品和涂料中的含量。

本发明的第一个目的在于提供一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，主要包括：

1）包被壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的浓度为0.25-2.5μg/mL；

2）壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液：该壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液的浓度为0.25-2.5μg/mL；

所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原与壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的用量为1:1。

在其中一个实施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

在其中一个实施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的浓度为1μg/mL；所述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的浓度为2μg/mL。

在其中一个实施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒还包括壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

在其中一个实施例中，所述壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液浓度分别为0，0.5，1.5，4.5，10.0，20.0，45.0μg/L；所述底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明的第二个目的在于提供一种上述壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

1）制备壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原

将壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，加入甲磺酰氯和三乙胺，甲磺化反应，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；然后再将该甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于无水乙醇中，加入乙二胺，胺化反应，制得能够与蛋白质偶联的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原;在N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺的催化下，再与载体蛋白偶联，制得壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原；所述的载体蛋白为牛血清蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白或卵清蛋白；

2）包被酶标板

将上述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的浓度为0.25-2.5μg/mL；

3）动物免疫

以步骤1）中合成的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，检测该血清抗壬基酚聚氧乙烯醚的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；

4）细胞融合与筛选

取步骤3）所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体；制备浓度为0.25-2.5μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液。

在其中一个实施例中，上述步骤1）中，制备壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的具体方法为：将0.68g(1mmol)壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，0°C下加入0.11g甲磺酰氯和1.0ml三乙胺，室温搅拌4小时，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；将上述甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于无水乙醇中，加入1ml乙二胺，回流5小时，制得能够与蛋白质偶联的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原;再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原；

上述步骤3）中，动物免疫的具体方法为：以步骤1）中合成的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.25mg/mL，剂量为125μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-8次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫，尾部取血检测血清效价；

上述步骤4）中，细胞融合与筛选的具体方法为：在无菌条件下，取效价和抑制价最高的免疫小鼠，取其脾细胞按10:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.2万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7～10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体。

本发明的第三个目的在于提供一种上述壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的使用方法，主要包括以下步骤：

1）样品前处理

准确称取化妆品或涂料样品，有机溶剂溶解后，用水稀释至样品重量：溶液体积比为1：10⁶，例如：1g样品最终稀释至1000L，0.1g样品最终稀释至100L，定容，超声提取10-30min，得到样品检测液；

2）检测

用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行检测，向包被有壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的酶标板中加入标准品或样品检测液，再加入壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液，温育后洗板，加入酶标二抗工作液进行酶活性的放大，再次洗板，加入显色液、终止液，酶标仪测定OD值；

3）结果分析

以抑制率I%为纵坐标，以壬基酚聚氧乙烯醚浓度的对数lg[壬基酚聚氧乙烯醚(μg/L)]为横坐标，绘制壬基酚聚氧乙烯醚竞争抑制曲线；将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中壬基酚聚氧乙烯醚的实际含量；

所述抑制率计算公式如下：

$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——（样品检测液的平均吸光度值）

B₀——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）

B_N——（参比空白对照平均吸光度值）。

在其中一个实施例中，上述步骤1）中，所述有机溶剂为甲醇或三氯甲烷；

上述步骤2）中，检测的具体方法为：首先用1μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用300μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；然后加入壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；随后洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；最后洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

本发明的壬基酚聚氧乙烯醚检测原理为：

将壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或壬基酚聚氧乙烯醚的标准溶液及壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液，待测样品中壬基酚聚氧乙烯醚和固相载体上包被的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原竞争结合壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中壬基酚聚氧乙烯醚的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出壬基酚聚氧乙烯醚浓度范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒和一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备和使用方法，可以快速检测壬基酚聚氧乙烯醚在化妆品和涂料中的含量，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。

实施例1

本实施例所述的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的主要组成成份如下：

1）壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原工作液；

通过以下方法制得：将0.68g(1mmol)壬基酚聚氧乙烯醚分散于35ml二氯甲烷中，0°C下加入0.11g甲磺酰氯和1.0ml三乙胺，室温搅拌4小时，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；将上述得到中间物分散于无水乙醇中，加入1ml乙二胺，回流5小时，反应产物经柱层析纯化后，制得能够与蛋白质偶联的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备得到壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为1μg/mL。

2）壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗体工作液；

通过以下方法制得：将合成得到的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为0.25mg/mL，剂量为125μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-8次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按10:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的制备与纯化：Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.2万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞7～10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4℃冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法：每1份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液（浓度0.05mol/L,pH4.0），用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH值至4.5，在4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40μL/mL；在4℃静止3h，离心（10140r/min,30min），取上清液，保持在4℃环境中，30min内加入（NH₄)₂SO₄使其终浓度为0.277g/mL，静止1h，4℃离心（10140r/min，30min），弃上清液，得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为1μg/mL。

3）辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

4）壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液7瓶；

浓度分别为：0，0.5，1.5，4.5，10.0，20.0，45.0μg/L；

5）酶标板；

96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；

6）底物显色剂；

由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；

7）洗涤液；

为含有重量比为0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；

8）终止液；

为2mol/L的硫酸溶液；

9）封闭液；

为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；

10）浓缩样品稀释液；

为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（即磷酸根浓度为0.01M/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液）；

11）自封袋；

由商业公司提供。

实施例2

1.最佳抗原包被浓度的选择

1）标准品浓度的筛选

选取市售涂料和化妆品，按照申请号为201210480913.9中的方法检测其中壬基酚聚氧乙烯醚的含量，结果如下表1。

表1市售涂料和化妆品中壬基酚聚氧乙烯醚的含量（%）

样品	涂料1	涂料2	涂料3	涂料4	唇膏	洗发护发剂	剃须膏	洗面奶
									含量%	1.2	0.5	2.3	1.1	0.8	0.9	1.7	0.07

由上述结果可知，市售涂料和化妆品的壬基酚聚氧乙烯醚含量一般为0.07-2.3%之间，将样品稀释10⁶倍后，待测溶液中壬基酚聚氧乙烯醚的浓度为0.7-23μg/L，因此以1.5μg/L的壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液作为最佳抗原包被浓度选择的加入溶液。

2）用1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用300μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；

3）加入1.5μg/L的壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液，再加入浓度为2μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；

4）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；

5）洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

同时设置空白对照孔（不如抗血清，只加其稀释液）和平行重复孔，取OD值为1.0左右时的包被浓度为最佳浓度，试验数据列于表1。

表1不同包被浓度的OD值

由表1的数据中可以确定，最佳的包被浓度为1μg/mL。

2间接ELISA检测抗体效价

以1.0μg/mL浓度包被酶标板，从4000倍开始倍比稀释抗血清，按上述的ELISA步骤操作。以两倍于阴性血清OD值的抗血清OD值对应的抗血清稀释度为抗血清效价。抗血清效价检测结果见表2

表2抗血清效价检测结果

由表2的数据中可以确定，本发明制备的抗血清的效价在64000以上。

3间接竞争ELISA方法的建立

采用间接竞争ELISA法检测壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下：

1）用1μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用300μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；

2）加入壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液（浓度分别为：0，0.5，1.5，4.5，10.0，20.0，45.0μg/L）或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；

3）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；

4）洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

以抑制率I%为纵坐标，以壬基酚聚氧乙烯醚浓度的对数lg[壬基酚聚氧乙烯醚(μg/L)]为横坐标，绘制壬基酚聚氧乙烯醚竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中壬基酚聚氧乙烯醚的实际含量。

抑制率计算公式如下：

$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——（样本溶液的平均吸光度值）

B₀——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）

B_N——（参比空白对照平均吸光度值）

实施例3

试剂盒灵敏度、特异性、准确度实验。

1.灵敏度测定。

利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立壬基酚聚氧乙烯醚检测的标准工作曲线。壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体在0.015μg/L～42μg/L范围内有良好的线性，IC₅₀=8.9μg/L，最低检测限为0.5μg/L，检测范围（抑制20%～80%之间）为2.8μg/L～33.4μg/L。化妆品和涂料的检测限均为0.05%。

2.特异性测定

采用实施例2的间接竞争ELISA法测定壬基酚聚氧乙烯醚结构类似物壬基酚、辛基酚、庚基酚、聚氧乙烯醚与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度（1×10⁷μg/L、1×10⁶μg/L、1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L）的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例2，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对壬基酚聚氧乙烯醚的IC₅₀值与单克隆抗体对各类似物的IC₅₀值的比值得到交叉反应率（CR%），公式如下：

结果表明壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体与壬基酚、辛基酚、庚基酚、聚氧乙烯醚的交叉反应率分别为2.5%，1.8%，1.3%，10.4%，符合要求。

3.准确度测定

向化妆品和涂料样品中添加0.02%和1.00%的壬基酚聚氧乙烯醚，重复三次，每次做三个平行，采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率，然后将抑制率（三个平行的平均值）代入标准曲线回归方程，算出含量，并计算回收率。

回收率公式如下：

结果表明化妆品的回收率为92.4%～102%，涂料的回收率为93.5%～101%。

实施例4

检测涂料中的壬基酚聚氧乙烯醚。

1.样品的前处理。

根据实施例2中检测得到的市售涂料中壬基酚聚氧乙烯醚的含量范围为0.5-2.3%之间，可知将样品稀释10⁶倍后，样品检测液中含有的壬基酚聚氧乙烯醚浓度在实施例1所述试剂盒的检测范围内，有较准确的检测效果。

准确称取0.1g（精确至0.001g）样品于100mL具塞玻璃比色管中，加入2mL甲醇，超声20s，然后加水定容，于漩涡振荡器上振荡2min，超声提取20min。取50μL溶液于50mL玻璃比色管中，加水定容后于漩涡振荡器上振荡2min，取50μL清液进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中壬基酚聚氧乙烯醚含量。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出壬基酚聚氧乙烯醚的含量，见下表3。

表3涂料中的壬基酚聚氧乙烯醚含量。

实施例5

检测化妆品中壬基酚聚氧乙烯醚。

1.样品的前处理。

根据实施例2中检测得到的市售化妆品中壬基酚聚氧乙烯醚的含量范围在0.07-1.7%之间,可知将样品将样品稀释10⁶倍后，样品检测液中含有的壬基酚聚氧乙烯醚浓度在实施例1所述试剂盒的检测范围内，有较准确的检测效果。

1.1粉状类化妆品（眼影等）样品。

准确称取0.1g（精确至0.001g）样品于100mL具塞玻璃比色管中，加入2mL甲醇，超声20s，然后加水定容，于漩涡振荡器上振荡2min，70℃超声提取20min。取50μL溶液于50mL玻璃比色管中，加水定容后于漩涡振荡器上振荡2min，取50μL清液进行分析。

1.2膏、霜类（唇膏、唇彩等）样品。

准确称取0.1g（精确至0.001g）样品于100mL具塞比色管中，加入2mL三氯甲烷，漩涡振荡10s，超声至试样完全分散，再加入50mL水，漩涡振荡2min，超声提取30min。取50μL溶液于50mL玻璃比色管中，加水定容后于漩涡振荡器上振荡2min，取50μL清液进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中壬基酚聚氧乙烯醚的含量。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出壬基酚聚氧乙烯醚的含量，见下表4。

表4化妆品中的壬基酚聚氧乙烯醚含量。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，其特征在于，主要包括：

1)包被壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的浓度为0.25-2.5μg/mL；

2)壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液：该壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液的浓度为0.25-2.5μg/mL；

所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原与壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的用量为1:1；

所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的制备方法为：将壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，加入甲磺酰氯和三乙胺，甲磺化反应，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；然后再将该甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于无水乙醇中，加入乙二胺，胺化反应，制得能够与蛋白质偶联的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原；在N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺的催化下，再与载体蛋白偶联，制得壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原；所述的载体蛋白为牛血清蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白或卵清蛋白；

所述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的制备方法为：以上述合成的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，检测该血清抗壬基酚聚氧乙烯醚的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；取所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

3.根据权利要求1所述的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，其特征在于，所述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的浓度为1μg/mL；所述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的浓度为2μg/mL。

4.根据权利要求1所述的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，其特征在于，还包括壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

5.根据权利要求4所述的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒，其特征在于，所述壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，10.0μg/L，20.0μg/L，45.0μg/L；所述底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5％脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。

6.权利要求1-5任一项的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)制备壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原

将壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，加入甲磺酰氯和三乙胺，甲磺化反应，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；然后再将该甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于无水乙醇中，加入乙二胺，胺化反应，制得能够与蛋白质偶联的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原；在N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺的催化下，再与载体蛋白偶联，制得壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原；所述的载体蛋白为牛血清蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白或卵清蛋白；

2)包被酶标板

将上述壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的浓度为0.25-2.5μg/mL；

3)动物免疫

以步骤1)中合成的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，检测该血清抗壬基酚聚氧乙烯醚的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；

4)细胞融合与筛选

取步骤3)所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体；制备浓度为0.25-2.5μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液。

7.根据权利要求6所述的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的具体方法为：将0.68g壬基酚聚氧乙烯醚分散于二氯甲烷中，0℃下加入0.11g甲磺酰氯和1.0ml三乙胺，室温搅拌4小时，得到甲磺壬基酚聚氧乙烯；将上述甲磺壬基酚聚氧乙烯分散于无水乙醇中，加入1ml乙二胺，回流5小时，制得能够与蛋白质偶联的氨基化壬基酚聚氧乙烯醚半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原；

步骤3)中，动物免疫的具体方法为：以步骤1)中合成的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.25mg/mL，剂量为125μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-8次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫，尾部取血检测血清效价；

步骤4)中，细胞融合与筛选的具体方法为：在无菌条件下，取效价和抑制价最高的免疫小鼠，取其脾细胞按10:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.2万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7～10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体。

8.权利要求1-5任一项的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的使用方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)样品前处理

准确称取化妆品或涂料样品，有机溶剂溶解后，用水稀释至样品重量：溶液体积比为1：10⁶，定容，超声提取10-30min，得到样品检测液；

2)检测

用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行检测，向包被有壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原的酶标板中加入标准品或样品检测液，再加入壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液，温育后洗板，加入酶标二抗工作液进行酶活性的放大，再次洗板，加入显色液、终止液，酶标仪测定OD值；

3)结果分析

以抑制率I％为纵坐标，以壬基酚聚氧乙烯醚浓度的对数lg[壬基酚聚氧乙烯醚]为横坐标，绘制壬基酚聚氧乙烯醚竞争抑制曲线；将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中壬基酚聚氧乙烯醚的实际含量；

所述抑制率计算公式如下：

$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

B——样品检测液的平均吸光度值

B₀——0μg/L标准溶液的平均吸光度值

B_N——参比空白对照平均吸光度值。

9.根据权利要求8的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤1)中，所述有机溶剂为甲醇或三氯甲烷；

步骤2)中，检测的具体方法为：首先用1μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用300μL/孔封闭液封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；然后加入壬基酚聚氧乙烯醚标准品溶液或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；随后洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；最后洗涤拍干，每孔加入50μL显色剂B、10μL显色剂A显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处，测定OD值。