CN102798710B - 碱性红g检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性红G检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL碱性红G特异性抗原的酶标板，浓度为1-3μg/mL的碱性红G特异性抗体，且所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1：1。本发明还公开了一种碱性红G检测试剂盒制备方法。本发明的试剂盒在检测碱性红G时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的碱性红G。

Description

碱性红G检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于碱性红G含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

碱性红G，又名罗丹明6G或玫瑰红6G，属酞菁类着色剂，易溶于水和醇，色彩鲜艳，具有优良的匀染性和渗染性，用作工业染色剂。碱性红G为高毒类化学物质，我国、美国、加拿大、日本、澳大利亚等多国都明确禁止食品和化妆品中使用碱性红G。因此，快速检测碱性红G在食品和化妆品中的含量是非常必要的。

发明内容

基于此，本发明提供一种碱性红G检测试剂盒和一种碱性红G试剂盒制备方法，该试剂盒在检测碱性红G时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。

本发明的第一个目的在于提供一种碱性红G检测试剂盒，其技术方案如下：一种碱性红G检测试剂盒，主要包括：

1）包被碱性红G特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2）碱性红G特异性抗体溶液：该碱性红G特异性抗体的浓度为1-3μg/mL；

所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1：1。

在其中一个实施例中，所述碱性红G检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

在其中一个实施例中，所述碱性红G特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述碱性红G特异性抗体的浓度为2μg/mL。

在其中一个实施例中，所述碱性红G检测试剂盒还包括碱性红G标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

在其中一个实施例中，所述特异性碱性红G特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗原为碱性红G与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述碱性红G标准品溶液浓度分别为1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。

本发明的第二个目的在于提供一种碱性红G检测试剂盒制备方法，主要包括以下步骤：

1）制备包被碱性红G特异性抗原的酶标板：将碱性红G分散于0.01mol/L盐酸中，搅拌，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将上述碱性红G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，搅拌，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到碱性红G特异性抗原；将碱性红G特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2）制备碱性红G特异性抗体：以步骤1）中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。

在其中一个实施例中，上述步骤1）中，制备碱性红G特异性抗原的方法优选为：将0.88g碱性红G分散于50mL的0.01mol/L盐酸中，55℃搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将0.82g的上述碱性红G羧酸衍生物、1.2g N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2.1g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65℃搅拌1h，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备得到碱性红G特异性抗原。

在其中一个实施例中，上述步骤2）为：以步骤1）中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.35mg/mL，剂量为110μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用碱性红G特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.4万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7~10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体。

本发明的碱性红G检测原理为：

将碱性红G特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或碱性红G的标准溶液及碱性红G特异性抗体工作液，待测样品中碱性红G和固相载体上包被的碱性红G特异性抗原竞争结合碱性红G特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中碱性红G的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出碱性红G浓度范围。

下面对前述技术方案的优点进行说明：

本发明的碱性红G检测试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测碱性红G，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的碱性红G。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。

实施例1

本实施例所述的碱性红G检测试剂盒的主要组成成份如下：

1）碱性红G特异性抗原工作液；

通过以下方法制得：将0.88g,即2.0mmol碱性红G分散于50mL的0.01mol/L盐酸中，55℃搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将0.82g，即2.0mmol的上述碱性红G羧酸衍生物、1.2g,即5mmol N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2.1g，即4mmol六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65℃搅拌1h，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸（TFA）中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺（NHS）和碳二亚胺（EDC）混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备得到碱性红G特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。

2）碱性红G特异性抗体工作液；

通过以下方法制得：将合成得到的碱性红G特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为0.35mg/mL，剂量为110μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用碱性红G特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的制备与纯化：Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.4万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞7~10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4℃冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法：每1份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液（浓度0.05mol/L,pH4.0），用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH值至4.5，在4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40μL/mL；在4℃静止3h，离心（10140r/min,30min），取上清液，保持在4℃环境中，30min内加入（NH₄)₂SO₄使其终浓度为0.277g/mL，静止1h，4℃离心（10140r/min，30min），弃上清液，得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2μg/mL。

3）辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；

4）碱性红G标准品溶液6瓶；

浓度分别为：1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L；

5）酶标板；

96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；

6）底物显色剂；

由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；

7）洗涤液；

为含有重量比为0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；

8）终止液；

为2mol/L的硫酸溶液；

9）封闭液；

为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；

10）浓缩样品稀释液；

为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（即磷酸根浓度为0.01M/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液）；

11）自封袋；

由商业公司提供。

实施例2

间接竞争ELISA方法的建立。

采用间接竞争ELISA法检测碱性红G单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下：

1）用2μg/mL的碱性红G特异性抗原包被96孔酶标板，100μL/孔，放置于4℃冰箱包被过夜，用300μL/孔封闭液（即5%脱脂奶粉）封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；

2）加入碱性红G标准品溶液（浓度分别为：1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L）或样品溶液50μL，再加入浓度为2μg/mL的碱性红G特异性抗体工作液50μL，混合均匀，37℃温育1h；

3）洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔，37℃温育1h；

4）洗涤拍干，每孔加入50μL显色液B液、10μL显色液A液显色15min，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50μL/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处（优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定OD值。

以抑制率I%为纵坐标，以碱性红G浓度的对数1g[碱性红G(ng/mL)]为横坐标，绘制碱性红G竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中碱性红G的实际含量。

抑制率计算公式如下：

$I=\frac{B-B_N}{B_0-B_N}\×100\%$

其中：I——抑制率

      B——（样本溶液的平均吸光度值）

      B_O——（0μg/L标准溶液的平均吸光度值）

      B_N——（参比空白对照平均吸光度值）

实施例3

试剂盒灵敏度、特异性、准确度。

1.灵敏度测定。

利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立碱性红G检测的标准工作曲线。碱性红G单克隆抗体在0.5μg/L～1×10⁵μg/L范围内有良好的线性，IC₅₀＝1018.5ng/mL，最低检测限为0.501ng/mL，检测范围（抑制20%～80%之间）为2.114ng/mL～1352.147μg/mL。食品的检测限为0.250ng/g，化妆品的检测限为30ng/g。

2.特异性测定

采用实施例2的间接竞争ELISA法测定碱性红G结构类似物双乙酯荧光素、异硫氰酸荧光素、荧光素半乳糖苷、罗丹明B、罗丹明123与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度（1×10⁷μg/L、1×10⁶μg/L、1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L）的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例2，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对碱性红G的IC₅₀值与单克隆抗体对各类似物的IC₅₀值的比值得到交叉反应率（CR%），公式如下：

结果表明碱性红G单克隆抗体与双乙酯荧光素、异硫氰酸荧光素、荧光素半乳糖苷、罗丹明B、罗丹明123的交叉反应率分别为7.5%，6.3%，3.3%，12.4%，15.4%，符合要求。

3.准确度测定

向化妆品和食品样品中添加0.1μg/mL和10μg/mL，的碱性红G，重复三次，每次做三个平行，采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率，然后将抑制率（三个平行的平均值）代入标准曲线回归方程，算出含量，并计算回收率。

回收率公式如下：

结果表明化妆品的回收率为88.6%～98.7%，食品的回收率为86.2%～102.5%。

实施例4

检测食品中的碱性红G。

1.样品的前处理。

汽水饮料及配置酒类取20g，加热驱除二氧化碳或乙醇；固体样品粉碎后取样品10g加30mL水温热溶解；试样用柠檬酸溶液调pH6左右。将1g聚酰胺粉加入少许水调成粥状，放在60℃水浴中，加入到样品中，搅拌均匀，以G3漏斗抽滤，加入pH4的水洗三次，然后用甲醇甲酸（体积比为3：2）洗涤三到五次，再用水洗至中性，用30mL乙醇-氨水-水（体积比为7：2：1）解析，收集解析液，加8mL乙酸中和，蒸发至干，用水定容至5mL，取50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中碱性红G含量。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出碱性红G的含量，见下表1。

表1食品中的碱性红G含量。

实施例5

检测化妆品中碱性红G。

1.样品的前处理。

1.1粉状类化妆品（眼影等）样品。

准确称取0.2g（精确至0.001g）样品于10mL具塞比色管中，加入1mL甲醇，超声20s，然后加水定容至10mL，于漩涡振荡器上振荡2min，70℃超声提取20min。取部分溶液于2mL塑料离心管中，15000r/min离心5min，取上清液50μL进行分析。

1.2膏、霜类（唇膏、唇彩等）样品。

准确称取0.2g（精确至0.001g）样品于10mL具塞比色管中，加入2mL三氯甲烷，漩涡振荡10s，超声至试样完全分散，再加入10mL水，漩涡振荡2min，超声提取30min。取部分上层溶液于2mL塑料离心管中，15000r/min离心5min，取上清液50μL进行分析。

2.间接竞争ELISA法检测样品中碱性红G的含量。

采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出碱性红G的含量，见下表2。

表2化妆品中的碱性红G含量。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种碱性红G检测试剂盒，其特征在于，主要包括：

1)包被碱性红G特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2)碱性红G特异性抗体溶液：该碱性红G特异性抗体的浓度为1-3μg/mL；

所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1：1；

所述包被碱性红G特异性抗原的酶标板由以下方法制得：将碱性红G分散于0.01mol/L盐酸中，搅拌，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将上述碱性红G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，搅拌，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到碱性红G特异性抗原；将碱性红G特异性抗原包被于酶标板中，即得；

所述碱性红G特异性抗体由以下方法制得：以上述合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

3.根据权利要求1或2所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，所述碱性红G特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述碱性红G特异性抗体的浓度为2μg/mL。

4.根据权利要求1所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，还包括碱性红G标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

5.根据权利要求4所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，所述碱性红G特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗原为碱性红G与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；所述碱性红G标准品溶液浓度分别为1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5％脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。

6.一种碱性红G检测试剂盒制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)制备包被碱性红G特异性抗原的酶标板：将碱性红G分散于0.01mol/L盐酸中，搅拌，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将上述碱性红G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，搅拌，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到碱性红G特异性抗原；将碱性红G特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2)制备碱性红G特异性抗体：以步骤1)中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。

7.根据权利要求6所述的碱性红G检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备碱性红G特异性抗原的具体方法为：将0.88g碱性红G分散于50mL的0.01mol/L盐酸中，55℃搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将0.82g的上述碱性红G羧酸衍生物、1.2g N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2.1g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65℃搅拌1h，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备得到碱性红G特异性抗原。

8.根据权利要求6所述的碱性红G检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤2)为：以步骤1)中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.35mg/mL，剂量为110μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用碱性红G特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/c小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.4万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7～10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体。