CN103145633B - 新型三聚氰胺抗原和抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型三聚氰胺抗原和抗体及应用，采用双胍与氯乙酸乙酯在甲醇钠条件下合成6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基，再与3-巯基丙酸反应得到半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸，采用活化酯法偶联蛋白得到人工抗原，经动物免疫、取血、分离抗血清、纯化制得三聚氰胺抗体。本合成方法合理，线路简单，半抗原最大限度的与目标物一致。制备的三聚氰胺抗体灵敏度高，完全满足三聚氰胺快速检测的需要。

Description

新型三聚氰胺抗原和抗体及应用

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域；涉及有机合成、免疫化学、生物化学以及物化测试技术等，特别涉及三聚氰胺半抗原、人工抗原、酶标抗原的设计合成和免疫动物、特异性抗体的制备及免疫分析方法的建立，尤其是一种新型三聚氰胺抗原和抗体及应用。

背景技术

三聚氰胺（melamine）是一种在常用的化学原料，与甲醛缩合聚合可制得三聚氰胺树脂，可用于塑料及涂料工业，也可作纺织物防摺、防缩处理剂。三聚氰胺改性树脂可做色泽鲜艳、耐久、硬度好的金属涂料，三聚氰胺还可用于坚固、耐热装饰薄板，防潮纸及灰色皮革鞣皮剂，合成防火层板的粘接剂，防水剂的固定剂或硬化剂等。三聚氰胺被非法添加至乳制品中以提高其含氮量，从而在用凯氏定氮法测量蛋白含量时获得较高的蛋白浓度。人如果长期摄入会导致人体泌尿系统膀胱、肾产生结石，并可诱发膀胱癌。世界各国都制定了三聚氰胺的限量标准，我国参照AOAC制定的标准制定了我国的限量标准：婴儿配方奶粉中婴儿配方食品中限量值为1mg/kg，其他普通食品中的限量值为2.5mg/kg。

由于三聚氰胺属于小分子物质，目前的检测方法包括液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法，气相色谱-质谱法等，这些方法具有成本较高、分析速度慢，难以满足大通量的实际需要，因此迫切要求发展简便、快速、灵敏的分析技术。

三聚氰胺作为一种分子量仅有126的小分子化合物，其免疫分析方法与大分子的免疫分析方法存在较大不同。

⑴三聚氰胺本身不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物并产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类、以及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此它们是决定产生其特异性抗体和建立免疫分析方法的关键。

⑵虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。

⑶基于抗原抗体免疫反应检测小分子化合物的分析技术，目前多采用酶联免疫分析（ELISA）。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度。

小分子化合物依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新领域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型三聚氰胺抗原和抗体及应用，设计合成具有氯甲基结构的三聚氰胺类似物，在此基础上合成三聚氰胺半抗原、人工抗原和酶标抗原，其创新之处在于利用该氯甲基结构与3-巯基丙酸反应接臂制备半抗原，避免了传统的以三聚氰胺为原料直接合成半抗原过程中反应位点无法控制的缺点。本方法合成的人工抗原免疫动物产生了特异性很高的抗体，并以此为基础建立了ELISA方法，可以快速、准确检测三聚氰胺。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种三聚氰胺半抗原前体，结构式如下：

一种三聚氰胺半抗原，结构式如下：

三聚氰胺半抗原在制备三聚氰胺抗原中的应用。

一种三聚氰胺人工抗原，结构式如下：

所述OVA为卵清白蛋白。

一种三聚氰胺人工抗原经动物免疫后获得的三聚氰胺抗体。

三聚氰胺抗体在检测三聚氰胺方法中或检测三聚氰胺试剂中的应用。

一种三聚氰胺的酶标抗原，结构式如下：

所述HRP为辣根过氧化物酶。

三聚氰胺的酶标抗原在检测三聚氰胺方法或检测三聚氰胺试剂中的应用。

一种三聚氰胺的免疫检测方法，方法如下：

包被：将抗体溶于50mmol、pH9-10的碳酸盐缓冲液中，配制成10μg/mL的包被液，酶标板每孔加100μl包被液4℃孵育12-16小时，将包被好酶标板的每个孔，用磷酸盐缓冲液加0.05%(v/v)Tween20洗液（PBST）洗涤三次；

封闭：每孔加入200μl、0.5%脱脂乳粉/PBS封闭液，封闭1h；

加样：将待测样品溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加样时每孔加入50μl标样；

竞争反应：将酶标抗原溶于PBS缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50μl酶标抗原溶液，孵育1h后用PBST洗涤三次；

显色：显色底物使用四甲基联苯胺，将5mg四甲基联苯胺溶于1mlPBS缓冲液中，配制成浓度为0.1%的底物溶液，显色时每孔加入150μl的底物溶液和5μl双氧水，显色15分钟后每孔加入50μl5mol/L的硫酸终止；反应液在酶标仪上读数。

本发明的优点和有益效果为：

1、本方法设计、合成的半抗原副产物少、合成方法简单、效率较高、与目标物相似程度高，有效避免了多种副反应的发生，为制备高特异性抗体奠定了基础。

2、本发明制备的抗体具有较好的灵敏度，检测限可达到0.66ng/mL。

3、本发明提供的快速检测方法操作简便、快速，完成全部检测操作过程只需75分钟，而且检测的精确度可达90％以上，具有高灵敏度、高特异性、省时、便捷、高通量的特点，非常适合现场检测的需要。

4、本发明不仅在实验室检测中表现出色，并为开发出成本低廉、检测效率高、操作简便的酶联免疫快速检测工具，奠定了基础，具有良好的应用前景，既有经济效益又有社会效益。

附图说明

图1为本发明的三聚氰胺直接竞争ELISA标准曲线；

图2为本发明牛奶基质影响的消除。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明设计、合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量地检测样本中超微量目标分析物，即可用于样本测定。其选择性决定于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此可以快速准确地分析检测三聚氰胺在样本中的残用量。本发明研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。

三聚氰胺结构如下图：

半抗原的设计、合成是本方法的关键，为突出三聚氰胺分子的特异性抗原决定簇，本发明选择

作为半抗原的基本结构，其分子量MW为229.06。

本发明以3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸为半抗原，与载体蛋白OVA偶联合成人工抗原，结构式为：

本发明以3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸为半抗原，与载体蛋白HRP偶联合成酶标抗原，结构式为：

上述物质的合成方法如下：

⑴中间产物的设计与合成

中间产物的关键在于使用双胍、氯乙酸乙酯和甲醇钠反应合成6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基，具体做法如下：

甲醇钠0.324g与双胍0.413g溶于16mL甲醇溶液中，70℃加热搅拌回流1h，之后改为64℃继续加热搅拌回流4h，将反应液移入50mL离心管中，并用甲醇洗涤一并移入离心管中，5000rpm，5min，将上清液移入50mL圆底烧瓶中，向其中逐滴加入氯乙酸乙酯0.442mL，64℃加热搅拌回流14h。反应结束后，将溶液去除得到6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基。

⑵半抗原的合成

半抗原的关键在于使用类似物与3-巯基丙酸反应生成3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸，用下述步骤制得：

将3-巯基丙酸0.174mL和氢氧化钾0.168g溶于2.5mL无水乙醇中，逐滴加入到含有0.319g6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基的38mL无水乙醇中，78℃加热搅拌回流28h，反应结束后过滤，滤渣用冷乙醇洗涤，即得白色固体，为所需半抗原。

⑶人工抗原的合成

用半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸，通过活化酯法，连接到OVA上，合成人工抗原，其具体做法如下：

称取4mg半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸和3mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于200μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，待完全溶解后加入5.4mgN,N—二环己基碳二亚胺（DCC），4℃条件下搅拌反应过夜，反应有沉淀产生，将反应产物4500rpm4℃离心10min，取上清，冰浴条件下逐滴加入到含13.5mgOVA的1.8mLPBS中，4℃条件下搅拌反应过夜，产物取出后装入透析袋中，用pH7.4的0.01mol/LPBS透析三天，每天换四次。最后取出透析液，精确量取体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃保存。

⑷酶标抗原的合成

用半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸，通过活化酯法，连接到HRP上，合成人工抗原，其具体做法如下：

准确称取1.0mg半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸与1.0mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于100μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，再加入1.4mgN,N—二环己基碳二亚胺（DCC），4℃搅拌20h，有浑浊产生，4℃4500rpm离心10min，取上清液。冰浴条件下将上清液逐滴加入到含有5.0mgBSA2.0mLPBS中，4℃搅拌反应过夜，反应结束后将反应液移入透析袋中，4℃使用磷酸盐缓冲液（PBS）透析三天，取出后计算浓度，和结合比，加入硫柳汞并与甘油1:1混匀后-20℃保存。

⑸免疫与特异性抗体制备

免疫动物选用雄性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月，第三、四、五次免疫完后8天时由兔子的耳动脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg上述人工抗原溶于0.9％的氯化钠溶液和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，进行动物免疫；

加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的氯化钠溶液和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化,进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B免疫层析亲和柱对抗血清进行纯化，制备IgG抗体（即三聚氰胺抗体）。

上述制备的三聚氰胺抗体与酶标抗原可以用于三聚氰胺的免疫检测。

免疫分析方法的建立和测定条件的优选：

本发明利用棋盘滴定法确定最适的抗体包被量和酶标抗原的稀释倍数，建立了直接竞争ELISA方法的标准曲线，及目标分析物对于酶标抗原和抗体结合的

抑制曲线。

其中：OD_对照是不加标准品的吸光值；OD_空白是不加标准品和酶标抗原的吸光值。

按照上述抑制率公式计算得到各组不同浓度目标物的抑制率，以三聚氰胺浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标建立标准曲线，见附图1不同浓度三聚氰胺的抑制率曲线。

抗体特异性：即抗体与结构类似化合物的交叉反应程度，以抑制抗体最大结合率的50％所需目标分析物的浓度与所需各种结构类似化合物的浓度之比的百分数表示，即交叉反应率C.R(％)。

交叉反应率越小，表明抗体的特异性越好。

上述制备的抗体和酶标抗原可用于三聚氰胺的免疫检测，其方法如下：

包被：将纯化的抗体溶于50mmol、pH9-10的碳酸盐缓冲液中，配制成10μg/mL的包被液，酶标板的每个孔加100μl包被液4℃孵育12-16小时，将包被好酶标板的每个孔，用PBST即磷酸盐缓冲液加0.05%(v/v)Tween20洗液洗涤三次；

封闭：每孔加入200μl、0.5%脱脂乳粉/PBS封闭液，封闭1h；

加样：将待测样品溶于PBS中，加样时每孔加入50μl标样；

竞争反应：将酶标抗原溶于PBS缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50μl酶标抗原溶液，孵育1h后用PBST洗涤三次；

显色：显色底物使用四甲基联苯胺（TMB），将5mg四甲基联苯胺溶于1mlPBS缓冲液中,配制成浓度为0.1%的底物溶液。显色时每孔加入150μl的底物溶液和5μl双氧水。显色15分钟后每孔加入50μl1.25mol/L的硫酸终止；反应液在酶标仪上读数得到OD值。

基质影响消除：目前，最常用的一种消除基质干扰方法是样品稀释法。本实验以液态牛奶为样品，考察样品基质影响和消除条件。主要采取不同的稀释浓度的方法，消除样品基质对检测的影响，绘制cd-ELISA法抑制率曲线，与标准曲线作比较。

添加回收实验：添加不同含量的三聚氰胺标准品到牛奶样品中。向空白牛奶样品中分别添加150ng/mL、100ng/mL、50ng/mL三个浓度，每个水平作三次平行实验，采用直接离心的方法，去除牛奶中的蛋白质和脂肪，在离心后提取上清液PBS直接稀释10倍进行直接竞争ELSIA法检测，标准曲线的建立及结果计算方法，计算加标样品的回收率。回收率计算公式：

（1）灵敏度

在确定的最优条件下，建立了如附图1所示的ELISA方法的标准曲线，从图可以得出该方法的灵敏度，即半抑制浓度IC₅₀为7.8±1.3ng/mL，方法的最低检出限(LOD)定义为IC₁₅，其值为0.66±0.18ng/mL。

（2）特异性

本方法对其他的三嗪类物质三聚氰酸、三聚氯氰和阿特拉津几乎没有交叉反应，与环丙氨嗪有较大的交叉反应。结果见附表1。环丙氨嗪通常用于杀灭蝇类，在动物体内的代谢产物为三聚氰胺，因此对于食物样品中的三聚氰胺检测不会产生影响。

表1三聚氰胺与其类似物的交叉反应率

（3）基质影响的消除实验

对牛奶样品的处理是直接离心的方法，去除牛奶中的蛋白质和脂肪，在离心后提取上清液直接稀释5倍、10倍和20倍分别进行直接竞争ELSIA法检测，并绘制标准曲线，如图2。图中可以看出，用PBS稀释10倍时标曲与PBS的标曲较为接近，因此，PBS稀释10倍可以消除基质影响。

（3）牛奶的添加回收实验

实验所用牛奶经液质验证为阴性样品，经低温离心后取上清用PBS稀释10倍用于直接竞争ELISA检测。向空白牛奶样品中分别添加150ng/mL、100ng/mL、50ng/mL三个浓度，按照上述方法处理后取上清稀释10倍进行dc-ELISA方法检测，计算加标回收率和批内批间变异系数，结果见表2。由表可知，三个浓度的回收率均较高，在84.8%到90.3%之间，批内变异系数为1.1%到12.7%之间，批间变异系数为9.6%到17.4%之间。

表2三聚氰胺直接竞争ELISA法牛奶基质添加回收率表

Claims (1)

1.一种三聚氰胺人工抗原的制备方法，其特征在于：所制备的抗原的结构式如下：

所述OVA为卵清白蛋白；

上述物质的合成方法如下：

⑴中间产物的设计与合成

甲醇钠0.324g与双胍0.413g溶于16mL甲醇溶液中，70℃加热搅拌回流1h，之后改为64℃继续加热搅拌回流4h，将反应液移入50mL离心管中，并用甲醇洗涤一并移入离心管中，5000rpm，5min，将上清液移入50mL圆底烧瓶中，向其中逐滴加入氯乙酸乙酯0.442mL，64℃加热搅拌回流14h；反应结束后，将溶液去除得到6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基；

⑵半抗原的合成

将3-巯基丙酸0.174mL和氢氧化钾0.168g溶于2.5mL无水乙醇中，逐滴加入到含有0.319g6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基的38mL无水乙醇中，78℃加热搅拌回流28h，反应结束后过滤，滤渣用冷乙醇洗涤，即得白色固体，为所需半抗原；

⑶人工抗原的合成

称取4mg半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸和3mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于200μLN,N-二甲基甲酰胺中，待完全溶解后加入5.4mgN,N—二环己基碳二亚胺，4℃条件下搅拌反应过夜，反应有沉淀产生，将反应产物4500rpm4℃离心10min，取上清，冰浴条件下逐滴加入到含13.5mgOVA的1.8mLPBS中，4℃条件下搅拌反应过夜，产物取出后装入透析袋中，用pH7.4的0.01mol/LPBS透析三天，每天换四次；最后取出透析液，精确量取体积，测定浓度和结合比，分装，-20℃保存。