CN102627628A - 氯虫苯甲酰胺抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氯虫苯甲酰胺抗原及其制备方法与应用。该氯虫苯甲酰胺抗原如式C所示，是氯虫苯甲酰胺与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物。本发明提供的制备氯虫苯甲酰胺抗原的方法，能够方便、快捷地获得氯虫苯甲酰胺抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的氯虫苯甲酰胺抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本发明的制备氯虫苯甲酰胺抗原的方法及由该方法获得的氯虫苯甲酰胺抗原在氯虫苯甲酰胺的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

Description

氯虫苯甲酰胺抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种氯虫苯甲酰胺抗原及其制备方法与应用。

背景技术

氯虫苯甲酰胺通用名为Chlorantraniliprole，化学名为3-溴-N-{4-氯-2-甲基-6-[(甲氨基)羰基]苯基}-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-酰胺，试验代号DPX-E2Y45，商品名为：Altaco，Coragen和Rynaxypyr；CAS登记号：500008-45-7；分子式为：C₁₈H₁₄BrCl₂N₅O₂；相对分子量为：483.1。氯虫酰胺(chlorantraniloprole)是美国杜邦公司在日本农药公司工作的基础上，以氟虫酰胺(flubendiamide)为先导，于2000年发现的第一个具有邻甲酰胺基苯甲酰胺类化学结构的化合物，该化合物虽然在结构上同氟虫酰胺有一定差别，但是都作用于鱼尼丁受体，且对哺乳动物安全。其化学结构式如下：

目前，氯虫苯甲酰胺的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(HPLC-MS/MS)等。但是这几种检测方法需要使用昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时长，不适用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种氯虫苯甲酰胺抗原及其制备方法与应用。

本发明提供的制备氯虫苯甲酰胺抗原(也即式C所示化合物)的中间体式A所示化合物，其结构通式如式A所示，

式A

所述式A中，n为2-6的整数；

本发明提供的制备所述式A所示化合物的方法，包括如下步骤：将氨基酸和2-[3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-5-吡唑]-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][1，3]恶嗪-4-酮于有机溶剂中混匀进行反应，反应完毕得到式A所示化合物。

上述方法中，所述氨基酸选自氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中的至少一种，优选氨基丁酸；

所述氨基酸和2-[3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-5-吡唑]-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][1，3]恶嗪-4-酮的投料摩尔配比为10∶1，优选1.2∶1；

所述反应步骤中，温度为0-50℃，优选25℃，时间为6-48小时，优选12小时；

所述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，优选N，N-二甲基甲酰胺；

所述制备式A所示化合物的方法，还包括如下步骤：在反应完毕后将反应体系倒入水中，调节pH值为3，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相后干燥，旋转蒸发去除溶剂，并用由体积比为3∶1的正己烷和乙酸乙酯组成的混合液重结晶。

本发明提供的用于制备氯虫苯甲酰胺抗原的化合物为式B所示化合物，

式B

所述式B中，n为2-6的整数。

本发明提供的制备所述式B所示化合物的方法，包括如下步骤：将所述式A所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与下述两化合物中的任意一种于有机溶剂或水中混匀进行反应得到所述式B所示化合物：二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。

上述方法中，所述有机溶剂均选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，优选N，N-二甲基甲酰胺；

所述式A所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的投料摩尔比为1∶1-5∶1-5，优选1∶1.3∶1.1；

所述反应步骤中，温度为0-50℃，优选25℃，时间为4-24小时，优选8小时。

本发明提供的氯虫苯甲酰胺抗原，也即式C所示化合物，

式C

所述式C中，n为2-6的整数。

该氯虫苯甲酰胺抗原是氯虫苯甲酰胺与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；所述酰胺键是式A上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。

本发明提供的制备式C所示氯虫苯甲酰胺抗原的方法，包括如下步骤：将前述本发明提供的式B所示化合物与载体蛋白溶液混匀进行偶联反应，反应完毕得到式C所示化合物。

上述制备式A至式C所示化合物方法的合成路线如图1所示。

上述式C和方法中，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中的至少一种，优选牛血清蛋白或卵清蛋白；所述式B所示化合物与载体蛋白溶液中载体蛋白的投料摩尔比为5-30∶1，优选15∶1；

所述偶联反应步骤中，温度为0-50℃，优选4℃，时间为8-36小时，优选12小时，pH值为5-9，优选7.5。

所述载体蛋白溶液按照包括如下步骤的方法制备而得：将载体蛋白与缓冲液混匀得到所述载体蛋白溶液；其中，所述缓冲液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐(PBS)缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中的至少一种，所述缓冲液的pH值均为7.5；

所述制备式C所示氯虫苯甲酰胺抗原的方法，还包括如下步骤：在所述偶联反应之后，将反应体系进行透析；所述透析步骤中，所用透析液为pH值为7-10、浓度为0.01-0.2mol/L的PBS溶液；优选所述透析液的pH值为7.5，浓度为0.1mol/L。

所述透析步骤中，所述pH值为7-10、浓度为0.01-0.2mol/L的PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O以质量比8.0∶0.2∶2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。

由上述本发明提供的氯虫苯甲酰胺抗原得到的抗体，以及上述抗原和/或抗体在检测样品中氯虫苯甲酰胺中的应用、在制备用于检测样品中氯虫苯甲酰胺的酶联免疫试剂盒、氯虫苯甲酰胺的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用，均属于本发明的保护范围。其中，所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。

本发明提供的制备氯虫苯甲酰胺抗原的方法，能够方便、快捷地获得氯虫苯甲酰胺抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的氯虫苯甲酰胺抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本发明的制备氯虫苯甲酰胺抗原的方法及由该方法获得的氯虫苯甲酰胺抗原在氯虫苯甲酰胺的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

附图说明

图1为氯虫苯甲酰胺抗原的合成路线图。

图2为建立的氯虫苯甲酰胺间接ELISA法标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，邻苯二胺(OPD)，氨基乙酸，氨基丙酸等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。

2-[3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-5-吡唑]-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][1，3]恶嗪-4-酮按照如下文献提供的方法制备而得：Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters(2007)，17(22)，6274-6279。

实施例1、式A所示氯虫苯甲酰胺半抗原4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸化合物的合成：

在25mL圆底烧瓶中加入0.26mmol氨基丁酸和0.45mmol NaOH，加入5mL无水DMF，25℃下搅拌1h后，加入0.22mmol 2-[3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-5-吡唑]-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][1，3]恶嗪-4-酮，继续搅拌12h，将反应液倒入15mL水中，用浓盐酸调节pH值为3，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取，无水硫酸钠干燥。旋转脱溶，将得到的产物用正己烷和乙酸乙酯(3∶1，v/v)重结晶，得白色固体89mg，产率72％。

¹H-NMR(DMSO)：1.64(m，CH₂，2H)，2.16(s，CH₃，3H)，2.24(t，CH₂，2H)，3.14(m，CH₂，2H)，7.34-8.49(m，aromatic-H，6H)，8.35(t，CONHCH₂，1H)，10.25(s，CONH，1H)，12.07(s，COOH，1H)；

¹³C-NMR(DMSO)：17.8，24.4，31.2，40.2，110.7，125.5，126.7，126.9，128.0，131.0，131.2，131.6，136.2，138.8，139.3，139.5，147.2，148.5，155.6，165.8，174.3.

HRMS：m/z calculated for C₂₁H₁₈BrCl₂N₅O₄(M+H⁺)553.9997，found 553.9973.

产品经¹H-NMR、¹³C-NMR和高分辨质谱确证，为式A所示氯虫苯甲酰胺半抗原4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸化合物。

式A

实施例2、氯虫苯甲酰胺和氯虫苯甲酰胺-卵清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-OVA)抗原的制备

制备氯虫苯甲酰胺：称取实施例1制备所得式I所示氯虫苯甲酰胺半抗原4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸(0.036mmol)，NHS(0.047mmol)，和DCC(0.040mmol)用1mL无水DMF溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，将反应液在8000转下离心5分钟，取上清液，其中含有式B所示化合物氯虫苯甲酰胺，反应后不分离产物，直接将上清液进行如下氯虫苯甲酰胺-卵清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-OVA)抗原的制备；

制备氯虫苯甲酰胺-卵清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-OVA)抗原：

将该实施例前述制备所得含有式B所示化合物氯虫苯甲酰胺的上清液缓慢滴加入载体蛋白OVA溶液(该载体蛋白溶液是由105mg OVA溶于10mL pH值为7.5的磷酸盐(PBS)缓冲液混匀而得)中，式B化合物与载体蛋白的投料摩尔比为15∶1，在4℃搅拌过夜后，将所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液(氯虫苯甲酰胺-OVA)稀释为1mg/mL的溶液，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸或其它小分子，得到式II1所示4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸与OVA的偶联物，也即式C所示氯虫苯甲酰胺抗原(如式C1所示)。

实施例3、氯虫苯甲酰胺和氯虫苯甲酰胺-卵清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-OVA)抗原的制备

氯虫苯甲酰胺的制备：称取实施例1制备所得式I所示氯虫苯甲酰胺半抗原4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸(0.036mmol)，NHS(0.047mmol)，和EDC(0.040mmol)用1mL水溶解，在室温25℃搅拌反应6小时后，将反应液在8000转下离心5分钟，取上清液，其中含有式B所示化合物氯虫苯甲酰胺。

氯虫苯甲酰胺-卵清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-OVA)抗原的制备：将该实施例前述制备所得含有式B所示化合物氯虫苯甲酰胺的上清液按照实施例2所示方法进行氯虫苯甲酰胺-卵清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-OVA)抗原的制备，得到式II1所示4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸与OVA的偶联物，也即式C所示氯虫苯甲酰胺抗原(如式C1所示)；

(式C1)

其中，该PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O以质量比8.0∶0.2∶2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。

实施例4、氯虫苯甲酰胺和氯虫苯甲酰胺-牛血清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-BSA)抗原的制备

氯虫苯甲酰胺的制备：

称取实施例1制备所得式I所示氯虫苯甲酰胺半抗原4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸(0.036mmol)，NHS(0.047mmol)，和DCC(0.040mmol)用1mL无水DMF溶解，在室温搅拌反应6小时后，将反应液在8000转下离心5分钟，取上清液，其中含有式B所示化合物氯虫苯甲酰胺，反应后不分离产物，直接将上清液进行如下氯虫苯甲酰胺-牛血清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-BSA)抗原的制备；

氯虫苯甲酰胺-牛血清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-BSA)抗原的制备：

将该实施例前述制备所得含有式B所示化合物氯虫苯甲酰胺的上清液缓慢滴加到载体蛋白溶液中(该载体蛋白溶液是由157.5mg BSA溶于10mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS))，式B化合物4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸与载体蛋白的投料摩尔比为15∶1，在4℃搅拌过夜后，将所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液(氯虫苯甲酰胺-BSA)稀释为1mg/mL的溶液，至于-40℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸或未反应的其它小分子，得到式II2所示4-(2-(3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰氨基)丁酸与OVA的偶联物，也即式C所示氯虫苯甲酰胺抗原(如式C2所示)。

式C2

其中，该PBS溶液按照如下方法制备而得：将NaCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O以质量比8.0∶0.2∶2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。

实施例5、氯虫苯甲酰胺-牛血清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-BSA)抗原的应用

一、利用氯虫苯甲酰胺-牛血清白蛋白(氯虫苯甲酰胺-BSA)抗原制备抗体

(1)取8-10周龄的Bal b/c小白鼠作为实验动物。

(2)基础免疫：由实施例4中得到稀释好的氯虫苯甲酰胺-BSA抗原溶液(浓度为1mg/mL)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，注射剂量为0.1mg乳化抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL上述稀释好的氯虫苯甲酰胺-BSA抗原溶液，然后加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg乳化稀释抗原(8周龄的Bal b/C小鼠体重约23-25g)。

加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被原为1mg/mL氯虫苯甲酰胺-OVA稀释500倍用，待效价大于1∶8000后(效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟后，分离出抗血清，即得到氯虫苯甲酰胺-BSA抗体。用于下述各实验。

二、抗体效果检测

下述实验中所用的各种缓冲液如下：

(1)包被缓冲液：0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

(2)磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.5)：称量4.0g NaCl、0.1g KH₂PO₄、1.48gNa₂HPO₄·12H₂O用蒸馏水定容到500mL，浓度为0.1M、pH为7.5磷酸盐缓冲液；

(3)样品稀释液PBSTG：由0.5mL吐温20、0.5g明胶和500mL浓度为0.1M、pH为9.6的PBS缓冲液混合得到；

(4)柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液：由柠檬酸三钠、Na₂HPO₄和水组成；柠檬酸三钠在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.01M，Na₂HPO₄在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的浓度为0.03M；柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的pH值为5.5；

(5)底物缓冲液：将20.0mg邻苯二胺(OPD)溶解于10.0mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μL体积百分含量为30％的H₂O₂水溶液得到的溶液，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液为(4)中所述；

(6)终止缓冲液：2.0M的硫酸水溶液；

(7)洗涤液：由NaCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、Tween-20和水组成；NaCl在洗涤液中的浓度为8.0g/L，KH₂PO₄在洗涤液中的浓度为0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O在洗涤液中的浓度为2.96g/L，Tween-20在洗涤液中体积百分含量为1∶1000。

(一)抗体抑制实验

1、氯虫苯甲酰胺-OVA包被抗原溶液的配制

将上述实施例1制备的稀释后的1mg/mL的氯虫苯甲酰胺-OVA抗原完全解冻后，用包被缓冲液按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000进行梯度稀释，得到不同浓度的氯虫苯甲酰胺-OVA的包被抗原溶液。

2、氯虫苯甲酰胺标准品溶液的配制

(1)称取5mg氯虫苯甲酰胺标样，充分溶解于10mL无水甲醇中，即得到0.5mg/mL氯虫苯甲酰胺标准品溶液；

(2)用样品稀释液将上述步骤(1)的0.5mg/mL氯虫苯甲酰胺标准品溶液配成浓度为2000ng/mL的氯虫苯甲酰胺标准品溶液。

3、氯虫苯甲酰胺-BSA抗血清稀释液的配制

将上述步骤一制备的氯虫苯甲酰胺-BSA抗体用样品稀释液按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000进行梯度稀释，得到氯虫苯甲酰胺-BSA抗血清稀释液。

4、抗原、抗体的棋盘格实验

包被：在96孔酶标板中每孔加入100μL步骤1制备得到的氯虫苯甲酰胺-OVA包被抗原溶液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次。

封闭：封闭液150μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h，弃封闭液，洗涤3次。

竞争：零孔每孔加50μl样品稀释液，抑制孔每孔加入50μl步骤2制备得到的氯虫苯甲酰胺标准品溶液。将上述步骤3得到的氯虫苯甲酰胺-BSA抗血清稀释液(从2.5×10³倍到40×10³倍)加入酶标板中(50μl/孔)，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗(IgG-HRP，Jackson公司，产品目录号为79556)(0.1mg/mL)稀释1000倍，稀释液是0.1M，pH为9.6的PBSTG，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，洗板4次。

显色：将底物缓冲液加入酶标板中，每孔100μl。避光显色15min。

终止：每孔加入50μL终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。

效价的定义为零孔OD值为1时的血清稀释倍数。

结果如表1所示。

表1、抗氯虫苯甲酰胺小鼠的血清效价检测(OPD 37℃显色15min，2000ng标样抑制)

注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。

表1中结果表明，当包被抗原稀释度为1∶8000，抗血清稀释度为1∶8000时，此时的抑制率最好，为75.2％(抑制率＝(A₀-A₂₀₀₀)/A₀×100％)，也即此时的抑制效果最好。说明上述实施例4制备的氯虫苯甲酰胺-BSA可以作为免疫原制备出检测氯虫苯甲酰胺的抗体。

A₀为对照孔OD值；A₂₀₀₀为抑制孔OD值；

抑制率的计算公式：抑制率＝(A₀-A₂₀₀₀)/A₀×100％。

(二)氯虫苯甲酰胺标准曲线的建立

将上述制备的氯虫苯甲酰胺标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL。

(1)包被原的包被：将上述制备的氯虫苯甲酰胺-OVA抗原按照1∶8000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的氯虫苯甲酰胺标准品溶液(实验孔)，每孔50μL，对照孔中不添加氯虫苯甲酰胺标准品溶液而加入50μL样品稀释液；

(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1∶8000的氯虫苯甲酰胺-BSA抗血清稀释液，每孔50μL；37℃温育30分钟；倒掉酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；

(4)在实验孔和对照孔中分别加入100μL稀释倍数为1∶1000的IgG-HRP(Jackson公司，产品目录号为79556)(0.1mg/mL)，37℃温育30分钟；用洗涤液洗板4次，倒掉酶标板中的溶液，甩干；

(5)向实验孔和对照孔中分别加入100μL底物缓冲液，37℃温育15分钟后，再向每孔中加入50μL 2.0M的硫酸溶液终止反应；

(6)在492nm下测定吸光值；

(7)绘制标准曲线：以不同浓度(ng/mL)的氯虫苯甲酰胺标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值(B/B₀×100％，其中，B为氯虫苯甲酰胺标准品溶液的平均吸光度值，B₀为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，绘制标准曲线图。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线图如图2所示。结果表明，其灵敏度(IC₅₀)为257ng/mL，检测范围是13.5ng/mL-1683ng/mL。说明上述实施例4制备的氯虫苯甲酰胺-BSA作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的效果。

(三)抗体特异性检测

1、氯虫苯甲酰胺类似物标准品溶液的配制

氯虫苯甲酰胺类似物标准品的配制

参照步骤(一)中氯虫苯甲酰胺标准品的配制方法，制备氟虫双酰胺的标准样品。

用样品稀释液将上述氟虫双酰胺分别稀释成如下浓度：20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL、312.5ng/mL。

2、建立标准曲线，测定抑制中浓度IC₅₀(抑制率达到50％的标样浓度值)。

标准曲线的建立方法与上述氯虫苯甲酰胺标准曲线的建立方法相同。

交叉反应率(％)＝(氯虫苯甲酰胺IC₅₀)/(氯虫苯甲酰胺类似鳌合物IC₅₀)×100％。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表2所示。

表2、由氯虫苯甲酰胺-BSA制备的抗体的特异性检测

分析物	IC50(ng/mL)	交叉反应率(％)
			氯虫苯甲酰胺	242.81	100
氟虫双酰胺	＞20000	---

表2中，“---”表示无交叉。

结果表明，上述由氯虫苯甲酰胺-BSA制备得到的抗体与其类似物氟虫双酰胺的交叉反应率很小，说明用氯虫苯甲酰胺-BSA制备的抗体对氯虫苯甲酰胺具有很好的特异性。

Claims (12)

1. 

式A

所述式A中，n为2-6的整数。

2.一种制备权利要求1所述式A所示化合物的方法，包括如下步骤：将氨基酸和2-[3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-5-吡唑]-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][1，3]恶嗪-4-酮于有机溶剂中混匀进行反应，反应完毕得到式A所示化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氨基酸选自氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中的至少一种，优选氨基丁酸；

所述氨基酸和2-[3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-1H-5-吡唑]-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][1，3]恶嗪-4-酮的投料摩尔配比为10∶1，优选1.2∶1；

所述反应步骤中，温度为0-50℃，优选25℃，时间为6-48小时，优选12小时；

所述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，优选N，N-二甲基甲酰胺；

所述制备权利要求1所述式A所示化合物的方法，还包括如下步骤：在反应完毕后将反应体系倒入水中，调节pH值为3，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相后干燥，旋转蒸发去除溶剂，并用由体积比为3∶1的正己烷和乙酸乙酯组成的混合液重结晶。

4.式B所示化合物，

式B

所述式B中，n为2-6的整数。

5.一种制备权利要求4所述式B所示化合物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述式A所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与下述两化合物中的任意一种于有机溶 剂或水中混匀进行反应得到所述式B所示化合物：二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂均选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的至少一种，优选N，N-二甲基甲酰胺；

所述式A所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的投料摩尔比为1∶1-5∶1-5，优选1∶1.3∶1.1；

所述反应步骤中，温度为0-50℃，优选25℃，时间为4-24小时，优选8小时。

7.式C所示化合物，

式C

所述式C中，n为2-6的整数。

8.一种制备权利要求7所述式C所示化合物的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述式B所示化合物与载体蛋白溶液混匀进行偶联反应，反应完毕得到所述式C所示化合物。

9.根据权利要求7所述的化合物或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中的至少一种，优选牛血清蛋白或卵清蛋白；所述式B所示化合物与载体蛋白溶液中所述载体蛋白的投料摩尔比为5-30∶1，优选15∶1；

所述偶联反应步骤中，温度为0-50℃，优选4℃，时间为8-36小时，优选12小时，pH值为5-9，优选7.5。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白溶液按照包括如下步骤的方法制备而得：将载体蛋白与缓冲液混匀得到所述载体蛋白溶液；其中，所述缓冲液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的至少一种，所述缓冲液的pH值均为7.5；

所述制备式C所示化合物的方法，还包括如下步骤：在所述偶联反应之后，将反应体系进行透析；所述透析步骤中，所用透析液为pH值为7-10、浓度为0.01-0.2mol/L的PBS溶液，优选所述透析液的pH值为7.5，浓度为0.1mol/L；

所述透析步骤中，所述pH值为7-10、浓度为0.01-0.2mol/L的PBS溶液按照如下 方法制备而得：将NaCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O以质量比8.0∶0.2∶2.96的比例溶于水中，用水定容到1L。

11.由权利要求7所述化合物得到的抗体。

12.权利要求7所述化合物和/或权利要求11所述抗体在检测样品中氯虫苯甲酰胺中的应用；

权利要求7所述化合物和/或权利要求11所述抗体在制备用于检测样品中氯虫苯甲酰胺的酶联免疫试剂盒、氯虫苯甲酰胺的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用；所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。 

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