CN101839907A

CN101839907A - 一种苏丹红ⅰ的酶联免疫吸附分析方法

Info

Publication number: CN101839907A
Application number: CN201010145257A
Authority: CN
Inventors: 许艇; 李季; 韦克毅; 王佳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2010-09-22

Abstract

本发明公开了一种苏丹红I的酶联免疫吸附分析方法，其是以人工合成的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原制备苏丹红I多克隆抗体；以所述半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联的复合物作为包被抗原，进行竞争性酶联免疫吸附分析(ELISA)。本发明的方法能准确灵敏地检测食品中的苏丹红I残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本发明对解决大批量样品的苏丹红I残留现场监控技术具有重要的现实意义。

Description

一种苏丹红Ⅰ的酶联免疫吸附分析方法

技术领域

本发明涉及一种苏丹红I的半抗原合成及其免疫分析方法。属于免疫分析化学技术领域。

背景技术

苏丹红(Sudan dyes)是一类人工合成的亲脂性偶氮化合物，主要分为四类(I、II、III、IV)，其中苏丹红II、III、IV都是苏丹红I的衍生物。国际癌症研究机构将苏丹红归为三类致癌物，即动物致癌物，目前尚不确定对人类有致癌作用。2003年英国、法国等许多欧盟国家相继发现了进口辣椒和食品中含有苏丹红，引发了全球的“苏丹红”风暴。我国自2005年3月开始，也相继在辣椒调味品、成鸭蛋及唇膏等产品中发现苏丹红，最常见的是苏丹红I和苏丹红IV。

苏丹红残留常规的分析主要是应用高效液相色谱(HPLC)或者高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)等仪器方法在实验室进行。应用这些理化分析技术对食品、生物和环境等样品中痕量苏丹红残留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化等前处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，容易造成环境污染。许多理化分析技术本身就具有局限性，如苏丹红I的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的仪器分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率的苏丹红快速分析技术。

发明内容

本发明针对上述不足，公开了一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ELISA方法，用于食品中苏丹红I的批量、快速检测。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种苏丹红I的酶联免疫吸附分析方法，其是以人工合成的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原制备苏丹红I多克隆抗体；以所述半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联的复合物作为包被抗原，进行竞争性ELISA，其中所述半抗原为4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸(S1)、4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸(S2)、4’-(2-羟基-1-萘偶氮基)联苯-4-甲酸(S3)、6-羟基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸(S4)、2-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸(S5)和5-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸(S6)中的任意一种。

本发明主要根据苏丹红I的化学结构特点，设计及合成苏丹红I的6种半抗原；再将半抗原与BSA偶联后制备人工免疫原，分别免疫新西兰大耳白兔制备出苏丹红I多克隆抗体。然后以6种半抗原与OVA偶联的复合物作为包被抗原，分别吸附于酶标板孔壁上，用定量苏丹红I做抑制试验，对每种抗体进行筛选，选出抑制效果最好的抗体和包被抗原组合，建立苏丹红I的竞争性ELISA方法。在番茄酱和辣椒粉样品中添加定量的苏丹红I，样品经简单前处理后用建立的ELISA检测，计算准确度和精确度，对ELISA方法进行验证。

本发明的方法，其中所述半抗原通过活性酯法与BSA和OVA偶联。

其中，本发明的6种苏丹红I的半抗原(S1-S6)合成的技术路线如下：

其中，苏丹红I抗体的制备过程中所用的免疫原优选是半抗原S2、S4、S6与BSA的偶联复合物(BSA-S2、BSA-S4和BSA-S6)。包被抗原是所有6种半抗原分别与OVA的偶联复合物(OVA-S1、OVA-S2、OVA-S3、OVA-S4、OVA-S5和OVA-S6)。

最后筛选出抑制效果最好的抗体和包被抗原组合是抗BSA-S2抗体和包被抗原OVA-S1。即苏丹红I多克隆抗体以4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸与BSA偶联的复合物为免疫原；以4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸与OVA偶联的复合物作为包被抗原。

其中，苏丹红I的竞争性ELISA方法原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的包被抗原，依次加入待测苏丹红I标准品或样品、多克隆抗体，固相包被抗原和待测苏丹红I相互竞争与抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测的苏丹红I浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物液和显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测苏丹红I浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知的苏丹红I浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测苏丹红I的浓度。根据本发明提供的ELISA方法和现有的技术，可以制备出直接使用的ELISA试剂盒，其可以含有上述抗苏丹红I多克隆抗体、吸附在酶标板上的上述包被抗原、苏丹红I的标准液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(酶标二抗)、浓缩缓冲液(PBST，含0.05％(v/v)Tween20的磷酸盐缓冲液，pH7.4)、样品稀释液(含10％甲醇的PBST)、显色液(A液和B液)、终止液(2M的硫酸液)等等，方便直接使用。

本发明的优点是能准确灵敏地检测食品中的苏丹红I残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本发明对解决大批量样品的苏丹红I残留现场监控技术具有重要的现实意义。

附图说明

图1为苏丹红I的标准抑制曲线，抗体来源于免疫原BSA-S2，包被抗原为OVA-S1。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 苏丹红I半抗原的合成及结构鉴定

(1)半抗原4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸(S1)的合成及鉴定

将1.37g 4-氨基苯甲酸溶于50ml水中，冰浴冷却至0-5℃，在搅拌状态下逐滴加入12ml浓盐酸，然后加入5ml亚硝酸钠溶液(0.7g)，混合液继续搅拌10min，温度控制为0-5℃。将1.44g 2-萘酚溶于30ml氢氧化钠溶液(10％，w/v)中，用冰浴预冷后再加入到上述混合液中，搅拌30min后，反应液用真空抽滤，产物用去离子水洗涤，最后用甲醇重结晶后得到纯化半抗原S1，产率约为60％。

结构鉴定：¹H NMR(DMSO)δ(ppm)：15.89(1H，s，ArOH)，13.03(1H，s，COOH)，8.47(1H，d，J＝7.7Hz，Ar)，8.06(2H，d，J＝6.9Hz，Ar)，7.96(1H，d，J＝9.6Hz，Ar)，7.88(2H，d，J＝6.9Hz，Ar)，7.75(1H，d，J＝7.7Hz，Ar)，7.61(1H，t，J＝4.4Hz，Ar)，7.50(1H，t，J＝4.4Hz，Ar)，6.80(1H，d，J＝9.6Hz，Ar).¹³C NMR(DMSO)δ(ppm)：175.99(COOH)，166.87，146.81，142.41，132.87，131.24，131.24，130.34，129.72，129.37，128.31，128.25，127.00，125.66，121.92，117.55，117.55(Ar).

(2)半抗原4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸(S2)的合成及鉴定

半抗原S2的合成方法与半抗原S1合成方法类似，用4-氨基苯丁酸替代4-氨基苯甲酸，半抗原S2的产率约为55％.

结构鉴定：¹H NMR(DMSO)δ(ppm)：15.65(1H，s，ArOH)，12.10(1H，s，COOH)，8.61(1H，d，J＝8.2Hz，Ar)，7.98(1H，d，J＝9.3Hz，Ar)，7.86-7.74(3H，m，Ar)，7.47(1H，t，J＝7.3Hz，Ar)，7.39(1H，d，J＝8.4Hz，Ar)，7.27(2H，d，J＝7.5Hz，Ar)，7.01(1H，d，J＝9.3Hz，Ar)，2.68(2H，t，J＝7.6Hz CH₂CH ₂COOH)，2.26(2H，t，J＝7.3Hz CH ₂CH₂CH₂)，1.85(2H，m，J＝7.4Hz CH₂CH ₂CH₂).¹³C NMR(DMSO)δ(ppm)：174.34(COOH)，165.43，144.44，142.94，138.97，132.81，129.86，129.86，129.13，129.02，128.91，127.96，126.22，122.75，121.37，119.80，118.74，108.78，108.78(Ar)，34.26(CH₂CH ₂CH₂COOH)，33.18(CH₂CH₂CH₂COOH)，26.28(CH₂ CH₂CH₂COOH).

(3)半抗原4’-(2-羟基-1-萘偶氮基)联苯-4-甲酸(S3)的合成及鉴定

半抗原S3的合成方法与半抗原S1合成方法类似，用4’-氨基-4-羧基联苯替代4-氨基苯甲酸，半抗原S3的产率约为40％.

结构鉴定：¹H NMR(DMSO)δ(ppm)：15.83(1H，s，ArOH)，13.05(1H，s，COOH)，8.57(1H，d，J＝8.1Hz，Ar)，8.05(1H，d，J＝8.4Hz，Ar)，8.00-7.87(9H，m，Ar)，7.80(1H，d，J＝8.0Hz，Ar)，7.46(1H，t，J＝8.0Hz，Ar)，6.93(1H，d，J＝9.4Hz，Ar).¹³C NMR(DMSO)δ(ppm)：168.62(COOH)，144.89，140.96，140.04，139.35，132.84，130.13，130.13，129.60，129.26，129.07，128.81，128.25，128.25，128.03，126.08，126.08，126.03，126.03，123.96，121.51，119.77，119.77(Ar).

(4)半抗原6-羟基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸(S4)的合成及鉴定

半抗原S4的合成方法与半抗原S1合成方法类似，用6-羟基-2-萘甲酸和苯胺分别替代2-萘酚和4-氨基苯甲酸，半抗原S4的产率约为58％.

结构鉴定：¹H NMR(DMSO)δ(ppm)：15.84(1H，s，ArOH)，13.06(1H，s，COOH)，8.64(1H，d，J＝8.6Hz，Ar)，8.44(1H，s，Ar)，8.11(2H，t，J＝9.1Hz，Ar)，7.90(2H，d，J＝7.0Hz，Ar)，7.58(2H，t，J＝7.8Hz，Ar)，7.44(1H，t，J＝7.3Hz，Ar)，7.03(1H，d，J＝9.4Hz，Ar).¹³C NMR(DMSO)δ(ppm)：168.60(COOH)，167.23，145.33，140.04，135.81，130.97，129.97，129.97，129.02，128.85，128.85，127.86，127.38，124.67，121.63，119.57，119.57(Ar).

(5)半抗原2-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸(S5)的合成及鉴定

将100ml丙酮加入到250ml圆底烧瓶中，再加入1.05g苏丹红I和10g碳酸钾，搅拌使其成悬浊液，在氮气保护下，将1.48g溴乙酸乙酯逐滴加入到反应液中，加热回流反应大约24h，冷却至室温。真空抽滤去除滤渣，蒸干滤液中的丙酮，残留物加入到50ml含4％氢氧化钠(w/v)的甲醇中，混合液加热回流反应2h，冷却至室温，蒸干甲醇，将残留物溶于50ml水中，用6M的HCl调整溶液的pH值至6.0，析出红色沉淀，该沉淀经晾干后再以重结晶方法纯化，最终产物半抗原S5的产率约为42％.

结构鉴定：¹H NMR(DMSO)δ(ppm)：13.11(1H，s，COOH)，8.25(1H，d，J＝8.4Hz，Ar)，8.03(1H，d，J＝9.3Hz，Ar)，7.96(3H，d，J＝9.6Hz，Ar)，7.68-7.48(6H，m，Ar)，4.93(2H，s，OCH ₂).¹³C NMR(DMSO)δ(ppm)：170.36(COOH)，153.07，147.74，135.82，131.60，131.17，129.66，129.66，129.13，128.24，128.23，127.22，124.87，122.76，122.51，122.51，116.29，66.53(OCH₂).

(6)半抗原5-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸(S6)的合成及鉴定

半抗原S6的合成方法与半抗原S5合成方法类似，用5-溴戊酸乙酯替代溴乙酸乙酯，半抗原S6的产率约为44％.

结构鉴定：¹H NMR(DMSO)δ(ppm)：12.03(1H，s，COOH)，8.30(1H，d，J＝8.5Hz，Ar)，8.04(1H，d，J＝9.1Hz，Ar)，7.97-7.92(3H，m，Ar)，7.66-7.46(5H，m，Ar)，7.45(1H，t，J＝5.8Hz，Ar)，4.21(2H，t，J＝5.7Hz，OCH ₂CH₂)，2.27(2H，t，J＝7.0Hz，CH₂CH ₂COOH)，1.70(4H，m，J＝5.1Hz，OCH₂CH ₂CH ₂CH₂).¹³C NMR(DMSO)δ(ppm)：174.50(COOH)，153.18，148.02，135.58，131.42，131.32，131.32，129.59，128.76，128.20，128.00，127.94，124.58，122.62，122.30，122.30，116.61(Ar)，69.59(OCH2)，33.43(CH₂COOH)，28.50(OCH₂ CH₂CH₂)，21.33(OCH₂CH₂ CH₂).

实施例2苏丹红I多克隆抗体制备

利用半抗原中的羧基，以活性酯法分别将半抗原S2，S4和S6与BSA偶联制备免疫原，冻干保存。将2mg免疫原溶于1ml生理盐水中，再与1ml完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射新西兰大耳白兔大腿，每一种免疫原免疫2只兔子。以后每隔两周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂与免疫原混合，免疫部位为颈背部皮下，从第三次免疫开始，每次免疫后一周从兔耳静脉采血检测血清效价。总共加强免疫7次，最后一次免疫后一周从兔颈动脉采全血，用35％的饱和硫酸铵盐析法纯化兔抗血清，获得较纯的苏丹红I多克隆抗体。

实施例3苏丹红I的竞争性ELISA方法

用活性酯法将所有半抗原(S1-S6)分别与OVA偶联制备包被抗原，以苏丹红I作抑制物，用竞争性ELISA法对每一种抗体进行筛选，其步骤如下：

(1)包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释，在96孔酶标板中每孔加入100μl，4℃包被过夜。

(2)洗板：每孔加入200μl的PBST(含0.05％(v/v)Tween20的磷酸盐缓冲液，pH 7.4)，放置1min，再甩掉洗涤液，重复3次，将板内残留PBST在吸水纸上拍干。

(3)封闭：加入封闭液150μl/孔，在室温条件下静置1.5h，弃封闭液，洗板同上。封闭液配制：100ml碳酸盐缓冲液(pH9.6)中加入1g明胶。

(4)竞争反应：每孔加入50μl的苏丹红I标准液或待测的样品，标准液和样品稀释液均用含10％甲醇的PBST；再加入50μl的抗体，抗体稀释液为PBST，在室温下反应1h，洗板。

(5)加酶标二抗：将羊抗兔酶标二抗用PBST按1∶10,000稀释，每孔加入100μl，在室温下反应1h，洗板。

(6)显色：A液配制：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，Tween-20 100μl，蒸馏水1000ml，pH5；B液配制：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40ml DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000ml，pH2.4-2.6。将A液和B液按1∶1混合，然后每孔加入100μl，室温条件下避光显色10-15min。

(7)终止及测定：每孔加入50μl浓度为2M的硫酸液终止反应，立即用酶标仪于450nm波长测定各孔的OD值。

根据表1的结果，苏丹红I抑制效果最好的组合是抗BSA-S2的抗体和包被抗原OVA-S1，因此该组合被用于建立苏丹红I的标准曲线，并用于样品分析。

表1 不同抗体与包被抗原组合苏丹红I的IC₅₀值

NA表示未检测

实施例4苏丹红I的标准抑制曲线

应用实施例3的ELISA方法，建立苏丹红I的标准抑制曲线，抗体(来源于BSA-S2)和包被抗原(OVA-S1)的最佳工作浓度用方阵法筛选获得，抗体和包被抗原的浓度均为1∶10,000。苏丹红I的系列标准浓度设置范围为0～100ng/ml。以四参数方程拟合标准曲线(见图1)，灵敏度用抑制最高OD值一半时所需的苏丹红I的浓度表示，即抑制中浓度IC₅₀值，该标准曲线的IC₅₀值为1.6ng/ml。最低检测限(LOD)以IC₁₀表示，该值为0.02ng/ml。曲线的线性范围IC₂₀-IC₈₀值为0.1-15ng/ml。

实施例5抗体的特异性实验

选择结构类似物苏丹红(I，II，III，IV)、苏丹红G、对位红、1-氨基-2-萘酚、晚霞黄、2-萘酚和苯胺作为待测物，测得各物质的IC₅₀值，再用下列方程式计算抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈小，则抗体对苏丹红I的特异性愈强，反之则抗体的特异性差。

交叉反应(CR％)＝IC₅₀(苏丹红I)/IC₅₀(供试物)×100％

实验测定结果见表2，采用间接ELISA法，多克隆抗体与对位红存在一定的交叉反应(12.8％)，原因是苏丹红I与对位红的结构非常接近，唯一的不同是对位红结构中苯环对位有一个硝基。抗体对其它结构相近或相似物质均无明显的交叉反应(＜0.3％)。说明该抗体的特异性好，可确保对样品中苏丹红I残留测定结果的可靠性。

表2 抗体与苏丹红I结构类似物的交叉反应

实施例6苏丹红I酶联免疫吸附分析试剂盒

本例中，试剂盒包含如下部分：

(1)吸附了包被抗原(OVA-S1)的96孔酶标板。

(2)以BSA-S2为免疫原制备的抗苏丹红I多克隆抗体。

(3)苏丹红I的标准液。

(4)辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(酶标二抗)。

(5)浓缩缓冲液(PBST)的配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、Tween-20 2ml、蒸馏水20ml。

(6)样品稀释液：含10％甲醇的PBST。

(7)显色A液：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2HPO4·12H2O，Tween-20 100μl，蒸馏水1000ml，pH5；显色B液：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40ml DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4-2.6。

(8)2M的硫酸液。

本试剂盒组装完成后，在4℃下至少可保存6个月。

实施例7样品检测

从超市中购买番茄酱和辣椒粉样品，经HPLC-GC鉴定样品中不含苏丹红等添加剂。分别称取2.0g番茄酱和辣椒粉在50ml烧杯中，往样品中添加苏丹红I标准品，使番茄酱中苏丹红I的终浓度为0.5μg/g，1μg/g和5μg/g，辣椒粉中苏丹红I的终浓度为1.0μg/g，5μg/g和20μg/g。样品前处理：往烧杯中加入20ml的甲醇，超声萃取10min，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，残留物用5ml的甲醇/PBST混合液(v/v，1/9)溶解，溶液经0.45μm醋酸纤维素膜过滤后，用建立的苏丹红I的ELISA方法进行测定。因为提取液中的各种基质对ELISA有干扰，所以采用PBST(含10％甲醇)稀释样品的方法消除基质的影响，根据实验结果，番茄酱和辣椒粉的提取液所需的最小稀释倍数是20倍和50倍。添加回收的检测结果见表3，批内分析的平均回收率是60.8-96.8％，变异系数6.4-16.2％；批间分析的平均回收率是58.5-92.4％，变异系数1.8-17.5％。该方法的准确度和精确度均符合实际检测要求，可用于苏丹红I在食品中的快速筛查。

表3 样品中苏丹红I的ELISA检测结果

通过以上实施例可知，本发明提供了一种苏丹红I的酶联免疫吸附分析方法，涉及6种苏丹红I半抗原的合成及结构鉴定、苏丹红I多克隆抗体的制备、最佳的抗体和包被抗原组合筛选、苏丹红I免疫分析方法的建立。本发明的特点是合成多种不同的半抗原，从而增加了抗体和包被抗原的多样性，通过筛选不同的抗体和包被抗原组合，建立了一种异源性的苏丹红I的ELISA方法，该方法灵敏度达0.02ng/ml，能准确地检测食品中的苏丹红I残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能作为一种仪器检测方法的补充，对样品进行筛查。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种苏丹红I的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，其是以人工合成的半抗原与BSA偶联作为免疫原制备苏丹红I多克隆抗体；以所述半抗原与OVA偶联的复合物作为包被抗原，进行竞争性酶联免疫吸附分析，其中所述半抗原为4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸、4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸、4’-(2-羟基-1-萘偶氮基)联苯-4-甲酸、6-羟基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸、2-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸和5-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸中的任意一种。

2.如权利要求1所述的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述半抗原通过活性酯法与BSA和OVA偶联。

3.如权利要求1或2所述的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述苏丹红I多克隆抗体以4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸与BSA偶联的复合物为免疫原。

4.如权利要求3所述的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于，所述包被抗原为4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸与OVA偶联的复合物。

5.权利要求1-4任一项所述的酶联免疫吸附分析方法用于检测番茄酱和辣椒粉样品中的苏丹红I残留量。

6.一种检测苏丹红I残留量的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于，其含有的抗体为以人工合成的半抗原与BSA偶联作为免疫原制备的苏丹红I多克隆抗体；包被抗原为所述半抗原与OVA偶联的复合物；其中所述半抗原为4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸、4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸、4’-(2-羟基-1-萘偶氮基)联苯-4-甲酸、6-羟基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸、2-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸和5-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸中的任意一种。

7.如权利要求6所述的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于，所述半抗原通过活性酯法与BSA和OVA偶联。

8.如权利要求6或7所述的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于，所述苏丹红I多克隆抗体以4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸与BSA偶联的复合物为免疫原。

9.如权利要求8所述的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于，所述包被抗原为4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸与OVA偶联的复合物。