CN111171073B - 一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用，所述对硫磷抗原以1份3‑氯‑4‑羟基苯甲酸甲酯溶解在3‑4份乙腈中，加入2‑3份无水碳酸钾和1.2份氯硫代磷酸二乙酯制得中间体：3‑氯‑4‑((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯，将中间体溶于3‑4份四氢呋喃，加入等体积的6mol/L盐酸，制得化合物：3‑氯‑4‑((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即为对硫磷半抗原。将半抗原与载体蛋白偶联，制备得到完全抗原。免疫动物实验表明本发明制备的人工抗原具有良好免疫原性。本发明的抗原和抗原可用于对硫磷免疫分析检测，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种对硫磷半抗原、完全抗原的制备方法与应用。
背景技术
有机磷农药，因广谱和高效特点在我国曾被广泛使用，据相关统计，过去10年其产量几乎占我国市场份额的1/3。经研究发现，大量使用的有机磷类农药未能及时降解，且在特定条件下半衰期更长，并能通过食物链在生物体内蓄积，这对人、畜构成威胁，同时也给农产品、食品的销售及安全出口带来了影响。对硫磷是有机磷农药一种，由于其高毒性，可致癌致畸致突变，已被我国禁用且被列为重点监测对象。我国食品安全国家标准GB2763-2016《食品中农药最大残留限量》中规定蔬菜类对硫磷的最大残留限量为0.01mg/kg，谷物类的最大残留量为0.1mg/kg，水果类为0.01mg/kg。
目前色谱法用于对硫磷检测较广，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)，气相色谱-红外光谱联用(GC/FTLR)等方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂、成本高、时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的对硫磷检测方法具有重要意义。
酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立小分子的检测方法，其首要条件是进行半抗原和抗原的制备。优秀的半抗原、抗原可以激发被免疫动物产生灵敏度高、特异性好的抗体。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种对硫磷半抗原的制备方法。
本发明所提供的对硫磷半抗原，其化学名为：3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，结构式如下：
上述对硫磷半抗原通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)使得3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯与硫代磷酸二乙酯发生酯化反应，得到中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯；
2)使得中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯在酸性条件下水解，得到3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即对硫磷半抗原。
上述方法步骤1)中，所述酯化反应可在无水碳酸钾存在下进行；
3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯与无水碳酸钾的摩尔比可为：1：2-3；
3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯与硫代磷酸二乙酯的摩尔比可为：1：1-1.5，具体可为1:1.2；
所述反应在加热回流条件下进行，所述反应的温度可为80℃，时间可为2～3小时；
所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为乙腈；
所述反应完成后，待反应体系冷却至室温，加入水淬灭反应，接着加入乙酸乙酯萃取分层，收集有机层干燥浓缩后柱色谱分离得到中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯。
上述方法步骤2)中，所述水解在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为四氢呋喃；
所述水解在室温下进行，所述水解的时间可为4-12小时，具体可为12小时；
所述水解的具体操作为：将1份(摩尔份数)中间体3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯溶于3-4份四氢呋喃，加入等体积的6mol/L盐酸，反应体系室温搅拌12小时，加入20份水淬灭反应，接着加入20份乙酸乙酯萃取分层，收集有机层干燥浓缩后柱色谱分离得到化合物：3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即有机磷农药对硫磷半抗原。
本发明的另一目的是提供一种对硫磷完全抗原，是由所述对硫磷半抗原与载体蛋白偶联后得到。
本发明还提供所述完全抗原的制备方法，即，通过碳二亚胺或混合酸酐法使所述对硫磷半抗原与载体蛋白偶联制得完全抗原。
具体地，采用活化酯法将载体蛋白偶联于所述半抗原的羧基上。
所述制备完全抗原的具体操作如下：
1)将对硫磷半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌得到A液；
2)将载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到B液；
3)将上述A液滴加到B液中，搅拌，得到C液；
4)将C液置于透析袋并于磷酸缓冲液中透析，收集透析袋中的溶液，即为有机磷农药对硫磷完全抗原。
上述方法步骤1)中，对硫磷半抗原、二甲基甲酰胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的用量比依次可为：20μmol∶1-2mL∶60-120μmol∶60-120μmol；具体可为：20μmol∶1mL∶60μmol∶60μmol；
所述室温搅拌的时间可为：18-24小时；
步骤2)中，所述载体蛋白具体可为牛血清蛋白；
载体蛋白和碳酸盐缓冲液的用量比可为：0.4μmol∶3-6mL，具体可为：0.4μmol∶3mL；
对硫磷半抗原与载体蛋白的摩尔比可为：20:1-40:1，具体可为20:1；
步骤3)中，所述搅拌在4-25℃(具体可为4℃)温度下搅拌10-12小时(具体可为10小时)；
步骤4)中，所述透析过程中，每3小时换液一次，进行多次透析，具体可进行6次透析。
本发明还提供所述有机磷农药对硫磷半抗原或所述有机磷农药对硫磷完全抗原在制备抗对硫磷的特异性抗体中的应用。
本发明的再一目的是提供由上述有机磷农药对硫磷完全抗原制备的特异性抗体。
所述特异性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、重链抗体和重组抗体。
所述特异性抗体的以下任一应用：
1)在检测对硫磷中的应用
2)在制备对硫磷的ELISA检测用试纸盒中的应用；
3)在制备对硫磷的胶体金检测试纸条中的应用。
本发明还提供由所述特异性抗体制备的对硫磷检测试剂或试剂盒。
本发明采用以上技术方案,以1份3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯溶解在3-4份乙腈中，加入2-3份无水碳酸钾和1.2份氯硫代磷酸二乙酯制得中间体：3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯，将中间体溶于3-4份四氢呋喃，加入等体积的6mol/L盐酸，制得化合物：3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即为对硫磷半抗原。将半抗原与载体蛋白偶联，制备得到完全抗原。本发明的制备方法简单易行，制备得到的对硫磷半抗原、对硫磷完全抗原，可有效地刺激被免疫动物产生灵敏度高、特异性强的抗体，可用于免疫分析中，满足国内对对硫磷残留的检测。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、对硫磷半抗原的制备
包括以下步骤：
1)将1份(摩尔份数，下同)3-氯-4-羟基苯甲酸甲酯溶解在3-4份乙腈中，加入2-3份无水碳酸钾和1.2份氯硫代磷酸二乙酯，反应体系80℃加热回流2～3小时，待反应体系冷却至室温，加入20份水淬灭反应，接着加入20份乙酸乙酯萃取分层，收集有机层干燥浓缩后柱色谱分离得到中间体：3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯。
2)将1份3-氯-4-((二乙氧基硫代硫代)氧基)苯甲酸甲酯溶于3-4份四氢呋喃，加入等体积的6mol/L盐酸，反应体系室温搅拌12小时，加入20份水淬灭反应，接着加入20份乙酸乙酯萃取分层，收集有机层干燥浓缩后柱色谱分离得到化合物：3-氯-4-((二乙氧基硫代磷酰基)氧基)苯甲酸，即有机磷农药对硫磷半抗原。
实施例2
以实施例1的对硫磷半抗原制备对硫磷完全抗原，包括以下步骤：
1)将有机磷农药半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌18小时得到A液；其中，有机磷农药半抗原、二甲基甲酰胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的用量比为20μmol∶1mL∶60μmol∶60μmol；
2)将载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到B液；其中，载体蛋白和碳酸盐缓冲液的用量比为0.4μmol∶3mL；
3)将上述A液滴加到B液中并于4℃搅拌10小时，得到C液；
4)将C液置于透析袋并于磷酸缓冲液中透析，每3小时换液一次，共透析6次，收集透析袋中的溶液，即为有机磷农药完全抗原。
所述载体蛋白为牛血清蛋白。
实施例3
对硫磷完全抗原的鉴定。
用实施例2制备的对硫磷完全抗原免疫Bal b/c小鼠，四免后第5天采眼眶静脉血清进行检测，判断所制备的对硫磷抗原是否具有免疫活性。
1)将实施例2制备的对硫磷完全抗原(1mg/mL)按500、1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍稀释后加入酶标板，见表1，每孔100uL，37℃温育3h后取出，用PBST洗净；
2)向包被的酶标孔0孔中加入50uL的PBS，抑制孔加入50uL浓度为100ng/L的对硫磷标样；取采集的小鼠血清，稀释500、1000、2000、4000、8000、16000倍加入酶标孔，每孔50uL，见表1，将酶标板置于37℃温育0.5h后取出，用PBST洗净；
3)向酶标孔中每孔加入1ug/mL的羊抗小鼠抗体，每孔100uL，随后将酶标板置于37℃温育0.5h后取出，用PBST洗净后向酶标孔中加入100uL的显色液，室温显色7min后，每孔加入50uL 50％浓硫酸终止反应，读取492nm吸光值；
4)实验结果见表1，可见随抗原、血清的稀释倍数加大，吸光值呈现逐渐下降的规律，小鼠血清效价在8×108，对对硫磷的抑制率达到55％。
表1对硫磷免疫小鼠的血清抑制反应检测Table 1 The titer and inhibitionrection of the mouse antiserum against parathion
注:C表示酶标板中的对照孔，I表示酶标板中的抑制孔
实施例4
食品中对硫磷的检测
1)准确称取25.0g西红柿试样放入匀浆机中，加入50.0mL乙腈，高速匀浆2min后用滤纸过滤，收集滤液装于有5g-7g氯化钠的100mL具塞量筒中，收集滤液40-50mL，盖上塞子，剧烈震荡1min，在室温下静置30min，使乙腈相和水相分层。
2)从具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放入150mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，杯内缓缓通入氮气，蒸发近干，提取两份等量样品。
3)1份用于ic-ELISA检测，所用溶剂为5.0mL PBS；1份用于液相色谱检测，所用溶剂为5.0mL丙酮，分别以25、50、75ng/mL对硫磷为添加浓度，进行添加回收检测，见表2。结果表明，以该方法制备的完全抗原免疫小鼠所得的抗体建立的ic-ELISA方法对西红柿中对硫磷检测，回收率在84％-100％，经GC法验证回收率在97％-106％之间，表明以此抗原制备的抗体所建立的ic-ELISA法具有良好的实用性。
表2对硫磷在西红柿中的添加回收试验
Claims (6)
1.对硫磷半抗原或对硫磷完全抗原在制备抗对硫磷的特异性抗体中的应用；
所述对硫磷半抗原其化学名为：3-氯-4 -（（二乙氧基硫代磷酰基）氧基）苯甲酸，结构式如下：
所述对硫磷完全抗原由所述对硫磷半抗原与载体蛋白偶联后得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述对硫磷完全抗原通过如下方法制备得到：1）将对硫磷半抗原溶于二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌得到A液；
2）将载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到B液；
3）将上述A液滴加到B液中，搅拌，得到C液；
4）将C液置于透析袋并于磷酸缓冲液中透析，收集透析袋中的溶液，即为有机磷农药对硫磷完全抗原。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤1）中，对硫磷半抗原、二甲基甲酰胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的用量比依次为：20μmol ∶1-2mL∶60-120 μmol∶60-120μmol；
所述室温搅拌的时间为：18-24小时；
步骤2）中，所述载体蛋白为牛血清蛋白；
载体蛋白和碳酸盐缓冲液的用量比为：0.4μmol∶3-6mL；
对硫磷半抗原与载体蛋白的摩尔比为：20:1-40:1；
步骤3）中，所述搅拌在4-25℃温度下搅拌10-12小时；
步骤4）中，所述透析过程中，每3小时换液一次，进行6次透析。
4.由权利要求1中所述的对硫磷完全抗原制备得到的抗对硫磷的特异性抗体。
5.权利要求4所述的抗对硫磷的特异性抗体以下任一应用：
1）在检测对硫磷中的应用
2）在制备对硫磷的ELISA检测用试纸盒中的应用；
3）在制备对硫磷的胶体金检测试纸条中的应用。
6.由权利要求4所述的抗对硫磷的特异性抗体制备的对硫磷检测试剂或试剂盒。
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