CN103675287B - 一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 - Google Patents
一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103675287B CN103675287B CN201310673734.1A CN201310673734A CN103675287B CN 103675287 B CN103675287 B CN 103675287B CN 201310673734 A CN201310673734 A CN 201310673734A CN 103675287 B CN103675287 B CN 103675287B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ivermectin
- solution
- hole
- elisa plate
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 22,23-dihydroavermectin B1a Natural products C1CC(C)C(C(C)CC)OC21OC(CC=C(C)C(OC1OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C1)C(C)C=CC=C1C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC1)O)CC4C2 AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- 229960002418 ivermectin Drugs 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 10
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 title abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 56
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 7
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical class OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 229940035429 isobutyl alcohol Drugs 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- -1 (methylol) amino Chemical group 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGXWBZJYJBAVKD-UHFFFAOYSA-N 3-amino-1,3-oxazol-2-one Chemical compound NN1C=COC1=O PGXWBZJYJBAVKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000003859 hyphenated technique Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/545—Synthetic resin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种伊维菌素的检测试剂盒，特别是一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒。包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括：伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。使用上述试剂盒，采用加样、洗涤、加酶标二抗、洗涤、加发光液、检测、结果判定的步骤，所制备试剂盒具有高的灵敏度，其灵敏度可达0.01-5ng/ml，而且具有宽的线性动力学范围，分析方法简便快速结果稳定、误差小，分析结果灵敏稳定可靠，安全性好及使用期长。
Description
技术领域
本发明涉及一种伊维菌素的检测试剂盒，具体的说是一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒。
背景技术
20世纪90年代以后，绝大多数测定食品中伊维菌素类药物残留的理化检测法主要依靠液相色谱技术进行分离，其次是色／质谱联用技术，气相色谱法、高效薄层色谱法等检测法，因其各自特有的性能，在抗生素残留检测方面稍有应用。色谱法检测牛乳中的药物残留要经过样品处理（包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤）、残留药物的分离和残留药物的检测。理化检测法利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，能进行定性、定量分析和药物鉴定，可作为乳中抗生素检测的确证方法。该法检测敏感性较高，但仪器及检测费用高、检测程序复杂、较耗时间等，这些不利因素使该法仅限于实验室乳样测定。
免疫学分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，目前药物残留免疫分析技术主要分三大类：相对独立的分析方法、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法、免疫受体法。1973年荷兰vanweeman、schμrrs及瑞典Engvall、Perlmann分别提出酶联免疫吸附法，30多年来国内外学者对免疫学方法检测食品中抗生素进行了大量研究。但由于抗生素是半抗原，抗原构建技术难度大、免疫特异性强、检测成本高，目前IDEXX实验室公司、Cha瑚Sciences等公司在免分析法方面的研究较为成熟，国内该技术仍处于研究发展中。当前主要是用酶联免疫吸附试验、放射性免疫发光法、荧光免疫法、化学发光法等，对比现有的几种标记免疫技术灵敏度的可知酶免与发光相比较，其酶免灵敏度较低。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、无毒无污染且所用仪器简单经济的检测伊维菌素的化学发光酶联免疫分析测定试剂盒，同时提供了其制备方法，以及检测样品中伊维菌素抗生素类的方法。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括：伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。
所述酶标板为不透明的聚苯乙烯8孔×12条的96孔化学发光酶标板。
所述包被抗原浓度为5μg/ml。
所述伊维菌素单克隆抗体的工作浓度为1:15000。
所述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒：所述伊维菌素的单克隆抗体是由伊维菌素的代谢物与分子量范围是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫小鼠制备得到。
一种使用上述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒检测残余伊维菌素的方法，包括以下步骤：
1）加样：向酶标板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃)恒温孵育2.5h；
2）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h；
4）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；
6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；
7）结果判定：以所测得的标准品发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率（B/B0%），以抑制率为纵坐标，伊维菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
有益效果：本发明所制备的伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有作为化学发光免疫分析最关键灵的优越的高灵敏度，其灵敏度可达0.01-5ng/ml，而且具有宽的线性动力学范围，光信号持续时间长，其产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天，分析方法简便快速结果稳定、误差小，样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠，安全性好及使用期长。
具体实施方式
一种伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括：伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。
所述酶标板为不透明的聚苯乙烯8孔×12条的96孔化学发光酶标板。
所述包被抗原浓度为5μg/ml。
所述伊维菌素单克隆抗体的工作浓度为1:15000。
所述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒：所述伊维菌素的单克隆抗体是由伊维菌素的代谢物与分子量范围是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫小鼠制备得到。
利用上述伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒检测残余伊维菌素的方法，包括以下步骤：
1）加样：向酶标板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃)恒温孵育2.5h；
2）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h；
4）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；
6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；
7）结果判定：以所测得的标准品发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率（B/B0%），以抑制率为纵坐标，伊维菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
1.制备所需试剂
制备浓缩洗涤液：
含有体积分数0.05%吐温20mmol/L,pH8.0的磷酸缓冲液。
制备校准液：
所述辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体的工作浓度优选1:15000。所述伊维菌素系列标准溶液浓度分别为：0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL。
所述包被抗原浓度优选5μg/mL，所述包被抗原制备具体由3-氨基-2-唑酮（AOZ）按照戊二醛法与活化的分子量范围是6.7KDa~6.8KDa的卵清蛋（cOVA）偶联完成。
本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒最低检测限可达0.1ng/ml，线性检测范围在0.1-20ng/ml，板内变异系数在10%以内，水样品中回收率在78%-81%之间。
制备发光底物液
发光液是0.01M鲁米诺与pH=8.80.001M对甲苯酚的三（羟甲基）氨基甲垸溶液和体积比浓度为3/10000H2O2的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
1.2伊维菌素化学发光酶联免疫检测法的建立
①抗体与包被抗原浓度的优选：
酶标板纵向用100mL/孔的，浓度梯度按80.0μg/ml、40.0μg/ml、20.0μg/ml、9.0μg/ml、5.0μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml和0.625μg/ml的包被抗原溶液包被，4℃放置过夜，用280μL/孔的洗涤液洗板三次，再用250μL/孔封闭液封闭，室温放置2.5小时，洗涤三次；横向加入100μL/孔，稀释梯度按1：100~1：500的抗体溶液，室温放置2小时，洗涤三次；加入100μL/孔的l:15000的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体，室温放置1小时，洗涤三次；加入100μL/孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
②抗体灵敏度的测定
经上述方阵法优选，申请人选择包被抗原浓度为5μg/mL，抗体浓度为1:15000，进行抗体的灵敏度的测定：
（1）包被过程：用0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，将伊维菌素的包被抗原配成5μg/ml的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，4℃反应12h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，200μL/孔，每次5分钟，拍干；
（2）封闭过程：用250μL/孔的封闭液封闭上述已包被的酶标板，室温孵育2.5小时，洗涤；
（3）竞争过程：加稀释抗体（1:1000）100μL/孔与不同浓度的药物50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育2-4小时，洗涤；
（4）酶标过程：于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体（1:15000）100μL/孔，室温孵育1.5小时，洗涤；
（5）发光过程：于各反应孔中加入100μL/孔即时配制的发光液，立即用化学发光免疫分析仪检测；
（6）计算过程：检测结果以抑制率计算，抑制率=B×100/B0，B是加入竞争者的发光值，B0是没有竞争者的发光值，计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
2.3本发明的检测伊维菌素的化学发光酶联免疫试剂盒的组装
（1）检测伊维菌素的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
a、包被有包被抗原（AOZ与卵清蛋白的偶联物)的固相载体（不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板）；
b、伊维菌素抗体工作液（体积比浓度为1:1000)；
c、伊维菌素标准溶液6瓶，浓度分别为0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL和10ng/mL；
d、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液（工作浓度为1:15000)；
e、浓缩磷酸盐缓冲溶液：80g的NaCl，2.0g的KH2P04，229.0g的Na2HP04·12H20，2.0g的KC1溶于1000mL蒸馏水中；
f、浓缩洗涤液：上述浓缩磷酸盐缓冲液加入体积比浓度为0.05mol/L的吐温20（Tween20）；
g、发光液：0.01M鲁米诺十0.001M对甲苯酚的三（羟甲基）氨基甲垸溶液（pH8.8）+体积比浓度为3/10000的H2O2。
2.4酶标板的制备
将包被抗原溶于包被液中，配成0.1ng/mL的溶液，酶标板的每孔加入10μL，4℃孵育12h，倾去包被液，每孔加入200μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后加入250μL/孔的封闭液，37℃孵育2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封在4℃下保存。
2.5本发明的伊维菌素的酶联免疫试剂盒的测定程序
试剂的准备
1）样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用；
2）洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用；
3）发光液：0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三（羟甲基）氨基甲烷溶液（pH8.8）3/10000（体积比）。
4.2样品前处理
（1）水样将水样经过0.45μm的滤膜抽滤，然后加入体积比浓度为0.05%的吐温-20。得到待测样品；
（2）牛奶将牛奶样品在4℃、10000转/分钟离心10分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶按1:10洗涤液稀释，得到待测样品；
（3）尿样将尿样品在4℃，10000转/分钟离心10分钟，去掉沉淀，将剩余的尿液用洗涤液按1:10稀释，得到待测样品；
（4）动物组织取样品与4mL0.1M的盐酸混合，并且放在一起用超生波处理20min，然后10000转/分钟离心20min，取上清液用10MNaOH调pH至8.0±0.5，旋涡振荡5min，然后10000转/分钟离心15min；取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000转/分钟离心10min，分出有机相，水相再用异丁醇（每次10mL）萃取两次，三次萃取的有机相合并在起，水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成l:10的溶液，得到待测样品。
4.3检测步骤
1）加样：向酶标板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温（25℃）恒温孵育2.5h；
2）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h；
4）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；
6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。
4.4结果判断
以所测得的标准品发光值，除以第一个标准（0标准）的发光值再乘以100，得到抑制率（B/B0%），以抑制率为纵坐标，伊维菌素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
抑制率=标准品发光值（或样品）×100/0标准品发光值。
Claims (1)
1.一种伊维菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊维菌素的代谢物与卵清蛋白偶联制成；所述试剂包括：伊维菌素的单克隆抗体、酶标二抗、伊维菌素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液；
所述的酶标二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体；
所述酶标板为不透明的聚苯乙烯8孔×12条的96孔化学发光酶标板；
所述包被抗原浓度为5μg/mL；
所述伊维菌素单克隆抗体的工作浓度为1:15000；
所述伊维菌素的单克隆抗体是由伊维菌素的代谢物与分子量范围是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫小鼠制备得到；
该检测试剂盒的检测方法如下，使用伊维菌素系列标准溶液浓度分别为：0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL，其特征在于，包括以下步骤：
1）加样：向酶标板中加入50μL/孔的伊维菌素系列标准浓度溶液或样品溶液，然后加入伊维菌素抗体工作液50μL/孔，室温恒温孵育2.5h；
2）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入200μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
3）加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL，室温恒温孵育1.5h;
4）洗涤：倾出孔中液体，向酶标板中加入280μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；
5）加发光液：每孔加入发光液l00μL；
6）检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度；
7）结果判定：以所测得的伊维菌素系列标准浓度溶液对应的孔的发光值，除以第一个标准的发光值再乘以100，得到抑制率B/B0%，以抑制率为纵坐标，各伊维菌素系列标准浓度溶液浓度的对数为横坐标作标准曲线，根据样品溶液所对应的孔的发光值和所得标准曲线，计算得到样品溶液的浓度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310673734.1A CN103675287B (zh) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | 一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310673734.1A CN103675287B (zh) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | 一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103675287A CN103675287A (zh) | 2014-03-26 |
| CN103675287B true CN103675287B (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=50313473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310673734.1A Active CN103675287B (zh) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | 一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103675287B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104880553A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-09-02 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 一种检测牛肉中伊维菌素残留的试剂盒 |
| CN106706778A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-24 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种食物中伊维菌素含量检测方法 |
| CN106770213A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种伊维菌素检测方法及试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1811440A (zh) * | 2006-02-17 | 2006-08-02 | 中国农业大学 | 一种检测伊维菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 |
| CN101256188A (zh) * | 2008-04-16 | 2008-09-03 | 北京望尔康泰生物技术有限公司 | 检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒及其应用 |
| CN201233399Y (zh) * | 2007-08-02 | 2009-05-06 | 北京望尔生物技术有限公司 | 阿维菌素类药物elisa检测试剂盒 |
| CN201993363U (zh) * | 2010-10-27 | 2011-09-28 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 林可霉素elisa检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0514678D0 (en) * | 2005-07-18 | 2005-08-24 | Europ Cardiovascular Genetics | Method for high-throughput screening |
-
2013
- 2013-12-12 CN CN201310673734.1A patent/CN103675287B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1811440A (zh) * | 2006-02-17 | 2006-08-02 | 中国农业大学 | 一种检测伊维菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 |
| CN201233399Y (zh) * | 2007-08-02 | 2009-05-06 | 北京望尔生物技术有限公司 | 阿维菌素类药物elisa检测试剂盒 |
| CN101256188A (zh) * | 2008-04-16 | 2008-09-03 | 北京望尔康泰生物技术有限公司 | 检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒及其应用 |
| CN201993363U (zh) * | 2010-10-27 | 2011-09-28 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 林可霉素elisa检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103675287A (zh) | 2014-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108333344A (zh) | 高灵敏度的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN103675287B (zh) | 一种伊维菌素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 | |
| CN101871936A (zh) | 一种罗丹明b酶联免疫检测方法 | |
| CN101750502A (zh) | 一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒 | |
| CN103487575A (zh) | 细交链孢菌酮酸的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法 | |
| CN101403752A (zh) | 一种加替沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN101776685A (zh) | 检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN101368953A (zh) | 一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN108982482A (zh) | 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN101893636B (zh) | 一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白的酶联免疫检测方法 | |
| CN101315379B (zh) | 一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒及其应用 | |
| CN110426515A (zh) | 一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒及其应用 | |
| US20040161857A1 (en) | Test strip for chromatography and process for producing the same | |
| CN103698504A (zh) | 邻苯二甲酸酯类总量elisa酶联免疫检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN109298178A (zh) | 基于免疫磁珠的心脏肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）时间分辨荧光免疫分析试剂盒 | |
| CN106645043A (zh) | 快速定量检测小分子化合物的试剂盒和方法 | |
| CN105399639A (zh) | 一种酪胺人工抗原和抗体及其制备方法与应用 | |
| CN103645320B (zh) | 一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 | |
| CN1924581A (zh) | 前列腺特异性抗原化学发光定量检测试剂盒 | |
| CN109406784A (zh) | 一种检测微囊藻毒素mc-lr时间分辨荧光免疫定量poct试纸条 | |
| CN101839907A (zh) | 一种苏丹红ⅰ的酶联免疫吸附分析方法 | |
| CN103675286B (zh) | 一种林可霉素化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 | |
| CN104142406B (zh) | 一种稳定的肌钙蛋白i检测试剂盒 | |
| CN107002017A (zh) | 疏水性半抗原分析物的精确测定测量 | |
| CN103822913A (zh) | 邻苯二甲酸二丁酯化学发光酶联免疫检测试剂盒及其使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Shanpu Inventor after: Wu Geli Inventor after: Zhang Kexin Inventor after: Jin Wanxia Inventor after: Zheng Ming Inventor after: Guo Hongwei Inventor after: Du Pingli Inventor before: Wang Shanpu Inventor before: Zheng Ming Inventor before: Guo Hongwei Inventor before: Jin Wanxia Inventor before: Wu Tingcai |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160729 Address after: 471000 Luoyang, Luolong, science and Technology Park, west of Peony Road, No. N3, No. Patentee after: LUOYANG LAIPSON INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD. Patentee after: Luoyang Modern Biotechnology Research Institute Co., Ltd. Address before: 471000 Luoyang, Luolong, science and Technology Park, west of Peony Road, No. N3, No. Patentee before: LUOYANG LAIPSON INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20160822 Granted publication date: 20151125 |
|
| RINS | Preservation of patent right or utility model and its discharge | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20170116 Granted publication date: 20151125 |
|
| RINS | Preservation of patent right or utility model and its discharge | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Shanpu Inventor after: Zheng Ming Inventor after: Guo Hongwei Inventor after: Ren Xuejian Inventor after: Wu Bin Inventor after: Wu Geli Inventor after: Zhang Kexin Inventor after: Li Cuan Inventor after: Du Pingli Inventor after: Zhang Jianming Inventor after: Wu Lei Inventor after: Yang Dan Inventor after: Jin Wanxia Inventor before: Wang Shanpu Inventor before: Wu Geli Inventor before: Zhang Kexin Inventor before: Jin Wanxia Inventor before: Zheng Ming Inventor before: Guo Hongwei Inventor before: Du Pingli |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171120 Address after: 471000 West S8, Kaiyuan Avenue, Luolong District Science Park, Luoyang City, Henan Patentee after: Luoyang Modern Biotechnology Research Institute Co., Ltd. Address before: 471000 Luoyang, Luolong, science and Technology Park, west of Peony Road, No. N3, No. Co-patentee before: Luoyang Modern Biotechnology Research Institute Co., Ltd. Patentee before: LUOYANG LAIPSON INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD. |