CN103645320B - 一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 - Google Patents

一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒，所述试剂盒内的试剂由以下组分组成：发光板、呋喃它酮代谢物标准溶液、呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液、酶标二抗、发光液、样本稀释液和浓缩洗涤液；所述的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液为以呋喃它酮代谢物与牛血清蛋白偶联作为免疫原的Balb-c小鼠免疫抗体，使用时以1:3500的体积比稀释；酶标二抗为呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液，其使用时的稀释比例为1:10000；发光液包括发光底物A和发光底物B两部分。本发明灵敏度高、线性动力学范围宽、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长。

Description

一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，主要涉及一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒。
背景技术
目前检测牛乳中呋喃它酮代谢物抗生素残留的技术主要有以下几种方法：
（1）微生物受阻检测法，我国鲜乳中抗生素残留检验标准(GB4789.27—2003)检测法，七、八十年代国外普遍采用的抑菌圈试验、浑浊度试验，还有目前市场上销售的变色型检测试剂盒均属此类。不同种类指示菌对不同种类抗生素敏感程度不同，选择适当的检测指示菌可以降低检测限，提高检测灵敏度。但是，微生物检测操作费时费力，不适合做大规模的生产。
（2）理化检测法
20世纪90年代以后，绝大多数测定食品中呋喃它酮代谢物类药物残留的理化检测法主要依靠液相色谱技术进行分离，其次是色／质谱联用技术，气相色谱法、高效薄层色谱法等检测法，因其各自特有的性能，在抗生素残留检测方面稍有应用。理化检测法利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，能进行定性、定量分析和药物鉴定，可作为乳中抗生素检测的确证方法。该法检测敏感性较高，但仪器及检测费用高、检测程序复杂、较耗时间等，这些不利因素使该法仅限于实验室乳样测定。
（3）免疫学分析法
目前药物残留免疫分析技术主要分三大类：相对独立的分析方法、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法、免疫受体法。国内该类技术仍处于研究发展中。当前主要是用酶联免疫吸附试验、放射性免疫发光法、荧光免疫法、化学发光法等，酶免与发光相比较，其酶免灵敏度较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、线性动力学范围宽、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长。
本发明实现上述目的采用的技术方案是：一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒，所述试剂盒内的试剂由以下组分组成：发光板、呋喃它酮代谢物标准溶液、呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液、酶标二抗、发光液、样本稀释液和浓缩洗涤液；
所述的发光板上包被有呋喃它酮代谢物-牛卵清蛋白偶联物，发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板；
所述的呋喃它酮代谢物标准溶液共有6瓶，浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL和10ng/mL；
所述的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液为以呋喃它酮代谢物与牛血清蛋白偶联作为免疫原的Balb-c小鼠免疫抗体，使用时以1:3500的体积比稀释；
所述的酶标二抗为呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液，酶标二抗的使用时的稀释比例为1:10000；
所述的发光液包括发光底物A和发光底物B两部分；
发光底物A的制备方法为：配制0.01mol/LPH=8.8的Tris缓冲液，向缓冲液中加入0.01mol/L鲁米诺，混合均匀；发光底物B的制备方法为：同样配制0.01mol/LPH=8.8的Tris缓冲液，然后加入0.001mol/L对碘苯酚，溶解完全后向得到的溶液中加入质量浓度为3/10000的过氧化氢；
所述的样本稀释液为8gNaCl、0.2gKH2P04、22.9gNa2HP04·12H20、0.2gKC1和酪蛋白溶于1000mL蒸馏水中制备得到，其中酪蛋白的质量浓度为1‰；
所述的浓缩洗涤液为80gNaClmol/L、2.0gKH2P04、229.0gNa2HP04·12H20、2.0gKC1和吐温-20溶于1000mL蒸馏水中制备得到，其中吐温-20的质量浓度为5‰，所述浓缩洗涤液在使用时，用蒸馏水稀释10倍；
发光板的制备：将包被抗原溶于包被液中，配成4.5ug/mL的溶液，并向发光板的每个孔中加入100uL，之后先将发光板置于35℃条件下避光孵育30min，再在4℃条件下避光孵育6h，孵育结束后倾去包被液，每孔加入300uL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，洗涤结束后拍干，加入100ul/孔的封闭液，置于37℃条件下孵育110min，孵育结束后倾去孔内液体，每孔加入300uL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，洗涤结束后拍干，用铝箔袋真空密封在4℃下保存。
采用所述的试剂盒检测样品中呋喃它酮代谢物的方法，步骤如下:
a.加样：按照50uL/孔的加入量向发光板中分别加入呋喃它酮代谢物系列标准溶液和样品溶液，然后加入稀释后的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液50uL/孔，室温条件下恒温孵育1h；
b.洗涤：倾出孔中液体，向发光板中加入300uL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复加入洗涤液、静置和拍干三次；
c.加酶标二抗：每孔加入稀释后的呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；室温恒温孵育1h；
d.洗涤：孵育结束后，倾出孔中液体，向发光板中加入300uL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复加入洗涤液、静置和拍干三次，洗涤完成；
e.加发光液：向洗涤完成的发光板中，每孔加入发光液底物A5Oμl、发光液底物B5Oμl，静置1-5min；
f.检测：用化学发光免疫分析仪测定发光板中每孔的发光强度；
g．绘制曲线：依据呋喃它酮代谢物系列标准溶液的浓度和与之对应的各孔的发光强度绘制曲线，根据样品溶液对应的孔的发光强度从曲线中得到样品溶液的浓度。
本发明的有益效果
其一、本发明提供的试剂盒灵敏度高，其灵敏度可达0.1-0.5ng/ml，能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等达不到的检测限，能提高临床检测结果的准确性。
其二、本发明检测的发光板的发光强度在4-6个量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系，这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值)为2.0的范围相比，优势明显。
其三、本发明的发光底物稳定好,光信号持续时间长。
其四、本发明提供的检测方法简便快速，结果稳定、误差小，安全性好及使用期长，免除了使用放射性物质，到目前为止，还未发现其危害性；试剂稳定，保存期可达六个月至一年以上。
附图说明
图1为实施例1得到的标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒，所述试剂盒内的试剂由以下组分组成：发光板、呋喃它酮代谢物标准溶液、呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液、酶标二抗、发光液、样本稀释液和浓缩洗涤液；
所述的发光板上包被有呋喃它酮代谢物-牛卵清蛋白偶联物，发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板；
所述的呋喃它酮代谢物标准溶液共有6瓶，浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL和10ng/mL；
所述的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液为以呋喃它酮代谢物与牛血清蛋白偶联作为免疫原的Balb-c小鼠免疫抗体，使用时以1:3500的体积比稀释；
所述的酶标二抗为呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液，酶标二抗的使用时的稀释比例为1:10000；
所述的发光液包括发光底物A和发光底物B两部分；
发光底物A的制备方法为：配制0.01mol/LPH=8.8的Tris缓冲液，向缓冲液中加入0.01mol/L鲁米诺，混合均匀；发光底物B的制备方法为：同样配制0.01mol/LPH=8.8的Tris缓冲液，然后加入0.001mol/L对碘苯酚，溶解完全后向得到的溶液中加入质量浓度为3/10000的过氧化氢；
所述的样本稀释液为8gNaCl、0.2gKH2P04、22.9gNa2HP04·12H20、0.2gKC1和酪蛋白溶于1000mL蒸馏水中制备得到，其中酪蛋白的质量浓度为1‰；
所述的浓缩洗涤液为80gNaClmol/L、2.0gKH2P04、229.0gNa2HP04·12H20、2.0gKC1和吐温-20溶于1000mL蒸馏水中制备得到，其中吐温-20的质量浓度为5‰，所述浓缩洗涤液在使用时，用蒸馏水稀释10倍；
发光板的制备：将包被抗原溶于包被液中，配成4.5ug/mL的溶液，并向发光板的每个孔中加入100uL，之后先将发光板置于35℃条件下避光孵育30min，再在4℃条件下避光孵育6h，孵育结束后倾去包被液，每孔加入300uL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，洗涤结束后拍干，加入100ul/孔的封闭液，置于37℃条件下孵育110min，孵育结束后倾去孔内液体，每孔加入300uL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，洗涤结束后拍干，用铝箔袋真空密封在4℃下保存。
采用所述的试剂盒检测样品中呋喃它酮代谢物的方法，步骤如下:
a.加样：按照50uL/孔的加入量向发光板中分别加入呋喃它酮代谢物系列标准溶液和样品溶液，然后加入稀释后的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液50uL/孔，室温条件下恒温孵育1h；
b.洗涤：倾出孔中液体，向发光板中加入300uL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复加入洗涤液、静置和拍干三次；
c.加酶标二抗：每孔加入稀释后的呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；室温恒温孵育1h；
d.洗涤：孵育结束后，倾出孔中液体，向发光板中加入300uL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复加入洗涤液、静置和拍干三次，洗涤完成；
e.加发光液：向洗涤完成的发光板中，每孔加入发光液底物A5Oμl、发光液底物B5Oμl，静置1-5min；
f.检测：用化学发光免疫分析仪测定发光板中每孔的发光强度；
g．绘制曲线：依据呋喃它酮代谢物系列标准溶液的浓度和与之对应的各孔的发光强度绘制曲线，根据样品溶液对应的孔的发光强度从曲线中得到样品溶液的浓度。
呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒技术参数的测定：
1、样品前处理
(1)水样将水样经过0.45um的滤膜抽滤，然后加入体积比浓度为0.05%的吐温-20。得到待测样品。
(2)牛奶将牛奶样品在4℃、10000转/分钟离心15分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。
(4)尿样将尿样品在4℃，10000转/分钟离心15分钟，去掉沉淀，将剩余的猪尿用洗涤液稀释成1:10。得到待测样品。
(5)动物组织取样品与4ml0.1mol/L的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20min，然后10000转/分钟离心15min,取上清液用10mol/LNaOH调PH至9.5±0.5，旋涡振荡5min，然后10000转/分钟离心15min。取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000转/分钟离心10min，分出有机相，水相再用异丁醇（每次10mL)萃取两次,三次萃取的有机相合并,50-60℃水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成l:1O的溶液，得到待测样品。
2、检测过程：
申请人选择包被抗原浓度为4.5ug/mL，抗体稀释浓度为1:10000，进行测定：
(1)包被过程：用0.05MPH9.6的碳酸盐缓冲液，将呋喃它酮代谢物的包被抗原配成4.5ug/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100uL,4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300uL/孔，每次5分钟，拍干。（此步简称洗涤，下同）。
(2)封闭过程：用150uL/孔的封闭液封闭上述已包被的发光板，室温孵育2.5小时，洗涤。
(3)竞争过程：加稀释抗体（1:3500)50uL/孔与不同浓度的药物50uL/孔于上述已封闭的反应孔中，室温孵育1小时，洗涤。
(4)酶标过程：于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体(1:10000)100uL/孔，室温孵育1小时，洗涤。
(5)发光过程：每孔加入发光液底物A5Oμl、发光液底物B5Oμl
(6)计算过程：
取标准品浓度对数做横坐标,标准品检测发光值对数做纵坐标,做标准曲线,每一个样品的浓度可以从标准曲线上计算出来。
经检测，本实施例测得的发光值如表1所示：
表1：
采用上述数据进行作图描线，得到如附图1所示，绘图得到的直线为y=-1.0146x+4.6668，R2=0.9982。

Claims (2)

1.一种呋喃它酮代谢物化学发光酶联免疫快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内的试剂由以下组分组成：发光板、呋喃它酮代谢物标准溶液、呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液、酶标二抗、发光液、样本稀释液和浓缩洗涤液；
所述的发光板上包被有呋喃它酮代谢物-牛卵清蛋白偶联物，发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板；
所述的呋喃它酮代谢物标准溶液共有6瓶，浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL和10ng/mL；
所述的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液为以呋喃它酮代谢物与牛血清蛋白偶联作为免疫原的Balb-c小鼠免疫抗体，使用时以1:3500的体积比稀释；
所述的酶标二抗为呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液，酶标二抗的使用时的稀释比例为1:10000；
所述的发光液包括发光底物A和发光底物B两部分；
发光底物A的制备方法为：配制0.01mol/LpH=8.8的Tris缓冲液，向缓冲液中加入0.01mol/L鲁米诺，混合均匀；发光底物B的制备方法为：同样配制0.01mol/LpH=8.8的Tris缓冲液，然后加入0.001mol/L对碘苯酚，溶解完全后向得到的溶液中加入质量浓度为3/10000的过氧化氢；
所述的样本稀释液为8gNaCl、0.2gKH2P04、22.9gNa2HP04·12H20、0.2gKC1和酪蛋白溶于1000mL蒸馏水中制备得到，其中酪蛋白的质量浓度为1‰；
所述的浓缩洗涤液为80gNaClmol/L、2.0gKH2P04、229.0gNa2HP04·12H20、2.0gKC1和吐温-20溶于1000mL蒸馏水中制备得到，其中吐温-20的质量浓度为5‰，所述浓缩洗涤液在使用时，用蒸馏水稀释10倍；
发光板的制备：将包被抗原溶于包被液中，配成4.5μg/mL的溶液，并向发光板的每个孔中加入100μL，之后先将发光板置于35℃条件下避光孵育30min，再在4℃条件下避光孵育6h，孵育结束后倾去包被液，每孔加入300μL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，洗涤结束后拍干，加入100μL/孔的封闭液，置于37℃条件下孵育110min，孵育结束后倾去孔内液体，每孔加入300μL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，洗涤结束后拍干，用铝箔袋真空密封在4℃下保存。
2.采用如权利要求1所述的试剂盒检测样品中呋喃它酮代谢物的方法，其特征在于：步骤如下:
a.加样：按照50μL/孔的加入量向发光板中分别加入呋喃它酮代谢物系列标准溶液和样品溶液，然后加入稀释后的呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液50μL/孔，室温条件下恒温孵育1h；
b.洗涤：倾出孔中液体，向发光板中加入300μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复加入洗涤液、静置和拍干三次；
c.加酶标二抗：每孔加入稀释后的呋喃它酮代谢物-辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；室温恒温孵育1h；
d.洗涤：孵育结束后，倾出孔中液体，向发光板中加入300μL/孔的洗涤液，静置5min后拍干，重复加入洗涤液、静置和拍干三次，洗涤完成；
e.加发光液：向洗涤完成的发光板中，每孔加入发光液底物A50μL、发光液底物B50μL，静置1-5min；
f.检测：用化学发光免疫分析仪测定发光板中每孔的发光强度；
g．绘制曲线：依据呋喃它酮代谢物系列标准溶液的浓度和与之对应的各孔的发光强度绘制曲线，根据样品溶液对应的孔的发光强度从曲线中得到样品溶液的浓度。
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