CN102809651A - 肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：CK-MB抗体包被板、CK-MB抗体酶结合物、CK-MB校准品、CK-MB质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。另外本发明还公开了一种肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。

Description

肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肌酸磷酸激酶(Creatine Kinase,CK)是由脑型亚单位（B）和肌型亚单位（M）组成的二聚体，有CK-MM、CK-MB和CK-BB三种同工酶，CK大量存在于心肌、骨骼肌和脑等组织，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，其中CK-BB主要存在于大脑、前列腺、肠、肺；骨骼肌中存在大量的CK-MM和少量的CK-MB；而心肌组织虽以CK-MM为主，但CK-MB所占比例远较其他组织高。

目前，心肌损伤、心肌梗塞和急性心肌梗死（AMI）已经成为威胁人类生命的主要疾病之一，心肌是唯一含CK-MB较多的器官，CK-MB是心肌类疾病早期诊断的重要指标。正常人血清中CK-MM占94%～96%，CK-MB仅占5%以下，若血清中CK-MB明显增高，说明心肌受累，一般认为当血清中CK-MB大于总活性的6%以上为心肌损伤的特异性指标。另外，CK-MB诊断透壁型心肌梗死的敏感性和特异性均极高，在起病4h后CK-MB含量增高，在16～24小时后达高峰，3～4天恢复正常。若CK-MB在急性心肌梗死（AMI）后仍保持在高水平，则意味着心肌坏死还继续进行；若恢复正常后再次升高，提示原梗死部位扩展或有新的梗死出现，由于半衰期短，CK-MB和亚型在监测再发损伤中比肌钙蛋白更为敏感；其增高的程度能较准确地反映梗死的范围；其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治疗是否成功。单独进行检测，CK-MB是很理想的标志物；与心肌肌钙蛋白进行联合检测，更有助于提高AMI的诊断阳性率。

目前，临床领域应用的CK-MB检测方法主要有电泳、放射性免疫法、免疫抑制法、酶联免疫测定法和化学发光免疫测定法等。电泳法和免疫抑制法均会受到溶血和巨CK的干扰，此外，免疫抑制法还受CK-BB的干扰，使这两种检测方法的应用受到了限制；酶联免疫测定法由于存在敏感性相对较低，所用标记酶与底物可定量测定范围窄、仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应用；放射性免疫由于存在试剂有效期短、操作繁琐、放射性污染等缺点，使其应用受到了限制。

化学发光免疫技术的研究起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为敏感的微量免疫测定法。主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样本无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化成度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等，因而得到了迅速发展与应用。但目前使用化学发光方法检测CK-MB还没有广泛应用在临床上，也未见相关文献的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供血肌酸磷酸激酶(Creatine Kinase,CK)的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：CK-MB抗体包被板、CK-MB抗体酶结合物、CK-MB校准品、CK-MB质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。

所述的肌酸磷酸激酶同工酶抗体包被板为包被有CK-MB抗体的96孔或48孔白色微孔板，孔间平均变异不高于10%。

所述的抗体酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶，纯度要求RZ≥3.0，活性≥250U/mL，购自Sigma公司。

所述的CK-MB抗体购自Fitzgerald公司，浓度与标示浓度相差≤10%，效价不低于10⁵倍稀释。

所述的CK-MB质控品包括低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其中低值质控品的浓度范围是8～12ng/mL，高值质控品的浓度范围是120～180ng/mL。

所述的肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，所述的发光液A液包含0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚；B液是浓度为0.675g/L过氧化脲的水溶液。

所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300。

上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）CK-MB抗体包被板制备

将CK-MB抗体用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4 PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃；

2）辣根过氧化物酶标记CK-MB抗体，得CK-MB抗体酶结合物

用高碘酸钠氧化法制备CK-MB抗体-HRP酶结合物，并在酶结合物中加入酶结合物稳定剂，于-20℃下储存；

3）CK-MB校准品

将CK-MB用校准品稀释液，稀释成不同浓度的校准品，浓度分别为0,5,25,100,250,500ng/mL；

4）CK-MB质控品的配制：在正常人血清中加入适量的CK-MB纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为10ng/mL和150ng/mL；

5）配制发光液A液和B液

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；

6）配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300；

7）组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

ProClin 300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin 300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。

肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）定量检测试剂盒（化学发光法）是基于微孔板双抗体夹心原理的化学发光免疫分析，在本专利中使用了两株在CK-MB分子上有着不同结合位点的特异性抗体，首先采用一株特异性CK-MB抗体包被发光板，加入待检样本和辣根过氧化物酶（HRP）标记的另一株CK-MB抗体后，若样本中含有CK-MB，则形成固相抗体-CK-MB-抗体-HRP复合物。反应后洗涤，除去未结合的酶联抗体。然后加入发光液，测定光信号，光信号强度与样本中的CK-MB含量成正比。根据本产品中已知浓度的系列校准品及其对应的光信号强度作出标准曲线，可计算出样本中的CK-MB含量。

本专利发明的肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）化学发光免疫定量测定试剂盒，采用当今最为灵敏的检测方法——化学发光免疫分析，具有以下优点：（1）反应快速，可在30分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.5ng/mL。（3）特异性强，与肌酸磷酸激酶同工酶MM（CK-MM）、肌酸磷酸激酶同工酶BB（CK-BB）的交叉特异性均小于1%。（4）精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20%。（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2~8℃可存放1年。（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，适用于临床常规检测。

附图说明

图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定CK-MB与放免试剂盒测定CK-MB的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的CK-MB值，横坐标为放免试剂盒测定CK-MB值，两种方法相关系数（r）=0.9528，直线方程y=1.0098x+0.2187。

具体实施方式

实施例1：制备肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）化学发光免疫定量检测试剂盒

肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB）化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：CK-MB抗体包被板、CK-MB抗体酶结合物、CK-MB校准品、CK-MB质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。

通过下述方法制备肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒

1）CK-MB抗体包被板的制备：将CK-MB抗体用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃；

2）CK-MB抗体酶结合物的制备：采用高碘酸钠氧化法制备CK-MB抗体-HRP酶结合物。

3）CK-MB校准品

将CK-MB用校准品稀释液，稀释成不太浓度的校准品，浓度分别为0,5,25,100,250,500ng/mL。

4）CK-MB质控品的配制：在正常人血清中加入适量的CK-MB纯品，配制低值质控品（QcL）和高值质控品（QcH），其浓度的平均值分别为10ng/mL和150ng/mL；

5）配制发光液A液和B液

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液为；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；

6）配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/LTween-20，1g/LProclin300；

7）组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定

说明：

物理检查：在外观上液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。

企业校准品的配制：将高纯度的CK-MB用校准品稀释液（含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）配成系列浓度的校准品，浓度分别为0,5,25,100,250,500ng/mL，储存于-20℃。

分析灵敏度：分析灵敏度不高于0.5ng/mL。

精密度：批内不精密度（CV%）应不高于15.0%；批间不精密度（CV%）应不高于20.0%。

质控品测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用双对数数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为8～12ng/mL和120～150ng/mL。

特异性：交叉反应应符合下表要求。

稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上各项的要求。

实施例2：制备CK-MB化学发光免疫定量检测试剂盒

除固相载体为48孔的白色微孔板外，以与实施例1一样的方法制备本发明试剂盒。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

1)将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。

2)配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。

3)配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A液与B液等体积混合。

4)取出适量的包被板条。设置空白对照1孔，校准品各2孔、质控品各10孔。每孔加入CK-MB校准品、质控品、样本各20μL，空白对照不加校准品、质控品和样本。

5)每孔加入CK-MB酶结合物100μL，空白对照孔除外。

6)振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。

7)吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，吸出或倒出洗液后拍干，也可用洗板机洗涤。

8)每孔加入发光液100μL，包括空白对照孔。

9)室温（18~25℃）下暗置5min，在化学发光免疫分析仪上测定发光值，然后采用双对数数学模型拟合，得到校准品剂量-反应曲线，样本中的CK-MB浓度与RLU之间的关系成正比，可从上述剂量-反应曲线上反推算出样本中CK-MB的浓度值。

实施例4本试剂盒的临床试验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数232例，先以CK-MB放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，并对测定结果进行了配对t检验、线性相关性分析及卡方检验。结果表明，直线方程为Y=1.0098X+0.2187，线性回归系数为1.0098，相关系数为0.9528。线性回归系数为1.0098接近于1，说明我们的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α=0.05），P<0.001，两种方法测定的CK-MB值密切相关，两种方法测定的CK-MB值密切相关。灵敏度（真阳性率）为96.04%、特异性（真阴性率）为100.00%，都比较高；而假阳性率（误诊率）为0.00%、假阴性率（漏诊率）为3.96%，都比较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性为98.28%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。

为了确定本试剂盒的临床参考值，对498份血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）(0~95%)为：0~7.0ng/mL。

上述参考值仅供参考，建议各实验室应建立自己的临床正常及病理值范围。在临界值附近的样本应进行第二次试验确认，并进行双孔测定；超出本试剂盒线性范围的样本，是通过校准曲线外延得出的计算结果，要得到准确的结果，需将样本稀释后进行测定。

Claims (9)

1.肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：CK-MB抗体包被板、CK-MB抗体酶结合物、CK-MB校准品、CK-MB质控品、20倍浓缩洗液、发光液A液和B液。

2.根据权利要求1所述的肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的肌酸磷酸激酶同工酶抗体包被板为包被有CK-MB抗体的96孔或48孔的白色微孔板，白色微孔板的孔间平均变异不高于10%。

3.根据权利要求1所述的肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体酶结合物所用的酶为辣根过氧化物酶，纯度要求RZ≥3.0，活性≥250U/mL。

4.根据权利要求1所述的肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的CK-MB抗体购自Fitzgerald公司，浓度与标示浓度相差≤10%，效价不低于10⁵倍稀释。

5.根据权利要求1所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于CK-MB质控品包括低值质控品和高值质控品，其中低值质控品的浓度范围是8～12ng/mL，高值质控品的浓度范围是120～180ng/mL。

6.根据权利要求1所述的肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液包含0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚；B液包含0.675g/L过氧化脲。

7.根据权利要求1所述的肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的20倍浓缩洗液包括75.5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/LTween-20，1g/LProclin300。

8.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）CK-MB抗体包被板的制备

将CK-MB抗体用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到白色微孔板中，37℃包被2小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃；

2）采用高碘酸钠氧化法将辣根过氧化物酶和CK-MB抗体连接在一起，得CK-MB抗体酶结合物，并加入酶结合物稳定剂，于-20℃下储存；

3）CK-MB校准品

将高纯度的CK-MB用校准品稀释液稀释成浓度分别为0,5,25,100,250,500ng/mL的校准品；

4）CK-MB质控品的配制：在正常人血清中加入适量的CK-MB纯品，配制低值质控品和高值质控品，其浓度的平均值分别为10ng/mL和150ng/mL；

5）配制发光液A液和B液

A液是含有0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚的pH8.6的5mmol/LTris·HCl缓冲液为；B液是浓度为0.675g/L的过氧化脲水溶液，用工艺用水配制；

6）配制20倍浓缩洗液

20倍浓缩洗液的配方如下：75.5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/LTween-20，1g/LProclin300；

7）组装

将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品测定值和稳定性进行测定。

9.根据权利要求8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的包被板为包被有CK-MB抗体的96孔或48孔白色微孔板。

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