CN1854737A

CN1854737A - 心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒

Info

Publication number: CN1854737A
Application number: CN 200510025494
Authority: CN
Inventors: 穆海东
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2006-11-01

Abstract

本发明涉及心血管疾病的诊断和预测的八项指标集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒。所述的反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12－200个样本孔，5－8个标准品孔，其中，每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗CRP(C－反应蛋白)，抗Myoglobin(肌红蛋白)，抗cTnI(心肌肌钙蛋白I)，抗cTnT(心肌肌钙蛋白T)，抗NT－proBNP(N－末端脑利钠肽)，抗CK－MB(肌酸激酶同工酶－MB)，抗H－FABP(心型脂肪酸结合蛋白)和抗GPBB(糖原磷酸化酶同工酶BB)等八种抗体的微点阵。本发明的反应板和试剂盒可简便、快速、准确地实现多个人份的心血管疾病的诊断和预测八项指标的同时检测。

Description

心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒

技术领域

本发明属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种适于心血管疾病的诊断，预测和预后的八项指标(CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，FABP和GPBB)集成检测的反应板和试剂盒

背景技术

心血管疾病包括心脏和血管系统疾病。20世纪以来，随着人类社会文明的进步，医学技术得到大幅度发展，感染性疾病逐步得到控制。而经济的发展，人们生活水平和生活方式的改变，使人类疾病谱也发生了显著变化，即转向慢性非传染性疾病为主向的改变。其中心血管疾病在西方国家已逐步成为引起死亡的主要病因，由心血管疾病引起的死亡人数约占世界总死亡人数的1/4，被称为人类健康的“头号杀手”，严重威胁人类的生命和生活质量，造成巨大的人力和经济资源的浪费。因此建立一套可以准确、快速、方便地预测和诊断心血管疾病的检测系统已迫在眉睫。

目前最常见的心血管疾病是冠状动脉粥样硬化性心脏病。冠状动脉粥样硬化性心脏病简称为冠心病，是由冠状动脉粥样硬化导致的管腔阻塞所引起，并进一步导致心肌缺血、缺氧所引起的心脏组织坏死以及冠状动脉功能性改变。

大量的研究表明冠状动脉粥样硬化本身是一个炎症的过程，持续的低水平的炎症预示着心血管疾病发生的可能性。目前在炎症指标中，C-反应蛋白(high sensitivity-CRP(hs-CRP))对心血管，脑血管以及外周血管疾病有着最好的预测及预后效果。

当冠心病发作时，心肌的缺血缺氧所导致的心肌损伤，会使得一些心肌细胞蛋白被释放入血，这些指示蛋白对冠心病的诊断有着及其重要的意义。目前，医院检测冠心病最为常用的指标是CK-MB，但它的地位正被cTnI和cTnT这两个同时具有高灵敏度和高特异性的“金指标”所取代。但这两个指标释放入血的时间相对较晚，因此还需要Myoglobin，FABP和GPBB这三个指标的配合来进行早期的诊断。

除了冠心病以外，充血性心力衰竭也是一种常见的心血管疾病，NT-proBNP是诊断这种疾病的最灵敏和有效的指标。

目前对心血管疾病的诊断和预测主要是对单个指标进行检测，费时费力。本发明通过对八个指标的快速检测实现对心血管疾病的发生和发展进行全面的预测，诊断及预后，对心血管疾病的预防和治疗有着重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同时对心血管疾病进行预测，诊断和预后判断的方法。我们的试剂盒通过检测血清或血浆中的CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，FABP和GPBB这八项指标，来达到这一目的。

在本发明的第一方面，提供了一种心血管疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12-200个样本孔，5-8个标准品孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。

在一优选例中，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

在另一优选例中，所述样本孔的数量为4-195个。

在另一优选例中，所述的抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体在固相载体上各有2个点样点。

在另一优选例中，所述反应孔每孔设有一个定位基准点。

在本发明的第二方面，提供了一种心血管疾病的诊断和预测八项指标集成检测试剂盒，它包括本发明上述的心血管疾病的诊断和预测六项指标集成检测反应板。

在另一优选例中，还包括：酶标工作液、检测液和标准品。

在另一优选例中，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。

在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

附图说明

图1是本发明一种固相载体上心血管疾病检测的八项指标的点样示意图

图2，图3是本发明的反应孔中进行的各抗原——抗体反应的示意图

具体实施方式

心血管疾病八项指标集成检测的关键是要使八项指标检测的灵敏度和特异性均达到要求以保证结果的准确可靠，而相应的难点是如何将浓度差高达10000倍的各检测指标整合到一个孔里来检测。经过深入而广泛的研究，本发明采用两种不同的反应方式进行检测，并对检测反应板作了改进，同时本发明采用的微点阵检测技术，酶免疫间接法和化学发光检测技术，大大提高了检测的灵敏度和特异性，从而解决了上述问题。

具体而言，为提高心血管疾病八项指标(CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，FABP和GPBB)的检测效率，本发明应用微点阵检测技术，结合酶免疫间接法和化学发光检测技术设计了一种心血管疾病八项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12-200个样本孔，5-8个标准品孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部平面上有固相载体，且在固相载体上包被着抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体的微点阵。

各反应孔的数量没有特别限制，通常样本孔为12-200个，较佳地5-50个。标准品孔3-10个，较佳地5-8个。

在本发明中，反应孔的形状和大小没有特别限制，可以是圆形、方形、六角形、椭圆形、或其他形状。大小通常为直径0-5-5cm，深度为0.5-2cm。

在本发明中，反应板基板的材料可以选用本领域常用的各种材料，较佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。

在本发明中，包被心血管疾病抗体的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)：玻璃片、塑料、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，较佳的固相载体包括NC膜、PDVF膜。

在固相载体上，各有抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体1-3个点样点，较佳地2个点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。各点样点之间的距离通常为0.1-5mm。

另一方面，本发明还提供了一种心血管疾病八项指标集成检测蛋白芯片试剂盒，该试剂盒可实现多指标并行化、微型化、高通量检测。它包括本实用新型的反应孔板、洗涤液、酶标工作液、检测液(A、B)、标准品等。其中，酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，使用前混合。

在本发明中，各指标的检测采用酶免夹心法或竞争法，检测原理如图2夹心法和图3竞争法所示。详细叙述如下：

1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。封闭，除去未结合的位点。

2)加受检血清和酶标溶液，酶标溶液包含八项检测指标的相应的酶标抗体(夹心法)或酶标抗原(竞争法)。对于采用夹心法检测的指标，特异的酶标抗体(图示为

)与血清中的抗原(图示为 )形成复合物，并进一步与固相抗体(图示为 )形成双抗夹心复合物。对于采用竞争法检测的指标，特异的酶标抗原(图示为

)与血清中的抗原(图示为

)竞争性地与固相抗体(图示为

)结合，形成抗原抗体复合物。

3)洗涤除去未结合的抗体，抗原及杂质。

4)加底物：固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度与标本中受检抗原的量呈正相关(夹心法)或负相关(竞争法)。

本发明巧妙地综合利用了蛋白质微点阵检测技术，酶免疫夹心法和竞争法，以及化学发光检测技术，实现了心血管疾病八项指标的同时检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

检测反应板的制备

取48孔板，设置42个样本孔，6个标准品孔。在每个反应孔的底部放置一固相载体(NC膜或PDVF膜)，且在固相载体上包被着抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体的蛋白质微列阵(图1)。

实施例2

试剂盒制备

制备含一心血管疾病八项指标集成检测的试剂盒，它含有实施例1的反应孔板一块(24-48人份)，洗涤浓缩液1瓶，酶标工作液1瓶，检测液A一瓶，检测液B一瓶，标准品瓶。

洗涤浓缩液、酶标工作液、检测液A、检测液B

实施例3

心血管疾病八项指标集成检测

按以下方法对各测试血请样品进行检测：

1.加检测血请或标准品于相应反应孔内，75ul/孔。

2.加酶标工作液，75ul/孔。

3.37℃保温振荡反应60分钟。

4.用洗液洗涤4-6次，每次2分钟，振动。

5.加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于孔的底部。

6.CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。

结果判定：

依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样品血清的阴阳性。

与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

Claims

1.一种心血管疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板，其特征在于，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括12-200个样本孔，5-8个标准品孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。

2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

3.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述样本孔的数量为4-195个。

4.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的抗CRP，抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八种抗体在固相载体上各有2个点样点。

5.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，在每一反应孔内还设有一定位基准点。

6.一种心血管疾病的诊断和预测八项指标集成检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的心血管疾病的诊断和预测八项指标集成检测反应板。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括：酶标工作液，检测液和标准品。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。