CN102257392A

CN102257392A - 预防心力衰竭的方法

Info

Publication number: CN102257392A
Application number: CN2009801518903A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·A·马尔丘克; 霍华德·A·罗克曼; 费林·C·惠勒
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2011-11-23
Also published as: WO2010062365A2; WO2010062365A3; CA2741887A1; US20110288149A1; EP2347262A2; EP2347262A4; JP2012507713A

Abstract

本发明总体而言涉及心力衰竭，并且具体而言涉及一种降低心力衰竭风险的方法，特别是对于已确诊为心肌病的患者而言。

Description

预防心力衰竭的方法

本申请要求提交于2008年10月31日的美国第61/110,323号临时申请的优先权，其全部内容以参照的方式并入于此。

本发明在政府的资助下完成，由美国国家卫生研究院授予的批准号为R01HL083155、R01 HL68963和5 F32HL079863。政府对于本发明拥有特定的权利。

技术领域

本发明总体而言涉及心力衰竭，具体而言涉及降低心力衰竭风险的方法，特别是对于已确诊为心肌病的患者而言。

背景技术

造成心脏病的发展和严重性的遗传因素很难被识别，很大程度上是因为人群中临床结果的规范化带来的挑战。因此，正向遗传学方法在识别新型药物作用靶点方面仅取得了有限的成就。

肌集钙蛋白(CSQ)转基因小鼠的心肌病模型(Jones et al，J.Clin.Invest.101：1385-1393(1998)，Cho et al，J.Biol.Chem.274：22251-22256(1999))在依赖于遗传背景的表型发展方面显示出很大的差异(Suzuki et al，Circulation 105：1824-1829(2002)，LeCorvoisier et al，Hum.Mol.Genet.12：3097-3107(2003))。使用CSQ转基因致敏原的数量性状基因定位(QTL)已获得了七种缓和疾病进展和结果的心力衰竭修饰基因(Hrtfm)位点(Suzuki et al，Circulation 105：1824-1829(2002)，Le Corvoisier et al，Hum.Mol.Genet.12：3097-3107(2003)，Wheeler et al，Mamm.Genome 16：414-423(2005))。在两种不同杂交体中定位的Hrtfm2(Suzuki et al，Circulation 105：1824-1829(2002)，Wheeler et al，Mamm.Genome 16：414-423(2005))占存活者中表型变异数的28～30％，并占心功能中变异数的22～42％。

本发明至少部分源于将Tnni3k(心肌肌钙蛋白I相互作用激酶)作为Hrtfm2的基础基因的识别。

发明内容

本发明总体而言涉及心力衰竭。更具体而言，本发明涉及预防和/或降低患有心肌病的患者的心力衰竭危险性的方法。本发明还涉及识别适合在为预防心力衰竭而设计的治疗策略中使用的药剂的方法，特别是对于已确诊为心肌病的患者而言。

根据后面的描述，本发明的目的和优点将会更加清楚。

附图说明

图1A～图1C：Tnni3k mRNA和蛋白表达在各小鼠品系之间变化明显。(A)Affymetrix基因芯片分析在小鼠3号染色体上仅识别出一种在B6、AKR和DBA之间具有明显表达变化的基因。示出了两种侧接于Tnni3k的基因(Cryz和Lrrc44)，它们在所有品系中以类似的水平表达，还示出了两种对照基因Actb(β-actin)和Gapdh。(B)qRT-PCR确认了通过基因芯片分析识别的表达差异。来自于每一品系的5只野生型小鼠心脏的Tnni3k的TaqMan qRT-PCR确认了在B6和AKR中的转录水平比DBA高(大约为25倍)(^**p＞0.0001以及^*p＞0.001)。来自于Hrtfm2同类系并且在DBA遗传背景的Tnni3k位点上包藏有AKR等位基因(DBA.AKR-Hrtfm2)的三个心脏显示出与B6和AKR心脏类似的转录水平，其明显高于在DBA心脏中观测到的水平(^**p＞0.0001)。Actb作为内源对照。误差线指示出平均数标准误差(SEM)。(C)蛋白质印记分析表明，三种在Tnni3k处共为DBA单倍型的品系未显示出可检测到的Tnni3k蛋白，而三种具有B6单倍型的品系显示出中等至较高的表达水平。如基于RNA表达所预期的那样，DBA.AKR-Hrtfm2同类小鼠显示出高的表达水平。将在心脏中显示出中等表达水平的受体酪氨酸激酶Tek(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/)用作蛋白负荷对照(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)。

图2：来自Tnni3k基因组区域的编码和代表性非编码多态SNP显示出两个不同的单倍型组。这两种SNP单倍型与Tnni3k转录水平相关。第1组(DBA、C3H和Balb/c)显示出低水平的Tnni3k，而第2组(B6、AKR和129Sv)显示出高水平的Tnni3k。

图3：对C末端小鼠Tnni3k肽进行了多克隆抗体的蛋白质印记分析。对照印记表明，来自293T细胞的裂解物用小鼠Tnni3k表达载体或空载体对照瞬时转染。Tnni3k蛋白在阳性对照裂解物中可见，尺寸如所预期的那样为大约90kDa。还示出了来自DBA、AKR和B6小鼠的心脏裂解物。DBA并未显示出Tnni3k蛋白，而AKR和B6显示出强劲的蛋白表达水平。

图4A～图4D：来自DBA小鼠的心脏中的Tnni3k异常拼接。(A)测序谱图显示出来自B6和DBA心脏的Tnni3k cDNA中的外显子19-20的边界。虚线显示出源自内含子19的4核苷酸cDNA插入物(GTTT)的第一个碱基。可看到DBA中正确拼接的转录物的一小部分与虚线之后的序列重叠。(B)具有侧接内含子序列以及B6(第1位点/正常)和DBA(第2位点/异常)氨基酸编码的外显子19和20的序列。4核苷酸GTTT插入物以粗体示出。(C)使用荧光片段分析(GeneMapper，Applied Biosystems)以确定DBA中异常拼接的百分比。DBA中几乎70％的总信息被误拼接，而在B6和AKR中没有观察到异常拼接。(D)使用简单加法数学模型(Staden，Nucleic Acids Res.12：505-519(1984)，Burset et al，Nucleic Acids Res.28：4364-4375(2000))来计算不同拼接供体位点的权重矩阵打分。示出了各种供体位点的算出的强度。

图5A和图5B：rs57952686处的序列是异常Tnni3k拼接的原因。使用体外体系来测试内含子19SNP(rs57952686)在外显子19和20之间异常拼接的作用以及在DBA中与在B6中的对比。(A)用于测试异常拼接的Tnni3k外显子18-20体外拼接构造体的示意图。将来自于DBA和B6，包括外显子18、19和20的基因组片段(4kb)扩增并克隆到pSPL3拼接载体中。此外，利用定位诱变来改变各构造体中rs57952686处的序列。将拼接构造体转染到293T细胞中，48小时后收获RNA。(B)对Tnni3k拼接的分析揭示出，体外DBA构造体的异常拼接与野生型DBA心脏中的拼接非常相似，但B6的体外构造体中没有异常转录。当内含子19中的+9位的关键核苷酸在各构造体之间交换时，拼接模式遵循SNP处的序列，表明rs57952686处的序列是拼接缺陷的原因。

图6A和图6B：无义介导的衰变是降低的Tnni3k转录水平的原因。用吐根碱或放线菌酮来处理HL-1心肌细胞以阻塞NMD。从处理24小时后的细胞中分离出RNA。利用荧光RT-PCR片段分析来测定异常对野生型转录物的比率，并利用qRT-PCR来确定相对于actb的Tnni3k信息水平。将模拟处理的细胞作为对照。(A)吐根碱和放线菌酮的处理都很好地提高了异常拼接信息相对于正常拼接信息的水平(^*p＞0.01)。(B)吐根碱和放线菌酮的处理都将Tnni3k信息的总水平提高到模拟处理细胞的大约16倍高(^**p＞0.001)。

图7A和图7B：当同类系与来自AKR系的Hrtfm2位点的杂交产物与CSQ转基因致敏原系(C+)杂交时，与杂交至转基因致敏原的DBA相比，显示出降低的心脏功能。与DBA小鼠相比，同类小鼠中的左心室舒张和收缩直径增加了。这导致了同类系中降低的缩短分数。DBA系未表达出可检测到的Tnni3k蛋白，而同类系表达出大约为可见于AKR的1/2的水平。这些数据显示出，与未表达出可检测到的蛋白的品系相比，小鼠Tnni3k表达的天然水平导致很差的心脏功能。

图8：中等或较高读数的TNNI3K表达引起CSQ转基因心肌病模型的过早死亡。Kaplan-Meier存活率图示出了由TNNI3K(T)和CSQ(C)转基因动物之间的杂交以及同类Hrtfm2系(描述于图2)和CSQ(C)转基因系之间的杂交产生的不同基因型组的结果——结果是来自AKR(1/2同类)的Hrtfm2位点的仅一个副本。对于与转基因系的杂交，双阳性转基因(T+/C+)的存活率在15～21天的范围内严重降低至17天的平均水平。几乎所有具有其他基因型的小鼠，包括两种单阳性(T+/C-，T-/C+)，在150天的终点过后都很好地存活。T+/C+的存活率与其他三组相比明显降低(p＜0.00001)。对于含有Hrtfm2的AKR基因组片段的同类动物与CSQ转基因动物的杂交，小鼠还显示出与对照相比降低了的存活率。Tnni3k在这些小鼠中的表达水平为在B6或AKR中的1/2，并且与Tnni3k转基因动物相比大约低至1/5～1/20。每组中的动物数量如下：T+/C+，n＝12；T+/C-，n＝18；T-/C+，n＝14；T-/C-，n＝18，1/2同类/C+，n＝8。

图9A和图9B：对C末端人TNNI3K肽进行了多克隆抗体的蛋白质印记分析。(A)对照印记表明，来自293T细胞的裂解物用人TNNI3K表达载体或空载体对照瞬时转染。TNNI3K蛋白仅在TNNI3K裂解物中可见，尺寸如从蛋白序列预期的那样为大约90kDa。(B)用来自几种TNNI3K转基因小鼠的心脏裂解物进行蛋白质印记。来自三种系的动物通过基因分型测试为转基因阳性(系9、系23和系26)。还示出了通过蛋白质印记，来自三代系9和两代系26的小鼠测试为转基因TNNI3K蛋白阳性。对于每一代都检查了心脏裂解物，以保证转基因蛋白的持续表达。转基因转录物的SYBR绿色qRT-PCR分析表明，TNNI3K转基因小鼠中的TNNI3K转基因表达水平在B6心脏RNA中测得的内源Tnni3k的5～20倍高的范围内。

图10A和图10B：TNN13K表达导致CSQ转基因心肌病模型中的收缩功能严重受损。对来自于TNNI3K和CSQ转基因动物之间的杂交的14日龄小鼠做了M型超声心动图。(A)代表性超声心动图表明，双阳性转基因小鼠显示出严重的左心室收缩功能障碍和腔扩张。如在疾病发展的初期所预期的那样，TNNI3K-/CSQ+动物仅显示出低水平的扩张，而TNNI3K+/CSQ-和TNNI3K-/CSQ-动物显示出正常的心脏功能。(B)来自四种可能基因型的小鼠的超声心动图数据表。示出了LVEDd、LVEDs、心率、缩短分数(FS)和mVCFc。在第14天，仅有两只双转基因小鼠在自觉超声心动图过程中存活；另外三只在该过程中死亡。对于在该过程中存活的两只小鼠的各自的数据单独示出。对于T-/C-、T+/C-和T-/C+组，数据由平均数±S.D表示。

图11A和图11B：TNNI3K表达导致手术引发的心肌病模型中的收缩功能障碍。在横向主动脉缩窄(TAC)之前并在TAC手术后4周和8周时做超声心动图。在TAC后4周和8周时比较了TNNI3K+小鼠(n＝11)和TNNI3K-同窝出生崽(n＝13)之间的LVEDs(A)和FS(B)。在4周和8周时，TNNI3K+小鼠中的LVEDs明显更高，但在手术前没有明显的统计差异。同样，在手术后4周和8周时，TNNI3K+小鼠中的缩短分数均明显降低了。误差线代表平均数标准误差(SEM)。

图12：人Tnni3k的氨基酸序列和编码该蛋白质的核酸序列。

图13：使用抗TNNI3K的抗体(红色)和其他肌节蛋白对TNNI3K转基因小鼠的心脏切片进行联合免疫染色。对于肌球蛋白，TNNI3K显示出相反的染色图案(绿色)。TNNI3K染色与纤维型肌动蛋白(鬼笔环肽，绿色)部分重叠，并且在纵向切片中与肌节Z-盘状(Z-disc)蛋白肌间线蛋白(绿色)专门地共局部化。在横截面中，TNNI3K在肌间线蛋白环状结构内部局部化。每条线代表5μm。

图14：使用抗小鼠TNNI3K的抗体(红色)和肌间线蛋白(绿色)对来自于C57BL/6J和DBA/2J近交系小鼠的心脏切片进行联合免疫染色。与先前的qRT-PCR和蛋白质印记的结果一致(Wheeler et al，PLoS Genet.Sep；5(9)：e1000647(2009).Epub 2009 Sep 18)，TNNI3K Z-盘状蛋白表达图案仅发现于C57BL/2J小鼠，而未见于DBA/2J小鼠。还在细胞核周围发现TNNI3K(箭头指向)。

具体实施方式

本发明至少部分源于下述研究，该研究表明，Tnni3k的水平是小鼠心肌病模型中心脏疾病进展率的主要决定因素(见如下实施例)。该研究还表明，为缓和疾病进展还需要Tnni3k的激酶活性。本发明提供了识别能用于在体内抑制Tnni3k的效果的化合物的方法，包括在患有心肌病的患者体内通过Tnni3k引入早期心力衰竭。本发明还涉及如此识别出的化合物，并且还涉及使用该化合物来预防患有心肌病的患者的心力衰竭，或降低其风险。

在一个实施方案中，本发明涉及根据化合物与Tnni3k结合并由此潜在地作为Tnni3k拮抗剂的能力来筛选化合物的方法。Tnni3k包括两种可辨识的蛋白基序：在氨基末端重复的一系列锚蛋白以及羧基末端中的酪氨酸激酶结构域。在本筛选方法(分析)中可使用整条Tnni3k分子，或者也可使用其片段，例如酪氨酸激酶结构域，就像包含Tnni3k或其片段的融合蛋白那样。

本发明实施方案的结合分析包括无细胞分析，其中Tnni3k或其片段(或含它的融合蛋白)用一种测试化合物(蛋白质的或非蛋白质的)来孵育，该化合物最好带有一种可检测的标记(例如放射性标记或荧光标记)。在孵育后，可使用各种技术将与测试化合物结合的Tnni3k或其片段(或融合蛋白)与未结合的测试化合物分离，例如，可将Tnni3k(或其片段或融合蛋白)与一种固体担体(例如板或柱)结合并冲洗掉未结合的测试化合物。然后，可使用适合用于检测所使用标记的技术(例如，对于用放射性同位素标记的测试化合物的情形，使用液体闪烁计数或伽马计数，或者使用荧光分析)来确定与Tnni3k或其片段(或融合蛋白)结合的测试化合物的量。与Tnni3k(或其片段或融合蛋白)结合的测试化合物是一种Tnni3k活性(例如激酶活性)的候选抑制剂。

本实施方案的结合分析还可采用无细胞竞争结合分析的形式。在这种分析中，Tnni3k或其片段或含它的融合蛋白可用一种已知与Tnni3k相互作用(例如与其结合)的化合物(例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)或髓鞘碱性蛋白(MBP))来孵育，该已知化合物最好带有一种可检测的标记(例如放射性标记或荧光标记)。将测试化合物(蛋白质的或非蛋白质的)添加到反应中，然后分析它和已知(做了标记的)化合物与Tnni3k或其片段(或融合蛋白)结合的竞争能力。可将游离的已知(做了标记的)化合物与结合的已知化合物分开，然后确定结合的已知化合物的量以评定测试化合物的竞争能力。可将这种分析按规定格式编排，以便于通过将Tnni3k或其片段(或融合蛋白)连接到固体担体上以容易地冲洗掉未结合的反应物来筛选大量的测试化合物。优选使用塑料担体，例如塑料板(例如96孔培养皿)。

适合用于上述无细胞分析的Tnni3k可分离自天然来源。Tnni3k或其片段(或融合蛋白)可用重组的方法或化学的方法来制备。可使用例如已知的重组技术将Tnni3k或其片段制成融合蛋白。优选的融合蛋白包括一个GST(谷胱甘肽-S-转移酶)部分、一个GFP(绿色荧光蛋白)部分(对于细胞定位研究有用)或一个His标签(对于亲和纯化有用)。非Tnni3k部分可存在于相对于Tnni3k部分的融合蛋白N末端或C末端。

如上所示，Tnni3k或其片段或融合蛋白可呈现为与固体担体连接，该担体包括塑料制或玻璃制的板或珠、层析树脂(例如琼脂糖凝胶)、过滤器或膜。将蛋白附着于这样的担体上的方法是本领域公知的。

本发明的结合分析还包括基于细胞的分析。适合用于这种分析的细胞包括天然表达Tnni3k的细胞和已经经过处理以表达Tnni3k(或其片段，或包含它的融合蛋白)的细胞。使用表达人Tnni3k的细胞是有利的。合适的细胞的例子包括心细胞，例如人心细胞，如心肌细胞。

细胞可经过处理以表达Tnni3k(最好为人Tnni3k或其片段，或包含它的融合蛋白)，这通过将一种表达构造体引入到选定的宿主细胞中来完成，所述表达构造体包含可操作地与启动子连接的编码Tnni3k或其片段或融合蛋白的序列(例如，图11所示的编码序列)。各种载体和启动子都可使用(例如pCMV5表达载体)。

本发明的基于细胞的结合分析可通过如下方式进行：将测试化合物(最好带有可检测的(例如放射性或者荧光)标记)添加到培养基中，在该培养基中培养了表达Tnni3k(或其片段，或包含它的融合蛋白)的细胞，在有利于结合的条件下用该细胞孵育测试化合物，然后去除未结合的测试化合物，并测定与该细胞结合的测试化合物的量。而对于无细胞分析的情形，与Tnni3k(或其片段或融合蛋白)结合的测试化合物是Tnni3k活性(例如激酶活性)的候选抑制剂。

基于细胞的分析还可采用竞争分析的形式，其中在存在和不存在测试化合物的情况下用表达Tnni3k(或其片段，或包含它的融合蛋白)的细胞孵育已知与Tnni3k结合的化合物(最好用可检测的标记来标记)。测试化合物对Tnni3k(或片段或融合蛋白)的亲和性可通过确定与在存在测试化合物的情况下孵育的细胞结合的已知化合物的量，并与在不存在测试化合物的情况下与细胞结合的量比较来评定。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种基于细胞的分析，其中使表达Tnni3k或其片段(或包含它的融合蛋白)的细胞与测试化合物接触，并确定该测试化合物抑制Tnni3k活性的能力。该细胞可以来自哺乳动物，例如心细胞，优选人心细胞。对测试化合物抑制Tnni3k活性的确定可通过例如监测心脏特异性蛋白或MBP的Tnni3K自体磷酸化或Tnni3K磷酸化作用来完成。

在一个优选实施方案中，对测试化合物抑制Tnni3k活性的确定可通过确定Tnni3k或其片段(或融合蛋白)使目标分子磷酸化的能力(例如，心脏特异性蛋白或MBP的Tnni3K自体磷酸化或磷酸化)来实现。

为了确定任何特定测试化合物(包括根据与Tnni3k结合的能力选择的测试化合物)的特异性效果，可进行分析以确定所选择的测试化合物的各种浓度对例如心功能的影响。

本发明还包括描述于此的Tnni3k/CSQ转基因，以及使用它来筛选具有治疗效果的化合物的方法。该转基因可用于验证作为试管中筛选结果而选择的化合物的体内功效。功效可通过监测例如心功能(例如使用超声心动图)或寿命来确定。

在另一个实施方案中，本发明涉及使用上述分析识别出的能与Tnni3k结合和/或能抑制Tnni3k对细胞生物活性的效果(例如激酶效果)的化合物。

在本发明的另一个实施方案中，可用抑制Tnni3k活性(例如激酶活性)的化合物对哺乳动物(人或非人)给药以预防心力衰竭或降低其风险，特别是当该哺乳动物患有心肌病时。根据本实施方案，该抑制剂可以足以提供这种预防或降低风险效果的量来给药。应理解，给药量和给药方案可根据例如抑制剂、哺乳动物的身体条件和所寻求的效果而改变。基于如下实施例描述的研究，看起来Tnni3k的抑制对于普通病理事实上是无关紧要的。因此，预期用Tnni3k活性抑制剂给药具有最小的不利副作用。

根据上述分析识别的Tnni3k抑制剂可配制成药物组合物。这种组合物包含该抑制剂和药学上可接受的稀释剂或载体。该抑制剂可以单元剂量的形式(例如为片剂或胶囊剂)存在，或为溶液，优选无菌溶液，特别是当预期通过注射给药的时候。如上所指出的那样，一次剂量以及用法用量可根据例如患者、化合物和所寻求的效果而改变。最佳的一次剂量和用法用量可由本领域的技术人员容易地确定。

抑制Tnni3k表达的技术(例如siRNA或反义策略)还可以治疗的方式使用以降低心力衰竭的风险。

Tnni3K的水平可用来预测疾病。具有高水平Tnni3K的患者可预期为心力衰竭的风险高。

在又一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，例如适于进行上述分析的试剂盒。这种试剂盒可包括Tnni3k或其片段，或包含它的融合蛋白，例如带有可检测的标记。该试剂盒可包括Tnni3k特异性抗体。该试剂盒还可包括用于该分析的配套试剂(例如缓冲液)。该试剂盒可包括在一种或多种容器手段中处理掉的上述成分中的任一种。

本发明的某些方面更详细地描述于随后的非限制性实施例中。(还可参见美国专利6,261,818、6,500,654、6,660,490、6,987,000、7,371,380、Feng等的Biochemistry(Mosc.)72：1199-204(2007)、Wang等的J.Cell.Mol.Med.，November 16，2007(早于印刷品的电子出版物)、Feng等的Gen.Physiol.Biophys.26：104-109(2007)和Karaman等的NatureBiotechnology 26：127-132(2008))。

实施例1

实验详述

动物保健和处理：所有的小鼠都根据公认的协议和杜克大学医学中心的机构伦理委员会的动物福利条例来进行处理。所有在本研究过程中使用的近交系小鼠的品系获自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。过表达CSQ的转基因小鼠(Jones et al，J.Clin.Invest.101：1385-1393(1998)，Cho et al，J.Biol.Chem.274：22251-22256(1999))在DBA/2J遗传背景下供养。

DBA.AKR-Hrtfm2同类系小鼠：通过不断与DBA/2J回交，在DBA遗传背景中创造出在Hrtfm2位点包藏有AKR基因组序列的同类系小鼠。在N2代中，选择产仔者，其在Hrtfm2处杂合而在其他定位的修饰位点处为纯合DBA(Wheeler et al，Mamm.Genome 16：414-423(2005))。基因组野生型SNP的基因分型通过用1449个SNP使用小鼠MD连锁分析芯片来进行(Illumina，San Diego，CA)。通过N6代，这些动物全部基因组的DBA等位基因都是纯合的，并且仅在3号染色体——含Hrtfm2的区域——上以大约10Mb的间隔显示出杂合性。一旦完成了N10代的回交，该DBA.AKR-Hrtfm2小鼠通过异种交配来维持。

小鼠RNA分离、基因芯片分析以及qRT-PCR：使用从来自三种初代品系(B6、DBA、AKR)中每一种的年龄和性别都匹配的野生型动物中摘除的完整心脏来检查RNA转录水平。使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离总RNA。用Affymetrix小鼠探针组(Mouse 430 2.0 Array，Affymetrix，Santa Clara，CA)进行基因芯片分析。使用GeneSpring GX^* 7.3表达分析仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)进行分析。对于TaqMan表达分析，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从完整心脏中提取出总RNA。使用高效cDNA存档试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)从1μg总RNA中合成出cDNA并将其用作qRT-PCR的模板。使用预先设计的基因表达检测(TaqMan，ABI，检测ID：Mm01318633_m1)扩增Tnni3k cDNA。将β-肌动蛋白(Actb)用作内源对照(TaqMan，ABI，产品样本号4352341E)。所有的扩增都用ABI Prism 7000实时荧光定量PCR系统进行三次，并用ABI软件进行分析。所有的统计分析都用不配对的双尾t检验来进行。

Tnni3k蛋白表达的分析：使用速冻心脏组织在具有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中再悬浮从而制备完整心脏蛋白的裂解物。用标准方法进行SDS-PAGE和蛋白质印记来分析裂解物。将一种多克隆肽抗血清展开到小鼠Tnni3k蛋白的C末端14个氨基酸上(LHSRRNSGSFEDGN)。用Protein A柱(GenScript，Piscataway，NJ)来纯化来自2只兔子的抗血清。Tnni3k抗体以TBST(具有5％的奶粉)中1∶1000的稀释度使用。通过使用二级抗兔抗体——其与HRP连接然后用Pierce SuperSignal West Pico化学荧光底物(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)孵育——并曝光到X-OMAT胶片(Kodak)上从而可是蛋白条带显现。使用蛋白质印记分析来确认抗体的特异性。如所预期的那样，mTnni3k抗体从裂解物中检测出了90kDa的蛋白，该裂解物是用全长Tnni3k表达载体瞬时转染的293T的细胞制备的，并且在野生型小鼠心脏的蛋白裂解物中也检测到(图3)。

荧光RT-PCR分析：使用为检测116bp或120bp的cDNA PCR产物而设计的引物对cDNA进行qRT-PCR。正向引物定位于所预测的4碱基插入物的25bp上游，并用5’-6FAM-AGATTTCTGCAGTCCCTGGAT-3’进行荧光标记，而未标记的反向引物用序列5’-AAGACATCAGCCTTGATGGTG-3’定位于所预测的4碱基插入物的48bp下游。用ABI Prism 3730DNA测序仪(Applied Biosystems)使用GeneMapper分析程序对两片段的累积进行定量。基于两种cDNA产物的相对扩增来计算正确拼接产物与误拼接产物的比例。

mTnni3k拼接构造体的克隆、细胞培养和转染：为了创建Tnni3k基因组拼接构造体，使用DBA基因组DNA和B6 BAC克隆RP23-180023作为模板来产生基因组的4kb片段，其包括内含子17的一部分、外显子18、内含子18、外显子19、内含子19、外显子20以及内含子20的一部分。正向PCR引物的序列为5’-ACTTACTTATGTGCTTCTCTTAGTTATGTGC-3’；反向引物为5’-GGATTTAAACATAGGTGTGTACCTAATTGT-3’。将PCR产物亚克隆到pSPL3(Invitrogen)中。这些克隆通过直接测序来检验。在含10％胎牛血清的Dulbecco’sModified Eagle’s Medium(DMEM，Gibco)中于37℃在5％CO₂的条件下维持人胚肾HEK293T(293T)细胞(ATCC，Manassas，VA)。这些细胞在35mm²的培养皿上生长，并根据制造商手册使用FuGene试剂(Roche，Indianapolis，IN)用1μg的质粒DNA转染。在转染后24小时用TRIzol(Invitrogen)提取RNA，并使用标准方法进行RT-PCR。

体外拼接分析：HEK293T细胞在6孔培养皿中生长至大约80％汇合，然后使用混合了FuGene试剂的1μg的DBA-或B6-pSPL3质粒进行转染。所有转染都进行三次。在转染后20小时用TRIzol提取总RNA。使用标准方法进行RT-PCR。通过前述的荧光RT-PCR分析来确定Tnni3k构造体的正确拼接产物与误拼接产物的比例。

定位诱变：使用QuikChange定位诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)并用PfuTurbo校对DNA聚合酶，在rs49812611(IVS19+9)处使一个碱基发生变化，在DBA-pSPL3构造体中为G→A，而在B6-pSPL3构造体中为A→G。所有的克隆都进行测序以检验SNP的正确混入。

心肌细胞的培养和NMD阻塞实验：在补充了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素/链霉素和100μM两性霉素B的Claycomb培养基(SAFC Laboratories，Lenexa，KS)中培养HL-1心肌细胞(Claycomb et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：2979-2984(1998))。这些细胞在37℃下用5％的CO₂进行培养。尽管HL-1心肌细胞来自于从杂交B6-DBA小鼠中分离的心脏(Claycomb et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：2979-2984(1998))，来自细胞系的基因组DNA的直接测序显示出，在Tnni3k位点的DBA等位基因是纯合的。HL-1细胞用5.7x10^-2mM放线菌酮或3.3x10^-2mM吐根碱进行处理。每一处理都进行三次，在处理后24小时从这些细胞中分离出RNA。对从细胞中分离出来的用NMD阻滞剂进行了处理的RNA和未经处理的对照进行RT-PCR。使用前述的荧光RT-PCR拼接分析来测定正确拼接产物与误拼接产物的比例。使用前述的Tnni3k TaqMan分析来确定总转录水平。

TNNI3K转基因小鼠的创建和测试：通过RT-PCR从正常人心脏RNA中扩增出一条全长2.5kb的TNNI3K cDNA，然后将其克隆到鼠科动物α-肌球蛋白重链(αMHC)启动子下游的载体中。将一条人工minx内含子插入到TNNI3K起始密码子的上游。将该构造体直线化，然后将含有αMHC启动子、cDNA和SV40聚腺苷酸化序列的8kb片段纯化并用于微量注射。将B6SJLF1/J胚泡与直线化的转基因一起注射然后植入到代孕小鼠中。使用αMHC启动子中的5’引物和TNNI3K转基因中的3’引物对所得到的初始动物(founder animals)进行基因型分析以确定TNNI3K转基因的存在。选择三种转基因株系以与DBA品系回交。使用了多克隆抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)——其相对于人C末端TNNI3K肽(FHSCRNSSSFEDSS)而提出——的心脏裂解物的蛋白质印记分析确认了每一株系中的TNNI3K转基因的表达水平都相似(图7)。与DBA回交的几代都重现了这一结果。来自初始动物和后代(N2-N3)的DNA的DNA印记分析表明，两种初始株系携带转基因的10～20个副本，而第三种株系显示出具有＞100的副本。对于来自几种转基因小鼠的心脏cDNA使用SYBRgreen(Invitrogen)进行了qRT-PCR，以确定内源Tnni3k和转基因TNNI3K表达之间的相对表达差异。

M型超声心动图：使用Vevo 770超声心动图仪(Visual Sonics，Toronto，Canada)或具有15-MHz频率的探针的HDI 5000超声心动图仪(Phillips Electronics，Bothell，WA)对12～18周龄的清醒小鼠做了经胸二维M型超声心动图。心脏功能的检测包括心率、后壁和室间隔壁厚度、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)和喷血时间(ET)。缩短分数(FS)根据如下公式计算：FS＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD。以心率校正的平均纤维缩短速度(mVCFc)如前述那样进行计算(Cho et al，J.Biol.Chem.274：22251-22256(1999))。

横向主动脉缩窄：用开他敏(100mg/kg)和甲苯噻嗪(2.5mg/kg)的混合物对小鼠进行麻醉，然后如前述那样进行横向主动脉缩窄(TAC)(Rockman et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8277-8281(1991))。TAC是对10周龄的14只TNNI3K转基因阳性动物和14只转基因阴性(野生型)同窝出生崽进行的。手术后，转基因阴性对照中的一只以及三只转基因阳性的动物死亡，这是该过程的正常并发症。然后，在手术后的4周和8周，对余下的24只小鼠用超声心动图(如前所述)进行分析。

结果

作为识别Hrtfm位点候选基因所作的努力的一部分，对于来自在这些研究中使用的品系的心脏组织进行了基因芯片分析，以识别显示出转录水平差异的基因。在Hrtfm2连接峰下的共享单倍型域(Wheeler et al，Mamm.Genome 16：414-423(2005))中定位的21个基因中，仅有一个基因显示出在受保护的品系DBA/2J(DBA)与敏感品系C57/BL6(B6)和AKR之间有超过两倍的表达差异。与DBA相比，B6和AKR中的Tnni3k转录水平提高到12倍，而邻近的基因——作为间隔内所有其他基因的一个例子——并没有显著提高(图1A)。这些差异通过qRT-PCR得以证实，其显示出B6和AKR品系中的信息水平为DBA中的25倍高(图1B)。在进行基因组野生型转录水平研究的同时，通过创建一个同类系而从基因方面分离了Hrtfm2位点，所述同类系带有在整个Hrtfm2上的AKR等位基因和遍及该基因组剩余部分的DBA等位基因。定量RT-PCR表明，来自DBA.AKR-Hrtfm2同类小鼠的心脏中的Tnni3k转录水平与在B6和AKR(Hrtfm2位点的来源)中观察到的水平相当，而与在DBA(the genomic background)中看到的不同，这暗示出Tnni3k表达差异由Hrtfm2位点处的顺式作用序列因素驱动，而不是由定位于基因组中别处的反式作用因子驱动。

对从六种近交系小鼠品系中制备的心脏组织进行分析以确定Tnni3k转录水平中的差异是否可在蛋白水平上观察到。选择了另外三种品系，它们在Tnni3k处具有共同的DBA或B6单倍型(图2)。如同通过转录水平预测的那样，在B6、AKR、129X1/Sv和DBA.AKR-Hrtfm2同类系——它们具有共同的B6单倍型——中检测到了Tnni3k蛋白的强健水平，但是对于DBA、A/J和Balb/c——它们具有共同的DBA单倍型——没有检测到蛋白(图1C)。因此，在抗血清的检测范围内(图3中证实)，在整个基因中具有共同的DBA单倍型的各品系的心脏中不存在Tnni3k蛋白。后者各品系有效地代表了Tnni3k空白基因型，其对于进展或存活不均有明显的影响，并且不具有明显的病理结果。

Tnni3k在相关品系之间含有一条非同义和两条同义SNP(rs30712233、T659I；rs30709744、D598D；以及rs30712230、T639T)。通过对Tnni3k cDNA进行测序，注意到另一种品系特异性序列变化。所有具有B6单倍型的品系都显示出与已公开的cDNA相同的主转录物。与之相比，所有具有DBA单倍型的品系都显示出两种转录物的混合物，即，已公开的转录物以及在外显子19和20之间含有一个4核苷酸插入物的第二转录物(图4A)。该插入物在基因组DNA中不存在，并且代表4核苷酸从内含子19加成到外显子19中。该插入物创建了移码和直接提前终止密码子(图4B)。这确定了该移码的转录物占DBA心脏mRNA信息的大约70％，但在B6或AKR中不存在(图4C)。其未曾见于小鼠或其他任何物种的任何一个EST数据库，暗示了其代表有拼接缺陷创建的异常信息，而该拼接缺陷是通过在正常供体位点下游4核苷酸处使用第二‘gt’拼接供体位点而导致的。

围绕外显子19和20的基因组区域包藏超过50个SNP。尽管它们中的任一者都能导致异常拼接，但焦点集中在与拼接供体结合处最近的SNP上。B6和相关品系(AKR、129X1/SvJ、MRL)在rs49812611处显示出一个‘a’，而DBA和相关品系(A/J、C3H、Balb/c)显示出一个‘g’。该SNP对于正常拼接位点来说位于+9位置处，但对于异常拼接位点来说位于+5位置处。因此，DBA和相关品系在对于异常位点+5位置处包藏共有‘g’序列。对于每一可能拼接供体位点的拼接供体强度的权重矩阵打分(Staden，Nucleic Acids Res.12：505-519(1984)，Burset et al，Nucleic Acids Res.28：4364-4375(2000))证实了仅当‘g’核苷酸存在于rs49812611时，第二(异常)拼接位点是该区域中最强的拼接位点(图4D)。

rs49812611为异常拼接的原因这一假说在体外拼接系统中进行检验。将来自B6和DBA的跨越外显子18～20的基因组DNA片段亚克隆并转染到293T细胞中。这些体外构造体再现了发现于体内的拼接模式，证实了拼接缺陷由位于所克隆的4kb片段上的顺式作用序列造成(图5B)。使用了定位诱变以调查rs49812611在异常拼接中的作用。在该SNP中的仅一个改变就会完全颠覆拼接模式。经改变而携带了‘a’等位基因的DBA基因组DNA没有产生异常拼接产物，而带有‘g’等位基因的B6DNA确实产生了异常产物(图5B)。这些结果表明，rs49812611是存在或不存在异常拼接信息的原因，尽管异常拼接的全范围可由其他序列差异来调节。

由于Tnni3k最初因各品系间的转录水平差异而被识别为位置性候选基因，所以推测无义介导的衰变(NMD)是DBA中移码信息水平剧烈降低的原因。这在小鼠心肌细胞系HL-1(Claycomb et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2979-2984(1998))——其在Tnni3k处共有DBA单倍型——中得到了验证。首次证实，HL-1细胞可以与野生型DBA心脏相当的水平表达异常和正常Tnni3k两者，其信息的大部分包括该4核苷酸插入物。然后，用两种能阻塞NMD的药物——放线菌酮和吐根碱来处理HL-1心肌细胞(Carteret al，J.Biol.Chem.270：28995-29003(1995))。与正常拼接的信息相比，用哪一种药物进行的处理都会提高异常拼接的转录水平(图6A)。如所预期的那样，这些处理将总Tnni3kmRNA的水平提高至16倍(图6B)，证实了NMD在所观察到的转录水平差异中扮演重要的角色。

尽管这些实验确定了作为所观察到的Tnni3k转录水平差异的原因的分子机制，但它们依然没有解决Tnni3k在心肌病发展中的体内作用问题。其后进行了一项研究，关于Tnni3k是否是作为Hrtfm2位点原因的基因。首先使Hrtfm2同类系(DBA.AKR-Hrtfm2)与CSQ转基因致敏原杂交。该株系对于除3号染色体外的所有染色体都保留了DBA基因组背景，其含有含Hrtfm2的大约10Mb的AKR基因组背景，包括在整个Tnni3k基因上的AKR单倍型。由该次杂交获得的F1代动物在Tnni3k处仅具有一个AKR等位基因的副本，相对于亲代AKR品系有效地将它们的Tnni3k表达水平降低了一半。表达正常(AKR)剂量Tnni3k一半的同类系显示出了与DBA对照相比更加扩张的心脏和降低的心功能(降低的缩短分数)(图7)。这些数据表明，即使1/2正常剂量的Tnni3k也会在心脏病的场合导致加速扩张和心功能障碍。

在CSQ转基因的存在下，DBA.AKR-Hrtfm2同类系小鼠还显示出与对照小鼠相比降低的存活率。同类系小鼠在100天之内死亡，表明由于较早出现心力衰竭，见于AKR的1/2的Tnni3k表达水平导致了降低的存活率(图8)。

为了证实Tnni3k为此影响的原因，创建了三种转基因小鼠系，其在心脏中表达人TNNI3K(图9)。定量RT-PCR表明，该人转基因表达水平为内源性B6或AKR小鼠转录物的5～20倍高。将TNNI3K转基因通过基因掺入到DBA背景中(没有可检测到的鼠科动物Tnni3k蛋白)，以测试如下假说：在CSQ转基因致敏原的存在下，提高的TNNI3K表达水平会加速疾病的发展。来自所有这三种系的F1代小鼠都存活超过一年，而12周龄和21周龄转基因动物的心脏功能与野生型动物没有区别。因此，TNNI3K的单独表达不会引起明显的心肌病或心力衰竭。这并不令人意外，因为在不存在CSQ转基因的情况下，在B6和DBA动物的心功能之间没有可测的差异，尽管B6表达出强大的Tnni3k水平而DBA未显示出可检测到的蛋白。

相比之下，在CSQ致敏原的场合中TNNI3K的表达引发严重的心肌病，导致过早死亡(图8)。在CSQ(致敏原)与TNNI3K(修饰基因)杂交出的四种可能基因型中，仅有双转基因显示出显著下降的存活率。而其他所有基因型都平均存活至少150天(实验的终点)，表达CSQ和TNNI3K的动物在21天内死亡。这种过早死亡表型与之前观测到的当尝试将CSQ进行基因掺入到B6(强大的内源Tnni3k水平)中的情形类似。从DBA背景中的致敏原开始(Cho et al，J.Biol.Chem.274：22251-22256(1999))，不可能将CSQ转基因移出到第二代之外，这是因为N2代动物于30～40天时死亡(Suzuki et al，Circulation 105：1824-1829(2002))。

为了确定过早死亡是否与心功能不全有关，对于14日龄——这是可再现数据的最早可能的年龄——的全部四种可能基因型的动物做了超声心动图。仅有双转基因的小鼠显示出异常的心功能，其特征是严重的收缩功能障碍、心室扩张以及降低的心率(图10)。由于严重受损的心功能和该过程中心力衰竭的风险，用于存活测试的双转基因动物不能同时用于超声心动表型。这种基因型动物的五分之三都在做超声心动图过程中死亡。因此，双转基因动物在14天内(或更早)发展出心肌病并且不久之后死亡。

这些数据表明，TNNI3K表达引发了CSQ转基因心肌病模型体内的过早心力衰竭。随后进行了一项研究，关于TNNI3K对于与肌集钙蛋白过表达无关的心肌病模型是否具有疾病缓解效果。作为对压力超负荷的响应，横向主动脉缩窄(TAC)引发了左心室肥大(Rockman et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8277-8281(1991))。对TNNI3K转基因动物和野生型同窝出生崽对照做了TAC。在TAC手术后4周和8周时通过超声心动图分析了心脏功能。在术后4周和8周时，转基因阳性小鼠显示出了收缩功能障碍(提高的LVED)和明显降低的缩短分数(图11)。这证实了在CSQ致敏原的场合之外，TNNI3K过表达对心功能有不利影响。

TNNI3K被识别为能与心肌肌钙蛋白I(cTnI)相互作用的心脏特异性蛋白激酶(Zhao et al，J.Mol.Med.81：297-304(2003))。但是，迄今为止，cTnI并未被确立为磷酸化目标，并且TNNI3K的体内功能尚不明确。与该新型激酶的目标无关，已证实TNNI3K的水平是心脏病进展率的主要决定因素，这是因为该蛋白的表达加速了两种独立的心肌病模型中的疾病进展。很多近交系小鼠品系对于该基因事实上为空(null)，但重要的是，该空表型是受保护的。该蛋白急剧下降的水平——与其不存在的情况近似——似乎对于正常发展或长期存活没有影响，暗示了该激酶活性的抑制几乎不会或根本不会有病理学副作用。由于蛋白激酶为关键的细胞周期调控因子，激酶抑制剂就已成为新型癌症疗法研发的主要途径。在心脏病的场合中，TNNI3K也许是用于类似的小分子激酶抑制剂研发的理想候选者。预期Tnni3k直系同源物(orthologue)的空等位基因不会存在于人群中，这样，几乎所有的人类心肌病患者都原则上成为用于以激酶抑制水平介入的合适的对象。TNNI3K的选择性抑制由于显示了疾病进展而会特别有用，并且可证明在患有急性发作心脏病的治疗中是有益的。在这些疾病模型的场合中激酶抑制剂的深入研究会产生心脏病的新型治疗方法。

实施例2

作为确认Tnni3k蛋白在正常心肌细胞中的功能的第一步，研究了其在小鼠心脏组织中的位置。使用了特异于人Tnni3k蛋白的抗血清以探查外源性(转基因)蛋白在Tnni3k转基因小鼠中的位置。这些小鼠表达来自于心脏特异性心肌肌球蛋白重链启动子的人Tnni3k蛋白。重要的是，这些转基因小鼠已经回交到DBA/2J背景中，后者表达不出可检测到的内源性小鼠Tnni3k蛋白。因此，任何染色都取决于存在于小鼠组织中的人蛋白。Tnni3k染色(红色)显示出了条纹状的染色图案，与其作为心脏肌节的构成单元的情况一致(图13)。这是Tnni3k作为结构蛋白的首次描述。肌节为心肌和骨骼肌二者的主要结构单元，并且直接负责肌肉的收缩作用。

为了确定Tnni3k是否在复杂的肌节结构内部局部化，用抗血清将心脏组织切片共染色到特异于肌节不同部分的其他蛋白中。仅当使用肌间线蛋白(合并后的图中的黄色)——一种肌节Z盘(也称为Z线)的标准标记物——时，Tnni3k才共局部化。Z盘是肌节关键部分——包括肌球蛋白和肌动蛋白丝——的附属物的位点。图14显示出，与肌间线蛋白一样，正常小鼠Tnni3k蛋白同样显示出相同的条纹状染色图案和共局部化。人转基因蛋白的位置数据与正常小鼠蛋白的数据类似，表明转基因数据并非是人工假象。重要的是，DBA/2J小鼠并未显示出这种条纹状染色图案，这与DBA/2J小鼠(以及相关品系)并不表达这种蛋白的数据相符。这是Tnni3k作为肌节Z盘蛋白的首次描述。如蛋白质印记所示，该蛋白很明显完全是可有可无的，就像在小鼠Tnni3k位点处具有相同基因蛋白型的DBA/2J和其他品系并不表达任何可见Tnni3k蛋白那样，并且在表型中也是完全正常的。因此，Tnni3k提供了激酶抑制剂的合理目标，这是因为其为可有可无的，并且对于正常心功能来说不是必需的。

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上面列举的所有文献和其他信息来源均整体以参照方式并入于此。

Claims

1.一种识别心肌肌钙蛋白I相互作用激酶(Tnni3k)活性的候选抑制剂的方法，包括：

i)用一种测试化合物来孵育Tnni3k或其片段，并且

ii)分析所述测试化合物与所述Tnni3k或所述其片段的结合，

其中能与所述Tnni3k或所述其片段结合的一种测试化合物为Tnni3k活性的候选抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述片段包含Tnni3k的酪蛋白激酶结构域或锚蛋白重复序列。

3.权利要求1的方法，其中在步骤(i)中，用所述测试化合物对包含Tnni3k或所述其片段的融合蛋白进行孵育。

4.权利要求1的方法，其中所述测试化合物是非蛋白质的化合物。

5.权利要求1的方法，其中所述测试化合物带有可检测的标记。

6.权利要求5的方法，其中所述标记是放射性标记或荧光标记。

7.权利要求1的方法，其中所述Tnni3k或所述其片段连接在固体担体上。

8.权利要求1的方法，其中所述Tnni3k活性是激酶活性。

9.权利要求1的方法，其中所述方法是无细胞的方法。

10.权利要求1的方法，其中所述Tnni3k或所述其片段存在于细胞中。

11.权利要求10的方法，其中所述细胞是表达人Tnni3k的细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述细胞是人心细胞。

13.权利要求12的方法，其中所述心细胞是心肌细胞。

14.权利要求11的方法，其中所述细胞经过处理以表达人Tnni3k或所述其片段。

15.权利要求10的方法，其中将所述测试化合物添加到培养了所述细胞的培养基中。

16.一种识别Tnni3k活性的候选抑制剂的方法，包括使用一种已知与Tnni3k相互作用的化合物以及一种测试化合物来孵育Tnni3k或其片段，并且测定所述测试化合物与所述已知与Tnni3k相互作用的化合物竞争以结合到所述Tnni3k或所述其片段上的能力，

其中能与所述已知与Tnni3相互作用的化合物竞争以结合到所述Tnni3k或所述其片段上的一种测试化合物为Tnni3k活性的候选抑制剂。

17.权利要求16的方法，其中所述已知与所述Tnni3k相互作用的化合物为心肌肌钙蛋白I(cTnI)或髓鞘碱性蛋白(MBP)。

18.权利要求16的方法，其中所述已知与所述Tnni3k相互作用的化合物带有可检测的标记。

19.一种识别Tnni3k活性的抑制剂的方法，包括在存在和不存在测试化合物的情况下培养能表达Tnni3k或其具有Tnni3k活性的片段的细胞，并且测定在存在和不存在所述测试化合物的情况下所述Tnni3k或所述其片段使目标分子磷酸化的能力，其中在存在所述测试化合物的情况下所述目标分子的磷酸化水平的降低表明所述测试化合物为Tnni3k活性的抑制剂。

20.权利要求19的方法，其中所述目标分子为Tnni3k、心肌特异性蛋白或MBP。

21.一种Tnni3k/CSQ转基因动物。

22.一种预防哺乳动物心力衰竭或降低心力衰竭风险的方法，该哺乳动物对预防心力衰竭或降低心力衰竭风险有需求，该方法包括以足以实现所述预防或所述风险降低的量、用能抑制Tnni3k活性或抑制Tnni3k表达的化合物对所述哺乳动物给药。

23.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物患有心肌病。

24.权利要求22的方法，其中所述方法包括用能抑制Tnni3k表达的siRNA分子或反义分子来给药。

25.能通过权利要求1或权利要求16的方法来识别的Tnni3k活性的候选抑制剂。

26.一种组合物，包含权利要求25的候选抑制剂以及药学上可接受的稀释剂或载体。

27.能通过权利要求19的方法来识别的Tnni3k活性的抑制剂。

28.一种组合物，包含权利要求27的抑制剂以及药学上可接受的稀释剂或载体。