CN104718222A - 炎症促发多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本技术涉及炎症促发多肽(或它们的编码序列)用以筛选适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病症相关的症状的药剂，用以鉴定易发展出加剧的炎性反应的个体，以及用以确定治疗方案是否能够预防、治疗或减轻与个体的炎性病症相关的症状的用途。本技术也提供用于基于抑制炎症促发靶标的表达或活性来预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的方法。

Description

炎症促发多肽及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年5月28日提交且整体并入本文的美国临时专利申请61/652,271的优先权。
技术领域
本发明涉及多肽(或它们的编码序列)用以筛选适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病症相关的症状的药剂，用以鉴定易发展出加剧的炎性反应的个体，以及用以确定治疗方案是否能够预防、治疗或减轻与个体的炎性病症相关的症状的用途。本申请也提供用于基于抑制炎症促发靶标的表达或活性来预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的方法。
背景技术
炎症是一种对由感染、灼伤、创伤和其它伤害引起的组织损伤的正常生理反应。严格调控此反应对于初始识别相关危险信号、消除病因性病变和恢复体内平衡至关重要。此过程涉及造血细胞与基质细胞之间的复杂相互作用，包括成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞与先天性和继承性免疫系统的细胞之间的相互影响。早期产生促炎性可溶性介体和重塑酶以及适时合成减弱及终止所述过程的消炎性分子是所述受调控炎性反应的特征。然而，此过程的调控异常会导致急性或慢性炎性病状。尽管存在许多类别和类型的消炎性药物，但它们的功效有限并常为短暂的，且它们的长期使用会引起显著不利副作用。因此，炎性疾病代表处于庞大市场中的未满足的药理学需要。
炎性反应涉及上皮、内皮和组织驻留免疫细胞中的一连串复杂事件，包括样式识别受体(PRR)和炎症小体由危险信号初始活化。这快速继之以如嗜中性白细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD4+和CD8+T淋巴细胞的免疫细胞自远端部位向损伤部位募集。这些浸润物释放许多可溶性介体(组胺、白三烯、一氧化氮)、细胞因子(TNFα、IFNγ、IL-1)、趋化因子(IL-8、MCP1、KC)和酶(溶酶体蛋白酶)，其连同某些血浆蛋白质(补体、舒缓激肽、纤维蛋白溶酶)一起产生并扩大炎性反应。适时产生消炎性分子(PGE2、IL-10、TGFβ、IL-1Ra)会减弱并最终终止此反应。在持续组织损伤或异常感染/环境伤害存在下，促炎性介体的过度表达或消炎性信号的不足产生会导致急性或慢性衰弱性病状。包括败血症和脑炎的急性炎性病状难以临床管理且具有高死亡率。慢性炎性疾病在北美显示高发病率，且包括类风湿性关节炎(RA，发病率75-1000/105)、炎性肠病(IBD，约0.5-25/105)、全身性红斑狼疮(SLE，40-200/105)、牛皮癣(PA，2/100)、多发性硬化症(MS，18-350/105)、1型糖尿病(T1D，8-17/105)和乳糜泻(CeD，1/100)。也已提出慢性阻塞性肺病、冠状动脉粥样硬化、糖尿病、癌症和神经退化性病症可能具有起作用的炎性组分。这些全球性“炎性”疾病是人类健康的重大负担，且代表消炎性药物的庞大医药市场。已开发若干类别的所述药物，包括类固醇(可的松(cortisone))、非类固醇消炎性药物(包括COX2抑制剂(塞来昔布(colecoxib)))以及丙酸的衍生物(布洛芬(ibuprofen))、乙酸的衍生物(吲哚美辛(indomethacin))、烯醇酸的衍生物和灭酸的衍生物。然而，这些药物的益处是有限的，且它们显示在功效方面具有显著个人间变化性，且它们的长期使用具有严重副作用，从而提升对特定靶向疗法的需要。近来，靶向TNF(英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab))、IL-12p40(单克隆抗体)和IL-1(阿那白滞素(anakinra))路径、以及B细胞(利妥昔单抗(rituximab))和T细胞(阿巴西普(abatacept))的生物制剂已显示在炎性病状中具有临床功效，从而支持我们的基于宿主的方法适合用以鉴定新型消炎性靶标。
慢性炎性病状共有若干临床特征，包括先天性和获得性免疫系统的持续活化。破坏正常上皮屏障、组织损坏或持续感染可导致长期暴露于惰性环境或宿主源性产物(食物、尿酸单钠晶体、石棉、二氧化硅等)、微生物产物(包括共生细菌、病毒、寄生虫和真菌)和/或暴露于引诱性自身抗原(核酸、损坏的蛋白质)。这些由先天性免疫系统的细胞内或细胞表面传感器识别或由获得性免疫系统的受体识别。这些受体的啮合和骨髓细胞中相关信号传导路径的活化导致产生促炎性细胞因子(IL-1、IL-18、IL-12、IL-23)和介体(白三烯)，且导致原位释放通过募集和活化来自全身部位的其它骨髓和淋巴样细胞，包括啮合CD8+和CD4+T淋巴细胞(Th1、Th2和Th17细胞)来使局部炎性环境恶化的毒性物质(活性氧自由基)和蛋白酶(溶酶体酶)。促炎性辅助T细胞程序持久存在于这些细胞(Th1、Th2、Th17)中和/或抑制性T调控(Treg)反应的缺陷导致持续不断组织损坏且是这些炎性疾病的主要共同特征。
家族性聚集和成对研究已长久确定慢性炎性病状具有强遗传组分。全基因组关联研究(GWAS)已显示这些疾病的遗传组分是复杂的，其中检测到>250个基因座，且值得注意的是这些风险基因座中的若干在类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣(PA)、全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)、乳糜泻(CeD)和炎性肠病(IBD)中是共有的，其中累加小遗传效应组合以通过阈值机制引起疾病。为这些病状所共有的遗传风险见于免疫路径中，所述路径包括：a)先天性免疫系统的样式识别受体(NLR、TLR)和相关信号传导级联(炎症小体)；b)抗原加工和呈递，产生杀细胞物质(ROS、iNOS)和由骨髓细胞分泌促炎性介体(IL-18、IL-12)；c)T和B淋巴细胞成熟(例如通过IL-2)，包括控制自身反应性T和B细胞；d)在I类或II类MHC(HLA)的情形下T和B细胞的用于识别的抗原受体；e)产生促炎性细胞因子(IL-12、IL-18、IL-23)以及免疫反应的相关Th1、Th17、Treg极化调控；f)活化普遍存在的细胞反应，如自体吞噬、ER应激等。由这些共有的遗传变体确定的蛋白质和路径可为用于药物开发和治疗干预的卓越候选靶标。然而，遗传控制的复杂性致使难以鉴定和优先考虑这些路径中的关键非冗余靶标。
将高度合乎需要的是提供使得能够发起和/或持续炎性反应的其它多肽靶标。这些靶标应优选是炎症中涉及的宿主蛋白质，而与疾病的病因学无关。
发明内容
简要概述
本发明的一个目的在于提供负责发起和维持病理性炎性反应的宿主源性炎症促发多肽,其与炎性疾病的病因学无关。
根据本发明，提供一种用于评估药剂预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的能力的方法。广义而言，所述方法包括(a)组合药剂与试剂以获得与至少一种炎症促发多肽(IEP)的生物活性相关的参数；(b)测量步骤(a)的所述试剂的所述参数以获得测试水平；(c)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在炎性病状的发作或维持期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的生物活性相关；及(d)基于所述比较表征所述药剂。因为IEP的生物活性在炎症的发作或维持期间增加，所以当药剂能够降低IEP的生物活性时，它被视为适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。或者，如果药剂不能降低IEP的生物活性(例如如果在药剂存在下，生物活性等于或高于对照生物活性)，则它被视为不适用于(例如缺乏效用)预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。在一实施方案中，炎症促发多肽是CCDC88B、USP15、IRF8、IRF1、IRGM1、THEMIS和/或FOXN1中的至少一者。在一实施方案中，试剂是核酸分子。在另一实施方案中，核酸分子包含编码至少一种炎症促发多肽的基因的启动子且参数是由所述启动子驱动的表达的量度。或者，核酸分子可为编码至少一种炎症促发多肽的转录物且参数可为所述转录物的量的量度。在其它实施方案中，核酸分子是至少一种其表达可由炎症促发多肽改变的基因的转录物且参数是所述转录物的量。例如，当炎症促发多肽是IRF8时，至少一种其表达可由炎症相关多肽改变的基因可选自由表1、2和3中呈现的基因组成的组。在另一实施方案中，试剂可为多肽。在另一实施方案中，多肽是至少一种炎症促发多肽。在所述实施方案中，参数是至少一种炎症促发多肽的量。或者，参数可为至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性。例如，当至少一种炎症促发多肽选自由FOXN1、IRF8和IRF1组成的组时，至少一种生物活性可为转录因子活性。作为另一实例，当至少一种炎症促发多肽是CCDC88B时，至少一种生物活性可为蛋白质折叠。作为另一实例，当至少一种炎症促发多肽是USP15时，至少一种生物活性可为去泛素化活性。作为另一实例，当至少一种炎症促发多肽是THEMIS时，至少一种生物活性可为蛋白质信号传导活性。在另一实施方案中，多肽是至少一种炎症促发多肽的结合搭配物。例如，当至少一种炎症促发多肽是USP15时，结合搭配物可为可由USP15去泛素化的多肽。在另一实施方案中，多肽与炎症促发多肽的信号传导路径相关。在一实施方案中，步骤(i)是在体外或在体内进行。在另一实施方案中，步骤(i)是在非人动物中，例如像在携带非功能性炎症促发多肽的至少一个基因拷贝的动物中进行。在另一实施方案中，步骤(i)是在人中进行。
根据本发明，提供一种用于评估药剂治疗和/或减轻与有需要的个体的炎性病状相关的症状的能力的方法。广义而言，所述方法包括(a)施用用于诱导就编码炎症促发多肽的基因而言是杂合的动物的炎性反应的触发剂；(b)向经历所述炎性反应(例如处于炎性状态)的所述动物施用药剂；(c)测量所述动物的所述炎性反应的参数以提供测试水平；(d)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在炎性病状的发作或维持期间观察的所述炎症促发多肽的生物活性相关：及(e)基于所述比较表征所述药剂。因为IEP的生物活性在炎症的发作或维持期间增加，所以当药剂显示降低治疗的动物的IEP的生物活性时，它被视为适用于治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。或者，当在药剂存在下时，IEP的生物活性等于或高于治疗的动物的对照水平，药剂被视为缺乏治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的效用。在一实施方案中，炎症促发多肽是FOXN1、CCDC88B、IRF1、IRF8、THEMIS、IRGM1或USP15中的至少一者。在另一实施方案中，触发剂是传染物。在另一实施方案中，参数是存活率。在另一实施方案中，参数是选自由发热、震颤、嗜睡、后肢麻痹和昏迷组成的组的神经症状。在另一实施方案中，参数是选自由免疫细胞数目、免疫细胞类型、细胞因子分布、趋化因子分布、免疫球蛋白分布、水肿和血脑屏障渗透性组成的组的炎症相关参数。
根据本发明，提供一种用于评估药剂预防个体的炎性病状的能力的方法。广义而言，所述方法包括(a)向就编码炎症促发多肽的基因而言是杂合的动物施用药剂；继之以(b)施用能够在不存在所述药剂下诱导所述动物的炎性反应的触发剂；(c)测量所述动物的所述炎性反应的参数以提供测试水平；(d)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在炎性病状的发作或维持期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的生物活性相关：及(e)基于所述比较表征所述药剂在个体中的效用。因为IEP的生物活性在炎症的发作或维持期间增加，所以当药剂显示降低治疗的动物的IEP的生物活性时，它被视为适用于预防炎性病状。或者，当在药剂存在下时，IEP的生物活性等于或高于治疗的动物的对照水平，药剂被视为缺乏预防个体的炎性病状的效用。本文所述的关于本文所述的炎症促发多肽、触发剂或参数的实施方案也可用于此方法中。
根据本发明，提供一种用于确定治疗剂是否适用于预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的方法。广义而言，所述方法包括(a)提供已接受至少一剂治疗剂的个体的生物样本；(b)测量试剂的与至少一种炎症促发多肽相关的参数以提供测试水平；(c)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在炎性病状的发作或维持期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的生物活性相关；及(d)基于所述比较表征所述治疗剂的适用性。因为IEP的生物活性在炎症的发作或维持期间增加，所以当药剂显示降低IEP的生物活性时，它被视为适用于预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状。或者，当在药剂存在下时，IEP的生物活性等于或高于对照水平，药剂被视为缺乏预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的效用。本文所述的关于试剂、参数、生物活性、炎症促发多肽、多肽的实施方案也可用于此方法中。在另一实施方案中，表征是用优选在两个不同时期的至少两个生物样本(且在一些实施方案中，可能更多)来进行以评估治疗剂在个体中随时间变化的适用性。
根据本发明，提供一种用于确定个体的炎性病状的易患性或存在性的方法。广义而言，所述方法包括(a)提供来自个体的生物样本；(b)测量与至少一种炎症促发多肽相关的试剂的参数以提供测试水平；(c)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在不存在炎性病状期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的生物活性相关；及(d)基于所述比较表征所述个体。本文所述的关于试剂、参数、生物活性、炎症促发多肽、多肽的实施方案也可用于此方法中。
根据本发明，提供一种用于预防、治疗和/或减轻与有需要的个体的炎性病状相关的症状的方法。广义而言，所述方法包括施用能够抑制炎症促发多肽的至少一种参数的药剂以便预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状。本文也提供能够抑制炎症促发多肽的至少一种参数的药剂用于预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的用途；能够抑制炎症促发多肽的至少一种参数的药剂用于制造用于预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的药剂的用途；以及一种用于预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的能够抑制炎症促发多肽的至少一种参数的药剂。在一实施方案中，药剂是能够限制炎症促发多肽的表达的核酸分子。关于所述炎症促发多肽的实施方案适用于这些治疗用途。在另一实施方案中，药剂是能够限制炎症促发多肽的生物活性的抗体。在另一实施方案中，炎性病状选自由神经炎症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、1型糖尿病和乳糜泻组成的组。
根据本发明，提供与炎症促发多肽相关的各种工具。在一实施方案中，提供一种分离的多肽。分离的多肽是炎症促发多肽(IEP)的突变体。当在受试者中表达时，突变IEP能够防止所述受试者的炎性病状的发作和/或维持。与上述不同类型的IEP相关的实施方案可在本文中应用。在一实施方案中，分离的多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:4。在另一实施方案中，提供一种核酸载体且其编码突变IEP。在另一实施方案中，提供一种细胞(或一种细胞系)。就编码炎症促发多肽(IEP)的基因而言，细胞可为杂合的。在所述实施方案中，杂合细胞具有编码IEP的第一基因拷贝和编码IEP的突变体的第二基因拷贝。或者，就编码炎症促发多肽(IEP)的突变体的基因而言，细胞可为纯合的。在一实施方案中，细胞可为转基因细胞且可具有例如本文所述的核酸载体。在另一实施方案中，提供一种动物。就编码炎症促发多肽(IEP)的基因而言，动物可为杂合的。在所述实施方案中，杂合动物具有编码IEP的第一基因拷贝和编码IEP的突变体的第二基因拷贝。在另一实施方案中，就编码炎症促发多肽(IEP)的突变体的基因而言，动物可为纯合的。在一些实施方案中，动物可为转基因动物，例如被操作来具有本文所述的核酸载体的转基因动物。
在本文通篇中，各术语是根据它们在本领域中的普通定义加以使用。然而，出于明晰的目的，以下定义一些特定术语。
生物样本。生物样本是个体的体液、细胞或组织的样本。在本发明中，生物样本可自个体的血液获得。生物样本可不经先前改变而用于本文所述的各种方法中。任选地，可在本文所述的测定之前处理(机械处理、酶处理等)生物样本。
杂合子。接合性是指个别生物体中针对某一遗传特性的等位基因的类似性。如果两个等位基因相同，则就所述特性而言，个别等位基因(纯合子)被视为纯合的。如果两个等位基因不同，则就那个特性而言，个别等位基因(杂合子)是杂合的。如果一个等位基因缺失，则个别等位基因(半合子)被视为半合的，且如果两个等位基因均缺失，则个别等位基因(缺合子)被视为缺合的。炎症促发多肽的杂合子携带编码功能性炎症促发多肽的第一等位基因和编码非功能性炎症促发多肽的第二等位基因。
炎症和炎性反应。炎症是身体对有害刺激物的反应且是通过血浆和白细胞(尤其粒细胞)自血液向损伤组织中的移动增加来达成。一连串生物化学事件传送炎性反应且使炎性反应成熟，涉及局部血管系统、免疫系统和损伤组织内的各种细胞。如本文所用，术语“炎症”和“炎性反应”是指此反应的非病理性方面且可甚至被视为有益于经受它的个体。
炎性病状、疾病或病症。如本文所用，这些术语共同是指调控异常的炎性反应，其导致受折磨的个体的组织的病理性细胞破坏。炎症可为急性的或慢性的。急性炎性病状包括但不限于败血症和脑炎。慢性炎性病状共有若干临床特征，包括先天性和获得性免疫系统的持续活化。慢性炎性病状可包括产生促炎性细胞因子(IL-1、IL-18、IL-12、IL-23)和介体(白三烯)、释放毒性物质(活性氧自由基)和蛋白酶(溶酶体酶)。在一些实施方案中，慢性炎性病状也包括募集和活化来自全身部位的其它骨髓和淋巴样细胞，例如像CD8+和CD4+T淋巴细胞(Th1、Th2和Th17细胞)。促炎性辅助T细胞程序持久存在于这些细胞(Th1、Th2、Th17)中和/或抑制性T调控(Treg)反应的缺陷可导致持续不断组织损坏。慢性炎性病状包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、全身性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣(PA)、多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)和乳糜泻(CeD)。与慢性炎症相关的其它病状包括但不限于慢性阻塞性肺病、冠状动脉粥样硬化、糖尿病、代谢综合征X、癌症和神经退化性病症。
炎症促发多肽(IEP)。如本文所用，此术语是指当它们的表达被限制或抑制时，会防止炎性病状(急性或慢性)的发作和/或维持的多肽。这些多肽是优先通过下文以及Bongfen等(伯氏疟原虫(P.berghei)激发ENU突变的动物)中所述的遗传筛选来鉴定。这些多肽优先选自由IRF8、IRF1、IRGM1、CCDC88B、THEMIS、FOXN1和USP15组成的组，更优选选自由IRF8、CCDC88B、FOXN1和USP15组成的组，甚至更优选选自由CCDC88B、FOXN1和USP15组成的组，且在最优选实施方案中，选自由CCDC88B和USP15组成的组。在一实施方案中，IEP不包括JAK-3。如以下将显示，可能必要的是提供就这些炎症促发多肽而言是杂合的动物。所述杂合动物携带编码功能性IEP的第一功能性基因拷贝和编码非功能性IEP的第二基因拷贝。“功能性”IEP(也被称为野生型IEP)是指能够表达且提供它的用于发起和/或维持炎性反应的生物活性的多肽。相反，“非功能性”IEP(也被称为突变IEP)是指不自它的相应基因拷贝表达，在较低水平下表达(当相较于功能性IEP时)和/或携带它的编码序列的最终导致IEP的炎症相关生物活性降低(且甚至不存在)的突变的多肽。
药学有效量或治疗有效量。这些表述是指有效介导对患者的治疗益处(例如预防、治疗和/或减轻炎性病状的症状)的量(剂量)。在本文中也应了解的是“药学有效量”可解释为以一次剂量或以任何剂量或途径采用，单独或与其它治疗剂组合采用的产生所需治疗作用的量。
药学上可接受的盐。此表述是指保留本文所述的治疗剂的生物有效性和性质的常规酸加成盐或碱加成盐。它们是由适合无毒有机或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐的实例包括由如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的无机酸获得的盐、以及由如对甲苯磺酸、水杨酸、甲烷磺酸、草酸、丁二酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、反丁烯二酸等的有机酸获得的盐。碱加成盐的实例包括由铵、钾、钠和季铵氢氧化物，例如像氢氧化四甲铵获得的盐。将药剂化学改性成盐是一种用于试图改良化合物的涉及物理或化学稳定性的性质，例如吸湿性、流动性或溶解度的熟知技术。
预防、治疗和/或减轻症状。这些表述是指某一方法或某一药剂能够限制炎性病状的发展、进展和/或症状学。表述包括预防、治疗和/或减轻至少一种与炎性病状相关的症状。
急性炎症可在脑疟疾和/或脑炎中观察到。急性炎症的特征通常在于以下症状：痛(疼痛)、灼热(发热)、潮红(发红)、肿(肿胀)和/或功能缺失(功能损失)。发红和发热被视为归因于在身体核心温度下血液向发炎部位的流动增加；肿胀被视为由流体累积引起；疼痛被视为归因于释放刺激神经末梢的化学物质。慢性炎症的特征可在于以下症状：血管舒张；器官功能障碍；可导致发热的急性期蛋白质(例如C反应性蛋白质、血清淀粉状蛋白A和血清淀粉状蛋白P)的存在增加；血压增加；出汗减少；不适；食欲不振和/或嗜眠；白细胞数目方面的调节(例如中性白细胞增多、嗜酸粒细胞增多、白细胞减少等)；白介素、细胞因子、激素或生长因子浓度方面的调节(例如IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、CRP、胰岛素、瘦素)；高血糖；和/或发热。
肉芽肿性炎症的特征在于形成常在结核、麻风、类肉瘤病和梅毒中观察到的肉芽肿。纤维蛋白性炎症导致血管渗透性大大增加且允许纤维蛋白穿过血管。如果存在适当促凝性刺激物(例如癌细胞)，则纤维蛋白性渗出物沉积。这通常见于浆液腔中，在所述浆液腔中，可在浆膜之间发生纤维蛋白性渗出物向疤痕的转化，从而限制它们的功能。脓性炎症产生大量脓液(例如嗜中性白细胞、死细胞和流体)。浆液性炎症的特征在于大量渗出非粘性浆液，其通常由浆膜的间皮细胞产生，但可由血浆获得。溃疡性炎症发生在上皮附近且可导致来自表面的组织的坏死性丧失，从而暴露下层。
触发剂。如本文所用，术语“触发剂”(也被称为炎性反应触发剂)是指能够诱导和/或维持个体的炎性反应的试剂。在某一实施方案中，“触发剂”可甚至导致个体的炎性病状的发作。触发剂包括但不限于细菌性感染、细菌源性组分(如细菌或源于其的组分)、病毒性感染、病毒源性组分、外来抗原和自身抗原。在一优选实施方案中，触发剂是伯氏疟原虫。
附图说明
已因此大体上描述本发明的性质，现将参照通过说明方式显示本发明的优选实施方案的附图，且其中：
图1说明在用伯氏疟原虫激发后各种小鼠的存活率百分比。Jak3+/-小鼠就jak3基因的一个正常拷贝和基因的一个携带内部缺失的非功能性拷贝而言是杂合子。Jak3W81R/+小鼠就jak3基因的一个正常拷贝和基因的一个编码携带W81R变体的蛋白质的非功能性拷贝而言是杂合子。B6小鼠就jak3基因而言是纯合子且携带基因的两个功能性拷贝。Jak-/-小鼠就基因的携带内部缺失的非功能性拷贝而言是纯合子。JakW81R小鼠就jak3基因而言是纯合子且两个基因拷贝均携带非功能性突变。“治疗的”是指动物已接受Jak3激酶抑制剂(塔索替尼)。“未治疗的”是指动物未接受Jak3激酶抑制剂。
图2说明CCDC88B的表达。(A)进行qPCR以探究Ccdc88b在成年小鼠中在一组鼠类器官中的mRNA表达。结果显示为随器官而变化的相对表达(呈与管家基因Hprt的比率形式)。(B)进行qPCR以探究Ccdc88b在成年小鼠中在一组鼠类细胞中的mRNA表达。结果显示为随细胞类型而变化的相对表达(呈与管家基因Hprt的比率形式)。(C)野生型动物(灰色棒条)和半合子动物(Ccdc88b+/-，白色棒条)的脾细胞的免疫表型分析。结果显示为每种细胞类型的脾细胞数目(×106)。(D)进行qPCR以探究Ccdc88b在人星形细胞、小神经胶质细胞或血脑屏障内皮细胞中的mRNA表达。提供未刺激或用IFNγ和TNFα(D1)或用IFNγ和IL1b(D2)刺激的星形细胞；未刺激或用IFNγ和LPS刺激的小神经胶质细胞(D3)；未刺激或用IFNγ、TNFα或用IFNγ和TNFα刺激的BBB内皮细胞(D4)的相对Ccdc88b mRNA表达水平。
图3说明在伯氏疟原虫感染之后BXH2小鼠对脑疟疾具有抗性。(A)BXH2小鼠、杂合(BXH2×B6)F1后代以及易感性B6和C3H亲本对照的存活曲线。所有曲线都在统计上彼此不同。(B)对伊文思蓝染料在来自未感染以及感染的B6(白色棒条)和BXH2(灰色棒条)小鼠的灌注脑中的累积的定量。将来自每种条件3只小鼠的数据平均化。(C)来自未感染以及感染的B6和BXH2小鼠的在不同时间点(感染后7天或第7天；感染后16天或第16天)的代表性伊文思蓝染色的脑的定性比较，其明确指示在感染的B6(第7天PbA)而非BXH2(第7天PbA或第16天PbA)小鼠中，血脑屏障受破坏。(D)易感性B6和C3H亲本对照、BXH2小鼠和杂合(BXH2×B6)F1后代在用伯氏疟原虫感染之后的血液寄生虫血症水平(寄生虫血症百分比)。
图4说明相较于CM易感性亲本对照，BXH2小鼠具有减弱的血清细胞因子和趋化因子反应。通过多路ELISA(n＝5只小鼠/品系)测定来自伯氏疟原虫感染的小鼠的血清且测定平均细胞因子水平。提供随小鼠类型(易感性B6和C3H亲本对照以及BXH2小鼠)而变化的(A)IFN-γ(pg/mL；*＝p＝0.07)、(B)IL-10(pg/mL)、(C)MIP-1β(pg/mL)、(D)CCL2(pg/mL)、(E)TNF-α(pg/mL；*＝p<0.001)和(F)RANTES(pg/mL)的水平。
图5显示对B6和BXH2脑的转录物谱分析揭示基因表达的品系和感染特异性差异。(A)无监督的主成分分析根据品系和感染来群集样本。显示B6(d0＝○；d7＝●)和BXH2小鼠(d0＝Δ；d7＝▲)的成分2(24.2％)随成分1(39.4％)而变化的结果。(B)通过感染与未感染的B6和BXH2转录物谱之间的成对比较产生的基因清单的相交。(C)以品系和感染特异性方式(双因素ANOVA，padj-相互作用<0.05)受调控的转录物的欧几里得群集热图，其以各品系的感染诱导的倍数变化(第7天/第0天)形式说明。各行代表独特基因，且如果基因的两次或更多次转录物探测是有效的，则使用平均倍数变化。差异表达样式被群集成三组，其中组1基因在两个品系中受感染上调，组2基因在B6小鼠中受感染上调而在BXH2中无反应，且组3基因受感染下调，通常在B6中比在BXH2中受下调程度更大。对于细节，参见表1。阴影化热图指示在基因转录起始位点的20kb内存在一个或多个直接IRF8结合位点。(D)在B6小鼠中在CM病变期间受感染差异调控的转录物的基因本体。上调的基因主要涉及于先天性和继承性免疫性过程中，而下调的基因不形成明确信息，但包括多种体内恒定生物和代谢过程。
图6说明在B6小鼠中在CM病变期间上调的基因显著富含通过染色质免疫沉淀和DNA测序(ChIP-Seq)确定的IRF8结合位点。(A)IRF8的已知结合靶标(例如Tlr4、H2-Q4、Tlr9、Cd74和Socs1)用于通过定量RT--PCR验证ChIP的成功。当相较于对照IgG制剂时，这些靶标高度富含在IRF8免疫沉淀的DNA中。显示n＝5实验的代表性数据。(B)沿小鼠参照基因组对准ChIP-Seq峰。淡蓝色(顶部)迹线指示非特异性(IgG)结合位点而深蓝色迹线(下部)显示直接IRF8结合位点。如果在转录起始位点的20kb内发现峰，则基因被视为具有IRF8结合位点。(C)针对在转录起始位点的20kb内的IRF8结合位点探询在B6小鼠中受感染调控(第7天/第0天成对)的基因的清单。反应于感染上调的转录物显著富含IRF8结合位点，而下调的转录物不显示富含。
图7说明用106个伯氏疟原虫寄生虫腹膜内感染的靶向的基因剔除小鼠的存活曲线。脑疟疾易感性小鼠在感染后第5天与第10天之间死于神经症状，而存活长于13天的小鼠从未显现CM症状且被分类为具有抗性。将感染特异性B6和BXH2对照与各基因剔除品系并排绘图。结果显示为(A)IFN-γ、(B)STAT1、(C)JAK3、(D)IRF1、(E)IRGM1、(F)IL12p40、(G)IFIT1、(H)ISG15和(I)NLRC4的基因剔除者随感染后天数而变化的存活百分比。
具体实施方式
根据本发明，提供在本文中显示能够诱导和/或持续病理性炎性反应的宿主多肽(也称为靶标)。这些多肽被视为涉及于任何病理性炎症反应中，而与疾病的病因学无关。如本文也显示，显示这些多肽的生物活性的降低适用于治疗、预防和/或减轻与炎性病状相关的症状。
如牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化症、狼疮、乳糜泻和IBD的常见炎性疾病显示共同路径和相关信号传导网络的失调。因此，干扰与发病机制相关的所述共有路径的药理学调节剂可具有针对若干炎性疾病的临床益处。大规模遗传研究显示这些疾病的遗传组分是不同和高度复杂的，且重要的是它们共有若干相同遗传风险等位基因。这表明发现为在一种炎性病状中起作用的基因可证明对更好了解相关炎性病状的病理生理学有价值且可代表对于用于这些病症中的药物发现而言有价值的靶标。在实验模型中的研究已确定潜伏在正常和异常炎性反应下的主要细胞类型、生理反应以及相关路径和可溶性介体在小鼠中是保守的。此外，小鼠中的生殖系修饰提供一种用以在小心控制触发性环境刺激物下单独研究个别基因和蛋白质对病理性炎症的影响的理想模型。
基于这些研究结果，提出在小鼠中进行随机突变诱发，随后筛选对急性神经炎症具有抗性的所得突变体提供一种用以鉴定在功能上有效的因素的系统方法，所述因素a)在一定范围的炎性疾病中起关键作用，且b)构成用于炎性病状中的药物发现和药理学干预的新型靶标。如以下将提供，所述策略已导致鉴定Jak3(RA中的一种已知药理学靶标)和Themis(SLE和乳糜泻中的一种已知遗传风险因素)，从而提供此遗传方法的强力性和效力性的说服性原理验证。因此，此方法提供GWAS获得的信息中不存在的丢失功能性关联以及体内验证的临床前系统，其中药理学抑制将充分钝化炎性反应以在临床上具有价值。
IBD影响北美约140万个体和欧洲约220万个体。自1940年代以来，在具有更西化生活方式的国家，IBD发病率已显著增加，从而表明包括生活方式、卫生、膳食和抗生素使用的环境因素具有影响，所述环境因素都可改变有利于疾病发作和/或进展的微生物丛。一大堆证据也指向IBD的病因学中的遗传因素，其中在GWAS中鉴定超过100个基因座。然而，这些基因座仅占对于IBD估计的遗传风险的20％。此外，尽管通过GWAS鉴定的基因座指向在炎症、上皮屏障功能、先天性和继承性免疫性、自体吞噬、ER应激等方面具有意义的特定路径，但由于缺乏评估这些基因座各自对疾病的非冗余体内影响的功能性研究，当前不可能根据这些研究合理选择候选可被药物靶向的分子/路径。选择通过伯氏疟原虫感染诱发的神经炎症模型，因为它具有为炎性病状所共有的若干特征，包括炎性骨髓和淋巴样细胞被募集至感染部位，分泌IL12、TNFα、IFNγ，以及随后破坏内皮细胞完整性，从而导致快速且致死性脑炎。此外，如以下将显示，先前未被怀疑在炎症中具有作用的许多基因确定具有发现新型可被药物靶向的靶标的被证明潜力。
推定性炎症促发靶标的遗传筛选和表征
用烷基化剂N-乙基N-亚硝基脲进行突变诱发是一种用以在小鼠基因组中产生随机单一点突变的高效方法。一组验证的条件被开发来成功突变诱发C57BL/6J(B6)小鼠品系(Bongfen等)。简要来说，首建B6雄性小鼠(鉴定为G0)每周接受1次腹膜内注射90mg/Kg ENU，持续3周。高效突变诱发的雄性(G0)短暂丧失生育力，所述生育力在11周之后重新获得。突变诱发的G0雄性接着与野生型B6雌性小鼠杂交以产生第1代(G1)后代：这些F1杂交物携带一组完全的突变诱发染色体和一组完全的野生型B6染色体。基于每1Mb 1个核苷酸的平均取代率，预期各G1在杂合状态下携带约3000个核苷酸变体。使用对于可见基因座确定的每700只G1小鼠每个基因座所对应的平均功能降低突变频率1，各G1小鼠可能是约40至50个功能性变体的杂合携带者。通过首先使G1雄性与野生型B6雌性杂交(以产生G2后代)，且接着使两个随后G2子代与它们的G1父本回交来将个别G1雄性育种成旨在使ENU序列变体(来自G0雄性)具有纯合性的单独B6谱系的首建小鼠。G1中存在的50％序列变体是由各G2子代所遗传，且预期这些序列变体中的25％(总体的12.5％)在任一N3后代中达成纯合性。总之，因此预期各G3后代就估计的375个序列变体和4个功能性变体而言是纯合的。在这些N3谱系的系统表型分析活动期间，在来自同一G1祖父的连续G3谱系中具有不一致或“表型偏差”特性(例如对致死性神经炎症的抗性)的个体的一致外观(在约25％的频率下)指示改变对刺激物的反应的完全渗透性隐性突变的分离。因此，通过筛选每个谱系最少24-32个N3后代(六窝)，可预期鉴定具有相同表型偏差特性的一群6-8个个体。
伯氏疟原虫ANKA(PbA)诱发脑疟疾，其是一种特征在于急性神经炎症和快速致命性脑炎的病状。它是由以下所引起：在血脑屏障(BBB)处捕集PbA寄生的红细胞，炎性细胞的浸润和产生IFNγ、TNFα、IL10、MCP-1，在BBB处内皮完整性丧失，以及在感染后第5天出现且截至第9-11天最终具有致命性的不可逆神经症状的精确发作。自疟疾参考和研究试剂资源中心(MR4)获得传染性伯氏疟原虫ANKA(PbA)分离株，且制备寄生的红细胞(pRBC)的储备物并冷冻储存在-80℃下。在感染之前，使寄生虫静脉内传代，且稀释血液以制备大量接种物(在107pRBC/mL下滴定)以感染各组100-150只G3小鼠(106pRBC，静脉内)。起始于感染后第3天，数次监测动物的神经症状的出现，所述神经症状可在颤抖、震颤、脊柱后凸、缺乏对触摸的反应性的范围内，且可进展成麻痹和昏迷。当初见所述症状时(通常截至第5至7天)，使小鼠安乐死且通过分离基因组DNA来收集组织样本。在感染后第12天存活的小鼠被标记为对神经炎症具有抗性，且相应G3谱系被标记为表型偏差体。接着分析来自相同G1首建小鼠的其它G3谱系的表型以确定稳定分离保护性特性，且确定保护性特性在最少24-32个G3后代(来自相同G2雌性的6窝)之中的传播频率(预期约25％G3个体在阳性谱系中)。针对血液寄生虫血症测试在脑阶段存活的抗性动物(以确定生产性感染)且接着用药物治愈(蒿素(Artemisin)，皮下，150mg/kg，每周3次，持续3周)以在活动物中保持保护性突变供未来繁殖突变系。
使用Agilent SureSelectXT Mouse All ExonTM系统测定来自相同表型偏差谱系的3只G3小鼠的所有外显子和外显子-内含子边界的序列(外显子组测序)。此系统使用巢式寡核苷酸引物来高效构建文库，所述文库捕集总计49.6Mb捕集的基因组DNA的24,306个注解的小鼠基因(使用UCSC mm9/NCBI编译版本37根据参照C57BL/6J基因组加以注解)内>221,784个外显子。接着使捕集的外显子经受使用Illumina HiSeqTM测序平台进行的深度测序。这两个组成部分已被优化来高效且可靠覆盖整个基因组以及检测ENU突变：平均读取长度180-200个核苷酸的200-300×106个序列读数足以提供>90％基因组的20X覆盖度和>95％基因组的10X覆盖度。已执行基于免费可用工具BWA、SAM工具、Picard和GATK的读取对准和变体识别流水线。使用IGV viewerTM软件包(Broad Institute,MIT)验证此清单以消除重复读数并标记测序错误(SNP与参照等位基因的比率<50％、多等位基因系统、末端序列)，且鉴定其它非ENU无关变体(先前见于其它外显子组文件中)或不影响氨基酸序列的沉默变体。将来自3只G3小鼠的SNP清单进行比较以鉴定为所述3只小鼠(纯合子或杂合子状态)所共有的变体。
ENU变体的病因性性质是通过分析来自同一G1祖父的额外20只G3小鼠的基因型，且通过在“抗性”小鼠中寻找ENU特异性变体的纯合性的共分离，并排除野生型等位基因的纯合性，同时确定“易感”小鼠中的逆转情况来验证。接着考查保护性变体中的功能损失的原因。尽管导致多肽过早终止的错义变体、或关键供体或接受体拼接位点中的可能影响RNA加工/拼接的内含子突变易于鉴定明显功能损失，但非同义变体可关于取代类型(非保守性>保守性)和针对显示交叉物种保守性(BLAST或BLOSSOM搜索)的残基加以优先考虑。对于ENU变体和对于相同基因的无效等位基因(寻找针对伯氏疟原虫的保护的重演)而言的F1小鼠双重杂合子中的遗传互补可用作最终验证测试。所述无效突变体可以来自独立实验室或来自公共资源(Jackson Laboratories)的活动物形式获得，或可以来自国际基因捕获协会(International Gene Trap Consortium)(www.igtc.org.uk)的基因捕集物形式获得。为获得对注解不充分的蛋白质的功能性作用的进一步了解，可通过半定量逆转录酶联用的扩增(RT-PCR)在与体内炎性反应相关的器官(胸腺、脾、骨髓、血液白细胞)和细胞(骨髓细胞、淋巴样细胞、上皮细胞)中对所述蛋白质的RNA进行表达。可研究这些基因的启动子区域中与由已知调控“促炎性”路径的转录因子(如STAT1、STAT3、IRF1和IRF8)调控相关的序列元件的存在。最后，扩增对于优先考虑的ENU变体而言的突变小鼠品系纯合子以产生足够数目的小鼠供下游表征。
使突变表型偏差谱系经受精简和层化免疫表型分析以确定它们的中枢和外周免疫系统的完整性、组成和活化状态。具体来说，在高通量多变量流动式细胞测量分析中使用群体特异性细胞表面标记和细胞内细胞因子染色列举中枢和外周免疫器官(骨髓、胸腺、脾、淋巴结和外周血液)中以及肠管中的不同免疫细胞群体(造血干细胞[HSC]、粒细胞、骨髓细胞、NK细胞、T和B淋巴细胞)。可使用以下抗体混合物：对于T细胞(抗CD3、CD4、CD8、CD44、CD62L、CD25、TCRVβ、γδTCR)、B细胞(抗B220、CD22、CD138、IgM、IgD、CD24)、HSC(抗CD117、Sca-1)、红细胞样细胞(抗Ter119)、粒细胞(抗Gr-1)、NK细胞(抗NK1.1)、巨噬细胞、DC、炎性单核细胞(抗CD11b、CD11c、F4/80)、以及嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞(抗SiglecF、CD117、FcERI)。免疫细胞功能是通过离体和体内分析不同免疫反应来探询。
遗传筛选提供决定性原理验证且支持这些结论：a)ENU筛选是一种用以鉴定使急性神经炎症钝化的突变(以及最终基因)的强力和有效的平台；b)迄今为止检测的一些突变处于已知对炎性反应至关重要的基因(例如JAK3)中和/或c)迄今为止检测的其它突变处于已知在人慢性炎性疾病的遗传病因学中重要的基因(例如THEMIS、IRF8)中，从而指示在小鼠中进行的急性炎症筛选中发现的基因与其它类型的人炎性病状相关；d)同样，筛选中遗传突变(例如JAK3)的神经炎症保护作用可通过用在临床使用中针对慢性人炎性疾病的化合物药理学抑制相应靶标来模拟(参见实施例I)；e)急性神经炎症模型可用作体内初级筛选以快速和有效临床前评估新型消炎性药物候选物；f)功能未知的新型基因/蛋白质也被鉴定且代表用于消炎性药物发现的新型机会窗口；g)筛选极其灵敏且可检测基因剂量依赖性路径，因为突变显示对神经炎症具有部分抗性，从而表明筛选可检测在体内对其进行部分抑制可具有临床价值的靶标。于此呈现的遗传筛选也是有利的，因为它提供源于宿主的炎症促发多肽。
为进一步表征遗传筛选的靶标，对于未知基因/蛋白质或在炎症中的功能未知的蛋白质，可使用AutoMACSTM系统或必要时更精确细胞拣选策略(例如BD FACSAriaTM)来拣选不同细胞群体且可用适当触发剂体外激发，所述触发剂包括PRR激动剂(LPS、PGN、CpG、polyI:C、MDP、DAP、B-DNA)、重组细胞因子或有丝分裂原(IL-2、IL-7、抗CD3/CD28、PMA+离子霉素)。可进行基于细胞的测定以监测细胞存活(通过膜联蛋白V/碘化丙啶染色和通过FACS进行列举)、增殖(通过用FACS追踪CFSE染色的稀释)和活化(对IFNγ[Th1]、IL-17[Th17]、IL-4[Th2]、FoxP3[Treg]的细胞内染色、以及MHC II类和共刺激性分子CD80/CD86[DC]的细胞表面染色)。这些测定可补充以体内激发和免疫实验来确定所探究的粒细胞、骨髓和淋巴样细胞的活化、存活和迁移能力。用于不同血清细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白的免疫组织化学分析、基于珠粒的免疫测定(BioPlex)和ELISA测定可用于评估体内先天性和继承性(细胞和体液)免疫反应。小鼠可用PAMP/DAMP(例如LPS、PGN、MSU、明矾)腹膜内(IP)注射且流动式细胞测量术用于定量浸润至腹膜腔中的粒细胞和骨髓细胞的频率和数目(Gr-1+、CD11b+、F4/80+、SiglecF+、FcERI+)。可通过BioPlex和ELISA测定来定量腹膜灌洗液和血清中的细胞因子和趋化因子。经典免疫实验可涉及通过腹膜内(IP)注射含DNP-Ficoll或DNP-KLH的完全或不完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)，随后在第28天进行抗原再激发/加强免疫来免疫动物。可通过BioPlex和ELISA来定量不同免疫球蛋白(IgA、IgG1、IgG2a/2b、IgG3、IgM)和细胞因子(IFNγ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17)的产生。可在延迟型过敏测定(用TNBS腹膜内免疫且在足垫中再激发并测量足垫肿胀作为读数)中探询获得性细胞免疫反应。
可通过鉴定相关免疫细胞类型中区分炎症抗性小鼠与炎症易感性小鼠的转录特征(使用RNAseqTM)来对突变对炎性反应的影响进行更深入分析。此全面分析不仅确定鉴定的靶标影响炎性反应所依的免疫机制，而且也可提供对病理性炎症中涉及的细胞类型和路径的完整见解，且可能提供在鉴定的基因/蛋白质的上游或下游起作用的对炎性疾病的免疫细胞功能和生理病理学具有等效结果的其它药物靶标。
可在如IBD的动物模型的其它炎性病状中评估先前鉴定的神经炎症保护性突变的相关性。IBD的实验动物模型个别地重演问题的各方面，且已提供对为肠体内平衡所需的路径、细胞和分子的作用的重要了解。这是通过关于IL-23-Th17细胞路径在IBD中的作用的显著收敛的小鼠和人研究加以最佳说明。IL-23p19是首先在小鼠中克隆且已显示为结肠炎在多个模型中显现所需。中和IL-23使一个模型中的活动性结肠炎完全逆转，这与显示在IBD中具有保护性的显性IL23R SNP编码基因的可变拼接形式，从而产生IL-23的可溶性受体拮抗剂的数据一致。类似地，Nlrp3炎性体-IL-18轴已与免遭结肠炎的保护作用相关联，这与将NLRP3和IL-18受体辅助蛋白(IL18RAP)中的SNP鉴定为IBD的风险等位基因的人遗传研究一致。在初级筛选中鉴定的突变小鼠的反应可在急性和慢性肠炎症的许多互补模型中加以考查，所述模型各自探询免疫反应的特定方面。所述模型包括但不限于用以探测先天性免疫性机制的急性和慢性葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的损伤/结肠炎模型；用以探测Th1/Th17机制以及失调的Treg功能的CD4+CD45RBHi T细胞转移结肠炎模型；用以考查Th2机制的噁唑酮结肠炎模型以及用以探测上皮和先天性免疫性抗微生物防御机制的啮齿柠檬酸杆菌(C.rodentium)感染。可系统测量各种参数以确定结肠炎的严重性，所述参数包括体重损失、用以评估隐窝构造的结肠组织学、杯状细胞损失、表面上皮的侵蚀、炎性细胞的浸润和水肿、用以测量各种抗微生物肽(包括防卫素(defensin))、趋化因子和细胞因子在结肠组织和在血清中中的表达的定量实时PCR和BioPlex/ELISA测定、用以确定细菌在结肠中以及向全身部位(肠系膜淋巴结和脾)的侵染程度的16S rRNA qPCR、以及用以列举结肠肠管中不同群体的免疫细胞(嗜中性白细胞、巨噬细胞、T和B细胞)的频率和绝对数目的流动式细胞测量分析。
也可探究靶标的人对应物内或附近的常见多态性变体(SNP)是否已被关联为全基因组关联研究(GWAS)中的常见炎性疾病的遗传风险。公开的GWAS研究已鉴定包括类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣(PA)、乳糜泻(CeD)、多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)、狼疮(SLE)和炎性肠病(IBD)的常见炎性病状的极其复杂遗传组分。尽管这些GWAS研究已确定共有或为一种疾病所特有的遗传特征和相关免疫/生物化学路径，但将GWAS命中物(hit)转换成用于药物发现和治疗干预的潜在新型靶标因许多因素而复杂，最重要的是缺乏对个别基因在疾病的发作/进展中的生物作用的直接实验验证。在小鼠中受抑制会保护免遭急性炎症的基因之间的正性相关以及公开的GWAS研究中就RA、PA、CeD、MS、T1D、SLE或IBD而言的遗传风险可招致对此基因在人炎性疾病中的作用的生物验证，这是在我们的发现体系中优先考虑此基因和蛋白质的关键准则。
也可确定炎症促发靶标的表达是否在来自罹患慢性炎性疾病的患者的组织样本中受调节。一种方法是基于报道显示重大比例(多达30％)的与疾病相关联的等位基因变体(关联的SNP)也与相关基因(顺式作用eSNP、eQTL)的等位基因特异性差异表达相关。可针对炎症促发小鼠靶标的人对应物中的eSNP的存在性搜索这些公开的数据集，且所述差异表达可与疾病相关。在另一方法中，炎症促发靶标在正常肠粘膜中的表达可与炎症促发靶标在来自IBD患者的发炎粘膜中的表达进行比较(通过例如用以完全捕集组织RNA的RNA测序技术或遵循显微解剖)，所述IBD患者的转录物组在正常和发炎组织和PBL中表达。最后，可测试小鼠靶标的人相关物中的稀有序列变体是否与IBD的特定临床特征或与某些遗传独特组的患者(如家族性病例、极早期发作儿科病例、和来自遗传同源的分离群体的散发性病例)的IBD发作和进展相关。在一实施方案中，各基因的个别外显子和外显子-内含子接合点可用PCR扩增，可经受DNA测序，从而使用标准方法寻找明显功能损失等位基因或非保守性和可能病理性错义突变。在一补充性或替代性实施方案中，也可使用标准方法测定内含子序列。
如果炎症促发蛋白质靶标需要进一步实验表征程度，则对于具有已知生物化学功能或配体结合性的蛋白质，可对底物进行易处理修饰。生物信息学工具也可用于仔细检查预测的氨基酸序列以a)根据与功能已知的其它蛋白质的相关性来推演生物化学功能，及b)确定与特定生物化学活性(核苷酸结合、蛋白酶位点、DNA结合、激酶、磷酸酶等)相关的序列基序和特征以及相关结构折叠，及c)确定指示蛋白质定位的二级结构基序(疏水性跨膜结构域、信号序列、核定位序列)的存在性，从而优先考虑药理学选取。所述蛋白质的候选生物化学活性可遵循在培养细胞中转染和过度表达且寻找与炎症的功能性标记相关的候选活性和/或细胞组分变化的出现，或反之，寻找在由RNAi或ShRNA分子沉默之后它们的消失加以验证。
在炎症促发蛋白质可能不是有吸引力的药理学靶标，但可属于具有其它“可被药物靶向的(druggable)”位点的路径的情况下，可鉴定(使用例如生物信息学工具或来自大规模转录物组学或蛋白质组学分析的公开结果)炎症促发蛋白质的路径。此外，也可在转染的细胞中进行直接实验，例如用以鉴定DNA结合蛋白的靶标的染色质免疫沉淀/测序、以及用以鉴定修饰性酶(蛋白酶、激酶、磷酸酶、泛素连接酶)的底物的蛋白质组学分析。所述路径也可具有其小分子调节剂已可用的蛋白质。
治疗剂的筛选方法
本文所述的筛选方法是被设计来捕集炎症促发多肽的表达和/或活性(共同称为IEP的生物活性)与炎症之间的关系以产生关于所筛选药剂的有价值的信息。
因为显示炎症促发多肽的表达/活性在炎症期间被上调，所以通过于此提供的筛选方法鉴定的药剂也可能具有以下优势：如果它们显示降低IEP的生物活性，则限制炎症以及在与加剧的炎症相关的病状中提供治疗益处。
在筛选应用中，将待筛选的药剂置于与试剂接触。适于此类型的应用的试剂具有与炎症促发多肽的生物活性相关(直接或间接)的参数。如果炎症促发多肽的生物活性因接触筛选的药剂而受限制、阻碍或甚至抑制，则预期所述限制、阻碍或抑制也反映在试剂的参数方面。在一个实施方案中，当炎症促发多肽的生物活性因存在和/或接触筛选的药剂而降低时，参数的水平或量度降低(关于对照水平)。
在第一实施方案中，试剂是核酸分子。核酸分子可为源于一种炎症促发多肽且能够调节它的下游可操作地连接的开放阅读框(例如像编码炎症促发多肽的基因或另一适合报道体基因)的表达的启动子或其片段。当核酸分子是启动子(或与其相关的功能性片段)时，所测量的参数是下游可操作地连接的报道体基因的表达水平，这与筛选的药剂限制、阻碍或抑制由启动子(或功能性片段)驱动的基因表达的能力(或缺乏所述能力)相关。如果药剂能够限制、阻碍或抑制报道体基因的表达，则假定自启动子的表达也受所述药剂限制、阻碍或抑制。或者，如果药剂不能够限制、阻碍或抑制报道体基因自启动子的基因表达，则假定自启动子的表达不受所述药剂限制、阻碍或抑制(且因此所述药剂可缺乏治疗效用)。
在另一实施方案中，核酸分子是转录物，例如像mRNA或它的相应cDNA。如本文所用，转录物是基因的编码区域的至少一个区段的核酸分子拷贝。转录物可例如编码炎症促发多肽。在此特定实施方案中，参数是转录物的稳定性和/或量。如果药剂能够限制、阻碍或抑制编码炎症相关多肽的转录物的稳定性和/或量，则假定转录物的水平受所述药剂限制、阻碍或抑制。或者，如果药剂不能够限制、阻碍或抑制转录物的稳定性和/或量，则假定转录物的水平不受所述药剂限制、阻碍或抑制。
在另一实施方案中，核酸分子是自表达受炎症促发多肽调节的基因表达的转录物。当炎症促发多肽是调节其它基因(也被称为下游基因)的表达的转录因子时，此实施方案特别有利。在此特定实施方案中，参数是转录物的稳定性和/或量。尽管表达受炎症相关多肽调节的单一基因的转录物可用于此方法中，但也设想与至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少100、至少200或至少250个表达受炎症促发多肽调节的基因相关的转录物的水平用于执行所述方法。如果药剂能够调节表达受炎症相关多肽调节的基因的至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少100、至少200或至少250个转录物的稳定性和/或量，则假定转录物的水平受所述药剂调节。或者，如果药剂不能够调节表达受炎症相关多肽调节的基因的至少1、至少5、至少10、至少15、至少20至少25、至少50、至少100、至少200或至少250个转录物的稳定性和/或量，则假定转录物的水平不受所述药剂调节。
在另一实施方案中，试剂是多肽。多肽可为例如炎症促发多肽或其功能性片段。在此特定实施方案中，参数可为多肽的稳定性、量和/或生物活性。如果药剂能够限制、阻碍或抑制炎症相关多肽的稳定性、量和/或生物活性，则假定所述多肽受所述药剂限制、阻碍或抑制。或者，如果药剂不能够限制、阻碍或抑制多肽的稳定性、量和/或生物活性，则假定所述多肽不受所述药剂限制、阻碍或抑制。
在另一实施方案中，试剂是与炎症促发多肽在相同信号传导路径中的多肽(或其功能性片段)。在此特定实施方案中，参数可为多肽的稳定性、量、化学结构/修饰(例如磷酸化状态)和/或生物活性。如果药剂能够限制、阻碍或抑制炎症相关多肽的稳定性、量和/或生物活性，则假定所述多肽受所述药剂限制、阻碍或抑制。或者，如果药剂不能够限制、阻碍或抑制多肽的稳定性、量和/或生物活性，则假定所述多肽不受所述药剂限制、阻碍或抑制。
在另一实施方案中，试剂是能够以物理方式与炎症促发多肽相互作用(直接或间接)的多肽(或其功能性片段)。在此特定实施方案中，参数可为炎症促发多肽与它的结合搭配物之间的缔合的量度。在IEP与它的搭配物结合可导致搭配物的化学结构被修饰(磷酸化状态或泛素化状态)的情况下，参数可为搭配物的稳定性、量、化学结构(例如磷酸化状态)和/或生物活性。如果药剂能够限制、阻碍或抑制两个多肽的缔合或搭配物的化学修饰，则假定炎症促发多肽的生物活性受所述药剂限制、阻碍或抑制。或者，如果药剂不能够限制、阻碍或抑制两个多肽的缔合，则假定炎症促发多肽不受所述药剂限制、阻碍或抑制。
尽管单一参数为使得能够表征药剂所需，但也规定可测量试剂的一种以上参数且甚至一种以上试剂可用于于此提供的筛选应用中。
如以下将进一步论述，药剂与试剂之间的接触可在体外(在可适应例如对试剂的参数的测量的反应容器中)或在体内(例如在动物中)进行。对于筛选应用，适于于此所述的筛选测定的体外环境可为分离的试剂(如分离的核酸分子或多肽)处于具有必要其它试剂的适当缓冲液中。另一适合体外环境可为细胞(如培养细胞)或细胞提取物。当使用培养细胞时，在某一实施方案中，可取的是在培养中维持它的活力。培养细胞应能够提供试剂。细胞优选源于骨髓或淋巴组织(初生细胞培养物或细胞系)。如果使用初生细胞培养物，则细胞可为分离的或呈组织样结构。
对于体内筛选应用，另一适合环境是非人模型，如动物模型。如果在非人模型中进行药剂特性，则所述模型(如啮齿动物)是用所述药剂施用。各种施用剂量和模式可用于充分表征药剂预防、治疗和/或减轻炎性病状的症状的能力。
一旦药剂已与试剂接触，即获得所述试剂的参数的量度或值。此评估可直接在发生接触(例如通过使用探针)所处的反应容器中或用所述反应容器的样本来进行。可在DNA层面、RNA层面和/或多肽层面上对试剂的参数进行测量。
测量步骤可依赖于向反应容器或其样本中添加对于待评估的参数而言具有特异性的计量物。计量物可特异性结合一定参数的所评估试剂。在那些情况下，可确定特异性结合(或不结合)于试剂的计量物的量以提供试剂的参数的量度。在另一实施方案中，计量物可由一定参数的试剂加以修饰。在此特定情况下，修饰(或未修饰)的计量物的量将用于提供试剂的参数的量度。在一实施方案中，计量物的信号可由直接或间接连接于计量物的标记提供。
为评估自目标基因的启动子(与编码炎症促发多肽的基因缔合或与表达受炎症促发多肽调节的靶标基因缔合)的转录活性，可使用报道体测定。在报道体测定中，将报道体载体置于与药剂接触且测量报道体基因的表达水平(通过转录物的量)以提供自启动子的转录活性。报道体载体可包括但不限于可操作地连接于编码报道体多肽(例如像荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)的核苷酸的目标基因的启动子区域(或其功能性片段)。在药剂与试剂接触后，通过测量报道体多肽的转录来间接测量自启动子转录的促进作用。在此特定实施方案中，计量物是报道体多肽且与此计量物相关的所测量信号将随所用报道体多肽而变化。
替代地或补充地，可通过定量核酸分子的量(例如使用qPCR或实时PCR)或所述分子的稳定性(例如通过提供至少两个随时间变化的量度)来评估核酸分子的稳定性和/或表达水平。在一种测定形式中，核酸分子在细胞或组织样本中的表达是通过核酸杂交技术(例如原位杂交)来监测。在另一测定形式中，可在适当条件和时间下使细胞系或组织暴露于待测试的药剂，且分离、任选扩增、并定量总RNA或mRNA。
在一些实施方案中，可对核酸分子或转录物的核酸身份进行确定。确定核酸分子的核酸序列的各种方法为本领域技术人员所知且包括但不限于化学测序(例如Maxam–Gilbert测序)、链终止方法(例如Sanger测序和染料-终止剂测序)、基于限制消化的测序(例如RFLP)、基于杂交的测序(例如DNA微阵列、RNA微阵列、分子信标探针、TaqMan探针)、基于质谱的测序、下一代测序(例如完整外显子组测序、大规模并行标记测序或MPSS、聚合酶群落(Polony)测序、焦磷酸测序、IlluminaTM(Solexa)测序、SOLiDTM测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、HelioscopeTM单一分子测序、单一分子SMRTTM测序、单一分子实时(RNAP)测序和纳米孔DNA测序)。
如果参数的测量是在多肽层面上进行，则可对多肽表达水平进行评估。在一实施方案中，具体来说，多肽的表达水平是例如通过基于抗体的技术(如免疫组织化学分析、BioPlex、ELISA、流动式细胞测量术、蛋白质微阵列、免疫检测)、光谱术等来测量。在一个实施方案中，此测定是利用对靶标多肽具有特异性的抗体(或其衍生物)来进行。
如以下所示，一些炎症促发多肽(如FOXN1)是调节炎症过程中涉及的下游靶标基因的表达的转录因子。因此，这些炎症促发多肽的一种生物活性在于结合其它转录调控剂(也被称为结合搭配物)以及结合它的靶标核苷酸序列以调节基因表达且最终促进炎性反应。通过限制IEP结合它的结合搭配物和/或它的靶标核酸测序来降低炎症促发多肽的转录因子活性将被视为适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病症相关的症状。
可通过测定炎症促发多肽与它的至少一种结合搭配物形成多聚复合物的能力来对转录因子活性进行评估。在体外，反应混合物可包括例如辅因子、底物或其它结合搭配物或其潜在相互作用性片段。IRF8的示例性结合搭配物包括但不限于IRF的成员(IRF1、IRF4)或ETS的成员(PU.1)。USP15的示例性结合搭配物包括但不限于COP9信号体和受体活化的SMAD转录因子。优选地，结合搭配物是直接结合搭配物。此类型的测定可例如通过以下方式来达成：使一种组分(炎症促发多肽或它的结合搭配物)与标记偶联以使标记的组分与另一组分的结合可通过检测复合物中标记的化合物来测定。组分可用125I、35S、14C或3H直接或间接标记，且可通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，组分可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶进行酶标记，且通过测定适当底物向产物的转化来检测酶标记。竞争测定也可用于评估测试化合物与靶标之间的物理相互作用。
在另一测定形式中，当炎症促发多肽是转录因子时，它的活性可通过定量(或半定量)它的靶标基因的表达水平来测量，所述靶标基因的表达受炎症促发多肽的存在和活性调节。可例如通过PCR(qPCR)进行所述测量。例如，IRF8的靶标基因包括但不限于表1、2和/或3中所列的基因。
在另一测定形式中，当炎症促发多肽是转录因子时，它的活性可通过测定对它的至少一种核酸识别基序的转录亲和力来测量。可例如通过胶凝阻滞迁移测定进行所述测量。例如，识别IRF8的核酸基序包括但不限于GAAAnnGAAA(SEQ ID NO:1)和GGAAAnnGAAA(SEQ ID NO:2)。
如于此所示，一些炎症促发多肽参与各种信号传导路径且与其它多肽(例如CCDC88B)相互作用。能够限制炎症促发多肽(如CCDC88B)参与信号传导级联的药剂将被视为适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。为鉴定调节炎症促发多肽与它的结合搭配物之间的相互作用的药剂，例如在足以允许两个多肽形成复合物的条件下且持续足以允许两个多肽形成复合物的时间，制备含有试剂(例如炎症促发多肽)和结合搭配物的反应混合物。为测试药剂是否调节炎症促发多肽与它的结合搭配物之间的相互作用，可在存在和不存在测试药剂下提供反应混合物。测试药剂可最初包括在反应混合物中，或可在添加靶标和它的细胞或细胞外结合搭配物之后的某一时间添加。在无测试药剂下或与媒介物一起孵育对照反应混合物。接着检测靶标产物与细胞或细胞外结合搭配物之间的任何复合物的形成。在含有测试化合物的反应混合物中而非在对照反应中形成复合物指示测试药剂有助于炎症促发多肽与相互作用性结合搭配物的相互作用。
在一实施方案中，有可能通过测量报道体基因的表达水平来间接检测炎症促发多肽复合物的形成，所述报道体基因的表达受复合物的存在(或不存在)调节。
在另一测定形式中，也可检测两个分子(尤其两个多肽)之间的直接相互作用。可用于方法中的信号产生或检测系统包括但不限于荧光方法，如荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、蛋白质片段互补测定(PCA)、生物分子互相作用分析(BIA)、荧光淬灭、荧光偏振以及其它化学发光、电化学发光、拉曼(Raman)、放射性、比色方法；杂交保护测定和质谱方法。
用于测定炎症促发多肽的生物活性的另一实例是测定炎症促发多肽向蛋白质添加和/或移除泛素部分的能力。如本文所示，USP15(炎症促发多肽)是一种半胱氨酸水解酶，其裂解泛素(Ub)单元之间的异肽键以及Ub(C末端甘氨酸)与结合的蛋白质之间的肽键。当USP15是炎症促发多肽时，能够限制(甚至抑制)它的去泛素酶活性的药剂被视为适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。例如，可使用无细胞测定。此测定可基于自泛素化固定靶标(例如泛素化SMAD3)以多肽依赖性方式移除Ub部分与基于ELISA的对反应中出现游离Ub的免疫检测联用。或者，如果炎症促发多肽显示对酯、硫酯以及酰胺和异肽键的硫醇依赖性水解，则使用荧光产生性肽的筛选也可用作初级测定。间接地，可检测对炎症促发多肽依赖性靶标(例如像对于USP15、TGFβ或BMP或报道体基因(pCAGA12-lux；ID1-BRE-lux))的表达的调节。
无细胞筛选测定通常涉及在足以允许两个组分相互作用且结合，由此形成可被移除和/或检测的复合物的条件下且持续足以允许两个组分相互作用且结合，由此形成可被移除和/或检测的复合物的时间来制备试剂和测试化合物的反应混合物。在一个实施方案中，使试剂锚定于固相上。可在反应(例如结合反应)结束时检测锚定在固相上的试剂相关复合物。例如，试剂可锚定于固体表面上，且可用本文论述的可检测标记直接或间接标记测试化合物(未锚定)。所述固相的实例包括微量滴定板、试管、阵列载片、珠粒和微量离心管。在一个实施方案中，可提供添加允许一种或两种蛋白质结合于基质的结构域的炎症促发蛋白质。在孵育之后，洗涤容器以移除任何未结合组分，在珠粒的情况下固定基质，例如如上所述直接或间接测定复合物。或者，可使复合物自基质解离，且使用标准技术测定蛋白质结合或活性的水平。
为进行所述测定，添加非固定组分(药剂)至含有锚定组分的涂布表面。在反应完成之后，在使得形成的任何复合物都将保持固定在固体表面上的条件下移除(例如通过洗涤)未反应组分。对锚定在固体表面上的复合物的检测可以许多方式来达成。当对先前非固定的组分进行预标记时，检测到固定在表面上的标记指示形成复合物。当未对先前非固定的组分进行预标记时，间接标记可用于检测锚定在表面上的复合物，例如使用对固定组分具有特异性的标记的抗体(所述抗体又可用例如标记的抗Ig抗体直接标记或间接标记)。
或者，无细胞测定可在液相中进行。在所述测定中，通过许多标准技术的任一者来使反应产物与未反应组分分离，所述技术包括但不限于差速离心、色谱(凝胶过滤色谱、离子交换色谱)和/或电泳。所述树脂和色谱技术为本领域技术人员所知。此外，也可如本文所述合宜地利用荧光能量转移来在不自溶液进一步纯化复合物下检测结合。
可以异质或均质形式进行于此所述的测定。异质测定涉及使试剂或结合搭配物锚定于固相上，以及在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在均质测定中，整个反应都是在液相中进行。在任一方法中，可变化反应物的添加顺序来获得关于所测试药剂的不同信息。例如，例如通过竞争来干扰试剂与结合搭配物之间的相互作用的测试药剂可通过在测试物质存在下进行反应来鉴定。或者，可通过在复合物已形成之前添加测试化合物至反应混合物中来测试有助于预形成的复合物的测试药剂。以下简要描述各种形式。
在一异质测定系统中，使试剂或结合搭配物锚定于固体表面(例如微量滴定板)上，同时直接或间接标记非锚定物质。锚定的物质可通过非共价或共价连接加以固定。或者，对待锚定的物质具有特异性的固定的抗体可用于使物质锚定于固体表面。
为进行所述测定，使固定的物质的搭配物暴露于用或未用药剂涂布的表面。在反应完成之后，移除(例如通过洗涤)未反应组分且形成的任何复合物都将保持固定在固体表面上。当对非固定物质进行预标记时，检测到固定在表面上的标记指示形成复合物。当未对非固定物质进行预标记时，间接标记可用于检测锚定在表面上的复合物，例如使用对初始非固定的物质具有特异性的标记的抗体(所述抗体又可用例如标记的抗Ig抗体直接标记或间接标记)。视反应组分的添加顺序而定，可检测使得能够形成复合物或促进预形成复合物的稳定性的药剂。
或者，反应可在存在或不存在药剂下在液相中进行，使反应产物与未反应组分分离，且例如使用用以锚定溶液中形成的任何复合物的对一种结合组分具有特异性的固定抗体以及用以检测锚定的复合物的对另一搭配物具有特异性的标记的抗体来检测复合物。再次，根据向液相中添加反应物的顺序，可鉴定使得能够形成复合物或促进预形成复合物的稳定性的测试化合物。
在一替代性实施方案中，可使用均质测定。例如，制备试剂和相互作用性细胞或细胞外结合搭配物产物的预形成复合物，因为靶标产物或它们的结合搭配物被标记，但由标记产生的信号由于复合物形成而淬灭。添加有利于形成复合物的药剂将导致产生低于对照值的信号。以此方式，可鉴定促进结合搭配物相互作用的药剂。
在另一方面，试剂可在双杂交物测定或三杂交物测定中用作“诱饵蛋白质”以鉴定结合结合搭配物或与结合搭配物相互作用且涉及炎症促发多肽活性的其它蛋白质。所述结合搭配物可为信号或转录控制的活化剂或抑制剂。
在另一实施方案中，用于选择与炎症促发多肽相互作用的化合物的测定可为基于细胞的测定。适用测定包体测量炎症的标记的测定。基于细胞的测定可包括使表达炎症促发多肽的细胞与药剂接触及测定测试化合物调节(例如刺激或抑制)炎症促发多肽的活性的能力，和/或测定药剂调节炎症促发多肽或相关蛋白质在细胞中的表达的能力。基于细胞的系统可用于鉴定使炎症促发多肽的表达和/或活性和/或作用降低的化合物。所述细胞可为重组或非重组细胞，如表达炎症促发基因的细胞系。在一些实施方案中，细胞可为表达炎症促发多肽的结合搭配物的重组或非重组细胞。示例性系统包括表达炎症促发多肽(例如自重组核酸)的哺乳动物或酵母细胞。在利用所述系统时，使细胞暴露于怀疑使炎症促发多肽的表达和/或活性降低的药剂。在暴露之后，例如测定细胞的炎症促发多肽的表达或活性。细胞可来自获自生物体(例如用药剂处理的生物体)的稳定细胞系或原代培养物。
除基于细胞且在体外的测定系统之外，也可使用非人生物体，例如转基因非人生物体或模式生物体。转基因生物体是其中异源DNA序列以染色体整合方式进入动物的生殖细胞中的生物体。转基因生物体也将具有整合至它的体细胞的染色体中的转殖基因。可在本文所述的方法中使用任何物种的生物体，包括但不限于：酵母、蠕虫、蝇、鱼、爬行动物、鸟类、哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猪、迷你猪和山羊)和非人灵长类动物(例如狒狒、猴、黑猩猩)。
本文所述的方法中使用的转基因细胞或动物可包括编码炎症促发多肽、片段或变体的转殖基因。转殖基因可编码对于转基因细胞或动物而言通常是外源性的蛋白质，包括人蛋白质，例如人炎症促发多肽或它的一种结合搭配物。可使转殖基因连接于异源或天然启动子。制备转基因细胞和动物的方法在本领域中是已知的。
在另一测定形式中，可测定已暴露于待测试的药剂的无细胞系统、细胞系、细胞群体或动物模型中炎症促发多肽的相对于标准单位加以标准化的比活性，且与未暴露的对照无细胞系统、细胞系、细胞群体或动物模型进行比较。也可使用缺乏炎症促发多肽的系统(例如其中基因的至少一个拷贝编码非功能性炎症促发多肽)评估筛选的化合物的比活性。
在一个实施方案中，测量步骤包括(或在于)测量参数的低于对照水平(通常与缺乏对与炎性病状相关的症状的预防、治疗和/或减轻相关)的测试水平。在此实施方案中，存在量度指示筛选的药剂能够预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。另一方面，不存在量度指示筛选药剂缺乏预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的能力。
在其它实施方案中，一旦已进行测量，即可求出与其相关的值且与对照值进行比较。在筛选应用中，将药剂对炎症促发多肽的表达和/或活性的影响与对照值进行比较。在一实施方案中，对照值与缺乏对炎性病状的症状的预防、治疗和/或减轻相关，且因此，适用于预防、治疗和/或减轻炎性病状的症状的药剂能够使测量的参数降低至对照值以下。在此实施方案中，不被视为适用于预防、治疗和/或减轻炎性病状的症状的药剂将呈现参数等于或高于对照值。
在另一实施方案中，对照值与预防、治疗和/或减轻炎性病状的症状相关，且因此，适用于预防、治疗和/或减轻炎性病状的相关药剂的测量参数等于或低于对照值。在所述实施方案中，不适用于预防、治疗和/或减轻炎性病状的症状的药剂显示测试值高于对照值。
在一实施方案中，比较可由个体来进行。在另一实施方案中，比较可在比较模块中进行。所述比较模块可包括处理器和存储卡以执行应用程序。处理器可访问存储器来检索数据。处理器可为可对数据进行操作的任何装置。实例是中央处理单元(CPU)、前端处理器、微处理器、图形处理单元(PPU/VPU)、物理处理单元(PPU)、数字信号处理器和网络处理器。应用程序与处理器联用且被配置来相对于对照值确定药剂对所基于的试剂的参数的影响。此比较的输出可被传输至显示装置中。可由处理器访问的存储器接受并储存数据，如试剂的测量参数或产生或使用的任何其它信息。存储器可为主存储器(如高速随机存取存储器或RAM)或辅助存储单元(如硬盘、软盘或磁带驱动器)。存储器可为任何其它类型的存储器(如只读存储器或ROM)或光存储介质(如视盘或光盘)。
一旦进行试剂的参数与对照值之间的比较，则有可能表征药剂。此表征是可能的，因为如本文所示，对于能够治疗、预防和/或减轻与炎性病症相关的症状的药剂，炎症促发多肽的表达和/或活性被下调。
在一实施方案中，表征可由个体来进行。在另一实施方案中，表征可用用以执行应用程序的处理器和存储卡来进行。处理器可访问存储器来检索数据。处理器可为可对数据进行操作的任何装置。实例是中央处理单元(CPU)、前端处理器、微处理器、图形处理单元(PPU/VPU)、物理处理单元(PPU)、数字信号处理器和网络处理器。应用程序与处理器联用且被配置来表征所筛选的个体或药剂。此表征的输出可被传输至显示装置中。可由处理器访问的存储器接受并储存数据，如试剂的测量参数或产生或使用的任何其它信息。存储器可为主存储器(如高速随机存取存储器或RAM)或辅助存储单元(如硬盘、软盘或磁带驱动器)。存储器可为任何其它类型的存储器(如只读存储器或ROM)或光存储介质(如视盘或光盘)。
本文所述的筛选方法可用于测定药剂预防、治疗或减轻炎性病状的症状的能力。此筛选方法背后的前提是炎症促发多肽活性或表达在炎症期间被上调。因此，通过评估炎症促发多肽的活性或表达的下调是否由药剂造成，所述药剂可与它预防、治疗或减轻炎性病症的症状的能力相关联。在这些方法中，对照值可为在不存在药剂下的试剂参数。在此特定实施方案中，试剂的参数可在药剂与试剂组合之前或在相同反应容器的至少两个平行测定中(其中一个筛选系统不包括药剂)测量。对照值也可为在已知不限制炎症或预防/治疗/减轻炎性病症的症状的对照剂存在下的试剂参数。所述对照剂可为例如药学上惰性赋形剂。对照值也可为自包括来自未受炎症折磨的健康受试者的细胞或组织的反应容器获得的试剂参数。对照值也可为与缺乏炎症(或炎性病症)相关的预定值。药剂的能力是基于试剂参数值相对于对照值的比较来确定。
当试剂参数值低于对照值时，所述药剂被表征为能够预防、治疗或减轻炎性病症的症状。另一方面，当试剂参数的量度低于或等于对照值时，所述药剂被表征为缺乏预防、治疗或减轻炎性病症的症状的能力。
本发明也提供用于执行本文所述的表征和方法的筛选系统。这些系统包括用于放置药剂和试剂的反应容器、电脑系统中的处理器、可由所述处理器访问的存储器和与所述处理器联用的应用程序。应用程序或应用程序组被配置来接收在药剂存在下的试剂参数测试值；将所述测试值与对照值进行比较和/或随此比较而变化来表征所述药剂。
本发明也提供一种收录在电脑可读介质上的软件产品。此软件产品包括用于根据本文所述的方法来表征个体或药剂的说明书。软件产品包括用于接收在药剂存在下的试剂参数测试值的接收模块；接收来自测量模块的输入以确定所述测试值是否低于、等于或高于对照值的比较模块；接收来自所述比较模块的输入以基于比较结果进行表征的表征模块。
在一实施方案中，在系统的电脑系统中所见的应用程序用于比较模块中。测量模块提取/接收来自反应容器的关于试剂参数的信息。接收模块与比较模块联用，所述比较模块接收试剂参数值且确定此值是否低于、等于或高于对照值。比较模块可与表征模块联用。在另一实施方案中，在系统的电脑系统中所见的应用程序用于表征模块中。比较模块与表征模块联用，所述表征模块接收比较结果且基于此比较结果进行表征。在另一实施方案中，接收模块、比较模块和表征模块被组织成单一离散系统。在另一实施方案中，各模块被组织成不同离散系统。在另一实施方案中，至少两个模块被组织成单一离散系统。
用于验证治疗性化合物的就炎症促发多肽而言的杂合子动物
在一些情况下，可能必要的是在动物模型中验证体外筛选的结果(来自无细胞测定或基于细胞的测定)。在其它情况下，也可能必要的是直接在动物中进行初始筛选。对于那些情况，于此提供杂合子动物以提供用于确定特定药剂是否适用于预防、治疗或减轻与炎性病状相关的症状的炎症的动物模型。
如本文所论述，当用伯氏疟原虫激发时，携带编码非功能性炎症促发多肽的基因的两个拷贝的小鼠不能够诱导、发起完全炎性反应。预期在涵盖编码炎症促发多肽的基因的基因座处是纯合的动物不显示对潜在消炎剂的差异反应，因为它们不能诱导炎性反应。
另一方面，当用伯氏疟原虫激发时，携带编码功能性炎症促发多肽的基因的两个拷贝的小鼠能够诱导、发起和维持完全且充分炎性反应。预期在涵盖编码炎症促发多肽的基因的基因座处是纯合的动物显示对潜在消炎剂的极小差异反应，因为它们发起强力炎性反应且极快速死亡。
因此，本发明提供一种在涵盖编码炎症促发多肽的基因的基因座处是杂合的动物。作为第一基因拷贝，提供功能性炎症促发多肽且其允许动物发起炎性反应。作为第二基因拷贝，提供非功能性炎症促发多肽且其在发起强力炎性反应方面对动物进行限制。非功能性拷贝可例如编码已丧失它的生物活性的突变蛋白质、剔除基因或敲入基因。因此，于此提供的动物能够发起炎性反应，但不是强力炎性反应，且能够显示对潜在消炎剂的差异反应。本发明也提供杂合动物用于评估筛选的药剂预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的适用性的用途。这定义为针对通过本发明中所述的方法鉴定的给定靶标的抑制剂的敏化筛选。
为确定药剂是否能够治疗或减轻与炎性病状相关的症状，首先在动物中诱导(通过施用触发剂)炎性反应且接着施用筛选的药剂。另一方面，为确定药剂是否能够防止炎性病状的发作，首先施用筛选的药剂且接着向动物提供触发剂。在不存在药剂下，触发剂(例如传染物，例如像伯氏疟原虫)能够诱导动物的炎性反应。
一旦已施用药剂和炎性触发剂，则测量炎性反应的参数。在传染物作为炎症触发剂施用，且已知所述触发剂最终导致受感染动物死亡的实施方案中，参数可为存活率或死亡率。尽管死亡是伯氏疟原虫感染模型中急性炎症的终点，但其它中间表型先于死亡且是致死性的预测；这些表型包括出现神经症状，如发热、震颤、嗜睡、后肢麻痹和昏迷。也可测量其它炎症相关参数(替代指标)，如免疫细胞数目和类型、细胞因子分布、趋化因子分布、免疫球蛋白分布、水肿、血脑屏障渗透性等。
在一实施方案中，测量也可包括测量随对照值而变化的参数。例如，当血脑屏障渗透性是测量的参数时，测量步骤可包括测量高于与非炎性状态相关的对照值的血脑屏障渗透性。存在量度(例如因为量度高于对照值)指示药剂是适用的。另一方面，不存在量度(例如因为量度低于对照值)指示药剂缺乏效用。
一旦测量，即可将测试参数(也被称为测试水平)与对照进行比较且基于此比较结果表征药剂。所述对照可与预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状相关或与缺乏对与炎性病状相关的症状的预防、治疗和/或减轻相关。对照可例如自尚未用药剂治疗或已用已显示不预防、治疗或减轻与炎性病状相关的症状的模拟剂(例如药学上可接受的赋形剂)治疗的动物获得。
例如，当所评估的参数是存活率且所用对照与缺乏对与炎性病状相关的症状的预防、治疗和/或减轻相关时，如果治疗的动物的存活率高于非治疗/模拟治疗的动物的存活率(例如与缺乏对与炎性病状相关的症状的预防、治疗和/或减轻相关的对照)，则药剂被视为适用。另一方面，如果治疗的动物的存活率等于或高于非治疗/模拟治疗的动物的存活率(例如与缺乏对与炎性病状相关的症状的预防、治疗和/或减轻相关的对照)，则药剂将不被视为适用(或将被视为缺乏效用)。
为对这些动物模型进行使用，设想炎症促发多肽(例如像CCDC88B、FOXN1或USP15)的单一基因的拷贝被修饰来编码非功能性多肽。然而，也设想各自编码不同炎症促发多肽的至少两个不同基因的拷贝在动物中被修饰(例如像CCDC88B和FOXN1的组合、CCDC88B和USP15的组合、或FOXN1和USP15的组合)。也设想各自编码不同炎症促发多肽的至少三个不同基因的拷贝在动物中被修饰(例如像CCDC88B、FOXN1和USP15的组合)。在一些情况下，可能可取的是提供与动物的炎症中牵涉的其它基因座相关的其它遗传突变。例如，有可能获得另外携带非功能性基因的拷贝的动物，所述基因编码JAK3、THEMIS、IRGM1、IRF1和IRF8的至少一者；JAK3、THEMIS、IRGM1、IRF1和IRF8的至少两者；JAK3、THEMIS、IRGM1、IRF1和IRF8的至少三者；JAK3、THEMIS、IRGM1、IRF1和IRF8的至少四者；或JAK3、THEMIS、IRGM1、IRF1和IRF8的全部五者。
用于提供非功能性基因拷贝的方法包括但不限于化学突变诱发(例如ENU定向突变诱发)和基因转移。杂合子动物也可通过使在涵盖编码非功能性炎症促发多肽的基因的基因座处是纯合的动物与在涵盖编码功能性炎症促发多肽的基因的基因座处是纯合的动物育种来获得。
各种动物可被获得且用于此方法中。在一实施方案中，动物是非人哺乳动物，如哺乳动物。在一些实施方案中，动物是啮齿动物(例如小鼠)。
使用炎症促发多肽靶标的预测方法
本文所述的预测方法被设计来捕集炎症促发多肽的生物活性与炎性病状之间的关系以产生关于向个体施用的治疗剂或所表征的个体的有价值的信息。如本文所示，炎症促发多肽的生物活性与个体诱导、发起和/或持续炎性反应的能力正性相关。当炎症促发多肽在个体中表达且具有功能性时(例如当炎症促发多肽显示生物活性时)，这指示所述个体能够产生或维持炎性反应。或者，当炎症促发多肽在个体中在较低水平下表达、不表达或不具有功能性时(例如当炎症促发多肽显示降低或不存在的生物活性时)，这指示所述个体不能够产生或维持充分且完全炎性反应。
炎症促发多肽的生物活性与炎症之间的此相关性也提供用于确定治疗方案在个体中是否成功预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的基础。如果炎症促发多肽的生物活性由治疗方案降低，则假定方案成功预防、治疗和/或减轻与个体的炎性反应相关的症状。或者，如果在施用治疗方案后，炎症促发多肽的生物活性不降低(例如保持相同或增加)，则假定方案不成功预防、治疗和/或减轻个体的炎性病状。
炎症促发多肽的生物活性与炎症之间的此相关性进一步提供用于评估个体显现炎性病状或受炎性病状折磨的风险的基础。如果筛选的个体中炎症促发多肽的生物活性相对于对照个体(例如已知不处于显现炎性病状或受炎性病状折磨的风险下的健康个体)较高，则假定筛选个体处于显现(易患)炎性病状或受炎性病状折磨的风险下。或者，如果筛选的个体中炎症促发多肽的生物活性类似于或低于在对照个体(例如已知不处于显现炎性病状或受炎性病状折磨的风险下的健康个体)中观察的生物活性，则假定筛选的个体不处于(易患)显现炎性病状或受炎性病状折磨的风险下。
在这些预测应用中，获得个体的生物样本且可将其放置在反应容器中。生物样本包含与炎症促发多肽相关的分析物(也被称为试剂)。在测定中，反应容器可为可适应对分析物/试剂的参数的测定的任何类型的容器。
一旦已提供生物样本，即可测量分析物/试剂的一种参数。此测量可直接在反应容器(通过使用探针)中或用所述反应容器的样本来进行。如上所指示，在筛选章节中，测量可在DNA层面、RNA层面和/或多肽层面上进行。如以上在筛选章节中也指示，分析物/试剂可为炎症促发多肽本身(相应转录物和/或基因)和/或与炎症促发多肽的生物活性相关的多肽(相应转录物和/或基因)。测量可涉及单一炎症促发多肽或炎症促发多肽的组合(例如两种或三种炎症促发多肽)。
在一实施方案中，测量步骤也可包括测量随对照值而变化的参数。例如，当IEP的量是测量的参数时，测量步骤可包括测量低于与非炎性状态相关的对照值的IEP的量。存在量度(例如因为量度低于对照值)指示药剂适用于治疗的个体。另一方面，不存在量度(例如因为量度高于对照值)指示药剂在治疗的个体中缺乏效用。
以上在“治疗剂的筛选方法”章节中描述的用于测量试剂以及获得IEP的生物活性的参数的测试水平的方法可用于本文所述的预测方法中。
一旦已对参数进行测量，即进行与对照水平的比较。例如，如果方法是用于测定治疗剂在个体中的适用性且所测量的分析物/试剂是mRNA表达谱(表达受炎症促发多肽(例如IRF8)调节的多种基因的转录物的身份和/或量)，则比较步骤可包括确定与表达受炎症促发多肽调节的多种基因相关的mRNA转录物的身份和/或各mRNA转录物的量。将获得的mRNA谱(转录物的遗传身份和/或转录物的量)与由健康个体获得的健康mRNA谱(与缺乏炎性病状相关的对照)和/或由受折磨和未治疗个体获得的疾病mRNA谱(与存在炎性病状以及因此缺乏对症状的预防、治疗和/或减轻相关的对照)进行比较以确定获得的mRNA谱与哪个mRNA谱更类似。如果获得的mRNA谱相对于疾病mRNA谱而言更类似于健康mRNA谱，则可假定治疗剂适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。或者，如果获得的mRNA谱相对于健康mRNA谱而言更类似于疾病mRNA谱，则可假定治疗剂不适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。
在另一实例中，如果方法是用于确定个体的炎性病状易患性或受折磨性且所测量的分析物/试剂是炎症促发多肽(例如USP15)的生物活性，则比较步骤可包括将筛选的个别鉴定物的生物活性的测试水平与炎症促发多肽的对照水平进行比较。可将测量的生物活性与可由健康个体获得的健康对照水平(与缺乏炎性病状相关的对照)和/或由受折磨和未治疗个体获得的疾病对照水平(与存在炎性病状以及因此缺乏对症状的预防、治疗和/或减轻相关的对照)进行比较以确定测量的生物活性与哪个对照水平更类似。如果测量的测试水平相对于疾病水平而言更类似(例如更接近)于健康水平，则可假定个体不易患(或至少如同健康个体一样易患)炎症促发多肽或不受炎症促发多肽折磨。或者，如果测量水平相对于健康对照水平而言更类似(更接近)于疾病对照水平，则可假定个体易患炎性病状或受炎性病状折磨。
在一实施方案中，比较可由个体来进行。在另一实施方案中，比较可在比较模块中进行。所述比较模块可包括处理器和存储卡以执行应用程序。处理器可访问存储器来检索数据。处理器可为可对数据进行操作的任何装置。实例是中央处理单元(CPU)、前端处理器、微处理器、图形处理单元(PPU/VPU)、物理处理单元(PPU)、数字信号处理器和网络处理器。应用程序与处理器联用且被配置来将测试水平与对照水平进行比较。此比较的输出可被传输至显示装置中。可由处理器访问的存储器接受并储存数据或产生或使用的任何其它信息。存储器可为主存储器(如高速随机存取存储器或RAM)或辅助存储单元(如硬盘、软盘或磁带驱动器)。存储器可为任何其它类型的存储器(如只读存储器或ROM)或光存储介质(如视盘或光盘)。
一旦进行比较，则有可能表征治疗剂的适用性或个体的易患性。此表征是可能的，因为如本文所示，至少一种炎症促发多肽的生物活性与炎症的发作和维持相关。
在一实施方案中，表征可由个体来进行。在另一实施方案中，表征可用用以执行应用程序的处理器和存储卡来进行。处理器可访问存储器来检索数据。处理器可为可对数据进行操作的任何装置。实例是中央处理单元(CPU)、前端处理器、微处理器、图形处理单元(PPU/VPU)、物理处理单元(PPU)、数字信号处理器和网络处理器。应用程序与处理器联用且被配置来表征所测试个体。此表征的输出可被传输至显示装置中。可由处理器访问的存储器接受并储存数据或产生或使用的任何其它信息。存储器可为主存储器(如高速随机存取存储器或RAM)或辅助存储单元(如硬盘、软盘或磁带驱动器)。存储器可为任何其它类型的存储器(如只读存储器或ROM)或光存储介质(如视盘或光盘)。
本文所述的预测方法适用于确定所施用的治疗方案是否适用或不适用于预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状。如果治疗方案适用，则假定在施用至少一剂治疗剂后，个体中至少一种炎症促发多肽的生物活性将降低。在一些情况下，可能必要的是施用治疗剂一次以上以观察某一(一些)治疗益处。因此，有可能按时重复方法以确定治疗剂是否(i)持续提供治疗益处或(ii)可在施用一次以上时提供治疗益处。如果允许，则也有可能在摄取治疗剂之前和之后执行此方法。
本文所述的预测方法适用于确定个体是否易患炎性病状/受炎性病状折磨。所述方法可连同其它方法一起用于提供对个体的炎性病状的诊断。如果个体易患/受折磨，则假定至少一种炎症促发多肽的生物活性将高于对照健康个体。在一些情况下，可能必要的是执行方法一次以上以确定易患性是否进一步增加或炎性病状是否继续恶化。
本文呈现的预测方法也可适用于基于炎症促发多肽的活性水平来分类已诊断有炎性病状的个体。本文呈现的预测方法也可适用于确定先前诊断(且任选加以治疗)有病状的个体的炎性病状的复发性。
本发明也提供用于执行本文所述的表征和方法的预测系统。这些系统包括用于放置生物样本的反应容器、电脑系统中的处理器、可由所述处理器访问的存储器和与所述处理器联用的应用程序。应用程序或应用程序组被配置来接收试剂参数测试水平；将所述测试水平与对照水平进行比较和/或随此比较而变化来表征治疗剂/个体。
本发明也提供一种收录在电脑可读介质上的软件产品。此软件产品包括用于根据本文所述的方法来表征个体的说明书。软件产品包括用于接收生物样本中的试剂参数测试水平的接收模块；接收来自测量模块的输入以将所述测试水平与对照水平进行比较的比较模块；接收来自所述比较模块的输入以基于比较结果进行表征的表征模块。
在一实施方案中，在系统的电脑系统中所见的应用程序用于比较模块中。测量模块提取/接收来自反应容器的关于测试水平的信息。接收模块与比较模块联用，所述比较模块接收测试水平的值且确定此值是否与对照水平相同或不同。比较模块可与表征模块联用。
在另一实施方案中，在系统的电脑系统中所见的应用程序用于表征模块中。比较模块与表征模块联用，所述表征模块接收比较结果且基于此比较结果进行表征。
在另一实施方案中，接收模块、比较模块和表征模块被组织成单一离散系统。在另一实施方案中，各模块被组织成不同离散系统。在另一实施方案中，至少两个模块被组织成单一离散系统。
研究工具
本发明也提供基于炎症促发多肽(IEP)的表达改变(例如降低)或突变IEP的表达的研究工具。
一种可适用于表征炎症病状的研究工具是IEP的突变多肽。当在受试者中表达时，突变IEP能够防止所述受试者的炎性病状的发作和/或维持。突变IEP包括能够防止受试者的炎性病状的发作和/或维持的截短形式的IEP以及突变形式的IEP。截短形式的IEP是比野生型IEP短至少一个氨基酸的多肽。突变形式的IEP是当相较于野生型IEP时，具有至少一个氨基酸取代或添加的多肽。如果当与另一多肽最优比对(伴有适当插入和/或缺失)时，在至少60％核苷酸碱基，通常至少70％、更通常至少80％、优选至少90％、且更优选至少95-98％氨基酸残基中存在核苷酸序列同一性，则多肽或其片段与另一多肽或其片段“实质上同源”或“实质上一致”。如所述的同源性或同一性比较的长度可历经较长链段，且在某些实施方案中，将常历经至少5个氨基酸、至少14个氨基酸、至少20个氨基酸、更通常至少24个氨基酸、通常至少28个氨基酸、更通常至少32个氨基酸、且优选至少36个或大于36个氨基酸的链段。在一实施方案中，突变IEP是截短或突变形式的CCDC88B或USP15。一种示例性突变IEP是SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列。
可使用的另一研究工具是编码本文所述的分离的IEP或突变IEP的核酸载体。如本文所用，术语“载体”是指表达载体(例如源于逆转录病毒、腺病毒、疱疹或牛痘病毒、细菌或真菌质粒)以及整合型载体(被设计来例如特异性破坏IEP的适当表达)。
细胞(在一些实施方案中是分离的细胞)也可用于本文所述的方法中。一些细胞可被设计成就编码炎症促发多肽(IEP)的基因而言是杂合的。在所述细胞中，在相同基因座处可见两个不同基因拷贝。例如，细胞可携带编码IEP的第一基因拷贝和编码IEP的突变体的第二基因拷贝。其它细胞可被设计成就编码突变炎症促发多肽(IEP)的基因而言是纯合的。也涵盖杂合细胞和纯合细胞的组合。在一些实施方案中，细胞将成为转基因细胞且可甚至携带本文所述的载体。
动物(在一些实施方案中是自其分离的细胞和组织)也可用于本文所述的方法中。一些动物可被设计成就编码炎症促发多肽(IEP)的基因而言是杂合的。在所述动物中，在相同基因座处可见两个不同基因拷贝。例如，动物可携带编码IEP的第一基因拷贝和编码IEP的突变体的第二基因拷贝。其它动物可被设计成就编码突变炎症促发多肽(IEP)的基因而言是纯合的。也涵盖杂合动物和纯合动物的组合。在一些实施方案中，动物将成为转基因动物且可甚至携带本文所述的载体。
治疗方法
本发明据此提出炎症促发多肽的生物活性随炎症而增加，且反之，炎症促发多肽的生物活性的降低将有益于预防、治疗和/或减轻与炎性病症相关的症状。因此，预期至少一种(或两种或三种)炎症促发多肽的表达的降低将有益于降低病理性炎症反应的程度或时长。因此，本申请提供一种用于基于抑制至少一种IEP的生物活性来预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的方法以及IEP的抑制剂预防、治疗和/或减轻与炎性病状相关的症状的用途。
可出于此目的施用的药剂包括但不限于小分子、肽、抗体、核酸、其类似物、其多聚体、其片段、其衍生物及其组合。
为限制以及甚至停止炎症促发多肽的表达，有可能使用基于核苷酸的药剂，如完全或部分互补于且可杂交于编码炎症促发多肽的靶标核酸的反义核酸或寡核苷酸(DNA或RNA)。例如，反义核酸或寡核苷酸可互补于5'或3'未翻译区域，或可重叠至少一种编码炎症促发多肽的核酸分子的翻译起始密码子(5'未翻译和翻译区域)。作为非限制性实例，反义寡核苷酸可被靶向来杂交以下区域：mRNA帽区域；翻译起始位点；翻译终止位点；转录起始位点；转录终止位点；聚腺苷酸化信号；3'未翻译区域；5'未翻译区域；5'编码区域；中间编码区域；3'编码区域；DNA复制起始和延伸位点。优选地，互补寡核苷酸被设计来杂交编码炎症促发多肽的核酸分子的最独特5'序列，包括跨越5'编码序列的任何约15-35个核苷酸。
在另一实施方案中，可构建将结合双链体核酸(即DNA:DNA或DNA:RNA)以形成含有三螺旋的稳定核酸或稳定三链体核酸。所述三链体寡核苷酸可抑制编码炎症促发多肽的核酸的转录和/或表达。三链体寡核苷酸是使用三螺旋形成的碱基配对准则来构建。
在另一实施方案中，寡核苷酸可用于本发明方法中。在本申请的情形下，术语“寡核苷酸”是指天然存在的物质或由天然存在的亚单位或它们的接近同源物形成的合成物质。所述术语也可指以与寡核苷酸类似的方式起作用，但具有非天然存在的部分的部分。因此，寡核苷酸可具有改变的糖部分或糖间键联。示例尤其是硫代磷酸酯和本领域中已知的其它含硫物质。在优选实施方案中，寡核苷酸的至少一个磷酸二酯键已被作用在于增强组合物穿透至细胞的定位其活性待调节的RNA所处的区域中的能力的结构取代。优选的是所述取代包括硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或短链烷基或环烷基结构。根据其它优选实施方案，磷酸二酯键被同时是实质上非离子性和非手性的结构或是手性和对映异构特异性的结构取代。本领域普通技术人员将能够选择用于实施本发明的其它键联。寡核苷酸也可包括以下物质：其包括至少一些修饰的碱基形式。因此，可如此采用除通常见于自然界中的嘌呤和嘧啶以外的嘌呤和嘧啶。类似地，也可涉及对核苷酸亚单位的呋喃糖基部分的修饰，只要本发明的基本宗旨被遵循即可。所述修饰的实例是2'-O-烷基取代的核苷酸和2'-卤素取代的核苷酸。适用于本发明中的在糖部分的2'位置处的修饰的一些非限制性实例包括OH、SH、SCH3、F、OCH3、OCN、O(CH2)、NH2和O(CH2)nCH3，其中n是1至约10。所述寡核苷酸在功能上可与天然寡核苷酸或合成的寡核苷酸互换，所述合成的寡核苷酸与自然结构具有一个或多个差异。所有所述类似物都包含于此，只要它们有效地起与至少一种编码炎症促发多肽的核酸分子杂交以抑制其功能的作用即可。
或者，源于逆转录病毒、腺病毒、疱疹或牛痘病毒或各种细菌质粒的表达载体可用于将核苷酸序列递送至靶向器官、组织或细胞群体中。为本领域技术人员所熟知的方法可用于构建将表达互补于编码炎症促发多肽的核酸序列的核酸序列的重组载体。
RNA干扰(RNAi)是一种由miRNA或dsRNA(小干扰RNA；siRNA)诱导的转录后基因沉默方法且已用于调节基因表达。RNAi可用于于此所述的治疗方法中。通常，RNAi是通过使细胞与双链siRNA或小发夹RNA(shRNA)接触来进行。然而，由于RNA对降解的敏感性，在细胞外部操作RNA是繁重的。因此，本文也涵盖编码小干扰RNA(siRNA)分子或构成所用siRNA的一个链的中间体siRNA分子(如shRNA)的脱氧核糖核酸(DNA)组合物。因此，本申请提供一种分离的DNA分子，其包括编码中间体siRNA的具有至少约16个核苷酸的可表达模板核苷酸序列，当作为siRNA的组分时，所述序列介导对靶标RNA的RNA干扰(RNAi)。本申请进一步涉及RNA干扰(RNAi)调节编码炎症促发多肽的核酸分子在靶标细胞中的表达的用途。尽管治疗应用不限于特定作用模式，但RNAi可涉及由RNA诱导的沉默复合物(RISC)降解信使RNA(例如炎症促发多肽的基因的mRNA)，从而阻止转录的靶向mRNA的翻译。或者，它也可涉及基因组DNA的甲基化，此使靶向基因的转录停止。由RNAi引起的对基因表达的遏制可为短暂的，或它可为更稳定的，甚至永久的。
“小干扰RNA”或siRNA也可用于本发明方法中。它是指能够介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默的任何核酸分子。例如，siRNA可为长度是约10至约30个核苷酸，因它们能够特异性干扰蛋白质表达(例如炎症促发多肽表达)来命名的双链RNA分子。在一个实施方案中，本发明的siRNA的长度是12-28个核苷酸、更优选15-25个核苷酸、甚至更优选19-23个核苷酸且最优选21-23个核苷酸。因此，优选siRNA的长度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个核苷酸。如本文所用，siRNA分子无需限于仅含有RNA的那些分子，而是进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。siRNA可被设计来通过RNA干扰降低炎症促发多肽在靶标细胞中的表达。siRNA可包含正义区域和反义区域，其中所述反义区域包含互补于编码炎症促发多肽的核酸分子的mRNA序列的序列，且所述正义区域包含互补于基因的mRNA的反义序列的序列。siRNA分子可自两个核酸片段装配，其中一个片段包含正义区域且第二片段包含siRNA分子的反义区域。正义区域和反义区域也可通过接头分子共价连接。接头分子可为多核苷酸接头或非多核苷酸接头。
核糖酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。一些核糖酶可作为治疗剂、作为靶向确定RNA序列的酶、作为生物传感器、以及对于在功能性基因组学和基因发现中应用起重要作用。核糖酶可被遗传工程化来特异性裂解来自编码炎症促发多肽的核酸分子的表达伴随疾病上调的基因的转录物。
将基因或遗传物质递送至细胞中是基因疗法治疗任何病症的第一步。许多递送方法为本领域技术人员所熟知。优选地，施用供体内或离体基因疗法使用的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸露核酸和与如脂质体的递送载体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在递送至细胞中之后，其具有游离或整合的基因组。
使用基于RNA或DNA的病毒系统递送核酸利用用于使病毒靶向体内特定细胞以及使病毒有效载荷迁移至核中的高度进展的方法。病毒载体可直接向患者施用(体内)或它们可用于体外处理细胞，且接着向患者施用改造的细胞(离体)。用于递送核酸的基于病毒的常规系统可包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关和单纯疱疹病毒载体。病毒载体当前是在靶标细胞和组织中进行基因转移的最高效且多用途方法。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法有可能达成整合在宿主基因组中，从而常导致插入的转殖基因的长期表达。另外，已在许多不同细胞类型和靶标组织中观察到高转导效率。
在核酸的短暂表达是优选的应用中，通常使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率且不需要细胞分裂。用所述载体已获得高效价和表达水平。此载体可在相对简单系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体也例如在体外核酸和肽产生中以及对于体内和离体基因疗法程序而言，用于用靶标核酸转导细胞。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是基于缺陷性和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的有前途的替代性基因递送系统。所有载体都源于仅保留侧接转基因表达盒的AAV 145bp倒置末端重复序列的质粒。归因于整合至转导的细胞的基因组中的高效基因转移和稳定转殖基因递送是此载体系统的关键特征。
复制有缺陷的重组腺病毒载体(Ad)主要用于短暂表达基因疗法中；因为它们可在高效价下产生且它们易于感染许多不同细胞类型。大多数腺病毒载体被工程化以使转殖基因替代Ad E1a、E1b和E3基因；随后使复制缺陷性载体在反式提供缺失的基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织，包括非分裂性分化细胞，如见于肝、肾和肌肉组织中的细胞。常规Ad载体具有大携带能力。
在许多基因疗法应用中，合乎需要的是基因疗法载体以高度特异性递送至特定组织类型(例如像骨髓或淋巴样细胞)中。病毒载体通常被修饰来通过在病毒外表面上以与病毒外壳蛋白的融合蛋白形式表达配体来对给定细胞类型具有特异性。选择配体以对已知存在于目标细胞类型上的受体具有亲和力。
基因疗法载体可通常通过全身性施药(例如静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌肉内、真皮下或颅内输注)或表面施药向个别受试者施用来体内递送。或者，载体可离体递送至细胞，如自个别患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓吸出物和组织生检体)或万能供血者造血干细胞中，随后通常在选择已并有载体的细胞之后将细胞再植入受试者中。
在一个实施方案中，干细胞用于细胞转染和基因疗法的离体程序中。使用干细胞的优势是它们可在体外分化成其它细胞类型，或可引入哺乳动物(如细胞的供体)中，在所述哺乳动物中，它们将移入在适当位置处(如在骨髓中)。使用例如像GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的细胞因子在体外使CD34+细胞分化成临床重要的免疫细胞类型的方法是已知的。
可使用已知方法分离干细胞来达成转导和分化。例如，可通过用结合非所要细胞的抗体，如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)淘选骨髓细胞来自骨髓细胞分离干细胞。
在另一实施方案中，治疗剂可为能够限制或甚至抑制炎症促发蛋白质的生物活性的抗体(或其变体)。所述抗体在本领域中也称为中和抗体。
天然存在的免疫球蛋白具有共同核心结构，其中两个相同轻链(约24kD)和两个相同重链(约55或70kD)形成四聚体。各链的氨基末端部分称为可变(V)区且可与各链的剩余部分的更保守恒定(C)区区分。在轻链的可变区内的是被称为J区的C末端部分。在重链的可变区内，除J区之外也存在D区。免疫球蛋白的大多数氨基酸序列变化限于V区中被称为直接涉及于抗原结合中的高变区或互补决定区(CDR)的三个分隔位置。自氨基末端前进，这些区域被分别指定为CDR1、CDR2和CDR3。CDR是由更保守框架区(FR)固持在适当位置。自氨基末端前进，这些区域被分别指定为FR1、FR2、FR3和FR4。
抗体衍生物包括但不限于嵌合抗体和人源化抗体。如本文所用，术语“嵌合”抗体是指由来自两个不同物种的抗体获得的抗体分子。人源化抗体是一种类型的嵌合抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含源于人抗体或免疫球蛋白的区域与源于非人抗体或免疫球蛋白的区域两者的免疫球蛋白。使抗体人源化的行动在于用人抗体的相应部分替代非人抗体的一部分。例如，如本文所用的人源化抗体可包含能够特异性识别炎症促发多肽的非人区域可变区(如源于鼠类抗体的区域)和源于人抗体的人恒定区。在另一实例中，人源化免疫球蛋白可包含重链和轻链，其中所述轻链包含源于结合(特异性)炎症促发多肽的非人来源的抗体的互补决定区和源于人来源的轻链的框架区，且所述重链包含结合(特异性)炎症促发多肽的源于非人来源的抗体的互补决定区和源于人来源的重链的框架区。
在一实施方案中，抗体可为单克隆抗体(例如由抗体产生性单克隆获得)。在某一实施方案中，本申请也提供单克隆抗体的片段。如本文所用，抗体(例如单克隆抗体)的“片段”是抗体的能够与完整形式的抗体特异性识别相同表位的部分。在本专利申请中，抗体片段能够特异性识别炎症促发多肽。抗体片段包括但不限于抗体轻链、单链抗体、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段。所述片段可通过酶裂解或通过重组技术来产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分别用于产生Fab或F(ab')2片段。也可使用其中一个或多个终止密码子已被引入在天然终止位点上游的抗体基因以多种截短形式产生抗体。例如，编码F(ab')2的重链的嵌合基因可被设计来包括编码重链的CH1结构域和铰链区的DNA序列。也可使抗体片段人源化。例如，人源化轻链包含非人来源的轻链CDR(即一个或多个CDR)和人轻链框架区。在另一实例中，人源化免疫球蛋白重链可包含非人来源的重链CDR(即一个或多个CDR)和人重链框架区。CDR可源于非人免疫球蛋白。
在其它实施方案中，可使用多克隆抗体组合物。多克隆抗体组合物可按照它产生时的原样由方法直接使用，或可在它的使用之前被进一步处理。例如，多克隆抗体组合物可被进一步片段化、人源化、连接于另一试剂等。
施用是通过通常用于将治疗剂引入以最终与血液或组织细胞接触的任何途径来达成。本文所述的核酸分子可以任何适合方式，优选与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。术语“药学上可接受的载体”、“赋形剂”和“佐剂”以及“生理可接受的媒介物”等应被理解为指可连同本发明的化合物一起向患者施用，且不破坏其药理学活性的可接受的载体或佐剂。此外，如本文所用，“药学上可接受的载体”或“医药载体”在本领域中是已知的且包括但不限于0.01-0.1M且优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％生理食盐水。另外，所述药学上可接受的载体可为水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括生理食盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的电解质补充剂)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂、惰性气体等。
如本文所用，“药物组合物”是指连同药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体一起的治疗有效量(剂量)的药剂。如本文所用的“治疗有效量”是指对于给定病状和施用方案提供治疗作用的量。所述组合物是液体或冻干或另外干燥制剂且包括各种缓冲内含物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)的稀释剂、pH和离子强度剂、用以防止吸收于表面的添加剂(如白蛋白或明胶)、以及清洁剂(例如Tween 20TM、Tween80TM、Pluronic F68TM、胆汁酸盐)。药物组合物可包含药学上可接受的增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞(thimerosal)、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、增量物质或张力调节剂(例如乳糖、甘露糖醇)、如聚乙二醇的聚合物与蛋白质的共价连接、与金属离子络合、或物质并入聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的颗粒制剂中或并于所述颗粒制剂上，或并于脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。所述组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。控制释放或持续释放组合物包括于亲脂性储槽(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明也包含用聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))包覆的颗粒组合物。
施用治疗剂的适合方法是可用的且为本领域技术人员所熟知，且尽管一种以上途径可用于施用特定组合物，但特定途径可常提供比另一途径更即刻且更有效的反应。本发明的预防剂或治疗剂可经口或胃肠外、全身或局部施用。例如，可选择静脉内注射(如滴注)、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射、栓剂、肠灌洗、经口肠溶包衣片剂等，且可视患者的年龄和病状而定酌情选择施用方法。有效剂量选自每次施药每千克体重0.01mg至100mg的范围。或者，可选择在每名患者1至1000mg、优选5至50mg的范围内的剂量。
炎症促发多肽
炎症促发多肽序列(及与其相关的核酸)涵盖在本文中显示能够诱导和/或持续病理性炎性反应的宿主多肽(也称为靶标)。这些多肽被视为涉及于任何病理性炎症反应中，而与疾病的病因学无关。在一实施方案中，IEP包括CCDC88B、FOXN1和USP15。在另一实施方案中，IEP包括CCDC88、FOXN1、USP15、THEMIS和IRF8。在另一实施方案中，IEP包括CCDC88B、FOXN1、USP15、THEMIS、IRF1、IRGM1和IRF8。在另一实施方案中，JAK3不被视为IEP。对于核酸分子，这涵盖与IEP的编码序列一致或互补的序列以及其序列保守性和功能保守性变体。对于IEP，这涵盖与多肽一致的序列以及其功能保守性变体。包括IEP编码基因的具有天然存在的多态性的不导致它们的相应基因的表达改变的等位基因、和不导致蛋白质水平、活性或稳定性改变的等位基因。
功能保守性变体是以下变体：其中给定密码子位置中的一个或多个核苷酸变化产生其中多肽中的给定氨基酸残基已被保守性氨基酸替代物替换的多肽序列。功能保守性变体也包括给定多肽的类似物和能够引发对指定多肽具有特异性的抗体的任何多肽。
序列保守性变体由以下变体组成：其中给定密码子位置中的一个或多个核苷酸变化不导致在那个位置处编码的氨基酸改变(例如沉默突变)。
如果当与另一核酸(或它的互补链)最优比对(伴有适当核苷酸插入和/或缺失)时，在至少60％核苷酸碱基，通常至少70％、更通常至少80％、优选至少90％、且更优选至少95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，则核酸或其片段与另一核酸或其片段“实质上同源”或“实质上一致”。或者，当核酸或其片段将在选择性杂交条件下与另一核酸(或其互补链)杂交时，存在实质性同源性或实质性同一性。当发生实质上比总体缺乏特异性更具选择性的杂交时，存在杂交选择性。通常，当历经至少约九个或大于九个核苷酸的链段，存在至少约55％、优选至少约65％、更优选至少约75％、且最优选至少约90％的序列同一性时，将发生选择性杂交。如所述的同源性或同一性比较的长度可历经较长链段，且在某些实施方案中，将常历经至少5个核苷酸、至少14个核苷酸、至少20个核苷酸、更通常至少24个核苷酸、通常至少28个核苷酸、更通常至少32个核苷酸、且优选至少36个或大于36个核苷酸的链段。
如果当与另一多肽最优比对(伴有适当插入和/或缺失)时，在至少60％核苷酸碱基，通常至少70％、更通常至少80％、优选至少90％、且更优选至少95-98％氨基酸残基中存在核苷酸序列同一性，则多肽或其片段与另一多肽或其片段“实质上同源”或“实质上一致”。如所述的同源性或同一性比较的长度可历经较长链段，且在某些实施方案中，将常历经至少5个氨基酸、至少14个氨基酸、至少20个氨基酸、更通常至少24个氨基酸、通常至少28个氨基酸、更通常至少32个氨基酸、且优选至少36个或大于36个氨基酸的链段。
CCDC88B.此IEP也被称为含有卷曲螺旋结构域的88B(智人基因ID283234)。它的功能尚未确定，但它是hook相关蛋白质家族的成员。此家族的成员的特征在于具有N末端潜在微管结合结构域、中心卷曲螺旋结构域和C末端Hook相关结构域。编码的蛋白质可涉及于使细胞器连接于微管中。此蛋白质的氨基酸突变体提供为SEQ ID NO:4(鼠类形式)。
FOXN1.此IEP也被称为叉头框N1、WHN、RONU以及FKHL20。FOXN1是一种翼化螺旋转录调控子(智人基因ID8456)。FoxN1小鼠突变体显示不存在胸腺且被严重免疫损害。已知人FOXN1突变导致T细胞免疫缺陷、先天性脱发和甲营养不良。
USP15.此IEP也被称为泛素特异性肽酶15(智人基因ID9958)。它是去泛素化酶的泛素特异性蛋白酶(USP)家族的成员。USP酶通过聚泛素链拆散和水解泛素-底物键结来在泛素依赖性过程中起关键作用。编码的蛋白质与COP9信号体缔合，且也通过使受体活化的SMAD转录因子去泛素化来在转化生长因子β信号传导中起作用。或者，已观察到编码此IEP的基因的编码多种亚型的拼接转录物变体。
THEMIS.此IEP也称为胸腺细胞选择相关多肽(智人基因ID387357)。已知此蛋白质在晚期胸腺细胞发育期间在正性T细胞选择与负性T细胞选择两者中均起调控作用。所述蛋白质通过T细胞抗原受体信号传导起作用，且似乎为T细胞的适当谱系定型和成熟所必需。它的相应基因的可变拼接产生多种转录物变体。
IRF8.此IEP也称为干扰素调控因子8(智人基因ID3394)。此干扰素共有序列结合蛋白(ICSBP)是干扰素(IFN)调控因子(IRF)家族的转录因子。此家族的蛋白质主要由N末端区域中的保守DNA结合结构域和充当调控结构域的趋异性C末端区域组成。IRF家族蛋白质结合IFN刺激的反应元件(ISRE)且调控由I型IFN(即IFNα和IFNβ)刺激的基因的表达。IRF家族蛋白质也控制由病毒性感染诱导的IFNα和IFNβ调控的基因的表达。
IRF1.此IEP也称为干扰素调控因子1(智人基因ID3659)。IRF1是干扰素调控转录因子(IRF)家族的成员。IRF1充当干扰素α和β转录的活化子，且在小鼠中已显示它为这些基因的双链RNA诱导所需。IRF1也充当由干扰素α、β和γ诱导的基因的转录活化子。此外，已显示IRF1在调控细胞凋亡和肿瘤抑制方面起作用。最后，在牵涉于对感染和炎症的反应中的许多基因的转录活化中，IRF1以物理方式与IRF8相互作用且杂二聚。
IRGM1.此IEP也称为免疫性相关GTP酶家族M(智人基因ID345611)。它是p47免疫性相关GTP酶家族的成员。表明它是通过调控反应于细胞内病原体的自体吞噬形成来在先天性免疫反应中起作用。影响此基因的正常表达的多态性与对克罗恩氏病(Crohn's disease)和结核的易感性相关。
本发明将通过参照以下实施例来更易于被理解，所述实施例被给出来说明本发明而非限制它的范围。
实施例I–遗传筛选ENU诱导的显性负性突变
如Bongfen等中所呈现来进行遗传筛选。简要来说，首先产生雄性G0ENU突变的小鼠的群体。使突变雄性回交两代(G1和G2)，随后在多个G3谱系中育种纯合性。接着用伯氏疟原虫感染这些小鼠以诱发脑疟疾。选择携带防止它们显现完全神经炎性反应的突变以及显示对神经炎症的异常抗性(且最终在伯氏疟原虫激发下存活)的小鼠且对它们的基因组测序以鉴定导致保护小鼠免遭死于伯氏疟原虫激发的遗传特性。
如Bongfen等中所示，表征的第一表型偏差谱系在Jak3中携带突变(Jak3W81R)，所述Jak3是一种与包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的细胞因子受体的共同γc链相互作用的胞质酪氨酸激酶。此募集为啮合STAT家族成员以及NK、T和B细胞中炎性路径的转录活化所需。Jak3W81R突变体显示NK细胞、CD8+T细胞和B细胞的数目降低，以及由CD4+T细胞产生的促炎性细胞因子IFNγ的严重降低。引起关注的是，JAK和STAT家族成员的遗传变体已与炎性疾病(IBD、MS、RA、SLE)相关联。此外，Jak3是消炎性药物的已知靶标，且当前在临床中用于类风湿性关节炎(RA)和克罗恩氏病(CD)的Jak3抑制剂(例如塔索替尼(tasocitinib)；Pfizer)可钝化神经炎症且增加用伯氏疟原虫感染的Jak3-/+杂合子的存活率。因此，JAK3抑制剂在药理学上模拟Bongfen等中获得和表征的遗传突变的影响。
发现第一表型偏差谱系(第48号)在Jak3中携带突变(Jak3W81R)，所述Jak3是一种与在淋巴细胞上表达的包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的1型和2型细胞因子受体的共同γc链相互作用的胞质酪氨酸激酶。Jak3磷酸化导致STAT家族成员的募集和磷酸化以达成T淋巴细胞中炎性路径的转录活化。Jak3W81R突变体显示CD8+T细胞和B细胞的数目降低，以及由CD4+T细胞产生的促炎性细胞因子(IFNγ)的严重降低。引起关注的是，已发现JAK(在炎性肠病中是JAK2)和STAT家族成员(在IBD和多发性硬化症中是STAT3；在类风湿性关节炎和红斑狼疮中是STAT4)的遗传变体是某些人慢性炎性疾病中的遗传风险。这些结果确认对保护免遭伯氏疟原虫感染相关的神经炎症的突变的筛选可鉴定用于消炎性药物发现的新型靶标。
小鼠用15mg/kg/天的塔索替尼(一种已知JAK3抑制剂)皮下治疗4天。在第5天，用106个PbA-pRBC进行处理来感染小鼠，且处理再持续4天(总计处理9天)。如图1上所示，治疗Jak3+/-杂合子小鼠(在感染之前3天开始，且在用伯氏疟原虫感染期间持续7天)可钝化神经炎症且可显著增加伯氏疟原虫感染的Jak3+/-杂合子的存活率(自未治疗动物的0％至治疗的动物的45％)。这些结果指示药理学调节在遗传筛选中发现的靶标可模拟相同基因的遗传病变的保护作用。这些结果也指示伯氏疟原虫感染模型可用于筛选具有消炎性活性的药物候选物。
实施例II-THEMIS
已如实施例I中所述进行遗传筛选且鉴定Themis的另一保护性突变(I23N)，所述Themis是一种与T细胞受体(TCR)相关的蛋白质，其磷酸化会诱导结合Lck和Grb2以刺激ERK1/ERK2路径。Themis为TCR活化和由CD4+和CD8+淋巴细胞反应于I类和II类MHC依赖性抗原呈递产生细胞因子所需。此外，ERK路径的抑制剂(PD184352、U0126)已被描述且可用于体内测试并可用于体内调节炎性反应。
已产生杂合子小鼠品系。
实施例III–FOXN1
已如实施例I中所述进行遗传筛选且鉴定翼化螺旋转录调控子FoxN1的另一保护性突变。两只裸抗性小鼠显示在外显子6供体位点处的拼接位点突变(A至C)。FoxN1小鼠突变体显示不存在胸腺且被严重免疫损害，而人FOXN1突变导致T细胞免疫缺陷、先天性脱发和甲营养不良。
已产生杂合子小鼠品系。
实施例IV–CCDC88B
已如实施例I中所述进行遗传筛选且鉴定Ccdc88b的另一保护性突变，所述Ccdc88b是在胸腺、淋巴结和骨髓中表达的基因。在啮合先天性免疫受体TLR4(脂多糖)和TLR9(CpG寡核苷酸)后，巨噬细胞中的Ccdc88bmRNA表达增加。此外，CCDC88B的表达也反应于结核分枝杆菌(肺)、伯氏疟原虫(血液、肝细胞)和利什曼原虫(Lesihmania)(巨噬细胞)的感染而增加。CCDC88B蛋白在淋巴样细胞中以及在骨髓细胞中的功能、生物化学活性和作用机制仍然未知。在结构上，CCDC88B的特征在于具有N末端潜在微管结合结构域、中心卷曲螺旋结构域和C末端Hook相关结构域。这些特征加上其它观察结果表明CCDC88B可在T淋巴细胞中形成骨架，有可能是为装配T细胞受体信号传导复合物所需的骨架。
应注意在CCDC88B处携带纯合子突变(内含子22中的拼接位点中的消除外显子22/23的拼接，且产生框外转录物的突变)的小鼠显示脾中粒细胞的数目强烈降低(嗜中性白细胞减少)。更具体来说，在纯合突变体中，CCDC88B的外显子22与外显子23之间的供体拼接位点中的T至C突变导致在外显子22的突变上游的可变供体拼接位点的活化。因此，在外显子22中存在缺失五个核苷酸，从而导致突变多肽序列中的框移。使用EBI的在线Transeq核苷酸至蛋白质序列转换工具，预测所述框移产生提早终止密码子以及由此非功能性相关蛋白质。突变CCDC88B蛋白的预期氨基酸序列在序列表中提供为SEQ ID NO:4。
开发(例如在HEK293EV细胞中)表达CCDC88B或它的突变形式的稳定细胞系。已产生杂合子小鼠品系。此外，已制备对野生型多肽或突变多肽具有特异性的兔多克隆血清。
CCDC88B的表达已通过原位杂交来进一步表征。在4％甲醛中固定组织且在55℃下在50％去电离甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA、10nM NaPO4、10％硫酸葡聚糖、1×登哈特氏液(Denhardt’s)、50μg/ml总酵母RNA和50至80000cpm/μl 35S标记的cRNA探针中与35S标记的cRNA反义和正义探针杂交过夜。使组织在65℃下在50％甲酰胺、2×SSC和10mM DTT中经受严格洗涤，继之以在PBS中洗涤，随后在37℃下用20μg/ml核糖核酸酶处理30分钟。在37℃下在2×SSC和0.1×SSC中洗涤10分钟之后，使载玻片脱水，与x射线胶片并置3和6天，接着在Kodak NTB核示踪乳液中浸渍，且在4℃下在具有干燥剂的不透光箱中暴露18天。用Kodak D-19进行照相显影。载玻片用甲酚紫轻微对比染色且在明亮视场光学与暗视场光学两者下进行分析。使用以下探针在10天大的小鼠(p10)中进行原位杂交(ISH)：
正义探针(SEQ ID NO:5)-斜体显示对T7启动子具有特异性的部分：
TCCGAATCTTTGGACCTGCCTTCT反义探针(SEQ ID NO:6)–斜体显示对SP6启动子具有特异性的部分：
AAGCTAGCCGTATCCACTGCTTCA在这些小鼠中，在胸腺中(在高水平下)、在脾和骨髓中(在低水平下)以及在肋骨和髋骨(数据未显示)中检测到Ccdc88b mRNA表达。
当使用相同方法在成年小鼠中进行ISH时，发现脾和骨髓中以及淋巴结中(数据未显示)的Ccdc88b mRNA表达增加。在胸腺中，在皮质中(在较高细胞密度下)以及在髓质中(数据未显示)均观察到Ccdc88b mRNA。在脾中，在接近于中央动脉周围的淋巴小结的生发中心中，Ccdc88b mRNA表达增加(数据未显示)。在淋巴结中，在髓质而非淋巴滤泡中观察到Ccdc88bmRNA表达(数据未显示)。通过使用产生的兔多克隆血清进行共焦显微术获得类似结果(数据未显示)。
为确认ISH结果，进行qPCR以评估Ccdc88b mRNA表达水平。使用96微孔板，以含有5μL cDNA样本、5uL PerfeCTa SYBR GreenSuperMix(Quanta BioSciences)和150nM各正向和反向引物的总体积10μL在Roche LightCycler 480系统上进行实时定量PCR(qPCR)扩增。使用温度循环：在94℃下10分钟，随后45个(在94℃下15秒和在60℃下1分钟)循环，一式三份进行PCR扩增，其中各样本具有一个RT对照。分别使用5’-GAT CTG GGG GCA CAG CGG TTG(SEQ ID NO:7)和5’-GCG TCTCAG CTG GGC CTT GGC(SEQ ID NO:8)扩增长度150bp的Ccdc88bcDNA。相对于参照基因HPRT使基因表达标准化，使用5'-TCC AGC AGGTCA GCA AAG AAC(SEQ ID NO:9)和5'-GGA CTG ATT ATG GAC AGGACT G(SEQID NO:10)引物，所述HPRT被扩增为122bp产物。制备五个10X稀释样本以确定Hprt和Ccdc88b的扩增效率。根据制造商方案，使用Pfaffl方法定量相对基因表达，且相对于未感染C57BL/10脑样本进行标准化。
如图2A上所示，发现在脾、胸腺、骨髓和肺中的Ccdc88b mRNA表达较高。因为炎症中涉及的器官中的Ccdc88b mRNA表达增加，所以测定各种炎性细胞类型中的Ccdc88b mRNA表达。如图2B中所示，发现在GR1+粒细胞、CD4+和CD8+T细胞中的Ccdc88b mRNA表达升高。
对半合子突变动物(CCDC88B+/-)进行免疫表型分析。如图2C上所示，在脾中，未感染半合子小鼠中的Gr1+CD11b+嗜中性白细胞存在显著降低。因此，CCDC8*B+/-动物具有严重嗜中性白细胞减少表型。也确定的是，在炎性激发后，无炎性细胞被募集至脑中(数据未显示)。
表征人神经胶质细胞和血脑屏障内皮细胞中的Ccdc88b mRNA表达。所有组织样本都取自人癫痫患者。组织是非发炎的。根据细胞类型测试三名不同个体。如图2D中所示，在由任选与LPS组合的细胞因子刺激48小时之后测定人星形细胞、小神经胶质细胞或血脑屏障内皮细胞中的Ccdc88b mRNA表达水平。在用IFNγ和LPS刺激之后，小神经胶质细胞中的Ccdc88b mRNA表达增加。在星形细胞中或在内皮细胞中未检测到Ccdc88b mRNA表达。
实施例V–USP15
已如实施例I中所述进行遗传筛选且鉴定Usp15(泛素羧基末端水解酶15)的另一保护性突变，所述Usp15是一种去泛素化酶(DUB)。所述突变(Usp15L749R)是在为DUB所共有的催化结构域中的高度保守残基处的非保守性变化。已显示USP15使受体相关的胞质SMAD去泛素化以调控下游TGFβ信号传导。尽管USP15在炎性细胞中的功能未知，但添加/自蛋白质移除泛素是一种调控免疫信号传导的常用手段，且与人炎性疾病相关的若干基因调控泛素化(TNFAIP3)，结合泛素化蛋白质(TNIP1、UBASH3A)或调控泛素化中的酶促事件(UBE2L3)。USP15蛋白似乎至少在脑中表达。
已产生杂合子小鼠品系。
实施例VI–IRF8
IRF8是转录调控子的干扰素调控因子(IRF)家族的成员，其反应于包括树突细胞(DC)的骨髓谱系的感染和成熟而在干扰素信号传导中起主要作用。它主要由螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域和也称为IRF关联结构域的反式活化结构域组成。在骨髓和淋巴样细胞中，IRF8调控组成性基因表达且也在使这些细胞暴露于I型或II型干扰素、脂多糖和一定范围的微生物产物之后活化或抑制病原体反应性转录程序。IRF8与IRF家族的成员(IRF1、IRF4)或ETS家族的成员(PU.1)的杂二聚化导致DNA结合和转录调控在它们的启动子中分别含有ISRE(GAAAnnGAAA)(SEQ ID NO:1)和EICE型典型基序(GGAAnnGAAA)(SEQ ID NO:2)的靶标基因。
在造血期间，IRF8通过充当多形核粒细胞路径的拮抗剂来促进骨髓祖细胞向单核吞噬细胞谱系(单核细胞、巨噬细胞、DC)分化。这是通过在CD11b+骨髓前体中正性调控促细胞凋亡信号(Cdkn2b、Nf1、Bax)和负性调控促存活信号(Bcl2、Bcl-XL)来达成。在Irf8处具有完全(null7)或严重(来自BXH2小鼠的Irf8R294C)功能损失突变的小鼠显示完全或部分不存在所有类别的DC(CD11c+CD8α+DC与浆细胞样DC两者)，其显示Gr1+/CD11b+粒细胞前体的扩增占优势的慢性骨髓性白血病样表型。另外，已显示IRF8为B淋巴细胞谱系特化、定型和分化，包括在这些抗原呈递细胞的特化功能中起关键作用的生物化学路径的表达所需。
在感染的情形下，IRF8为激活驻留骨髓细胞针对促炎性信号的传播以及针对由这些细胞扩大早期免疫反应的抗微生物防御所需。IRF8为早期免疫反应的由抗原呈递细胞介导的Th1极化所必需，因为它为反应于IFNγ的IL12p40、IL12p35和IL-18基因表达所必需。因此，Irf8有缺陷的小鼠显示缺陷性Th1反应(不存在抗原特异性CD4+、IFNγ产生性T细胞)，显示Th17反应增强，且易受许多细胞内病原体的体内感染，包括结核和血液阶段疟疾。此外，全基因组转录物谱分析、染色质免疫沉淀实验和个别基因研究显示IRF8调控单核吞噬细胞中的抗微生物防御的若干方面，包括抗原识别和加工、吞噬体成熟、溶酶体酶的产生和其它细胞质杀微生物路径的产生。因此，Irf8有缺陷的巨噬细胞极其易受多种细胞内病原体的离体感染。
人的IRF8突变导致的病变显著类似于在Irf8突变小鼠中观察到的病变，且一般来说影响骨髓细胞且具体来说影响DC。在一名患者中，转录非活性和不能结合DNA的IRF8突变变体(IRF8K108E)的纯合性与严重和复发性围产期细菌和真菌感染相关，其中在淋巴结和骨髓中不存在血液单核细胞和DC，且在体外刺激血细胞之后缺乏IL-12和IFNγ产生。近来在用牛分枝杆菌(M.bovis)BCG进行围产期疫苗接种之后遭受复发性分支杆菌感染事件的两名MSMD患者(具有对分支杆菌病的孟德尔易感性(Mendelian Susceptibility))中也发现具有IRF8缺陷性的轻微常染色体显性形式(IRF8T80A)。这些患者具有CD11c+CD1c+DC子组的选择性去除，且由循环外周血液细胞对IL-12的产生受损。IRF8T80A变体显示负性显性且可抑制野生型IRF8对如NOS2和IL-12的已知转录靶标的反式活化潜力。最后，来自全基因组关联研究(GWAS)的新近结果已指向IRF8在具有重要炎性组分的多种人类疾病的复杂遗传病因学中具有作用。已检测到在患有全身性红斑狼疮、克罗恩氏病(CD)和多发性硬化症(MS)的患者的IRF8内或附近的多态性变体之间存在强烈且独立重复的关联。在MS患者的一项研究中，在IRF8处的易感性等位基因与IRF8mRNA表达较高相关。
由感染伯氏疟原虫ANKA(PbA)诱发的脑疟疾(CM)的实验模型用于探究IRF8在病理性炎症中的作用。在此模型中，PbA感染的红细胞粘着于脑微血管结构导致急性且快速致命性神经炎症，其症状包括在感染后第5天-第8天之间开始出现的震颤、共济失调和癫痫发作。IRF8有缺陷的BXH2小鼠(Irf8R294C)不显现任何神经症状且对PbA诱发的CM具有完全抗性。在野生型C57BL/6和Irf8有缺陷的BXH2小鼠的PbA感染的脑中进行的比较转录物谱分析研究连同与高通量DNA测序(ChIP-seq)联用的IRF8染色质免疫沉淀一起已鉴定一列关键IRF8靶标，其表达与急性CM相关的神经炎症相关，但也被发现在用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的肺中活化。CM病变中的这些基因中的若干者的作用已在体内在用伯氏疟原虫感染的相应小鼠突变体中加以验证。这些研究将IRF8鉴定为在CM期间急性神经炎症的关键调控子。
小鼠。C57BL/6J(B6)、BXH2、Il12p40-/-、Irf1-/-和Isg15-/-突变小鼠最初自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)获得。Stat1-/-突变小鼠自Taconic Farms(Germantown,NY)购买。Ifng-/-有缺陷的小鼠自M.M.Stevenson医生(Montreal General Hospital Research Institute)获得，Ifit1-/-突变小鼠自M.Diamond博士(Washington University School of Medicine,St-Louis)获得，Irgm1-/-来自J.D.MacMicking博士(Yale,New Haven,CT)且Nlrc4-/-来自Millenium Pharmaceuticals,Inc.和R.A.Flavell博士(Yale,NewHaven,CT)。所有小鼠都饲养在无病原体条件下且根据加拿大动物照护理事会(Canadian Council on Animal Care)的指导方针和规章来处理。
寄生虫和感染。伯氏疟原虫ANKA自疟疾参考和研究试剂资源中心(MR4)获得，且冷冻储存在-80℃下。在实验感染之前，使伯氏疟原虫ANKA在B6小鼠中传代直至外周血液寄生虫血症水平达到3-5％，此时，通过CO2吸入使动物安乐死，放血且制备传染性储备物。所有实验感染都通过用106个寄生的红血细胞(pRBC)腹膜内(i.p.)注射来进行。通过显微检查用Diff-QuickTM(Dade Behring,Newark,DE,USA)染色的薄血液涂抹物来监测感染期间的血液寄生虫血症。严密监测与脑疟疾(CM)相关的神经症状(颤抖、震颤、毛皮起皱、癫痫发作)的出现，且立刻处死受影响的动物。使用卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)统计法比较存活曲线。
伊文思蓝(Evans Blue)染料外渗测定。为监测在实验CM期间的血脑屏障完整性，各组对照和PbA感染的C57BL/6和BXH2小鼠在感染后第7天和第16天(仅BXH2)用0.2ml含1％伊文思蓝染料(E2129；Sigma-Aldrich,Oakville,ON,Canada)的无菌磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)腹膜内注射(n＝3只小鼠/条件)。使染料循环1小时，接着通过CO2吸入处死小鼠，用PBS灌注且将脑解剖并照相。为定量染料在脑中的累积，将组织称重且在1mlN,N-二甲基甲酰胺中萃取染料48小时，随后测量在OD620下的光密度。同时制备标准曲线且线性回归用于计算各萃取的样本溶液中的染料浓度。作为对照，未感染的小鼠也用染料注射，灌注且解剖。
血清细胞因子。野生型B6、C3H/HeJ和突变BXH2各五只雄性小鼠用106个伯氏疟原虫ANKA pRBC腹膜内感染，且在感染后第6天，将它们处死并收集血清。使用基于ELISA的商业试剂(Milliplex assayTM；Millipore)测量循环细胞因子IFNγ、IL-2、IL-10、IL12p40、IL12p70、MCP-1(CCL2)、MIP-1β(CCL4)、RANTES(CCL5)、TNF-α和VEGF的水平。
转录物谱分析。在感染之前(第0天)或感染后7天(第7天)自B6和BXH2小鼠解剖全脑(每种条件下n＝3只)。根据制造商说明书使用TRIzolTM试剂(Invitrogen,Burlington,Canada)分离总脑RNA，随后用RNeasyTM柱(Qiagen,Toronto,Canada)进一步纯化且杂交于IlluminaMouseWG-6v2.0微阵列(Genome Quebec Innovation Centre,Montreal,Canada)。使用用以用vst(方差稳定变换)进行变换以及用以进行四分位标准化的lumi程序包，用R进行无监督的主成分分析。对于其它分析，使用GeneSifter(Geospiza)软件对微阵列表达数据进行log2变换，中值标准化和分析。使用成对(t检验，≥2倍截断值，Benjamini-Hochberg校正的padj值<0.05)或使用双因素ANOVA(≥2倍截断值，Benjamini-Hochberg校正的padj值<0.05)将各组进行比较以鉴定表达以品系依赖性方式、感染依赖性方式和/或相互作用方式被调节的基因。使用Multi Experiment Viewer根据倍数变化将差异表达的各列基因进行群集。
染色质免疫沉淀(ChIP)。使J774小鼠巨噬细胞细胞系在完全杜贝卡氏改良依格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)中生长至80％汇合。涂铺在150mm组织培养级皮氏培养皿(Corning Inc.,Corning,NY)中的细胞用400U/ml IFNγ(Cell science,Canton,MA)和CpG DNA寡核苷酸(5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3')(SEQ ID NO:3)处理3小时。如先前所述，在少许修改下进行染色质免疫沉淀。简要来说，在20℃下使处理的细胞与于培养基中的1％甲醛交联10分钟。用含有0.125M甘氨酸的冰冷PBS终止交联5分钟。制备核且用Branson数字超声波仪(BransonUltrasonics,Danbury,CT)超声处理成平均尺寸250bp。在4℃下在转动平台上使超声处理的染色质与20μl蛋白质A和20μl蛋白质G Dyna珠粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)的混合物一起孵育过夜，所述Dyna珠粒预结合有6μg正常山羊IgG(sc-2028)或IRF8(sc-6058x)抗体(Santa CruzBiotechnologies,Santa Cruz,CA)。在室温下用1ml以下缓冲液依序洗涤免疫复合物2分钟：洗涤物B(1％曲通(Triton)X-100、0.1％SDS、150mMNaCl、2mM EDTA、20mM Tris-HCl pH 8)、洗涤物C(1％曲通X-100、0.1％SDS、500mM NaCl、2mM EDTA、20mM Tris-HCl pH 8)、洗涤物D(1％NP-40、250mM LiCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH 8)和TEN缓冲液(50mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 8、1mM EDTA)。在去交联之后，遵循制造商程序(Qiagen,Mississauga,Ca)用QIAquickTM PCR纯化柱纯化DNA。通过使用Perfecta SYBRTM绿色PCR试剂盒(Quanta Bioscience,Gaithersburg,MD)进行qPCR来评估相对于IgG对照的针对已知IRF8结合位点的IRF8ChIP效率。
ChIP-seq制备和分析。对于各条件(IRF8和IgG)，汇合总计8个独立ChIP。遵循Illumina的推荐(Illumina,San Diego,CA)，由IRCM MolecularBiology Core Facility制备文库和流动池，其中尺寸选择步骤以250与500bp之间的片段为目标。在Illumina HiSeq 2000测序仪上对ChIP文库测序。对于IgG对照和IRF8样本，测序分别产生8600万和7900万个50bp序列读数。使用采用以下参数的Bowtie将读数定位至小鼠mm9基因组装配：-t--solexa1.3-qual--sam--best mm9。定位效率是91.7％(对于IgG)和91.9％(对于IRF8样本)。为鉴定IRF8结合峰，我们使用采用以下参数的MACS 1.4.1峰查找器：--bw 250--mfold 7,30--pvalue 1e-5-g mm。此分析产生由IRF8结合的11216个基因组区域，其中p值低于阈值10-5。查询在表达谱分析实验中鉴定为受PbA感染影响的基因在基因转录起始位点(TSS)周围20kb间隔中的IRF8结合峰存在性。也对在用于微阵列实验中的Illumina小鼠WG-6v2.0阵列上显示的所有基因进行此分析以评估IRF8峰与周围基因的背景关联(图6)。
BXH2是源于C57BL/6J(B6)和C3H/HeJ(C3H)亲本的在Irf8处携带严重亚效等位基因(Irf8R294C)且导致表现为粒细胞增生、单核吞噬细胞去除和对感染具有易感性的骨髓缺陷的重组近交小鼠品系。为评估Irf8对病理性炎症的影响，BXH2(n＝18)和亲本对照小鼠B6(n＝19)和C3H小鼠(n＝10)用鼠类脑疟疾(CM)媒介物伯氏疟原虫ANKA感染。历经18天记录感染的小鼠的血液寄生虫复制、CM神经症状出现和总体存活率(图3)。尽管所有B6和80％C3H小鼠显现CM且截至第9天死亡，但BXH2小鼠对CM阶段具有完全抗性，随后死于由寄生虫的血液阶段复制不受控制引起的增生性贫血(图3A和D)。当相较于易感B6和C3H亲本对照时，[BXH2×B6]F1小鼠(n＝15)显示对PbA诱发的CM具有显著抗性，其中约50％动物第9天过后存活(相对于C3H，p＝0.03，相对于B6，p<0.0001)，从而表明BXH2的CM抗性特性以共显性方式得以遗传。对一小组[BXH2×B6]F2小鼠(n＝17)的额外表型分析仅在就Irf8R294C等位基因而言是纯合子或杂合子的小鼠中鉴定CM抗性，从而确认保护作用是由于Irf8R294C突变，而BXH2的混合B6/C3H遗传背景具有最小或不具有影响。这些数据显示在此CM相关的神经炎症模型中，IRF8功能的部分或完全损失会保护小鼠免遭致死性。它们也确认Irf8R294C突变的CM保护作用是以共显性方式遗传。
先前报道已说明PbA感染的小鼠的致死性CM与内皮功能障碍，包括血脑屏障(BBB)完整性损失相关。使用伊文思蓝染料外渗测试(图3B和3C)，注意到尽管PbA感染的B6小鼠截至第7天显示明显BBB渗透性，但感染的BXH2小鼠保留BBB完整性，且在感染期间的早期(第7天)和晚期(第16天)均在类似于未感染的小鼠的水平下排除伊文思蓝染料(图3B和3C)。BXH2小鼠的对CM的抗性不与寄生虫负担降低相关(图3D)，因为存活B6和C3H对照以及BXH2和[BXH2×B6]F1在感染后第5、7和9天显示类似循环血液寄生虫血症(p>0.1)。然而，不同于存活对照和[BXH2×B6]F1，随着感染进展，一些BXH2小鼠显现极高水平的血液寄生虫血症(在第12天-第21天之间)。此高寄生虫血症而非脑炎症导致观察到的死亡。这些结果说明尽管IRF8活性损失具有针对脑疟疾的保护性，但需要的是在感染晚期控制PbA的血液阶段复制，且[BXH2×B6]F1中的部分IRF8功能足以防止高度血液阶段复制。
尽管在同一组的个别小鼠之间存在实质性变化，但血清细胞因子分析显示在感染后6天，BXH2小鼠的对PbA的抗性与TNF-α(相较于C3H对照；p<0.001)和IFNγ(相较于B6对照；p＝0.07)的水平降低相关，但另一亲本对照的这些差异未达到统计显著性。IL-2、IL-12p70和VEGF的平均水平低于测定检测限，且在其它测试的细胞因子(IL-10、CCL2(MCP-1)、CCL4(MIP-1β)和CCL5(RANTES))之间未检测到血清水平差异(图4)。
为获得对在神经炎症期间起关键病理性作用的基因、蛋白质和路径以及谁的表达受IRF8调控的进一步了解，进行若干实验。首先，转录物谱分析用于鉴定在PbA感染之前或期间在BXH2和B6小鼠的脑中受差异性调控的基因。主成分分析(PCA)沿两个轴群集样本：成分1，其说明39.4％方差且与感染状态相关(感染成分)；和成分2，类似于品系(遗传成分)，其说明24.4％方差(图5A)。PCA也指示PbA感染对转录谱的影响在B6小鼠中比在BXH2中强得多，其中B6第7天感染的样本形成疏远外组。相反，BXH2第7天群集仅因感染适度改变且保持非常接近BXH2第0天组(相较于B6第0天对B6第7天)，从而指示由BXH2达成的反应要适度得多。成对t检验用于评估B6小鼠与BXH2小鼠两者中归因于感染的转录反应变化以提取包括与病理性神经炎症相关的强烈变化的基因清单。如由PCA所表明，B6对感染的反应是强力的，其中296个独特基因显示统计显著表达差异(第0天对第7天；倍数变化≥2，padj<0.05)。另一方面，BXH2中的对感染的反应更适度，其中81个基因达到统计显著性。BXH2中超过半数受感染调控的基因(n＝48)为B6组所共有且可对应于IRF8非依赖性调控机制。此分析也鉴定一个子组117个基因，其在感染之前在B6对BXH2小鼠中显示显著表达差异。仅约10％的这些“遗传调控的”基因(n＝16)受伯氏疟原虫感染进一步显著调节(图4B)。重要的是，此分析也鉴定一个子组231个基因，其在B6小鼠中受感染独特调控。
为探究Irf8在CM相关的神经炎症表型中的作用，进行虑及脑中基因表达的基础水平的差异(在第0天B6对BXH2)与感染诱导的对PbA的转录反应的差异两者的双因素ANOVA(图5C)。此分析鉴定总计107个以Irf8依赖性方式(padj-相互作用<0.05)受感染强烈调控的基因(123个探针；倍数变化≥2，padj<0.05)(图5C，表1)。对此基因清单的欧几里得分层群集(Euclidean hierarchical clustering)鉴定三个主要种类的转录物。在两个品系中，组1基因(n＝15)均受感染上调(上调在B6中比BXH2更显著)，在B6小鼠中，组2基因受感染上调，但在BXH2中不被显著诱导(n＝62)，且组3基因(n＝30)受感染下调(相较于BXH2，B6中的阻遏更强烈)。使用在线注释和整合发现的数据库(DAVID)工具考查受品系和受感染调控的基因的完全清单指示在以下方面实质性增浓：免疫反应(高于Illumina WG-6v2.0芯片背景增浓4.4倍，padj＝3.3×10-12)、抗原加工和呈递(增浓11.0倍，padj＝1.4×10-9)、防御反应(增浓3.8倍，padj＝1.7×10-8)、趋化性(增浓5.2倍，padj＝3.4×10-3)和炎性反应(增浓3.6倍，padj＝3.7×10-3)。在这些清单上的上调的基因包括使骨髓和淋巴样细胞募集至感染和/或组织损伤部位的强力促炎性化学引诱趋化因子，如Cxcl9、Cxcl10、Ccl4和Ccl12；骨髓细胞中与微生物的吞噬(Fcgr4；低亲和力IgG受体)和吞噬体的成熟(小GTP酶Igtp、Irgm1、Gbp2、Gbp3)相关的蛋白质；IRF8的杂二聚化搭配物(Irf1)；和早期I型干扰素反应(Oasl2、Ifit3)。发现在这些免疫和炎性反应种类下的基因在B6中的表达水平高于在BXH2小鼠中，这与以下见解一致：BXH2中对CM相关的神经炎症的抗性与强烈涉及骨髓区室的IRF8依赖性炎性和先天性免疫反应降低相关联。
表1.在以品系和感染依赖性方式差异表达的转录物的倍数变化(2向ANOVA，2>倍数变化截断值，padj-相互作用<0.05)。基因顺序如图5C中所见；且阴影化各行指示在转录起始位点的20kb内的IRF8结合位点。加星号的基因的倍数变化被报道为两次或更多次有效探测的平均值。
因为使用总脑RNA，所以反应于感染以Irf8依赖性方式差异调控的基因可代表IRF8的直接转录靶标或可为对应于B6和BXH2小鼠中被差异募集至感染部位的细胞群体的标记的二级靶标。为区分反应于感染而受Irf8直接或间接调控的基因，我们定位全基因组IRF8结合位点。为此，进行染色质免疫沉淀，随后对用CpG和IFNγ处理的培养巨噬细胞进行高通量测序(ChIP-seq)。相对于mm小鼠参照基因组定位所得序列读数，且使用MACS峰发现算法鉴定IRF8结合峰。为验证ChIP-seq结果，通过非依赖性ChIP-qPCR实验关于若干已知靶标位点来确认IRF8募集(图6A)。使IRF8结合的基因(鉴定为在自转录起始位点开始的20kb窗口内含有IRF8结合位点)的清单与以品系、感染和推定Irf8依赖性方式受PbA差异调控的基因的清单相交(图5C)。此相交揭示在感染期间上调的基因中强烈富含IRF8结合位点，其中在85％的组1基因(13/15)和50％的组2基因(31/62)中检测到IRF8结合位点(表1)。相反，差异下调的基因不显示任何增浓，其中仅13％(4/30)的组3基因与IRF8峰相关，低于背景峰关联(Illumina阵列上显示的所有基因的21％，图6B)。这些结果强烈表明在神经炎症期间，IRF8充当直接转录活化子以上调在对PbA感染的此病理性反应中起关键作用的基因的表达。
另外反应于PbA查询在Irf8感受态B6小鼠中的表达受调控的所有基因的清单(感染调控的基因；成对比较第7天/第0天B6)以得知IRF8结合位点的存在性以及以鉴定IRF8结合的与CM易感性和神经病理学相关的基因。如图6B中所描绘，此分析显示在受感染上调的基因附近极其强烈富含IRF8结合位点(p<0.0001，费雪氏精确检验(Fisher’s Exact test))，其中74％(92/125)的上调基因在TSS的20kb内携带一个或多个IRF8结合位点(图6B是关于图6C中提供的IRF8结合分布实例)。反应于感染显示下调的基因不显示高于背景的所述任何增浓(图6B)。AMIGO基因本体注释工具用于在功能上考查在B6小鼠的神经炎症期间受感染调控的基因的清单(图5D和表2)。此清单中占优势的是炎性和先天性免疫反应中涉及的基因，甚至更显著的是IRF8结合的基因的子组(74％)，所述子组包括骨髓和淋巴样细胞类型向感染部位的趋化(Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl12、Cxcl9、Cxcl10)、早期先天性免疫识别和反应(Nlrc5、Ifi205)、对病毒性感染的反应(Oasl2、Mx2、Oas1g)、I型干扰素反应性基因和路径(Ifit2、Ifit3、Isg15、Rsad2)、抗原捕集(C1q、C4b、Fcerg1)、吞噬体成熟(Irgm1、Irgm2、Igtp、Gbp2、Gbp3)、抗原加工(Tap1、Tap2)、以及骨髓细胞中I类和II类MHC依赖性抗原呈递(B2m、H2-Ab1、H2-D、H2-K、H2-L、H2-Q、H2-T22)中涉及的炎性细胞因子和趋化因子。此外，也诱导牵涉于对抗原刺激物或危险信号的早期反应中的其它IRF家族成员(Irf1、Irf7、Irf9)(表2)。这些结果支持IRF8作为促炎性基因和潜伏在PbA感染中所见的由宿主驱动的病理性神经炎症下的相关路径的转录活化子的关键作用。这些Irf8调控的促炎性路径似乎主要与骨髓细胞区室相关联。
表2.CM易感性B6小鼠中根据本体种类(AMIGO)拣选的对伯氏疟原虫的转录反应。在上调的基因(用粗体文本指示)中，Irf8直接靶标显著增浓。上标字母是指其中人同源物已在针对牛皮癣(P)、类风湿性关节炎(RH)、乳糜泻(C)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、糖尿病(D)、多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、易激性肠病(IBD)的GWAS研究中被鉴定，或其中人同源物见于已在不同程度上牵涉于它们全部之中的MHC(MHC)中的基因。
涉及表2中鉴定的宿主反应路径不为脑疟疾所特有，因此将在病理性神经炎症期间在B6脑中受感染调控(第7天/第0天)的基因的清单与在结核分枝杆菌感染的B6小鼠的肺中促进保护性反应(第30天/第0天)的基因的清单进行比较(表3)。在两个疾病模型中，B6和BXH2小鼠具有相反表型，其中B6易受CM，但对结核分枝杆菌具有抗性，而BXH2对CM具有抗性，但在用结核分枝杆菌感染时极其快速死于传播的分支杆菌病。惊人地，在CM期间上调超过2倍的123个基因中，66个基因也在结核分枝杆菌感染期间上调≥2倍(p<0.0001，费雪氏精确检验)。在下调的基因中存在最小重叠(21个结核分枝杆菌调控的基因与170个PbA调控的基因重叠)。着眼于受两种感染上调的基因，压倒性大多数(80％)含有至少一个IRF8结合位点，从而再次强调IRF8在炎症以及宿主对感染的反应期间的主要作用(表3)。
最后，为验证鉴定的IRF8靶标和相关路径在先天性免疫性和病理性神经炎症中的作用，在这些基因座的若干者处携带无效突变的小鼠品系中分析对PbA感染的易感性的表型。这些包括感染调控的携带IRF8结合位点的基因(Irf1、Ifit1、Isg15、Irgm1和Nlrc4)，和已知在早期先天性免疫反应中起关键作用的其它基因(Ifng、Jak3、Stat1、Il12p40)。来自这些实验的结果(图7)显示IFNγ-/-、JAK3-/-和STAT1-/-突变小鼠对伯氏疟原虫感染具有完全抗性且不显现CM，从而强调这些分子在病理性炎性反应的进展或扩大中具有关键作用。损失Irf1和Irgm1使神经症状的出现延迟且使PbA感染的小鼠的存活延长。这些结果指示在淋巴样细胞和骨髓细胞中在PbA感染期间活化的若干IRF8转录靶标在神经炎症中起关键作用。另一方面，IL12p40-/-、IFIT1-/-、ISG15-/-和NLRC4-/-突变小鼠保持易受PbA诱发的CM，从而表明尽管这些蛋白质可能在神经炎症中起重要作用，但它们的缺失不足以诱导保护作用。
IRF8在骨髓细胞的个体发生中的所说明的作用、它在针对传染性病原体的防御中的已知作用以及来自人GWAS研究的一堆日益增长的使IRF8变体与慢性自体免疫炎性病状(如多发性硬化症、全身性红斑狼疮和克罗恩氏病)相关联的证据促使探究IRF8在急性病理性炎性反应中的可能作用。为此，使用由感染伯氏疟原虫引起的急性脑炎(脑疟疾)的小鼠模型，其涉及由募集炎性单核和多核白细胞引起的致死性神经炎症，以及随之而来的血脑屏障(BBB)完整性损失。发现在BXH2小鼠中使Irf8损失会起针对此病变的完全保护作用，从而防止显现神经症状以及延长感染后存活。引起关注的是，保护作用以共显性方式遗传，因为当用PbA感染时，50％的Irf8R294C/+F1杂合子在脑阶段存活(图3A)。这些研究结果确定IRF8对与实验脑疟疾相关的急性致死性神经炎症的显现至关重要且进一步暗示Irf8是此病理性反应的主要调控子。此外，来自Irf8R294C/+F1杂合子的结果指示Irf8以基因剂量依赖性方式调控关键促炎性细胞和路径。
除它在骨髓细胞的个体发生和功能方面的确定作用之外，Irf8也为B淋巴细胞发育的某些方面和T淋巴细胞功能的某些方面(Th1、Th17反应)所需。为鉴定在神经炎症期间由IRF8活化的细胞类型和基因剂量依赖性路径，将来自PbA感染的B6和BXH2小鼠的脑转录物谱与提取的一列由感染以Irf8依赖性和非依赖性方式诱导的基因进行比较(2X2 ANOVA和成对分析)(图5，表1)。同时，进行ChIP-seq实验以定位全基因组IRF8结合位点。我们将这些位置与通过转录物谱分析产生的基因清单进行比较且鉴定IRF8结合的基因(表2)与IRF8结合的以Irf8等位基因特异性方式调控的基因(表1)两者。在这些基因组之间存在大量重叠，所述基因组中类似地占优势的是抗原呈递细胞(APC)所特有的标记和路径，包括抗原加工和呈递、产生I型干扰素、产生促炎性细胞因子/趋化因子等。这些组合的分析确认IRF8在独特APC功能方面起显著作用，所述功能包括抗原捕集和微生物吞噬(C1q、C4b、Fcgr4、Fcgr1)、细胞质炎性体平台，如Nlrc5和Ifi205；吞噬体成熟，包括募集关键小GTP酶(Irgm1、Irgm2、Igtp、Gbp2、Gbp3)、内质网膜相关抗原转运(Tap1、Tap2)、APC中的I类和II类MHC依赖性抗原呈递(B2m、H2-A、D、K、L、Q、T分子)。这些基因清单的特征也在于存在骨髓和淋巴样细胞类型向感染部位的趋化中涉及的许多炎性细胞因子和趋化因子(Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl12、Cxcl9、Cxcl10)。这些研究结果可与其中骨髓细胞(包括APC)快速大量募集至伯氏疟原虫感染和相关组织损伤的部位，即血脑屏障毛细管的简单功能模型相容。这启动强力IRF8依赖性促炎性级联。由募集的细胞所致的此反应的局部扩大导致由T淋巴细胞过度产生免疫病理性可溶性介体，如IFNγ和TNFα，且诱导其它转录因子，包括Stat1和其它IRF家族成员(Irf1、Irf7、Irf9)。不存在IRF8使此病理性反应钝化且使突变BXH2小鼠避免在CM期间显现神经炎症，由此在关键急性阶段存活。
尽管在BXH2中重度去除树突细胞和巨噬细胞以及相伴降低IL12产生和抗原特异性T细胞致敏可能解释CM抗性的重要组成部分，但提出的是即使在正常骨髓细胞数目的情形下，APC特异性路径的IRF8依赖性转录活化降低也足以显著钝化炎性反应且保护免遭急性病理性炎症。这是基于三个主要观察结果。首先，IRF8在骨髓细胞中主要充当转录活化子而非阻遏子，如可通过仅上调基因中富含IRF8结合位点所见(图6B)。表1也强调对于以品系和感染特异性方式调控的各基因，IRF8感受态小鼠不变地显示比BXH2高的量值倍数变化，且这些基因的大多数被上调(组1和2)而非下调(组3)。其次，Irf8R294C/+F1杂合子显示正常数目的骨髓细胞(DC，巨噬细胞)和淋巴样细胞(数据未显示)，但仍然显示对伯氏疟原虫诱发的CM具有显著抗性(图3A)。第三，已显示使IRF8的若干直接转录靶标(鉴定为在PbA感染期间由IRF8结合和调控)(包括吞噬体相关小GTP酶Irgm1、促炎性细胞因子Cxcl9和Cxcl10、Cd11b受体Icam1以及转录活化子和IRF8二聚化搭配物Irf1)失活会导致相应缺失小鼠突变体的对CM的抗性(图7)。最后，已显示使在本文中通过ChIP-Seq检测的其它IRF8靶标失活会保护免遭伯氏疟原虫诱发的CM，所述靶标包括Ifng、Jak3、Cd8、Cd14、Cd40、Hc、Fcgr2、Lta和Ltbr8。总之，这些结果强调IRF8在CM相关神经炎症期间在调控骨髓细胞中的促炎性路径方面具有作用。
尽管骨髓细胞中的促炎性路径的IRF8依赖性活化在PbA感染中具有有害和病理性结果，但其在其它类型的感染，包括肺结核中明确起保护作用。实际上，使用相同分析和极严格统计参数，注意到在B6小鼠脑中反应于PbA感染上调的基因的清单与在用结核分枝杆菌进行气雾剂感染之后30天在肺中上调的基因的清单之间存在强烈重叠(表3)。在伯氏疟原虫感染的脑中上调的123个基因中，超过半数(n＝66)也在结核分枝杆菌感染的肺中上调，且接近3/4(90/123)的伯氏疟原虫调控的基因具有IRF8结合位点。在结核分枝杆菌感染期间和在CM期间均上调的66个基因之中，惊人的80％(n＝53)显示一个或多个IRF8结合位点。此外，在这些基因的若干者(包括Irf8、Irf1和Irgm1)中的失活性突变导致对肺TB的易感性，同时传达一定程度的针对CM的保护。Tap1和B2m中的突变也导致对TB的易感性，而它们对CM易感性的影响仍待测试。提出的是这组53个基因代表在针对TB以及与CM相关的病理性炎症的保护方面起关键作用的核心Irf8依赖性促炎性反应路径。
总之，伯氏疟原虫感染模型指示Irf8和IRF8调控的靶标在病理性炎症中起主要作用。Irf8(或某些转录靶标)的失活性突变或不存在导致针对CM的完全保护且Irf8表达降低导致部分保护(在Irf8R294C/+F1杂合子中)。所述基因剂量依赖性影响也提升IRF8表达或活性的甚至小变化也可具有表型结果的可能性，其中Irf8表达增加可能与炎症增强和/或慢性炎症相关。
与此假设一致，来自新近全基因组关联研究(GWAS)的结果已指向IRF8是牵涉于若干人自体免疫和慢性炎性病状的复杂遗传病因学中的一个遗传因素。例如，发现接近IRF8的SNP与其中I型干扰素的产生对于发病机制而言是重要的疾病全身性红斑狼疮相关。此外，在使用针对炎性肠病(IBD)患者63的GWA研究和元分析检测的风险单倍型内，以及在某些组的克罗恩氏病患者的连锁不平衡定位中发现IRF8中的SNP(rs16940202)。最后，IRF8是多发性硬化症(MS)中的关键风险因素，且它与此疾病的关联已在多个GWA研究和元分析中得以验证。在MS中，疾病风险与表达SNP(rs17445836)相关，所述SNP(rs17445836)定位在IRF8下游61kb且调控基因表达，其中较高IRF8mRNA水平与疾病相关。这些结果不仅支持IRF8在人慢性炎性病状中具有作用，而且进一步表明与我们在小鼠中的结果一致，在持续微生物或自体免疫刺激的情形下，即使适度Irf8表达或活性变化也可导致慢性或病理性炎症。与此提议一致，注意到在PbA感染的小鼠中在神经炎症期间受调控的若干IRF8靶标也已在人慢性炎性病状的GWA研究中被检测为遗传风险因素，所述靶标包括MHC(1型糖尿病、类风湿性关节炎、狼疮、MS、牛皮癣)、CCL7(在IBD中)、IRF1(IBD)、IRF7(狼疮)和ICAM1(IBD)(表2)。这强调IRF8调控的路径在人病理性炎症中具有作用。
已证明由伯氏疟原虫感染诱发的急性神经炎症的小鼠模型对鉴定病理性炎性病状中涉及的新型基因、蛋白质和路径有价值。此模型可帮助优先考虑在人GWA研究中鉴定的基因供治疗开发，包括评估新型消炎性药物候选物用于常见人炎性病状的活性。
参考文献
Bongfen SE,Rodrigue-Gervais IG,Berghout J,Torre S,Cingolani P,Wiltshire SA,Leiva-Torres GA,Letourneau L,Sladek R,Blanchette M,Lathrop M,Behr MA,Gruenheid S,Vidal SM,Saleh M,Gros P.An N-ethyl-N-nitrosourea(ENU)-induced dominant negativemutation in the JAK3 kinase protects against cerebral malaria.PLoSOne.2012；7(2):e31012.电子公开2012年2月21日。
尽管已结合其特定实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，能够进一步修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或改型，这些变化、用途或改型一般遵循本发明的原理，并且包括脱离本公开中的内容，因为它们落入本发明所涉及的现有技术领域之内的公知或习惯实践之中，可应用于前述实质性特征，并且落入所附权利要求的范围内。

Claims (87)

1.一种用于评估药剂预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的能力的方法，所述方法包括：
(a)组合所述药剂与试剂以获得与至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性相关的参数；
(b)测量步骤(a)的所述参数以获得测试水平；
(c)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在所述炎性病状的发作或维持期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的所述至少一种生物活性相关；及
(d)将所述药剂表征为(i)当与所述测试水平相关的所述至少一种生物活性低于与所述对照水平相关的所述生物活性时适用于预防、治疗和/或减轻与所述炎性病状相关的所述症状，或(ii)当与所述测试水平相关的所述至少一种生物活性等于或高于与所述对照水平相关的所述生物活性时缺乏预防、治疗和/或减轻与所述炎性病状相关的所述症状的效用。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述炎症促发多肽是CCDC88B、USP15、IRF8、IRF1、IRGM1、THEMIS和FOXN1中的至少一者。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂是核酸分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸分子包含编码所述至少一种炎症促发多肽的基因的启动子且所述参数是由所述启动子驱动的表达的量度。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸分子是编码所述至少一种炎症促发多肽的转录物且所述参数是所述转录物的量的量度。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸分子是至少一种其表达可由所述至少一种炎症促发多肽改变的基因的转录物且所述参数是所述转录物的量。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述炎症促发多肽是IRF8且所述至少一种其表达可由所述炎症相关多肽改变的基因选自由表1至3的任一者中呈现的基因组成的组。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂是多肽。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述多肽是所述至少一种炎症促发多肽。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述参数是所述至少一种炎症促发多肽的量。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述参数是所述至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是CCDC88B且所述至少一种生物活性是蛋白质折叠活性。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是USP15且所述至少一种生物活性是去泛素化活性。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽选自由FOXN1、IRF8和IRF1组成的组且所述至少一种生物活性是转录因子活性。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是THEMIS且所述至少一种生物活性是蛋白质信号传导活性。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是IRGM1且所述至少一种生物活性是GTP酶活性。
17.如权利要求8所述的方法，其中所述多肽是所述至少一种炎症促发多肽的结合搭配物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是USP15且所述结合搭配物是可由USP15去泛素化的多肽。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中步骤(i)是在体外进行。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中步骤(i)是在体内进行。
21.如步骤20所述的方法，其中步骤(i)是在非人动物中进行。
22.如步骤21所述的方法，其中所述非人动物携带非功能性炎症促发多肽的至少一个基因拷贝。
23.一种用于评估药剂治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的适用性的方法，所述方法包括：
(a)施用用于诱导就编码至少一种炎症促发多肽的基因而言是杂合的动物的炎性反应的触发剂；
(b)向具有所述炎性反应的所述动物施用所述药剂；
(c)测量步骤(b)的所述动物的所述炎性反应的参数以提供测试水平；
(d)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与所述炎性反应的发作或维持相关；及
(e)将所述药剂表征为(i)当与所述测试水平相关的所述炎性反应低于与所述对照水平相关的所述炎性反应时适用于治疗和/或减轻与所述炎性病状相关的所述症状，或(ii)当与所述测试水平相关的所述炎性反应等于或高于与所述对照水平相关的所述炎性反应时缺乏治疗和/或减轻与所述炎性病状相关的所述症状的效用。
24.一种用于评估药剂预防个体的炎性病状的能力的方法，所述方法包括：
(a)向就编码炎症促发多肽的基因而言是杂合的动物施用药剂；
(b)向步骤(a)的所述动物施用能够在不存在所述药剂下诱导炎性反应的触发剂；
(c)测量步骤(b)的所述动物的所述炎性反应的参数以提供测试水平；
(d)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与所述炎性反应的发作或维持相关；及
(e)将所述药剂表征为(i)当与所述测试水平相关的所述炎性反应低于与所述对照水平相关的所述炎性反应时适用于预防所述炎性病状，或(ii)当与所述测试水平相关的所述炎性反应等于或高于与所述对照水平相关的所述炎性反应时缺乏预防所述炎性病状的效用。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述炎症促发多肽是FOXN1、CCDC88B、IRF1、IRF8、THEMIS、IRGM1和USP15的至少一者。
26.如权利要求23或24中任一项所述的方法，其中所述触发剂是传染物。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述参数是存活率。
28.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述参数是以下神经症状中的至少一者：发热、震颤、嗜睡、后肢麻痹和昏迷。
29.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述参数是选自由免疫细胞数目、免疫细胞类型、细胞因子分布、趋化因子分布、免疫球蛋白分布、水肿和血脑屏障渗透性组成的组的炎症相关参数。
30.一种用于确定治疗剂是否适用于预防、治疗和/或减轻与个体的炎性病状相关的症状的方法，所述方法包括：
(a)提供已接受至少一剂所述治疗剂的所述个体的生物样本；
(b)测量试剂的与至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性相关的参数以提供测试水平；
(c)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在所述炎性病状的发作或维持期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的所述至少一种生物活性相关；及
(d)将所述治疗剂表征为(i)当与所述测试水平相关的所述至少一种生物活性低于与所述对照水平相关的所述生物活性时适用于预防、治疗和/或减轻与所述个体的所述炎性病状相关的所述症状，或(ii)当与所述测试水平相关的所述至少一种生物活性等于或高于与所述对照水平相关的所述生物活性时缺乏预防、治疗和/或减轻与所述个体的所述炎性病状相关的所述症状的效用。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述炎症促发多肽是CCDC88B、USP15、IRF8、IRF1、IRGM1、THEMIS和FOXN1中的至少一者。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述试剂是核酸分子。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述核酸分子包含编码所述至少一种炎症促发多肽的基因的启动子且所述参数是由所述启动子驱动的表达的量度。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述核酸分子是编码所述至少一种炎症促发多肽的转录物且所述参数是所述转录物的量的量度。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述核酸分子是至少一种其表达可由所述至少一种炎症促发多肽改变的基因的转录物且所述参数是所述转录物的量。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述炎症促发多肽是IRF8且至少一种其表达可由所述炎症促发多肽改变的基因选自由表1至3的任一者中所列的基因组成的组。
37.如权利要求30或31所述的方法，其中所述试剂是多肽。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽是所述至少一种炎症促发多肽。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述参数是所述至少一种炎症促发多肽的量。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述参数是所述至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是CCDC88B且所述至少一种生物活性是蛋白质折叠活性。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是USP15且所述至少一种生物活性是去泛素化活性。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是FOXN1、IRF1或IRF8且所述至少一种生物活性是转录因子活性。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是THEMIS且所述至少一种生物活性是蛋白质信号传导活性。
45.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是IRGM1且所述至少一种生物活性是GTP酶活性。
46.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽是所述至少一种炎症促发多肽的结合搭配物。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是USP15且所述结合搭配物是可由USP15去泛素化的多肽。
48.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽与所述炎症促发多肽的信号传导路径相关。
49.如权利要求30至48中任一项所述的方法，其中所述表征是用所述个体的至少两个不同生物样本来进行。
50.一种用于确定个体的炎性病状的易患性或存在性的方法，所述方法包括：
(a)提供来自所述个体的生物样本；
(b)测量试剂的与至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性相关的参数以提供测试水平；
(c)比较所述测试水平与对照水平，其中所述对照水平与在不存在所述炎性病状期间观察的所述至少一种炎症促发多肽的所述生物活性相关；及
(d)将所述个体表征为(i)当与所述测试水平相关的所述至少一种生物活性等于或高于与所述对照水平相关的所述生物活性时易患所述炎性病状，或(ii)当与所述测试水平相关的所述至少一种生物活性低于与所述对照水平相关的所述生物活性时缺乏所述炎性病状的易患性。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述炎症促发多肽是CCDC88B、USP15、IRF8、IRF1、IRGM1、THEMIS和FOXN1中的至少一者。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述试剂是核酸分子。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述核酸分子包含编码所述至少一种炎症促发多肽的基因的启动子且所述参数是由所述启动子驱动的表达的量度。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述核酸分子是编码所述至少一种炎症促发多肽的转录物且所述参数是所述转录物的量的量度。
55.如权利要求52所述的方法，其中所述核酸分子是至少一种其表达可由所述至少一种炎症促发多肽改变的基因的转录物且所述参数是所述转录物的量。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述炎症促发多肽是IRF8且至少一种其表达可由所述炎症促发多肽改变的基因选自由表1至3的任一者中所列的基因组成的组。
57.如权利要求50或51所述的方法，其中所述试剂是多肽。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述多肽是所述至少一种炎症促发多肽。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述参数是所述至少一种炎症促发多肽的量。
60.如权利要求57所述的方法，其中所述参数是所述至少一种炎症促发多肽的至少一种生物活性。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是CCDC88B且所述至少一种生物活性是蛋白质折叠活性。
62.如权利要求60所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是USP15且所述至少一种生物活性是去泛素化活性。
63.如权利要求60所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是FOXN1、IRF1或IRF8且所述至少一种生物活性是转录因子活性。
64.如权利要求60所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是THEMIS且所述至少一种生物活性是蛋白质信号传导活性。
65.如权利要求60所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是IRGM1且所述至少一种生物活性是GTP酶活性。
66.如权利要求57所述的方法，其中所述多肽是所述至少一种炎症促发多肽的结合搭配物。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述至少一种炎症促发多肽是USP15且所述结合搭配物是可由USP15去泛素化的多肽。
68.如权利要求57所述的方法，其中所述多肽与所述炎症促发多肽的信号传导路径相关。
69.如权利要求50至68中任一项所述的方法，其中所述表征是用所述个体的至少两个生物样本来进行。
70.一种用于预防、治疗和/或减轻与有需要的个体的炎性病状相关的症状的方法，所述方法包括施用能够抑制炎症促发多肽的至少一种生物活性的药剂以便预防、治疗和/或减轻与所述个体的所述炎性病状相关的所述症状。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述药剂是能够限制所述炎症促发多肽的表达的核酸分子。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述药剂是能够限制所述炎症促发多肽的所述生物活性的抗体。
73.如权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述炎性病状选自由神经炎症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、1型糖尿病和乳糜泻组成的组。
74.一种分离的多肽，其是炎症促发多肽(IEP)的突变体且当在受试者中表达时能够防止所述受试者的炎性病状的发作和/或维持。
75.如权利要求74所述的分离的多肽，其中所述IEP是CCDC88B或USP15。
76.如权利要求75所述的分离的多肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4。
77.一种核酸载体，其编码如权利要求74至76中任一项所述的分离的多肽。
78.一种就编码炎症促发多肽(IEP)的基因而言是杂合的细胞，其中所述细胞具有编码IEP的第一基因拷贝和编码所述IEP的突变体的第二基因拷贝，其中当在受试者中表达时，所述IEP的所述突变体能够防止所述受试者的炎性病状的发作和/或维持。
79.一种就编码炎症促发多肽(IEP)的突变体的基因而言是纯合的细胞，其中当在受试者中表达时，所述IEP的所述突变体能够防止所述受试者的炎性病状的发作和/或维持。
80.如权利要求78或79所述的细胞，其表达如权利要求74至76中任一项所述的分离的多肽。
81.如权利要求78至80中任一项所述的细胞，其是转基因细胞。
82.如权利要求81所述的细胞，其具有如权利要求77所述的核酸载体。
83.一种就编码炎症促发多肽(IEP)的基因而言是杂合的动物，其中所述动物具有编码IEP的第一基因拷贝和编码所述IEP的突变体的第二基因拷贝，其中当在所述动物中表达时，所述IEP的所述突变体能够防止所述动物的炎性病状的发作和/或维持。
84.一种就编码炎症促发多肽(IEP)的突变体的基因而言是纯合的动物，其中当在所述动物中表达时，所述IEP的所述突变体能够防止所述动物的炎性病状的发作和/或维持。
85.如权利要求83或84所述的动物，其表达如权利要求74至76中任一项所述的分离的多肽。
86.如权利要求83至85中任一项所述的动物，其是转基因动物。
87.如权利要求86所述的动物，其具有如权利要求77所述的核酸载体。
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