WO2007052561A1 - Ｓｌｉｍ１とｕｓｐの相互作用阻害による心筋肥大の阻害方法および阻害剤 - Google Patents

Ｓｌｉｍ１とｕｓｐの相互作用阻害による心筋肥大の阻害方法および阻害剤 Download PDF

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WO2007052561A1
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Hirofumi Doi
Yoshitaka Isumi
Hiroto Nakajima
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Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to ubiquitin-specific protease (Ubiquitin-specific protease; hereinafter, abbreviated as USP) in an in vitro sample or non-human mammal, ubiquitinated SLIMl (ubiquitinated skeletal muscle LIM protein 1 ) Deubiquitinating, SLIM 1 (skeletal muscle LIM protein 1) stabilization method, and cardiomyocyte hypertrophy method. More specifically, the present invention relates to the above method characterized by using any force 1 selected from the group consisting of USP15, USP20, USP21, USP22 and USP33.
  • the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits deubiquitination of SLIM 1 by ubiquitination by any one selected from the group consisting of USP15, USP20, USP21, USP22 and USP33.
  • the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between SLIM 1 and any one selected from the group consisting of USP15, USP20, USP21, USP22 and USP33 force.
  • the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding of ubiquitinated SLIM1 to any one selected from the group consisting of USP15, USP20, USP21, USP22 and USP33.
  • the present invention is selected from the group consisting of USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33, and is a compound that inhibits myocardial cell hypertrophy due to deubiquitination of SLIM 1 It relates to the identification method.
  • the present invention uses a compound that inhibits the deubiquitination activity of any one selected from the group consisting of USP15, USP20, USP21, USP22 and USP33, and a method for inhibiting SLIM1,
  • the present invention relates to a method for inhibiting cardiomyocyte hypertrophy and a method for preventing and / or treating hypertrophic cardiomyopathy.
  • the present invention provides a SLIM1 inhibitor comprising the above compound, an anti-myocardial hypertrophy And an agent for preventing and / or treating hypertrophic cardiomyopathy.
  • any one USP selected from the group consisting of the present invention USP15, USP20, USP21, USP22 and USP33, a gene encoding the USP, a recombinant vector containing the gene, and the vector And at least one of the transformants obtained by introducing SLIM1, a gene encoding SLIM1, a recombinant vector containing the gene, and at least one transformant obtained by introducing the vector. It relates to a reagent kit containing one of them. Background art
  • SLIM 1 is a protein having a LIM domain and highly expressed in skeletal muscle and cardiac muscle (Non-patent Documents 1-5).
  • the LIM domain is a protein-binding motif with 50-60 amino acids, interacts with transcription factors and cytoskeletal proteins, and plays an important role in maintaining cell differentiation and cytoskeletal integrity (non-patented). Reference 6). Transcription factors and cytoskeletal proteins that bind to SLIM1 have not been reported, but SLIM1 has been reported to regulate myoblast power, differentiation into muscle cells, expansion of myoblasts, etc. (non-patent literature) 7).
  • SLIM1 promotes myoblast power through integrin as well as myoblast expansion (hypertrophy), and signal transduction through integrin promotes cardiomyocyte hypertrophy This strongly suggests that an increase in SLIM1 protein level may be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy (Non-patent Documents 7-9).
  • Hypertrophic cardiomyopathy is cardiomyopathy associated with hypertrophy of cardiomyocytes. In many cases, enlargement of myocardial cells is observed mainly in the left ventricle. In the heart of patients with hypertrophic cardiomyopathy, the amount of SLIM1 mRNA is increased compared to the heart of healthy individuals, and in the model mouse for hypertrophic cardiomyopathy (aortic banding model), compared to control mice It has been reported that the amount of SLIM1 mRNA is increased and the SLIM1 mRNA level is correlated with myocardial hypertrophy (Non-patent Documents 10-12).
  • the myocardium refers to the myocardium that constitutes the majority of the heart due to the myocardial fiber force having striated pattern.
  • the thick left ventricle is particularly thick in the ventricle, which is thin in the atria.
  • the atria and ventricular muscles are independent and separated by annulus fibrosus.
  • the muscle layer of the atrium consists of a shallow layer that runs around the left and right atria and a deep layer that runs separately on the left and right.
  • the ventricular muscle layer starts with three layers become.
  • a ubiquitin-specific protease is a deubiquitinase enzyme that catalyzes a deubiquitin-reaction in which a ubiquitin-conjugated protein ubiquitin (hereinafter sometimes abbreviated as Ub) is dissociated.
  • Ub ubiquitin-conjugated protein ubiquitin
  • Many family proteins are known as USP. USP has cysteine (Cys) domain (Cys box), histidine (His) domain (His box) and aspartate (Asp) domain (Asp box) as its active domains.
  • a cysteine protease having a group as an active site. USP dissociates ubiquitin when a polymer is attached to the C-terminus of ubiquitin.
  • the ubiquitin-specific protease is involved in the regulation of proteolysis by the proteanome due to its deubiquitin activity.
  • ubiquitin is isopeptide bound to a target protein to form a polyubiquitin chain, resulting in a ubiquitinated protein.
  • the ubiquitin protein is subjected to proteasome-dependent degradation by the recognition of the polyubiquitin chain of the ubiquitin protein by the proteanome.
  • the living body also has a function of dissociating protein ubiquitin and suppressing protein degradation.
  • ubiquitin is also dissociated by deubiquitin enzyme, deubiquitinized protein is not recognized by the proteanome and proteolysis is suppressed.
  • ubiquitin from which ubiquitin protein power is also dissociated is reused for protein ubiquitination.
  • Non-patent Document 13 ubiquitin modification and deubiquitin modification of proteins are considered to be involved in the regulation of protein stability.
  • One of the functions of the ubiquitin proteasome system involving ubiquitin zyme and deubiquitin zyme is the removal of abnormal proteins generated in vivo and quantitative regulation by degradation of transcription factors and signal transduction factors. The dysfunction of these enzymes causes abnormalities in this system.
  • USP15 (Ubiquitin-specific protease 15) is one of ubiquitin-specific proteases and has been reported to have a deubiquitination activity that cleaves ubiquitin-protein activity ubiquitin (Non-patent Document 14). USP15 expression has been observed in various tissues, particularly high in skeletal muscle and heart. [0018] USP15 mRNA level strength It has been reported that it increases with cardiomyocyte hypertrophy induced by fibronectin, which is an integrin ligand (Non-patent Document 15). It is suggested that there is a possibility of increasing. However, there are no reports on the physiological functions and interacting proteins of USP15 at this time.
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. WO01Z67299.
  • Non-Patent Document 1 Brown S. et al., “Journal of Molecular and Cellular Cardiolog y”, 1999, 31st pp. 837-843.
  • Non-Patent Document 2 Chu P. H. et al., “Mechanisms of HMechanisms of Development”, 2000, No. 95, p. 259-265.
  • Non-Patent Document 3 Lee S. M. Y. et al., “Gene”, 1998, No. 216, p. 163-170.
  • Non-Patent Document 4 Morgan M. et al., “Biochemical and Biophysical Research Communications”, 1999, 255, p. 245-250.
  • Non-Patent Document 5 Morgan M. J. et al., "Biochemical and Biophysical Research (Biochemical and Biophysical Research)
  • Non-Patent Document 6 Bach I. et al., “Mechanisms of Development”, 2000, 91st, p. 5-17.
  • Non-Patent Document 7 McGrath M. J. et al., “American journal of physiology. Cell phy siology”, 2003, No. 285, p. C1513-1526.
  • Non-Patent Document 8 Kostin S. et al., “Cell Tissue Research”, 1998, No. 294, p. 449-460.
  • Non-Patent Document 9 Pham CG, et al., “American journal of p. hysiology ⁇ Heart and circulatory physiology), 2000, No. 279, p. H2 916-2926.
  • Non-Patent Document 10 Hwang D. M. et al., “Genomics”, 2000, Vol. 66, p. 1-14.
  • Non-Patent Document 11 Hwang D. M. et al., “Circulation”, 1997, 96th, p. 4146-4203.
  • Non-Patent Document 12 Lim D. S. et al., “Journal of the American College of Cardiology”, 2001, 38th, p. 1175—1180.
  • Non-Patent Document 13 Yeh E. T. et al., “Gene”, 2000, No. 248, p. 114.
  • Non-Patent Document 14 Baker R. T. et al., “Genomics”, 1999, 59th, p. 264-274.
  • Non-Patent Document 15 Chen H. et al., “Physiological Genomics”, 2004, No. 18, p. 273-283.
  • An object of the present invention is to find a protein involved in the regulation of the action of SLIM 1, which is considered to be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy, and to provide a means for regulating the action of SLIM1. .
  • the subject of the present invention also includes providing means for enabling prevention and Z or treatment of hypertrophic cardiomyopathy.
  • SLIM1 which is thought to be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy, interacts with USP15, a deubiquitinase enzyme, in silico ( in silico). From this result, the present inventors predicted that SLIM1 is ubiquitinated and that US P 15 is involved in the deubiquitination of ubiquitinated SLIM 1.
  • proteasome-dependent SLIM1 degradation control mechanism through deubiquitination by (e.g., USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33), and this mechanism regulates the amount of SLIM 1 and SLIM 1 in the cell. We found that the action was regulated.
  • the present invention relates to a method for deubiquitinating ubiquitinated SLIM 1 in an in vitro sample or non-human mammal with a ubiquitin-specific protease selected from the following group;
  • the present invention also relates to a method for deubiquitinating ubiquitinated SLIM 1 in an in vitro sample or a non-human mammal with ubiquitin-specific protease 15.
  • the present invention relates to a method for stabilizing SLIM1 in an in vitro sample or a non-human mammal with a ubiquitin-specific protease selected from the following group;
  • the present invention relates to a method for hypertrophy of cardiomyocytes in an in vitro sample or a non-human mammal using a ubiquitin-specific protease selected from the following group;
  • the present invention also relates to a method for hypertrophy of cardiomyocytes in an in vitro sample or non-human mammal using ubiquitin-specific protease 15.
  • the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits deubiquitin of ubiquitin ⁇ SLIM1 by a ubiquitin-specific protease selected from the following group, wherein the interaction between the ubiquitin-specific protease and ubiquitinated SLIM 1
  • the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits deubiquitination of ubiquitin ⁇ SLIM1 by ubiquitin-specific protease 15, wherein the ubiquitin-specific protease 15 and ubiquitinated SLIM1 interact with each other.
  • a compound is contacted with ubiquitin-specific protease 15 and Z or ubiquitinated SLIM1, and then ubiquitinated with ubiquitin-specific protease 15 by deubiquitination of SLIM 1.
  • the present invention relates to an identification method for determining whether or not the ability to inhibit ubiquitination.
  • the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the binding between SLIM1 and a ubiquitin-specific protease selected from the following group, under conditions that allow interaction between the ubiquitin-specific protease and SLIM1.
  • a system that uses a signal and Z or marker generated by binding the compound to the ubiquitin-specific protease and Z or SLIM 1, and binding the ubiquitin-specific protease to SLIM 1, the signal and the Z or marker
  • the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the binding between a ubiquitin-specific protease selected from the following group and ubiquitin SLIM1, and enables the interaction between the ubiquitin-specific protease and ubiquitinated SLIM1.
  • This system is used by contacting a compound with the ubiquitin-specific protease and Z or ubiquitinated SLIM1, and using a signal generated by the binding of the ubiquitin-specific protease and ubiquitinated SLIM1 and a Z or marker.
  • An identification method for determining whether the compound inhibits the binding of the ubiquitin-specific protease and ubiquitinated SLIM1 by detecting the presence or absence or change of a signal and Z or marker;
  • the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the binding between ubiquitin-specific protease 15 and SLIM1, wherein the compound and ubiquitin-specific protease 15 are capable of interacting with ubiquitin-specific protease 15 and SLIM1. And the presence or absence or change of this signal and Z or marker using a system using the signal and Z or marker resulting from the binding of ubiquitin-specific protease 15 and SLIM 1 Thus, the present invention relates to an identification method for determining whether the compound is capable of inhibiting the binding between ubiquitin-specific protease 15 and SLIM1.
  • the present invention also relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between ubiquitin-specific protease 15 and ubiquitin SLIM 1, wherein the compound and ubiquitin-specific protease 15 are capable of interacting with ubiquitinated SLIM1 under certain conditions.
  • Ubiquitin-specific protease 15 and Z or ubiquitin ⁇ SLIM1 are contacted, and the presence or absence of this signal and Z or marker is determined using a system that uses the signal and Z or marker generated by binding of ubiquitin-specific protease 15 and ubiquitin ⁇ SLIM1.
  • the present invention relates to an identification method for determining whether or not the compound is capable of inhibiting the binding of ubiquitin-specific protease 15 and ubiquitin SLIM1 by detecting the presence or change.
  • the present invention relates to a method for inhibiting SLIM1, characterized by using a compound that inhibits the deubiquitination activity of a ubiquitin-specific protease selected from the following group:
  • the present invention provides a deubiquitin of a ubiquitin-specific protease selected from the following group:
  • a method for inhibiting cardiomyocyte hypertrophy characterized by using a compound that inhibits chitin ⁇ ⁇ activity:
  • the present invention also relates to a method for preventing and / or treating hypertrophic cardiomyopathy, characterized by using a compound that inhibits the deubiquitination activity of a ubiquitin-specific protease selected from the following group:
  • the present invention relates to an inhibitor of SLIM1, comprising a compound that inhibits the deubiquitination activity of a ubiquitin-specific protease selected from the following group:
  • the present invention relates to an anti-myocardial hypertrophy agent comprising a compound that inhibits the deubiquitin activity of a ubiquitin-specific protease selected from the following group:
  • the present invention also relates to a preventive and hypertrophic cardiomyopathy and Z or therapeutic agent comprising a compound that inhibits the deubiquitination activity of a ubiquitin-specific protease selected from the following group:
  • the present invention provides a ubiquitin-specific protease selected from the following group, a gene encoding the ubiquitin-specific protease, a recombinant vector containing the gene, and a transformant obtained by introducing the vector.
  • a reagent kit comprising at least one of SLIM1, a gene encoding SLIM1, a recombinant vector containing the gene, and at least one transformant into which the vector is introduced :
  • SLIM1 and USP15 which is a deubiquitinase, interact with each other, and from this prediction result, SLIM1 is ubiquitinated, and ubiquitinated SLIM1 USP15 was predicted to be involved in deubiquitination.
  • (l) SLIMl is ubiquitinized and decomposed by a proteanome, (2) ubiquitinated by USP15, SLIM1 is deubiquitinated, (3) USP15 SLIM1 binding, (4) USP15 increases SLIM1 capacity S, (5) USP15, USP20, U SP21, USP22 and USP33, also known as deubiquitinases, increase SLIM1 And (6) USP 20, demonstrated that SLIM1 binds to USP21, USP22, and USP33, respectively.
  • SLIM1 ubiquitination, and the proteasome-dependent SLIM1 degradation regulation mechanism via deubiquitination by USP for example, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33
  • USP for example, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33
  • this mechanism regulates the amount of SLIM 1 and the action of SLIM 1 in the cell.
  • ubiquitination of SLIM1 generates ubiquitinated SLIM1, which is recognized by the proteasome, and as a result, is degraded in a proteasome-dependent manner.
  • deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 by USP reduces SLI Ml recognition by the proteasome, and as a result, proteasome-dependent degradation of SLIM1 is suppressed.
  • SLIM1 is considered to be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy (Non-patent Document 7).
  • SLIM1 mRNA levels increased in the heart of patients with hypertrophic cardiomyopathy compared to that of healthy individuals, and SLIM1 in hypertrophic cardiomyopathy model mice compared to control mice. It has been reported that the amount of mRNA increases! /, (non-patent literature 10-12).
  • Inhibiting ubiquitin ⁇ SLIM1 degeneration by USP can promote SLIM1 degradation and reduce SLIM1 levels. As a result, hypertrophy of cardiomyocytes can be inhibited. Moreover, the onset and progress of hypertrophic cardiomyopathy can be suppressed.
  • USP USP15, USP20, USP21, USP22 or ⁇ or USP33
  • Ubiquitin® SLIM1 deubiquitin® method, SLIM1 stabilization method, cardiomyocyte Can provide a way to enlarge.
  • a method for identifying compounds that inhibit deubiquitination by USP of ubiquitinated SLIM1, and the binding of USP and SLIM1 It is possible to provide a method for identifying an inhibitory compound, a method for identifying a compound that inhibits binding between USP and ubiquitinated SLIM1, and a method for identifying a compound that inhibits cardiomyocyte hypertrophy due to deubiquitin ⁇ by USP of ubiquitin ⁇ ⁇ SLIM 1. Furthermore, it is possible to provide a method for inhibiting SLIM1, a method for inhibiting cardiomyocyte hypertrophy, a method for preventing and treating hypertrophic cardiomyopathy, which comprises using a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • a SLIM1 inhibitor an anti-cardiac hypertrophy agent, a hypertrophic cardiomyopathy prevention and Z or therapeutic agent comprising a compound that inhibits the deubiquitination activity of USP can be provided.
  • a reagent kit can be provided.
  • the amount of SLIM1 and the function of SLIM1 can be inhibited, and as a result, hypertrophic cardiomyopathy can be prevented and Z or treated.
  • FIG. 1 is a diagram showing the result of in silico prediction of the interaction between SLIM1 and USP15.
  • the area where high alignment was performed by local alignment between SLI Ml and USP15 is shown.
  • the amino acid sequence is represented by one letter. In the figure, the number shown on the left side of the amino acid sequence means the position of the N-terminal amino acid in each region shown in the amino acid sequence of SLIM 1 or USP15. (Example 1)
  • FIG. 2 Daltathione S-transferase (hereinafter abbreviated as GST) and N-terminal GST fusion SLIM1 (referred to as GST-SLIM1 in the figure) on the membrane, N-terminal His fusion USP15 (in the figure, As a result of reaction with His-USP15 binding), GST-SLIM1 was detected by Western blotting with anti-His antibody at the position where GST-SLIM1 was dot-blotted. FIG. In contrast, when a buffer (indicated as Buffer only) was used instead of His-USP15, such a signal was hardly detected. (Example 2)
  • His-Xpress-SLIM1 coprecipitation was detected by Western blotting (denoted as WB in the figure) using Omni Probe antibody (denoted as Omni in the figure).
  • Omni Probe antibody denoted as Omni in the figure.
  • co-precipitation of His-Xpress SLIM1 with anti-V5 antibody was not observed in cells expressing only His-Xpress SLIM1 (upper panel).
  • USP15-V5-His in cells co-expressed with His-Xpress-SLIMl and US P15-V5-His was confirmed by Western blotting using an anti-V5 antibody (middle panel).
  • His-Xpress SLIMl expression in Western blots using OmniProbe antibodies in cells expressing only His—Xpress—SLIM1, and cells co-expressing His—Xpress—SLIM1 and USP15—V5—His. Confirmed by teeing (lower panel).
  • FIG.4 Co-expression of N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (indicated as His-Xpress-SLIM1 in the figure) and N-terminal FLAG-fused ubiquitin (indicated as FLAG-Ub in the figure) His-Xpress-SLIM1 was immunoprecipitated (shown as IP in the figure) using the Omni Probe antibody (shown as Omni in the figure) in the cell lysate of the cultured cells. It is a figure which shows that the coprecipitation of FLAG-Ub was recognized occasionally (upper panel).
  • the co-precipitation of FLAG-Ub was detected by Western blotting (denoted as WB in the figure) using an anti-FLAG antibody (denoted as ⁇ FLAG in the figure).
  • the detected ladder-like signal in the high molecular region was thought to be His-Xpres s-SLIM1 (denoted as Ub-SLIM1 in the figure) modified with one or more FLAG—Ub.
  • His-Xpres s-SLIM1 denoted as Ub-SLIM1 in the figure
  • co-precipitation of FLAG-Ub with Omni Probe antibody and ladder-like signals in the polymer region are not observed. Or the degree was significantly lower (upper panel).
  • N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (sometimes abbreviated as His-Xpress SLIM1; referred to as SLIM 1 in the figure) and C-terminal V5— His fusion LacZ (LacZ V5— Proteasome inhibition of cells co-expressed with His (sometimes abbreviated as His; referred to as LacZ in the figure)
  • MG-132 denoted as MG132 in the figure
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (sometimes abbreviated as His-Xpress-SLIM1; in the figure abbreviated as SLIM 1) and N-terminal FLAG fusion ubiquitin (abbreviated as FLAG-Ub) Yes; in cell lysate of cultured cells coexpressed with Ub in the figure, His-Xpress-SLIM1 (Ub-SLIM1) modified with one or more FLAG-Ub
  • the amount of His—Xpress—SLIM 1 in the cell lysate used was the cell expressing only His-Xpress-SLIM 1, the cell co-expressing His—Xpress—SLIM1 and FLAG—Ub, His—Xp ress— SLIM1, FLAG—Ub, and USP15—V5—His or USP15 (C269A) V5—His co-expressed cells were almost equivalent (middle panel). It was also confirmed that USP15-V5-His or USP15 (C269A) -V5-His was expressed in the cell lysate used (lower panel).
  • Ub SLIM1 is subjected to Western blotting (denoted as WB in the figure) using anti-FLAG antibody after immunoprecipitation (denoted as IP in the figure) by Omni Probe antibody (denoted as Omni in the figure) Detected. His-Xpress-SLIMl was detected by Western blotting using an anti-Xpress antibody (denoted as a Xpress in the figure).
  • N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (sometimes abbreviated as His-Xpress-SLIM1; referred to as SLIM1 in the figure) and C-terminal V5-His fusion USP15 (abbreviated as USP15-V5-His)
  • SLIM1 N-terminal His-Xpress fusion SLIM1
  • SLIM15-V5-His C-terminal V5-His fusion USP15
  • FIG. 8 N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (sometimes abbreviated as His-Xpress SLIM1; abbreviated as SLIM 1 in the figure) and N-terminal HA fusion USP21 (sometimes abbreviated as HA-USP21)
  • His-Xpress-SLIM1 and N-terminal HA fusion inactive USP21 (sometimes abbreviated as HA-USP21 (C221A); shown in the figure as USP21 (C221A)) co-expressed cells
  • HA-USP21 C221A
  • C221A N-terminal HA fusion inactive USP21
  • the increase in His-Xpress-SLIM1 was low (upper panel). 13 ⁇ 45—55—3 cells that co-expressed ⁇ 1 and 11-8-1; 3-21, and His-Xpress-SLIM1 and HA-USP21 (C221A) co-expressed
  • the expression of each of HA-USP21 and HA-USP21 (C221A) was confirmed by Western blotting using anti-HA antibodies (middle panel).
  • N-terminal FLAG fusion USP20 (sometimes abbreviated as FLAG USP20; in the figure, abbreviated as US P20), N-terminal FLAG fusion USP22 (sometimes abbreviated as FLAG—USP22; in the figure, USP22 ) And N-terminal FLAG fusion USP33 (FLAG—USP33; may be abbreviated as USP33 in the figure)!
  • His -Xpress SLIM1 (sometimes abbreviated as SLI Ml)
  • SLI Ml N-terminal His-Xpress fusion SLIM1
  • cells were prepared from cells expressing only His- Xpre ss- SLIM 1 It is a figure which shows that the remarkable increase in the amount of His-Xpress-S LIM1 was recognized compared with (upper panel).
  • N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (In the figure, the terminal HA fusion USP21, which is abbreviated as His-Xpress-SLIM 1, may be abbreviated as HA-USP21; in the figure, it is abbreviated as USP21)
  • HA-USP21 the terminal HA fusion USP21
  • Yl 1 anti-HA antibody
  • N-terminal FLAG fusion USP20 (sometimes abbreviated as FLAG USP20; in the figure, referred to as USP20), N-terminal FLAG fusion USP22 (sometimes abbreviated as FLAG—USP22; in the figure, as USP22) And N-terminal FLAG fusion USP33 (FLAG-USP3 3; may be abbreviated as USP33 in the figure)!
  • protein As used herein generically, it means an isolated or synthetic full-length protein; an isolated or synthetic full-length polypeptide; or an isolated or synthetic full-length oligopeptide.
  • protein may be used.
  • the protein, polypeptide or oligopeptide includes two or more amino acids linked to each other by peptide bonds or modified peptide bonds. In the following, amino acids may be represented by one or three letters.
  • SLIM1 degradation (stability) of SLIM1 was regulated by deubiquitination by (for example, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33), and the action of SLIM1 was regulated by regulating the degradation. That is, there is a proteasome-dependent SLIM 1 degradation control mechanism through SLIM1 ubiquitination and ubiquitination SLIM 1 deubiquitination, and this mechanism regulates the amount of SLIM 1 and the action of SLIM 1 in the cell I found the possibility of being. Specifically, ubiquitination SLIM 1 is generated by SLIM1 ubiquitin, and the amount of ubiquitination SLIM 1 increases.
  • the ubiquitination S LIM1 is recognized by the proteasome and degraded in a proteasome-dependent manner.
  • This series of proteasome-dependent SLIM1 degradation mechanisms can be thought to reduce SLIM1 levels.
  • ubiquitin SLIM1 is deubiquitinated by USP
  • ubiquitin is dissociated from ubiquitinated SLIM1
  • the amount of ubiquitin SLIM1 decreases.
  • proteasome-dependent degradation of SLIM 1 decreases, so it can be considered that the amount of SLIM 1 increases.
  • Proteasome-dependent ubiquitination By promoting the degradation of SLIM1, the amount of SLIM1 can be decreased, and as a result, the action of SLIM1 can be reduced or eliminated. That is, SLIM 1 can be inhibited by promoting the degradation of proteasome-dependent ubiquitin ⁇ SLIM 1.
  • Deubiquitination by USP of ubiquitinated SLIM1 involves binding of USP and SLIM1, and binding of USP and ubiquitinated SLIM1.
  • SLIM1 can be considered to be ubiquitinized by an intracellular ubiquitination mechanism, and the resulting ubiquitin SLIM1 binds to USP. After binding, it is considered that the ubiquitinated SLIM 1 deubiquitinates depending on the cysteine protease activity of the USP. Since USP has been reported to have substrate specificity, it seems that USP recognizes both the ubiquitin part (or part thereof) and the SLIM1 part (or part thereof) of SLIM1. . Based on this, it is considered that the binding between USP and SLIM1 can be inhibited by inhibiting the binding between USP and SLIM1.
  • SLIM1 binds to USP (Examples 2, 9 and 10). Therefore, after SLIM1 binds to USP, SLIM1 is ubiquitinated by an intracellular ubiquitination mechanism, and ubiquitin is dissociated from the resulting ubiquitinated SLIM1 depending on the cysteine protease activity of the USP. It can also be thought that ubiquitination SLIM1 is deubiquitinated.
  • the amount of SLIM1 can be decreased, and as a result, the action of SLIM1 can be reduced or eliminated. That is, SLIM 1 can be inhibited by promoting proteasome-dependent degradation of ubiquitin SLIM 1.
  • Non-Patent Document 7 SLIM1 is thought to be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy.
  • SLIM1 mRNA levels increased in the heart of patients with hypertrophic cardiomyopathy compared to that of healthy individuals, and SLIMl in hypertrophic cardiomyopathy model mice compared to control mice. It has been reported that the amount of mRNA increases! /, (non-patent literature 10-12).
  • rSLIMlJ is a protein highly expressed in skeletal muscle and cardiac muscle.
  • the LIM domain of SLIM1 is a 50-60 amino acid protein-binding motif that interacts with transcription factors and cytoskeletal proteins and plays an important role in maintaining cell differentiation and cytoskeletal integrity.
  • Non-patent document 6 SLIM1 has been reported to be involved in the development of myoblasts and the development and development of hypertrophic cardiomyopathy, as well as myoblast power, the division of muscle cells, and myoblasts. Reference 7-12).
  • SLIM1 gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the gene and the protein are each NCBI (National Center for Biotechnology Information) official! 3 ⁇ 4Access to the data base It is published as Yon Number NM-001449 and NP-001440.
  • USP is a deubiquitinase that catalyzes a deubiquitin-reaction in which ubiquitin-resolved protein power ubiquitin dissociates.
  • Many family proteins are known as USP.
  • USP is a cysteine protease having a Cys domain, a His domain, and an Asp domain as its active domains, and a cysteine residue present in the Cys domain as an active site.
  • USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33 are preferably exemplified as USP. More preferably, USP15 can be exemplified. In the present invention, USPs are not limited to these USPs, and may be any USP having deubiquitination activity and expressed in the heart.
  • USP15 is one of cysteine proteases and has been reported to have a deubiquitin activity that cleaves ubiquitin from ubiquitinated proteins (Non-patent Document 14). USP15 expression has been observed in various tissues, particularly high in skeletal muscle and heart. Preferred examples of the USP15 gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, respectively. The gene and the protein are published in the NCBI public database as accession numbers NM-006313 and NP_006304, respectively.
  • USP21 is one of the cysteine proteases and has been reported to have deubiquitin activity that cleaves ubiquitin from ubiquitinated proteins ("The Journal of Novel Logic Chemistry (The Journal of Biological Chemistry), 2000, 275, p. 14212-14216). In addition, USP21's high expression in the organ is known. Preferred examples of the USP21 gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, respectively. The gene and the protein are published in the NCBI public database as accession numbers NM-012475 and NP-03 6607, respectively.
  • USP20 is one of cysteine proteases and is a ubiquitinated protein. It has been reported to have deubiquitin activity that cleaves chitin ("The Journal of Clinical Investigation", 2003, 112, p. 189—196).
  • Preferred examples of the USP20 gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, respectively. The gene and the protein are published in the NCBI public database as accession numbers NM 1 006676 and NP 1 006667, respectively.
  • USP22 is one of cysteine proteases and is a protein that is highly expressed in the heart.
  • Preferred examples of the USP22 gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively.
  • the gene and the protein are disclosed as accession numbers AB028986 and BAA83015 in the NCBI public database, respectively.
  • USP33 is one of cysteine proteases and has been reported to have deubiquitin activity that cleaves ubiquitin from ubiquitinated proteins ("The Journal of Tal-calin The Journal of Clinical Investiga- tion, "2003, 112, p. 189-196).
  • Preferred examples of the USP33 gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing, respectively. The gene and the protein are published in the NCBI public database as accession numbers NM 015017 and NP 055832, respectively.
  • Ubiquitination means modification of a protein by ubiquitin by covalently binding one or more molecules of ubiquitin to one molecule of protein. Ubiquitin is thought to be covalently bound to a lysine residue in the target protein. When another ubiquitin is further covalently bound to a lysine residue in ubiquitin bound to a lysine residue in the target protein, a plurality of ubiquitins are bound to the protein in a chain. A chain in which a plurality of ubiquitins are linked in this manner is called a polyubiquitin chain. The 48th lysine residue in the amino acid sequence has been identified as the site for ubiquitin in ubiquitin.
  • Ubiquitin is a protein having a 76 amino acid force that exists universally in eukaryotes. In proteolytic proteolysis, ubiquitin binds to a target protein to form a polyubiquitin chain and functions as a proteolytic label.
  • Preferred examples of the ubiquitin gene and the protein encoded by the gene include human-derived genes and proteins represented by the sequences shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, respectively. The base sequence and amino acid sequence of the gene and the protein are published as accession numbers NM-002954 and NP-002945 in the NCBI public database, respectively.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) published in accession number NM-002954 encodes two proteins, namely ubiquitin and ribosomal protein S27a, and the first force in the nucleotide sequence is also the 228th.
  • the region up to is the region encoding ubiquitin.
  • the first power of the amino acid sequence disclosed in accession number NP-002945 is also the amino acid sequence up to the 76th amino acid sequence (SEQ ID NO: 14).
  • SLIM1 ubiquitination means modification of SLIM1 by ubiquitin by covalently binding one or more molecules of ubiquitin to one molecule of SLIM1.
  • Ultraquitinated SLIM1J means ubiquitinated SLIM 1, that is, SLIM1 modified by covalently binding one or more molecules of ubiquitin to one molecule of SLI Ml.
  • ubiquitination of SLIM1 means that ubiquitin is derived from SLIM1 that is modified by covalently binding one or more ubiquitins to SLIM1 that is ubiquitinated, that is, one molecule of SLIM1. It means a dissociating reaction.
  • Ubiquitination of SLIM1 by USP refers to ubiquitinated SLI M1, ie, SLIM1 modified by covalent binding of one molecule of SLIM1 to USP cysteine. It means a reaction in which ubiquitin dissociates depending on protease activity.
  • “Inhibition of deubiquitination by USP of ubiquitinated SLIM1” means that the amount of ubiquitinated SLIM 1 is increased or occurs compared to before inhibiting deubiquitination of USP of ubiquitinated SL IM1 , And Z or SLIM 1 amount decreases or disappears It means to do.
  • USP deubiquitination activity refers to a ubiquitin-modified protein, that is, a protein that is modified by covalently binding one or more molecules of ubiquitin to one molecule of protein. Means the reaction of ubiquitin dissociation
  • USP-SLIM1 binding means that USP and SLIM1 interact by non-covalent bonds such as hydrogen bonds, hydrophobic bonds, or electrostatic interactions to form a complex. To do. In this case, it is sufficient that USP and SLIM1 are partly connected. For example, it means a binding between USP or a part thereof and SLIM1 or a part thereof.
  • USP and ubiquitinated SLIM1 The binding of USP and ubiquitinated SLIM1 means that USP and ubiquitinated SLIM1 interact with each other by non-covalent bonds such as hydrogen bonds, hydrophobic bonds, or electrostatic interactions to form a complex. It means to do. In this case, it is sufficient that USP and ubiquitin SLIM1 are combined in a part of them. For example, it means binding between USP or a part thereof and SLIM1 or a part thereof constituting ubiquitinated SLIM1.
  • “Inhibition of binding between USP and ubiquitinated SLIM1” means that the complex containing USP and ubiquitinated SLIM1 is reduced or eliminated compared to before inhibition of binding between USP and ubiquitinated SLIM1. Means.
  • Proteanome is a macromolecular protease localized in the nucleus and cytoplasm, and selectively degrades intracellular proteins.
  • the 26S proteasome is known as a protease complex that recognizes ubiquitin protein and participates in its selective and energy-dependent degradation.
  • Proteasome-dependent ubiquitination of SLIM1 degradation means a series of reactions that are recognized by the ubiquitination SLIM1 force proteanome and degraded in the proteasome.
  • “Stabilizing SLIM1” means inhibiting the proteasome-dependent degradation of SLIM1 and increasing the amount of SLIM1. For example, the intracellular ubiquitination mechanism Inhibits proteasome-dependent degradation of biquitinated SLIM 1 to increase the amount of SLIM 1
  • “Hypertrophic cardiomyopathy” is a myocardial disease in which the myocardium, mainly the myocardium of the left ventricle, is enlarged. As the myocardium becomes enlarged, the lumen of the ventricle, mainly the left ventricle, becomes narrower and blood circulation worsens. Symptoms such as chest pain and dyspnea may appear, but most of them have a high risk of sudden death due to arrhythmia, which lacks subjective symptoms. As a therapeutic agent for hypertrophic cardiomyopathy, ⁇ -sympathetic receptor blockers and calcium antagonists are used for the purpose of dilating the left ventricle.
  • Cardiomyocyte hypertrophy means a phenomenon in which the volume of cardiomyocytes increases. In general, enlarged cells increase in volume with the protoplasm, nucleus, accompanied by an increase in the number of mitochondria and other organelles.
  • Marker showing cardiomyocyte hypertrophy means an index capable of detecting cardiomyocyte hypertrophy. Specifically, changes in cardiomyocytes caused by cardiomyocyte hypertrophy can be used as a marker indicating cardiomyocyte hypertrophy. Markers that indicate hypertrophy of cardiomyocytes: increased uptake of leucine into cardiomyocytes, increased surface area of cardiomyocytes, and atrial natriuretic peptide (sometimes abbreviated as ANP) An increase in secretion amount can be preferably exemplified. It is known that ANP is also secreted from the ventricle by normal cardiac hypertrophy, which is a peptide hormone secreted by the atrial force.
  • One embodiment of the present invention provides a method for deubiquitinating ubiquitin SLIM 1, a method for stabilizing SLIM 1, and a cardiac myocyte in an in vitro sample or a non-human mammal using USP. It relates to the method of enlargement.
  • An in vitro sample or a non-human mammal treated by any one of the method for deubiquitinating SLIM1 according to the present invention, the method for stabilizing SLIM1, and the method for hypertrophying cardiomyocytes is provided. It can be used in a method for identifying a compound that inhibits deubiquitination by USP of ubiquitinated SLIM 1.
  • an "in vitro sample” refers to an animal, for example, a cell or tissue prepared by mammalian force, a cultured cell derived from an animal, and a protein or genetic material prepared from the cell, tissue or cultured cell. It means a sample such as a solution containing children.
  • Non-human mammal means mammals other than human, for example, mammals such as mouse, rat, usagi, inu, goat and the like. Preferably a mouse is used.
  • the method for deubiquitinating ubiquitinating SLIM1 according to the present invention can be carried out under different conditions, in vivo and in vitro.
  • this method can be carried out by any of the following methods: (1) Using a cell in which SLIM 1 expression is observed, express the USP in the cell; (2) In the cell, SLIM1 and USP And (3) let cells express ubiquitinated SLIM1 and USP.
  • SLIM1 expression and USP expression can be achieved by transfection of cells into cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM1 and an appropriate vector containing the gene encoding USP, respectively. Can be achieved.
  • SLIM1 ubiquitin is performed by the endogenous ubiquitination mechanism of cells.
  • the expression of ubiquitinated SLIM 1 is carried out by transfection into cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM 1 and an appropriate vector containing the gene encoding ubiquitin. This can be achieved.
  • the cell is preferably a eukaryotic cell.
  • Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines.
  • a cultured cell line derived from a mammal is used, more preferably a cultured cell line derived from a human.
  • HEK293T cells can be preferably exemplified as a human-derived cell line.
  • Deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 can be detected by measuring the amount of ubiquitinated SLIM1 and the amount of Z or SLIM1 (Examples 5 to 8).
  • ubiquitinated SLIM1 is deubiquitinated, ubiquitin is dissociated from ubiquitinated SLIM1 and the amount of ubiquitinated SLIM1 decreases.
  • the proteasome-dependent degradation of SLIM1 decreases, so it can be considered that the amount of SLIM1 increases. Therefore, deubiquitination of ubiquitin SLIM1 by USP can be detected by measuring the amount of ubiquitin SLIM1 and Z or SLIM1.
  • ubiquitination SLIM1 level decreases or disappears, or SLIM1 level increases If it occurs, it can be determined that ubiquitinated SLIM1 was deubiquitinated by USP.
  • detection of deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 in cells can be carried out by measuring the amount of ubiquitinated SLIM1 and Z or SLIM1 in the cell lysate in which the cell force is also prepared.
  • the amount of ubiquitinated SLIM1 in cell lysate decreases or disappears, or when the amount of SLIM1 in cell lysate increases or occurs, it can be determined that ubiquitinated SLIM1 has been deubiquitinated by USP in cells.
  • the cell When measuring the amount of ubiquitinated SLIM1 in a cell, the cell is preferably cultured in a medium containing a proteasome inhibitor such as MG-132. By culturing cells in a medium containing a proteasome inhibitor, degradation of ubiquitinated SLIM1 by the proteasome can be suppressed, so that the amount of ubiquitinated SLIM can be accurately measured.
  • a proteasome inhibitor such as MG-132
  • the method for stabilizing SLIM1 according to the present invention can be performed under both in vivo and in vitro conditions.
  • this method can be carried out by any of the following methods: (1) Using a cell in which SLIM 1 expression is observed, allow the cell to express USP; (2) In a cell, SLIM 1 and Express USP; and (3) express USP in cells that have expressed ubiquitinated SLIM 1.
  • SLIM 1 expression and USP expression were transferred to cells by conventional genetic engineering techniques using appropriate vectors containing the gene encoding SLIM 1 and appropriate vectors containing the gene encoding USP, respectively. This can be achieved by performing SLIM1 ubiquitin is performed by the endogenous ubiquitination mechanism of cells.
  • the expression of ubiquitinated SLIM1 is achieved by transfecting cells into cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM1 and an appropriate vector containing the gene encoding ubiquitin. Can be achieved.
  • the cell is preferably a eukaryotic cell.
  • Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines.
  • a cultured cell line derived from a mammal is used, more preferably a cultured cell line derived from a human.
  • HEK293 cells are preferably exemplified as a human-derived cultured cell line.
  • SLIM1 stabilization was determined by determining the amount of ubiquitinated SLIM1 and the amount of Z or SLIM1. This can be done by measuring (Examples 6-8). When the amount of ubiquitinated SLIM 1 decreases or disappears, or when the amount of SLIM1 increases or occurs, it can be determined that SLIM1 is stabilized. For example, the determination of the stability of SLIM1 in cells can be carried out by measuring the amount of ubiquitinated SLIM 1 and / or SLIM 1 in cell lysate prepared from the cells. When the amount of ubiquitinated SLIM1 in cell lysate decreases or disappears, or when the amount of SLIM1 in cell lysate increases or occurs, it can be determined that SLIM1 is stabilized in the cell.
  • the amount of ubiquitinated SLIM1 and the amount of Z or SLIM1 can be measured by a protein detection method known per se.
  • protein detection methods include Western plot method, immunoprecipitation method, pull-down method, two-hybrid method, and fluorescence resonance energy transfer method. These methods can be used alone, or a combination of these methods can be used to detect the desired protein.
  • ubiquitin and / or SLIM1 in advance and detecting the labeled substance, ubiquitinated SLIM 1 and SLIM 1 can be easily detected.
  • Preferred examples of the labeling substance include tag peptides such as HA-tag and FLAG-tag.
  • the method for hypertrophying cardiomyocytes according to the present invention can be carried out, for example, by expressing USP in cardiomyocytes.
  • SLIM1 can be expressed together with USP.
  • the cardiomyocytes can be any of eukaryotic myocardial force prepared cells, primary cultured cells, and cultured cell lines.
  • cultured cardiomyocytes derived from mammals are used.
  • the myocardial cells are preferably ventricular cardiomyocytes.
  • Preferred examples of cultured cardiomyocytes derived from mammalian ventricles include rat-derived primary cultured cardiomyocytes.
  • SLIM1 expression and USP expression were transferred to cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM1 and an appropriate vector containing the gene encoding USP, respectively. This can be achieved.
  • Cardiomyocyte hypertrophy can be determined by detecting a marker indicating cardiomyocyte hypertrophy.
  • markers indicating hypertrophy of cardiomyocytes include increased uptake of leucine into cardiomyocytes, increased cardiomyocyte surface area, and increased ANP secretion from cardiomyocytes.
  • Increased uptake of leucine into cardiomyocytes, cardiomyocyte surface area Increased ANP and increased ANP secretion of cardiomyocyte force can be compared with cardiomyocytes expressing USP or USP and SLIM1, and cardiomyocytes not expressing them. Can be determined.
  • the uptake of leucine can be measured, for example, by culturing cardiomyocytes in a [3] mouth icin-containing culture medium for an appropriate period of time, then dissolving the cells and measuring the radioactivity.
  • the cardiomyocyte surface area can be measured, for example, by expressing a fluorescent substance in cardiomyocytes and detecting the fluorescent substance.
  • the amount of ANP secretion can be measured by collecting the culture supernatant of cardiomyocytes and quantifying the amount of ANP in the culture supernatant using a commercially available ELISA (enzyme linked immunos orbent assay) kit.
  • cardiomyocytes expressing USP or cardiomyocytes expressing USP and SLIM 1 leucine uptake, cardiomyocyte surface area, and cardiomyocyte ANP secretion compared to cardiomyocytes not expressing these If at least one of the markers such as the quantity increases, it can be determined that the cardiomyocytes are enlarged.
  • the method of deubiquitinating ubiquitinating SLIM1, the method of stabilizing SLIM1, and the method of hypertrophying cardiomyocytes according to the present invention can be performed by introducing a USP gene into a non-human mammal. .
  • the SLIM1 gene together with the USP gene can be introduced into a non-human mammal.
  • Introduction of a desired gene into a non-human mammal can be carried out using a technique that intentionally modifies the genetic information of an organism by homologous recombination of the gene.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitin ⁇ SLIM1.
  • the method for identifying a compound that inhibits deubiquitination of USP of ubiquitin SLIM1 is described in an experimental system capable of measuring deubiquitination of USP of ubiquitinated SLIM1 in the presence of the compound (test compound) to be examined.
  • Contact SLIM1 and USP Including the step of For example, the test compound is brought into contact with the ubiquitinated SLIM1 and Z or USP under conditions that allow the interaction between ubiquitinated SLIM1 and USP, and then the deubiquitination of the ubiquitinated SLIM 1 by USP occurs.
  • a compound that inhibits deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitinated SLIM 1 by detecting the presence or absence or change of this signal and Z or marker using a system that uses the signal and Z or marker. Can be identified.
  • Whether a test compound inhibits USP deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 is determined by determining whether the signal generated by deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitin ⁇ SLIM1 in the presence of the test compound or the deubiquitin ⁇ This can be carried out by comparing the marker with the signal generated by deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitinated SLIM 1 in the absence of the test compound or the deubiquitin ⁇ .
  • SLIM1 degradation (stability) of SLIM1 may be regulated by deubiquitination by USP. That is, there is a proteasome-dependent SLIM 1 degradation control mechanism through SLIM1 ubiquitination and ubiquitination of SLIM 1, and this mechanism regulates the amount of SLIM 1 and the action of SLIM 1 in the cell I found the possibility of being lost. Specifically, ubiquitination of SLIM1 generates ubiquitinated SLI Ml, and the amount of ubiquitinated SLIM1 increases. The ubiquitinated SLI Ml is then recognized by the proteasome and degraded proteasome-dependently.
  • the test compound when the amount of ubiquitinated SLIM1 increases or occurs in the presence of a test compound compared to the amount of ubiquitinated SLIM1 in the absence of the test compound, the test compound is deubiquitinated by USP of ubiquitinated SLIM1. Can be determined to inhibit. Further, when the amount of SLIM1 in the presence of the test compound is reduced or eliminated compared to the amount of SLIM1 in the absence of the test compound, it can be determined that the test compound inhibits deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 by USP.
  • the amount of ubiquitinated SLIM1 and the amount of Z or SLIM1 can be measured by a protein detection method known per se.
  • protein detection methods include Western plot method, immunoprecipitation method, pull-down method, two-hybrid method, and fluorescence resonance energy transfer method. These methods can be used alone, or a combination of these methods can be used to detect the desired protein.
  • ubiquitin and / or SLIM1 in advance and detecting the labeled substance, ubiquitinated SLIM 1 and SLIM 1 can be easily detected.
  • Preferred examples of the labeling substance include tag peptides such as HA-tag and FLAG-tag.
  • the experimental system capable of measuring deubiquitination of SLIM1 by USP may be an in vitro experimental system or an in vivo experimental system.
  • this experimental system include an experimental system using an in vitro sample or non-human mammal treated by the method of deubiquitinating ubiquitinated SLIM1 according to the present invention.
  • the following cells can be exemplified: (1) cells in which SLIM1 expression is observed and cells in which USP is expressed; (2) cells in which SLIM1 and USP are expressed; and (3) ubiquitin Cells expressing SLIM1 and USP.
  • SLIM1 expression and USP expression can be carried out by transfecting cells into cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM1 and an appropriate vector containing the gene encoding USP, respectively. Can be achieved.
  • SLIM1 ubiquitin is performed by the endogenous ubiquitination mechanism of cells.
  • Ubiquitination SLIM1 expression is routinely performed using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM 1 and an appropriate vector containing the gene encoding ubiquitin. These can be achieved by transfecting these cells with genetic engineering techniques.
  • the cell is preferably a eukaryotic cell.
  • Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines.
  • a mammalian cell line more preferably a human cell line is used.
  • a preferred example of a human-derived cell line is HEK293T cells.
  • a method for identifying a compound that inhibits deubiquitination of USP of ubiquitin SLIM1 by the USP is exemplified below.
  • the cells are cultured in the presence and absence of the test compound. Subsequently, cell lysate is prepared from the cells, and ubiquitin SLIM1 and / or SLIM1 in the cell lysate is detected.
  • the test compound when the amount of ubiquitin SLIM1 detected in the presence of the test compound is increased or generated compared to the amount of ubiquitinated SLIM1 detected in the absence of the test compound, the test compound is It can be determined that ubiquitination of SLIM1 inhibits deubiquitination by USP. In addition, when the amount of SLIM 1 detected in the presence of the test compound decreases or disappears compared to the amount of SLIM 1 detected in the absence of the test compound, the test compound is also a USP of ubiquitinated SLIM 1. It can be determined that the deubiquitination caused by is inhibited.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between USP and SLIM1.
  • the method for identifying a compound that inhibits the binding between USP and SLIM1 includes a step of bringing USP and SLIM 1 into contact in the presence of a test compound in an experimental system capable of measuring the binding between USP and SLIM1.
  • a test compound is brought into contact with SLIM1 and Z or USP under conditions that allow interaction between USP and SLIM1, and then a system using a signal and Z or marker generated by the binding of SLIM1 and USP is used. Use this signal and Z
  • compounds that inhibit the binding of USP and SLIM 1 can be identified by detecting the presence or absence or change of the marker.
  • Whether or not a test compound inhibits the binding between USP and SLIM1 is determined based on the signal generated by the binding of USP and SLIM1 in the presence of the test compound or a marker of the binding, and USP and SLIM1 in the absence of the test compound. Can be performed by comparing the signal produced by the binding of and the marker of Z or the binding. When the signal generated by the binding of USP and SLIM1 in the presence of the test compound or the marker for the binding compared to the signal generated by the binding of USP and SLIM1 in the absence of the test compound or the marker for the binding is reduced or eliminated, The test compound can be determined to inhibit the binding between USP and SLIM1.
  • Detection of the binding between USP and SLIM1 can be carried out using a protein detection method known per se.
  • the binding between USP and SLIM1 can be detected by detecting a complex containing USP and SLIM1 by a protein detection method known per se.
  • protein detection methods include Western blot method, immunoprecipitation method, pull-down method, two-hybrid method, and fluorescence resonance energy transfer method. These methods can be used alone or in combination to detect a desired protein.
  • Tag peptides such as HA-tag and FLAG-tag are preferably displayed as labeling substances.
  • the experimental system capable of measuring the binding between USP and SLIM1 may be an in vitro experimental system or an in vivo experimental system.
  • this experimental system include an experimental system using an in vitro sample or a non-human mammal treated by the method of deubiquitinating ubiquitinated SLIM1 according to the present invention.
  • the following cells can be exemplified: (l) cells in which SLIMl expression is observed, cells expressing USP; (2) cells expressing SLIM 1 and USP; and (3) ubiquitin Cells expressing SLIM 1 and USP.
  • SLIM 1 expression and USP expression can be performed by conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM 1 and an appropriate vector containing the gene encoding USP, respectively. This can be achieved by transfecting the cells.
  • SLIM1 ubikichi National is carried out by the endogenous ubiquitination mechanism of cells.
  • Ubiquitination S LIM 1 is expressed in cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM 1 and an appropriate vector containing the gene encoding ubiquitin. This can be achieved by using Yong.
  • the cell is preferably a eukaryotic cell. Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines. Preferably, a mammalian cell line, more preferably a human cell line is used.
  • HEK293T cells are preferably exemplified as a human-derived cultured cell line.
  • a method for identifying a compound that inhibits the binding between USP and SLIM1 is exemplified below.
  • the cells are cultured in the presence of the test compound and in the absence of the test compound.
  • cell lysate is prepared from the cell capsule, and the binding between USP and SLIM1 is detected by detecting a complex containing USP and SLIM1 in the cell lysate.
  • Detection of the complex containing USP and SLIM1 involves immunoprecipitation using an antibody capable of detecting one of the USP and SLIM1, and further western blotting using an antibody capable of detecting the other protein. It can be done by doing.
  • a reducing agent necessary for USP cysteine protease activity for example dithiothreitol (DTT) or It is preferable not to mix ⁇ -mercaptoethanol in this binding reaction solution.
  • DTT dithiothreitol
  • cysteine which is a site necessary for cysteine protease activity of USP
  • cysteine which is a site necessary for cysteine protease activity of USP
  • other amino acids For example, a USP inactive mutant that is substituted with alanine or serine, etc. and that binds to ubiquitinated SLIM1 is used instead of USP. , Is also good.
  • an "inactive mutant of USP” is a USP in which mutations such as amino acid deletion, substitution, addition, or insertion have been introduced into USP, compared to USP (wild-type USP). It means USP in which cysteine protease activity is attenuated or disappears. Inactive mutants of USP may be naturally occurring or artificially introduced mutations. Means for introducing such mutations are known per se, for example, using Ulmer's technology (Ulmer KM, Science, 1983, No. 219, p. 666-671). Can be implemented. Examples of the mutation site include a site necessary for USP cysteine protease activity in the USP amino acid sequence.
  • USP15 inactive mutants in which the 269th cysteine of USP15 was replaced with alanine, and USP21 in which the 221nd cysteine of USP21 was replaced with an alanine were used as inactive mutants of USP.
  • Inactive mutants can be preferably exemplified.
  • the 269th cysteine of USP15 and the 221nd cysteine of USP21 are the cysteine protease active sites of USP15 and USP21, respectively, and are essential amino acid residues for cysteine protease activity.
  • a known two-hybrid method can be used.
  • a plasmid that expresses USP and a DNA-binding protein as a fusion protein a plasmid that expresses SLIM 1 and a transcriptional activity protein as a fusion protein, and a plasmid containing a reporter gene such as lacZ connected to an appropriate promoter gene are yeast.
  • the expression level of the reporter gene in the presence of the test compound is compared with the expression level of the reporter gene in the absence of the test compound. No test compound present When the expression level of the reporter gene in the presence of the test compound decreases compared to the expression level of the reporter gene below, it can be determined that the test compound has an action of inhibiting the binding of USP and SLIM 1. .
  • One embodiment of the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits binding between USP and ubiquitinated SLIM1.
  • SLIM1 is ubiquitinized by an intracellular ubiquitination mechanism, and the resulting ubiquitin SLIM 1 can be thought to bind to USP. After binding, it is considered that the ubiquitinated SLIM 1 deubiquitinates depending on the cysteine protease activity of the USP. Since USP has been reported to have substrate specificity, USP recognizes the difference between the ubiquitin part (or part thereof) and SLIM1 part (or part thereof) of ubiquitin ⁇ SLIM1! / I think.
  • SLIM1 binds to USP (Examples 2, 9 and 10). From this, after SLIM1 binds to USP, the SLIM1 is ubiquitinated by the intracellular ubiquitination mechanism, and ubiquitin is dissociated from the ubiquitinated SLIM1 generated as a result of the USP cysteine protease activity, that is, It can also be considered that the ubiquitinated SLIM1 is deubiquitinated.
  • the method for identifying a compound that inhibits the binding between USP and ubiquitinated SLIM1 is the step of contacting USP with ubiquitinated SLIM 1 in the presence of a test compound in an experimental system capable of measuring the binding between USP and ubiquitinated SLIM1. including. For example, a test compound and ubiquitinated SLIM 1 and Z or Z under conditions that allow USP to interact with ubiquitinated SLIM 1.
  • the determination of whether a test compound is capable of inhibiting the binding of USP and ubiquitin SLIM1 is based on the signal generated by the binding of USP and ubiquitinated SLIM1 in the presence of the test compound or a marker of the binding, and the test compound. This can be done by comparing the signal produced by the binding of USP and ubiquitin SLIM 1 in the absence or marker of the binding.
  • the signal generated by binding of USP and ubiquitinated SLIM1 in the presence of the test compound or the marker of binding is reduced or compared to the signal generated by binding of USP and ubiquitinated SLIM1 in the absence of the test compound or If it disappears, it can be determined that the test compound inhibits the binding of USP and ubiquitinated SLIM1.
  • Detection of binding between USP and ubiquitin SLIM1 can be performed using a protein detection method known per se.
  • the binding between USP and ubiquitinated SLIM1 can be detected by detecting a complex containing USP and ubiquitinated SLIM1 by a protein detection method known per se.
  • protein detection methods include the Western plot method, immunoprecipitation method, pull-down method, two hybrid method, and fluorescence resonance energy transfer method. These methods can be used alone, or a combination of these methods can be used to detect a desired protein.
  • tag peptides such as HA-tag and FLAG-tag can be preferably exemplified
  • the experimental system capable of measuring the binding of USP and ubiquitin SLIM1 may be an in vitro experimental system or an in vivo experimental system.
  • this experimental system include an experimental system using an in vitro sample or a non-human mammal treated by the method of deubiquitinating ubiquitinated SLIM 1 according to the present invention.
  • the following cells can be exemplified: (l) cells in which SLIMl expression is observed, and cells in which USP is expressed; (2) SLIM1 and USP are expressed. And (3) cells expressing ubiquitinated SLIM1 and USP.
  • SLIM1 expression and USP expression were transferred to cells using conventional genetic engineering techniques using appropriate vectors containing the SLIM 1 encoding gene and appropriate vectors containing the USP encoding gene, respectively. This can be achieved by using Yong.
  • SLIM1 ubiquitin is carried out by the endogenous ubiquitination mechanism of cells.
  • the expression of ubiquitinated SLIM1 can be carried out by transfecting cells into cells using conventional genetic engineering techniques using an appropriate vector containing the gene encoding SLIM1 and an appropriate vector containing the gene encoding ubiquitin. This can be achieved by using Yong.
  • the cell is preferably a eukaryotic cell.
  • Eukaryotic cells can be any of cells prepared from eukaryotes, primary cultured cells, and cultured cell lines.
  • a mammalian cell line more preferably a human cell line is used.
  • HEK293T cells are preferably listed as human cell lines.
  • Examples of methods for identifying compounds that inhibit the binding of USP and ubiquitinated SLIM1 are shown below.
  • the cells are cultured in the presence of the test compound and in the absence of the test compound.
  • cell lysate is prepared from the cell cassette, and the binding between USP and ubiquitinated SLIM 1 is detected by detecting a complex containing USP and ubiquitinated SLIM 1 in the cell lysate.
  • Detection of the complex containing USP and ubiquitinated SLIM 1 was performed by immunoprecipitation using an antibody capable of detecting one protein of USP and ubiquitinated SLIM1, and further using an antibody capable of detecting the other protein. Western blotting can be performed. In such a detection method, when a coprecipitate of USP and ubiquitinated SLIM1 is detected, it can be determined that USP and ubiquitinated SLIM 1 bind to form a complex containing USP and ubiquitinated SLIM 1. .
  • USP and ubiquitinated SLIM1 coprecipitate detected in the presence of the test compound compared to the amount of USP and ubiquitinated SLIM1 coprecipitate detected in the absence of the test compound.
  • the amount of the test compound decreases or disappears, it can be determined that the test compound inhibits the binding between USP and ubiquitinated SLIM 1.
  • a reducing agent necessary for USP cysteine protease activity to inhibit the progression of the deubiquitin-reaction by USP for example, It is preferable not to mix dithiothreitol (DTT) or ⁇ -mercaptoethanol in this binding reaction solution.
  • DTT dithiothreitol
  • ⁇ -mercaptoethanol ⁇ -mercaptoethanol
  • cysteine which is a site necessary for cysteine protease activity of USP
  • cysteine which is a site necessary for cysteine protease activity of USP
  • a USP inactive mutant that is substituted with alanine or serine or the like and that binds to ubiquitinated SLIM1 is also preferably used instead of USP.
  • USP inactive mutants are preferably exemplified by USP15 inactive mutants in which the 269th cysteine of USP15 is replaced with alanine, and USP21 inactive mutants in which the 221nd cysteine of USP21 is replaced with alanine. it can.
  • both proteins were obtained by pulling down the GS ⁇ fusion USP and ubiquitinated SLIM 1 in vitro and using dartathione rosin.
  • An identification method using an experimental system for detecting the binding of can be exemplified.
  • the binding of both proteins can be detected using a Western plot method or the like. In such an experimental system, when the amount of binding of both proteins detected in the presence of the test compound is reduced or eliminated compared to the amount of binding detected in the absence of the test compound, the test compound is It can be determined that the binding is inhibited.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits hypertrophy of cardiomyocytes caused by deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitin ⁇ SLIM1.
  • the method of identifying compounds that inhibit cardiomyocyte hypertrophy due to deubiquitination of USP of ubiquitinating SLIM1 was performed in an experimental system that can measure hypertrophy of cardiomyocytes due to deubiquitinization by USP of ubiquitinating SLIM1.
  • SLIM1 and ZP or USP in contact with a test compound under conditions that allow SLIM1 and USP interaction, and then uses signals and Z or markers generated by myocardial cell hypertrophy
  • signals and Z or markers generated by myocardial cell hypertrophy By detecting the presence or absence or change of this signal and Z or marker, compounds that inhibit cardiomyocyte hypertrophy due to deubiquitination by USP of ubiquitinated SLIM 1 can be identified.
  • Test compound is ubiquitinated SLIM1 cardiomyocyte induced by USP deubiquitin
  • the determination of whether to inhibit the hypertrophy of the cardiomyocytes depends on the signal generated by hypertrophy of cardiomyocytes in the presence of the test compound, or the signal generated by hypertrophy of the cardiomyocytes in the absence of the test compound Or it can carry out by comparing the marker of this enlargement.
  • the test compound can be determined to inhibit hypertrophy of myocardial cells caused by deubiquitin-induced ubiquitination by USP of ubiquitinated SLIM1.
  • markers showing cardiomyocyte hypertrophy include increased leucine uptake into cardiomyocytes, increased cardiomyocyte surface area, and increased ANP secretion of cardiomyocyte force.
  • ANP is known to be secreted from the ventricle by force cardiac hypertrophy, which is a peptide hormone that normally secretes the heart, especially atrial force.
  • test compound inhibits cardiomyocyte hypertrophy due to deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 by USP was determined based on the amount of leucine incorporated into cardiomyocytes, cardiomyocyte surface area, and myocardial cell surface. This can be done by measuring any one or more of the ANP secretion from the cells. Specifically, leucine uptake into cardiomyocytes in the presence of the test compound compared to the amount of leucine uptake into the myocardial cells in the absence of the test compound, cardiomyocyte surface area, and ANP secretion from the cardiomyocytes. If the ANP secretion amount, myocardial cell surface area, and cardiomyocyte force is reduced or eliminated, the test compound can be determined to inhibit cardiomyocyte hypertrophy due to deubiquitin ⁇ by ubiquitinated SLIM 1 USP.
  • SLIM1 and USP were expressed, or S LIM 1 and Z or USP were expressed.
  • a cardiomyocyte can be illustrated.
  • cardiomyocytes expressing ubiquitin can also be used.
  • SLIM1, USP, and ubiquitin are expressed using an appropriate vector containing a gene encoding SLIM 1, an appropriate vector containing a gene encoding USP, and an appropriate vector containing a gene encoding ubiquitin, respectively. These are detailed using conventional genetic engineering techniques. This can be achieved by transfusing cells. SLIM1 ubiquitination is carried out by the endogenous ubiquitination mechanism of cells.
  • the cardiomyocytes may be any of eukaryotic myocardial force-prepared cells, primary cultured cells, and cultured cell lines.
  • cultured cardiomyocytes derived from mammals are used.
  • the cardiomyocytes are preferably ventricular cardiomyocytes.
  • Preferred examples of cultured cardiomyocytes derived from mammalian ventricles include rat-derived primary cultured cardiomyocytes.
  • Ubiquitination A method for identifying a compound that inhibits hypertrophy of cardiomyocytes by deubiquitination of SLIM1 by USP is exemplified below.
  • Rat cardiomyocytes coexpressed with SLIM 1 and USP are used to grow the cells in the presence and absence of the test compound.
  • Expression of SLIM1 and USP can be achieved using recombinant adenovirus for SLIM1 expression and recombinant adenovirus for USP expression.
  • [] mouth isin is added to the culture medium and further cultured, so that [] leucine is incorporated into the cells. Thereafter, the cells are washed and fixed with triclonal acetic acid (TCA).
  • TCA triclonal acetic acid
  • the cells After further washing the cells, the cells are solubilized and the radioactivity of [] leucine incorporated into the cells is measured.
  • Such Te Contact ⁇ the experimental system as compared with the radioactivity of [3 H] leucine to be detected by the test compound in the absence, is detected by the presence of the test compound [3 H] decreases radioactivity of leucine Alternatively, when it disappears, it can be determined that the test compound inhibits hypertrophy of cardiomyocytes due to deubiquitination of ubiquitinated SLIM 1 by USP.
  • Ubiquitination Another example of a method for identifying a compound that inhibits cardiomyocyte hypertrophy by deubiquitination of SLIM1 by USP is described below.
  • Rat cardiomyocytes co-expressing SLIM1 and USP are used, and the cells are cultured in the presence of a test compound and in the absence of the test compound.
  • SLIM1 and USP expression can be achieved using recombinant adenovirus for SLIM1 expression and recombinant adenovirus for USP expression. After culturing the cells, capture an image of the cells and measure the cell surface area with image analysis software.
  • the test compound is due to the USP of ubiquitinated SLIM 1. It can be determined that the hypertrophy of cardiomyocytes by deubiquitin is inhibited.
  • Ubiquitination Another example of a method for identifying a compound that inhibits hypertrophy of cardiomyocytes by deubiquitination of SLIM 1 by USP is described below. Rat cardiomyocytes co-expressing SLIM1 and USP are used, and the cells are cultured in the presence of a test compound and in the absence of the test compound.
  • SLIM1 and USP expression can be achieved using recombinant adenovirus for SLIM1 expression and recombinant adenovirus for USP expression.
  • After culturing the cells collect the culture supernatant and measure the amount of ANP in the culture supernatant using an ELISA kit.
  • the test compound is a USP of ubiquitin ⁇ SLIM1. It can be judged to inhibit the hypertrophy of cardiomyocytes caused by deubiquitin ⁇ .
  • SLIM1, USP, and genes encoding each of these are not limited to those represented by each of the sequences exemplified above, and as long as they have a generally known function, one to several genes in each of the sequences exemplified above. Proteins and genes having these mutations can be used. In addition, for the desired purpose of promoting or deleting these functions, mutants having 1 to several mutations introduced into each of the above sequences can be used.
  • SLIM1 and USP may be cells or biological samples prepared by genetic engineering techniques, or may be cell-free synthetic products or chemical synthetic products, or these products may be further purified. It may be.
  • cells in which SLIM1 and USP are expressed by genetic engineering techniques can be used.
  • Such cells can also be used in which ubiquitin is expressed by genetic engineering techniques.
  • SLIM1, USP and ubiquitin have different proteins and polypeptides on the N-terminal side and C-terminal side, such as His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-, as long as their properties and functions are not affected.
  • Tag peptides such as tag or Xpress-tag, immunoglobulin Fc fragments such as GST, ⁇ -galactosidase, IgG, etc., directly or indirectly through linker peptides, etc., using genetic engineering techniques, etc. It may be added.
  • Properties and functions of SLIM1, USP and ubiquitin include SLIM1 and ubiquitin binding, USP and SLIM1 binding, USP and ubiquitination, SLIM 1 binding, USP cysteine protease activity, and ubiquitination SLIM 1 deubiquitination by USP Can be illustrated.
  • SLIM1, USP, and the genes encoding them are known per se from, for example, appropriate sources in which the expression of each gene is observed (for example, tissues such as heart and skeletal muscle and cells derived from these tissues). It can be easily obtained using a cloning method or the like. Proteins encoded by these genes can be obtained, for example, by a known genetic engineering technique using the respective genes. For example, ubiquitinated SLIM1 can be prepared as an immunoprecipitate obtained from a cell lysate of cells expressing ubiquitinated SLIM1 using an anti-SLIM1 antibody or the like.
  • Expression of ubiquitin SLIM1 can be carried out by introducing a recombinant vector containing a gene encoding ubiquitin and a recombinant vector containing a gene encoding SLIM1 into cells by a method known per se.
  • ubiquitinated SLIM1 is synthesized in the cell by the ubiquitination mechanism existing in the cell.
  • HEK293 cells can be exemplified as cells having a ubiquitination mechanism.
  • proteasomes can also be prepared for cellular forces with proteasomes.
  • Preferred examples of cells include human erythrocytes.
  • the proteanome can be prepared according to the method of Emma Rich et al. (“The Journal of Biologic al Chemistry”, 2000, Vol. 275, p. 21140-21148).
  • commercially available proteasomes can be used. For example, you can add a proteasome from St. Affiniti Research Products Ltd. (UK).
  • test compound examples include a chemical library, a compound derived from a natural product, or a compound obtained by drug design based on the primary structure or three-dimensional structure of SLIM1 and USP.
  • a compound obtained by drug design based on the structure of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the binding site of USP and SLIM1 is also suitable as a test compound.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for inhibiting SLIM1, which comprises using a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • one embodiment of the present invention relates to a method for inhibiting cardiomyocyte hypertrophy, which comprises using a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • a method for preventing and / or treating hypertrophic cardiomyopathy characterized by using a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • a compound that inhibits the deubiquitination activity of USP a compound that inhibits deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitinated SLIM1, a compound that inhibits the binding of USP and SLIMl, and the binding of USP and ubiquitin ⁇ SLIM 1 can be used. These compounds can be obtained by the compound identification method according to the present invention.
  • Ubiquitination SLIM1 is a compound that inhibits USP deubiquitination, a compound that inhibits the binding of USP and SLI M 1, and a compound that inhibits the binding of USP and ubiquitinated SLIM 1, Inhibits deubiquitin 1 by USP of SLIM 1
  • SLIM1 degradation is regulated by ubiquitination of SLIM1 and deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 by USP, and the action of SLIM1 is inhibited by regulation of the degradation I found a possibility. That is, there is a proteasome-dependent SLIM1 degradation control mechanism through SLIM1 ubiquitination and ubiquitination SLIM 1 deubiquitination, and this mechanism may regulate the amount of SLIM1 in the cell and the action of SLIM1 I found. Specifically, ubiquitination of SLIM1 generates ubiquitination SLIM1, and the amount of ubiquitination SLIM1 increases.
  • the ubiquitin SLIM1 is recognized by the proteasome and degraded in a proteasome-dependent manner. This series of proteasome-dependent SLIM1 degradation mechanisms can be thought to reduce SLI Ml levels.
  • ubiquitinated SLIM1 is deubiquitinated by USP
  • ubiquitin is dissociated from ubiquitinated SLIM1 and the amount of ubiquitinated SLIM1 decreases. As the amount of ubiquitinated SLIM1 decreases, the proteasome-dependent degradation of SLIM1 decreases, so it can be considered that the amount of SLIM1 increases.
  • Non-Patent Document 7 SLIM1 is thought to be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy.
  • SLIM1 mRNA levels increased in the heart of patients with hypertrophic cardiomyopathy compared to that of healthy individuals, and SLIM1 in hypertrophic cardiomyopathy model mice compared to control mice. It has been reported that the amount of mRNA increases! /, (non-patent literature 10-12).
  • a method of inhibiting cardiomyocyte hypertrophy can be carried out using a compound that inhibits the deubiquitination activity of USP.
  • a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP can be used to prevent and / or treat hypertrophic cardiomyopathy.
  • One embodiment of the present invention relates to an inhibitor of SLIM 1, comprising a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • “Inhibitor” means a compound having an inhibitory effect.
  • the inhibitor include low molecular weight compounds and antibodies having a competitive inhibitory effect.
  • Low molecular weight compounds include peptides, peptide-like substances, polypeptides, polynucleotides, organic compounds, and inorganic compounds, and their molecular weights are preferably 10000 or less, more preferably 5000 or less, even more preferably 1000 or less, Even more preferably, it means 500 or less compounds.
  • One embodiment of the present invention also relates to an anti-cardiomyocyte hypertrophy agent comprising a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • the "anti-cardiomyocyte hypertrophy agent” means a cardiomyocyte hypertrophy inhibitor, that is, a compound that inhibits cardiomyocyte hypertrophy.
  • a cardiomyocyte hypertrophy inhibitor that is, a compound that inhibits cardiomyocyte hypertrophy.
  • one embodiment of the present invention relates to an anti-myocardial hypertrophy agent comprising a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • anti-myocardial hypertrophy means an inhibitor of myocardial hypertrophy, that is, a compound that inhibits myocardial hypertrophy.
  • one embodiment of the present invention relates to a prophylactic and Z or therapeutic agent for hypertrophic cardiomyopathy, comprising a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP.
  • a compound that inhibits the deubiquitination activity of USP a compound that inhibits deubiquitin ⁇ ⁇ ⁇ by USP of ubiquitinated SLIM1, a compound that inhibits the binding of USP and SLIM1, and the binding of USP and ubiquitin ⁇ SLIM 1 can be used. These compounds can be obtained by the compound identification method according to the present invention.
  • the compound that inhibits the deubiquitination of USP by ubiquitination SLIM1, the compound that inhibits the binding of USP and SLI M 1, and the compound that inhibits the binding of USP and ubiquitination SLIM 1, are all ubiquitinated. Inhibits deubiquitin 1 by USP of SLIM 1
  • SLIM1 degradation is regulated by ubiquitination of SLIM1 and deubiquitination of SLIM1 by USP, and SLIM1 action is inhibited by regulation of the degradation.
  • SLIM1 action is inhibited by regulation of the degradation.
  • ubiquitination of SLIM1 generates ubiquitination SLIM1, and the amount of ubiquitination SLIM1 increases.
  • the ubiquitin SLIM1 is recognized by the proteasome and degraded in a proteasome-dependent manner. This series of proteasome-dependent SLIM1 degradation mechanisms can be thought to reduce SLI Ml levels.
  • ubiquitinated SLIM1 is deubiquitinated by USP
  • ubiquitin is dissociated from ubiquitinated SLIM1 and the amount of ubiquitinated SLIM1 decreases. As the amount of ubiquitinated SLIM1 decreases, the proteasome-dependent degradation of SLIM1 decreases, so it can be considered that the amount of SLIM1 increases.
  • a compound that inhibits deubiquitin ⁇ by USP of ubiquitin ⁇ SLIMl can promote proteasome-dependent ubiquitination of SLIM1, and the amount of intracellular SLIM1 decreases by promoting the degradation.
  • the action of SLIM 1 can be reduced or eliminated.
  • a compound that inhibits the deubiquitination activity of USP can be used as an active ingredient of an inhibitor of SLIM1.
  • SLIM1 is thought to be involved in the development and development of hypertrophic cardiomyopathy (Non-patent Document 7)
  • SLIM1 mRNA levels increased in the heart of patients with hypertrophic cardiomyopathy compared to that of healthy individuals, and SLIMl in hypertrophic cardiomyopathy model mice compared to control mice. It has been reported that the amount of mRNA increases! /, (non-patent literature 10-12).
  • compounds that inhibit USP deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 can promote the degradation of SLIM1 and reduce SLIM1 levels, resulting in inhibition of cardiomyocyte hypertrophy. It can be considered to be effective in preventing and / or treating hypertrophic cardiomyopathy.
  • a compound that inhibits the deubiquitination activity of USP can be used as an active ingredient of an anti-cardiomyocyte hypertrophy agent.
  • a compound that inhibits the deubiquitin activity of USP can be used as an active ingredient for the prevention and Z or treatment of hypertrophic cardiomyopathy.
  • a compound that inhibits the binding between USP and ubiquitin SLIM 1 can be used.
  • Ubiquitination Examples of compounds that inhibit the deubiquitination of SLIM1 by USP include compounds that can reduce USP cysteine protease activity. With such compounds Examples thereof include cysteine protease inhibitors.
  • the cysteine protease inhibitor is preferably an inhibitor that specifically inhibits the cysteine protease activity of USP. More preferably, it is an inhibitor that specifically inhibits the cysteine protease activity of USP15, USP21, USP20, USP22, and USP33. More preferably, the inhibitor specifically inhibits USP15 or USP21 cysteine protease activity.
  • Specifically inhibiting USP cysteine protease activity means strongly inhibiting USP cysteine protease activity but not or weakly inhibiting the enzyme activity of other enzymes.
  • Examples of compounds that inhibit the deubiquitination of SLIM1 by USP include compounds that inhibit the binding of USP and SLIM1.
  • the compound that inhibits the binding between USP and SLIM 1 is preferably a compound that specifically inhibits the binding, and more preferably a low molecular weight compound that specifically inhibits the binding. Inhibiting the binding of USP and SLIM1 specifically means that the binding is strongly inhibited but the binding between other proteins is not inhibited.
  • Examples of a compound that inhibits deubiquitination of USP and ubiquitinated SLIM1 by USP of ubiquitinated SLIM1 can be exemplified.
  • Examples of the compound that inhibits the binding between USP and ubiquitin SLIM1 are preferably compounds that specifically inhibit the binding, and more preferably low molecular weight compounds that specifically inhibit the binding.
  • Specifically inhibiting the binding of USP and ubiquitinated SLIM1 means that the binding is strongly inhibited, but the binding between other proteins is not inhibited or is weakly inhibited.
  • Inactive mutants of USP can be exemplified as compounds that inhibit the binding of USP and SLIM1.
  • an inactive mutant having a binding ability to SLIM 1 can be exemplified.
  • Such inactive mutants can inhibit the action of USP on SLIM1 by antagonizing wild-type USP and binding to SLIM1.
  • Such inactive mutants can be identified by carrying out a method for identifying compounds that inhibit the binding of USP and SLIM1.
  • Inactive mutants of USP can be exemplified as compounds that inhibit the binding of USP to ubiquitinated SLIM1. Binding to ubiquitinated SLIM1 as a preferred inactive mutant An inactive mutant having an ability can be exemplified. Such inactive mutants can inhibit the action of USP on ubiquitinated SLIM 1 by binding to ubiquitinated SLIM 1 in competition with wild-type USP. Such inactive mutants can be identified by carrying out a method for identifying a compound that inhibits the binding of USP and ubiquitinated SLIM1.
  • USP15 inactive mutants in which the 269th cysteine in USP15 was replaced with alanine, and USP21 in which the 221nd cysteine in USP21 was replaced with an alanine were used as inactive mutants of USP.
  • Inactive mutants can be preferably exemplified.
  • the 269th cysteine of USP15 and the 221nd cysteine of USP21 are the cysteine protease active sites of USP15 and USP21, respectively, and are essential amino acid residues for cysteine protease activity.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the site where USP and SLIM1 bind, and a polypeptide which also has the amino acid sequence of the site where USP and ubiquitinated SLIM1 bind must competitively inhibit binding between proteins. Can do.
  • Such a polypeptide is designed from the amino acid sequence of USP or SLIM1, and is selected from those synthesized by a peptide synthesis method known per se, and those that inhibit the binding of USP and SLIM1 or USP and ubiquitinated SLIM1. Can be obtained.
  • a polypeptide in which mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids are introduced into the thus identified polypeptide is also included in the scope of the present invention.
  • a polypeptide into which such a mutation has been introduced preferably inhibits the binding between USP and SLIM1, or the binding between USP and ubiquitinated SLIM1.
  • Polypeptides having mutations may be naturally occurring or artificially introduced with mutations. Means for introducing such mutations are known per se, for example, using Ulmer's technology (Ulmer KM, Science, 1983, No. 219, p. 666-671). it can.
  • the polypeptide From the standpoint of not changing the basic properties (physical properties, functions, immunological activity, etc.) of tide, for example, homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positive charges) Mutual substitution between amino acids, negatively charged amino acids and aromatic amino acids etc. is easily envisaged. Furthermore, these usable polypeptides can be modified to such an extent that the structural amino group or carboxyl group or the like is not significantly changed in function, for example, by amidation modification.
  • polypeptide can be produced by a general method known in peptide chemistry.
  • a desired polypeptide can be produced using a commercially available amino acid synthesizer.
  • a desired polypeptide can be obtained by genetic engineering techniques. For example, a recombinant expression vector capable of expressing a gene encoding the desired polypeptide in a host cell is prepared, and this is transformed into an appropriate host cell, for example, E. coli, and then transformed. It can be produced by culturing and recovering the desired polypeptide from the culture obtained next.
  • an antibody that recognizes USP or SLIM1 and inhibits the binding between USP and SLIM1 can be exemplified.
  • Such an antibody can be obtained by a known antibody production method using USP or SLIM1 itself, or a fragment of these proteins, preferably a polypeptide having an amino acid sequence at the site where USP and SLIM1 bind as antigens.
  • an antibody that recognizes USP or ubiquitinated SLIM1 and inhibits the binding between USP and ubiquitinated SLIM1 can be exemplified.
  • Such an antibody can be obtained by known antibody production methods using USP or ubiquitinated SLIM1 itself, or a fragment of these proteins, preferably a polypeptide comprising an amino acid sequence at the site where USP and ubiquitin bind to each other as an antigen.
  • Examples of compounds that inhibit the binding between USP and SLIM1 include compounds that inhibit the expression of USP.
  • Examples of compounds that inhibit the binding of USP and ubiquitination SLIM1 include compounds that inhibit the expression of USP.
  • USP gene antisense oligonucleotides can be exemplified as compounds that inhibit USP expression.
  • examples of such compounds include siRNA (small interfering RNA) that can reduce or eliminate USP expression by RNA interference techniques.
  • the compound and the inhibitor can be prepared as a pharmaceutical composition by selecting in consideration of the balance between biological usefulness and toxicity. In preparing a pharmaceutical composition, these compounds and inhibitors can be used alone or in combination. The above compounds and the above inhibitors and pharmaceutical compositions can be used for prevention and Z or treatment of hypertrophic cardiomyopathy.
  • the compound and the inhibitor when prepared as a pharmaceutical composition, the compound and the inhibitor can be produced as a medicament containing an effective amount of at least one of the compound and the inhibitor as an active ingredient. Usually, it is preferably produced as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutical carriers in addition to the active ingredient.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation according to the present invention is appropriately selected from a wide range. Usually, it is appropriate that the amount is in the range of about 0.0001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight.
  • the pharmaceutical carrier includes a filler, a bulking agent, a binder, a moistening agent, a disintegrant, a lubricant, a diluent, an excipient and the like that are generally used according to the form of use of the preparation. It can be illustrated. These are appropriately selected and used depending on the dosage form of the resulting preparation.
  • water pharmaceutically acceptable organic solvent
  • collagen polyvinyl alcohol, polybutylpyrrolidone
  • carboxyvinyl polymer sodium alginate
  • water-soluble dextran sodium carboxymethyl starch
  • pectin examples include xanthan gum, gum arabic gum, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and ratatose.
  • these are the components of the pharmaceutical composition Depending on the dosage form, one or a combination of two or more may be used.
  • Examples of the stabilizer include human serum albumin, ordinary L amino acids, saccharides, and cellulose derivatives. These can be used alone or in combination with a surfactant or the like. In particular, this combination may further improve the stability of the active ingredient.
  • the L-amino acid is not particularly limited, and may be any of glycine, cysteine, glutamic acid and the like.
  • Sugars are not particularly limited, for example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol, sucrose and maltose.
  • Disaccharides such as lactose, polysaccharides such as dextran, hydroxypropyl starch, chondroitin sulfate and hyaluronic acid, and derivatives thereof.
  • Cellulose derivatives are not particularly limited, such as methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropenoresenorelose, hydroxypropinoremethinoresenorelose, sodium canoleboxymethylcellulose, and so on.
  • surfactant any of an ionic surfactant and a nonionic surfactant can be used.
  • Surfactants include, for example, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether, sorbitan monoacyl ester, and fatty acid glyceride.
  • Buffering agents include boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citrate, ⁇ -aminocaproic acid, glutamic acid and sputum or salts thereof (for example, sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts thereof) Examples thereof include alkali metal salts and alkaline earth metal salts.
  • Examples of the isotonic agent include sodium chloride sodium, potassium salt potassium, saccharides, glycerin and the like.
  • Examples of the chelating agent include sodium edetate and citrate.
  • the medicine and pharmaceutical composition according to the present invention can be used as a solution preparation, and after freezing, drying and storing it, it contains water, physiological saline and the like at the time of use. It can be used after being dissolved in a buffer solution or the like to prepare an appropriate concentration.
  • the dose range of the medicine and the pharmaceutical composition is not particularly limited, the effectiveness of the contained ingredients, The dosage form, route of administration, type of disease, nature of the subject (weight, age, medical condition, use of other medicines, etc.), and judgment of the doctor in charge are appropriately selected.
  • a suitable dose is, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to lOOmg, preferably about 0.0: Lg to lmg, per kg body weight of the subject.
  • these dose changes can be made using general routine experimentation for optimization well known in the art.
  • the above dose can be administered once to several times a day, or intermittently at a rate of once every several days or weeks.
  • the pharmaceutical composition may be used alone or together with other compounds or medicines necessary for the prevention and Z or treatment of the target disease. May be used. For example, other hypertrophic cardiomyopathy prevention and Z or anti-therapeutic active ingredients may be added.
  • the administration route either systemic administration or local administration can be selected.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like.
  • the parenteral route includes normal intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous, intradermal, intramuscular administration and the like.
  • it can be administered by the oral route.
  • transmucosal administration or transdermal administration can be performed.
  • various forms can be selected according to the purpose. Typical examples are solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules, aqueous solutions, ethanol solutions, suspensions, fat emulsions, ribosome formulations. And inclusion forms such as cyclodextrin, and liquid dosage forms such as syrup and elixir. Depending on the route of administration, these preparations can also be administered orally, parenterally (infusions, injections), nasal preparations, inhalants, vaginal preparations, suppositories, sublingual, eye drops, ear drops, ointments, creams. And can be prepared, molded and prepared according to ordinary methods.
  • one embodiment of the present invention relates to a reagent kit.
  • This reagent kit encodes at least one of USP, a gene encoding the USP, a recombinant vector containing the gene, and a transformant obtained by introducing the vector, and SLIM1 and SLIM1.
  • the reagent kit may contain at least one of a gene, a recombinant vector containing the gene, and a transformant obtained by introducing the vector.
  • SLIM1 It includes at least one of an enzyme necessary for biquitination, a gene encoding the enzyme, a vector containing the gene, and a transformant containing the vector.
  • the reagent kit comprises at least one of SLIM1, a gene encoding SLIM 1, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the recombinant vector, ubiquitin and ubiquitin. It can be a reagent kit comprising at least one of a coding gene, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the recombinant vector and a proteanome. This reagent kit can be used, for example, in the method for identifying a compound according to the present invention.
  • USP, SLIM1, and ubiquitin can be obtained by the production method described above.
  • Each gene, recombinant vector, and transformant can be prepared by the above-described genetic engineering technique.
  • the proteasome can be prepared by the production method described above, and a commercially available proteasome can be used.
  • This reagent kit can contain required substances such as signals and Z or markers, buffers, and salts used in the identification method. Furthermore, it may contain substances such as stabilizers and Z or preservatives. In formulating, it is only necessary to introduce formulating means suitable for each substance to be used.
  • a protein having a function of interacting with USP15 was predicted according to the prediction method described in Patent Document 1. That is, the amino acid sequence of USP15 is divided into oligopeptides of a certain length, proteins having the amino acid sequence of each oligopeptide or an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence are searched in a database, and the obtained protein and We conducted a direct alignment with USP15 and predicted that local alignment scores would interact with USP15.
  • SLI Ml was found as a protein predicted to have a function of interacting with USP 15 (FIG. 1).
  • SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence of SLIM1 (SEQ ID NO: 2), the oligopeptide derived from the amino acid sequence of USP15 (SEQ ID NO: 4), MGDQNV (SEQ ID NO: 15), CPECAK (SEQ ID NO: 17) and TASEDQ (SEQ ID NO: 19), homologous to each other, AGDQNV (SEQ ID NO: 16), CPDCAK (SEQ ID NO: 18), and TAVEDQ (SEQ ID NO: 20) It was strong (Figure 1).
  • clone KIAA0529 obtained from Kazusa DNA Research Institute was used.
  • a human SLIM1 cDNA GeneStorm, Invitrogen clone RG000895 was used.
  • His-USP15 N-terminal 6 X His fusion USP15 (hereinafter referred to as His-USP15) expression plasmid for E. coli was prepared by incorporating USP15 cDNA into a pDEST vector (Invitrogen).
  • a C-terminal V5-His fusion USP15 (hereinafter referred to as USP15-V5-His) expression plasmid for animal cells was prepared by incorporating USP15 cDNA into a pcDNA4ZV5-His vector (Invitrogen).
  • An N-terminal His-Xpress fusion SLIM1 (hereinafter referred to as His-Xpress-SLIMl) expression plasmid for animal cells was prepared by incorporating SLIM1 cDNA into a pcDNA3.1 / His vector (Invitrogen).
  • His-USP15 used was induced by expression in E. coli transfected with an N-terminal 6 X His fusion USP15 expression plasmid for E. coli and then purified using TALON Metal Affinity Resin.
  • GST-SLIM 1 and GST were used after inducing expression in Escherichia coli transformed with these expression plasmids and then purifying them using dartathione sepharose (Amersham). Dot blot GST or GST—USP15 on nitrocellulose membrane and air dry Then, it was immersed in 5 g of His-USP15 solution and reacted overnight by shaking at 4 ° C.
  • GST or GST-USP15 was dot-blotted using a binding buffer (Tris-buffered saline containing Tween20; hereinafter abbreviated as TBST). Processed. The next day, the nitrocellulose membrane was washed and blocked, and then the protein was detected using an anti-His antibody (manufactured by Amersham) and an anti-mouse IgG antibody labeled with HRP.
  • TBST Tris-buffered saline containing Tween20
  • Intracellular binding test Intracellular co-expression / immunoprecipitation method
  • HEK293T cells were transfected with 5 ⁇ g of His—Xpress-SLIMl expression plasmid and 5 ⁇ g of USP15—V5—His expression plasmid using Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen).
  • Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000, Invitrogen
  • cells transfected with only 5 g of His-Xpress-SLIM1 expression plasmid were prepared.
  • the DNA was adjusted with pcDNA3.1 / His vector so that the total amount of DNA was ⁇ / z g. After culturing for 48 hours, the cells were collected in a 15 ml centrifuge tube with a cell scraper, and then centrifuged at lOOOrpm for 5 minutes to remove the supernatant.
  • the cells were washed with 3 ml of phosphate buffered saline (hereinafter abbreviated as PBS) and then centrifuged at lOOOrpm for 5 minutes to collect the cells.
  • PBS phosphate buffered saline
  • IX cell lysis buffer Cell Lysis Buffer ⁇ Cell Signaling
  • the signal detected by the anti-His antibody is a signal indicating that GST-SLIM1 and His-USP15 are bound. From these results, it was found that SLIM1 and USP15 bind in vitro.
  • the amount of His-Xpress-SLIMl in the cell lysate used was almost the same for cells expressing only His-Xpress-SLIM1, and cells co-expressing His-Xpress-SLIM 1 and USP 15-V5-His. It was equivalent (bottom panel in Figure 3).
  • transient expression of USP15-V5-His in cells co-expressed with His-Xpress-SLIM1 and USP15-V5-His was confirmed by Western blotting using anti-V5 antibody (Fig. 3 middle panel).
  • SLIM1 ubiquitin was examined in an intracellular test using an intracellular co-expression system.
  • FLAG-Ub N-terminal FLAG-fused ubiquitin expression plasmid
  • HEK293 cells were transfected with 3 ⁇ g of His-Xpress-SLIM1 expression plasmid and 3 ⁇ g of FLAG-Ub expression plasmid using Fugene 6 (FuGene6, Roche).
  • Fugene 6 Fugene 6, Roche
  • cells transfected with only 3 g of His-Xpress-SLIM1 expression plasmid or 3 g of FLAG-Ub expression plasmid were prepared.
  • the total amount of DNA was adjusted with pcDNA3.1 vector or pcDN A3.lZHis vector.
  • the medium was replaced with a medium containing 20 ⁇ of MG-132 (Calbiochem), a proteasome inhibitor, and further cultured for 48 hours.
  • the cells were collected and washed with a cell scraper, 0.4 ml of IX cell lysis buffer was added to the cells, mixed by pipetting, and incubated for 20 minutes in ice. After transfer to a microtube, the insoluble fraction was removed by centrifugation at 15000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was used as cell lysate. Add 10 1 of 5 XS DS sample buffer to 40 ⁇ 1 of each cell lysate, boil and cool on ice, develop on SDS-PAGE (5-20% Gradient Gel), and perform Western blotting using anti-Xpress antibody. And SLIM1 was detected.
  • Protein G Sepharose 151 was added to each cell lysate 3001, mixed by inverting at 4 ° C for 1 hour, and then centrifuged to collect the supernatant. Next, 3 ⁇ g of Omni Probe antibody was added and mixed by inversion at 4 ° C, and then protein G Sepharose 151 was added and mixed again at 4 ° C for 1 hour. The resin is collected by centrifugation, washed 3 times with 1 X cell lysis buffer 500 ⁇ l, and then 20 x 2 X SDS sample buffer, boiled and ice-cooled, then SDS-PAGE (5-20 % Gradient Gel) and western blotting using anti-FLAG antibody (Sigma) SLIM 1 was detected.
  • the amount of His—Xpress-SLIM 1 in the cell lysate used is approximately the same in cells expressing only His—Xpress-SLIM 1 and cells co-expressing His—Xpress—SLIM1 and FLAG—Ub. (Lower panel in Figure 4).
  • LacZ-V5-His A C-terminal V5-His fusion LacZ (hereinafter abbreviated as LacZ-V5-His) expression plasmid was prepared by incorporating LacZ cDNA into the pcDNA4 / V5-His vector.
  • the His-Xpress-SLIM1 expression plasmid was prepared in the same manner as described in Example 2.
  • HEK293 cells were transfected with 0.5-g His-Xpress-SLIM1 expression plasmid and LacZ-V5-His expression plasmid using FuGene6. 48 hours incubation Thereafter, the medium was replaced with a medium containing 20 ⁇ of MG-132 (Calbiochem), a proteasome inhibitor, and further cultured overnight, and then the cells were collected.
  • MG-132 Calbiochem
  • DMSO was added to the medium in an amount equal to the amount of dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSMS) in the medium containing MG-132.
  • DMSMS dimethyl sulfoxide
  • the protein amount of each cell lysate was quantified by, 1 X cells as protein concentration of each cell lysate is 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 Dilute with lysis buffer. Add 10 x 1 5 X SDS sample buffer to each cell lysate, boil, cool on ice, and develop on SDS-PAGE (5-20% Gradient Gel). Omni Probe antibody and anti-V5 antibody Using Western blotting, SLIM1 and LacZ were detected.
  • proteasome inhibitors increase intracellular SLIM1 levels.
  • SLIM1 is degraded in a proteasome-dependent manner. That is, it can be considered that the proteasome inhibitor inhibited the proteolytic function of proteanome, and as a result, the proteasome-dependent degradation of SLIM1 was inhibited, and the amount of intracellular SLIM1 increased.
  • a USP15 inactive mutant expression plasmid was prepared.
  • a USP15 inactive mutant a mutant in which the 269th cysteine, which was suggested to be essential for protease activity of USP15, was substituted with alanine (hereinafter abbreviated as USP15 (C269A)) was used.
  • the C-terminal V5-His fusion USP15 (C269A) (hereinafter abbreviated as USP15 (C269A) -V5-His) expression plasmid is a codon that codes for the 269th cysteine in the amino acid sequence of USP15.
  • USP15 (C269A) -V5-His) expression plasmid is a codon that codes for the 269th cysteine in the amino acid sequence of USP15.
  • His-Xpress-SLIM1 expression plasmid The His-Xpress-SLIM1 expression plasmid, the FLAG-Ub expression plasmid, and the USP1 5-V5-His expression plasmid were prepared in the same manner as described in Example 2 or 3.
  • HEK293T cells can be combined with His— Xpress—SLIM1 expression plasmid 3 g, FLAG—Ub expression plasmid 3 g, USP15—V5—His 3 g, and USP15 (C269A) —V5—His 3 ⁇ g in various combinations.
  • Transfection using At this time the DNA was adjusted with pcDNA3.1 vector or pcDNA4 / V5 His vector so that the total amount of DNA was 9; zg.
  • the medium was replaced with a medium containing 20 ⁇ of MG-132 (Calbiochem), a proteasome inhibitor, and the cells were collected after further culturing for 48 hours.
  • Each cell lysate (300 ⁇ l) was supplemented with Protein G Sepharose 301, mixed by inverting at 4 ° C. for 1 hour, and centrifuged to collect the supernatant. To this was added 3 ⁇ g of Omni Probe antibody, and mixed by inversion at 4 ° C. Then, protein G Sepharose 30 1 was added and mixed again at 4 ° C for 1 hour.
  • the resin is recovered by centrifugation, washed 3 times with 1 X cell lysis buffer (500 ⁇ 1), added with 2 ⁇ SDS sample buffer (20 ⁇ 1), boiled, ice-cooled, and then SDS-PAGE (5-20% (Gradient Gel) and Western blotting was performed using an anti-FLAG antibody (manufactured by Sigma) to detect ubiquitinated SLIM1.
  • the ladder-like band detected in the polymer region shows the SLIM1 that is polyubiquitinated (see Example 3). Since the expression of USP15 significantly reduced the band in such a high molecular region, USP 15 is thought to reduce the amount of ubiquitinated SLIM 1. In addition, when USP15 (C269A), an inactive mutant of USP15, was expressed instead of USP15, there was almost no decrease in the band in the high molecular region, indicating that ubiquitin caused by USP15 SLIM 1 The reduction in amount was found to be dependent on the deubiquitin activity of USP 15.
  • His-Xpress-SLIMl expression plasmid, USP15-V5-His expression plasmid, and USP15 (C269A) -V5-His expression plasmid were prepared in the same manner as described in Example 2 or Example 5.
  • HEK293 cells were transferred to USP15—V5—His expression plasmid 2 g or USP15 (C26 9A)
  • a control cells transfected with only a His-Xp ress-SLIMl expression plasmid were prepared. At this time, the total amount of DNA was adjusted to 2.5 i ug with a pcDNA4 / V5-His vector.
  • HA-USP21 N-terminal HA-fused USP21 (hereinafter abbreviated as HA-USP21) expression plasmid was constructed by inserting cDNA with the HA-tag coding sequence inserted 5 'to the USP 21 cDNA into a pCI vector (Clontec h). did.
  • an expression plasmid of USP21 inactive mutant was prepared.
  • a USP21 inactive mutant a mutant in which the 221st cysteine, which was suggested to be essential for protease activity of USP21, was substituted with alanine (hereinafter abbreviated as USP21 (C221A)) was used.
  • an N-terminal HA fusion USP21 (C221A) (hereinafter abbreviated as HA—USP21 (C221A)) expression plasmid encodes alanine, a codon encoding the 221nd cysteine in the amino acid sequence of USP21. It was prepared by incorporating the cDNA substituted for the codon into a pCI vector (Clontech). The His—Xpres s—SLIM1 expression plasmid was prepared in the same manner as described in Example 2.
  • HEK293 cells were transfected with HA-USP21 expression plasmid or HA-USP21 (C221A) expression plasmid and His-Xpress-SLIMl expression plasmid. As a control, only the His-Xpress-SLIM1 expression plasmid was transfected. Cells were created. After recovering the cells after 48 hours of culture, cell lysates were prepared in the same manner as described in Example 6, and IX cell lysis was performed so that the protein concentration of each cell lysate was 1.5 gZ1. Dilute with buffer.
  • Each cell lysate was developed on SDS-PAGE in the same manner as described in Example 6, and Western blotting was performed using anti-Xpress antibody, and the amount of SLIM1 was reduced by co-expression with USP21 or USP21 (C221A).
  • expression of HA-USP21 or HA-USP21 (C221A) was confirmed by Western blotting using an anti-HA antibody.
  • Western blotting was performed using an anti-GAPDH antibody, and the endogenous protein GAPDH was detected to confirm whether the protein amount of each cell lysate used in this experiment was constant.
  • Cellular lysates prepared from cells co-expressing His-Xpress-SLIM 1 and HA—USP21 have a His-Xpress-SLIMl content as compared to cells prepared from cells expressing only His-Xpress-SLIM1. A significant increase was observed ( Figure 8). In contrast, in the cell lysate prepared from cells co-expressed with His-Xpress-SLIM1 and HA-USP21 (C221A), the increase in the amount of His-Xpress-SLIM1 was low.
  • each lysate prepared with cells expressing only His-Xpress-SLIM1 and cell force co-expressing His-Xpress-SLIM1 and HA-USP21 or HA-USP21 (C221A).
  • the amount of the endogenous protein GAPDH detected by Western blotting using an anti-GAPDH antibody was almost the same. From this, it was confirmed that the protein amount of each cell lysate used in this experiment was constant.
  • USP20, USP22, and USP33 The ability of USP20, USP22, and USP33 to inhibit SLIM1 ubiquitinated SLIM1 proteasome-dependent degradation was examined. This study reveals the potential for SLIM1 stabilization by USP20, USP22, or USP33. Specifically, the effects of transient overexpression of these USPs on the amount of SLIM 1 in the cells were examined using an intracellular test using an intracellular co-expression system as shown below. .
  • N-terminal FLAG fusion USP20 (hereinafter abbreviated as FLAG—USP20) expression plasmid
  • N-terminal FLAG fusion USP22 (hereinafter abbreviated as FLAG—USP22) expression plasmid
  • N-terminal FLAG fusion USP33 (hereinafter, FLAG—USP33) (Abbreviated as) expression plasmids were prepared by incorporating cDNAs with a FLAG-tag coding sequence inserted into the 5 ′ end of human USP20, 22, 23, and 33 cDNAs into a pCI vector (Clontech).
  • the His Xpress-SLIM1 expression plasmid was prepared in the same manner as described in Example 2.
  • HEK293 cells were transfected with any one of the FLAG—USP20 expression plasmid, FLAG—USP22 expression plasmid, and FLAG—USP33 expression plasmid and the His-Xpress—SLI Ml expression plasmid.
  • cells transfected with only His-Xpress-S LIM1 expression plasmid were prepared.
  • cell lysates were prepared in the same manner as described in Example 6, and IX cell lysis was performed so that the protein concentration of each cell lysate was 1.5 gZ1. Dilute with buffer.
  • Each cell lysate was developed on SDS-PAGE in the same manner as described in Example 6, and Western blotting was performed using an anti-Xpress antibody.
  • the His-Xpress-SLIM1 expression plasmid was prepared in the same manner as described in Example 2.
  • the HA-USP21 expression plasmid was prepared in the same manner as described in Example 7.
  • HEK293T cells were transfected with His-Xpress-SLIM1 expression plasmid and HA-USP21 expression plasmid.
  • As a control cells transfected with only the His-Xpress-SLIM 1 expression plasmid were prepared. At this time, it was adjusted with an empty vector so that the total amount of DNA was constant. After culturing for 48 hours, the cells were collected in a 15 ml centrifuge tube with a cell scraper, and then centrifuged at lOOOrpm for 5 minutes to remove the supernatant. After washing the cells with 3 ml of PBS, the cells were collected by centrifugation at lOOOrpm for 5 minutes.
  • IX cell lysis buffer manufactured by Cell Signaling
  • 0.4 ml of IX cell lysis buffer manufactured by Cell Signaling
  • the insoluble fraction was removed by centrifugation at 15000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was used as a cell lysate.
  • each protein was confirmed by Western blotting using Probe antibody or anti-HA antibody (Y-11).
  • 30 ⁇ l of agarose (50% slurry, prepared with cell lysis buffer) conjugated with anti-antibody antibody ( ⁇ -11) to each cell lysate (300 ⁇ 1) at 4 ° C overnight. After mixing by inversion, the resin was collected by centrifugation and washed 3 times with 500 ⁇ l of cell lysis buffer.
  • NA! / ⁇ The binding between USP21 and SLIM1 was detected by detecting His- Xpress- SLIM1 that co-precipitated by binding to HA-USP21.
  • the His-Xpress-SLIM1 expression plasmid was prepared in the same manner as described in Example 2.
  • the FLAG-USP20 expression plasmid, FLAG-USP22 expression plasmid, and FLAG-USP33 expression plasmid were prepared in the same manner as described in Example 8.
  • HEK293T cells were transfected with one of the FLAG—USP20 expression plasmid, FLAG—USP22 expression plasmid, and FLAG—USP33 expression plasmid and the His-Xpress-S LIM1 expression plasmid.
  • As a control cells transfected with only the His-Xpress SLIM1 expression plasmid were prepared. At this time, it was adjusted with an empty vector so that the total amount of DNA was constant.
  • cell lysates were prepared in the same manner as described in Example 9. Each cell lysate was developed on SDS-PAGE, and the expression of each protein was confirmed by Western blotting using anti-Omni Probe antibody or anti-FLAG antibody (M2).
  • each cell lysate (300 1) contains protein G sepharose (1% ushi serum albumin Z tris).
  • 30 ⁇ l of 50% slurry prepared by blocking with buffered saline (BSAZTBS) and cell lysis buffer was added, and the mixture was mixed by inverting at 4 ° C overnight, and the supernatant was collected by centrifugation.
  • 3 ⁇ g of anti-FLAG antibody (M2) was added and mixed by inversion at 4 ° C.
  • 30 ⁇ l of Protein G Sepharose (50% slurry blocked with 1% BSAZTBS and prepared with cell lysis buffer) was added, and the mixture was mixed by inverting at 4 ° C overnight.
  • Resin is collected by centrifugation, washed 3 times with 500 ⁇ l of cell lysis buffer, added with 20 ⁇ 1 of 2 X SDS sample buffer, boiled and ice-cooled, then SDS-PAGE (5-20% Gr adient Gel) and Western blotting using Omni Probe antibody V, and binding of each USP to SLIM1 by detecting His—Xpress—SLIM 1 that binds and co-precipitates to each FLAG—USP Was detected.
  • the present invention it is possible to provide a method for identifying a compound that inhibits ubiquitin ⁇ of SLIMl by USP (for example, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33).
  • USP for example, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33.
  • degradation of ubiquitinated SLIM1 by the pteateasome is inhibited by inhibiting deubiquitination of ubiquitinated SLIM1 by USP (eg, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33).
  • USP eg, USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33.
  • SLIM1 is thought to be involved in the onset and progression of hypertrophic cardiomyopathy.
  • USP e.g., USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33
  • USP e.g., USP15, USP20, USP21, USP22, and USP33
  • the present invention is very useful for basic research on hypertrophic cardiomyopathy and development of medicines and treatment methods for hypertrophic cardiomyopathy.
  • SEQ ID NO: 1 Human SLIM1 gene.
  • SEQ ID NO: 2 A protein that is deleted by the human SLIM1 gene (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 3 Human USP15 gene.
  • SEQ ID NO: 4 protein encoded by human USP 15 gene (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 5 rabbit USP21 gene.
  • SEQ ID NO: 6 Protein encoded by human: USP21 gene (SEQ ID NO: 5).
  • SEQ ID NO: 7 baboon USP20 gene.
  • SEQ ID NO: 8 protein encoded by: added to human USP20 gene (SEQ ID NO: 7).
  • SEQ ID NO: 9 baboon USP22 gene.
  • SEQ ID NO: 10 protein encoded by the human USP22 gene (SEQ ID NO: 9)
  • SEQ ID NO: 11 human USP33 gene.
  • SEQ ID NO: 12 protein encoded by human USP33 gene (SEQ ID NO: 11)
  • SEQ ID NO: 13 human ubiquitin gene.
  • SEQ ID NO: 14 human ubiquitin.
  • SEQ ID NO: 15 Human USP having high homology with a partial sequence of human SLIM1 (SEQ ID NO: 16) A partial sequence of 15 (SEQ ID NO: 4).
  • SEQ ID NO: 16 Partial sequence of human SLI Ml (SEQ ID NO: 2) having high homology with the partial sequence of human USP15 (SEQ ID NO: 15).
  • SEQ ID NO: 17 Partial sequence of human USP 15 (SEQ ID NO: 4) having high homology with the partial sequence of human SLIM1 (SEQ ID NO: 18).
  • SEQ ID NO: 18 Partial sequence of human SLI Ml (SEQ ID NO: 2) having high homology with the partial sequence of human USP15 (SEQ ID NO: 17).
  • SEQ ID NO: 19 Partial sequence of human USP 15 (SEQ ID NO: 4) having high homology with the partial sequence of human SLIM1 (SEQ ID NO: 20).
  • SEQ ID NO: 20 Partial sequence of human SLI Ml (SEQ ID NO: 2) having high homology with the partial sequence of human USP15 (SEQ ID NO: 19).

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Abstract

【課題】ＳＬＩＭ１の作用調節手段、並びに肥大型心筋症の防止および／または治療手段の提供する。 【解決手段】ＵＳＰ（ＵＳＰ１５、ＵＳＰ２０、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２またはＵＳＰ３３）を用いる、ユビキチン化ＳＬＩＭ１の脱ユビキチン化方法、ＳＬＩＭ１の安定化方法、心筋細胞肥大化方法；ＵＳＰによるユビキチン化ＳＬＩＭ１の脱ユビキチン化を阻害する化合物の同定方法；ＵＳＰとＳＬＩＭ１またはユビキチン化ＳＬＩＭ１との結合を阻害する化合物の同定方法；ＵＳＰによるユビキチン化ＳＬＩＭ１の脱ユビキチン化による心筋細胞肥大化を阻害する化合物の同定方法；ＵＳＰの脱ユビキチン化活性を阻害する化合物を用いる、ＳＬＩＭ１の阻害方法、心筋細胞肥大化阻害方法、肥大型心筋症の防止および／または治療方法；前記化合物を含有するＳＬＩＭ１阻害剤、抗心筋肥大化剤、肥大型心筋症の防止および／または治療剤；試薬キット。

Description

SLIM1と USPの相互作用阻害による心筋肥大の阻害方法および阻害 剤
技術分野
[0001] 本発明は、ュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin—specific protease ;以下、 USPと略称することがある）により、生体外試料または非ヒト哺乳動物において、ュビ キチン化 SLIMl (ubiquitinated skeletal muscle LIM protein 1)を脱ュビ キチン化する方法、 SLIM 1 (skeletal muscle LIM protein 1)を安定化する方 法、および心筋細胞を肥大化する方法に関する。より詳しくは、 USP15、 USP20、 USP21、USP22および USP33からなる群より選ばれるいずれ力 1を用いることを特 徴とする上記方法に関する。
[0002] また、本発明 ίま、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22および USP33力らなる群 より選ばれるいずれか 1によるュビキチン化 SLIM 1の脱ュビキチン化を阻害する化 合物の同定方法に関する。
[0003] さらに、本発明は、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22および USP33力らなる群 より選ばれる 、ずれか 1と SLIM 1の結合を阻害する化合物の同定方法に関する。
[0004] さらにまた、本発明は、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22および USP33力らな る群より選ばれるいずれか 1とュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定 方法に関する。
[0005] また、本発明 ίま、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22および USP33力らなる群 より選ばれる 、ずれか 1によるュビキチン化 SLIM 1の脱ュビキチン化による心筋細 胞の肥大化を阻害する化合物の同定方法に関する。
[0006] さらに、本発明は、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22および USP33力らなる群 より選ばれるいずれか 1の脱ュビキチン化活性を阻害する化合物を用いることを特徴 とする、 SLIM1の阻害方法、心筋細胞の肥大化阻害方法、並びに肥大型心筋症の 防止および Zまたは治療方法に関する。
[0007] さらにまた、本発明は、前記化合物を含有してなる SLIM1阻害剤、抗心筋肥大化 剤、並びに肥大型心筋症の防止および zまたは治療剤に関する。
[0008] また、本発明 ίま、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22および USP33力らなる群 より選ばれるいずれか 1の USP、該 USPをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する 組換えベクターおよび該ベクターを導入してなる形質転換体のうち少なくともいずれ 力 1つと、 SLIM1、 SLIM 1をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えべクタ 一、および該ベクターを導入してなる形質転換体のうち少なくともいずれカゝ 1つを含 む試薬キットに関する。 背景技術
[0009] SLIM 1は、 LIMドメインを有し、骨格筋や心筋に高発現する蛋白質である（非特許 文献 1— 5)。 LIMドメインは、 50— 60アミノ酸力もなる蛋白質結合モチーフであり、 転写因子や細胞骨格蛋白質と相互作用し、細胞の分化や細胞骨格の整合性の保 持に重要な働きを担っている（非特許文献 6)。 SLIM1と結合する転写因子や細胞 骨格蛋白質は報告されていないが、 SLIM1が筋芽細胞力 筋肉細胞への分化、筋 芽細胞の伸展等を調節することが報告されて!ヽる (非特許文献 7)。
[0010] SLIM1が、インテグリンを介する筋芽細胞力 筋肉細胞への分ィ匕のみならず、筋 芽細胞の伸展 (肥大）を促進し、インテグリンを介するシグナル伝達が心筋細胞の肥 大化を促進することから、 SLIM1蛋白質量の増加が肥大型心筋症の発症や進展に 関与する可能性が強く示唆されて 、る (非特許文献 7— 9)。
[0011] 肥大型心筋症は、心筋細胞の肥大化に伴う心筋症である。主に左心室で心筋細 胞の肥大化が認められる症例が多い。肥大型心筋症患者の心臓では、健常人の心 臓に比して、 SLIM1 mRNA量が増加していること、肥大型心筋症のモデルマウス（ aortic banding model)において、コントローノレマウスに比して、 SLIM1 mRNA 量が増加し、 SLIM1 mRNAレベルが心筋の肥大化と相関することが報告されてい る (非特許文献 10— 12)。
[0012] 心筋とは、横紋を有する心筋線維力 なり心臓の大部分を構成する心筋層を意味 する。心房では薄ぐ心室では厚ぐ左心室は特に厚い。心房および心室の筋はそ れぞれ独立していて、線維輪によって全く隔てられる。心房の筋層は左右心房を取り 巻いて横走する浅層と左右別々に走る縦走の深層からなる。心室の筋層は三層から なる。
[0013] ュビキチン特異プロテアーゼは、ュビキチンィ匕された蛋白質力 ュビキチン（以下、 Ubと略称することがある）が解離する脱ュビキチンィ匕反応を触媒する脱ュビキチンィ匕 酵素である。 USPとして、多くのファミリー蛋白質が知られている。 USPは、その活性 ドメインとしてシスティン（Cys)ドメイン（Cys box)、ヒスチジン（His)ドメイン（His b ox)およびァスパラギン酸 (Asp)ドメイン (Asp box)を持ち、 Cysドメイン内に存在す るシスティン残基を活性部位とするシスティンプロテアーゼである。 USPはュビキチ ンの C末端に高分子が結合している場合にュビキチンを解離させる。
[0014] ュビキチン特異プロテアーゼは、その脱ュビキチンィ匕活性により、プロテアノームに よる蛋白質分解の調節に関与している。
[0015] プロテアソームによる蛋白質分解において、まずュビキチンが標的蛋白質にイソべ プチド結合することによりポリュビキチン鎖が形成され、ュビキチンィ匕された蛋白質が 生じる。次いで、ュビキチンィ匕蛋白質のポリュビキチン鎖がプロテアノームに認識さ れることにより、ュビキチン化蛋白質は、プロテアソーム依存的な分解を受ける。一方 、生体は蛋白質力 ュビキチンを解離させ、蛋白質の分解を抑制する機能も備えて いる。ュビキチンィ匕蛋白質力も脱ュビキチンィ匕酵素によりュビキチンが解離されると、 脱ュビキチン化された蛋白質はプロテアノームに認識されないため、蛋白質分解が 抑制される。また、ュビキチンィ匕蛋白質力も解離されたュビキチンは、蛋白質のュビ キチン化に再利用される。
[0016] このように、蛋白質のュビキチンィ匕修飾および脱ュビキチンィ匕は、蛋白質の安定性 の調節に関与していると考えられている（非特許文献 13)。ュビキチンィ匕酵素および 脱ュビキチンィ匕酵素が関与するュビキチンプロテアソームシステムの機能の 1つは、 生体内で生じた異常蛋白質の除去、および転写因子やシグナル伝達因子等の分解 による量的調節等であり、これら酵素の機能障害はこのシステムの異常をきたす。
[0017] USP15 (Ubiquitin— specific protease 15)は、ュビキチン特異プロテアーゼ の 1つであり、ュビキチンィ匕蛋白質力 ュビキチンを切断する脱ュビキチン化活性を 有することが報告されている（非特許文献 14)。 USP15の発現は様々な組織で認め られており、特に骨格筋および心臓で高い発現が認められる。 [0018] USP15 mRNAレベル力 インテグリンのリガンドであるフイブロネクチンで誘導さ れる心筋細胞の肥大化で増加することが報告 (非特許文献 15)されており、このこと から、肥大型心筋症においても USP15量が増加している可能性が示唆される。しか しながら、現時点で USP15の生理的機能および相互作用蛋白質については報告が ない。
[0019] 特許文献 1：国際公開第 WO01Z67299号パンフレット。
非特許文献 1 :ブラウン（Brown S. )ら、「ジャーナル ォブ モレキュラー アンド セルフ一 カルティォロン一 (Journal of Molecular and Cellular Cardiolog y)」、 1999年、第 31卷、 p. 837— 843。
非特許文献 2 :チュー（Chu P. H. )ら、「メカニズムス ォブ ディべ口プメン HMec hanisms of Development)」、 2000年、第 95卷、 p. 259— 265。
非特許文献 3 :リー（Lee S. M. Y. )ら、「ジーン（Gene)」、 1998年、第 216卷、 p. 163— 170。
非特許文献 4 :モーガン（Morgan M. )ら、「バイオケミカル アンド バイオフイジ力 ノレ リサーチ コ^ュニケーションズ (Biochemical and Biophysical Research Communications)」、 1999年、第 255卷、 p. 245— 250。
非特許文献 5 :モーガン（Morgan M. J. )ら、「バイオケミカル アンド バイオフイジ カル リサーテ コ^ュニケーションズ (Biochemical and Biophysical Research
Communications)」、 1996年、第 225卷、 p. 632— 638。
非特許文献 6 :バッハ（Bach I. )ら、「メカニズムス ォブ ディべ口プメント（Mechan isms of Development)」、 2000年、第 91卷、 p. 5— 17。
非特許文献 7 :マグラス（McGrath M. J. )ら、「アメリカン ジャーナル ォブ フイジ ォロン一，セル フィンォロシ一 (American journal of physiology. Cell phy siology)」、 2003年、第 285卷、 p. C1513— 1526。
非特許文献 8 :コスティン (Kostin S. )ら、「セル ティシュー リサーチ（Cell Tissu e Research)」、 1998年、第 294卷、 p. 449—460。
非特許文献 9 :ファム（Pham C. G. )ら、「アメリカン ジャーナル ォブ フイジォロ ジ一'ノヽート アンド サーキユレイトリー フィジオロジー (American journal of p hysiology · Heart and circulatory physiology)」、 2000年、第 279卷、 p. H2 916— 2926。
非特許文献 10 :ホワンゲ（Hwang D. M. )ら、「ゲノミクス（Genomics)」、 2000年、 第 66卷、 p. 1— 14。
非特許文献 11 :ホワンゲ（Hwang D. M. )ら、「サーキュレーション（Circulation)」 、 1997年、第 96卷、 p. 4146—4203。
非特許文献 12 :リム（Lim D. S. )ら、「ジャーナル ォブ ザ アメリカン カレッジ ォブ カルティォロシ一 (Journal of the American College of Cardiology) 」、 2001年、第 38卷、 p. 1175— 1180。
非特許文献 13 :ィエイ (Yeh E. T. )ら、「ジーン（Gene)」、 2000年、第 248卷、 p. 1 14。
非特許文献 14:ベイカー（Baker R. T. )ら、「ゲノミクス（Genomics)」、 1999年、 第 59卷、 p. 264— 274。
非特許文献 15 :チェン（Chen H. )ら、「フイジォロジカル ゲノミタス（Physiological Genomics)」、 2004年、第 18卷、 p. 273— 283。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0020] 本発明の課題は、肥大型心筋症の発症や進展に関与すると考えられている SLIM 1の作用の調節に関与する蛋白質を見出し、 SLIM1の作用を調節する手段を提供 することである。また、本発明の課題には、肥大型心筋症の防止および Zまたは治療 を可能にする手段を提供することが含まれる。
課題を解決するための手段
[0021] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、肥大型心筋症の発症や進展に 関与すると考えられている SLIM1と脱ュビキチンィ匕酵素である USP15が相互作用 することをインシリコ（in silico)で予測した。この結果から、本発明者らは、 SLIM1 がュビキチン化されること、また、ュビキチン化された SLIM 1の脱ュビキチン化に US P 15が関与することを予測した。
[0022] そして、 SLIM 1がュビキチンィ匕され、プロテアソーム依存的に分解されること、また 、 USP15によりュビキチン化 SLIMlが脱ュビキチン化されること、 USP15と SLIM1 が結合すること、さらに、 USP15により SLIM1量が増加する、すなわち SLIM1が安 定ィ匕することを実証した。
[0023] USP15の他、脱ュビキチン化酵素として知られている USP20、 USP21、 USP22 、および USP33により、 SLIM 1が安定化することをさらに実証した。また、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33それぞれと SLIMlが結合することを実証した。
[0024] これら実証結果から、 SLIM 1のュビキチン化、およびュビキチン化 SLIM 1の USP
(例えば、 USP15, USP20、 USP21、 USP22、および USP33)による脱ュビキチ ン化を介した、プロテアソーム依存的な SLIM1分解制御機構が存在し、本機構によ り細胞内の SLIM 1量および SLIM 1の作用が調節されていることを見出した。
[0025] 本発明は、これら実証結果に基づ!/ヽて完成した。
[0026] すなわち、本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼにより、生 体外試料または非ヒト哺乳動物にお!/、て、ュビキチン化 SLIM 1を脱ュビキチンィ匕す る方法に関する；
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0027] また本発明は、ュビキチン特異プロテアーゼ 15により、生体外試料または非ヒト哺 乳動物において、ュビキチン化 SLIM 1を脱ュビキチン化する方法に関する。
[0028] さらに本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼにより、生体外 試料または非ヒト哺乳動物において、 SLIM1を安定ィ匕する方法に関する；
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。 [0029] さらにまた本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼによる、生 体外試料または非ヒト哺乳動物における、心筋細胞の肥大化方法に関する；
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0030] また本発明は、ュビキチン特異プロテアーゼ 15による、生体外試料または非ヒト哺 乳動物における、心筋細胞の肥大化方法に関する。
[0031] さらに本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼによるュビキ チンィ匕 SLIM1の脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物の同定方法であって、該ュビキ チン特異プロテアーゼとュビキチン化 SLIM 1の相互作用を可能にする条件下、ある 化合物と該ュビキチン特異プロテアーゼおよび Zまたはュビキチン化 SLIM1を接触 させ、次いで、該ュビキチン特異プロテアーゼによるュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュビキ チンィ匕により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシ グナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することに より、該化合物が該ュビキチン特異プロテアーゼによるュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュ ビキチンィ匕を阻害する力否かを判定する同定方法に関する；
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0032] さらにまた本発明は、ュビキチン特異プロテアーゼ 15によるュビキチンィ匕 SLIM1 の脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物の同定方法であって、ュビキチン特異プロテア ーゼ 15とュビキチン化 SLIM1の相互作用を可能にする条件下、ある化合物とュビ キチン特異プロテアーゼ 15および Zまたはュビキチン化 SLIM1を接触させ、次いで 、ュビキチン特異プロテアーゼ 15によるュビキチン化 SLIM 1の脱ュビキチン化によ り生じるシグナルおよび zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよ び Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合 物がュビキチン特異プロテアーゼ 15によるュビキチン化 SLIM1の脱ュビキチン化を 阻害する力否かを判定する同定方法に関する。
[0033] また本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼと SLIM1の結 合を阻害する化合物の同定方法であって、該ュビキチン特異プロテアーゼと SLIM1 の相互作用を可能にする条件下、ある化合物と該ュビキチン特異プロテアーゼおよ び Zまたは SLIM 1を接触させ、該ュビキチン特異プロテアーゼと SLIM 1の結合に より生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルお よび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化 合物が該ュビキチン特異プロテアーゼと SLIM1の結合を阻害する力否かを判定す る同定方法に関する；
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0034] さらに本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼとュビキチン ィ匕 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法であって、該ュビキチン特異プロテ ァーゼとュビキチン化 SLIM1の相互作用を可能にする条件下、ある化合物と該ュビ キチン特異プロテアーゼおよび Zまたはュビキチン化 SLIM1を接触させ、該ュビキ チン特異プロテアーゼとュビキチン化 SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Z またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存 在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ュビキチン特異プ 口テアーゼとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害するか否かを判定する同定方法に 関する；
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、 (3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0035] さらにまた本発明は、ュビキチン特異プロテアーゼ 15と SLIM1の結合を阻害する 化合物の同定方法であって、ュビキチン特異プロテアーゼ 15と SLIM1の相互作用 を可能する条件下、ある化合物とュビキチン特異プロテアーゼ 15および Zまたは SL IM 1を接触させ、ュビキチン特異プロテアーゼ 15と SLIM 1の結合により生じるシグ ナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたは マーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がュビキ チン特異プロテアーゼ 15と SLIM1の結合を阻害する力否かを判定する同定方法に 関する。
[0036] また本発明は、ュビキチン特異プロテアーゼ 15とュビキチンィ匕 SLIM 1の結合を阻 害する化合物の同定方法であって、ュビキチン特異プロテアーゼ 15とュビキチン化 SLIM1の相互作用を可能する条件下、ある化合物とュビキチン特異プロテアーゼ 1 5および Zまたはュビキチンィ匕 SLIM1を接触させ、ュビキチン特異プロテアーゼ 15 とュビキチンィ匕 SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用 する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または 変化を検出することにより、該化合物がュビキチン特異プロテアーゼ 15とュビキチン ィ匕 SLIM1の結合を阻害する力否かを判定する同定方法に関する。
[0037] さらに本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼの脱ュビキチ ン化活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、 SLIM1の阻害方法に関する
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0038] さらにまた本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼの脱ュビ キチンィ匕活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、心筋細胞の肥大化阻害 方法に関する：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0039] また本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテア一ゼの脱ュビキチン 化活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、肥大型心筋症の防止および Z または治療方法に関する：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0040] さらに本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼの脱ュビキチ ン化活性を阻害する化合物を含有してなる、 SLIM1の阻害剤に関する：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0041] さらにまた本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼの脱ュビ キチンィ匕活性を阻害する化合物を含有してなる、抗心筋肥大化剤に関する：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および (5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0042] また本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテア一ゼの脱ュビキチン 化活性を阻害する化合物を含有してなる、肥大型心筋症の防止および Zまたは治 療剤に関する：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
[0043] さらに本発明は、以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ、該ュビキチ ン特異プロテアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、およ び該ベクターを導入してなる形質転換体のうち少なくともいずれか 1つと、 SLIM1、 S LIM1をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、および該ベクター を導入してなる形質転換体のうち少なくともいずれカゝ 1つを含む試薬キットに関する：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22、および
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33。
発明の効果
[0044] 本発明においては、 SLIM1と脱ュビキチン化酵素である USP15が相互作用する ことをインシリコで予測し、さらにこの予測結果から、 SLIM1がュビキチンィ匕されること 、また、ュビキチン化された SLIM1の脱ュビキチン化に USP15が関与することを予 測した。そして、実験的な検証を行った結果、（l) SLIMlがュビキチンィ匕され、プロ テアノームで分解されること、（2) USP15によりュビキチン化 SLIM1が脱ュビキチン ィ匕されること、（3) USP15と SLIM1が結合すること、（4) USP15により SLIM1量力 S 増加すること、（5) USP15の他、脱ュビキチン化酵素として知られている USP20、 U SP21、 USP22、および USP33により、 SLIM1量が増加すること、および（6) USP 20、 USP21、 USP22、および USP33それぞれと SLIM1が結合することを実証し た。
[0045] これら結果から、 SLIM1のュビキチン化、およびュビキチン化 SLIM1の USP (例 えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33)による脱ュビキチンィ匕 を介した、プロテアソーム依存的な SLIM1分解制御機構が存在し、本機構により細 胞内の SLIM 1量および SLIM 1の作用が調節されて 、る可能性を見出した。具体的 には、 SLIM1のュビキチン化により、ュビキチン化 SLIM1が生成されてプロテアソ ームにより認識され、その結果、プロテアソーム依存的に分解される。一方、ュビキチ ン化 SLIM1が USPにより脱ュビキチン化されることにより、プロテアソームによる SLI Mlの認識が低下し、その結果、プロテアソーム依存的な SLIM1の分解が抑制され る。
[0046] した力つて、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33 )によるュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュビキチンィ匕を阻害することにより、プロテアソーム によるュビキチンィ匕 SLIM1の分解を促進することができ、その結果、細胞内 SLIM1 量を減少させて、 SLIM 1の作用を阻害することができる。
[0047] SLIM1は肥大型心筋症の発症や進展に関与すると考えられている（非特許文献 7
9)。具体的には、肥大型心筋症患者の心臓で、健常人の心臓に比して、 SLIM1 mRNA量が増加していること、肥大型心筋症のモデルマウスにおいて、コントロー ルマウスに比して、 SLIM1 mRNA量が増加して!/、ることが報告されて 、る（非特許 文献 10— 12)。
[0048] した力つて、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33 )によるュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュビキチンィ匕を阻害することにより、 SLIM1の分解 を促進させて SLIM1量を減少させることができ、その結果、心筋細胞の肥大化を阻 害することができる。また、肥大型心筋症の発症や進展を抑制することができる。
[0049] 本発明にお ヽて、 USP (USP15、 USP20、 USP21、 USP22また ίま USP33)を 用いることを特徴とする、ュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュビキチンィ匕方法、 SLIM1の安 定化方法、心筋細胞を肥大化する方法を提供できる。また、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物の同定方法、 USPと SLIM1の結合を 阻害する化合物の同定方法、 USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物 の同定方法、ュビキチンィ匕 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細胞の 肥大化を阻害する化合物の同定方法を提供できる。さらに、 USPの脱ュビキチンィ匕 活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、 SLIM1の阻害方法、心筋細胞の 肥大化阻害方法、肥大型心筋症の防止および Zまたは治療方法を提供できる。また 、 USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物を含有してなる、 SLIM1阻害剤、抗 心筋肥大化剤、肥大型心筋症の防止および Zまたは治療剤を提供できる。さらに、 試薬キットを提供できる。
[0050] 本発明により SLIM1量および SLIM1の機能の阻害が可能になり、その結果、肥 大型心筋症の防止および Zまたは治療が可能になる。
図面の簡単な説明
[0051] [図 1]SLIM1と USP15の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。 SLI Mlと USP15の間でローカルァライメントを行い、高いスコアを示した領域を図示した 。アミノ酸配列は 1文字表記した。図中、アミノ酸配列の左側に示した数字は、 SLIM 1または USP15の各アミノ酸配列における、図示した各領域の N末端アミノ酸の位置 を意味する。（実施例 1)
[図 2]ダルタチオン S—トランスフェラーゼ (以下、 GSTと略称する）および N末端 GS T融合 SLIM1 (図中、 GST—SLIM1と表記する）を、メンブレン上で、 N末端 His融 合 USP15 (図中、 His— USP15 bindingと表記する）とそれぞれ反応させた結果、 GST— SLIM1をドットブロットした位置に、 GST— SLIM1と His— USP15の結合を 示す強いシグナル力 S、抗 His抗体によるウェスタンブロッテイングにより検出されたこと を示す図である。これに対し、 His— USP15の代わりにバッファー（図中、 Buffer o nlyと表記する）を用いたときには、このようなシグナルはほとんど検出されな力つた。 ( 実施例 2)
[図 3]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (図中、 His— Xpress— SLIM1と表記する） と C末端 V5 - His融合 USP 15 (図中、 USP 15— V5— Hisと表記する）とを共発現さ せた培養細胞のセルライセート（図中、 cell lysateと表記する）にお 、て、抗 V5抗 体（図中、 o; V5と表記する）により USP15の免疫沈降（図中、 IPと表記する）を行つ たときに His— Xpress— SLIM 1の共沈降が認められた（上パネル）ことを示す図で ある。 His— Xpress— SLIM1の共沈降は Omni Probe抗体（図中、 Omniと表記す る）を用いたウェスタンブロッテイング（図中、 WBと表記する）により検出された。一方 、 His -Xpress SLIM1のみを発現させた細胞では抗 V5抗体による His—Xpress SLIM1の共沈降は認められなかった（上パネル）。 His—Xpress— SLIMlと US P15—V5—Hisを共発現させた細胞において、 USP15—V5—Hisの発現力 抗 V 5抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された（中パネル）。 His—Xpress — SLIM1のみを発現させた細胞、および His— Xpress— SLIM1と USP15—V5 —Hisを共発現させた細胞において、 His—Xpress— SLIMlの発現が、 Omni Pr obe抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された（下パネル)。（実施例 2) [図 4]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (図中、 His— Xpress— SLIM1と表記する） と N末端 FLAG融合ュビキチン（図中、 FLAG— Ubと表記する）とを共発現させた培 養細胞のセルライセート（図中、 cell lysate)において、 Omni Probe抗体（図中、 Omniと表記する）により His— Xpress— SLIM1の免疫沈降（図中、 IPと表記する） を行ったときに、 FLAG— Ubの共沈降が認められられた（上パネル）ことを示す図で ある。 FLAG— Ubの共沈降は抗 FLAG抗体（図中、 α FLAGと表記する）を用いた ウェスタンブロッテイング（図中、 WBと表記する）により検出された。検出された高分 子領域のラダー状のシグナルは 1以上の FLAG— Ubにより修飾された His— Xpres s— SLIM1 (図中、 Ub— SLIM1と表記する）であると考えられた。一方、 His— Xpr ess— SLIM1のみを発現させた細胞および FLAG— Ubのみを発現させた細胞では 、 Omni Probe抗体による FLAG— Ubの共沈降および高分子領域のラダー状のシ グナルは認められないか、またはその程度が著しく低力つた（上パネル)。 His -Xpr ess— SLIM 1のみを発現させた細胞、および His—Xpress— SLIM 1と USP 15—V 5— Hisを発現させた細胞において、 His—Xpress— SLIMlの発現が、抗 Xpress 抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された（下パネル)。（実施例 3) [図 5]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (His -Xpress SLIM1と略称することがあ る；図中、 SLIM 1と表記する）と C末端 V5— His融合 LacZ (LacZ V5— Hisと略称 することがある；図中、 LacZと表記する）を共発現させた細胞を、プロテアソーム阻害 剤である MG— 132 (図中、 MG132と表記する）で処理したときに、 MG— 132の代 わりにジメチルスルホキシド（図中、 DMSOと表記する）で処理したときと比較して、細 胞内 His—Xpress— SLIMl量の増加が認められたことを示す図である。 LacZ—V 5— Hisおよび内在性蛋白質であるグリセルアルデヒドー3—ホスフェート デヒドロゲ ナーゼ（以下、 GAPDHと略称することがある）の量に変化は認められな力つた。（実 施例 4)
[図 6]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (His— Xpress— SLIM1と略称することがあ る；図中、 SLIM 1と表記する）と N末端 FLAG融合ュビキチン (FLAG— Ubと略称す ることがある；図中、 Ubと表記する）を共発現させた培養細胞のセルライセート（cell lysate)において、 1以上の FLAG— Ubにより修飾された His— Xpress— SLIM1 ( Ub— SLIM1と略称することがある）と考えられるラダー状のシグナルが高分子領域 に検出された（上パネル)こと、および該シグナルが C末端 V5— His融合 USP15 (U SP15— V5— Hisと略称することがある；図中、 USP15と表記する）の共発現により 顕著に減少した (上パネル)ことを示す図である。該シグナルの減少は C末端 V5— H is融合不活性型 USP15 (USP15 (C269A)—V5— Hisと略称することがある；図中 、 USP15 (C269A)と表記する）を共発現させたときには認められな力つた (上パネ ル）。 His— Xpress SLIM 1のみまたは FLAG— Ubのみを発現させた培養細胞の セルライセートでは、このようなシグナルは認められなかった（上パネル)。用いたセル ライセート中の His—Xpress— SLIM 1の量は、 His -Xpress- SLIM 1のみを発現 させた細胞、 His— Xpress— SLIM1と FLAG— Ubを共発現させた細胞、 His—Xp ress— SLIM1、 FLAG— Ub、および USP15— V5— Hisまたは USP15 (C269A) V5— Hisを共発現させた細胞のいずれの細胞についても、ほぼ同等であった（中 パネル）。用いたセルライセート中で USP15— V5— Hisまたは USP15 (C269A) - V5— Hisが発現されていることも確認された（下パネル）。 Ub SLIM1は、 Omni Probe抗体（図中、 Omniと表記する）による免疫沈降（図中、 IPと表記する）後に、抗 FLAG抗体を用いたウェスタンブロッテイング（図中、 WBと表記する）を行うことにより 検出された。 His—Xpress— SLIMlの検出は、抗 Xpress抗体（図中、 a Xpressと 表記する）を用いたウェスタンブロッテイングにより行った。 USP15— V5— Hisおよ び USP15 (C269A)— V5— Hisの検出は、抗 V5抗体（図中、 a V5と表記する）を 用いたウェスタンブロッテイングにより行った。（実施例 5)
[図 7]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (His— Xpress— SLIM1と略称することがあ る；図中、 SLIM1と表記する）と C末端 V5— His融合 USP15 (USP15— V5— Hisと 略称することがある；図中、 USP 15と表記する）を共発現させた細胞から調製したセ ルライセートでは、 His—Xpress— SLIMlのみを発現させた細胞から調製したもの と比較して、 His—Xpress— SLIM1量の著し!/、増加が認められた（上パネル）ことを 示す図である。これに対して、 1¾5— 55— 3し^^1とじ末端¥5— 1¾5融合不活性 型 USP15 (USP15 (C269A)—V5— Hisと略称することがある；図中、 USP15 (C2 69A)と表記する）を共発現させた細胞力も調製したセルライセートでは、 His— Xpre ss— SLIM 1量の増加の程度は低かった（上パネル）。 His—Xpress— SLIM 1と US P15 -V5- Hisまたは USP 15 (C269 A)— V5— Hisとを共発現させた細胞におい て、 USP15— V5— Hisまたは USP15 (C269A)—V5— Hisの発現が、抗 V5抗体 を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された（中パネル）。 His—Xpress— SLI M 1のみを発現させた細胞、および His—Xpress— SLIM 1と USP 15— V5— Hisま たは USP15 (C269A)—V5— Hisとを共発現させた細胞力も調製した各ライセート において、抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより検出された内在 性蛋白質 GAPDHの量がほぼ同等であった。（実施例 6)
[図 8]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (His -Xpress SLIM1と略称することがあ る；図中、 SLIM 1と表記する）と N末端 HA融合 USP21 (HA— USP21と略称するこ とがある；図中、 USP21と表記する）を共発現させた細胞カゝら調製したセルライセート では、 His— Xpress— SLIM1のみを発現させた細胞から調製したものと比較して、 His -Xpress SLIM 1量の著 ヽ増加が認められた（上パネル）ことを示す図であ る。これに対して、 His— Xpress— SLIM1と N末端 HA融合不活性型 USP21 (HA -USP21 (C221A)と略称することがある；図中、 USP21 (C221A)と表記する）を 共発現させた細胞力も調製したセルライセートでは、 His—Xpress - SLIM1量の増 加の程度は低かった（上パネル）。 1¾5— 55— 3し^^1と11八ー1；3?21を共発 現させた細胞、および His— Xpress— SLIM1と HA—USP21 (C221A)を共発現 させた細胞において、 HA— USP21および HA— USP21 (C221A)それぞれの発 現力 抗 HA抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された（中パネル)。 Hi s-Xpress SLIM 1のみを発現させた細胞、および His—Xpress— SLIM 1と HA USP21または HA— USP21 (C221A)とを共発現させた細胞から調製した各ライ セートにおいて、抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより検出された 内在性蛋白質 GAPDHの量がほぼ同等であった。（実施例 7)
[図 9]N末端 FLAG融合 USP20 (FLAG USP20と略称することがある；図中、 US P20と表記する）、 N末端 FLAG融合 USP22 (FLAG— USP22と略称することがあ る；図中、 USP22と表記する）および N末端 FLAG融合 USP33 (FLAG— USP33 と略称することがある；図中、 USP33と表記する）のうち!/、ずれか 1の USPと N末端 H is—Xpress融合 SLIM1 (His -Xpress SLIM1と略称することがある；図中、 SLI Mlと表記する）とを共発現させた細胞力 調製したセルライセートでは、 His— Xpre ss— SLIM 1のみを発現させた細胞から調製したものと比較して、 His— Xpress— S LIM1量の著しい増加が認められた（上パネル）ことを示す図である。 FLAG— USP 20、 FLAG— USP22および FLAG— USP33のうちいずれか 1の USPと His— Xpr ess SLIM 1とを共発現させた細胞において、 FLAG— USP20、 FLAG— USP2 2または FLAG— USP33の発現力 抗 FLAG抗体を用いたウェスタンブロッテイン グにより確認された（中パネル）。 His— Xpress— SLIM1のみを発現させた細胞、お よび FLAG— USP20、 FLAG— USP22および FLAG— USP33のうちいずれか 1 と His—Xpress— SLIM1とを共発現させた細胞力 調製した各ライセートにおいて 、抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより検出された内在性蛋白質 GAPDHの量がほぼ同等であった。（実施例 8)
[図 10]N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (図中、 His— Xpress— SLIM 1と表記する 末端 HA融合 USP21 (HA— USP21と略称することがある；図中、 USP21と表 記する）とを共発現させた培養細胞のセルライセート（図中、 cell lysateと表記する） にお 、て、抗 HA (Yl 1)抗体（図中、 HA (Yl 1)と表記する）により HA— USP21の 免疫沈降（図中、 IPと表記する）を行ったときに His— Xpress— SLIM1の共沈降が 認められた（右パネル）ことを示す図である。 His— Xpress— SLIM1の共沈降は抗 X press抗体（図中、 Xpressと表記する）を用いたウェスタンブロッテイング（図中、 WB と表記する）により検出された。これに対して、 His— Xpress— SLIM1のみを発現さ せた細胞では抗 HA (Yl 1)抗体による His—Xpress— SLIM1の共沈降はほとんど 認められなかった（右パネル）。 His—Xpress— SLIM 1と HA— USP21とを共発現 させた培養細胞において、 HA—USP21の発現が、抗 HA (Yl l)抗体を用いたゥェ スタンプロッテイングにより確認された（左パネル）。 His—Xpress— SLIMlのみを発 現させた細胞、および His— Xpress— SLIM1と HA— USP21とを共発現させた培 養細胞において、 His— Xpress— SLIM1の発現が、 Omni Probe抗体を用いたゥ エスタンブロッテイングにより確認された（中パネル)。（実施例 9)
[図 11]N末端 FLAG融合 USP20 (FLAG USP20と略称することがある；図中、 U SP20と表記する）、 N末端 FLAG融合 USP22 (FLAG— USP22と略称することが ある；図中、 USP22と表記する）および N末端 FLAG融合 USP33 (FLAG— USP3 3と略称することがある；図中、 USP33と表記する）のうち!/、ずれ力 1の USPと N末端 His— Xpress融合 SLIM1 (His— Xpress— SLIM1と略称することがある；図中、 SL IM1と表記する）とを共発現させた細胞力も調製したセルライセート（図中、 cell lysa teと表記する）において、抗 FLAG M2抗体（図中、 FLAG M2と表記する）により 、該 USPの免疫沈降（図中、 IPと表記する）を行ったときに His— Xpress— SLIM1 の共沈降が認められた（右パネル）ことを示す図である。 His— Xpress— SLIM1の 共沈降は Omni Probe抗体（図中、 Omni Probeと表記する）を用いたウェスタン ブロッテイング（図中、 WBと表記する）により検出された。これに対して、 His—Xpres s SLIM 1のみを発現させた細胞でも、抗 FLAG M2抗体による免疫沈降および Omni Probe抗体によるウェスタンブロッテイングの結果、 His— Xpress— SLIM1 の共沈降が認められたがその程度は低かった。 FLAG— USP20、 FLAG— USP2 2および FLAG— USP33のうちいずれか 1の USPと His— Xpress— SLIM1とを共 発現させた細胞において、該 USPの発現が、抗 FLAG M2抗体を用いたウェスタ ンブロッテイングにより確認された（左パネル）。 His— Xpress— SLIM1のみを発現さ せた細胞、および FLAG— USP20、 FLAG— USP22および FLAG— USP33のう ちいずれか 1の USPと His— Xpress— SLIM1とを共発現させた細胞において、 His — Xpress— SLIM1の発現が、 Omni Probe抗体用いたウェスタンブロッテイングに より確認された（中パネル)。（実施例 10)
発明を実施するための最良の形態
[0052] 以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書にぉ ヽては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは 合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチド を意味する総称的用語として「蛋白質」 t 、う用語を使用することがある。ここで蛋白 質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結 合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を 表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。
[0053] 本発明においては、 SLIM1が USP15と相互作用する可能性をインシリコで予測し た。 USP15が脱ュビキチンィ匕活性を有することが知られていることから、 SLIM1が ュビキチン化されること、また、ュビキチン化された SLIM 1の脱ュビキチン化に USP 15が関与することを予測した。そして、実験的な検証を行った結果、（l) SLIMlがュ ビキチン化され、プロテアノームで分解されること、（2) USP15によりュビキチン化 S LIM1が脱ュビキチン化されること、（3) USP15と SLIM1が結合すること、（4) USP 15により SLIM1量が増加すること、（5) USP15の他、脱ュビキチン化酵素として知 られている USP20、 USP21、 USP22、および USP33により、 SUM1量力 ^増カロす ること、および（6) USP20、 USP21、 USP22、および USP33それぞれと SUM1力 S 結合することを実証した。
[0054] これら実証結果から、 SLIM 1のュビキチン化、およびュビキチン化 SLIM 1の USP
(例えば、 USP15, USP20、 USP21、 USP22、および USP33)による脱ュビキチ ン化により SLIM1の分解 (安定性)が調節され、該分解の調節により SLIM1の作用 が調節されている可能性を見出した。すなわち、 SLIM1のュビキチン化およびュビ キチン化 SLIM 1の脱ュビキチン化を介したプロテアソーム依存的な SLIM 1分解制 御機構が存在し、本機構により細胞内の SLIM 1量および SLIM 1の作用が調節され ている可能性を見出した。具体的には、 SLIM1のュビキチンィ匕により、ュビキチン化 SLIM 1が生成され、ュビキチン化 SLIM 1量が増加する。次いで、該ュビキチン化 S LIM1はプロテアソームにより認識されてプロテアソーム依存的に分解される。このよ うな一連のプロテアソーム依存的な SLIM1分解機構により、 SLIM1量は減少すると 考えることができる。一方、ュビキチンィ匕 SLIM1が USPにより脱ュビキチンィ匕される ことにより、ュビキチン化 SLIM1からュビキチンが解離され、ュビキチン化 SLIM1量 が減少する。ュビキチン化 SLIM1量が減少するのに伴い、プロテアソーム依存的な SLIM 1の分解が低減するため、 SLIM 1量は増加すると考えることができる。
[0055] した力つて、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33 )によるュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュビキチンィ匕を阻害することにより、プロテアソーム 依存的なュビキチン化 SLIM 1の分解を促進することができる。
[0056] プロテアソーム依存的なュビキチン化 SLIM1の分解を促進することにより、 SLIM 1量を減少させることができ、その結果、 SLIM1の作用を低減または消失させること ができる。すなわち、プロテアソーム依存的なュビキチンィ匕 SLIM 1の分解を促進す ることにより、 SLIM 1を阻害できる。
[0057] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化には、 USPと SLIM1の結合、 および USPとュビキチン化 SLIM1の結合が関与している。
[0058] SLIM1は細胞内のュビキチン化機構によってュビキチンィ匕され、その結果生成し たュビキチンィ匕 SLIM 1が USPと結合すると考えることができる。結合後、該 USPの システィンプロテアーゼ活性依存的に該ュビキチン化 SLIM 1が脱ュビキチンィ匕する と考えられる。 USPは基質特異性を有することが報告されていることから、 USPはュ ビキチンィ匕 SLIM1のュビキチン部分 (またはその一部）と SLIM1部分 (またはその 一部）のいずれをも認識していると考える。このことから、 USPと SLIM1の結合を阻 害することにより、 USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害できると考える。
[0059] 一方、本発明において、 SLIM1が USPと結合することを実証した（実施例 2、 9お よび 10)。したがって、 SLIM1は USPと結合した後、該 SLIM1が細胞内のュビキチ ン化機構によってュビキチン化され、その結果生成したュビキチン化 SLIM1から該 USPのシスティンプロテアーゼ活性依存的にュビキチンが解離する、すなわち、該 ュビキチン化 SLIM1が脱ュビキチンィ匕されると考えることも可能である。
[0060] 上記知見から、 USPと SLIM1の結合を阻害することにより、 USPとュビキチン化 S LIM1の結合を阻害できると考えられる。
[0061] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害することにより、ュビキチン化 SLIM1の
USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害できると考える。
[0062] ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチン化を阻害することにより、ュビキチ ン化 SLIM 1のプロテアソーム依存的な分解を促進することができる。
[0063] ュビキチンィ匕 SLIM1のプロテアソーム依存的な分解を促進することにより、細胞内
SLIM1量を減少させることができ、その結果、 SLIM1の作用を低減または消失させ ることができる。すなわち、ュビキチンィ匕 SLIM 1のプロテアソーム依存的な分解を促 進することにより、 SLIM 1を阻害できる。
[0064] SLIM1は肥大型心筋症の発症や進展に関与すると考えられている（非特許文献 7
9)。具体的には、肥大型心筋症患者の心臓で、健常人の心臓に比して、 SLIM1 mRNA量が増加していること、肥大型心筋症のモデルマウスにおいて、コントロー ルマウスに比して、 SLIMl mRNA量が増加して!/、ることが報告されて 、る（非特許 文献 10— 12)。
[0065] した力つて、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33 )によるュビキチンィ匕 SLIMlの脱ュビキチンィ匕を阻害することにより、 SLIM1の分解 を促進させて SLIM1量を減少させることができ、その結果、心筋細胞の肥大化を阻 害することができる。また、肥大型心筋症の発症や進展を抑制することができる。
[0066] rSLIMlJは、骨格筋や心筋に高発現する蛋白質である。 SLIM1が有する LIMド メインは 50— 60アミノ酸力 なる蛋白質結合モチーフであり、転写因子や細胞骨格 蛋白質と相互作用し、細胞の分化や細胞骨格の整合性を保つのに重要な働きを担 つている（非特許文献 6)。 SLIM1については、筋芽細胞力 筋肉細胞への分ィ匕ゃ 筋芽細胞の伸展等の調節作用、および肥大型心筋症の発症や進展への関与が報 告されて!/ヽる (非特許文献 7— 12)。
[0067] SLIM1遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表 の配列番号 1および配列番号 2に記載の各配列で表されるヒト由来の遺伝子および 蛋白質を好ましく例示できる。該遺伝子および該蛋白質は、それぞれ NCBI (Natio nal Center for Biotechnology Information)公！ ¾テータベースにァクセッシ ヨンナンバー NM— 001449および NP— 001440として公開されている。
[0068] 「USP」は、ュビキチンィ匕された蛋白質力 ュビキチンが解離する脱ュビキチンィ匕 反応を触媒する脱ュビキチン化酵素である。 USPとして、多くのファミリー蛋白質が 知られている。 USPは、その活性ドメインとして Cysドメイン、 Hisドメイン、および Asp ドメインを持ち、 Cysドメイン内に存在するシスティン残基を活性部位とするシスティン プロテアーゼである。
[0069] USPとして、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33を好ましく例示 できる。より好ましくは USP15を例示できる。本発明において、 USPはこれら USPに 制限されず、脱ュビキチン化活性を有し、心臓で発現している USPであればいずれ でもあり得る。
[0070] 「USP15」は、システィンプロテアーゼの 1つであり、ュビキチン化蛋白質からュビ キチンを切断する脱ュビキチンィ匕活性を有することが報告されて 、る（非特許文献 1 4)。 USP15の発現は、様々な組織で認められており、特に骨格筋および心臓で高 い発現が認められる。 USP15遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質とし て、それぞれ配列表の配列番号 3および配列番号 4に記載の各配列で表されるヒト 由来の遺伝子および蛋白質を好ましく例示できる。該遺伝子および該蛋白質は、そ れぞれ NCBI公開データベースにァクセッションナンバー NM— 006313および NP _006304として公開されて!、る。
[0071] 「USP21」は、システィンプロテアーゼの 1つであり、ュビキチン化蛋白質からュビ キチンを切断する脱ュビキチンィ匕活性を有することが報告されて 、る (「ザ ジャーナ ノレ ォブ ノィォロジカノレ ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry )」、 2000年、第 275卷、 p. 14212—14216)。また、 USP21の'、臓における高発 現が知られている。 USP21遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、 それぞれ配列表の配列番号 5および配列番号 6に記載の各配列で表されるヒト由来 の遺伝子および蛋白質を好ましく例示できる。該遺伝子および該蛋白質は、それぞ れ NCBI公開データベースにァクセッションナンバー NM— 012475および NP— 03 6607として公開されて!ヽる。
[0072] 「USP20」は、システィンプロテアーゼの 1つであり、ュビキチン化蛋白質からュビ キチンを切断する脱ュビキチンィ匕活性を有することが報告されて 、る (「ザ ジャーナ ル ォブ タリ-カルインべスティゲーシヨン（The Journal of Clinical Investiga tion)」、 2003年、第 112卷、 p. 189— 196)。 USP20遺伝子および該遺伝子によ りコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号 7および配列番号 8に記載 の各配列で表されるヒト由来の遺伝子および蛋白質を好ましく例示できる。該遺伝子 および該蛋白質は、それぞれ NCBI公開データベースにァクセッションナンバー NM 一 006676および NP一 006667として公開されて!/、る。
[0073] 「USP22」は、システィンプロテアーゼの 1つであり、心臓で高い発現が認められる 蛋白質である。 USP22遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それ ぞれ配列表の配列番号 9および配列番号 10に記載の各配列で表されるヒト由来の 遺伝子および蛋白質を好ましく例示できる。該遺伝子および該蛋白質は、それぞれ NCBI公開データベースにァクセッションナンバー AB028986および BAA83015と して公開されている。
[0074] 「USP33」は、システィンプロテアーゼの 1つであり、ュビキチン化蛋白質からュビ キチンを切断する脱ュビキチンィ匕活性を有することが報告されて 、る (「ザ ジャーナ ル ォブ タリ-カルインべスティゲーシヨン（The Journal of Clinical Investiga tion)」、 2003年、第 112卷、 p. 189— 196)。 USP33遺伝子および該遺伝子によ りコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号 11および配列番号 12に記 載の各配列で表されるヒト由来の遺伝子および蛋白質を好ましく例示できる。該遺伝 子および該蛋白質は、それぞれ NCBI公開データベースにァクセッションナンバー N M一 015017および NP一 055832として公開されて!/、る。
[0075] 「ュビキチン化」とは、 1分子の蛋白質に 1分子以上のュビキチンが共有結合するこ とによる、ュビキチンによる該蛋白質の修飾を意味する。ュビキチンは、標的蛋白質 内のリジン残基に共有結合すると考えられる。標的蛋白質内のリジン残基に結合した ュビキチン内のリジン残基に、別のュビキチンがさらに共有結合することにより、蛋白 質には複数のュビキチンが鎖状に結合する。このように複数のュビキチンが鎖状に 結合したものをポリュビキチン鎖と称する。ュビキチン内のュビキチンィ匕を受ける部位 として、そのアミノ酸配列第 48番目のリジン残基が同定されている。 [0076] 「ュビキチン」は、真核生物に普遍的に存在する 76アミノ酸力もなる蛋白質である。 ュビキチンは、プロテアソームによる蛋白質分解において、標的蛋白質に結合してポ リュビキチン鎖を形成し、蛋白質分解の標識として機能する。ュビキチン遺伝子およ び該遺伝子によりコードされる蛋白質として、それぞれ配列表の配列番号 13および 配列番号 14に記載の各配列で表されるヒト由来の遺伝子および蛋白質を好ましく例 示できる。該遺伝子および該蛋白質は、それぞれ NCBI公開データベースにァクセ ッシヨンナンバー NM— 002954および NP— 002945としてその塩基配列およびァ ミノ酸配列が公開されている。ァクセッションナンバー NM— 002954に公開されてい る塩基配列（配列番号 13)は、 2つの蛋白質、すなわちュビキチンとリボソーム蛋白 質 S27aをコードしており、該塩基配列内の第 1番目力も第 228番目までの領域がュ ビキチンをコードする領域である。また、ァクセッションナンバー NP— 002945に公 開されているアミノ酸配列の第 1番目力も第 76番目までのアミノ酸配列（配列番号 14 )力 ュビキチンのアミノ酸配列である。
[0077] 「SLIM1のュビキチン化」とは 1分子の SLIM1に 1分子以上のュビキチンが共有 結合することによる、ュビキチンによる SLIM1の修飾を意味する。
[0078] 「ュビキチン化 SLIM1Jとは、ュビキチン化された SLIM 1、すなわち 1分子の SLI Mlに 1分子以上のュビキチンが共有結合することにより修飾された SLIM1を意味 する。
[0079] 「ュビキチン化 SLIM1の脱ュビキチン化」とは、ュビキチン化された SLIM 1、すな わち 1分子の SLIM1に 1分子以上のュビキチンが共有結合することにより修飾され た SLIM1から、ュビキチンが解離する反応を意味する。
[0080] 「ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化」とは、ュビキチン化された SLI Ml、すなわち 1分子の SLIM1に 1分子以上のュビキチンが共有結合することにより 修飾された SLIM1から、 USPのシスティンプロテアーゼ活性依存的にュビキチンが 解離する反応を意味する。
[0081] 「ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化の阻害」とは、ュビキチン化 SL IM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する前と比較して、ュビキチン化 SLIM 1量 が増加するまたは発生すること、および Zまたは、 SLIM 1量が減少するまたは消失 することを意味する。
[0082] 「USPの脱ュビキチン化活性」とは、ュビキチンィ匕された蛋白質、すなわち 1分子の 蛋白質に 1分子以上のュビキチンが共有結合することにより修飾された蛋白質から、 USPのシスティンプロテアーゼ活性依存的にュビキチンが解離する反応を意味する
[0083] 「USPと SLIM1の結合」とは、 USPと SLIM1が、複合体を形成するように、水素結 合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味 する。ここでの結合とは、 USPと SLIM1がその一部分において結合すれば足りる。 例えば、 USPまたはその一部と、 SLIM1またはその一部との結合を意味する。
[0084] 「USPと SLIM1の結合の阻害」とは、 USPと SLIM1の結合を阻害する前と比較し て、 USPと SLIM1を含む複合体が減少するまたは消失することを意味する。
[0085] 「USPとュビキチン化 SLIM1の結合」とは USPとュビキチン化 SLIM1が、複合体 を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合によ り相互作用することを意味する。ここでの結合とは、 USPとュビキチンィ匕 SLIM1がそ の一部分において結合すれば足りる。例えば、 USPまたはその一部と、ュビキチン 化 SLIM1を構成する SLIM1またはその一部との結合を意味する。
[0086] 「USPとュビキチン化 SLIM1の結合の阻害」とは、 USPとュビキチン化 SLIM1の 結合を阻害する前と比較して、 USPとュビキチン化 SLIM1を含む複合体が減少す るまたは消失することを意味する。
[0087] 「プロテアノーム」は、核および細胞質に局在する高分子プロテアーゼであり、細胞 内蛋白質を選択的に分解する。ュビキチンィ匕蛋白質を認識し、その選択的かつエネ ルギー依存的な分解に関与して 、るプロテアーゼ複合体として、 26Sプロテアソーム が知られている。
[0088] 「プロテアソーム依存的なュビキチン化 SLIM1の分解」とは、ュビキチン化 SLIM1 力 プロテアノームに認識され、プロテアソームにおいて分解される一連の反応を意 味する。
[0089] 「SLIM1を安定化する」とは、 SLIM1のプロテアソーム依存的な分解を阻害して、 SLIM1量を増加させることを意味する。例えば、細胞内のュビキチン化機構によりュ ビキチン化された SLIM 1のプロテアソーム依存的な分解を阻害して、 SLIM 1量を増 カロさせることを意味する。
[0090] 「肥大型心筋症」は、心筋、主に左心室の心筋が肥大化する心筋疾患である。心筋 が肥大化することにより心室、主に左心室の内腔が狭くなり、血液循環が悪化する。 その症状として胸痛や呼吸困難等が出現することがあるが、大部分は自覚症状に乏 しぐ不整脈による突然死の危険性が高い。肥大型心筋症の治療薬として、左心室 の拡張を目的とし、 β交感神経受容体遮断薬やカルシウム拮抗剤が用いられて 、る
[0091] 「心筋細胞の肥大化」とは、心筋細胞の容積が増加する現象を意味する。一般的に 、肥大した細胞は、原形質、核と共にその容積を増し、ミトコンドリアその他の細胞内 小器官の数の増加を伴う。
[0092] 「心筋細胞の肥大化を示すマーカー」とは、心筋細胞の肥大化を検出し得る指標を 意味する。具体的には、心筋細胞の肥大化に伴って生じる心筋細胞の変化を、心筋 細胞の肥大化を示すマーカーとして利用できる。心筋細胞の肥大化を示すマーカー として、心筋細胞へのロイシンの取込みの増加、心筋細胞表面積の増加、および心 筋細胞からの心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic peptide ;ANPと 略称することがある）分泌量の増加を好ましく例示できる。 ANPは、正常では心臓の 、特に心房力 分泌されるペプチドホルモンである力 心肥大により心室からも分泌さ れることが知られている。
[0093] 本発明の一態様は、 USPにより、生体外試料または非ヒト哺乳動物において、ュビ キチンィ匕 SLIM 1を脱ュビキチン化する方法、 SLIM 1を安定ィ匕する方法、および心 筋細胞を肥大化する方法に関する。
[0094] 本発明に係るュビキチンィ匕 SLIM1を脱ュビキチンィ匕する方法、 SLIM1を安定ィ匕 する方法、および心筋細胞を肥大化する方法のいずれかにより処理された生体外試 料または非ヒト哺乳動物は、ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻 害する化合物の同定方法に用いることができる。
[0095] 「生体外試料」とは、動物、例えば哺乳動物力 調製された細胞や組織、動物由来 の培養細胞、並びに前記細胞、組織および培養細胞から調製された蛋白質や遺伝 子を含む溶液等の試料を意味する。
[0096] 「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ャ ギ等の哺乳動物を意味する。好ましくはマウスが使用される。
[0097] 本発明に係るュビキチン化 SLIM1を脱ュビキチン化する方法は、インビボ（in viv o)およびインビトロ（in vitro)の 、ずれの条件でも実施できる。例えば、本方法は、 次に示すいずれかの方法で実施できる：（1) SLIM 1の発現が認められた細胞を用 いて、該細胞に USPを発現させる；（2)細胞に、 SLIM1および USPを発現させる； および（3)細胞に、ュビキチン化 SLIM1および USPを発現させる。 SLIM1の発現 および USPの発現は、それぞれ SLIM1をコードする遺伝子を含む適当なベクター および USPをコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学 的手法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。 SLIM1のュビ キチンィ匕は、細胞が有する内在性のュビキチン化機構により行なわれる。ュビキチン 化 SLIM 1の発現は、 SLIM 1をコードする遺伝子を含む適当なベクターとュビキチン をコードする遺伝子を含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこ れらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。細胞は、真核細胞が好ま しい。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株 のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由 来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、 HEK293T細胞を好ましく 例示できる。
[0098] ュビキチン化 SLIM1の脱ュビキチン化の検出は、ュビキチン化 SLIM1量および Zまたは SLIM1量を測定することにより実施できる（実施例 5— 8)。ュビキチン化 SL IM1が脱ュビキチン化されることにより、ュビキチン化 SLIM1からュビキチンが解離 され、ュビキチン化 SLIM 1量が減少する。ュビキチン化 SLIM1量が減少するのに 伴い、プロテアソーム依存的な SLIM1の分解が低減するため、 SLIM1量は増加す ると考えることができる。したがって、ュビキチンィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビキチン 化を、ュビキチンィ匕 SLIM1量および Zまたは SLIM1量を測定することにより検出で きる。
[0099] ュビキチン化 SLIM1量が減少若しくは消失する場合、または、 SLIM1量が増加若 しくは発生する場合には、ュビキチン化 SLIM1が USPにより脱ュビキチンィ匕された と判定できる。例えば、細胞におけるュビキチン化 SLIM1の脱ュビキチン化の検出 は、該細胞力も調製したセルライセート（cell lysate)中のュビキチン化 SLIM1量お よび Zまたは SLIM1量を測定することにより実施できる。セルライセート中のュビキ チン化 SLIM1量が減少若しくは消失する場合、または、セルライセート中の SLIM1 量が増加若しくは発生する場合に、細胞においてュビキチン化 SLIM1が USPにより 脱ュビキチンィ匕されたと判定できる。
[0100] 細胞内のュビキチン化 SLIM1量を測定する場合には、 MG— 132等のプロテアソ ーム阻害剤を含有する培地で該細胞を培養することが好まし 、。プロテアソーム阻害 剤を含有する培地で細胞を培養することにより、ュビキチン化 SLIM1のプロテアソー ムによる分解を抑制できるため、ュビキチン化 SLIM量を正確に測定することができ る。
[0101] 本発明に係る SLIM1を安定化する方法は、 in vivoおよび in vitroのいずれの 条件でも実施できる。例えば、本方法は、次に示すいずれかの方法で実施できる： (1 ) SLIM 1の発現が認められた細胞を用いて、該細胞に USPを発現させる；（2)細胞 に、 SLIM 1および USPを発現させる；および（ 3)ュビキチン化 SLIM 1を発現させた 細胞に USPを発現させる。 SLIM 1の発現および USPの発現は、それぞれ SLIM 1 をコードする遺伝子を含む適当なベクターおよび USPをコードする遺伝子を含む適 当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフエクショ ンすることにより達成できる。 SLIM1のュビキチンィ匕は、細胞が有する内在性のュビ キチン化機構により行なわれる。ュビキチン化 SLIM1の発現は、 SLIM1をコードす る遺伝子を含む適当なベクターとュビキチンをコードする遺伝子を含む適当なベクタ 一とを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすること により達成できる。細胞は、真核細胞が好ましい。真核細胞は、真核生物から調製し た細胞、初代培養細胞、および培養細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動 物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養 細胞株として、 HEK293細胞を好ましく例示できる。
[0102] SLIM1の安定化の判定は、ュビキチン化 SLIM1量および Zまたは SLIM1量を 測定することにより実施できる（実施例 6— 8)。ュビキチン化 SLIM 1量が減少若しく は消失する場合、または、 SLIM1量が増加若しくは発生する場合には、 SLIM1が 安定化されたと判定できる。例えば、細胞における SLIM1の安定ィヒの判定は、該細 胞から調製したセルライセート中のュビキチン化 SLIM 1量および/または SLIM 1 量を測定することにより実施できる。セルライセート中のュビキチン化 SLIM 1量が減 少若しくは消失する場合、または、セルライセート中の SLIM1量が増加若しくは発生 する場合に、細胞において SLIM1が安定ィ匕されたと判定できる。
[0103] ュビキチン化 SLIM1量および Zまたは SLIM1量の測定は、自体公知の蛋白質検 出法により実施できる。蛋白質検出法として、ウェスタンプロット法、免疫沈降法、プ ルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法を例示できる。こ れら方法を単独で用いて、またはこれら方法を組合わせて用いて、所望の蛋白質の 検出を実施できる。ュビキチンおよび/または SLIM1を予め標識しておき、その標 識物質を検出することにより、ュビキチン化 SLIM 1および SLIM 1の検出を容易に実 施できる。標識物質として HA— tagや FLAG— tag等のタグペプチドを好ましく例示 できる。
[0104] 本発明に係る心筋細胞を肥大化する方法は、例えば、心筋細胞に USPを発現さ せることにより実施できる。このとき、 USPと共に SLIM1を発現させることができる。心 筋細胞は、真核生物の心筋力 調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株 のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養心筋細胞を用いる。心筋細 胞は、心室由来の心筋細胞であることが好ましい。哺乳動物の心室由来の培養心筋 細胞として、ラット由来の初代培養心筋細胞を好ましく例示できる。 SLIM1の発現お よび USPの発現は、それぞれ SLIM1をコードする遺伝子を含む適当なベクターお よび USPをコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的 手法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。
[0105] 心筋細胞の肥大化の判定は、心筋細胞の肥大化を示すマーカーを検出することに より実施できる。心筋細胞の肥大化を示すマーカーとして、心筋細胞へのロイシンの 取込みの増加、心筋細胞表面積の増加、および心筋細胞からの ANP分泌量の増加 を好ましく例示できる。心筋細胞へのロイシンの取込みの増加、心筋細胞表面積の 増カロ、および心筋細胞力 の ANP分泌量の増加は、 USPを発現させた心筋細胞ま たは USPと SLIM1とを発現させた心筋細胞と、これらを発現させていない心筋細胞 とを比較することにより判定できる。ロイシンの取込みは、例えば、心筋細胞を [¾]口 イシン含有培養液中で適当な時間培養後、該細胞を可溶ィ匕して放射活性を計測す ることにより測定できる。心筋細胞表面積は、例えば心筋細胞に蛍光物質を発現させ 、該蛍光物質を検出することにより測定できる。 ANP分泌量は、心筋細胞の培養上 清を回収し、該培養上清の ANP量を、市販の ELISA (enzyme linked immunos orbent assay)キットを用いて定量することにより測定できる。 USPを発現させた心 筋細胞または USPと SLIM 1とを発現させた心筋細胞において、これらを発現させて いない心筋細胞と比較して、ロイシンの取込み、心筋細胞表面積、および心筋細胞 力もの ANP分泌量といったマーカーのうち少なくとも 1つのマーカーが増加した場合 、心筋細胞が肥大化したと判定できる。
[0106] 本発明に係るュビキチン化 SLIM1を脱ュビキチンィ匕する方法、 SLIM1を安定ィ匕 する方法、および心筋細胞を肥大化する方法は、非ヒト哺乳動物に USP遺伝子を導 入することにより実施できる。このとき、 USP遺伝子と共に SLIM1遺伝子を非ヒト哺 乳動物に導入することもできる。非ヒト哺乳動物への所望の遺伝子の導入は、遺伝子 の相同組換えにより生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術を利用して実施できる
。このような技術として、マウスの胚性幹細胞を用いて、変異マウスを作製する方法を 例示できる（カぺツチ（Capeccchi M. R. )、「サイエンス（Science)」、 1989年、第 244卷、 p. 1288— 1292)。上記変異マウスの作製方法は、既に一般的に知られて おり、該作製方法に使用された技術 (野田哲生編、「実験医学」、羊土社、 1996年、 増刊、第 14卷、第 20号）に、 USP遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る
[0107] 本発明の一態様は、ュビキチンィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害する 化合物の同定方法に関する。
[0108] ュビキチンィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物の同定方法 は、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を測定できる実験系において 、調べようとする化合物 (被験化合物)存在下、ュビキチン化 SLIM1と USPを接触さ せる工程を含む。例えば、ュビキチン化 SLIM1と USPの相互作用を可能にする条 件下、被験化合物と該ュビキチン化 SLIM1および Zまたは USPを接触させ、次い で、該ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチン化により生じるシグナルおよ び Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカー の存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ュビキチン化 SLIM 1の US Pによる脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物を同定できる。
[0109] 被験化合物がュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害するか否 かの判定は、被験化合物存在下におけるュビキチンィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビ キチンィ匕により生じるシグナルまたは該脱ュビキチンィ匕のマーカーと、被験化合物非 存在下におけるュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕により生じるシグ ナルまたは該脱ュビキチンィ匕のマーカーを比較することにより実施できる。被験化合 物非存在下におけるュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕により生じる シグナルまたは該脱ュビキチンィ匕のマーカーと比較し、被験化合物存在下における ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕により生じるシグナルまたは該脱 ュビキチンィ匕のマーカーが低減または消失する場合、該被験化合物は、ュビキチン 化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害すると判定できる。
[0110] 本発明において、 USPによる脱ュビキチンィ匕により SLIM1の分解 (安定性）が、調 節されている可能性を見出した。すなわち、 SLIM1のュビキチンィ匕およびュビキチ ン化 SLIM 1の脱ュビキチン化を介したプロテアソーム依存的な SLIM 1分解制御機 構が存在し、本機構により細胞内の SLIM 1量および SLIM 1の作用が調節されて ヽ る可能性を見出した。具体的には、 SLIM1のュビキチンィ匕により、ュビキチン化 SLI Mlが生成され、ュビキチン化 SLIM1量が増加する。次いで、該ュビキチン化 SLI Mlはプロテアソームにより認識されてプロテアソーム依存的に分解される。このよう な一連のプロテアソーム依存的な SLIM 1分解機構により、 SLIM 1量は減少すると 考えることができる。一方、ュビキチンィ匕 SLIM1が USPにより脱ュビキチンィ匕される ことにより、ュビキチン化 SLIM1からュビキチンが解離され、ュビキチン化 SLIM1量 が減少する。ュビキチン化 SLIM1量が減少するのに伴い、プロテアソーム依存的な SLIM 1の分解が低減するため、 SLIM 1量は増加すると考えることができる。 [0111] したがって、被験化合物がュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻 害するか否かの判定を、ュビキチン化 SLIM 1量および Zまたは SLIM 1量を測定す ることにより実施できる。具体的には、被験化合物非存在下におけるュビキチン化 SL IM1量と比較し、被験化合物存在下におけるュビキチン化 SLIM1量が増加または 発生する場合、該被験化合物は、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン 化を阻害すると判定できる。また、被験化合物非存在下における SLIM1量と比較し 、被験化合物存在下における SLIM1量が低減または消失する場合、該被験化合物 は、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害すると判定できる。
[0112] ュビキチン化 SLIM1量および Zまたは SLIM1量の測定は、自体公知の蛋白質検 出法により実施できる。蛋白質検出法として、ウェスタンプロット法、免疫沈降法、プ ルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法を例示できる。こ れら方法を単独で用いて、またはこれら方法を組合わせて用いて、所望の蛋白質の 検出を実施できる。ュビキチンおよび/または SLIM1を予め標識しておき、その標 識物質を検出することにより、ュビキチン化 SLIM 1および SLIM 1の検出を容易に実 施できる。標識物質として HA— tagや FLAG— tag等のタグペプチドを好ましく例示 できる。
[0113] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を測定できる実験系は、 in vit roの実験系でもよぐ in vivoの実験系でもよい。本実験系として、本発明に係るュビ キチン化 SLIM1を脱ュビキチン化する方法により処理された生体外試料または非ヒ ト哺乳動物を用いた実験系を例示できる。例えば、次に示す細胞を例示できる：（1) SLIM1の発現が認められた細胞であって、 USPを発現させた細胞；（2) SLIM1お よび USPを発現させた細胞；および（3)ュビキチン化 SLIM1および USPを発現させ た細胞。 SLIM1の発現および USPの発現は、それぞれ SLIM1をコードする遺伝子 を含む適当なベクターおよび USPをコードする遺伝子を含む適当なベクターを用い て慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成 できる。 SLIM1のュビキチンィ匕は、細胞が有する内在性のュビキチン化機構により 行なわれる。ュビキチン化 SLIM1の発現は、 SLIM 1をコードする遺伝子を含む適 当なベクターとュビキチンをコードする遺伝子を含む適当なベクターとを用いて慣用 の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。 細胞は、真核細胞が好ましい。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養 細胞、および培養細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細 胞株、より好ましくはヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、 H EK293T細胞を好ましく例示できる。
[0114] 細胞内のュビキチン化 SLIM1量を測定する場合には、 MG— 132等のプロテアソ ーム阻害剤を含有する培地で該細胞を培養することが好まし 、。プロテアソーム阻害 剤を含有する培地で細胞を培養することにより、ュビキチン化 SLIM1のプロテアソー ムによる分解を抑制できるため、ュビキチン化 SLIM量を正確に測定することができ る。
[0115] ュビキチンィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物の同定方法 を以下に例示する。 SLIM1、 USPおよびュビキチンを共発現させた細胞を用い、該 細胞を被験化合物存在下および被験化合物非存在下で培養する。次いで、細胞か らセルライセートを調製し、該セルライセート中のュビキチンィ匕 SLIM1および/また は SLIM1を検出する。このような実験系において、被験化合物非存在下で検出され るュビキチン化 SLIM1量と比較して、被験化合物存在下で検出されるュビキチンィ匕 SLIM1量が増加または発生する場合には、該被験化合物はュビキチン化 SLIM1 の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害すると判定できる。また、被験化合物非存在下 で検出される SLIM 1量と比較して、被験化合物存在下で検出される SLIM 1量が減 少または消失する場合にも、該被験化合物はュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱 ュビキチンィ匕を阻害すると判定できる。
[0116] 本発明の一態様は、 USPと SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法に関する
[0117] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法は、 USPと SLIM1の結合を 測定できる実験系において、被験化合物存在下、 USPと SLIM 1を接触させる工程 を含む。例えば、 USPと SLIM1の相互作用を可能にする条件下、被験化合物と SL IM1および Zまたは USPを接触させ、次いで、該 SLIM1と該 USPの結合により生じ るシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zま たはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、 USPと SLIM 1の結合を阻害する化合物を同定できる。
[0118] 被験化合物が USPと SLIM1の結合を阻害するか否かの判定は、被験化合物存在 下における USPと SLIM1の結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーと、 被験化合物非存在下における USPと SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Z または該結合のマーカーを比較することにより実施できる。被験化合物非存在下に おける USPと SLIM1の結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーと比較し 、被験化合物存在下における USPと SLIM1の結合により生じるシグナルまたは該結 合のマーカーが低減または消失する場合、該被験化合物は、 USPと SLIM1の結合 を阻害すると判定できる。
[0119] USPと SLIM1の結合の検出は、 自体公知の蛋白質検出法を用いて実施できる。
例えば、 USPと SLIM1を含む複合体を、自体公知の蛋白質検出法で検出すること により、 USPと SLIM1の結合を検出できる。蛋白質の検出方法として、ウェスタンブ ロット法、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー 転移法を例示できる。これら方法を単独で用いて、またはこれら方法を組合わせて用 いて、所望の蛋白質の検出を実施できる。 USPおよび Zまたは SLIM1を予め標識 しておき、その標識物質を検出することにより、 USPと SLIM 1を含む複合体の検出 を容易に実施できる。標識物質として HA— tagや FLAG— tag等のタグペプチドを 好ましく ί列示でさる。
[0120] USPと SLIM1の結合を測定できる実験系は、 in vitroの実験系でもよぐ in viv oの実験系でもよい。本実験系として、本発明に係るュビキチン化 SLIM1を脱ュビキ チンィ匕する方法により処理された生体外試料または非ヒト哺乳動物を用いた実験系 を例示できる。例えば、次に示す細胞を例示できる：（l) SLIMlの発現が認められた 細胞であって、 USPを発現させた細胞；（2) SLIM 1および USPを発現させた細胞； および（ 3)ュビキチン化 SLIM 1および USPを発現させた細胞。 SLIM 1の発現およ び USPの発現は、それぞれ SLIM 1をコードする遺伝子を含む適当なベクターおよ び USPをコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手 法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。 SLIM1のュビキチ ン化は、細胞が有する内在性のュビキチン化機構により行なわれる。ュビキチン化 S LIM 1の発現は、 SLIM 1をコードする遺伝子を含む適当なベクターとュビキチンをコ ードする遺伝子を含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれら を細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。細胞は、真核細胞が好ましい 。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞株のい ずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましくはヒト由来の 培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、 HEK293T細胞を好ましく例示 できる。
[0121] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法を以下に例示する。 SLIM1 および USPを共発現させた細胞を用い、該細胞を被験化合物存在下および被験化 合物非存在下で培養する。次いで、細胞カゝらセルライセートを調製し、該セルライセ ート中の USPと SLIM1を含む複合体を検出することにより、 USPと SLIM1の結合を 検出する。 USPと SLIM1を含む複合体の検出は、 USPおよび SLIM1のうちの一方 の蛋白質を検出し得る抗体を用いて免疫沈降を行い、さらに、他方の蛋白質を検出 し得る抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行うことにより実施できる。このような検 出法において、 USPと SLIM1の共沈降物が検出された場合、 USPと SLIM1とが結 合し、 USPと SLIM 1を含む複合体を形成したと判定できる。このような実験系におい て、被験化合物非存在下で検出される USPと SLIM1の共沈降物の量と比較して、 被験化合物存在下で検出される USPと SLIM1の共沈降物の量が減少または消失 する場合には、該被験化合物は USPと SLIM1の結合を阻害すると判定できる。
[0122] 本同定方法を細胞を用いて実施する場合、 USPによる脱ュビキチンィ匕反応の進行 を阻害するために、 USPのシスティンプロテアーゼ活性に必要な還元剤、例えば、 ジチオスレィトール（DTT)または βメルカプトエタノールを本結合反応液に混在させ ないことが好ましい。
[0123] または、本同定方法を細胞を用いて実施する場合、 USPによる脱ュビキチンィ匕反 応の進行を阻害するために、 USPのシスティンプロテアーゼ活性に必要な部位であ るシスティンを他のアミノ酸、例えばァラニンまたはセリン等に置換した、 USP不活性 型変異体であってュビキチン化 SLIM1と結合する USP変異体を USPの代わりに用 、ることも好まし 、。
[0124] 「USPの不活性型変異体」とは、 USPに、アミノ酸の欠失、置換、付加または挿入 等の変異が導入された USPであって、 USP (野生型の USP)と比較してシスティン プロテアーゼ活性が減弱したまたは消失した USPを意味する。 USPの不活性型変 異体は、天然に存在するものであってもよぐ人工的に変異を導入したものであって もよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術 (ゥ ノレマー（Ulmer K. M. )、 「サイエンス（Science)」、 1983年、第 219卷、 p. 666— 671)を利用して実施できる。変異部位は、 USPのアミノ酸配列において USPのシス ティンプロテアーゼ活性に必要な部位を例示できる。
[0125] USPの不活性型変異体として、 USP15の第 269番目のシスティンをァラニンに置 換した USP 15不活性型変異体、および USP21の第 221番目のシスティンをァラ- ンに置換した USP21不活性型変異体を好ましく例示できる。 USP15の第 269番目 のシスティン、および USP21の第 221番目のシスティンは、それぞれ USP15および USP21のシスティンプロテアーゼ活性部位であり、システィンプロテアーゼ活性に必 須なアミノ酸残基である。
[0126] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法として、また、 GST融合 USP と SLIM1とを in vitroで反応させて、ダルタチオン榭脂を用いたプルダウン法により 両蛋白質の結合を検出する実験系を利用した同定方法を例示できる。両蛋白質の 結合は、ウェスタンプロット法等を用いて検出できる。このような実験系において、被 験化合物存在下で検出される両蛋白質の結合の量が被験化合物非存在下で検出 される結合の量と比較し、低減または消失する場合には、被験化合物は該結合を阻 害すると判定できる。
[0127] また、公知のツーハイブリッド（two— hybrid)法を用いることができる。例えば、 US Pと DNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、 SLIM 1と転写活性ィ匕 蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に 接続した lacZ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入 し、被験化合物存在下でのレポーター遺伝子の発現量と、被験化合物非存在下で のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより達成できる。被験化合物非存在 下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して、被験化合物存在下でのレポーター遺 伝子の発現量が減少する場合、該被験化合物は USPと SLIM 1の結合を阻害する 作用を有すると判定できる。
[0128] 本発明の一態様は、 USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定 方法に関する。
[0129] 本発明において、 USPと SLIM1が結合することを明らかにした（実施例 2、 9およ び 10)。さらに、ュビキチン化 SLIM1が USPにより脱ュビキチン化されることを確認 した（実施例 3および 5— 8)。
[0130] このことから、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化には、 USPと SLI
Mlの結合、および USPとュビキチン化 SLIM1の結合が関与していると考えることが できる。
[0131] SLIM1は細胞内のュビキチン化機構によってュビキチンィ匕され、その結果生成し たュビキチンィ匕 SLIM 1が USPと結合すると考えることができる。結合後、該 USPの システィンプロテアーゼ活性依存的に該ュビキチン化 SLIM 1が脱ュビキチンィ匕する と考えられる。 USPは基質特異性を有することが報告されていることから、 USPはュ ビキチンィ匕 SLIM1のュビキチン部分 (またはその一部）と SLIM1部分 (またはその 一部）の 、ずれをも認識して!/、ると考える。
[0132] 一方、本発明において、 SLIM1が USPと結合することを実証した（実施例 2、 9お よび 10)。このことから、 SLIM1は USPと結合した後、該 SLIM1が細胞内のュビキ チン化機構によってュビキチンィ匕され、その結果生成したュビキチン化 SLIM1から 該 USPのシスティンプロテアーゼ活性依存的にュビキチンが解離する、すなわち、 該ュビキチン化 SLIM1が脱ュビキチンィ匕されると考えることも可能である。
[0133] したがって、 USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害することにより、ュビキチン 化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害できると考える。
[0134] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法は、 USPとュビ キチン化 SLIM1の結合を測定できる実験系において、被験化合物存在下、 USPと ュビキチン化 SLIM 1を接触させる工程を含む。例えば、 USPとュビキチン化 SLIM 1の相互作用を可能にする条件下、被験化合物とュビキチン化 SLIM 1および Zまた は USPを接触させ、次いで、該ュビキチンィ匕 SLIM1と該 USPの結合により生じるシ グナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまた はマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、 USPとュビキチ ン化 SLIM 1の結合を阻害する化合物を同定できる。
[0135] 被験化合物が USPとュビキチンィ匕 SLIM1の結合を阻害する力否かの判定は、被 験化合物存在下における USPとュビキチン化 SLIM1の結合により生じるシグナルま たは該結合のマーカーと、被験化合物非存在下における USPとュビキチンィ匕 SLIM 1の結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーを比較することにより実施でき る。被験化合物非存在下における USPとュビキチン化 SLIM1の結合により生じるシ グナルまたは該結合のマーカーと比較し、被験化合物存在下における USPとュビキ チン化 SLIM1の結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが低減または消 失する場合、該被験化合物は、 USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害すると判 定できる。
[0136] USPとュビキチンィ匕 SLIM1の結合の検出は、自体公知の蛋白質検出法を用いて 実施できる。例えば、 USPとュビキチン化 SLIM1を含む複合体を、自体公知の蛋白 質検出法で検出することにより、 USPとュビキチン化 SLIM 1の結合を検出できる。 蛋白質の検出方法として、ウェスタンプロット法、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハ イブリツド法および蛍光共鳴エネルギー転移法を例示できる。これら方法を単独で用 いて、またはこれら方法を組合わせて用いて、所望の蛋白質の検出を実施できる。 U SPおよび Zまたはュビキチン化 SLIM1を予め標識しておき、その標識物質を検出 することにより、 USPとュビキチン化 SLIM 1を含む複合体の検出を容易に実施でき る。標識物質として HA— tagや FLAG— tag等のタグペプチドを好ましく例示できる
[0137] USPとュビキチンィ匕 SLIM1の結合を測定できる実験系は、 in vitroの実験系でも よぐ in vivoの実験系でもよい。本実験系として、本発明に係るュビキチン化 SLIM 1を脱ュビキチン化する方法により処理された生体外試料または非ヒト哺乳動物を用 いた実験系を例示できる。例えば、次に示す細胞を例示できる：（l) SLIMlの発現 が認められた細胞であって、 USPを発現させた細胞；（2) SLIM1および USPを発現 させた細胞；および（3)ュビキチン化 SLIM1および USPを発現させた細胞。 SLIM1 の発現および USPの発現は、それぞれ SLIM 1をコードする遺伝子を含む適当なベ クタ一および USPをコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子 工学的手法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。 SLIM1 のュビキチンィ匕は、細胞が有する内在性のュビキチン化機構により行なわれる。ュビ キチン化 SLIM1の発現は、 SLIM1をコードする遺伝子を含む適当なベクターとュビ キチンをコードする遺伝子を含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手 法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。細胞は、真核細胞 が好ましい。真核細胞は、真核生物から調製した細胞、初代培養細胞、および培養 細胞株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞株、より好ましく はヒト由来の培養細胞株を用いる。ヒト由来の培養細胞株として、 HEK293T細胞を 好ましく ί列示でさる。
[0138] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法を以下に例示す る。ュビキチンィ匕 SLIM1および USPを共発現させた細胞を用い、該細胞を被験化 合物存在下および被験化合物非存在下で培養する。次いで、細胞カゝらセルライセー トを調製し、該セルライセート中の USPとュビキチン化 SLIM 1を含む複合体を検出 することにより、 USPとュビキチン化 SLIM 1の結合を検出する。 USPとュビキチン化 SLIM 1を含む複合体の検出は、 USPおよびュビキチン化 SLIM1のうちの一方の 蛋白質を検出し得る抗体を用いて免疫沈降を行い、さらに、他方の蛋白質を検出し 得る抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行うことにより実施できる。このような検 出法において、 USPとュビキチン化 SLIM1の共沈降物が検出された場合、 USPと ュビキチン化 SLIM 1とが結合し、 USPとュビキチン化 SLIM 1を含む複合体を形成 したと判定できる。このような実験系において、被験化合物非存在下で検出される U SPとュビキチン化 SLIM1の共沈降物の量と比較して、被験化合物存在下で検出さ れる USPとュビキチン化 SLIM1の共沈降物の量が減少または消失する場合には、 該被験化合物は USPとュビキチン化 SLIM 1の結合を阻害すると判定できる。
[0139] 本同定方法を細胞を用いて実施する場合、 USPによる脱ュビキチンィ匕反応の進行 を阻害するために、 USPのシスティンプロテアーゼ活性に必要な還元剤、例えば、 ジチオスレィトール（DTT)または βメルカプトエタノールを本結合反応液に混在させ ないことが好ましい。
[0140] または、本同定方法を細胞を用いて実施する場合、 USPによる脱ュビキチンィ匕反 応の進行を阻害するために、 USPのシスティンプロテアーゼ活性に必要な部位であ るシスティンを他のアミノ酸、例えばァラニンまたはセリン等に置換した、 USP不活性 型変異体であってュビキチン化 SLIM1と結合する USP変異体を USPの代わりに用 いることも好ましい。 USP不活性型変異体として、 USP15の第 269番目のシスティン をァラニンに置換した USP15不活性型変異体、および USP21の第 221番目のシス ティンをァラニンに置換した USP21不活性型変異体を好ましく例示できる。
[0141] USPとュビキチンィ匕 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法として、また、 GS Τ融合 USPとュビキチン化 SLIM 1とを in vitroで反応させて、ダルタチオン榭脂を 用いたプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する実験系を利用した同定方法を 例示できる。両蛋白質の結合は、ウェスタンプロット法等を用いて検出できる。このよ うな実験系において、被験化合物存在下で検出される両蛋白質の結合の量が被験 化合物非存在下で検出される結合の量と比較し、低減または消失する場合には、被 験化合物は該結合を阻害すると判定できる。
[0142] 本発明の一態様は、ュビキチンィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋 細胞の肥大化を阻害する化合物の同定方法に関する。
[0143] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化による心筋細胞の肥大化を阻 害する化合物の同定方法は、ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕に よる心筋細胞の肥大化を測定できる実験系において、被験化合物存在下、 SLIM1 と USPを接触させる工程を含む。例えば、 SLIM1と USPの相互作用を可能にする 条件下、被験化合物と該 SLIM1および Zまたは USPを接触させ、次いで、心筋細 胞の肥大化により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、こ のシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出するこ とにより、ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細胞の肥大 化を阻害する化合物を同定できる。
[0144] 被験化合物がュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細胞 の肥大化を阻害するか否かの判定は、被験化合物存在下における心筋細胞の肥大 化により生じるシグナルまたは該肥大化のマーカーと、被験化合物非存在下におけ る心筋細胞の肥大化により生じるシグナルまたは該肥大化のマーカーを比較するこ とにより実施できる。被験化合物非存在下における心筋細胞の肥大化より生じるシグ ナルまたは該肥大化のマーカーと比較し、被験化合物存在下における心筋細胞の 肥大化により生じるシグナルまたは該肥大化のマーカーが低減または消失する場合 、該被験化合物は、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細 胞の肥大化を阻害すると判定できる。
[0145] 心筋細胞の肥大化を示すマーカーとして、心筋細胞へのロイシンの取込みの増加 、心筋細胞表面積の増加、および心筋細胞力 の ANP分泌量の増加を好ましく例 示できる。 ANPは、正常では心臓、特に心房力も分泌されるペプチドホルモンである 力 心肥大により心室からも分泌されることが知られている。
[0146] したがって、被験化合物がュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化によ る心筋細胞の肥大化を阻害する力否かの判定を、心筋細胞へのロイシンの取込み 量、心筋細胞表面積、および心筋細胞からの ANP分泌量のうちのいずれか 1以上を 測定することにより実施できる。具体的には、被験化合物非存在下における心筋細 胞へのロイシンの取込み量、心筋細胞表面積、および心筋細胞からの ANP分泌量 と比較して、被験化合物存在下における心筋細胞へのロイシンの取込み量、心筋細 胞表面積、および心筋細胞力 の ANP分泌量が低減または消失する場合、該被験 化合物は、ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細胞の肥 大化を阻害すると判定できる。
[0147] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化による心筋細胞の肥大化を測 定できる実験系として、 SLIM1および USPの発現が確認された心筋細胞、または S LIM 1および Zまたは USPを発現させた心筋細胞を例示できる。 SLIM 1および US Pの他、さらにュビキチンを発現させた心筋細胞を用いることができる。 SLIM1、 US P、およびュビキチンの発現は、それぞれ SLIM 1をコードする遺伝子を含む適当な ベクター、 USPをコードする遺伝子を含む適当なベクター、およびュビキチンをコー ドする遺伝子を含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細 胞にトランスフエクシヨンすることにより達成できる。 SLIM1のュビキチン化は、細胞が 有する内在性のュビキチン化機構により行なわれる。
[0148] 心筋細胞は、真核生物の心筋力 調製した細胞、初代培養細胞、および培養細胞 株のいずれでもあり得る。好ましくは哺乳動物由来の培養心筋細胞を用いる。心筋 細胞は、心室由来の心筋細胞であることが好ましい。哺乳動物の心室由来の培養心 筋細胞として、ラット由来の初代培養心筋細胞を好ましく例示できる。
[0149] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化による心筋細胞の肥大化を阻 害する化合物の同定方法を以下に例示する。 SLIM 1および USPを共発現させたラ ット心筋細胞を用い、該細胞を被験化合物存在下および被験化合物非存在下で培 養する。 SLIM1および USPの発現は、 SLIM1発現用組換えアデノウイルスおよび USP発現用組換えアデノウイルスを用いて達成できる。細胞を培養後、 [ ]口イシ ンを培養液に加えてさらに培養することにより、該細胞に [ ]ロイシンを取り込ませる 。その後、細胞を洗浄して、トリクロ口酢酸 (TCA)で固定し、さらに細胞を洗浄した後 、細胞を可溶ィ匕して、細胞に取り込まれた [ ]ロイシンの放射活性を測定する。この ような実験系にお ヽて、被験化合物非存在下で検出される [3H]ロイシンの放射活性 と比較して、被験化合物存在下で検出される [3H]ロイシンの放射活性が減少または 消失する場合、該被験化合物はュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチン化 による心筋細胞の肥大化を阻害すると判定できる。
[0150] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化による心筋細胞の肥大化を阻 害する化合物の同定方法の別の例を以下に説明する。 SLIM1および USPを共発 現させたラット心筋細胞を用い、該細胞を被験化合物存在下および被験化合物非存 在下で培養する。 SLIM1および USPの発現は、 SLIM1発現用組換えアデノウィル スおよび USP発現用組換えアデノウイルスを用いて達成できる。細胞を培養後、細 胞の画像を取込み、イメージアナリシスソフトにより、細胞表面積を測定する。このよう な実験系において、被験化合物非存在下で検出される細胞表面積と比較して、被験 化合物存在下で検出される細胞表面積が減少する場合、該被験化合物はュビキチ ン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細胞の肥大化を阻害すると判 定できる。 [0151] ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチン化による心筋細胞の肥大化を阻 害する化合物の同定方法の別の例を以下に説明する。 SLIM1および USPを共発 現させたラット心筋細胞を用い、該細胞を被験化合物存在下および被験化合物非存 在下で培養する。 SLIM1および USPの発現は、 SLIM1発現用組換えアデノウィル スおよび USP発現用組換えアデノウイルスを用いて達成できる。細胞を培養後、培 養上清を回収し、培養上清中の ANP量を ELISAキットで測定する。このような実験 系において、被験化合物非存在下で検出される ANP量と比較して、被験化合物存 在下で検出される ANP量が減少または消失する場合、該被験化合物はュビキチン ィ匕 SLIM1の USPによる脱ュビキチンィ匕による心筋細胞の肥大化を阻害すると判定 できる。
[0152] SLIM1、 USP、およびこれらをそれぞれコードする遺伝子は上記例示した各配列 で表されるものに限らず、一般に知られている機能を有する限りにおいて、上記例示 した各配列において 1乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることがで きる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のため に、上記各配列に 1乃至数個の変異を導入した変異体を用いることができる。
[0153] SLIM1および USPは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料 力 調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよぐあるいはこ れらカもさらに精製されたものであってもよい。また、 SLIM1、および USPを遺伝子 工学的手法で発現させた細胞を使用することができる。このような細胞に、さらにュビ キチンを遺伝子工学的手法により発現させた細胞も使用できる。 SLIM1、 USPおよ びュビキチンは、その性質や機能に影響がない限りにおいて、 N末端側や C末端側 に別の蛋白質やポリペプチド、例えば His— tag、 Myc— tag、 HA—tag、 FLAG— t ag、または Xpress— tag等のタグペプチド類、 GST、 β ガラクトシダーゼ、 IgG等 の免疫グロブリン Fc断片を、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、 遺伝子工学的手法等を用いて付加してもよい。 SLIM1、 USPおよびュビキチンの 性質や機能として、 SLIM1とュビキチンの結合、 USPと SLIM1の結合、 USPとュビ キチン化 SLIM 1の結合、 USPのシスティンプロテアーゼ活性、ュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕を例示できる。 [0154] SLIM1、 USP、およびこれらをそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子 の発現が認められる適当な起源 (例えば、心臓や骨格筋等の組織およびこれら組織 由来の細胞)から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得できる。これ ら遺伝子によりコードされる蛋白質は、例えば、それぞれの遺伝子を用いた自体公知 の遺伝子工学的手法により取得できる。例えば、ュビキチン化 SLIM1は、ュビキチ ン化 SLIM 1を発現させた細胞のセルライセートから抗 SLIM 1抗体等を用いて得ら れる免疫沈降物として調製できる。ュビキチン化 SLIM1の発現は、ュビキチンをコー ドする遺伝子を含有する組換えベクターおよび SLIM1をコードする遺伝子を含有す る組換えベクターを自体公知の方法により細胞に導入することにより実施できる。この 場合、細胞内に存在するュビキチン化機構により該細胞内においてュビキチン化 SL IM1が合成される。ュビキチン化機構が存在する細胞として、 HEK293細胞を例示 できる。
[0155] プロテアソームは、プロテアソームを有する細胞力も調製することができる。好ま ヽ 細胞として、ヒト赤血球を例示できる。プロテアノームの調製は、エマ一リッチらの方法 (「ザ ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリー（The Journal of Biologic al Chemistry)」、 2000年、第 275卷、 p. 21140— 21148)に従って実施できる。 あるいは、巿販のプロテアソームを用いることができる。例えば、ァフィユティーリサ一 チプロダクツ社 (AFFINITI Research Products Ltd.、 UK)からプロテアソー ムを St入することができる。
[0156] 被験化合物は、化学ライブラリーや天然物由来の化合物、または SLIM1および U SPの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られたィ匕合物等を例 示できる。あるいは、 USPと SLIM1の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチド の構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被験化合物として好適で ある。
[0157] 本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用いることを 特徴とする、 SLIM1の阻害方法に関する。
[0158] また、本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用いる ことを特徴とする、心筋細胞の肥大化を阻害する方法に関する。 [0159] さらに、本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用い ることを特徴とする、肥大型心筋症の予防および Zまたは治療方法に関する。
[0160] USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物として、ュビキチン化 SLIM1の US Pによる脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物、 USPと SLIMlの結合を阻害する化合物 、 USPとュビキチンィ匕 SLIM 1の結合を阻害する化合物を用いることができる。これら 化合物は、本発明に係る化合物の同定方法により取得できる。
[0161] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物、 USPと SLI M 1の結合を阻害する化合物、および USPとュビキチン化 SLIM 1の結合を阻害す る化合物は、 、ずれもュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害する
[0162] 本発明においては、 SLIM1のュビキチン化、およびュビキチン化 SLIM1の USP による脱ュビキチンィ匕により SLIM1の分解 (安定性）が調節され、該分解の調節によ り SLIM1の作用が阻害されている可能性を見出した。すなわち、 SLIM1のュビキチ ン化およびュビキチン化 SLIM 1の脱ュビキチン化を介したプロテアソーム依存的な SLIM1分解制御機構が存在し、本機構により細胞内の SLIM1量および SLIM1の 作用が調節されている可能性を見出した。具体的には、 SLIM1のュビキチン化によ り、ュビキチン化 SLIM1が生成され、ュビキチン化 SLIM1量が増加する。次いで、 該ュビキチンィ匕 SLIM1はプロテアソームにより認識されてプロテアソーム依存的に 分解される。このような一連のプロテアソーム依存的な SLIM1分解機構により、 SLI Ml量は減少すると考えることができる。一方、ュビキチン化 SLIM1が USPにより脱 ュビキチン化されることにより、ュビキチン化 SLIM1からュビキチンが解離され、ュビ キチン化 SLIM 1量が減少する。ュビキチン化 SLIM1量が減少するのに伴い、プロ テアソーム依存的な SLIM1の分解が低減するため、 SLIM1量は増加すると考える ことができる。
[0163] したがって、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害することによ りプロテアソーム依存的なュビキチン化 SLIM1の分解を促進することができる。該分 解の促進により細胞内 SLIM1量が減少するため、 SLIM 1の作用を低減または消失 させることがでさる。 [0164] このように、 USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物を用いて、 SLIM1の阻 害方法を実施できる。
[0165] SLIM1は肥大型心筋症の発症や進展に関与すると考えられている（非特許文献 7
9)。具体的には、肥大型心筋症患者の心臓で、健常人の心臓に比して、 SLIM1 mRNA量が増加していること、肥大型心筋症のモデルマウスにおいて、コントロー ルマウスに比して、 SLIM1 mRNA量が増加して!/、ることが報告されて 、る（非特許 文献 10— 12)。
[0166] したがって、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害することによ り、 SLIM 1の分解を促進させて SLIM 1量を減少させ、その結果、心筋細胞の肥大 化を阻害することができる。
[0167] また、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害することにより、 SL IM1の分解を促進させて SLIM 1量を減少させ、その結果、心筋細胞の肥大化を阻 害することにより肥大型心筋症の予防および Zまたは治療方法を実施できる。
[0168] このように、 USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物を用いて、心筋細胞の 肥大化を阻害する方法を実施できる。
[0169] また、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用いて、肥大型心筋症の予 防および Zまたは治療方法を実施できる。
[0170] 本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を含有してなる 、 SLIM 1の阻害剤に関する。
[0171] 「阻害剤」とは、阻害効果を有する化合物を意味する。阻害剤として、競合阻害効 果を有する低分子化合物および抗体を例示できる。低分子量化合物とは、ペプチド 、ペプチド様物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機化合物、および無機化合物 が含まれ、その分子量が好ましくは 10000以下、より好ましくは 5000以下、さらに好 ましくは 1000以下、さらにより好ましくは 500以下の化合物を意味する。
[0172] また、本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を含有し てなる、抗心筋細胞肥大化剤に関する。
[0173] 「抗心筋細胞肥大化剤」とは、心筋細胞の肥大化阻害剤、すなわち、心筋細胞の 肥大化を阻害する化合物を意味する。 [0174] また、本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を含有し てなる、抗心筋肥大化剤に関する。
[0175] 「抗心筋肥大化剤」とは、心筋の肥大化阻害剤、すなわち、心筋の肥大化を阻害す る化合物を意味する。
[0176] さらに、本発明の一態様は、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を含有 してなる、肥大型心筋症の予防および Zまたは治療剤に関する。
[0177] USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物として、ュビキチン化 SLIM1の US Pによる脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物、 USPと SLIM1の結合を阻害する化合物 、 USPとュビキチンィ匕 SLIM 1の結合を阻害する化合物を用いることができる。これら 化合物は、本発明に係る化合物の同定方法により取得できる。
[0178] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物、 USPと SLI M 1の結合を阻害する化合物、および USPとュビキチン化 SLIM 1の結合を阻害す る化合物は、 、ずれもュビキチン化 SLIM 1の USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害する
[0179] 本発明においては、 SLIM1のュビキチン化、およびュビキチン化 SLIM1の USP による脱ュビキチンィ匕により SLIM1の分解 (安定性）が調節され、該分解の調節によ り SLIM1の作用が阻害されている可能性を見出した。すなわち、 SLIM1のュビキチ ン化およびュビキチン化 SLIM 1の脱ュビキチン化を介したプロテアソーム依存的な SLIM1分解制御機構が存在し、本機構により細胞内の SLIM1量および SLIM1の 作用が調節されている可能性を見出した。具体的には、 SLIM1のュビキチン化によ り、ュビキチン化 SLIM1が生成され、ュビキチン化 SLIM1量が増加する。次いで、 該ュビキチンィ匕 SLIM1はプロテアソームにより認識されてプロテアソーム依存的に 分解される。このような一連のプロテアソーム依存的な SLIM1分解機構により、 SLI Ml量は減少すると考えることができる。一方、ュビキチン化 SLIM1が USPにより脱 ュビキチン化されることにより、ュビキチン化 SLIM1からュビキチンが解離され、ュビ キチン化 SLIM 1量が減少する。ュビキチン化 SLIM1量が減少するのに伴い、プロ テアソーム依存的な SLIM1の分解が低減するため、 SLIM1量は増加すると考える ことができる。 [0180] したがって、ュビキチンィ匕 SLIMlの USPによる脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物 は、プロテアソーム依存的なュビキチン化 SLIM1の分解を促進することができ、該分 解の促進により細胞内 SLIM1量が減少するため、 SLIM 1の作用を低減または消失 することができる。
[0181] このように、 USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物は、 SLIM1の阻害剤の 有効成分として使用できる。
[0182] SLIM1は肥大型心筋症の発症や進展に関与すると考えられている（非特許文献 7
9)。具体的には、肥大型心筋症患者の心臓で、健常人の心臓に比して、 SLIM1 mRNA量が増加していること、肥大型心筋症のモデルマウスにおいて、コントロー ルマウスに比して、 SLIMl mRNA量が増加して!/、ることが報告されて 、る（非特許 文献 10— 12)。
[0183] した力つて、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および USP33 )によるュビキチンィ匕 SLIMlの脱ュビキチンィ匕を阻害することにより、 SLIM1の分解 を促進させて SLIM1量を減少させ、その結果、心筋細胞の肥大化を阻害することが できる。
[0184] また、ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物は、 SL IM1の分解を促進させて SLIM1量を減少させることができ、その結果、心筋細胞の 肥大化を阻害することにより肥大型心筋症の予防および Zまたは治療に効果を示す と考えることができる。
[0185] このように、 USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物は、抗心筋細胞肥大化 剤の有効成分として使用できる。
[0186] また、 USPの脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物は、肥大型心筋症の予防およ び Zまたは治療剤の有効成分として使用できる。
[0187] USPの脱ュビキチン化活性を阻害する化合物として、ュビキチン化 SLIM1の US
Pによる脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物、 USPと SLIMlの結合を阻害する化合物
、USPとュビキチンィ匕 SLIM 1の結合を阻害する化合物を用いることができる。
[0188] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物として、 USP のシスティンプロテアーゼ活性を低減し得る化合物を例示できる。このような化合物と して、システィンプロテアーゼ阻害剤を例示できる。システィンプロテアーゼ阻害剤は 、 USPのシスティンプロテアーゼ活性を特異的に阻害する阻害剤が好ましい。より好 ましく ίま、 USP15、 USP21、 USP20、 USP22、また ίま USP33のシスティンプロテ ァーゼ活性を特異的に阻害する阻害剤である。さらに好ましくは、 USP15または US P21のシスティンプロテアーゼ活性を特異的に阻害する阻害剤である。 USPのシス ティンプロテアーゼ活性を特異的に阻害するとは、 USPのシスティンプロテアーゼ活 性を強く阻害するが、他の酵素の酵素活性を阻害しないか、弱く阻害することを意味 する。
[0189] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物として、 USP と SLIM 1の結合を阻害する化合物を例示できる。 USPと SLIM 1の結合を阻害する 化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該 結合を特異的に阻害する低分子量ィ匕合物を例示できる。 USPと SLIM1の結合を特 異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しない カゝ、弱く阻害することを意味する。
[0190] ュビキチン化 SLIM1の USPによる脱ュビキチン化を阻害する化合物として、 USP とュビキチン化 SLIM 1の結合を阻害する化合物を例示できる。 USPとュビキチンィ匕 SLIM1の結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化 合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量ィ匕合物を例示できる。 U SPとュビキチン化 SLIM1の結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害す るが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。
[0191] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物として、 USPの不活性型変異体を例示で きる。好ましい不活性型変異体として、 SLIM 1との結合能を有する不活性型変異体 を例示できる。このような不活性型変異体は、野生型の USPと拮抗して SLIM1と結 合することにより、 SLIM1に対する USPの作用を阻害することができる。このような不 活性型変異体は USPと SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法を実施すること により同定できる。
[0192] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物として、 USPの不活性型変 異体を例示できる。好ましい不活性型変異体として、ュビキチン化 SLIM1との結合 能を有する不活性型変異体を例示できる。このような不活性型変異体は、野生型の USPと拮抗してュビキチン化 SLIM 1と結合することにより、ュビキチン化 SLIM 1に 対する USPの作用を阻害することができる。このような不活性型変異体は、 USPとュ ビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することにより同定で きる。
[0193] USPの不活性型変異体として、 USP15の第 269番目のシスティンをァラニンに置 換した USP 15不活性型変異体、および USP21の第 221番目のシスティンをァラ- ンに置換した USP21不活性型変異体を好ましく例示できる。 USP15の第 269番目 のシスティン、および USP21の第 221番目のシスティンは、それぞれ USP15および USP21のシスティンプロテアーゼ活性部位であり、システィンプロテアーゼ活性に必 須なアミノ酸残基である。
[0194] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物として、 USPと SLIM1が結合する部位の アミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。
[0195] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物として、 USPと SLIM1が結 合する部位のアミノ酸配列力 なるポリペプチドを例示できる。
[0196] USPと SLIM1が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、 USP とュビキチン化 SLIM1が結合する部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチドは、蛋白 質間の結合を競合的に阻害することができる。このようなポリペプチドは、 USPまたは SLIM1のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものか ら、 USPと SLIM1の結合または USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害するもの を選択することにより得ることができる。このように特定されたポリペプチドに、 1乃至数 個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範 囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、 USPと SLIM1の結合ま たは USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポ リペプチドは天然に存在するものであってよぐまた人工的に変異を導入したもので あってもよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの 技術（ウルマー（Ulmer K. M. )、「サイエンス（Science)」、 1983年、第 219卷、 p . 666— 671)を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリぺプ チドの基本的な性質 (物性、機能または免疫学的活性等)を変化させな 、と 、う観点 から、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性 アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相 互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成ァ ミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を 伴わない程度に改変することができる。
[0197] 上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。
例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、 1975年および「ペプチド シンテシ ス（Peptide Synthesis)」、インターサイエンス (Interscience)、ニューヨーク（Ne w York) , 1996年）に記載の方法を例示できる力 これらに限らず公知の方法が広 く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例え ば Fmoc法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて所望の ポリペプチドを製造することができる。あるいは遺伝子工学的手法により所望のポリべ プチドを取得することができる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を 宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例 えば大腸菌にトランスフエクシヨンして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次 いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造することが できる。
[0198] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物として、 USPまたは SLIM 1を認識する抗 体であって、 USPと SLIM1の結合を阻害する抗体を例示できる。かかる抗体は、 U SPまたは SLIM1自体、またはこれら蛋白質の断片、好ましくは USPと SLIM1とが 結合する部位のアミノ酸配列力 なるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製 法により得ることができる。
[0199] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物として、 USPまたはュビキチ ン化 SLIM1を認識する抗体であって、 USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害す る抗体を例示できる。かかる抗体は、 USPまたはュビキチン化 SLIM1自体、または これら蛋白質の断片、好ましくは USPとュビキチンィ匕とが結合する部位のアミノ酸配 列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。 [0200] USPと SLIM1の結合を阻害する化合物として、また、 USPの発現を阻害する化合 物を例示できる。
[0201] USPとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する化合物として、また、 USPの発現を 阻害する化合物を例示できる。
[0202] USPの発現を阻害する化合物として、 USP遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを例示できる。また、このような化合物として、 USPの発現を RNA干渉の手法により 低下または消失させ得る siRNA (small interfering RNA)を例示できる。
[0203] 上記化合物および上記阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選 別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら 化合物や阻害剤は、単独で使用することができるし、複数を組合わせて使用すること もできる。上記化合物および上記阻害剤並びに医薬組成物は、肥大型心筋症の防 止および Zまたは治療方法の実施に使用できる。
[0204] 上記化合物および上記阻害剤を医薬組成物として調製する場合、該化合物および 該阻害剤のうち少なくともいずれか 1つを有効成分としてその有効量含む医薬として 製造できる。通常は、該有効成分に加えて 1種または 2種以上の医薬用担体を含む 医薬組成物として製造することが好まし 、。
[0205] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される 。通常、約 0. 00001〜70重量％、好ましくは 0. 0001〜5重量％程度の範囲とする のが適当である。
[0206] 医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、 結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得 られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
[0207] より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコ ール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ-ルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性 デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、ァラビ ァゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリ コール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン 、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等を例示できる。これらは、本医薬組成物の 剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合わせて使用される。
[0208] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺 菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、および pH調整剤等を適宜使用 することができる。
[0209] 安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等 を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこ の組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。 Lーァミノ 酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい
。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単 糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース
、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒ アルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等の 、ずれでもよ 、。セルロース誘 導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセル ロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カノレボキ シメチルセルロースナトリウム等の!/、ずれでもよ!/、。
[0210] 界面活性剤も特に限定はなぐイオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤 のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソル ビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノ ァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
[0211] 緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸およ び Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム 塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等を例示できる。
[0212] 等張化剤は、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
[0213] キレート剤は、ェデト酸ナトリウム、クェン酸等を例示できる。
[0214] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍 結乾燥ィ匕し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等 で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することができる。
[0215] 医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、 投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬 の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適 当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g乃至 lOOmg程度、好ましくは 約 0.： L g乃至 lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野にお いてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更 を行うことができる。上記投与量は 1日 1回乃至数回に分けて投与することができ、数 日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよ 、。
[0216] 本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよぐあ るいは目的の疾患の防止および Zまたは治療に必要な他の化合物または医薬と共 に使用してもよい。例えば、他の肥大型心筋症の防止および Zまたは抗治療剤の有 効成分等を配合してもよい。
[0217] 投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合 、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通 常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることが できる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投 与を実施することができる。
[0218] 投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、 丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製 剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等 の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与 経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤 、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分 類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
[0219] さらに本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、 USP、該 USPをコ ードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、および該ベクターを導入して なる形質転換体のうち少なくともいずれか 1つと、 SLIM1、 SLIM1をコードする遺伝 子、該遺伝子を含有する組換えベクター、および該ベクターを導入してなる形質転換 体のうち少なくともいずれ力 1つを含む試薬キットであり得る。好ましくは SLIM1のュ ビキチン化に必要な酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有するべクタ 一、該ベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか 1つを含む。また、本 試薬キットは、 SLIM1、 SLIM 1をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えべ クタ一および該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくともいずれか 1つ と、ュビキチン、ュビキチンをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター および該組換えベクターを含有する形質転換体のうち少なくとも!/ヽずれか 1つと、プロ テアノームとを含んでなる試薬キットであり得る。本試薬キットは、例えば本発明に係 る化合物の同定方法に使用できる。
[0220] USP、 SLIM1、およびュビキチンは、上述の製造方法により取得できる。また、各 遺伝子、組換えベクターおよび形質転換体は、上述の遺伝子工学的手法により調製 することができる。プロテアソームは、上述の製造方法により調製することができるし、 また、市販のプロテアソームを用いることができる。本試薬キットは、上記同定方法に おいて用いるシグナルおよび Zまたはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる 物質を含むことができる。さらに、安定化剤および Zまたは防腐剤等の物質を含んで いてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を 導入すればよい。
[0221] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。
実施例 1
[0222] (USP15と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
USP15と相互作用する機能を有する蛋白質を、特許文献 1に記載の予測方法に 従って予測した。すなわち、 USP15のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分 解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配 列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質と USP15との間で口 一力ルァライメントを行い、ローカルァライメントのスコアの高いものを USP15と相互 作用すると予測した。
[0223] 解析の結果、 USP 15と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、 SLI Mlを見出した（図 1)。 SLIM1のアミノ酸配列（配列番号 2)中には、 USP15のァミノ 酸配列（配列番号 4)由来のオリゴペプチド、 MGDQNV (配列番号 15)、 CPECAK (配列番号 17)、および TASEDQ (配列番号 19)とそれぞれ相同性のあるオリゴぺ プチド、 AGDQNV (配列番号 16)、 CPDCAK (配列番号 18)、および TAVEDQ ( 配列番号 20)が存在することが分力つた（図 1)。
実施例 2
[0224] (SLIM1と USP15の結合）
SLIM 1が USP 15と結合するか否かを、ファーウェスタンブロット法による in vitro 結合試験、および、細胞内共発現系を用いた細胞内結合試験で検討した。
[0225] <材料およびその調製 >
ヒト USP15 cDNAは、かずさ DNA研究所から得たクローン KIAA0529を用い た。ヒト SLIM1 cDNAは、ジーンストーム（GeneStorm、 Invitrogen社）のクローン RG000895を用いた。
[0226] 大腸菌用 N末端 6 X His融合 USP15 (以下、 His— USP15と称する）発現プラスミ ドは、 USP15 cDNAを pDESTベクター（Invitrogen社製）に組込むことにより作 製した。大腸菌用 N末端 GST融合 SLIM1 (以下、 GST— SLIM1と称する）発現プ ラスミドは、 SLIM1 cDNAを pGEX— 4T— 1ベクター（Amersham社製）に組込む ことにより作製した。動物細胞用 C末端 V5— His融合 USP15 (以下、 USP15— V5 —Hisと称する）発現プラスミドは、 USP15 cDNAを pcDNA4ZV5—Hisベクター (Invitrogen社製）に組込むことにより作製した。動物細胞用 N末端 His— Xpress融 合 SLIM1 (以下、 His—Xpress— SLIMlと称する）発現プラスミドは、 SLIM1 cD NAを pcDNA3. 1 /Hisベクター（Invitrogen社製）に組込むことにより作製した。
[0227] <方法 >
in vitro結合試験（ファーウェスタンブロット法）
His— USP15は、大腸菌用 N末端 6 X His融合 USP15発現プラスミドをトランスフ ェクシヨンした大腸菌で発現誘導後、タロン メタルァフィユティーレジン (TALON Metal Affinity Resin)を用いて精製したものを使用した。 GST— SLIM 1および GSTは、これらの発現プラスミドをそれぞれトランスフエクシヨンした大腸菌で発現誘 導後、ダルタチオンセファロース (Amersham社製)を用いて精製したものを使用し た。ニトロセルロース膜に の GSTまたは GST— USP15をドットブロットし、風乾 後、 5 gの His— USP15溶液に浸し、 4°Cで一晩振とうして反応させた。コントロー ルとして、 His— USP15溶液を用いる代わりにバインディングバッファー（Tween20 を含むトリス緩衝生理食塩水；以下、 TBSTと略称する）を用いて、 GSTまたは GST —USP15をドットブロットした-トロセルロース膜を同様に処理した。翌日、ニトロセル ロース膜を洗浄してブロッキングした後、抗 His抗体 (Amersham社製）および HRP 標識された抗マウス IgG抗体を用いて蛋白質の検出を行った。
細胞内結合試験 (細胞内共発現 ·免疫沈降法）
HEK293T細胞に、 His— Xpress— SLIMl発現プラスミド 5 μ gおよび USP15 —V5— His発現プラスミド 5 μ gをリポフエクトァミン 2000 (Lipofectamine2000、 I nvitrogen社製）を用いてトランスフエクシヨンした。コントローノレとして、 His— Xpress — SLIM1発現プラスミド 5 gのみをトランスフエクシヨンした細胞を作成した。このと き、 DNAの総量が ΙΟ /z gとなるように pcDNA3. l/Hisベクターにて調整した。 48 時間培養後、セルスクレーパーで細胞を 15ml遠心管に回収した後、 lOOOrpmで 5 分間遠心処理し、上清を除去した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（以下、 PBSと略称 する） 3mlにて洗浄した後、 lOOOrpmで 5分間遠心処理し、細胞を回収した。細胞に I X細胞溶解バッファー（Cell Lysis Bufferゝ Cell Signaling社製） 0. 3mlをカロ え、ピペッティングにて混合し、氷中で 20分間インキュベーションした。マイクロチュー ブに移した後、 15000rpmで 20分間遠心処理して不溶性画分を除去し、上清をセ ルライセート（Cell lysate)として用いた。各セルライセート 40 μ 1に 5 X SDSサン プルバッファーを 10 μ 1加え、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gra dient Gel)に展開し、抗 V5抗体（Invitrogen社製）またはォムニプローブ（Omni Probe)抗体（Santa Cruz社製）を用いたウェスタンブロッテイングで各蛋白質の発 現を確認した。また、各セルライセート（250 μ 1)に抗 V5抗体を 3 μ g添加し、 4°Cで ー晚転倒混和した後、プロテイン G セファロース (Amersham社製）を 15 1添加し 、再度 4°Cで一晩転倒混和した。遠心によりレジンを回収し、 I X細胞溶解バッファー
500 μ 1で 3回洗浄後、 2 X SDSサンプルバッファーを 20 μ 1加え、煮沸処理して氷 冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel)に展開し、 Omni Probe抗体を 用いてウェスタンブロッテイングを行った。 [0229] <結果 >
in vitro結合試験（ファーウェスタンブロット法）
GSTおよび GST— SLIM1をドットブロットしたメンブレンを His— USP15を含む溶 液に浸して反応させた結果、 GST— SLIM1をドットブロットした位置に抗 His抗体に より強いシグナルが検出された（図 2)。これに対し、 His— USP 15を含む溶液の代わ りに、バインディングバッファーを用いたときには、このようなシグナルはほとんど検出 されなかった。また、 GSTをドットブロットした位置には、 His— USP 15を含む溶液お よびバインディングバッファーのいずれを用いたときも、このようなシグナルはほとんど 検出されなかった。
[0230] 抗 His抗体により検出された上記シグナルは、 GST—SLIM1と His—USP15が結 合したことを示すシグナルである。本結果から、 SLIM1と USP15が in vitroで結合 することが判明した。
[0231] 細胞内結合試験 (細胞内共発現 ·免疫沈降法）
USP15-V5- Hisおよび His - Xpress - SLIM 1を共発現させた細胞から調製 したセルライセートでは、抗 V5抗体による免疫沈降および Omni Probe抗体を用い たウェスタンブロッテイングの結果、 USP 15-V5- Hisと His—Xpress— SLIM 1と の共沈降を示すバンドが検出された（図 3の上パネル)。これに対し、 His -Xpress SLIM1のみを発現させた細胞力 調製したセルライセートでは、抗 V5抗体による 免疫沈降および Omni Probe抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果、このよ うなバンドはほとんど検出されなかった（図 3の上パネル)。用いたセルライセート中の His—Xpress— SLIMlの量は、 His—Xpress— SLIM1のみを発現させた細胞、 および His—Xpress— SLIM 1と USP 15— V5— Hisを共発現させた細胞で、ほぼ 同等であった（図 3の下パネル）。また、 His— Xpress— SLIM1と USP15— V5— Hi sを共発現させた細胞における USP15— V5— Hisの一過性発現は、抗 V5抗体を用 V、たウェスタンブロッテイングで確認された（図 3の中パネル）。
[0232] USP15— V5— Hisと His— Xpress— SLIM1との共沈降が検出されたことから、 U SP15と SLIM1が細胞内において結合することが判明した。
実施例 3 [0233] (SLIM 1のュビキチン化）
SLIM1のュビキチンィ匕を、細胞内共発現系を用いた細胞内試験で検討した。
[0234] <材料およびその調製 >
N末端 FLAG融合ュビキチン (以下、 FLAG— Ubと略称する)発現プラスミドは、 F LAG— tagコード配列を挿入したヒトュビキチン cDNAを pDNA3. 1 (Invitrogen 社製）に組込むことにより作製した。 His— Xpress— SLIM1発現プラスミドは、実施 例 2に記載の方法と同様の方法で作製した。
[0235] <方法 >
HEK293細胞に His— Xpress— SLIM1発現プラスミド 3 μ gおよび FLAG— Ub 発現プラスミド 3 μ gをフュージーン 6 (FuGene6、 Roche社製）を用いてトランスフ ェクシヨンした。コントロールとして、 His— Xpress— SLIM1発現プラスミド 3 gの み、または FLAG— Ub発現プラスミド 3 gのみをトランスフエクシヨンした細胞を作 成した。このとき、 DNAの総量が となるように pcDNA3. 1ベクターまたは pcDN A3. lZHisベクターにて調整した。 24時間培養後、培地をプロテアソーム阻害剤で ある MG— 132 (Calbiochem社製）を 20 μ Μ含有する培地に置換し、さらに 48時間 培養した。その後、セルスクレーパーで細胞を回収して洗浄し、細胞に I X細胞溶解 バッファー 0. 4mlを加え、ピペッティングにて混合し、氷中で 20分間インキュベー シヨンした。マイクロチューブに移した後、 15000rpmで 20分間遠心処理して不溶性 画分を除去し、上清をセルライセートとして用いた。各セルライセート 40 μ 1に 5 X S DSサンプルバッファーを 10 1加え、煮沸処理して氷冷後、 SDS-PAGE (5- 20 % Gradient Gel)に展開し、抗 Xpress抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行 い、 SLIM1の検出を行った。また、各セルライセート 300 1にプロテイン G セファ ロース 15 1を添加し、 4°Cで 1時間転倒混和した後、遠心処理して上清を回収した 。次いで Omni Probe抗体を 3 μ g添加し、 4°Cでー晚転倒混和した後、プロテイン G セファロース 15 1を添カ卩し再度 4°Cで 1時間混和した。遠心処理によりレジンを 回収し、 1 X細胞溶解バッファー 500 μ 1で 3回洗浄後、 2 X SDSサンプルバッファ 一を 20 1カ卩え、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel) に展開し、抗 FLAG抗体（Sigma社製）を用いてウェスタンブロッテイングを行い、ュ ビキチンィ匕された SLIM 1を検出した。
[0236] <結果 >
His—Xpress— SLIM 1と FLAG— Ubを共発現させた細胞から調製したセルライ セートでは、 Omni Probe抗体による免疫沈降および抗 FLAG抗体によるウェスタ ンブロッテイングの結果、 His - Xpress- SLIM 1または FLAG - Ubより高分子領域 にラダー状のバンドが強く検出された（図 4の上パネル)。これに対し、 His -Xpress — SLIM1または FLAG— Ubを発現させた細胞力 調製したセルライセートでは、こ のようなバンドはほとんど検出されなかった（図 4の上パネル)。用いたセルライセート 中の His— Xpress - SLIM 1の量は、 His— Xpress- SLIM 1のみを発現させた細 胞、および His— Xpress— SLIM1と FLAG— Ubを共発現させた細胞で、ほぼ同等 であった（図 4の下パネル）。
[0237] His— Xpress— SLIM1と FLAG— Ubを共発現させた細胞から調製したセルライ セートで検出されたバンドは、抗 FLAG抗体により SLIM1より高分子量側に検出さ れたことから、 FLAG— Ubが結合した His— Xpress— SLIM1を示すバンドであると 考える。また、バンドがラダ一状であることから、 His— Xpress— SLIM1には 1以上 の FLAG— Ubが結合したと考えられる。
[0238] 本結果から、 SLIM 1がュビキチン化されることが判明した。
実施例 4
[0239] (SLIM 1のプロテアソーム依存的な分解）
SLIM 1の分解がプロテアソーム依存的であることを、プロテアソーム阻害剤を用い て、細胞内共発現系を用いた細胞内試験で検討した。
[0240] <材料およびその調製 >
C末端 V5— His融合 LacZ (以下、 LacZ— V5— Hisと略称する)発現プラスミドは、 LacZ cDNAを pcDNA4/V5— Hisベクターに組込むことにより作製した。 His— Xpress— SLIM1発現プラスミドは実施例 2に記載の方法と同様の方法で作製した。
[0241] <方法 >
HEK293細胞に His— Xpress— SLIM1発現プラスミド 0. 5 gと LacZ— V5— His発現プラスミド を FuGene6を用いてトランスフエクシヨンした。 48時間培養 後、培地をプロテアソーム阻害剤である MG— 132 (Calbiochem社製）を 20 μ Μ含 有する培地に置換し、さらに一晩培養した後、細胞を回収した。なお、 MG— 132未 処理の場合は、 MG— 132を含有する培地中のジメチルスルホキシド（以下、 DMS Οと略称する）量と等量の DMSOを培地に添加した。次いで、細胞に I X細胞溶解 バッファー 0. 2mlを加え、ピペッティングにて混合し、氷中で 20分間インキュベー シヨンした。マイクロチューブに移した後、 15000rpmで 20分間遠心処理して不溶性 画分を除去し、上清をセルライセートとして用いた。各セルライセートの蛋白質総量を 、ビーシーエー プロテイン アツセィ キット（BCA Protein Assay kit、 PIERC E社製）にて定量し、各セルライセートの蛋白質濃度が 1 μ ξΖ μ 1になるように 1 X細 胞溶解バッファーで希釈した。各セルライセート 40 μ 1に 5 X SDSサンプルバッファ 一を 10 1カ卩え、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel) に展開し、 Omni Probe抗体および抗 V5抗体を用いてウェスタンブロッテイングを 行い、 SLIM1および LacZを検出した。また、内在性蛋白質ダリセルアルデヒド 3 ホスフェート デヒドロゲナーゼ（GAPDH)を、抗 GAPDH抗体を用いたウェスタン ブロッテイングを行って検出することにより、本実験に用いた各セルライセートの蛋白 質量が一定である力否かの確認を行った。
[0242] <結果 >
MG— 132処理した細胞力 調製したセルライセートでは、 MG— 132未処理の細 胞から調製したものと比較して、 Omni Probe抗体を用いたウェスタンブロッテイング により、 His—Xpress— SLIMlを示すバンドが強く検出された（図 5の上パネル）。こ れに対し、いずれのセルライセートでも、抗 V5抗体を用いたウェスタンブロッテイング により検出された LacZ— V5— Hisを示すバンドはほぼ同じ強さであった（図 5の中パ ネル)。抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより検出された内在性蛋 白質 GAPDHを示すバンド力 MG— 132処理した細胞および MG— 132未処理の 細胞でほぼ同じ強さであったことから、本実験に用いた各セルライセートの蛋白質量 が一定であることが確認できた（図 5の下パネル)。
[0243] 上記のように、プロテアソーム阻害剤により、細胞内 SLIM1量が増加することが判 明した。 [0244] 本結果から、 SLIM1がプロテアソーム依存的に分解されることが明らかになった。 すなわち、プロテアソーム阻害剤によりプロテアノームの蛋白質分解機能が阻害され 、その結果、プロテアソーム依存的な SLIM1の分解が阻害されて、細胞内 SLIM1 量が増加したと考えることができる。
実施例 5
[0245] (ュビキチン化 SLIM 1の USP 15による脱ュビキチン化）
ュビキチン化 SLIM 1の USP 15による脱ュビキチン化を、細胞内共発現系を用 ヽ た細胞内試験で検討した。
[0246] <材料およびその調製 >
USP15不活性型変異体の発現プラスミドを作製した。 USP15不活性型変異体と して、 USP15のプロテアーゼ活性に必須と示唆される第 269番目のシスティンをァ ラニンに置換した変異体 (以下、 USP15 (C269A)と略称する）を用いた。具体的に は、 C末端 V5— His融合 USP15 (C269A) (以下、 USP15 (C269A)— V5— His と略称する)発現プラスミドは、 USP15のアミノ酸配列内第 269番目のシスティンをコ ードするコドンをァラニンをコードするコドンに置換した cDNAを pcDNA4/V5— Hi sベクターに糸且込むことにより作製した。
[0247] His— Xpress— SLIM1発現プラスミド、 FLAG— Ub発現プラスミド、および USP1 5— V5— His発現プラスミドは、実施例 2または 3に記載の方法と同様の方法で作製 した。
[0248] <方法 >
HEK293T細胞に His— Xpress— SLIM1発現プラスミド 3 g、 FLAG— Ub発 現プラスミド 3 g、 USP15— V5— His 3 g、および USP15 (C269A)— V5— His 3 μ gを、様々な組み合わせで、 FuGene6を用いてトランスフエクシヨンした。こ のとき、 DNAの総量が 9 ;z gとなるように pcDNA3. 1ベクターまたは pcDNA4/V5 Hisベクターにて調整した。 24時間培養後、培地をプロテアソーム阻害剤である M G- 132 (Calbiochem社製）を 20 μ Μ含有する培地に置換し、さらに 48時間培養 後、細胞を回収した。次 、で、細胞に 1 X細胞溶解バッファー (Cell Signaling社製 ) 0. 4mlをカ卩え、ピペッティングにて混合し、氷中で 20分間インキュベーションした。 マイクロチューブに移した後、 15000rpmで 20分間遠心処理して不溶性画分を除去 し、上清をセルライセートとして用いた。各セルライセート 40 μ 1に 5 X SDSサンプル バッファーを 10 μ 1加え、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradien t Gel)に展開し、抗 Xpress抗体および抗 V5抗体を用いてウェスタンブロッテイング を行い、 SLIM1および USP15の検出を行った。また、各セルライセート 300 μ 1に プロテイン G セファロース 30 1を添カ卩し、 4°Cで 1時間転倒混和した後、遠心処理 し上清を回収した。これに Omni Probe抗体を 3 μ g添加し、 4°Cでー晚転倒混和し た後、プロテイン G セファロース 30 1を添カ卩し再度 4°Cで 1時間混和した。遠心処 理によりレジンを回収し、 1 X細胞溶解バッファー 500 μ 1で 3回洗浄後、 2 X SDS サンプルバッファーを 20 μ 1加え、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel)に展開し、抗 FLAG抗体（Sigma社製）を用いてウェスタンブロッテ イングを行 、、ュビキチン化された SLIM1を検出した。
<結果 >
His -Xpress SLIM 1と FLAG— Ubを共発現させた細胞から調製したセルライ セートでは、高分子領域にラダー状のバンドが検出された（図 6の上パネル)。これに 対し、 His - Xpress - SLIM 1と FLAG - Ubに加えて USP 15— V5— Hisをさらに 共発現させた細胞力も調製したセルライセートでは、このような高分子領域のバンド が著しく減少した（図 6の上パネル）。一方、 His— Xpress— SLIM1と FLAG— Ub にカロえて USP15 (C269A)— V5— Hisを共発現させた細胞から調製したセルライセ ートでは、高分子領域のバンドの減少がほとんど認められなかった（図 6の上パネル） 。 His—Xpress— SLIM1または FLAG— Ubを発現させた細胞から調製したセルラ イセートでは、高分子領域のバンドはほとんど検出されな力つた（図 6の上パネル)。 用 、たセルライセート中の His— Xpress - SLIM 1の量は、 His— Xpress - SLIM 1 のみを発現させた細胞、 His -Xpress SLIM 1と FLAG— Ubを共発現させた細胞 、 His— Xpress— SLIM 1、 FLAG— Ub、および USP15— V5— Hisまたは USP1 5 (C269A) V5— Hisを共発現させた細胞のいずれの細胞についても、ほぼ同等 であった（図 6の中パネル）。また、 His— Xpress— SLIM1と USP15— V5— Hisま たは USP15 (C269A)—V5— Hisとを共発現させた細胞において、 USP15— V5 — Hisまたは USP15 (C269A)— V5— Hisが発現されていることが確認された（図 6 の下パネル）。
[0250] 高分子領域に検出されたラダー状のバンドは、ポリュビキチン化された SLIM1を示 す (実施例 3参照)。 USP15の発現によりこのような高分子領域のバンドが著しく減少 したことから、 USP 15はュビキチン化 SLIM 1量を減少させると考える。また、 USP1 5不活性型変異体である USP15 (C269A)を USP15の代わりに発現させたときに は、高分子領域のバンドの減少がほとんど認められな力つたことから、 USP15による ュビキチンィ匕 SLIM 1量の減少は、 USP 15の脱ュビキチンィ匕活性に依存的であるこ とが判明した。
[0251] 本結果から、 USP 15はュビキチン化された SLIM 1を脱ュビキチン化させることが 明らかになった。
実施例 6
[0252] (USP15による SLIM1の安定化）
ュビキチン化 SLIM1が USP15により脱ュビキチン化されることにより SLIM1のプ 口テアソーム依存的な分解が抑制されるか否かについて検討した。この検討により、 USP15による SLIM1安定ィ匕の可能性が明らかになる。具体的には、以下に示すよ うに細胞内共発現系を用 、た細胞内試験を用いて、細胞内の SLIM 1量に対する U SP15の一過性過剰発現の影響について検討した。
[0253] <材料およびその調製 >
His—Xpress— SLIMl発現プラスミド、 USP15—V5— His発現プラスミド、およ び USP15 (C269A)—V5— His発現プラスミドは、実施例 2または実施例 5に記載 の方法と同様の方法で作製した。
[0254] <方法 >
HEK293細胞に、 USP15—V5— His発現プラスミド 2 gまたは USP15 (C26 9A) V5— His発現プラスミド 2 μ gと、 His—Xpress— SLIMl発現プラスミド 0. 5 μ gとを、 FuGene6を用いてトランスフエクシヨンした。コントロールとして、 His— Xp ress— SLIMl発現プラスミドのみをトランスフエクシヨンした細胞を作成した。このとき 、 DNAの総量が 2. 5 iu gとなるょぅにpcDNA4/V5—Hisべクターにて調整した。 4 8時間培養後に細胞を回収し、細胞に I X細胞溶解バッファー 0. 3mlをカ卩え、ピぺ ッティングにて混合し、氷中で 20分間インキュベーションした。 15000rpmで 20分間 遠心処理して不溶性画分を除去し、上清をセルライセートとして用いた。各セルライ セートの蛋白質総量を BCA Protein Assay kit (PIERCE社製）にて定量し、各 セルライセートの蛋白質濃度が 1. 5 g/ 1になるように 1 X細胞溶解バッファーで 希釈した。各セルライセート 40 μ 1に 5 X SDSサンプルバッファーを 10 μ 1加え、煮 沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel)に展開し、抗 Xpres s抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行ない、 USP15または USP15 (C269A) の共発現により SLIM1量に変化が認められる力否力検討した。また、抗 V5抗体を用 いたウェスタンブロッテイングにより、 USP15— V5— Hisまたは USP15 (C269A) - V5— Hisの発現を確認した。さらに、抗 GAPDH抗体を用いてウェスタンブロッティ ングを行い、内在性蛋白質 GAPDHを検出することにより、本実験に用いた各セルラ イセートの蛋白質量が一定である力否かの確認を行った。
<結果 >
His - Xpress - SLIM 1と USP15— V5— Hisを共発現させた細胞から調製したセ ルライセートでは、 His—Xpress— SLIMlのみを発現させた細胞から調製したもの と比較して、 His— Xpress— SLIM1量の著しい増加が認められた（図 7)。これに対 し、 His— Xpress— SLIM1と USP15 (C269A)—V5— Hisを共発現させた細胞か ら調製したセルライセートでは、 His— Xpress— SLIM1量の増加の程度は低かった 。 His—Xpress— SLIMlとUSP15—V5— Hisを共発現させた細胞、および His— Xpress— SLIM1と USP15 (C269A)— V5— Hisを共発現させた細胞において、 USP15— V5— Hisおよび USP15 (C269A)—V5— Hisそれぞれの発現力 抗 V5 抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された。また、 His— Xpress— SLI M 1のみを発現させた細胞、および His—Xpress— SLIM 1と USP 15— V5— Hisま たは USP15 (C269A)—V5— Hisとを共発現させた細胞力も調製した各ライセート において、抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより検出された内在 性蛋白質 GAPDHの量がほぼ同等であった。このことから、本実験に用いた各セル ライセートの蛋白質量が一定であることが確認された。 [0256] 上記のように、 USP15により SLIM1量が著しく増加したのに対し、 USP15不活性 型変異体では SLIM1量の増加程度が低力つたことから、 USP15の脱ュビキチンィ匕 活性依存的に SLIM 1量が増加することが明らかになつた。
[0257] 本結果から、 USP15によりュビキチン化 SLIM1が脱ュビキチン化され、その結果
、 SLIM1のプロテアソーム依存的な分解が抑制されて、 SLIM1の安定性が増加し、
SLIM 1量が増加すると考える。
実施例 7
[0258] (USP21による SLIM1の安定化）
ュビキチン化された SLIM1が USP21により脱ュビキチン化されることにより SLIM 1のプロテアソーム依存的な分解が抑制される力否かについて検討した。この検討に より、 USP21による SLIM1安定ィ匕の可能性が明らかになる。具体的には、以下に示 すように細胞内共発現系を用 、た細胞内試験を用 、て、細胞内の SLIM 1量に対す USP21の一過性過剰発現の影響について検討した。
[0259] <材料およびその調製 >
N末端 HA融合 USP21 (以下、 HA— USP21と略称する)発現プラスミドは、 USP 21 cDNAの 5'側に HA— tagコード配列を挿入した cDNAを pCIベクター（Clontec h社製）に組込むことにより作製した。また、 USP21不活性型変異体の発現プラスミド を作製した。 USP21不活性型変異体として、 USP21のプロテアーゼ活性に必須と 示唆される第 221番目のシスティンをァラニンに置換した変異体（以下、 USP21 (C 221A)と略称する）を用いた。具体的には、 N末端 HA融合 USP21 (C221A) (以 下、 HA— USP21 (C221A)と略称する）発現プラスミドは、 USP21のアミノ酸配列 内第 221番目のシスティンをコードするコドンをァラニンをコードするコドンに置換し た cDNAを pCIベクター（Clontech社製）に組込むことにより作製した。 His— Xpres s— SLIM1発現プラスミドは、実施例 2に記載の方法と同様の方法で作製した。
[0260] <方法 >
HEK293細胞に、 HA—USP21発現プラスミドまたは HA—USP21 (C221A)発 現プラスミドと、 His—Xpress— SLIMl発現プラスミドとをトランスフエクシヨンした。コ ントロールとして、 His—Xpress— SLIM1発現プラスミドのみをトランスフエクシヨンし た細胞を作成した。 48時間培養後に細胞を回収した後、実施例 6に記載の方法と同 様の方法でセルライセートを調製し、さらに、各セルライセートの蛋白質濃度が 1. 5 gZ 1になるように I X細胞溶解バッファーで希釈した。各セルライセートを、実施 例 6に記載の方法と同様の方法で SDS— PAGEに展開し、抗 Xpress抗体を用 ヽて ウェスタンブロッテイングを行ない、 USP21または USP21 (C221A)の共発現により SLIM1量に変化が認められるか否力検討した。また、抗 HA抗体を用いたウェスタン ブロッテイングにより、 HA— USP21または HA— USP21 (C221A)の発現を確認し た。さらに、抗 GAPDH抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、内在性蛋白質 GAPDHを検出することにより、本実験に用いた各セルライセートの蛋白質量が一定 であるか否かの確認を行った。
[0261] <結果 >
His - Xpress - SLIM 1と HA— USP21を共発現させた細胞から調製したセルラ イセートでは、 His— Xpress— SLIM1のみを発現させた細胞から調製したものと比 較して、 His—Xpress— SLIMl量の著しい増加が認められた（図 8)。これに対し、 His— Xpress— SLIM1と HA—USP21 (C221A)を共発現させた細胞から調製し たセルライセートでは、 His— Xpress— SLIM1量の増加の程度は低かった。 His— Xpress— SLIMlとHA—USP21を共発現させた細胞、および His—Xpress— SLI Mlと HA— USP21 (C221A)を共発現させた細胞において、 HA— USP21および HA-USP21 (C221A)それぞれの発現が、抗 HA抗体を用いたウェスタンブロッテ イングにより確認された。また、 His— Xpress— SLIM1のみを発現させた細胞、およ び His— Xpress— SLIM1と HA— USP21または HA— USP21 (C221A)とを共発 現させた細胞力も調製した各ライセートにお 、て、抗 GAPDH抗体を用いたウェスタ ンブロッテイングにより検出された内在性蛋白質 GAPDHの量がほぼ同等であった。 このことから、本実験に用いた各セルライセートの蛋白質量が一定であることが確認 された。
[0262] 上記のように、 USP21により SLIM1量が著しく増加したのに対し、 USP21不活性 型変異体では SLIM1量の増加程度が低力つたことから、 USP21の脱ュビキチンィ匕 活性依存的に SLIM 1量が増加することが明らかになつた。 [0263] 本結果から、 USP21によりュビキチン化 SLIM1が脱ュビキチン化され、その結果 、 SLIM1のプロテアソーム依存的な分解が抑制されて、 SLIM1の安定性が増加し、 SLIM 1量が増加すると考える。
実施例 8
[0264] (USP20、 USP22、 USP33による SLIM1の安定化）
USP20、 USP22、および USP33がュビキチン化された SLIM1を脱ュビキチン 化することにより SLIM1のプロテアソーム依存的な分解が抑制される力否かについ て検討した。この検討により、 USP20、 USP22、または USP33による SLIM1安定 化の可能性が明らかになる。具体的には、以下に示すように細胞内共発現系を用い た細胞内試験を用 、て、細胞内の SLIM 1量に対するこれら USPの一過性過剰発 現の影響にっ 、て検討した。
[0265] <材料およびその調製 >
N末端 FLAG融合 USP20 (以下、 FLAG— USP20と略称する）発現プラスミド、 N 末端 FLAG融合 USP22 (以下、 FLAG— USP22と略称する）発現プラスミド、およ び N末端 FLAG融合 USP33 (以下、 FLAG— USP33と略称する）発現プラスミド、 はそれぞれヒト USP20、 22、 23、 33cDNAの5'末端側にFLAG—tagコード配列 を挿入した cDNAを pCIベクター（Clontech社製）へ組込むことにより作製した。 His Xpress— SLIM1発現プラスミドは、実施例 2に記載の方法と同様の方法で作製し た。
[0266] <方法 >
HEK293細胞に、 FLAG— USP20発現プラスミド、 FLAG— USP22発現プラス ミド、および FLAG— USP33発現プラスミドのうちいずれか 1と、 His—Xpress— SLI Ml発現プラスミドとをトランスフエクシヨンした。コントロールとして、 His—Xpress— S LIM1発現プラスミドのみをトランスフエクシヨンした細胞を作成した。 48時間培養後 に細胞を回収した後、実施例 6に記載の方法と同様の方法でセルライセートを調製し 、さらに、各セルライセートの蛋白質濃度が 1. 5 gZ 1になるように I X細胞溶解 バッファーで希釈した。各セルライセートを、実施例 6に記載の方法と同様の方法で S DS— PAGEに展開し、抗 Xpress抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行ない、 USPの共発現により SLIM1量に変化が認められるカゝ否カゝ検討した。また、抗 HA抗 体を用いたウェスタンブロッテイングにより、各 USPの発現を観察した。さらに、抗 GA PDH抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行 、、内在性蛋白質 GAPDHを検出 することにより、本実験に用いた各セルライセートの蛋白質量が一定である力否かの 確認を行った。
[0267] <結果 >
FLAG— USP20、 FLAG— USP22、および FLAG— USP33のうちいずれ力 1と 、 His— Xpress— SLIM1とを共発現させた細胞力 調製したセルライセートでは、 H is—Xpress— SLIMlのみを発現させた細胞から調製したものと比較して、 His—Xp ress— SLIMl量の著しい増加が認められた（図 9)。 FLAG— USP20、 FLAG— U SP22および 1^^ 113?33のぅちぃずれか1と、 His—Xpress— SLIMlとを共発 現させた細胞において、 FLAG— USP20、 FLAG— USP22または FLAG— USP 33の発現力 抗 FLAG抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された。 His —Xpress— SLIMlのみを発現させた細胞、および FLAG— USP20、 FLAG— U SP22および FLAG— USP33から選ばれるいずれか 1の USPと His— Xpress— SL IM1とを共発現させた細胞力も調製した各ライセートにお 、て、抗 GAPDH抗体を用 いたウェスタンブロッテイングにより検出された内在性蛋白質 GAPDHの量がほぼ同 等であった。このことから、本実験に用いた各セルライセートの蛋白質量が一定であ ることが確認された。
[0268] 上記のように、 USP20、 USP22および USP33のうち!/、ずれ力 1により SUM1量 が著しく増加したことから、 USP20、 USP22および USP33により SLIM1の安定性 が増加することが明らかになった。
[0269] 本結果から、 USP20、 USP22および USP33によって、ュビキチン化 SLIM1が脱 ュビキチン化され、その結果、 SLIM1のプロテアソーム依存的な分解が抑制されて
、 SLIM 1の安定性が増加し、 SLIM 1量が増加すると考える。
実施例 9
[0270] (SLIM1と USP21の結合）
SLIM 1力USP21と結合するか否かを、細胞内共発現系を用 、た細胞内結合試 験で検討した。
[0271] <材料およびその調製 >
His— Xpress— SLIM1発現プラスミドは、実施例 2に記載の方法と同様の方法で 作製した。 HA— USP21発現プラスミドは、実施例 7に記載の方法と同様の方法で 作製した。
[0272] <方法 >
HEK293T細胞に、 His— Xpress— SLIM1発現プラスミドおよび HA— USP21 発現プラスミドをトランスフエクシヨンした。コントロールとして、 His— Xpress— SLIM 1発現プラスミドのみをトランスフエクシヨンした細胞を作成した。このとき、 DNAの総 量が一定となるように空ベクターにて調整した。 48時間培養後、セルスクレーパーで 細胞を 15ml 遠心管に回収した後、 lOOOrpmで 5分間遠心処理し、上清を除去し た。細胞を PBS 3mlにて洗浄した後、 lOOOrpmで 5分間遠心処理して細胞を回収 した。細胞に I X細胞溶解バッファー（Cell Signaling社製） 0. 4mlを加え、ピぺッ ティングにて混合し、氷中で 20分間インキュベーションした。マイクロチューブに移し た後、 15000rpmで 20分間遠心処理して不溶性画分を除去し、上清をセルライセー トとして用いた。各セルライセート 20 μ 1に 5 X SDSサンプルバッファーを 20 μ 1カロえ 、煮沸処理し氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel)に展開し、 Omni
Probe抗体または抗 HA抗体 (Y— 11)を用いたウェスタンブロッテイングにより各蛋 白質の発現を確認した。また、各セルライセート（300 μ 1)に、抗 ΗΑ抗体 (Υ— 11)を コンジュゲートさせたァガロース（50% スラリー、細胞溶解バッファーで調製）を 30 μ 1添加し、 4°Cで一晩転倒混和した後、遠心処理によりレジンを回収し、細胞溶解バ ッファー 500 μ 1で 3回洗浄した。レジンに 2 X SDSサンプルバッファーを 20 μ 1カロえ 、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gradient Gel)に展開し、抗 Xp ress抗体を用 、てウェスタンブロッテイングを行な!/ \ HA-USP21に結合して共沈 降する His— Xpress— SLIM1を検出することにより、 USP21と SLIM1の結合の検 出を行った。
[0273] <結果 >
HA—USP21および His—Xpress— SLIMlを共発現させた細胞から調製したセ ルライセートでは、抗 HA抗体 (Y—11)による免疫沈降および抗 Xpress抗体を用い たウェスタンブロッテイングの結果、 His— Xpress— SLIM1を示すバンドが検出され た（図 10の右パネル）。これに対し、 His— Xpress— SLIM 1のみを発現させた細胞 力も調製したセルライセートでは、抗 HA抗体 (Y— 11)による免疫沈降および抗 Xpr ess抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果、 His— Xpress— SLIM1を示すバ ンドはほとんど検出されなかった。各セルライセートにおける HA— USP21および Hi s—Xpress— SLIMlの発現は、抗 HA抗体または Omni Probe抗体を用いたゥェ スタンプロッテイングにより確認された（図 10の左パネルおよび中パネル）。
[0274] 本結果から、 USP21は SLIM1と結合することが明らかになった。
実施例 10
[0275] (SLIM1と USP20、 USP22, USP33との結合）
SLIM1力USP20、 USP22、 USP33と結合するか否かを、細胞内共発現系を用 Vヽた細胞内結合試験で検討した。
[0276] <材料およびその調製 >
His— Xpress— SLIM1発現プラスミドは、実施例 2に記載の方法と同様の方法で 作製した。 FLAG—USP20発現プラスミド、 FLAG—USP22発現プラスミド、およ び FLAG—USP33発現プラスミドは、実施例 8に記載の方法と同様の方法で作製し た。
[0277] <方法 >
HEK293T細胞に、 FLAG— USP20発現プラスミド、 FLAG— USP22発現プラ スミド、および FLAG— USP33発現プラスミドのうちいずれ力 1と、 His -Xpress -S LIM1発現プラスミドとをトランスフエクシヨンした。コントロールとして、 His— Xpress SLIM1発現プラスミドのみをトランスフエクシヨンした細胞を作成した。このとき、 D NAの総量が一定となるように空ベクターにて調整した。 48時間培養後に細胞を回 収した後、実施例 9に記載の方法と同様の方法でセルライセートを調製した。各セル ライセートを SDS— PAGEに展開し、抗 Omni Probe抗体または抗 FLAG抗体（M 2)を用いたウェスタンブロッテイングにより各蛋白質の発現を確認した。また、各セル ライセート（300 1)に、プロテイン G セファロース（1% ゥシ血清アルブミン Zトリス 緩衝整理食塩水（BSAZTBS)でブロッキングし、細胞溶解バッファーで調製した 5 0% スラリー）を 30 μ 1添加し、 4°Cで一晩転倒混和した後、遠心処理により上清を回 収した。次いで、抗 FLAG抗体 (M2) 3 μ g相当を添カ卩し、 4°Cでー晚転倒混和した。 さらに、プロテイン G セファロース（1% BSAZTBSでブロッキングし、細胞溶解バ ッファーで調製した 50% スラリー）を 30 μ 1添加し、 4°Cで一晩転倒混和した。遠心 処理によりレジンを回収し、細胞溶解バッファー 500 μ 1で 3回洗浄後、 2 X SDSサ ンプルバッファーを 20 μ 1加え、煮沸処理して氷冷後、 SDS— PAGE (5— 20% Gr adient Gel)に展開し、 Omni Probe抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行な V、、各 FLAG— USPに結合して共沈降する His—Xpress— SLIM 1を検出すること により、各 USPと SLIM1の結合の検出を行った。
[0278] <結果 >
FLAG— USP20、 FLAG— USP22、および FLAG— USP33のうちいずれ力 1と 、 His -Xpress SLIM1発現プラスミドとを共発現させた細胞力 調製したセルライ セートでは、抗 FLAG抗体 (M2)による免疫沈降および Omni Probe抗体を用いた ウェスタンブロッテイングの結果、 His—Xpress— SLIM1を示すバンドが検出された (図 11の右パネル）。これに対し、 His— Xpress— SLIM1のみを発現させた細胞か ら調製したセルライセートでは、抗 FLAG抗体 (M2)による免疫沈降および Omni P robe抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果、 His—Xpress— SLIM 1を示す バンドが検出された力 その程度は各 USPを共発現させた細胞と比較して低力つた 。各セルライセートにおける USP21および SLIM1の発現は、抗 FLAG抗体（M2)ま たは Omni Probe抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認された（図 11の 左パネルおよび右パネル）。
[0279] 本結果から、 USP20、 USP22および USP33はいずれも、 SLIM1と結合すること が明らかになった。
産業上の利用可能性
[0280] 本発明によれば、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、および U SP33)によるュビキチンィ匕 SLIMlの脱ュビキチンィ匕を阻害する化合物の同定方法 を提供できる。 [0281] また、本発明によれば、 USP (例えば、 USP15、 USP20、 USP21、 USP22、お よび USP33)によるュビキチン化 SLIM1の脱ュビキチン化を阻害することにより、プ 口テアソームによるュビキチン化 SLIM1の分解を促進することができ、その結果、細 胞内 SLIM 1量を減少させることができる。
[0282] SLIM1は肥大型心筋症の発症や進展に関与すると考えられている。したがって、 USP (例えば、 USP15, USP20、 USP21、 USP22、および USP33)によるュビキ チン化 SLIM 1の脱ュビキチンィ匕を阻害することにより、 SLIM 1の分解を促進させて SLIM1量を減少させ、それにより、心筋細胞の肥大化を阻害することができ、また、 肥大型心筋症の発症や進展を抑制することができる。
[0283] このように本発明は、肥大型心筋症に関する基礎的研究、および肥大型心筋症に 用いる医薬や治療法の開発に非常に有用である。
配列表フリーテキスト
[0284] 配列番号 1 : ：ヒト SLIM1遺伝子。
配列番号 2 : ：ヒト SLIM1遺伝子（配列番号 1)により -ドされる蛋白質。
配列番号 3 : ：ヒト USP15遺伝子。
配列番号 4 : ：ヒト USP 15遺伝子（配列番号 3)に ：より ードされる蛋白質。
配列番号 5 : ：ヒ卜 USP21遺伝子。
配列番号 6 : ：ヒト USP21遺伝子（配列番号 5)に ：より ードされる蛋白質。
配列番号 7 : ：ヒ卜 USP20遺伝子。
配列番号 8 : ：ヒト USP20遺伝子（配列番号 7)に ：より ードされる蛋白質。
配列番号 9 : ：ヒ卜 USP22遺伝子。
配列番号 10 :ヒト USP22遺伝子 (配列番号 9)によりコードされる蛋白質。
配列番号 11：ヒト USP33遺伝子。
配列番号 12 :ヒト USP33遺伝子 (配列番号 11)によりコードされる蛋白質。
配列番号 13：ヒトュビキチン遺伝子。
配列番号 13 : (1)： (288)ュビキチンをコードする領域。
配列番号 14：ヒトュビキチン。
配列番号 15：ヒト SLIM1の部分配列（配列番号 16)と高い相同性を有する、ヒト USP 15 (配列番号 4)の部分配列。
配列番号 16：ヒト USP15の部分配列（配列番号 15)と高い相同性を有する、ヒト SLI Ml (配列番号 2)の部分配列。
配列番号 17 :ヒト SLIM1の部分配列（配列番号 18)と高い相同性を有する、ヒト USP 15 (配列番号 4)の部分配列。
配列番号 18：ヒト USP15の部分配列（配列番号 17)と高い相同性を有する、ヒト SLI Ml (配列番号 2)の部分配列。
配列番号 19：ヒト SLIM1の部分配列（配列番号 20)と高い相同性を有する、ヒト USP 15 (配列番号 4)の部分配列。
配列番号 20 :ヒト USP15の部分配列（配列番号 19)と高い相同性を有する、ヒト SLI Ml (配列番号 2)の部分配列。

Claims

請求の範囲
以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)により、生体外試料または非ヒト哺乳動物において、ュビキチン化 SLIMl (skelet al muscle LIM protein 1)を脱ュビキチン化する方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin—specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin- specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin—specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)〖こより、生 体外試料または非ヒト哺乳動物において、ュビキチン化 SLIM 1 (skeletal muscle
LIM protein 1)を脱ュビキチン化する方法。
以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)により、生体外試料または非ヒト哺乳動物において、 SLIM1 (skeletal muscle LIM protein 1)を安定化する方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)による、生体外試料または非ヒト哺乳動物における、心筋細胞の肥大化方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin—specific protease 33)。
[5] ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)〖こよる、生 体外試料または非ヒト哺乳動物における、心筋細胞の肥大化方法。
[6] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)によるュビキチン化 SLIMl (skeletal muscle LIM protein 1)の脱ュビキチ ン化を阻害する化合物の同定方法であって、該ュビキチン特異プロテアーゼとュビ キチン化 SLIM1の相互作用を可能にする条件下、ある化合物と該ュビキチン特異 プロテアーゼおよび Zまたはュビキチン化 SLIM1を接触させ、次いで、該ュビキチ ン特異プロテアーゼによるュビキチンィ匕 SLIM 1の脱ュビキチンィ匕により生じるシグナ ルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマ 一力一の存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ュビキ チン特異プロテアーゼによるュビキチンィ匕 SLIM1の脱ュビキチンィ匕を阻害する力否 かを判定する同定方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin—specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin- specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin—specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
[7] ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)によるュビ キチン化 SLIMl (skeletal muscle LIM protein 1)の脱ュビキチン化を阻害 する化合物の同定方法であって、ュビキチン特異プロテアーゼ 15とュビキチン化 SL IM1の相互作用を可能にする条件下、ある化合物とュビキチン特異プロテアーゼ 15 および Zまたはュビキチンィ匕 SLIM1を接触させ、次いで、ュビキチン特異プロテア ーゼ 15によるュビキチンィ匕 SLIM 1の脱ュビキチンィ匕により生じるシグナルおよび/ またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存 在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物がュビキチン特異プロ テアーゼ 15によるュビキチンィ匕 SLIMlの脱ュビキチンィ匕を阻害する力否かを判定 する同定方法。
[8] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)と SLIMl (skeletal muscle LIM protein 1)の結合を阻害する化合物の同 定方法であって、該ュビキチン特異プロテアーゼと SLIM1の相互作用を可能にする 条件下、ある化合物と該ュビキチン特異プロテアーゼおよび Zまたは SLIM1を接触 させ、該ュビキチン特異プロテアーゼと SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Z またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存 在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ュビキチン特異プ 口テアーゼと SLIM1の結合を阻害する力否かを判定する同定方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin—specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin- specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin—specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
[9] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)とュビキチンィ匕 SLIMl (ubiquitinated skeletal muscle LIM protein 1) の結合を阻害する化合物の同定方法であって、該ュビキチン特異プロテア一ゼとュ ビキチン化 SLIM1の相互作用を可能にする条件下、ある化合物と該ュビキチン特 異プロテアーゼおよび Zまたはュビキチン化 SLIM 1を接触させ、該ュビキチン特異 プロテアーゼとュビキチン化 SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Zまたはマ 一力一を使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しく は不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ュビキチン特異プロテア一 ゼとュビキチン化 SLIM1の結合を阻害する力否かを判定する同定方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、 (4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin- specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
[10] ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)と SLIM1 ( skeletal muscle LIM protein 1)の結合を阻害する化合物の同定方法であつ て、ュビキチン特異プロテアーゼ 15と SLIM1の相互作用を可能する条件下、ある化 合物とュビキチン特異プロテアーゼ 15および Zまたは SLIM1を接触させ、ュビキチ ン特異プロテアーゼ 15と SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Zまたはマーカ 一を使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不 存在または変化を検出することにより、該化合物がュビキチン特異プロテアーゼ 15と SLIM1の結合を阻害する力否かを判定する同定方法。
[11] ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)とュビキチ ン化 SLIMl (ubiquitinated skeletal muscle LIM protein 1)の結合を阻害 する化合物の同定方法であって、ュビキチン特異プロテアーゼ 15とュビキチン化 SL IM1の相互作用を可能する条件下、ある化合物とュビキチン特異プロテアーゼ 15お よび Zまたはュビキチン化 SLIM1を接触させ、ュビキチン特異プロテアーゼ 15とュ ビキチン化 SLIM1の結合により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する 系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変 化を検出することにより、該化合物がュビキチン特異プロテアーゼ 15とュビキチンィ匕 SLIM1の結合を阻害する力否かを判定する同定方法。
[12] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)の脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、 SLIM1 (skel etal muscle LIM protein 1)の阻害方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び (5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin—specific protease 33)。
以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)の脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、心筋細胞の 肥大化阻害方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin—specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin- specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin—specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)の脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を用いることを特徴とする、肥大型心筋 症の防止および Zまたは治療方法：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)の脱ュビキチン化活性を阻害する化合物を含有してなる、 SLIM 1 (skeletal mu scle LIM protein 1)の阻害剤：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。 [16] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)の脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を含有してなる、抗心筋肥大化剤：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin—specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin- specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin—specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
[17] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)の脱ュビキチンィ匕活性を阻害する化合物を含有してなる、肥大型心筋症の防止 および Zまたは治療剤：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び
(5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin— specific protease 33)。
[18] 以下の群より選ばれるュビキチン特異プロテアーゼ（Ubiquitin— specific proteas e)、該ュビキチン特異プロテアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換 えベクター、および該ベクターを導入してなる形質転換体のうち少なくとも ヽずれか 1 つと、 SLIM1 (skeletal muscle LIM protein 1)、 SLIM1をコードする遺伝子 、該遺伝子を含有する組換えベクター、および該ベクターを導入してなる形質転換体 のうち少なくともいずれ力 1つを含む試薬キット：
(1)ュビキチン特異プロテアーゼ 15 (Ubiquitin— specific protease 15)、
(2)ュビキチン特異プロテアーゼ 20 (Ubiquitin - specific protease 20)、
(3)ュビキチン特異プロテアーゼ 21 (Ubiquitin— specific protease 21)、
(4)ュビキチン特異プロテアーゼ 22 (Ubiquitin - specific protease 22)、およ び (5)ュビキチン特異プロテアーゼ 33 (Ubiquitin—specific protease 33)。
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