JP2001518303A

JP2001518303A - スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびにそれらについての調節剤および使用方法

Info

Publication number: JP2001518303A
Application number: JP2000513957A
Authority: JP
Inventors: ジュリーディー．サバ，; ジャンフイゾウ，
Original assignee: チルドレンズホスピタルメディカルセンターオブノーザンカリフォルニア
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2001-10-16
Also published as: US7041291B2; EP1027443A2; US6423527B1; US20030059922A1; US20030166897A1; US6495359B1; CA2305686A1; US7262044B2; WO1999016888A2; US6569666B1; AU9779498A; US20090203044A1; DE69841164D1; US7973143B2; WO1999016888A3; HK1030018A1; EP1027443B1; US20050221346A1; ATE443147T1; US20080085995A1

Abstract

(57)【要約】ガンを診断および処置するための組成物、方法、およびキットが提供される。治療用組成物は、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ（ＳＰＬ）の発現または活性を調節する薬剤を含み得る。このような組成物は、ガンに罹患した哺乳動物に投与され得る。診断方法およびキットは、内因性ＳＰＬにおける変化を検出するために適切な薬剤を用い得る。このような方法およびキットを用いて、ガンの存在を検出し得るかまたは既知の疾患の予後を評価し得る。ＳＰＬポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、ガンの検出および治療に関する。本発明はより詳細には、
スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドに、
そしてこのようなポリペプチドの発現および／または活性を調節する薬剤に関す
る。このような薬剤は、例えば、乳ガンのようなガンの診断および／または処置
のために用いられ得る。

【０００２】（発明の背景）乳ガンは、米国および世界中の女性の重大な健康問題である。この疾患の検出
および処置は進歩しているとはいえ、乳ガンは、米国の女性において最も通常の
形態のガンのままであり、そしてガンによる死の第２の主要な原因である。アフ
リカ系アメリカ人女性および１５歳と５４歳との間の年齢の女性の中では、乳ガ
ンはガンによる死亡の第１の原因である。合衆国の８人に１人の女性は、乳ガン
を発症させ、その危険性は１９５０〜１９９０の間に５２％増加した。１９９４
年には、女性乳ガンの新規な１８２，０００の症例が診断され、そして４６，０
００人の女性がこの疾患により死亡したと見積もられる。

【０００３】乳ガンの予防または処置のためのワクチンも他の普遍的に成功する方法も現在
利用可能でない。この疾患の管理は現在、初期診断（慣習的な乳房スクリーニン
グ手順による）と攻撃的処置との組み合わせに頼っている。攻撃的処置は、手術
、放射線治療、化学療法、およびホルモン治療のような種々の処置のうちの１つ
以上を含み得る。特定の乳ガンのための処置経過は、しばしば、特異的な腫瘍マ
ーカーの分析を含む、種々の予後パラメーターに基づいて選択される。しかし、
確立されたマーカーの使用はしばしば、解釈するのが困難な結果をもたらす。

【０００４】現行の治療では、腫瘍の侵襲性および転移は、乳ガン患者の結末（ｏｕｔｃｏ
ｍｅ）の重大な決定因子である。局所的な乳ガンと診断された女性についての５
年生存率は約９０％であるが、疾患が転移した女性についての５年生存率は１８
％に低下する。現行の治療は、この重篤な疾患を有する大きな女性集団について
腫瘍侵襲性を阻害するのに不適切である。

【０００５】従って、乳ガンの処置、診断、および予防における改良が必要である。本発明
は、この必要性を満たし、他の関連する利点をさらに提供する。

【０００６】（発明の要旨）手短に述べると、本発明は、ガンの診断および治療のための組成物および方法
を提供する。１つの局面では、本発明は、以下からなる群より選択される配列を
含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号１に記載の配列；
（ｂ）配列番号３に記載の配列；（ｃ）前記の配列のいずれかに相補的なポリヌ
クレオチドに、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレ
オチド配列であって、ここで、このヌクレオチド配列は、スフィンゴシン−１−
リン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列；および（ｄ）前
記の配列のいずれかによりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列。

【０００７】関連する局面では、配列番号２に記載のポリペプチド、またはスフィンゴシン
−１−リン酸リアーゼ活性を有するこのようなポリペプチドの改変体をコードす
る、単離されたポリヌクレオチドが提供される。別の関連する局面では、配列番
号４に記載の配列、またはスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有するこ
のようなポリペプチドの改変体を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される
。

【０００８】前記のいずれかのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、およびこのよ
うな発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供
される。

【０００９】さらなる局面では、ＳＰＬポリペプチドが提供される。このようなポリペプチ
ドは、前記のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされ得る。あるいは、ポ
リペプチドは、配列番号２もしくは４に記載のアミノ酸配列、またはその改変体
を含み得、ここでこのポリペプチドは、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活
性を有する。

【００１０】さらなる局面では、本発明は、配列番号１または３に記載の配列に相補的な少
なくとも１００ヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１１】他の局面では、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを調製するための方法が
提供される。この方法は、上記のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフ
ェクトされた宿主細胞を、このポリヌクレオチドの発現を促進する条件下で培養
する工程、およびスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを回収する工程を含む。

【００１２】さらなる局面では、本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調
節する薬剤を同定するための方法を提供する。１つのこのような局面では、この
方法は、以下の工程を包含する：（ａ）候補薬剤を、スフィンゴシン−１−リン
酸リアーゼを発現する細胞と接触させる工程；および（ｂ）続いて、候補薬剤の
非存在下における所定のレベルと比較した、細胞におけるスフィンゴシン−１−
リン酸リアーゼまたはスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼをコードするｍＲＮ
Ａのレベルを測定する工程。別のこのような局面では、この方法は以下の工程を
含む：（ａ）候補薬剤を、配列番号２、４、６、もしくは８のいずれか１つに記
載の配列、またはスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有するこのような
配列の改変体を含むポリペプチドと接触させる工程であって、ここで接触工程が
、候補モジュレーターがポリペプチドと相互作用するのを可能にするのに十分な
条件下かつ充分な時間で実施される、工程；および（ｂ）続いて、候補薬剤の非
存在下における能力と比較した、このポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン
酸またはその誘導体を分解する能力を測定する工程。接触させる工程は、ポリペ
プチドを発現する細胞を候補モジュレーターとともにインキュベートすることに
より実施され得、そしてスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を測定する
工程は、インビトロアッセイおよび細胞抽出物を用いて実施され得る。

【００１３】本発明はさらに、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を
、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有する、薬学的組成物を提供す
る。このような薬剤は、好ましくは、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性
を阻害する。このような阻害は、内因性ＳＰＬ遺伝子の発現を阻害することによ
ってか、または内因性ＳＰＬがスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を阻
害することにより達成され得る。特定の好ましい実施態様では、調節薬剤は、ポ
リヌクレオチドまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む。

【００１４】なお別の局面では、本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸活性を調節するた
めの方法を提供する。この方法は、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを、ス
フィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する有効量の薬剤と接触させる工
程であって、ここで、接触工程が、薬剤とスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ
とが相互作用するのを可能にするに十分な条件下でかつ充分な時間で実施される
工程を包含する。細胞中のスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する
ために、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを発現する細胞はこのような薬剤
と接触され得る。

【００１５】関連する局面では、本発明は、ガン細胞の増殖を阻害するための方法を提供す
る。この方法は、ガン細胞を、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を阻害
する薬剤と接触させる工程を含む。好ましい実施態様では、ガン細胞は乳ガン細
胞である。

【００１６】本発明はまた、哺乳動物におけるガンの発達および／または転移を阻害するた
めの方法を提供する。この方法は、哺乳動物に、スフィンゴシン−１−リン酸リ
アーゼ活性を阻害する薬剤を投与する工程を含む。特定の実施態様では、薬剤は
、標的化成分（例えば、抗腫瘍抗体またはエストロゲンレセプターに結合する成
分）を含み得るかまたはこれらに連結され得る。

【００１７】他の局面では、哺乳動物におけるガンを診断するための方法が提供される。こ
の方法は、哺乳動物から得たサンプルにおける内因性スフィンゴシン−１−リン
酸リアーゼ遺伝子の変化を検出する工程、およびそこからこの哺乳動物における
ガンを診断する工程を含む。特定の実施態様では、ガンは、乳ガンであり、そし
てサンプルは乳房腫瘍生検である。

【００１８】関連する局面では、本発明は、ガンの予後を評価するための方法を提供する。
この方法は、ガンに罹患した哺乳動物から得たサンプルにおける内因性スフィン
ゴシン−１−リン酸リアーゼ遺伝子の変化の存在または非存在を決定する工程、
およびそこから予後を決定する工程を含む。

【００１９】本発明はさらに、配列番号２、４、または６のいずれか１つに記載の配列を有
するポリペプチドに結合する、単離された抗体を提供する。このような抗体は、
ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして配列番号２、４、または
６のいずれか１つに記載の配列を有するポリペプチドのスフィンゴシン−１−リ
ン酸を分解する能力を阻害し得る。

【００２０】なおさらなる局面では、本発明は、サンプル中のスフィンゴシン−１−リン酸
リアーゼを検出するための方法を提供する。この方法は、（ａ）サンプルを、抗
体と、上記のようにこの抗体がスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼに結合する
のを可能にするに十分な条件下でかつ充分な時間接触させる工程；および（ｂ）
このサンプルにおいて、この抗体に結合したスフィンゴシン−１−リン酸リアー
ゼの存在を検出する工程を含む。

【００２１】上記の方法において使用するためのキットもまた提供される。サンプル中のス
フィンゴシン−１−リン酸リアーゼを検出するためのキットは、上記の抗体、お
よび緩衝液または検出試薬を含む。サンプル中のスフィンゴシン−１−リン酸リ
アーゼ遺伝子の変化を検出するためのキットは、ポリヌクレオチドおよび検出試
薬を含む。

【００２２】さらなる局面では、本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性が減
少しているトランスジェニック動物、およびこのようなトランスジェニック動物
に由来する細胞株を提供する。

【００２３】本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
すれば明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々が個々に
援用されたかのように、本明細書中にその全体が参考として援用される。

【００２４】（発明の詳細な説明）上記のように、本発明は、一般に、乳ガンのようなガンの診断および治療のた
めの組成物および方法に関する。本発明はより詳細には、スフィンゴシン−１−
リン酸を不活性な代謝産物に切断する能力を有するスフィンゴシン−１−リン酸
リアーゼ（ＳＰＬ）ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドに関する。スフィンゴシン−１−リン酸は、乳ガン細胞の増殖
および侵襲性を強力に阻害するが非腫瘍細胞の増殖には影響を与えない、内因性
の腫瘍抑制脂質である（Ｓａｄａｈｉｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９６８６−９０，１９９２を参照のこと）。インビボで
は、ＳＰＬは、スフィンゴシン−１−リン酸のＣ₂〜₃炭素結合での切断を触媒し
て、長鎖のアルデヒドおよびリン酸エタノールアミンを生じ、これは全ての高次
スフィンゴ脂質の分解の最終段階である。内因性ＳＰＬポリペプチドの発現また
は活性を減少させる薬剤は、本発明により包含される。このような調節薬剤は、
本明細書中に記載の方法を用いて同定され得、そして例えば、ガンの治療におい
て使用され得る。本発明の状況において、内因性ＳＰＬ配列の変化を検出するこ
とを用いて、ガンを診断し得、そして回復について予後を評価し得ることもまた
見出されている。本発明はさらに、このような診断方法およびキットを提供する
。

【００２５】本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、全長内因性（すなわち、天
然の）ＳＰＬタンパク質および内因性配列の改変体を含む、任意の長さのアミノ
酸鎖を包含する。「改変体」は、改変体がＳＰＬ活性（これは、本明細書中に記
載される代表的な方法を用いて決定され得る）を保持するような、置換、欠失、
および／または他の改変においてのみ天然のＳＰＬと配列が異なるポリペプチド
である。ＳＰＬポリペプチド改変体の中では、アミノ酸置換は、好ましくは、天
然のポリペプチドの５０％以下のアミノ酸残基、より好ましくは２５％以下のア
ミノ酸残基で行われる。このような置換は、好ましくは保存的である。保存的置
換は、あるアミノ酸で、類似の特性を有する別のアミノ酸を置換し、その結果、
ペプチド化学の分野の当業者が、このポリペプチドの二次構造およびヒドロパシ
ー性質が実質的に変化しないと予測する置換である。一般に、以下のアミノ酸は
、保存的変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ
、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖ
ａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉ
ｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。置換、欠失、および／また
はアミノ酸付加は、ポリペプチドの任意の位置で行われ得る。ただし、改変は、
改変体のＳＰＬ活性を減少させない。従って、改変体は、天然のＳＰＬ配列の一
部のみを含み得る。さらに、またはあるいは、改変体は、さらなるアミノ酸配列
（例えば、リンカー、タグ、および／またはリガンドなど）を、好ましくはアミ
ノ末端および／またはカルボキシ末端に含み得る。このような配列は、例えば、
ポリペプチドの精製、検出、または細胞取り込みを促進するために用いられ得る
。

【００２６】ＳＰＬポリペプチドのＳＰＬ活性は、一般に、標識基質（すなわち、スフィン
ゴシン−１−リン酸、またはその誘導体）の分解を検出するインビトロアッセイ
を用いて評価され得る。このようなアッセイでは、ピリドキサル５’−リン酸は
、ＳＰＬ活性についての必要条件である。さらに、反応は一般に、最適にはｐＨ
７．４〜７．６で進行し、そして重金属イオンに対する感受性に起因してキレー
ト剤を必要とする。基質は、Ｄ−エリトロ異性体であるべきであるが、スフィン
ゴシン−１−リン酸の誘導体においては、スフィンゴイドベースの型および鎖長
は変化し得る。一般に、ＶａｎＶｅｌｄｈｏｖｅｎおよびＭａｎｎａｅｒｔｓ
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２５０２−０７，１９９１により記載さ
れるようなアッセイが用いられ得る。手短には、ポリペプチドを含有する溶液（
例えば、細胞抽出物）を、４０μＭ基質とともに３７℃にて１時間、例えば、５
０ｍＭスクロース、１００ｍＭリン酸Ｋ緩衝液（ｐＨ７．４）、２５ｍＭＮ
ａＦ、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ｍＭＥＤＴＡ、
２ｍＭＤＴＴ、０．２５ｍＭピリドキサルリン酸の存在下でインキュベートし
得る。次いで、反応は終結され、そして薄層クロマトグラフィーにより分析され
て標識脂肪アルデヒドおよびさらなる代謝産物の形成が検出され得る。一般に、
このようなアッセイにおいて、（１）２〜５０μｇ（または０．１〜１０ｍｇ／
ｍＬ）のポリペプチドの存在が、このポリペプチドの非存在下で観察されるレベ
ルと比較して、基質分解のレベルの統計的に有意な増加、好ましくは２倍の増加
を生じる場合；および（２）基質分解のレベルの増加がピリドキサル５’−リン
酸に依存する場合、ポリペプチドはＳＰＬ活性を有する。

【００２７】特定の実施態様では、ＳＰＬ活性についてのインビトロアッセイは、目的のポ
リペプチドを発現する細胞から調製した細胞抽出物を用いて行われ得る。好まし
くは、ＳＰＬポリペプチドをコードする遺伝子の非存在下では、このような細胞
は、有意な量の内因性ＳＰＬを生成しない（すなわち、細胞抽出物は、抽出物を
含まない緩衝液単独と比較した場合に、ＳＰＬのレベルの検出可能な増加を含ま
ないべきである）。本発明の状況では、ＳＰＬ遺伝子（ＢＳＴ１）の欠失を含む
酵母細胞が、ポリペプチドのＳＰＬ活性を評価する際に用いるために適切である
ことが見出されている。ｂｓｔ１Δ細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから、本
明細書中に記載のように、ＰＣＲのような標準的技術を用いて生成され得る。次
いで、ＳＰＬ活性について試験されるポリペプチドは、ｂｓｔ１Δ細胞において
発現され得、そしてこのポリペプチドを含有する抽出物におけるＳＰＬ活性のレ
ベルが、このポリペプチドを発現しない細胞から調製された抽出物のＳＰＬ活性
と比較され得る。このような試験のために、ポリペプチドは、好ましくは、１細
胞あたり２０コピーより多くの遺伝子を生じる多コピー性酵母ベクター（例えば
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＹＥＳ２）で発現される。一般に、こ
のようなベクターを用いてｂｓｔ１Δ細胞において発現された場合に、細胞抽出
物が、ポリペプチドを発現しない細胞から調製された抽出物について観察される
レベルに対して、基質分解の２倍の増加をもたらすならば、このポリペプチドは
ＳＰＬ活性を有する。

【００２８】ＳＰＬ活性についてのさらなる試験は、ｂｓｔ１Δ株における機能的相補に基
づき得る。本発明の文脈において、ｂｓｔ１Δ細胞が、Ｄ−エリトロ−スフィン
ゴシンに高度に感受性であることが見出されている。詳細には、１０μＭ程度の
低い濃度のスフィンゴシンは、ｂｓｔ１Δ細胞の増殖を完全に阻害する。このよ
うなレベルのスフィンゴシンは、野生型細胞の増殖には何の影響も与えない。上
記で提供したようなＳＰＬ活性を有するポリペプチドは、１細胞あたり２０コピ
ーを超える遺伝子を生じる多コピー性酵母ベクターにおいて発現される場合にス
フィンゴシン感受性を有意に（すなわち、少なくとも２倍）減少させる。

【００２９】一般に、ＳＰＬポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術のいずれかを用いて調製され得
る。例えば、天然のＳＰＬをコードするＤＮＡ配列は、適切なｃＤＮＡまたはゲ
ノムライブラリーから、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはハイブ
リダイゼーション技術を用いる増幅により調製され得る。ライブラリーは、一般
に、当業者に周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載の方法）を用いて調製およびスクリーニン
グされ得る。ｃＤＮＡライブラリーは、ＳＰＬ活性を有する酵素を含むことが公
知の種々の供給源のいずれかから調製され得る。ＳＰＬ活性は、血小板（ＳＰＬ
活性が明らかに存在しない）を除いて、種および哺乳動物組織に関して偏在する
。ラット組織では、最大レベルの活性が腸粘膜、肝臓、およびハルダー腺におい
て実証され、低い活性が骨格筋および心臓において実証されている。活性はまた
、多数のヒト細胞株（肝ガン細胞株ＨＢ８０６５、子宮頸ガンＨｅＬａ）、マウ
ス細胞株（肝ガン細胞株ＢＷ１、マウス胚３Ｔ３−Ｌ１、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細
胞）、および他の細胞株、ならびにヒト培養線維芽細胞において実証されている
。好ましいｃＤＮＡライブラリーは、ヒトの肝臓、腸、または脳の組織または細
胞から調製され得る。用いられ得る他のライブラリーは、当業者に明らかである
。増幅において使用されるプライマーは、本明細書中に提供されるような天然の
ＳＰＬポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列に基づいて容易に設計され得
る。

【００３０】あるいは、内因性ＳＰＬ遺伝子は、酵母におけるＢＳＴ１欠失を相補するｃＤ
ＮＡについてのスクリーニングを用いて同定され得る。ｃＤＮＡ発現ライブラリ
ーは、調節可能な酵母発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．
から入手可能であるｐＹＥＳ）および標準的な技術を用いて生成され得る。次い
で、酵母ｂｓｔ１Δ株は、ｃＤＮＡライブラリーを用いて形質転換され得、そし
て酵母のリアーゼの欠損を機能的に相補する（すなわち、Ｄ−エリトロ−スフィ
ンゴシンの存在下での増殖をする能力を回復する）能力を有する内因性ｃＤＮＡ
が単離され得る。

【００３１】内因性ＳＰＬ遺伝子はまた、本明細書に記載のように調製され得る抗ＳＰＬ抗
体とタンパク質産物との交叉反応性に基づいて同定され得る。このようなスクリ
ーニングは、一般に、標準的な技術（Ｈｕｙｎｈら，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ
ｎａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｉｅｓｉｎ λｇ
ｔ１１」，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔ
ｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，１：４９−７８、１９８４（ＩＲＬＰｒｅｓｓ
，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照のこと）を用いて行われ得る。

【００３２】本発明により包含されるポリヌクレオチドは、内因性ＳＰＬ遺伝子配列を含む
、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１
、３、５、および７のいずれか１つに記載の配列を含むポリヌクレオチドを含む
。配列番号２、４、６、および８のいずれか１つに提供されるＳＰＬアミノ酸配
列をコードする他のポリヌクレオチド、ならびにＳＰＬ活性を保持する天然のＳ
ＰＬ配列の改変体をコードするポリヌクレオチドもまた包含される。内因性ＳＰ
Ｌ遺伝子に相補的な配列に実質的に相同なポリヌクレオチドもまた、本発明の範
囲内である。本明細書中で使用する場合「実質的相同性」とは、中程度にストリ
ンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号３に提供される配列に相補的
なポリヌクレオチドに対してハイブリダイズし得るが、ただし、コードされるＳ
ＰＬポリペプチド改変体がＳＰＬ活性を保持するポリヌクレオチドをいう。適切
な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０
ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液における予備洗浄；５０〜６５℃で、５×
ＳＳＣで一晩のハイブリダイズ；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０
．５×、および０．２×ＳＳＣの各々を用いる６５℃にて２０分間の２回の洗浄
を含む。コードの縮重により、上記の配列のいずれかによりコードされるポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列もまた本発明に包含される。

【００３３】本発明のポリペプチドは、培養された宿主細胞においてポリペプチドをコード
する組換えＤＮＡの発現により調製され得る。好ましくは、宿主細胞は、細菌、
酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞であり、より好ましくは宿主細胞はＳ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅｂｓｔ１Δ細胞である。組換えＤＮＡは、宿主細胞内での使
用に適切な任意の発現ベクター中にクローニングされ得、そして当業者に周知の
技術を用いて宿主細胞内にトランスフェクトされ得る。適切な発現ベクターは、
宿主細胞において活性であるプロモーター配列を含む。組織特異的または条件的
に活性なプロモーターもまた、使用され得る。好ましいプロモーターは、ポリペ
プチドを高レベルで発現する。

【００３４】必要に応じて、構築物は、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリ（Ａ）シ
グナル配列、細菌もしくは哺乳動物の複製起点、および／または選択マーカー（
これらは全て当該分野で周知である）を含み得る。エンハンサー配列は、プロモ
ーター領域の一部として、または別個に含まれ得る。転写ターミネーターは、Ｒ
ＮＡポリメラーゼ媒介性転写を終結させる配列である。ポリ（Ａ）シグナルは、
終結配列内に含まれ得るか、または別個に取り込まれ得る。選択マーカーは、形
質転換細胞が同定されるのを可能にする、宿主細胞に表現型を付与する任意の遺
伝子を含む。このようなマーカーは、特定の条件下での増殖に有利性を付与し得
る。細菌にとって適切な選択マーカーは周知であり、そしてアンピシリン、カナ
マイシン、およびテトラサイクリンについての耐性遺伝子を含む。哺乳動物細胞
について適切な選択マーカーは、ハイグロマイシン、ネオマイシン、宿主におけ
る欠損を相補する遺伝子（例えば、チミジンキナーゼおよびＴＫ^-細胞）、および当該分野で周知の他のものを含む。酵母細胞については、１つの適切な選択マ
ーカーはＵＲＡ３であり、これはウラシルを含まない培地上で増殖する能力を付
与する。

【００３５】この方法において発現されたＤＮＡ配列は、ネイティブＳＰＬポリペプチド（
例えば、ヒト）をコードし得るか、またはネイティブＳＰＬポリペプチドの部分
または他の改変体をコードし得る。ネイティブＳＰＬの改変体をコードするＤＮ
Ａ分子は、一般的に、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的変異誘発のような標
準的な変異誘発技術を用いて調製され得る。そして、そのＤＮＡ配列の切片を取
り出して、短縮ポリペプチドの調製を可能にし得る。

【００３６】ＳＰＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する細胞を作製する
ために、細胞を、当該分野で公知の種々の方法のいずれかを用いてトランスフェ
クトし得る。このようなトランスフェクションは、安定な形質転換体を生じ得る
か、または一過性であり得る。１つの適切なトランスフェクション技術は、エレ
クトロポレーションであり、これは、種々の細胞型（哺乳動物細胞、酵母細胞、
および細菌を含む）において、市販の装置を用いて実施され得る。エレクトロポ
レーションについての最適な条件（電圧、抵抗およびパルス長を含む）は、特定
の宿主細胞型について実験的に決定され、そしてエレクトロポレーションを最適
化するための一般的なガイドラインは、製造業者から入手し得る。トランスフェ
クションについての他の適切な方法は、使用する細胞の型に依存し（例えば、酵
母についての酢酸リチウム方法）、そして当業者には明白である。トランスフェ
クション後、細胞を、その細胞内でポリヌクレオチドの発現を促進する条件下で
維持し得る。適切な条件は、発現系および細胞型に依存し、そして当業者には明
白である。

【００３７】ＳＰＬポリペプチドは、トランスフェクトされたポリヌクレオチドの発現を促
進する条件下でトランスフェクトした細胞を培養することによって、そのトラン
スフェクトした細胞において発現させ得る。適切な条件は、使用した特定の宿主
細胞および発現ベクターに依存し、そして当業者には容易に明白である。市販の
発現ベクターについて、そのポリペプチドは、一般的に製造業者の指示に従って
発現され得る。特定の目的について、本発明の発現されたポリペプチドは、実質
的に純粋な形態で単離され得る。好ましくは、このポリペプチドは、少なくとも
８０重量％の純度、より好ましくは少なくとも９５重量％の純度、そして最も好
ましくは、少なくとも９９重量％の純度にまで単離される。一般的に、このよう
な精製は、例えば、硫酸アンモニウム分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、および
／またはアフィニティークロマトグラフィーの標準的な技術を用いて達成され得
る。

【００３８】本発明は、ＳＰＬポリペプチドに結合する抗体をさらに提供する。抗体は、調
節因子（以下により詳細に議論する）として機能して、インビボでＳＰＬ活性を
阻害またはブロックし得る。あるいは、またはさらに、抗体は、内因性ＳＰＬポ
リペプチドまたは調節因子についてのスクリーニングにおいて、ＳＰＬポリペプ
チドの精製のために、サンプル内のＳＰＬレベルをアッセイするために、および
／またはＳＰＬ発現の研究のために用いられ得る。このような抗体は、ポリクロ
ーナルまたはモノクローナルであり得、そして一般的に１つ以上のＳＰＬポリペ
プチドおよび／または１つ以上のその改変体について特異的である。特定の好ま
しい実施態様において、抗体はポリクローナルである。

【００３９】抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって調製され得る（例えば
、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、１９８８を参照のこと）。１つのこのような技術において、ＳＰＬポリ
ペプチドまたはその抗原性部分を含む免疫原をまず適切な動物（例えば、マウス
、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に、好ましくは、１回以上の追加免疫を
組み込んだ所定のスケジュールに従って注射する。ウサギの使用が好ましい。免
疫原性を増強するために、免疫原を、例えば、グルタルアルデヒドまたはキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結し得る。注射後、その動物から定
期的に採血して、ポリクローナル抗ＳＰＬ抗体を含む免疫後血清を得る。次いで
、ポリクローナル抗体を、このような抗血清から、例えば、適切な固体支持体に
連結したＳＰＬポリペプチドその抗原性部分を用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーによって精製し得る。このようなポリクローナル抗体を、スクリーニン
グ目的に直接およびウェスタンブロットのために使用し得る。

【００４０】より詳細には、成体ウサギ（例えば、ＮＺＷ）を、１ｍＬの容量において完全
フロイントアジュバント（１：１ｖ／ｖ）に乳化した１０μｇの精製（例えば
、ニッケルカラムを用いて）ＳＰＬポリペプチドで免疫し得る。免疫は、少なく
とも６つの異なる皮下部位における注射を介して達成され得る。続く免疫につい
て、５μｇのＳＰＬポリペプチドを、不完全フロイントアジュバント中で乳化し
て、そして同様の方法で注射し得る。免疫を適切な血清抗体力価が達成されるま
で継続し得る（代表的には合計約３回の免疫）。このウサギから、免疫直前に採
血して、免疫前血清を入手し得、次いで各免疫後７〜１０日で採血し得る。

【００４１】特定の実施態様について、モノクローナル抗体が所望され得る。モノクローナ
ル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術およびその改良法を用いて調製
され得る。手短には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペ
プチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。
このような細胞株は、例えば、上記に記載のように免疫した動物から入手した脾
細胞から産生され得る。次いで、脾細胞を、例えば、ミエローマ細胞融合パート
ナー、好ましくはその免疫動物と同系であるものとの融合によって不死化する。
例えば、脾細胞およびミエローマ細胞を、数分間非イオン性界面活性剤と合わせ
得、次いでハイブリッド細胞の増殖を支持するがミエローマ細胞は支持しない選
択培地上に低密度でプレートする。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。充分な時間、通常約１〜２週間
の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そして
そのポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性
を有するハイブリドーマが好ましい。

【００４２】モノクローナル抗体は、増殖中のハイブリドーマコロニーの上清から単離され
得る。さらに、種々の技術（例えば、マウスのような適切な脊椎動物宿主の腹腔
へのハイブリドーマ細胞株の注射）を用いて収率を増加させ得る。次いで、モノ
クローナル抗体は、腹水または血液から採取され得る。混入物は、従来技術（例
えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降および抽出）によってこの抗体から
除去され得る。

【００４３】上記のように、本発明は、ＳＰＬポリペプチドの発現（転写または翻訳）、安
定性および/または活性を調節、好ましくは阻害する因子を提供する。このような調節因子を同定するために、任意の種々のスクリーニングが実施され得る。候
補調節因子は、種々の供給源（例えば、植物、真菌または化学物質、低分子もし
くはランダムなペプチドのライブラリ）から周知の技術を用いて入手され得る。
ＳＰＬポリペプチドに結合する抗体およびＳＰＬをコードするポリヌクレオチド
にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドは、候補調節因子であり得
る。好ましくは、調節因子は、最小限の副作用を有し、そして非毒性である。い
くつかの適用について、細胞を貫通し得る因子が好ましい。

【００４４】ＳＰＬ発現または安定性を減少させる調節因子についてのスクリーニングは、
ＳＰＬタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを検出する周知の技術を用いて容易に
実施され得る。適切なアッセイは、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、インサイチュハイ
ブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロットおよびウェスタンブロット
を含む。そのようなアッセイは、一般的に標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨｏｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）を用いて実
施され得る。例えば、ＳＰＬをコードするｍＲＮＡを検出するために、ＳＰＬ遺
伝子配列のすべてまたは一部に相補的な核酸プローブが、適切な細胞から調製さ
れたｍＲＮＡのノーザンブロット分析において使用され得る。ＳＰＬタンパク質
を検出するために、タンパク質に結合する試薬（代表的には、本明細書において
記載される抗体）をＥＬＩＳＡまたはウェスタンアッセイにおいて使用され得る
。結合後、その試薬の直接または間接の検出に適切なレポーター基を使用する（
すなわち、そのレポーター基は、その試薬に共有結合してい得るか、または第二
の分子（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、イムノグロブリンまたはレクチ
ン（これは、それ自身がその試薬に結合し得る）に結合されてい得る）。適切な
レポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、コファ
クター、インヒビター、色素、放射核種、発光基、蛍光基およびビオチンを含む
がそれらに限定されない。そのようなレポーター基を使用して、当業者に公知に
標準的な方法を用いてサンプル成分に対するその試薬の結合を直接または間接的
に検出し得る。

【００４５】調節因子を同定するためのそのようなアッセイを使用するために、ＳＰＬタン
パク質またはｍＲＮＡのレベルは、１つ以上の候補調節因子で処置した細胞にお
いて評価され得る。ＳＰＬレベルの上昇または低下は、候補調節因子の存在また
は非存在下においてＳＰＬｍＲＮＡおよび/またはタンパク質のレベルを評価することによって測定され得る。例えば、アンチセンス調節因子は、ＳＰＬレベ
ルに対する効果をアッセイすることによって評価され得る。そのようなアッセイ
における使用に適切な細胞は、乳ガン細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴ
Ｂ−２２）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−２６）を含
む。候補調節因子は、その細胞を、その候補をコードするポリヌクレオチドでト
ランスフェクトすること、およびＳＰＬレベルに対するそのポリヌクレオチドの
発現の効果を評価することによって試験され得る。あるいは、その細胞は、代表
的に約１０ｎＭ〜約１０ｍＭの範囲の量で候補調節因子と接触され得る。ＳＰＬ
ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルに統計学的に有意な変化をもたら
す候補は調節因子である。

【００４６】あるいは、またはさらに、候補調節因子は、ＳＰＬ活性を阻害する能力につい
て、本明細書において記載されるインビトロアッセイ（ＶａｎＶｅｌｄｈｏｖ
ｅｎおよびＭａｎｎａｅｒｔｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２５０２
−０７、１９９１を参照のこと）を用いて試験され得る。このアッセイは、標識
された基質（すなわち、スフィンゴシン−１−ホスフェートまたはその誘導体）
の分解を検出する。手短には、ＳＰＬポリペプチド（例えば、１０ｎＭ〜約１０
ｍＭ）を含む溶液（例えば、細胞抽出物）は、候補調節因子（代表的には、１ｎ
Ｍ〜１０ｍＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１ｍＭ）および基質（例えば、４０μＭ）
と、３７℃で１時間、例えば、５０ｍＭスクロース、１００ｍＭＫリン酸緩衝
液ｐＨ７．４、２５ｍＭＮａＦ、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴ，０．２５ｍＭピリドキサールホ
スフェートの存在下で、インキュベートし得る。次いで、反応を、終結させ得、
そして薄層クロマトグラフフィーによって分析して標識された脂肪アルデヒドお
よびさらなる代謝物の形成を検出し得る。ＳＰＬ活性を阻害する調節因子（例え
ば、抗体）は、調節因子の非存在下での分解のレベルと比較して、スフィンゴシ
ン−１−ホスフェートの分解の統計学的に有意な減少をもたらす。このような調
節因子は、以下に記載されるように、細胞培養物または哺乳動物におけるＳＰＬ
活性を阻害するのに使用され得る。

【００４７】調節因子は、所望の組織または細胞型に対してその因子を指向させるように作
用する標的成分をさらに含み得るかまたはこれと会合し得る。本明細書において
使用される場合、用語「標的成分」は、化合物と連結される場合にその化合物の
標的組織への輸送を増強することによってその化合物の局所濃度を増加させる任
意の物質（例えば、化合物または細胞）であり得る。標的成分は、抗体またはそ
のフラグメント、レセプター、リガンドまたは標的組織の細胞もしくはその近傍
の細胞に結合する他の分子を含む。公知の標的成分は、ホルモン、細胞表面抗原
に対する抗体、レクチン、接着分子、腫瘍細胞表面結合リガンド、ステロイド、
コレステロール、リンホカイン、フィブリン溶解酵素および所望の標的部位に結
合する他の薬物およびタンパク質を含む。特に、エストロゲンレセプターに結合
する抗腫瘍抗体および化合物は、標的成分として作用し得る。本発明において使
用される抗体は、インタクト分子（全体）、そのフラグメントまたはその機能的
等価物であり得る。抗体フラグメントの例は、Ｆ（ａｂ’）２、−Ｆａｂ’、Ｆ
ａｂ、およびＦ［ｖ］フラグメントであり、これらは、従来技術または遺伝子的
もしくはタンパク質工学によって生成され得る。連結は、当該分野において周知
である標準的な技術を用いて任意の適切な共有結合によってであり得る。そのよ
うな連結は、一般的に共有結合であり得、そして例えば、直接の縮合または他の
反応によって、または二官能性もしくは多官能性リンカーによって達成され得る
。

【００４８】インビボでの使用のために、本明細書において記載されるような調節因子は、
一般的に投与の前に薬学的組成物へ取り込まれる。薬学的組成物は、１つ以上の
調節因子を、生理的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。薬学的組成物を
調製するために、有効量の１以上の調節因子を、当業者にとって公知である薬学
的キャリアと混合して、投与の特定の態様に適切にさせる。薬学的キャリアは、
液体、半液体または固体であり得る。非経口、皮内、皮下または局所的適用のた
めに使用される溶液または懸濁物は、例えば、滅菌希釈剤（例えば、水）、生理
食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコー
ル、または他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパ
ラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム）お
よびキレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤
（酢酸、クエン酸、およびリン酸）を含み得る。静脈内投与される場合、適切な
キャリアは、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに濃
厚剤および可溶化剤（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロ
ピレングリコール、およびそれらの混合物）を含む溶液を含む。さらに、他の薬
学的有効成分（他の抗がん剤を含む）および／または適切な賦形剤（例えば、塩
、緩衝剤および安定化剤）は、その組成物内に存在し得るが必要ではない。

【００４９】調節因子は、身体からの迅速な除去からそれを保護するキャリアとともに調製
され得る（例えば、時限放出処方物またはコーティング）。このようなキャリア
は、制御された放出処方物（例えば、インプラントおよび微小カプセル送達系、
生体分解性、生体適合性のポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物
、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他
のもの）であるがそれらに限定されない）を含む。

【００５０】投与は、種々の異なる経路（経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下または
局所を含む）によって達成され得る。好ましい投与態様は、処置または予防され
る状態の性質に依存する。投与後に、ガンの進行および／または転移を阻害、予
防または遅延させる量は、有効とみなされる。好ましくは、投与された量は、５
０％重量によるかまたは走査寸法によって示される場合、後退をもたらすに充分
である。処置の正確な投薬および期間は、処置される疾患の関数であり、そして
公知の試験プロトコルを用いて経験的に、または当該分野で公知のモデル系にお
いてその組成物を試験すること、およびそれから推測することによって決定され
得る。制御された臨床試験もまた、実施され得る。投薬量はまた、軽減されるべ
き状態の重篤度とともに変動し得る。薬学的組成物は、一般的に処方され、そし
て投与されて、所望されない副作用を最小限にしつつ治療的に有用な効果を発揮
する。この組成物は、１回で投与され得るか、または多数の少用量に分割されて
時間の間隔をおいて投与され得る。任意の特定の被験体について、特定の投薬レ
ジメンは、個体の必要性に従って時と共に調整され得る。

【００５１】調節因子の直接投与の代替として、調節因子をコードするポリヌクレオチドが
投与され得る。このようなポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の種々の送
達系において薬学的組成物（核酸、細菌発現系およびウイルス発現系、およびコ
ロイド状分散系（例えば、リポソーム））中に存在し得る。適切な核酸発現系は
、患者における発現のために必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターお
よび終結シグナル、上記に記載のように）を含む。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌ
ｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−４９、１９９３に記載のように
「裸」であり得る。

【００５２】核酸配列を標的の患者細胞に導入するのに使用され得る種々のウイルスベクタ
ーは、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レ
トロウイルスまたはアデノウイルスを含むがそれらに限定されない。ＤＮＡをそ
のようなベクターに組み込む技術は、当業者に周知である。ポリヌクレオチドに
ついての別の送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、高分子複合
体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および液体ベースの系（水中油エ
マルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）を含む。リポソームの調製
および使用は当業者に周知である。

【００５３】本発明の特定の局面において、１つ以上の調節因子を使用して、細胞または哺
乳動物における、ＳＰＬ発現および／またはインビトロの活性を調節し得る。イ
ンビトロで、ＳＰＬポリペプチドは、ＳＰＬ活性を阻害する調節因子（例えば、
特定の抗体）と接触され得る。細胞または哺乳動物における使用のために、この
ような調節は、本明細書において記載されるように標的細胞と有効量の調節因子
を接触させることによって達成され得る。哺乳動物への投与は、一般的に上記に
記載されるように達成され得る。

【００５４】上記のように、ＳＰＬ発現および／または活性の阻害は、培養物またはガンに
罹患した哺乳動物のいずれかにおいて、ガン細胞の成長（すなわち、増殖）を阻
害するための方法を提供する。インビボでは、そのような阻害はまた、ガンの発
生、進行および／または転移を阻害するのに使用され得る。従って、本明細書に
おいて提供されるような１以上の調節因子は、上記に記載のように抗ガン治療を
必要とする哺乳動物投与され得る。調節因子の投与の利益が受け得る患者は、ガ
ンに罹患した患者である。このような患者は、当該分野で周知である標準的な基
準に基づいて同定され得る。好ましい実施態様において、患者は、当該分野で周
知の技術を用いて、組織生検および顕微鏡評価に基づいて同定されるように乳ガ
ンに罹患している。特に、その腫瘍細胞が組織特異的な欠失および／または変更
を内因性ＳＰＬ遺伝子内に含む患者は、本明細書において提供されるような調節
因子の投与の利益を受け得る。

【００５５】他の局面では、本発明は、ガンを診断するためのおよび／または平均より高い
または低い転移の危険性を有する個体を同定するための方法およびキットを提供
する。本発明の状況において、特定のヒト腫瘍細胞が、変化されたＳＰＬ遺伝子
を含むことが見出されている。特に、特定の脳腫瘍細胞が、図８および配列番号
４に示されたヒトＳＰＬ配列の残基３５４から４３３の欠失を含む。他の腫瘍細
胞（例えば、胸部腫瘍細胞）に存在する特異的な変化は、標準的な技術（例えば
、ＰＣＲ）を使用して容易に同定され得る。特定の腫瘍と関連され得る変化は、
アミノ酸欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせを含む。このような変化
の存在または不在が決定される方法は、一般に、ガンを検出するために、および
ガンに罹患したことが知られる患者について予後を診断するために使用され得る
。

【００５６】変化されたＳＰＬ遺伝子を検出するために、種々の周知の技術のいずれかが使
用され得る。これらの方法は、ＰＣＲ、およびハイブリダイゼーション技術を包
含するが、これらに制限されない。ガン性細胞を含み得る任意のサンプルがアッ
セイされ得る。一般には、適切なサンプルは、腫瘍生検である。好ましい実施態
様では、サンプルは、胸部腫瘍生検である。

【００５７】ガンの予後を診断または評価するためのキットは、一般に、使用される特定の
アッセイにおいて使用するための試薬を含む。一般に、本発明のキットは、アッ
セイにおいて使用される要素（例えば、プローブ、試薬、または緩衝液）を封入
する１つ以上の容器を含む。例えば、キットは、ＳＰＬｍＲＮＡに相補的な、
少なくとも１００ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２００ヌクレオチ
ドを含む、１つ以上のポリヌクレオチドプローブを含み得る。このようなプロー
ブは、ハイブリダイゼーションによって、変化されたＳＰＬ遺伝子を検出するた
めに使用され得る。例えば、キットは、腫瘍において一般に変化されていないＳ
ＰＬ遺伝子の領域にハイブリダイズする１つのプローブ（コントロール）および
乳ガンにおいて共通して欠失された領域にハイブリダイズする第二のプローブを
含み得る。（標準的な技術を使用して）第一のプローブにハイブリダイズするが
、第二のプローブにハイブリダイズしないｍＲＮＡを含むサンプルは、変化され
たＳＰＬ遺伝子を含む。適切なコントロールプローブは、アミノ酸残基３５４か
ら４３３をコードする共通して欠失された領域の外側のＳＰＬ遺伝子の部分にハ
イブリダイズするプローブを含む；変化された領域についての適切なプローブは
、アミノ酸残基３５４から４３３をコードするＳＰＬ遺伝子の部分にハイブリダ
イズするプローブを含む。あるいは、キットは、ＰＣＲ分析のための１つ以上の
プライマーを含み得る。これは、本明細書中に提供される配列に基づいて、当業
者によって容易に設計され得る。必要に応じて、キットは、上述のようなアッセ
イ内で使用するための、１つ以上の溶液、化合物、または検出試薬をさらに含み
得る。

【００５８】本発明の関連した局面では、ＳＰＬを検出するためのキットが提供される。こ
のようなキットは、サンプル内でＳＰＬまたはＳＰＬをコードする核酸のレベル
を検出するために設計され得るか、または本明細書中に記載のようにＳＰＬ活性
のレベルを検出し得る。ＳＰＬ、またはＳＰＬをコードする核酸のレベルを検出
するためのキットは、代表的には、ＳＰＬタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡに
結合する試薬を含む。ＳＰＬをコードする核酸を検出するために、試薬は、核酸
プローブまたはＰＣＲプライマーであり得る。ＳＰＬタンパク質を検出するため
に、試薬は、代表的には、抗体である。キットはまた、上述のような試薬の直接
的または間接的な検出に適切なリポーター基を含み得る。

【００５９】さらなる局面では、本発明は、野生型動物に比較してＳＰＬ活性が減少したト
ランスジェニック哺乳動物を提供する。このような動物は、内因性ＳＰＬ遺伝子
における変化、挿入、または欠失を含み得るか、またはＳＰＬ遺伝子の発現また
は活性を阻害する調整剤をコードするＤＮＡを含み得る。トランスジェニック動
物は、当業者に公知の技術を使用して生成され得る。例えば、ＳＰＬ遺伝子のコ
ード領域における挿入または欠失を含むトランスジェニック動物は、標準的な技
術を用いて、胚幹細胞から生成され得る。このような幹細胞は、まず、ＳＰＬを
コードする遺伝子の全ゲノム配列を同定し、次いで、胚幹細胞におけるコード領
域における挿入または欠失を作出することにより生成され得る。あるいは、適当
な遺伝子変化した胚幹細胞が、バンクから同定され得る。変化された幹細胞を用
いて、１つの正常ＳＰＬ遺伝子および１つの顕著な異常遺伝子を有する雑種動物
が、生成され得る。これらの雑種は交配され得、そして同種子孫が同定され得る
。

【００６０】トランスジェニック動物は、種々の目的のために使用され得る。これらの目的
は、当業者に明らかである。例えば、このような動物は、周知の技術を使用して
、異なる組織から細胞株を調製するために使用され得る。このような細胞株は、
例えば、変化の効果を評価するため、および種々の候補調整剤を試験するために
使用され得る。

【００６１】（配列表の要約）配列番号１は、マウス内因性ＳＰＬをコードするｃＤＮＡ配列である。

【００６２】配列番号２は、マウス内因性ＳＰＬのアミノ酸配列である。

【００６３】配列番号３は、ヒト内因性ＳＰＬをコードするｃＤＮＡ配列である。

【００６４】配列番号４は、ヒト内因性ＳＰＬのアミノ酸配列である。

【００６５】配列番号５は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ内因性ＳＰＬをコードするｃＤＮＡ配列で
ある。

【００６６】配列番号６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ内因性ＳＰＬのアミノ酸配列である。

【００６７】配列番号７は、酵母内因性ＳＰＬをコードするｃＤＮＡ配列である。

【００６８】配列番号８は、酵母内因性ＳＰＬのアミノ酸配列である。

【００６９】配列番号９は、変化されたヒトＳＰＬをコードするｃＤＮＡ配列である。

【００７０】配列番号１０は、変化されたヒトＳＰＬのアミノ酸配列である。

【００７１】以下の実施例は、例示のためであって提供されるのであって、限定のために提
供されるわけではない。

【００７２】（実施例）（実施例１：酵母からのＳＰＬｃＤＮＡの単離および特徴づけ）本実施例は、内因性ＳＰＬポリペプチドをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅｃＤＮＡ分子の調製を例示する。

【００７３】野生型酵母細胞（ＳＧＰ３（ＧａｒｒｅｔｔおよびＢｒｏａｃｈ、Ｇｅｎｅ
ａｎｄＤｅｖ．３：１３３６−１３４８、１９８９）；ｌｅｕ２−３，１１２
ｔｒｐ１ｕｒａ３−５２ｈｉｓ３ａｄｅ８ｒａｓ１：：ＨＩＳ３）を
、選択性栄養マーカー（ＵＲＡ３）を含むｐＲＳ２０２高コピーシャトルベクタ
ーに保有される酵母ゲノムライブラリー（ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＨｅｉｔｅｒ
、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２：１９−２７、１９８９）で形質転換した。ｐＲＳ
２０２は、ｐＲＳ３０６ベクターの改変されたバージョンである。ここには、２
ミクロンのプラスミド片が挿入されている。このライブラリーからの挿入片は、
約６〜８ｋｂ長である。野生型酵母を、Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１５３：１６
３−６８、１９８３により記載のような高コピーライブラリーで形質転換し、ウ
ラシル栄養要求性（すなわち、ウラシル欠損培地で増殖する能力）について選択
し、そして形質転換体をプールし、そして１ｍＭＤ−エリトロ−スフィンゴシ
ンプレート上にプレートあたり１０⁶細胞の濃度で再プレートした。

【００７４】１ｍＭＤ−エリトロ−スフィンゴシンプレート上に大きなコロニーを増殖し
た６つの形質転換体を、選択培地中で増殖させ、そしてコントロールＳＧＰ３コ
ロニーを最少培地中で増殖させた（飽和まで３０℃で）。６６０ｎｍでの吸光度
を使用して、培養物間の細胞濃度における小さな変動を補正した。系列希釈を行
い、そして細胞を１ｍＭＤ−エリトロ−スフィンゴシンプレート上にテンプレ
ート接種し、３０℃で４８時間インキュベートした。

【００７５】最も高く表された挿入片１３−１をサブクローン化し、配列決定し、ＢＳＴ１
と名付けた（スフィンゴシン耐性の付与（ｂｅｓｔｏｗｅｒｏｆｓｐｈｉｎ
ｇｏｓｉｎｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５１０３１；
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムデータベース受託
番号ＹＤＲ２９４Ｃ）。ＢＳＴ１ヌクレオチド配列は、６５，５２３キロダルト
ンおよび５８９アミノ酸長の以前に知られていない推定タンパク質をコードする
。この配列は、ｇａｄＡおよびｇａｄＢに対して２３％同一である。これは、グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（神経伝達物質γ−アミノ酪酸の合成
を触媒するピリドキサル−５’−リン酸依存性酵素）をコードする２つのほぼ同
一のＥ．ｃｏｌｉ遺伝子である。ＢＳＴ１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ第４染
色体に局在している。ＢＳＴ１の配列は、図１および配列番号７に提供される。

【００７６】ＢＳＴ１の機能を探索するために、欠失株を、ＮＥＯ選択性マーカーを用いる
相同性組換えによって作製した（Ｗａｃｈら、Ｙｅａｓｔ１０：１７９３−１
８０８、１９９４）。ゲノムＢＳＴ１を、ｋａｎＭＸと置換した（Ｗａｃｈら、
Ｙｅａｓｔ１０：１７９３−１８０８、１９９４）。これは、Ｇ４１８に対す
る耐性を付与する。破壊により置換される領域のちょうど５’および３’末端側
のゲノム配列に対するプライマーを使用して、Ｇ４１８耐性クローン由来のゲノ
ムＤＮＡのＰＣＲ増幅を使用して、破壊を確認した。ＢＳＴ１の欠失および全て
の続く生物学的研究を、ＳＧＰ３およびＪＫ９３ｄにおいて行った（Ｈｉｅｔｍ
ａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１９４８−５
２、１９９１）；ｕｒａ３−５２ｌｅｕ２−３，１１２ｈｉｓ４ｔｒｐ１
ｒｍｅ１）。異種二倍体を胞子形成させ、そして胞子は、Ｇ４１８耐性につい
て２：２に分離した。Ｇ４１８耐性子孫および感受性子孫の両方は生存可能であ
り、このことは、ＢＳＴ１が必須遺伝子ではないことを示す。

【００７７】野生型株、ＢＳＴ１過剰発現株、およびｂｓｔ１Δ株からの細胞質ゾル抽出物
におけるＧＡＤ活性の分析は、ＢＳＴ１が、ＧＡＤのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ホモログをコードしないことを示した。しかし、ＢＳＴ１の欠失は、Ｄ−エリト
ロ−スフィンゴシンに対する激しい感受性と関連した。１０μＭスフィンゴシン
程度の低さの濃度は、ｂｓｔ１Δ株の増殖を完全に阻害したが、野生型細胞の生
存に対して効果を有しなかった。コントロール株に比較して、ｂｓｔ１Δ株はま
た、１００μＭフィトスフィンゴシン（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａに対して内因性
である長鎖塩基）に対してより大きな感受性を示した。フィトスフィンゴシン（
この濃度では野生型細胞に対して最小限でのみ毒性である）における野生型株お
よびＢＳＴ１過剰発現株の増殖の間には、差異は観察されなかった。

【００７８】スフィンゴシン取り込みまたは代謝における差異がこれらの感受性差異の原因
となるか否かを決定するために、ＢＳＴ１野生型株、過剰発現株、およびｂｓｔ
１Δ株を［Ｃ３−³Ｈ］標識化スフィンゴシン（ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に曝
露し、滅菌水中で洗浄し、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ抽出（ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅ
ｒ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｕｉｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−１７、１９
５９）に供した。３つの株間でのスフィンゴシン回収において主要な差異はなか
った。しかし、ｂｓｔ１Δ株由来の水相は、コントロール株およびＢＳＴ１過剰
発現株よりも、１０倍増加した放射活性を含んだ。ブタノール：酢酸：水（３：
１：１）中の脂質画分の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、各株におい
て等価に見えたスフィンゴシンバンドを明示した。

【００７９】放射性スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ−１−Ｐ）もまた、ｂｓｔ１Δ株から
の抽出物において観察されたが、野生型株またはＢＳＴ１過剰発現株では観察さ
れなかった。この化合物は、迅速に蓄積し、６０分までにプラトーに達した。３
つの個々のＴＬＣ条件を使用して、Ｓ−１−Ｐの存在を確認した。これらの条件
を、得られたＲＦ値とともに、以下に示す：

【００８０】

【化１】Ｓ−１−Ｐの過剰蓄積およびＤ−エリトロ−スフィンゴシンに対する過剰感受
性は、Ｓ−１−Ｐの代謝不全を示唆する。このことは、ＢＳＴ１が酵母ＳＰＬで
あることを示している。この同定を確認するために、ＢＳＴ１野生型株、過剰発
現株、および欠失株におけるリアーゼ活性を、ＶｅｌｄｈｏｖｅｎおよびＭａｎ
ｎａｅｒｔｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２５０２−０７、１９９１
により記載されるように、未標識Ｄ−エリトロ−ジヒドロスフィンゴシン−１−
リン酸（Ｂｉｏｍｏｌ、ＰｌｙｍｏｕｔｈＭｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）およびＤ−
エリトロ−ジヒドロスフィンゴシン−［４，５−³Ｈ］１−リン酸（ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して評価した。比活性は、１００ｍＣｉ／ｍｍｏｌであ
った。ＳＰＬ活性は、ＢＳＴ１発現と相関することが見出された。このことは、
ＢＳＴ１がスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼの酵母ホモログであることを確
認する。

【００８１】これらの結果は、ＢＳＴ１が酵母ＳＰＬであること、ＳＰＬがスフィンゴ脂質
異化作用において律速段階を触媒することを示す。従って、ＳＰＬ活性の調節は
、細胞内Ｓ−１−Ｐレベルの調節を生じ得る。

【００８２】（実施例２：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびマウスからのＳＰＬｃＤＮＡの単離
および特徴付け）本実施例は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓからの内因
性ＳＰＬｃＤＮＡの同定を例示する。

【００８３】酵母ＢＳＴ１配列のＧｅｎＢａｎｋデータベース内の配列との比較は、Ｃ．ｅ
ｌｅｇａｎｓゲノムの系統的配列決定の間に同定されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来
の全長遺伝子を同定した。この配列は、ＳＰＬをコードすることが見出された。
そしてこの配列を図２ならびに配列番号５および６に示す。本明細書中に記載の
このおよび他のＤＮＡ相同性検索を、ＢＬＡＳＴ検索プログラムを用いてＮａｔ
ｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎウェブサイトを介して実施した。

【００８４】ＥＳＴデータベースを検索するためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓの両ＳＰＬ配列を用いて、マウスの初期胚細胞（８日胚、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊ株）由来の発現配列タグを同定した。この推定マウスＳＰＬを含むｃＤ
ＮＡクローンを、ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
、ＭＯ）から購入した。全長ｃＤＮＡ配列の完成は、１７０９ｂｐのオープンリ
ーディングフレームを明示した（図３ならびに配列番号１および２）。このマウ
ス配列は、ＢＳＴ１および他のピリドキサルリン酸結合酵素（例えば、グルタミ
ン酸デカルボキシラーゼ）に対する有意な相同性を示した。最も大きな保存は、
推定ピリドキサルリン酸結合リジンの周囲にある（図４）。マウスグルタミン酸
デカルボキシラーゼをコードする２つの遺伝子が以前に同定されており、そして
この同定された配列は独特であり、そして既知の機能を有さないので、これはお
そらく候補マウスＳＰＬ遺伝子であった。

【００８５】マウス遺伝子のＳＰＬ活性を確認するために、２工程プロセスを行った。まず
、この配列を高コピー酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローン化した。ここで、目的の遺伝子を酵
母ＧＡＬプロモーターの制御下に置き、従って、ガラクトースにより転写活性化
され、そしてグルコースによって抑制される。ｐＹＥＳ２はまた、ＵＲＡ３遺伝
子（これは、形質転換体に、ウラシルのない培地中で増殖する能力を提供する）
およびアンピシリン耐性マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉにおいて機能的な複製起点
を含む。

【００８６】次いで、全長マウスＳＰＬ遺伝子を含む発現ベクターは、上述のように、スフ
ィンゴシンのＳ−１−Ｐへの代謝の結果として、Ｄ−エリトロ−スフィンゴシン
に極度に感受性の酵母ｂｓｔ１Δ株に導入した。Ｓ−１−Ｐは、ＳＰＬ活性が存
在しなければさらには分解され得ず、そして過剰蓄積し、増殖阻害を引き起こす
。酢酸リチウム法（Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１５３：１６３−６８，１９８３
）を使用して、形質転換を行った。２０ｇ／Ｌガラクトースを含む培地上で形質
転換体を増殖させ、ウラシル栄養要求性について選択した。

【００８７】次いで、形質転換体をスフィンゴシン耐性について評価した。目的の株を、液
体培養中で、２〜３日間、飽和するまで増殖させた。次いで、これらを、最少培
地中で懸濁し、９６ウェルプレートの最初の列に置き、そしてプレートを横切っ
て１：２から１：４０００まで系列希釈した。次いで、培養物を、コントロール
プレート（ＹＰＤ）、および５０μＭＤ−エリトロ−スフィンゴシン（Ｓｉｇ
ｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および０．００１
５％ＮＰ４０（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）を補充した最少合成培
地を含むプレート上にテンプレート接種した。ＮＰ４０のこの濃度で、細胞生存
度に関しては、何の効果も観察されなかった。プレートを３０℃で２日間インキ
ュベートした。増殖における差異について視覚的に評価した。マウスＳＰＬ遺伝
子を含む形質転換体は、ガラクトース含有プレート中に存在するスフィンゴシン
に対して耐性であった（図５）。ベクターのみで形質転換した株は、スフィンゴ
シンに対して感受性のままであった。従って、マウスＳＰＬ遺伝子は、酵母ｂｓ
ｔ１Δ株のスフィンゴシン感受性表現型を逆転し得た。

【００８８】マウスＳＰＬ遺伝子が、ｂｓｔ１Δ株に対する生化学的ＳＰＬ活性を回復し得
るかどうかを決定するために、非形質転換ｂｓｔ１Δ株、およびＢＳＴ１または
推定マウスＳＰＬ遺伝子のいずれかを含むｐＹＥＳ２で形質転換されたｂｓｔ１
Δ株を、最少培地（ＪＳ１６）または炭素源としてガラクトースを含むウラシル
培地のいずれかにおいて、対数期（Ａ₆₀₀＝１．０）まで増殖させた。全細胞抽出物を、上記のように各株から調製し、タンパク質濃度について調整し、そして
上記のようにスフィンゴシンリン酸リアーゼ活性について³Ｈ−ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅ
ｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて評価した。産物の
定性分析を、オートラジオグラフィーによって行った。定性測定を、ＴＬＣプレ
ートをスクラップし、そして標準的シンチレーションカウンターを用いて存在す
る放射活性を決定することにより実施した。

【００８９】スフィンゴシンリン酸リアーゼアッセイの結果を、図６Ａおよび６Ｂに示す。
酵母およびマウスの両配列の発現は、ｂｓｔ１Δ株に対してＳＰＬ活性を回復し
、一方、ベクターのみは、効果を有さなかった。このことは、マウス配列がＳＰ
Ｌであることを確認する。

【００９０】マウスＳＰＬ転写物の発現が、マウスにおいて以前に報告された組織特異的Ｓ
ＰＬ活性と一致するかどうかを決定するために、全ＲＮＡを、種々のマウス組織
から得、完全なマウスＳＰＬｃＤＮＡ配列でプローブした。ノーザン分析を、
ランダム標識化技術（ＣａｂｉａｎｃｈｉおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．１５２：９４−１１０，１９８７）により標識化された全長マウス
ＳＰＬｃＤＮＡプローブを用いて、Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：５２０１、１９８０によって記載されるように実
施した。この分析は、種々のマウス組織における既知のＳＰＬ活性と一致した発
現のパターンを明示した。このことは、この配列がマウスＳＰＬをコードすると
いうさらなる確証を提供する（図７）。

【００９１】（実施例３：ヒトＳＰＬｃＤＮＡの単離および特徴付け）本実施例は、内因性ヒトｃＤＮＡの同定を例示する。

【００９２】ＥＳＴデータベースを、本明細書中に記載のマウスＳＰＬ配列を用いて検索し
た。マウス配列に対して強い相同性を有する２つの異なるＥＳＴ配列を、ヒト供
給源から同定した。これらの配列のうち一方は、Ｃ末端に相当し、そして他方は
、Ｎ末端に相当した。これらの配列に基づいてプライマーを設計し、そしてＤＮ
Ａフラグメントを、ヒト多形神経膠芽腫組織ＲＮＡから作製されたヒト発現ライ
ブラリーから、ＰＣＲによって増幅した。このフラグメントを配列決定し、そし
て欠失を含むことが示され、そこでこのプライマーをヒト線維芽ＲＮＡ由来の遺
伝子を増幅するために使用した。この遺伝子は、配列番号３に提供された配列を
有し、そして欠失を含む遺伝子の配列を、配列番号９に提供する。

【００９３】前出から、本発明の特定の実施態様を例示の目的で本明細書中に記載してきた
が、種々の改変が、発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ること
が理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ〜１Ｃは、代表的なＳＰＬポリペプチドをコードする、Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのポリヌクレオチド配列を表す。

【図２】図２Ａおよび２Ｂは、代表的なＳＰＬポリペプチドをコードする、Ｃ．ｅｌｅ
ｇａｎｓのポリヌクレオチド配列を表す。

【図３】図３Ａおよび３Ｂは、代表的なＳＰＬポリペプチドをコードする、Ｍｕｓ．ｍ
ｕｓｃｕｌｕｓのポリヌクレオチド配列を表す。

【図４】図４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、酵母、およびマウスからの内因性ＳＰＬゲノム
配列の比較を表す。

【図５】図５は、液体培養において飽和まで増殖され、次いで５０μＭスフィンゴシン
あり（上のプレート）およびなし（下のプレート）のＹＰＤにプレートした酵母
細胞の増殖を示す写真である。各プレートにおいて、細胞の上の列はＢＳＴ１Δ
（ＢＳＴ１遺伝子がＧ４１８耐性マーカーＮＥＯにより置換されたＳＧＰ３（ｌ
ｅｕ２−３、１１２ｔｒｐｌｕｒａ３−５２ｈｉｓ３ａｄｅ８ｒａｓ
１：：ＨＩＳ３）の改変体であるＪＳ１６）である。２番目の列は、ベクター単
独で形質転換されたＪＳ１６である。３番目の列および下の２つの列（ｍＢＳＴ
１）は、ＪＳ６０細胞（ＪＳ１６［ｐＹＥＳ−マウスＳＰＬ］）を示し、そして
４番目の列（ｃｅＢＳＴ１）は、ＪＳ６１細胞（ＪＳ１６［ｐＹＥＳ−Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓＢＳＴ１］）を示す。各々のプレートにおける５番目の列（ＢＳＴ１
−ＷＴ）は、野生型ＳＧＰ３株の増殖を示す。

【図６Ａ】図６Ａは、ＪＳ２９＝ｐＹＥＳ２−酵母ＢＳＴ１（ｙｔＢＳＴ１）、ＪＳ６０
＝ｐＹＥＳ２−マウスＳＰＬ（ｍＢＳＴ１）、または挿入片なしのｐＹＥＳ２（
ビヒクルコントロール）で形質転換されたＪＳ１６から得た抽出物について行わ
れたＳＰＬアッセイの産物を示すオートラジオグラムである。

【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａに示されるＴＬＣプレートを掻き取り、そして放射活性のレ
ベルを評価することにより決定した場合の、図６Ａに示される株における活性を
示すヒストグラムである。

【図７】図７は、示すように、種々のマウス組織におけるマウスＳＰＬのレベルのノー
ザンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。

【図８】図８Ａ〜８Ｃは、代表的なＳＰＬポリペプチドをコードするヒトポリヌクレオ
チドの配列を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 48/00 43/00 １１１Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 16/40 9/88 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/88 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/56 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ゾウ，ジャンフイアメリカ合衆国カリフォルニア 94065, レッドウッドシティー，ビアリッズコート 246

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離されたポリヌクレオチドであって、以下：（ａ）配列番号１に記載の配列；（ｂ）配列番号３に記載の配列；（ｃ）上記配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチドに対して、中程度にス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここ
で、該ヌクレオチド配列がスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；および（ｄ）上記のいずれかの配列によりコードされるポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列、からなる群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】配列番号２に記載のポリペプチド、またはスフィンゴシン−
１−リン酸リアーゼ活性を有するこのようなポリペプチドの改変体をコードする
、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】配列番号４に記載の配列を含むポリペプチド、またはスフィ
ンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有するこのようなポリペプチドの改変体を
コードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含
む、組換え発現ベクター。
【請求項５】請求項４に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトした、宿主細胞。
【請求項６】配列番号１または３に記載の配列に相補的な少なくとも１０
０ヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを調製するための方法
であって、該方法は、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで
形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現を
促進する条件下で培養する工程、およびスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを
回収する工程、を包含する、方法。
【請求項８】請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項９】配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはその改変体
を含むポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、スフィンゴシン−１−
リン酸リアーゼ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１０】スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤
を同定するための方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを発現する細胞と接
触させる工程；および（ｂ）続いて、該候補薬剤の非存在下における所定のレベルと比較した、該細
胞におけるスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼまたはスフィンゴシン−１−リ
ン酸リアーゼをコードするｍＲＮＡのレベルを測定し、それによってスフィンゴ
シン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を同定する、工程、を包含する、方法。
【請求項１１】スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤
を同定するための方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を、配列番号２、４、６、もしくは８のいずれか１つに記載の
配列、またはスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を有するこのような配列
の改変体を含むポリペプチドと接触させる工程であって、ここで該接触工程が、
候補モジュレーターが該ポリペプチドと相互作用するのを可能にするのに十分な
条件下かつ充分な時間で実施される、工程；および（ｂ）続いて、候補薬剤の非存在下における能力と比較した、該ポリペプチド
がスフィンゴシン−１−リン酸またはその誘導体を分解する能力を測定し、それ
によってスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤を同定する、
工程、を包含する、方法。
【請求項１２】前記接触工程が、前記ポリペプチドを発現する細胞を前記
候補モジュレーターとともにインキュベートすることにより実施され、そしてス
フィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を測定する工程が、インビトロアッセ
イおよび細胞抽出物を用いて実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節する薬剤
を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有する、薬学的組成物。
【請求項１４】前記スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼが、配列番号２
、４、または６のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項１３に記載の組成物
。
【請求項１５】前記薬剤が、内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ
遺伝子の発現を阻害する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】前記薬剤が、ポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載
の組成物。
【請求項１７】前記薬剤が、内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ
がスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を阻害する、請求項１３に記載の
組成物。
【請求項１８】前記薬剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む
、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を調節するため
の方法であって、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを、スフィンゴシン−１
−リン酸リアーゼ活性を調節する有効量の薬剤と接触させる工程であって、該接
触工程が、該薬剤と該スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼとが相互作用するの
を可能にするに十分な条件下でかつ充分な時間で実施される工程を包含する、方
法。
【請求項２０】前記接触工程が、前記ポリペプチドを発現する細胞を前記
薬剤とともにインキュベートすることにより実施される、請求項１９に記載の方
法。
【請求項２１】前記薬剤が、内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ
遺伝子の発現を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】前記薬剤が、ポリヌクレオチドを含む、請求項２１に記載
の方法。
【請求項２３】前記薬剤が、配列番号２、４、または６のいずれか１つに
記載の配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を
阻害し得る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】ガン細胞の増殖を阻害するための方法であって、ガン細胞
を、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性を阻害する薬剤と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項２５】前記薬剤が、内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ
遺伝子の発現を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記薬剤が、請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記薬剤が、配列番号２、４、または６のいずれか１つに
記載の配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を
阻害し得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】前記ガン細胞が、乳ガン細胞である、請求項２４に記載の
方法。
【請求項２９】哺乳動物におけるガンの発達および／または転移を阻害す
るための方法であって、哺乳動物に、スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ活性
を阻害する薬剤を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】前記薬剤が、内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ
遺伝子の発現を阻害する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】前記薬剤が、請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】前記薬剤が、配列番号２、４、または６のいずれか１つに
記載の配列を含むポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力を
阻害し得る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】前記薬剤が、標的化成分に連結されている、請求項２９に
記載の方法。
【請求項３４】前記標的化成分が、抗腫瘍抗体である、請求項３３に記載
の方法。
【請求項３５】前記標的化成分が、エストロゲンレセプターに結合する、
請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】前記哺乳動物が、乳ガンに罹患している、請求項２９に記
載の方法。
【請求項３７】哺乳動物におけるガンを診断するための方法であって、哺
乳動物から得たサンプルにおける内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ遺
伝子の変化を検出する工程、およびそこから該哺乳動物におけるガンを診断する
工程を包含する、方法。
【請求項３８】前記変化が欠失である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】前記ガンが乳ガンであり、そして前記サンプルが乳房腫瘍
生検である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】ガンの予後を評価するための方法であって、ガンに罹患し
た哺乳動物から得たサンプルにおける内因性スフィンゴシン−１−リン酸リアー
ゼ遺伝子の変化の存在または非存在を決定する工程、およびそこから予後を決定
する工程を包含する、方法。
【請求項４１】前記変化が欠失である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】前記欠失が、配列番号４のアミノ酸残基３５４〜４３３を
含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】前記ガンが乳ガンであり、そして前記サンプルが乳房腫瘍
生検である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】配列番号２、４、または６のいずれか１つに記載の配列を
有するポリペプチドに結合する、単離された抗体。
【請求項４５】配列番号２、４、または６のいずれか１つに記載の配列を
有するポリペプチドに結合する、モノクローナル抗体。
【請求項４６】前記抗体が、配列番号２、４、または６のいずれか１つに
記載の配列を有するポリペプチドのスフィンゴシン−１−リン酸を分解する能力
を阻害する、請求項４４または請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】サンプル中のスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを検出
するための方法であって、以下の工程：（ａ）サンプルを、請求項４４または請求項４５に記載の抗体と、該抗体がス
フィンゴシン−１−リン酸リアーゼに結合するのを可能にするに十分な条件下で
かつ充分な時間接触させる工程；および（ｂ）該サンプルにおいて、該抗体に結合したスフィンゴシン−１−リン酸リ
アーゼの存在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項４８】サンプル中のスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼを検出
するためのキットであって、請求項４４または請求項４５に記載の抗体、および
緩衝液または検出試薬を含む、キット。
【請求項４９】サンプル中のスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼ遺伝子
の変化を検出するためのキットであって、請求項６に記載のポリヌクレオチドお
よび検出試薬を含む、キット。
【請求項５０】トランスジェニック動物であって、スフィンゴシン−１−
リン酸リアーゼ活性が、野生型動物と比較して減少している、動物。
【請求項５１】請求項５０に記載のトランスジェニック動物に由来する、
細胞株。