JP4912657B2 - 大腸癌マーカー遺伝子 - Google Patents
大腸癌マーカー遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4912657B2 JP4912657B2 JP2005297645A JP2005297645A JP4912657B2 JP 4912657 B2 JP4912657 B2 JP 4912657B2 JP 2005297645 A JP2005297645 A JP 2005297645A JP 2005297645 A JP2005297645 A JP 2005297645A JP 4912657 B2 JP4912657 B2 JP 4912657B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- seq
- dna
- leu
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
我々が見いだしたHmat-Xaの腫瘍における発現調節についても、今後、同様にして、詳細な解析が必要となろう。
マンノース転移酵素としては、リピド中間体生合成以外に、GPIアンカー蛋白における糖鎖の生合成に関わるマンノース転移酵素やO-マンノシル化蛋白のマンノシル化を触媒する酵素も見つかっている。そして、これらにおいても、その欠損により重篤な症状を示すヒト遺伝病が見つかっている。しかし、これらの他にはマンノース転移酵素の存在は知られていない。
以上のように、生体内におけるマンノース転移酵素の役割として、特に癌などの疾患との係わりに関する知見は、まだ蓄積しつつある段階にある。本発明は、ヒト由来の新規なマンノース転移酵素遺伝子(特に、全生物を通じて未知であるGDP-マンノースを糖供与体とするマンノース転移酵素IIおよびマンノース転移酵素IV)をクローニングすることを解決すべき課題とした。さらに本発明は、例えば、その欠陥がヒト先天的グリコシル化異常症の原因遺伝子となるような、また、癌のマーカー遺伝子となるような、マンノース転移酵素遺伝子をクローニングすることを解決すべき課題とした。さらに本発明は、得られたマンノース転移酵素遺伝子を用いて、ヒト先天的グリコシル化異常症の遺伝子診断や癌の診断方法を提供することを解決すべき課題とした。
酸配列、(3)糖ヌクレオチドを供与体とする糖転移酵素に共通の、DXDあるいは DDX 配列、(4)糖ヌクレオチドにおけるα-グリコシド結合を、そのまま維持して結合するretaining typeの糖転移酵素に共通のEX7E配列、(5)酵母リピド中間体生合成に働く糖転移酵素、酵母ドリコールキナーゼ(Sec59蛋白)、イヌオリゴ糖転移酵素ribophorin Iサブユニットなどで提唱された仮想的ドリコール認識配列PDRSの、以上、5つである。
次に、これらの塩基配列およびアミノ酸配列の情報をもとに、更に検索を進めて得た全ORFと思われる領域を含む塩基配列をもとに設計したプライマーを用いてヒト胎児脳cDNAプールを鋳型にPCRを行った。さらに、得られたPCR産物を用いて、ヒト胎児脳cDNA ライブラリーを検索した結果、アミノ酸457残基をコードする1371塩基から成るORFを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(b)配列番号1に記載の塩基配列において、1若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含む塩基配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(c)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のDNA又は組み換えベクターを有する、形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、大腸癌のマーカーとして上記した本発明の蛋白質を使用する方法が提供される。
(1)本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、下記(A)又は(B)の何れかの蛋白質である。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。
換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列」における「1若しくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、1から20個、好ましくは1から10個、より好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個程度を意味する。
本発明のDNAは、上記(1)に記載した本発明の蛋白質をコードするDNAであり、好ましくは、下記(a)、(b)又は(c)の何れかのDNAである。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(b)配列番号1に記載の塩基配列において、1若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含む塩基配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(c)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。
本発明は、上記した本発明の蛋白質をエピトープ(抗原)として認識する抗体に関する。
株を得ることができる。
本発明は、上記した本発明の蛋白質に対する抗体を含む大腸癌の診断薬、並びに、生体試料中における本発明の蛋白質の発現を本発明の抗体を用いて検出又は測定することを含む大腸癌の診断方法に関する。ここで用いる生体試料としてはヒトや動物から採取した生体試料(例えば、臓器、生体組織、血液、尿など)、あるいはこれらの生体試料から樹立した初代培養細胞又は細胞株などが用いられる。
本発明は、上記した本発明のDNAの塩基配列の部分配列又はその相補配列から成るオリゴヌクレオチドに関する。
本発明のオリゴヌクレオチドの具体例としては、本発明のDNAの塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、当該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体などが挙げられる。さらに具体的には、配列番号1の塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。また、配列の長さは、一般的には5〜100塩基であり、好ましくは10〜60塩基であり、より 好ましくは15〜50塩基である。
本発明は、上記した本発明のオリゴヌクレオチドを含む大腸癌の診断薬、並びに、生体試料中における本発明のDNAの発現を本発明のオリゴヌクレオチドを用いて検出又は測定することを含む大腸癌の診断方法に関する。
段落番号0008に記したように、全生物を通じて、その遺伝子が未だにクローニングされていないマンノース転移酵素IIおよびマンノース転移酵素IVも、上記のマンノース転移酵素I、マンノース転移酵素IIIおよびマンノース転移酵素Vと同様に、糖ヌクレオチドであるGDP-マンノースをマンノース供与体としている。そこで、以下のパラメーターを用いてバイオインフォーマティックスの手法で、未知遺伝子のクローニングを企てた。検索に用いたパラメーターは、(1)CaZY などを用いた、ヒトのマンノース転移酵素I、マンノース転移酵素III、マンノース転移酵素Vを始めとする、糖ヌクレオチドを糖供与体とする糖転移酵素に共通なドメインGlycosyltransferase group 1 domainを持つ糖転移酵素および糖転移酵素候補のアミノ酸配列、(2)既知の全生物のマンノース転移酵素のアミノ酸配列、(3)糖ヌクレオチドを供与体とする糖転移酵素に共通の、DXDあるいは DDX 配列、(4)糖ヌクレオチドにおけるα-グリコシド結合を維持して結合する糖転移酵素に共通のEX7E配列、(5)酵母リピド中間体生合成に働く糖転移酵素、酵母ドリコールキナーゼ(Sec59蛋白)、イヌオリゴ糖転移酵素ribophorin Iサブユニットなどで提唱された仮想的ドリコール認識配列PDRS、である。
以上のことから、まず、Pfamに登録されているGlycosyltransferase group 1 domainを持つ糖転移酵素グループに属する約1000の蛋白のうち、真核生物由来のもので、機能未知のものをリストアップした。
また、CAZYのglycosyltransferase family の方の検索をすると、Hmat-3遺伝子およびHmat-5遺伝子が属しているglycosyltransferase family 4に未知ヒトESTクローンAK021815があり、それは我々が見いだしたHmat-Xa遺伝子に相同であることがわかった。
このAK021815 をもとに、以下の検索をおこなった。EST クローンAK021815と、これにBLASTでヒットしたESTクローンAK091684を比較して、AK091684がAK021815よりも5'側に637bp伸長していることを見出した(同時にAK091684がエクソン1つ分スキップしていることも見出した; 下図の黒の大文字配列が欠如したエクソンに相当)。また、AK021815の最上流側エクソンを含むゲノミッククローンAC010681には、このAK091684の637bp配列は含まれていなかった。そこで、AK091684の配列(全長2353bp)で再度BLAST検索を行ったところ、AC010681に隣接するゲノミッククローンAC009957が検出され、この中にAK091684の2〜613番目のヌクレオチドが4分割されて含まれていた(614〜967番目のヌクレオチドは、同時に検出されたAC010681中に含まれていた)。また、AK091684の2〜400番目のヌクレオチドを元にESTデータベースを検索したところ、AK091684よりもさらに5'側に伸長したESTクローンが複数検出され(BG027230, BG427368等)、これらESTクローンの5'側伸長部分のコンセンサスをとり、Hmat-Xa cDNA配列を5'側にさらに59bp伸長させた(この59bp配列は、ゲノミッククローンAC009957にさらに5'側に隣接するゲノミッククローンAC010130に含まれる)。この59bp配列の5'側には、なおもスプライシングによりエクソンが連結している可能性が残されているが、59bp配列中には、in frameで終止コドン(TAG)が存在するため、開始コドンは、AK091684の93〜95番目の位置(ATG)であると結論づけられた。
attgtgcttcaagaagaccatagggaagaacgcattttcatcttgctgcaaaagttgcaatagaa/
gatctgaaggtttgaatgggccaATGagtatcctcatcattgaagcattctatggaggctcccataaacagctggtggat
cttcttcaagaagagttaggagactgtgtcgtttatacccttcctgcaaagaaatggcattggagagcccggacatctgc
tttatatttctctcagaccattcccatcagtgagcattacag/
gaccctctttgcaagttcagtgcttaacctgaccgaactggctgcccttcggcctgaccttgggaaactgaaaaagattc
tgtattttcacgagaaccagttgatatatcctgtcaagaaatgtcaggagagggatttccaatatggatacaaccaaatt
ctttcatg/
cctggtggctgatgtggttgtattcaactcagtttttaatatggaatcatttctcacttccatgggaaaatttatgaagc
tgattcctgatcacagacccaaggatctggaaagcatcatcagacccaagtgccaagttatttactttcccatcaggttt
cctgatgtgagcag/
attcatgcccaagcacaaaacaacccatttaaagaagatgctcggccttaaaggaaatggcggtgcggttctgtccatgg
cccttccttttcagccagagcagagagattcagaggatttattgaagaattttaattcagagtgtgatacacactgtggc
cttgatactgcacgacaagaatatttgggtaactcattaagacaggaatcagacttgaaaaaatccacctcgtcagataa
ttcaagctctcatcatggtgaaaataaacaaaatctgactgttgatccctgtgacattttgggtggagttgataatcagc
aaagactgctacacattgtctggcctcacaggtg/
ggagcatgataaagatccagaaagcttttttaaggtattaatgcatcttaaagacttaggactcaatttccacgtgtctg
tacttggagaaaccttcacagatgtcccag
ATATTTTTTCAGAGGCCAAAAAGGCATTGGGATCTTCTGTCTTACACTGGGGCTACTTACCCAGCAAAGATGACTACTTC
CAAGTACTGTGCATGGCTGATGTTGTCATCTCAACAGCTAAGCATGAATTCTTTGGAGTGGCAAT/
gttggaagctgtgtactgtgggtgttacccactttgtcctaaagatttggtttatcccgaaatatttccag/
ctgaatatctgtattctacacctgaacagctttcaaaaaggctccagaatttctgcaagagaccagatattaTAAgaaaa
catctctataag/
ggtgaaatcgctccgttttcttgggcagccctacatggtaaattcaggtctctgcttacaacagaacctagggaagattt
gTGAcagatggggctaagtcacaaacttgcagcctaaggcagagtctgaagaactttccagagtgtgcccatatttacct
gatcagagagaaaagaaaatctgcagaggaagctgagcctggctgcttgtcatagctgacacagagccatctgccacaaa
cctgtggcggcttcagatctccaatccctgccaccaccccaactcaaattaaatacagattcctagagacgttatgatgg
ttacacatgtcctcggcatcacatgtaggagactgttcaaaaaaaatatgtggcctgttgtataaccgcactcatgtatc
ccatatgtggtgccacattgaatttccggttgaatccgtttttatcctttgtactggatgacatggtgcctgaattcttt
cttttcgccgacacgatggcagccaaactgcagcttcaaacgctcacacttggctgggtttctacctaggttgccaggtt
atcatcggagccttcttgtgtcctcaaagggccacgaggcctgaaaggaggatcagaatgctttgggattaattgggcag
ccatcgcagaattgtttgtgggcaaagggctgctttagcacttttcttttagcaaattaatgactctcaggcacaggggg
ttttaagtgaaggtattaataagaggtctggcaggtattcccatgattcacagagttacatttgcatttaattaatctta
aagttgcaagataaacagctgtaattcggacaaacatgacaaacacagtgaagccaactatcccataaaatgaacactga
catacttgttttaatttttttcccagcgtaaaaatagaaaaatcaaaatactcctaacaaaaccagtgattttgatagaa
atatttctccaatatacttgcatccacctacaaatataaccttttcaagataaatcgcttatgatttcaatagtcaaact
gctgtgtttgttgatgtaaagatgttttgaatggctagatggtaaaataaattcttaataaagtacccactgc
XA-9F : ATCAGATTGTGCTTCAAGAAGACCATAGGG (配列番号7)
XA-10R : TGACAAGCAGCCAGGCTCAGCTTCCTCTGC (配列番号8)
を設計し(グライナージャパンに委託合成)、brain及びliverのcDNAプール(MTC Panel Human I;Clontech)を鋳型にして、以下の条件で、PCRを行った。
Human MTC Panel のcDNA (brainまたはliver) 5μl
dH2O 36.25μl
10×buffer (酵素付属、No.1) 5μl
10mM dNTP mix 1μl
10μM各プライマー 1μlずつ
Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics)のenzyme mix 0.75μl
反応液のtotal 50μl
94℃ 1 minの後、(94℃ 30 sec・68℃ 3 min) × 50 cycles、68℃ 2 min
こうして、pUCベクターにクローニング後、それら2つのサイズの陽性クローンの塩基配列を決定した。
puCF: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (配列番号9)
pUCR: CGGATAACAATTTCACACAGGAAAC (配列番号10)
XA-5R: TCTGCTCTGGCTGAAAAGGAAGGGCCATGG (配列番号11)
XA-7F: GAAGATGCTCGGCCTTAAAGGAAATGGCGG (配列番号12)
開始コドンと終始コドンを大文字で示した。
gtatctctgcatTAGccagattggacatatgtaaagggacatcagtatatctggatcatcagattgtgcttcaagaagac
catagggaagaacgcattttcatcttgctgcaaaagttgcaatagaagatctgaaggtttgaatgggccaATGagtatcc
tcatcattgaagcattctatggaggctcccataaacagctggtggatcttcttcaagaagagttaggagactgtgtcgtt
tatacccttcctgcaaagaaatggcattggagagcccggacatctgctttatatttctctcagaccattcccatcagtga
gcattacaggaccctctttgcaagttcagtgcttaacctgaccgaactggctgcccttcggcctgaccttgggaaactga
aaaagattctgtattttcacgagaaccagttgatatatcctgtcaagaaatgtcaggagagggatttccaatatggatac
aaccaaattctttcatgcctggtggctgatgtggttgtattcaactcagtttttaatatggaatcatttctcacttccat
gggaaaatttatgaagctgattcctgatcacagacccaaggatctggaaagcatcatcagacccaagtgccaagttattt
actttcccatcaggtttcctgatgtgagcagattcatgcccaagcacaaaacaacccatttaaagaagatgctcggcctt
aaaggaaatggcggtgcggttctgtccatggcccttccttttcagccagagcagagagattcagaggatttattgaagaa
ttttaattcagagtgtgatacacactgtggccttgatactgcacgacaagaatatttgggtaactcattaagacaggaat
cagacttgaaaaaatccacctcgtcagataattcaagctctcatcatggtgaaaataaacaaaatctgactgttgatccc
tgtgacattttgggtggagttgataatcagcaaagactgctacacattgtctggcctcacaggtgggagcatgataaaga
tccagaaagcttttttaaggtattaatgcatcttaaagacttaggactcaatttccacgtgtctgtacttggagaaacct
tcacagatgtcccagATATTTTTTCAGAGGCCAAAAAGGCATTGGGATCTTCTGTCTTACACTGGGGCTACTTACCCAGC
AAAGATGACTACTTCCAAGTACTGTGCATGGCTGATGTTGTCATCTCAACAGCTAAGCATGAATTCTTTGGAGTGGCAAT
gttggaagctgtgtactgtgggtgttacccactttgtcctaaagatttggtttatcccgaaatatttccagctgaatatc
tgtattctacacctgaacagctttcaaaaaggctccagaatttctgcaagagaccagatattaTAAgaaaacatctctat
aagggtgaaatcgctccgttttcttgggcagccctacatggtaaattcaggtctctgcttacaacagaacctagggaaga
tttgTGAcagatggggctaagtcacaaacttgcagcctaaggcagagtctgaagaactttccagagtgtgcccatattta
cctgatcagagagaaaagaaaatctgcagaggaagctgagcctggctgcttgtcatagctgacacagagccatctgccac
aaacctgtggcggcttcagatctccaatccctgccaccaccccaactcaaattaaatacagattcctagagacgttatga
tggttacacatgtcctcggcatcacatgtaggagactgttcaaaaaaaatatgtggcctgttgtataaccgcactcatgt
atcccatatgtggtgccacattgaatttccggttgaatccgtttttatcctttgtactggatgacatggtgcctgaattc
tttcttttcgccgacacgatggcagccaaactgcagcttcaaacgctcacacttggctgggtttctacctaggttgccag
gttatcatcggagccttcttgtgtcctcaaagggccacgaggcctgaaaggaggatcagaatgctttgggattaattggg
cagccatcgcagaattgtttgtgggcaaagggctgctttagcacttttcttttagcaaattaatgactctcaggcacagg
gggttttaagtgaaggtattaataagaggtctggcaggtattcccatgattcacagagttacatttgcatttaattaatc
ttaaagttgcaagataaacagctgtaattcggacaaacatgacaaacacagtgaagccaactatcccataaaatgaacac
tgacatacttgttttaatttttttcccagcgtaaaaatagaaaaatcaaaatactcctaacaaaaccagtgattttgata
gaaatatttctccaatatacttgcatccacctacaaatataaccttttcaagataaatcgcttatgatttcaatagtcaa
actgctgtgtttgttgatgtaaagatgttttgaatggctagatggtaaaataaattcttaataaagtacccactgc
下線部はORF2のアミノ酸配列とは異なる配列を示す。
MSILIIEAFYGGSHKQLVDLLQEELGDCVVYTLPAKKWHWRARTSALYFSQTIPISEHYRTLFASSVLNLTELAALRPDL
GKLKKILYFHENQLIYPVKKCQERDFQYGYNQILSCLVADVVVFNSVFNMESFLTSMGKFMKLIPDHRPKDLESIIRPKC
QVIYFPIRFPDVSRFMPKHKTTHLKKMLGLKGNGGAVLSMALPFQPEQRDSEDLLKNFNSECDTHCGLDTARQEYLGNSL
RQESDLKKSTSSDNSSSHHGENKQNLTVDPCDILGGVDNQQRLLHIVWPHRWEHDKDPESFFKVLMHLKDLGLNFHVSVL
GETFTDVPDIFSEAKKALGSSVLHWGYLPSKDDYFQVLCMADVVISTAKHEFFGVAMLEAVYCGCYPLCPKDLVYPEIFP
AEYLYSTPEQLSKRLQNFCKRPDIIRKHLYKGEIAPFSWAALHGKFRSLLTTEPREDL(term)
開始コドンと終始コドンを大文字で示した。
gtatctctgcatTAGccagattggacatatgtaaagggacatcagtatatctggatcatcagattgtgcttcaagaagac
catagggaagaacgcattttcatcttgctgcaaaagttgcaatagaagatctgaaggtttgaatgggccaATGagtatcc
tcatcattgaagcattctatggaggctcccataaacagctggtggatcttcttcaagaagagttaggagactgtgtcgtt
tatacccttcctgcaaagaaatggcattggagagcccggacatctgctttatatttctctcagaccattcccatcagtga
gcattacaggaccctctttgcaagttcagtgcttaacctgaccgaactggctgcccttcggcctgaccttgggaaactga
aaaagattctgtattttcacgagaaccagttgatatatcctgtcaagaaatgtcaggagagggatttccaatatggatac
aaccaaattctttcatgcctggtggctgatgtggttgtattcaactcagtttttaatatggaatcatttctcacttccat
gggaaaatttatgaagctgattcctgatcacagacccaaggatctggaaagcatcatcagacccaagtgccaagttattt
actttcccatcaggtttcctgatgtgagcagattcatgcccaagcacaaaacaacccatttaaagaagatgctcggcctt
aaaggaaatggcggtgcggttctgtccatggcccttccttttcagccagagcagagagattcagaggatttattgaagaa
ttttaattcagagtgtgatacacactgtggccttgatactgcacgacaagaatatttgggtaactcattaagacaggaat
cagacttgaaaaaatccacctcgtcagataattcaagctctcatcatggtgaaaataaacaaaatctgactgttgatccc
tgtgacattttgggtggagttgataatcagcaaagactgctacacattgtctggcctcacaggtgggagcatgataaaga
tccagaaagcttttttaaggtattaatgcatcttaaagacttaggactcaatttccacgtgtctgtacttggagaaacct
tcacagatgtcccaggttggaagctgtgtactgtgggtgttacccactttgtcctaaagatttggtttatcccgaaatat
ttccagctgaatatctgtattctacacctgaacagctttcaaaaaggctccagaatttctgcaagagaccagatattaTA
Agaaaacatctctataagggtgaaatcgctccgttttcttgggcagccctacatggtaaattcaggtctctgcttacaac
agaacctagggaagatttgTGAcagatggggctaagtcacaaacttgcagcctaaggcagagtctgaagaactttccaga
gtgtgcccatatttacctgatcagagagaaaagaaaatctgcagaggaagctgagcctggctgcttgtcatagctgacac
agagccatctgccacaaacctgtggcggcttcagatctccaatccctgccaccaccccaactcaaattaaatacagattc
ctagagacgttatgatggttacacatgtcctcggcatcacatgtaggagactgttcaaaaaaaatatgtggcctgttgta
taaccgcactcatgtatcccatatgtggtgccacattgaatttccggttgaatccgtttttatcctttgtactggatgac
atggtgcctgaattctttcttttcgccgacacgatggcagccaaactgcagcttcaaacgctcacacttggctgggtttc
tacctaggttgccaggttatcatcggagccttcttgtgtcctcaaagggccacgaggcctgaaaggaggatcagaatgct
ttgggattaattgggcagccatcgcagaattgtttgtgggcaaagggctgctttagcacttttcttttagcaaattaatg
actctcaggcacagggggttttaagtgaaggtattaataagaggtctggcaggtattcccatgattcacagagttacatt
tgcatttaattaatcttaaagttgcaagataaacagctgtaattcggacaaacatgacaaacacagtgaagccaactatc
ccataaaatgaacactgacatacttgttttaatttttttcccagcgtaaaaatagaaaaatcaaaatactcctaacaaaa
ccagtgattttgatagaaatatttctccaatatacttgcatccacctacaaatataaccttttcaagataaatcgcttat
gatttcaatagtcaaactgctgtgtttgttgatgtaaagatgttttgaatggctagatggtaaaataaattcttaataaa
gtacccactgc
下線部はORF1のアミノ酸配列とは異なる配列を示す。
MSILIIEAFYGGSHKQLVDLLQEELGDCVVYTLPAKKWHWRARTSALYFSQTIPISEHYRTLFASSVLNLTELAALRPDL
GKLKKILYFHENQLIYPVKKCQERDFQYGYNQILSCLVADVVVFNSVFNMESFLTSMGKFMKLIPDHRPKDLESIIRPKC
QVIYFPIRFPDVSRFMPKHKTTHLKKMLGLKGNGGAVLSMALPFQPEQRDSEDLLKNFNSECDTHCGLDTARQEYLGNSL
RQESDLKKSTSSDNSSSHHGENKQNLTVDPCDILGGVDNQQRLLHIVWPHRWEHDKDPESFFKVLMHLKDLGLNFHVSVL
GETFTDVPGWKLCTVGVTHFVLKIWFIPKYFQLNICILHLNSFQKGSRISARDQIL(term)
上記の方法によるHmat-Xa遺伝子のクローニングと平行して、微生物起源のマンノース転移酵素のアミノ酸配列をもとに、ヒトESTデータベースに対して、新規糖転移酵素遺伝子候補をtBLASTn検索した結果、結核菌Mycobacterium tuberculosisのPimC遺伝子の遺伝子産物である仮想的マンノース転移酵素(Q9RLP4)およびMethanosarcina mazeiのマンノース転移酵素(Q8PZ44)が、Hmat-Xa遺伝子と相同性を持つ蛋白して検出された。このことから、Hmat-Xa遺伝子がマンノース転移酵素をコードする遺伝子である可能性が示唆された。
Hmat-Xa遺伝子(ORF1)のヒト組織別の発現および正常腺上皮および腺癌における発現をRT-PCR法により、半定量的に検討した。具体的には、以下の通り行った。
MTC Panelの各cDNA 5μl
dH2O 36.25μl
10×buffer (酵素付属、No.1) 5μl
10mM dNTP mix 1μl
プライマーmix(XA-17FおよびXA-10R;各10μM) 2μl
Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics)のenzyme mix 0.75μl
反応液のtotal 50μl
94℃ 30 secの後、(94℃ 30 sec(変性)・68℃ 2 min(アニーリング)) ×30または34 cycles、68℃ 2 min(伸長)
Hmat-Xa遺伝子は、前記したように、酵母に相同な配列が見あたらない、そして、本項に示したように、ヒト組織間で発現の程度に相違がある。一方、リピド中間体生合成に働く遺伝子は真核生物間で普遍に存在している(保存されている)遺伝子であり、また、常に発現している、いわゆる、ハウスキーピング遺伝子であり、真核生物の各組織で同程度に発現している遺伝子である(私達は、ヒト・マンノース転移酵素I遺伝子およびヒト・マンノース転移酵素III遺伝子の組織別発現を検討したが、組織に於ける発現の程度に大きな違いは見られなかった)。そのようなことから、Hmat-Xa遺伝子はリピド中間体生合成に働くマンノース転移酵素ではないことが予想される。
この目的のために、まずHAタグ付加Hmat-Xa遺伝子を作製した。すなわち、すでにpUCベクターにクローニングしたORF1を含む配列(配列番号1)をPCRで増幅し、動物細胞発現用ベクター(pMH; Roche Diagnostics)のKpnI-NotI部位間に組み込んだ。
PCRの条件と反応組成液は、実施例2に記してある通りである。但し、鋳型DNAは形質転換株由来であり、プライマーは下記の通りである。
XA-11FK aaggtaccaccATGAGTATCCTCATCATTG(配列番号14)
XA-12RN gggcggccgCAAATCTTCCCTAGGCTCTGT(配列番号15)
PCR の条件と反応液組成は、実施例2に記してある通りである。但し、鋳型DNA は形質転換株由来であり、プライマーは下記の通りである。
HA-RX: ggctcgagTTAGACGTAGTCTGGGACGTCG (配列番号16)
XA-11FS: gggtcgacATGAGTATCCTCATCATTGAAG (配列番号17)
Fugene 6(Roche)を 6μl、HAタグ付加Hmat-Xa 遺伝子含有コンストラクトを2μg含み、無血清DMEM培地で全量を100μlとした後、その全量を、HeLa細胞をDMEM培地で対数増殖期(3×105細胞/ml)まで4ml量培養したシャーレに加えた。3日間培養後、コロニー形成させるために、細胞懸濁液を1/64および1/128に希釈して、ジェネティシン(400 μg/ml)含有DMEM培地4ml中にまいた。さらに10日間培養後、コロニー形成した細胞を集め、96穴プレート、24穴プレート、100mmシャーレの順に培養して行き、1コロニー由来の細胞を増やした。このような中から、形質転換株を得た。
<方法>
酵母YPH499株をYPDA培地1mlにて、30℃恒温槽で9時間振盪培養後、遠心で集菌し、そこに、100μlのOne Step Buffer(0.2M 酢酸リチウム、40% PEG4000、100mM DTT)を加えて懸濁。HAタグ付加Hmat-Xa遺伝子含有pESC-URAベクター溶液3μl(2μg)を加えて混合し、45℃恒温槽で、30分間、ヒートショックを与えた後、SD-URA寒天培地に、塗布し、30℃で3日間培養した。
HeLa 細胞におけるHAタグ付加Hmat-Xa遺伝子の存在をPCR 法で、また、同遺伝子のRNAへの発現(転写)をRT-PCR 法で確認した。また、酵母におけるHAタグ付加Hmat-Xa遺伝子の存在をPCR 法で確認した。
HeLa導入HAタグ配列付加Hmat-Xa遺伝子の存在および転写確認用
Forward: XR-17F(前述)
Reverse: H1-CHR(HA タグ配列 含有プライマー)
GACGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGTCTAA (配列番号18)
Forward: XR-17F(前述)
Reverse: XR-10R(前述)
(1)PCR反応液組成:
0.2mM dNTPmix
0.2μM Fプライマー
0.2μM Rプライマー
0.75μg template DNA
2.6U Expand High Fidelity PCR System Enzyme(Roche Diagnostics)
10 X Buffer (酵素液に付随)
15mM MgCl2
Total 50μl
1、 94℃ 1min (変性)
2、 94℃ 1min (変性)
3、 55℃ 1min (アニーリング)
4、 72℃ 1min (伸長)
5、 4℃ 30min
2〜4を35回繰り返す。
(1)RT-PCR反応液組成:
Ready-To-Go RT-PCR Beads (Amersham Pharmacia Biotech)
200nM F、Rプライマー
RNA 1ng
0.1% DEPC含有滅菌水
Total 50μl
1、 42℃ 45min (逆転写酵素反応)
2、 94℃ 5min (変性)
3、 94℃ 1min (変性)
4、 55℃ 1min (アニーリング)
5、 72℃ 1min (伸長)
6、 4℃ 30min
3〜5を45回繰り返す。
Forward: XR-17F(前述)
Reverse: H1-CHR(HA タグ配列 含有プライマー、前述)
図2(a)は、HAタグ付加Hmat-Xa遺伝子形質転換細胞に於ける同遺伝子の存在をPCRで確認した結果を示す。その結果、図の様に、プライマーから予想された、長さ約980bPのサイズのバンドがHeLa細胞の系(レーン2)および酵母の系(レーン3)で検出されたので、同遺伝子が両細胞内に導入されたことが確認できた。
ウエスタン法
1.HAタグ付加Hmat-Xa遺伝子形質転換HeLa細胞からのSDS-PAGE用サンプルの調製
HAタグ付加Hmat-Xa遺伝子形質転換HeLa細胞を、DMEM 培地+ 10%FCSを含む100mmの組織培養用シャーレ12枚で培養後、培地を除去し、さらに、細胞を氷冷PBS(-)で2度洗浄した。次に、細胞を2%EDTA-PBS(-)溶液ではがして遠心で回収した。沈殿した細胞をPBS(-)200μlで洗浄し湿重量を測定した。細胞湿重量の10倍量のサンプルバッファー[2%SDS, 100mM DTT, 0.36M Tris-HCl(pH6.8), 1mM PMSF]を加えピペッテング後、100℃で、5分間煮沸した。サンプルを氷冷後、20Gの注射針をつけたシリンジで30秒間、続いて、26Gの注射針をつけたシリンジで30秒間吸引排出した後、15000rpm、4℃、15min遠心し、上清(SDS可溶化画分)を回収した。そして、上清の蛋白量を測定した。
ゲル板で、縦9 cm、横10cm、厚さ1mmの、1%SDS-10%ポリアクリルアミドゲルを作成し、蛋白量を揃えたサンプル質溶液をゲルのウェルに加えた。30mA/gelの定電流で泳動した。ゲルをプラステック容器に移し、転写buffer 100mlを加えて洗浄した(この洗浄を5回繰り返した)後、ブロッティング装置にてPVDF膜に転写した。さらに、ブロッティング後のPVDF膜を10%スキムミルク溶液でブロッキング後、TBS-Tで洗浄した。
PVDF膜をハイブリダイゼーション用パック中で、家兎抗HA抗体(Bethyl laboratories, Inc:A190-108A)の10%スキムミルク溶液による1000倍希釈液5mlと、室温で1時間反応させた。PVDF膜をTBS-Tで洗浄した(この洗浄を5回繰り返した)後、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗家兎抗体(Amersham Biosciences NIF824)の、10%スキムミルク溶液による1000倍希釈液10mlと、室温で1時間反応させた。PVDF膜をTBS-Tで洗浄した(この洗浄を5回繰り返した)
PVDF膜をラップの上に置き、PVDF膜面積(cm2)あたり、0.1mlの検出液(Amersham Bio sciences: RPN2132)をのせ、5分間放置した。検出液を除去後、PVDF膜をラップで包み 、その上にX線フィルム[Hyper film ECL (Amersham: 型番 RPN2104K)]を置き、Hyper film cassetteにセットし、30秒間、1分間、5分間、30分間露光させた。続いて、露光させたX線フィルムを現像した。
<110> Tokai University
<120> A marker gene for colon cancer
<130> A51782A
<160> 18
<210> 1
<211> 2556
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
gtatctctgc attagccaga ttggacatat gtaaagggac atcagtatat ctggatcatc 60
agattgtgct tcaagaagac catagggaag aacgcatttt catcttgctg caaaagttgc 120
aatagaagat ctgaaggttt gaatgggcca atgagtatcc tcatcattga agcattctat 180
ggaggctccc ataaacagct ggtggatctt cttcaagaag agttaggaga ctgtgtcgtt 240
tatacccttc ctgcaaagaa atggcattgg agagcccgga catctgcttt atatttctct 300
cagaccattc ccatcagtga gcattacagg accctctttg caagttcagt gcttaacctg 360
accgaactgg ctgcccttcg gcctgacctt gggaaactga aaaagattct gtattttcac 420
gagaaccagt tgatatatcc tgtcaagaaa tgtcaggaga gggatttcca atatggatac 480
aaccaaattc tttcatgcct ggtggctgat gtggttgtat tcaactcagt ttttaatatg 540
gaatcatttc tcacttccat gggaaaattt atgaagctga ttcctgatca cagacccaag 600
gatctggaaa gcatcatcag acccaagtgc caagttattt actttcccat caggtttcct 660
gatgtgagca gattcatgcc caagcacaaa acaacccatt taaagaagat gctcggcctt 720
aaaggaaatg gcggtgcggt tctgtccatg gcccttcctt ttcagccaga gcagagagat 780
tcagaggatt tattgaagaa ttttaattca gagtgtgata cacactgtgg ccttgatact 840
gcacgacaag aatatttggg taactcatta agacaggaat cagacttgaa aaaatccacc 900
tcgtcagata attcaagctc tcatcatggt gaaaataaac aaaatctgac tgttgatccc 960
tgtgacattt tgggtggagt tgataatcag caaagactgc tacacattgt ctggcctcac 1020
aggtgggagc atgataaaga tccagaaagc ttttttaagg tattaatgca tcttaaagac 1080
ttaggactca atttccacgt gtctgtactt ggagaaacct tcacagatgt cccagatatt 1140
ttttcagagg ccaaaaaggc attgggatct tctgtcttac actggggcta cttacccagc 1200
aaagatgact acttccaagt actgtgcatg gctgatgttg tcatctcaac agctaagcat 1260
gaattctttg gagtggcaat gttggaagct gtgtactgtg ggtgttaccc actttgtcct 1320
aaagatttgg tttatcccga aatatttcca gctgaatatc tgtattctac acctgaacag 1380
ctttcaaaaa ggctccagaa tttctgcaag agaccagata ttataagaaa acatctctat 1440
aagggtgaaa tcgctccgtt ttcttgggca gccctacatg gtaaattcag gtctctgctt 1500
acaacagaac ctagggaaga tttgtgacag atggggctaa gtcacaaact tgcagcctaa 1560
ggcagagtct gaagaacttt ccagagtgtg cccatattta cctgatcaga gagaaaagaa 1620
aatctgcaga ggaagctgag cctggctgct tgtcatagct gacacagagc catctgccac 1680
aaacctgtgg cggcttcaga tctccaatcc ctgccaccac cccaactcaa attaaataca 1740
gattcctaga gacgttatga tggttacaca tgtcctcggc atcacatgta ggagactgtt 1800
caaaaaaaat atgtggcctg ttgtataacc gcactcatgt atcccatatg tggtgccaca 1860
ttgaatttcc ggttgaatcc gtttttatcc tttgtactgg atgacatggt gcctgaattc 1920
tttcttttcg ccgacacgat ggcagccaaa ctgcagcttc aaacgctcac acttggctgg 1980
gtttctacct aggttgccag gttatcatcg gagccttctt gtgtcctcaa agggccacga 2040
ggcctgaaag gaggatcaga atgctttggg attaattggg cagccatcgc agaattgttt 2100
gtgggcaaag ggctgcttta gcacttttct tttagcaaat taatgactct caggcacagg 2160
gggttttaag tgaaggtatt aataagaggt ctggcaggta ttcccatgat tcacagagtt 2220
acatttgcat ttaattaatc ttaaagttgc aagataaaca gctgtaattc ggacaaacat 2280
gacaaacaca gtgaagccaa ctatcccata aaatgaacac tgacatactt gttttaattt 2340
ttttcccagc gtaaaaatag aaaaatcaaa atactcctaa caaaaccagt gattttgata 2400
gaaatatttc tccaatatac ttgcatccac ctacaaatat aaccttttca agataaatcg 2460
cttatgattt caatagtcaa actgctgtgt ttgttgatgt aaagatgttt tgaatggcta 2520
gatggtaaaa taaattctta ataaagtacc cactgc 2556
<210> 2
<211> 458
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Met Ser Ile Leu Ile Ile Glu Ala Phe Tyr Gly Gly Ser His Lys Gln
1 5 10 15
Leu Val Asp Leu Leu Gln Glu Glu Leu Gly Asp Cys Val Val Tyr Thr
20 25 30
Leu Pro Ala Lys Lys Trp His Trp Arg Ala Arg Thr Ser Ala Leu Tyr
35 40 45
Phe Ser Gln Thr Ile Pro Ile Ser Glu His Tyr Arg Thr Leu Phe Ala
50 55 60
Ser Ser Val Leu Asn Leu Thr Glu Leu Ala Ala Leu Arg Pro Asp Leu
65 70 75 80
Gly Lys Leu Lys Lys Ile Leu Tyr Phe His Glu Asn Gln Leu Ile Tyr
85 90 96
Pro Val Lys Lys Cys Gln Glu Arg Asp Phe Gln Tyr Gly Tyr Asn Gln
100 105 110
Ile Leu Ser Cys Leu Val Ala Asp Val Val Val Phe Asn Ser Val Phe
115 120 125
Asn Met Glu Ser Phe Leu Thr Ser Met Gly Lys Phe Met Lys Leu Ile
130 135 140
Pro Asp His Arg Pro Lys Asp Leu Glu Ser Ile Ile Arg Pro Lys Cys
145 150 155 160
Gln Val Ile Tyr Phe Pro Ile Arg Phe Pro Asp Val Ser Arg Phe Met
165 170 175
Pro Lys His Lys Thr Thr His Leu Lys Lys Met Leu Gly Leu Lys Gly
180 185 190
Asn Gly Gly Ala Val Leu Ser Met Ala Leu Pro Phe Gln Pro Glu Gln
195 200 205
Arg Asp Ser Glu Asp Leu Leu Lys Asn Phe Asn Ser Glu Cys Asp Thr
210 215 220
His Cys Gly Leu Asp Thr Ala Arg Gln Glu Tyr Leu Gly Asn Ser Leu
225 230 235 240
Arg Gln Glu Ser Asp Leu Lys Lys Ser Thr Ser Ser Asp Asn Ser Ser
245 250 255
Ser His His Gly Glu Asn Lys Gln Asn Leu Thr Val Asp Pro Cys Asp
260 265 270
Ile Leu Gly Gly Val Asp Asn Gln Gln Arg Leu Leu His Ile Val Trp
275 280 285
Pro His Arg Trp Glu His Asp Lys Asp Pro Glu Ser Phe Phe Lys Val
290 295 300
Leu Met His Leu Lys Asp Leu Gly Leu Asn Phe His Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Gly Glu Thr Phe Thr Asp Val Pro Asp Ile Phe Ser Glu Ala Lys Lys
325 330 335
Ala Leu Gly Ser Ser Val Leu His Trp Gly Tyr Leu Pro Ser Lys Asp
340 345 350
Asp Tyr Phe Gln Val Leu Cys Met Ala Asp Val Val Ile Ser Thr Ala
355 360 365
Lys His Glu Phe Phe Gly Val Ala Met Leu Glu Ala Val Tyr Cys Gly
370 375 380
Cys Tyr Pro Leu Cys Pro Lys Asp Leu Val Tyr Pro Glu Ile Phe Pro
385 390 395 400
Ala Glu Tyr Leu Tyr Ser Thr Pro Glu Gln Leu Ser Lys Arg Leu Gln
405 410 415
Asn Phe Cys Lys Arg Pro Asp Ile Ile Arg Lys His Leu Tyr Lys Gly
420 425 430
Glu Ile Ala Pro Phe Ser Trp Ala Ala Leu His Gly Lys Phe Arg Ser
435 440 445
Leu Leu Thr Thr Glu Pro Arg Glu Asp Leu
450 455
<210> 3
<211> 2411
<212> DNA
<213> Human
<400> 3
gtatctctgc attagccaga ttggacatat gtaaagggac atcagtatat ctggatcatc 60
agattgtgct tcaagaagac catagggaag aacgcatttt catcttgctg caaaagttgc 120
aatagaagat ctgaaggttt gaatgggcca atgagtatcc tcatcattga agcattctat 180
ggaggctccc ataaacagct ggtggatctt cttcaagaag agttaggaga ctgtgtcgtt 240
tatacccttc ctgcaaagaa atggcattgg agagcccgga catctgcttt atatttctct 300
cagaccattc ccatcagtga gcattacagg accctctttg caagttcagt gcttaacctg 360
accgaactgg ctgcccttcg gcctgacctt gggaaactga aaaagattct gtattttcac 420
gagaaccagt tgatatatcc tgtcaagaaa tgtcaggaga gggatttcca atatggatac 480
aaccaaattc tttcatgcct ggtggctgat gtggttgtat tcaactcagt ttttaatatg 540
gaatcatttc tcacttccat gggaaaattt atgaagctga ttcctgatca cagacccaag 600
gatctggaaa gcatcatcag acccaagtgc caagttattt actttcccat caggtttcct 660
gatgtgagca gattcatgcc caagcacaaa acaacccatt taaagaagat gctcggcctt 720
aaaggaaatg gcggtgcggt tctgtccatg gcccttcctt ttcagccaga gcagagagat 780
tcagaggatt tattgaagaa ttttaattca gagtgtgata cacactgtgg ccttgatact 840
gcacgacaag aatatttggg taactcatta agacaggaat cagacttgaa aaaatccacc 900
tcgtcagata attcaagctc tcatcatggt gaaaataaac aaaatctgac tgttgatccc 960
tgtgacattt tgggtggagt tgataatcag caaagactgc tacacattgt ctggcctcac 1020
aggtgggagc atgataaaga tccagaaagc ttttttaagg tattaatgca tcttaaagac 1080
ttaggactca atttccacgt gtctgtactt ggagaaacct tcacagatgt cccaggttgg 1140
aagctgtgta ctgtgggtgt tacccacttt gtcctaaaga tttggtttat cccgaaatat 1200
ttccagctga atatctgtat tctacacctg aacagctttc aaaaaggctc cagaatttct 1260
gcaagagacc agatattata agaaaacatc tctataaggg tgaaatcgct ccgttttctt 1320
gggcagccct acatggtaaa ttcaggtctc tgcttacaac agaacctagg gaagatttgt 1380
gacagatggg gctaagtcac aaacttgcag cctaaggcag agtctgaaga actttccaga 1440
gtgtgcccat atttacctga tcagagagaa aagaaaatct gcagaggaag ctgagcctgg 1500
ctgcttgtca tagctgacac agagccatct gccacaaacc tgtggcggct tcagatctcc 1560
aatccctgcc accaccccaa ctcaaattaa atacagattc ctagagacgt tatgatggtt 1620
acacatgtcc tcggcatcac atgtaggaga ctgttcaaaa aaaatatgtg gcctgttgta 1680
taaccgcact catgtatccc atatgtggtg ccacattgaa tttccggttg aatccgtttt 1740
tatcctttgt actggatgac atggtgcctg aattctttct tttcgccgac acgatggcag 1800
ccaaactgca gcttcaaacg ctcacacttg gctgggtttc tacctaggtt gccaggttat 1860
catcggagcc ttcttgtgtc ctcaaagggc cacgaggcct gaaaggagga tcagaatgct 1920
ttgggattaa ttgggcagcc atcgcagaat tgtttgtggg caaagggctg ctttagcact 1980
tttcttttag caaattaatg actctcaggc acagggggtt ttaagtgaag gtattaataa 2040
gaggtctggc aggtattccc atgattcaca gagttacatt tgcatttaat taatcttaaa 2100
gttgcaagat aaacagctgt aattcggaca aacatgacaa acacagtgaa gccaactatc 2160
ccataaaatg aacactgaca tacttgtttt aatttttttc ccagcgtaaa aatagaaaaa 2220
tcaaaatact cctaacaaaa ccagtgattt tgatagaaat atttctccaa tatacttgca 2280
tccacctaca aatataacct tttcaagata aatcgcttat gatttcaata gtcaaactgc 2340
tgtgtttgtt gatgtaaaga tgttttgaat ggctagatgg taaaataaat tcttaataaa 2400
gtacccactg c 2411
<210> 4
<211> 376
<212> PRT
<213> Human
<400> 4
Met Ser Ile Leu Ile Ile Glu Ala Phe Tyr Gly Gly Ser His Lys Gln
1 5 10 15
Leu Val Asp Leu Leu Gln Glu Glu Leu Gly Asp Cys Val Val Tyr Thr
20 25 30
Leu Pro Ala Lys Lys Trp His Trp Arg Ala Arg Thr Ser Ala Leu Tyr
35 40 45
Phe Ser Gln Thr Ile Pro Ile Ser Glu His Tyr Arg Thr Leu Phe Ala
50 55 60
Ser Ser Val Leu Asn Leu Thr Glu Leu Ala Ala Leu Arg Pro Asp Leu
65 70 75 80
Gly Lys Leu Lys Lys Ile Leu Tyr Phe His Glu Asn Gln Leu Ile Tyr
85 90 96
Pro Val Lys Lys Cys Gln Glu Arg Asp Phe Gln Tyr Gly Tyr Asn Gln
100 105 110
Ile Leu Ser Cys Leu Val Ala Asp Val Val Val Phe Asn Ser Val Phe
115 120 125
Asn Met Glu Ser Phe Leu Thr Ser Met Gly Lys Phe Met Lys Leu Ile
130 135 140
Pro Asp His Arg Pro Lys Asp Leu Glu Ser Ile Ile Arg Pro Lys Cys
145 150 155 160
Gln Val Ile Tyr Phe Pro Ile Arg Phe Pro Asp Val Ser Arg Phe Met
165 170 175
Pro Lys His Lys Thr Thr His Leu Lys Lys Met Leu Gly Leu Lys Gly
180 185 190
Asn Gly Gly Ala Val Leu Ser Met Ala Leu Pro Phe Gln Pro Glu Gln
195 200 205
Arg Asp Ser Glu Asp Leu Leu Lys Asn Phe Asn Ser Glu Cys Asp Thr
210 215 220
His Cys Gly Leu Asp Thr Ala Arg Gln Glu Tyr Leu Gly Asn Ser Leu
225 230 235 240
Arg Gln Glu Ser Asp Leu Lys Lys Ser Thr Ser Ser Asp Asn Ser Ser
245 250 255
Ser His His Gly Glu Asn Lys Gln Asn Leu Thr Val Asp Pro Cys Asp
260 265 270
Ile Leu Gly Gly Val Asp Asn Gln Gln Arg Leu Leu His Ile Val Trp
275 280 285
Pro His Arg Trp Glu His Asp Lys Asp Pro Glu Ser Phe Phe Lys Val
290 295 300
Leu Met His Leu Lys Asp Leu Gly Leu Asn Phe His Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Gly Glu Thr Phe Thr Asp Val Pro Gly Trp Lys Leu Cys Thr Val Gly
325 330 335
Val Thr His Phe Val Leu Lys Ile Trp Phe Ile Pro Lys Tyr Phe Gln
340 345 350
Leu Asn Ile Cys Ile Leu His Leu Asn Ser Phe Gln Lys Gly Ser Arg
355 360 365
Ile Ser Ala Arg Asp Gln Ile Leu
370 375
<210> 5
<211> 272
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Met Leu Gly Leu Lys Gly Asn Gly Gly Ala Val Leu Ser Met Ala Leu
1 5 10 15
Pro Phe Gln Pro Glu Gln Arg Asp Ser Glu Asp Leu Leu Lys Asn Phe
20 25 30
Asn Ser Glu Cys Asp Thr His Cys Gly Leu Asp Thr Ala Arg Gln Glu
35 40 45
Tyr Leu Gly Asn Ser Leu Arg Gln Glu Ser Asp Leu Lys Lys Ser Thr
50 55 60
Ser Ser Asp Asn Ser Ser Ser His His Gly Glu Asn Lys Gln Asn Leu
65 70 75 80
Thr Val Asp Pro Cys Asp Ile Leu Gly Gly Val Asp Asn Gln Gln Arg
85 90 95
Leu Leu His Ile Val Trp Pro His Arg Trp Glu His Asp Lys Asp Pro
100 105 110
Glu Ser Phe Phe Lys Val Leu Met His Leu Lys Asp Leu Gly Leu Asn
115 120 125
Phe His Val Ser Val Leu Gly Glu Thr Phe Thr Asp Val Pro Asp Ile
130 135 140
Phe Ser Glu Ala Lys Lys Ala Leu Gly Ser Ser Val Leu His Trp Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Pro Ser Lys Asp Asp Tyr Phe Gln Val Leu Cys Met Ala Asp
165 170 175
Val Val Ile Ser Thr Ala Lys His Glu Phe Phe Gly Val Ala Met Leu
180 185 190
Glu Ala Val Tyr Cys Gly Cys Tyr Pro Leu Cys Pro Lys Asp Leu Val
195 200 205
Tyr Pro Glu Ile Phe Pro Ala Glu Tyr Leu Tyr Ser Thr Pro Glu Gln
210 215 220
Leu Ser Lys Arg Leu Gln Asn Phe Cys Lys Arg Pro Asp Ile Ile Arg
225 230 235 240
Lys His Leu Tyr Lys Gly Glu Ile Ala Pro Phe Ser Trp Ala Ala Leu
245 250 255
His Gly Lys Phe Arg Ser Leu Leu Thr Thr Glu Pro Arg Glu Asp Leu
260 265 270
<210> 6
<211> 2556
<212> DNA
<213> Human
<400> 6
gtatctctgc attagccaga ttggacatat gtaaagggac atcagtatat ctggatcatc 60
agattgtgct tcaagaagac catagggaag aacgcatttt catcttgctg caaaagttgc 120
aatagaagat ctgaaggttt gaatgggcca atgagtatcc tcatcattga agcattctatv180
ggaggctccc ataaacagct ggtggatctt cttcaagaag agttaggaga ctgtgtcgtt 240
tatacccttc ctgcaaagaa atggcattgg agagcccgga catctgcttt atatttctct 300
cagaccattc ccatcagtga gcattacagg accctctttg caagttcagt gcttaacctg 360
accgaactgg ctgcccttcg gcctgacctt gggaaactga aaaagattct gtattttcac 420
gagaaccagt tgatatatcc tgtcaagaaa tgtcaggaga gggatttcca atatggatac 480
aaccaaattc tttcatgcct ggtggctgat gtggttgtat tcaactcagt ttttaatatg 540
gaatcatttc tcacttccat gggaaaattt atgaagctga ttcctgatca cagacccaag 600
gatctggaaa gcatcatcag acccaagtgc caagttattt actttcccat caggtttcct 660
gatgtgagca gattcatgcc caagcacaaa acaacccatt taaagaagat gctcggcctt 720
aaaggaaatg gcggtgcggt tctgtccatg gcccttcctt ttcagccaga gcagagagat 780
tcagaggatt tattgaagaa ttttaattca gagtgtgata cacactgtgg ccttgatact 840
gcacgacaag aatatttggg taactcatta agacaggaat cagacttgaa aaaatccacc 900
tcgtcagata attcaagctc tcatcatggt gaaaataaac aaaatctgac tgttgatccc 960
tgtgacattt tgggtggagt tgataatcag caaagactgc tacacattgt ctggcctcac 1020
aggtgggagc atgataaaga tccagaaagc ttttttaagg tattaatgca tcttaaagac 1080
ttaggactca atttccacgt gtctgtactt ggagaaacct tcacagatgt cccagatatt 1140
ttttcagagg ccaaaaaggc attgggatct tctgtcttac actggggcta cttacccagc 1200
aaagatgact acttccaagt actgtgcatg gctgatgttg tcatctcaac agctaagcat 1260
gaattctttg gagtggcaat gttggaagct gtgtactgtg ggtgttaccc actttgtcct 1320
aaagatttgg tttatcccga aatatttcca gctgaatatc tgtattctac acctgaacag 1380
ctttcaaaaa ggctccagaa tttctgcaag agaccagata ttataagaaa acatctctat 1440
aagggtgaaa tcgctccgtt ttcttgggca gccctacatg gtaaattcag gtctctgctt 1500
acaacagaac ctagggaaga tttgtgacag atggggctaa gtcacaaact tgcagcctaa 1560
ggcagagtct gaagaacttt ccagagtgtg cccatattta cctgatcaga gagaaaagaa 1620
aatctgcaga ggaagctgag cctggctgct tgtcatagct gacacagagc catctgccac 1680
aaacctgtgg cggcttcaga tctccaatcc ctgccaccac cccaactcaa attaaataca 1740
gattcctaga gacgttatga tggttacaca tgtcctcggc atcacatgta ggagactgtt 1800
caaaaaaaat atgtggcctg ttgtataacc gcactcatgt atcccatatg tggtgccaca 1860
ttgaatttcc ggttgaatcc gtttttatcc tttgtactgg atgacatggt gcctgaattc 1920
tttcttttcg ccgacacgat ggcagccaaa ctgcagcttc aaacgctcac acttggctgg 1980
gtttctacct aggttgccag gttatcatcg gagccttctt gtgtcctcaa agggccacga 2040
ggcctgaaag gaggatcaga atgctttggg attaattggg cagccatcgc agaattgttt 2100
gtgggcaaag ggctgcttta gcacttttct tttagcaaat taatgactct caggcacagg 2160
gggttttaag tgaaggtatt aataagaggt ctggcaggta ttcccatgat tcacagagtt 2220
acatttgcat ttaattaatc ttaaagttgc aagataaaca gctgtaattc ggacaaacat 2280
gacaaacaca gtgaagccaa ctatcccata aaatgaacac tgacatactt gttttaattt 2340
ttttcccagc gtaaaaatag aaaaatcaaa atactcctaa caaaaccagt gattttgata 2400
gaaatatttc tccaatatac ttgcatccac ctacaaatat aaccttttca agataaatcg 2460
cttatgattt caatagtcaa actgctgtgt ttgttgatgt aaagatgttt tgaatggcta 2520
gatggtaaaa taaattctta ataaagtacc cactgc 2556
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 7
atcagattgt gcttcaagaa gaccataggg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 8
tgacaagcag ccaggctcag cttcctctgc 30
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 9
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 10
cggataacaa tttcacacag gaaac 24
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 11
tctgctctgg ctgaaaagga agggccatgg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 12
gaagatgctc ggccttaaag gaaatggcgg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 13
gactcaattt ccacgtgtct gtacttggag 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 14
aaggtaccac catgagtatc ctcatcattg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 15
gggcggccgc aaatcttccc taggctctgt 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 16
ggctcgagtt agacgtagtc tgggacgtcg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 17
gggtcgacat gagtatcctc atcattgaag 30
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 18
gacgtagtct gggacgtcgt atgggtacac tacccatacg acgtcccaga ctacgtctaa 60
Claims (5)
- 下記(A)又は(B)の何れかの蛋白質に対する抗体を含む、大腸癌の診断薬。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。 - 生体試料中における下記(A)又は(B)の何れかの蛋白質の発現を、該(A)又は(B)の何れかの蛋白質に対する抗体を用いて検出又は測定することを含む、大腸癌の検査方法。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。 - 生体試料中における下記(A)若しくは(B)の何れかの蛋白質をコードするDNA、又は下記(a)、(b)若しくは(c)の何れかのDNAの発現を検出又は測定することを含む、大腸癌の検査方法。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA。
(b)配列番号1に記載の塩基配列において、1若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含む塩基配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(c)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA。 - 配列番号7に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号8に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー対、又は配列番号13に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号8に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマー対を含む、請求項3に記載の方法に用いるための大腸癌の診断薬。
- 大腸癌のマーカーとして下記(A)又は(B)の何れかの蛋白質を使用する方法。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖転移酵素活性を有する蛋白質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005297645A JP4912657B2 (ja) | 2004-10-12 | 2005-10-12 | 大腸癌マーカー遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004297885 | 2004-10-12 | ||
JP2004297885 | 2004-10-12 | ||
JP2005297645A JP4912657B2 (ja) | 2004-10-12 | 2005-10-12 | 大腸癌マーカー遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006136319A JP2006136319A (ja) | 2006-06-01 |
JP4912657B2 true JP4912657B2 (ja) | 2012-04-11 |
Family
ID=36617513
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005297645A Expired - Fee Related JP4912657B2 (ja) | 2004-10-12 | 2005-10-12 | 大腸癌マーカー遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4912657B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101144324B1 (ko) | 2009-12-30 | 2012-05-11 | 한국과학기술연구원 | 대장암 예후진단용 단백질 마커 디펜신?5와 rod1단백질의 조합 및 이들 각각에 대한 항체를 포함하는 대장암 예후진단키트 |
-
2005
- 2005-10-12 JP JP2005297645A patent/JP4912657B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2006136319A (ja) | 2006-06-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4234319B2 (ja) | 前立腺腫瘍ポリヌクレオチドおよび抗原組成物 | |
EP1027443B1 (en) | Sphingosine-1-phosphate lyase polypeptides, polynucleotides and modulating agents and methods of use therefor | |
US20020164749A1 (en) | Alpha1,3-fucosyltransferase | |
JP2002528122A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ由来α1,2−フコシルトランスフェラーゼ | |
US7163795B2 (en) | Methods and compositions for pearl oyster cultivation | |
WO1996038467A1 (en) | Fragile x related proteins, compositions and methods of making and using the same | |
JP4214442B2 (ja) | 新規なグアノシン三リン酸(gtp)結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質 | |
JP2690266B2 (ja) | ヒト細胞接着分子および核酸配列 | |
JP2005505237A (ja) | スルファターゼおよびそれらの使用の方法 | |
AU741170B2 (en) | Human intestinal Npt2B | |
JP4912657B2 (ja) | 大腸癌マーカー遺伝子 | |
CA2251264A1 (en) | Human hyaluronan receptor | |
JPH0956380A (ja) | アシアロ糖蛋白質受容体誘導体及びその使用 | |
WO2002077156A2 (en) | Protection-of-telomere-1 (pot-1) protein and encoding polynucleotides | |
JPH09507755A (ja) | 哺乳類細胞におけるメチルチオアデノシンホスホリラーゼ欠乏の検出方法 | |
JP2006512923A (ja) | 癌関連遺伝子ファミリー | |
JPH11155574A (ja) | Mdc遺伝子ファミリーに属する新規蛋白質およびそれをコードするdna | |
JP4251402B2 (ja) | N−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体 | |
WO2001009319A1 (fr) | Gene exprime specifiquement dans le muscle cardiaque foetal humain | |
JP3670030B2 (ja) | Mdc蛋白質およびそれをコードするdna | |
WO2000004142A1 (en) | Mucins | |
WO2000063392A1 (fr) | Nouvelle tyrosine phosphatase | |
EP1541684A1 (en) | Smg-1-binding protein and method of screening substance controlling its activity | |
JPH10262680A (ja) | Rho標的タンパク質ヒトmDiaおよびその遺伝子 | |
JP2003259884A (ja) | 新規ポリペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080722 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110201 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110419 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110613 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111220 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120118 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |