KR101144324B1 - 대장암 예후진단용 단백질 마커 디펜신?５와 ｒｏｄ１단백질의 조합 및 이들 각각에 대한 항체를 포함하는 대장암 예후진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암 예후 진단 마커를 검출할 수 있는 대장암의 예후 판별용 진단 키트 및 이를 이용한 예후 판별 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 대장암의 예후가 좋았던 환자에서 높게 발현되는 디펜신-5(Defensine-5) 단백질 및 대장암의 예후가 나빴던 환자에서 높게 발현되는 ROD1(Regulator of differentiation 1) 단백질을 각각 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 대장암의 예후 판별용 진단 키트, 및 상기 항체를 피검시료와 접촉시켜 항원-항체 반응을 통해 대장암의 예후 판단 및 암전이 고위험군을 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 대장암의 예후가 좋았던 환자 및나빴던 환자의 단백질 발현량을 비교하여, 예후의 좋고 나쁨에 따라 발현량이 다른 디펜신-5 및 ROD1을 대장암 예후 진단용 마커로 선별하였으며, 환자로부터 유래한 대장암 조직에서 상기 마커를 검출한 결과, 대장암 환자의 예후를 정확하고 민감하게 구분하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 진단 키트는 대장암의 예후 판단 및 암 전이 고위험군의 선별에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 대장암의 예후를 진단하여 이에 따른 향휴 치료 계획의 수립과 환자별 맞춤 치료에 효과적으로 응용할 수 있다.

대장암, 예후판단 마커, 예후인자, 디펜신-5(Defensine-5), ROD1(Regulator of differentiation 1)

Description

대장암 예후진단용 단백질 마커 디펜신?５와 ＲＯＤ１단백질의 조합 및 이들 각각에 대한 항체를 포함하는 대장암 예후진단키트{PROTEIN MARKERS DEFA5 AND ROD1 FOR COLORECTAL CANCER PROGNOSIS AND PROGNOSIS KIT FOR COLORECTAL CANCER USING ANTIBODIES AGAINST THE SAME}

본 발명은 대장암 예후 판단용 진단 키트, 및 대장암의 예후를 진단하는 방법에 관한 것이다.

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간).

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음 식의 섭취와 관련된 식이습관, 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자에게서, 직장암은 남자에게서 다소 높게 나타난다.

대장암을 포함하는 대부분의 암환자는 현존하는 여러 치료방법(수술, 항암제, 방사선처리)을 이용하여도 암전이(metastasis)의 발생결과로서 주로 사망하게 된다. 암 전이가 일어나기 전에 1차 종양이 관찰된 환자의 대부분은 치료 가능성이 상당히 높지만 이런 환자는 쉽게 발견하기 어려우며, 대부분의 환자에서는 1차 종양이 관찰된 시점에서 이미 암의 전이가 발견된다. 대부분의 암의 전이는 다발성, 전신성이며, 그 존재 여부의 판정도 어렵기 때문에 현재의 암 치료방법으로는 치료효능이 만족스럽지 못하다. 하지만 암 전이는 1차 종양을 구성하는 암세포의 극히 일부분만이 전이과정의 여러 단계를 성공적으로 마치고 전이암으로 되는 비효율적인 과정이다. 따라서, 전이 과정을 잘 이해하고, 임상적, 생물학적으로 유용한 치료표적을 발굴하고 이를 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하면 암 전이에 의한 사망을 효과적으로 제어할 수 있는 유용한 치료법의 개발이 가능하게 된다. 또한, 예후판단을 조기에 예측하고 암전이 고위험군을 조기에 진단할 수 있다면, 예후에 따른 향후치료의 계획수립과 환자별 맞춤치료에 유용하게 사용될 수 있다.

원발성 종양을 갖는 모든 암환자에서 원격전이가 발견되지는 않는다. 원발종양이 원격전이에 필요하지만 충분조건은 아니라는 사실은, 특정한 유전자(군)의 기 능적 손실이 전이억제 효능을 나타낼 수 있을 수 있는 가능성을 보여준다. 이러한 가설에 근거하여 현재까지 최소 11종 이상의 전이억제유전자가 발견되었다(Kauffman et al ., J. Urol., 169: 1122-1133,2003; Shevde et al ., Cancer Lett., 198: 1-20, 2003; Berger et al ., Anticancer Drugs, 15: 559-568, 2004). 유전자의 기능적 손실이 종양의 성장을 유도하는 암억제유전자(tumor suppressor gene)와는 다르게 전이억제유전자(metastasis suppressor gene)는 원발종양의 성장에는 영향을 미치지 않으며 원격전이만 선택적으로 억제할 수 있는 유전자로 정의된다.

현재까지 발견된 전이억제유전자들이 어떠한 작용기전에 의해 암전이를 억제하는지에 대해서는 많은 부분이 알려져 있지 않다. 여러 연구 결과에 의하면, 원발암에서 박리되어 성공적으로 원격지의 조직으로 침윤해 들어온 암세포가 종종 원격지에서 증식하는데 실패하는 경우가 보고되었다(Chambers et al., Nat . Rev . Cancer, 2: 563-572, 2002; Yoshida et al .,J. Natl . Cancer Inst ., 92: 1717-1730, 2000). 이러한 연구 결과들은 혈관으로부터 원격지의 조직 내로 침윤한 암세포가 증식하는 과정(전이증식; metastatic colonization)에서 일종의 증식조절(post-extravasation growth control)을 받으며, 이러한 조절단계가 전이과정을 완성하는데 결정적인 속도결정단계(rate-limiting step)로 작용함을 개시한다. 일부 전이억제단백질들에 의해 영향 받는 신호전달체계가 보고되기는 하였지만(Shevde et al ., Cancer Lett ., 198: 1-20, 2003;Kauffman et al ., J. Urol ., 169: 1122-1133, 2003), 대다수 전이억제단백질들이 어떠한 신호전달체계를 통하여 전이증식과정을 조절하는지에 대해서는 많은 부분이 밝혀지지 않았다. 암의 발생, 진행 및 악성화는 유전적 요인과 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 관련 프로테옴(proteome)의 총체적인 변화를 보이게 된다. 암세포를 포함한 모든 세포의 생존에 필수적인 대사 및 조절경로에 직접 작용하는 단백질과 유전자(mRNA)의 양적인 상관관계(correlation coefficiency=0.48)는 매우 낮아서 유전자 대량 발굴에 의한 mRNA 변화 연구에만 의존하는 것은 단백질의 생물학적 기능을 이해하는데 잘못된 결과를 발생시킬 가능성이 있다. 또한 세포의 생존, 분화,사멸을 조절하는 단백질의 활성, 안정성, 세포내 위치, 전환(turnover)이 단백질의 수식화(Post-Translational Modification, PTM)에 의해 조절되므로 mRNA 변화 연구보다는 프로테옴 분석의 중요성이 더욱 강조되고 있다.

암 진단에 있어서 한 종류의 표지 물질을 사용하는 경우 민감도 및 특이도가 여러 표지 물질을 사용하는 경우보다 상대적으로 낮아 위양성 혹은 위음성의 오류를 범할 확률이 상대적으로 높다. 발굴된 암세포 혹은 조직에 특이적인 표지물질이 조기 진단에 사용되기 위해서는 몇 가지 제약 조건이 있다. 우선 표지물질의 농도의 문제 인데, 암 조직에서 발현된 표지 물질이 혈장 혹은 척수액 같은 용액에 방출되면 지나치게 희석되어 진단표지물질로 사용하는데 있어 어려움이 있다. 따라서 조직에서 발견된 표지 물질을 체액에서 검출하기는 무리가 따르고, 조직 자체를 조사할 경우 표지 물질의 의미를 상당히 상실하게 된다. 또한 체액에서 발현의 차이를 보이는 물질과 암 혹은 다른 병변 조직에서 변화하는 물질과 일치 하지 않을 가능성이 있다. 조직 내의 변화가 캐스케이드(cascade)에 따라 체액에 도달하면 전혀 다른 표지 물질로 나타날 수도 있고, 서로 다른 암 조직이라도 공통의 표지 물질을 나타낼 수 있다. 따라서 다중 바이오마커(multiplex biomarker)를 이용한 암의 진단은 향후 진단의 방향이 될 것으로 예상되고, 대장암 진단 시스템이 개발되면 이의 파급효과는 상당히 클 것으로 예측된다. 이러한 추세는 암 이외에도 면역 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 및 신경 질환 같은 대부분의 질환에도 공통적으로 응용될 것으로 예측된다.

이에, 본 발명자들은 대장암의 예후진단과 관련한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속하던 중, 동일 4기 진단 판정 후 5년 이상의 생존율을 보이는 생존그룹과 동일 4기 진단 판정 후 2년 이내에 재발하여 사망한 사망그룹의 대장암 환자로부터 얻어진 생물학적 검체 시료 내에서 예후와 관련하여 특이하게 변화하는 디펜신-5(Defensine-5) 및 ROD1(Regulator of differentiation 1) 단백질을 발굴하고, 상기 항원의 조합 및 각각의 항체(군)을 이용한 면역화학적 방법으로 예후판단 예측 및 암전이 고위험군을 간편하게 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장암의 예후의 좋고 나쁨에 따라 다르게 발현되는 디펜신-5(Defensine-5) 단백질 또는 ROD1(Regulator of differentiation 1) 단백질을 마커로 이용하여 대장암의 예후를 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디펜신-5(Defensine-5) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 대장암 예후 판단용 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체를 포함하는 대장암 예후 판단용 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 항-디펜신-5 항체를 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;

3) 상기 단계 2)를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체 접합체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및,

4) 상기 검출된 디펜신-5 단백질이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 좋을 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 대장암 예후 진단의 정보를 제공하기 위해 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체를 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;

3) 상기 단계 2)를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체 접합체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및,

4) 상기 검출된 디펜신-5 단백질이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 좋을 가능성이 있는 개체로, ROD1 단백질의 발현량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 나쁠 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 대장암 예후 진단의 정보를 제공하기 위해 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자

하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-표지 상호작용인자가 접합된 항-디펜신-5 항체를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 검체 패드에 연결되어, 상호결합인자 결합 물질이 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항-인간 IgG 항체가 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 대장암 예후 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자

하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제가 표지된 Protein A를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 검체 패드에 연결되어, 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체가 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항-인간 IgG 항체가 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 대장암 예후 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

본 발명에서 대장암 4기 환자로부터 얻어진 생물학적 검체 시료 내에서 예후와 관련하여 특이하게 변화하는 디펜신-5(Defensine-5) 및 ROD1(Regulator of differentiation 1)단백질을 발굴하고, 이의 항체를 이용한 면역화학적 방법으로 예후판단 예측 및 암전이 고위험군을 간편하게 선별할 수 있는 키트를 개발하여, 예후에 따른 향후치료의 계획수립과 환자별 맞춤치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 디펜신-5(Defensine-5) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 대장암 예후 판단용 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체를 포함하는 대장암 예후 판단용 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 대장암 예후 판단용 진단 키트는 본 발명의 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및, 효소반응 정지액을 추가로 포함할 수 있다.

상기 디펜신-5 단백질은 예후가 좋은 대장암 환자에서 발현량이 증가하고, 상기 ROD1 단백질은 예후가 나쁜 대장암 환자에서 발현량이 증가하는 것으로부터 대장암 환자의 예후를 진단할 수 있다.

본 발명의 대장암 예후 판단용 진단 키트는 환자로부터 유래한 대장암 조직으로부터 상기 대장암 예후 판단용 마커를 탐지하는데 이용되는 것이 바람직하나, 본 발명의 대장암 예후 판단용 마커를 포함하는 것으로 예상되는 시료라면 모두 사용가능하다.

상기 디펜신-5 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 대장암 환자로부터 유래한 대장암 조직에서 디펜신-5를, 상기 ROD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 대장암 환자로부터 유래한 대장암 조직에서 ROD1 단백질을 검출한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 대장암 4기 진단 판정 후 수술을 받은 대장암 환자로부터 대장암 조직을 채취한 다음, 예후가 좋지 않아 2년 이내에 재발하여 사망한 그룹(사망 그룹) 및 예후가 좋아 5년 이상 생존한 그룹(생존 그룹))으로 분류하여, 각 그룹의 단백질을 질량분석기를 사용하여 생존 그룹 및 사망 그룹 사이의 단백질 발현량의 차이를 정량화하였다. 이로부터 생존 그룹에서 특이적으로 발현량이 증가한 디펜신-5(Defensine-5)(도 1 참조) 및 사망 그룹에서 특이적으로 발현량이 증가한 ROD1(Regulator of differentiation 1)(도 2 참조)을 대장암 예후 진단용 마커로서 선별하였다.

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서 상기에서 선별한 대장암 예후 진단용 마커 단백질의 발현량를 대장암 조직에서 면역 블롯팅을 통하여 확인한 결과, 디펜신-5는 사망 그룹에 비해 생존 그룹에서 발현량이 높았고, ROD1은 생존 그룹에 비해 사망그룹에서 발현량이 높았다(도 3 및 도 4 참조). 상기에서 측정한 단백질 발현량을 수용자-조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 그래프로 나타내어 분석하여 상기 단백질 마커의 민감성 및 정확성을 확인하였다(도 5 참조). 특히, 디펜신-5 및 ROD1 단백질을 조합한 경우의 AUC는 0.92로, 100%에 가까운 정확도 및 민감도를 나타내어 다중 바이오마커로서 대장암 예후 진단에 매우 효과적일 수 있음을 확인하였다(도 5 참조).

상기 결과로부터, 디펜신-5 또는 ROD1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 조합을 사용하여 각 항원의 농도를 측정하고 각 마커들의 발현 패턴을 분석함으로써 이로부터 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 진단 키트는 항원항체 결합반응을 통하여 항-디펜신-5 항체 또는 항-ROD1 항체에 대한 항원을 분석함으로써 대장암의 예후를 진단할 수 있으며, 상기 항원항체 결합반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.

상기 2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다.

발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 발색제 기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 항-디펜신-5 항체 또는 항-ROD1 항체에 대한 항원의 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액,0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 항-디펜신-5 항체 또는 항-ROD1 항체, 이를 포함하는 대장암 예후 판별용 조성물 또는 대장암 예후 판별용 진단 키트를 이용하여 대장암의 예후를 진단하는 방법을 제공한다.

대장암의 예후 진단 방법은 구체적으로 하기와 같은 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 항-디펜신-5 항체를 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;

3) 상기 단계 2)를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체 접합체 및 발 색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및,

4) 상기 검출된 디펜신-5 단백질이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 좋을 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계.

1) 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체를 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;

3) 상기 단계 2)를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체 접합체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및,

4) 상기 검출된 디펜신-5 단백질이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 좋을 가능성이 있는 개체로, ROD1 단백질의 발현량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 나쁠 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계.

상기 피검체 유래 시료는 인간으로부터 유래한 세포 또는 조직, 바람직하게는 환자로부터 유래한 대장암 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법, 방사능면역분석법, 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한 되는 것은 아니다.

상기 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

아울러, 본 발명은 항-디펜신-5 항체 또는 항-ROD1 항체를 포함하는 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은 접착성 플라스틱 지지체와, 상기 접착성 플라스틱 지지체에 부착되어 있는 검체 패드, 컨쥬게이트 패드, 신호검출 패드 및 흡수 패드로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 면역크로마토그래피 스트립은 하기와 같은 구성을 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자

하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-표지 상호작용인자가 접합된 항 -디펜신-5 항체를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 검체 패드에 연결되어, 상호결합인자 결합 물질이 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항-인간 IgG 항체가 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드.

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자

하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제가 표지된 Protein A를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 검체 패드에 연결되어, 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체가 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항-인간 IgG 항체가 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드.

상기 구성에 있어서, 단계 3)의 발색제는 콜로이드성 골드 파티클(gold particle)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 3)의 상호작용인자는 단백질, 핵산(예를 들어 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드), 소 분자, 기질, 억제제, 약물 또는 약물 후보, 수용체, 항원, 호르몬, 스테로이드, 지질, 인지질, 리포솜, 항체, 보조인자, 시토킨, 글루타치온, 면역 글로불린 도메인, 탄수화물, 말토오즈, 니켈, 디하이드로트립신, 칼모듈린, 비오틴, 렉틴, 및 중금속으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오즈 막으로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 4)의 상호결합인자 결합 물질은 상기 상호작용인자와 특이성을 가지고 결합할 수 있는 물질은 모두 가능하다.

상기 구성에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 다공성 지지체의 상부면에 부착된 다공성 필름층을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 흡수제는 염화칼슘, 염화마그네슘, 규조토, 벤토나이트, 백운석, 석고, 실리카겔 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은 상기 면역크로마토그래피 스트립 상의 조라인 및 검출라인에 착색선이 나타났을 때,

a) 검출라인에 항-디펜신-5 항체를 고정시킨 경우 피검 시료를 대장암의 예 후가 좋은 것으로 판정하고; 및,

b) 검출라인에 항-ROD1 항체를 고정시킨 경우 피검 시료를 대장암의 예후가 나쁜 것으로 판정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 우선 피검 시료인 대장암 조직으로부터 유래한 단백질이 함유된 시료를 상기 검체 패드를 통해 면역크로마토그래피 스트립으로 공급된다. 상기 검체 패드는, 분석물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 상기 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링의 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 패드의 업스트림에 분석물질과 컨쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 상기 검체 패드를 통해 도입된 시료는 크로마토그래피적 이동을 통해 상기 검체 패드의 업스트림에 위치하는 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 상기 컨쥬게이트 패드는 시료에 함유되어 있는 디펜신-5 단백질 또는 ROD1 단백질과 특이적으로 결합하는 항-디펜신-5 항체 또는 항-ROD1 항체가 함유되어 있다. 상기 항체는 발색제-표지 상호작용인자와 접합되어 있으며, 상기 항체에 접합된 상호작용인자는 단백질, 핵산(예를 들어 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드), 소 분자, 기질, 억제제, 약물 또는 약물 후보, 수용체, 항원, 호르몬, 스테로이드, 지질, 인지질, 리포솜, 항체, 보조인자, 시토킨, 글루타치온, 면역 글로불린 도메인, 탄수화물, 말토오즈, 니켈, 디하이드로트립신, 칼모듈린, 비오틴, 렉틴 또는 중금속 등으로 서, 특이성을 가지고 하기 신호검출 패드에 고정된 상호작용인자 결합 물질과 특이성을 가지고 결합하는 물질이며, 상기 상호작용인자는 금입자, 라텍스 입자, 형광물질, 및 효소 등에 의해 레이블링된다. 상기 컨쥬게이트 패드를 통과한 피검 시료는 신호검출 패드로 이동한다. 상기 신호검출 패드는 상기 피검 시료에 분석물질이 존재하는 지의 여부를 검출하는 검출라인과, 분석물질의 존재 유무와 관계없이 분석키드가 정상적으로 작동하였는지 여부를 확인하는 대조라인을 포함한다. 이를 위해, 상기 검출라인에는 분석물질과 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트 사이의 결합산물에 선택적이고 특이적으로 결합하는 물질(또는 신호검출물질)이 코팅되고, 상기 대조라인에는 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 물질이 코팅되는 것이 좋다. 상기 신호검출 패드는 다공성 멤브레인 패드로 구성되며, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론 등으로 이루어질 수 있다.

한편, 디펜신-5 또는 ROD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 중 어느 하나 이상을 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하면, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 예후가 다른 대장암 환자의 단백질 시료의 준비 및 표지

<1-1> 단백질 시료의 준비

대장암 4기 진단 판정 후 수술을 받은 대장암 환자로부터 대장암 조직을 채취하였다. 상기 대장암 환자로부터 생검을 통해 대장암 조직이 채취되었고, 원심분리를 거쳐 영하 70℃에서에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다. 상기 조직은 서면으로된 사전 동의 후에 이루어졌다. 한국과학기술연구원의 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)는 연구목적으로 이러한 환자에게서 생화학적 물질과 정보를 수집하는 것을 승인하였다. 상기와 같이 채취된 유방암 조직 및 혈장을 연세대학교 의료원 세브란스 병원의 유전자은행 소속의 연구용 감암 검체은행에서 제공받아 실험에 사용하였다. 상기 대장암 조직을 예후가 좋지 않아 2년 이내에 재발하여 사망한 그룹(사망 그룹) 및 예후가 좋아 5년 이상 생존한 그룹(생존 그룹))으로 분류하여, 각 그룹별로 3명의 환자의 조직으로부터 TriZol 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 분리한 단백질을 동량으로 섞어 1 ㎍/㎕ 농도의 혼합 단백질 시료 100 ㎕을 각각 준비하였다.

<1-2> 단백질 시료의 표지

상기 1-1에서 준비한 사망 그룹 또는 생존 그룹의 단백질 시료에 3.5 mM cICAT 시약(Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 후 37℃에서 120분 동안 반응시켜 표지하였다. cICAT는 티올기(thiol)에 특이적으로 반응할 수 있도록 개발된 시약으로, 9개의 탄소원소가 모두 가벼운 동위원소(¹²C) 또는 무거운 동위원소(¹³C)로 치환된 두 종류의 시약으로 구성되는데, 상기에서 사망 그룹의 단백질 시료에는 무거운 동위원소(¹³C)의 cICAT 시약을, 생존 그룹의 단백질 시료에는 가벼운 동위원소(¹²C)의 cICAT 시약을 처리하였다. cICAT 시약으로 표지된 각 그룹의 단백질 시료를 동일한 비율로 혼합한 다음, 5 ㎍의 트립신 25 ㎕을 첨가하고 37℃에서 16시간 동안 처리하여 펩티드 절편으로 절단하였다. 이후, 펩티드 절편을 강한 양이온 교환수지 컬럼(PolyLC inc, 미국)에 적재하고 염화칼륨 농도 구배(0% → 60%)를 통해 용리하여 여러 개의 분획으로 나누었다. 양이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 23개의 분획을 아비딘 친화성 컬럼에 충진하여 cICAT 시약이 결합되어 있는 펩티드만을 농축하였다. 이로부터 얻은 농축 시료에 인산을 처리하여 cICAT 시약에 접합되어 있는 바이오틴(biotin)을 제거함으로써 질량 분석을 위한 최종 시료를 준비하였다.

실시예 2. 대장암 예후 진단용 마커의 선별

본 발명자들은 대장암의 예후 진단용 마커 단백질을 선별하기 위하여 공지의 cICAT 시약으로 표지한 단백질을 질량분석기로 정량분석하는 방법을 사용하였 다(Gygi SP. et al ., Nat. Biotechnol., 17: 994-999, 1999). 상기 실시예 1-2에서 준비된 각 그룹의 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피를 이용하여 혈장 펩티드 절편을 분리하고 탠덤질량분석기를 사용하여 각 절편의 탠덤질량분석 스팩트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 내경 75 ㎛의 무수규산이 입혀진 모세관(silica coated capillary)에 매직 아쿠아 수지(magic C18 aqua resin, Microchom, 미국)를 충진한 컬럼으로 70분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. SEQUEST 컴퓨터 분석 프로그램(Thermofinnigan사)을 이용하여 펩티드 절편의 탠덤질량분석 정보를 SWISS-PROT 단백질 데이터베이스와 비교 검색하여 단백질을 동정한 다음, ISB 파이프라인(Institute for Systems Biology사)을 사용하여 동정된 단백질을 재확인하였으며, 이로부터 사망 그룹 및 생존 그룹 사이의 단백질 발현의 양적 차이를 분석하였다(Keller A. et al ., Anal . Chem ., 15: 5395-5392, 2002; Nesvizhskii AI. et al., Anal . Chem ., 75: 4646-4658, 2003; Li XJ. et al ., Anal . Chem ., 75: 6648-6657, 2003). 즉, 상기 펩티드 절편 각각의 크로마토그램을 추적하여 이들의 질량 피크 면적을 계산하고, 각 펩티드의 크로마토그램 면적비를 구하여 생존 그룹 및 사망 그룹 사이의 단백질 발현량의 차이를 정량화하였다.

그 결과, 생존 그룹에서 특이적으로 발현량이 증가한 디펜신-5(Defensine-5)(도 1) 및 사망 그룹에서 특이적으로 발현량이 증가한 ROD1(Regulator of differentiation 1)(도 2)을 대장암 예후 진단용 마커로서 선별하였다.

실시예 3. 대장암 조직에서 대장암 예후 진단용 마커의 검출

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 선별한 대장암 예후 진단용 마커 단백질의 발현량를 대장암 조직에서 면역 블롯팅을 통하여 확인하였다. 구체적으로, 생존 그룹(6 명) 또는 사망 그룹(8 명)의 각 샘플로부터 수득한 조직에 TriZol 시약을 처리하여 단백질을 정제한 다음, 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 SDS-PAGE를 수행하여 검체에 들어 있는 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 상기 그룹별 각 샘플에서 분리된 단백질을 50 mM 트리스-HCl(Tris-HCl), 130 mM 글리신(glycine), 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올(methanol)이 포함된 용액 내에서 PVDF 막으로 달하였고, 상기 전달된 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 막에 항-디펜신-5 항체(1:200, Novus, 미국) 또는 항-ROD1 항체(1:200, Abnova, 태국)를 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척한 후 각 1차 항체에 해당되는 면역글로불린과 결합하는 2차 항체 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare, 영국)로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 PVDF 막을 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience, 미국)과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

그 결과, 디펜신-5는 사망 그룹에 비해 생존 그룹에서 발현량이 증가한 경우가 3.9배 높았고, ROD1은 생존 그룹에 비해 사망그룹에서 발현량이 증가한 경우가 3.7배 높았다(도 3 및 도 4).

또한, 본 발명자들은 상기에서 측정한 단백질 농도를 수용자-조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 그래프로 나타내었다. 상기 ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig et al ., Clin . Chem . 39: 561-577, 1993).

그 결과, ROC 그래프에서 디펜신-5 및 ROD1단백질의 AUC(area under the curve)는 각각 0.74 및 0.77로 나타나 상기 단백질 마커의 민감성 및 정확성을 확인하였다. 특히, 디펜신-5 및 ROD1 단백질을 조합한 경우의 AUC는 0.92로, 100%에 가까운 정확도 및 민감도를 나타내어 다중 바이오마커로서 대장암 예후 진단에 매우 효과적일 수 있음을 확인하였다.

도　1은 생존과 사망그룹의 조직 단백질을 각각 가벼운 동위원소와 무거운 동위원소로 치환된 cICAT 시약으로 표지하고 트립신으로 절단한 후, 질량분석기로 동정 및 정량하여 생존그룹에서 특이적으로 발현량이 증가한 것으로 확인된 ‘디펜신-5(Defensine-5)’ 펩티드의 두 동위원소 쌍에 대한 크로마토그램과 상기 펩티드의 탠덤질량분석 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도　2는 상기와 같이 cICAT 방법으로 동정 및 정량하여 사망그룹에서 특이적으로 발현량이 증가한 것으로 확인된 ‘ROD1(Regulator of differentiation 1)’ 펩티드의 두 동위원소 쌍에 대한 크로마토그램과 상기 펩티드의 탠덤질량분석 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도 3은 대장암 환자군으로부터 적출한 생존그룹과 사망그룹의 암조직을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분석한 후 디펜신-5와 ROD1단백질의 항체로 면역 블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

도 4은 상기 도 3의 면역 블롯팅에 의해 측정된 단백질 항원 농도를 통계 처리하여 나타낸 도이다.

도 5은 상기 도 3에서 얻은 항원 농도를 수용자-조작 특성그래프로 나타낸 도이다.

Claims (20)

1. 삭제
2. 디펜신-5(Defensine-5) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 및 ROD1(Regulator of differentiation 1) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 를 포함하는 대장암 예후 판단용 진단 키트.
3. 제 2항에 있어서, 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및, 효소반응 정지액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
4. 제 2항에 있어서, 디펜신-5 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 대장암 환자로부터 유래한 대장암 조직에서 디펜신-5를 검출하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
5. 제 2항에 있어서, ROD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 대장암 환자로부터 유래한 대장암 조직에서 ROD1 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
6. 삭제
7. 1) 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체를 고정체에 코팅시키는 단계;

   2) 상기 단계 1)의 고정체에 피검체 유래 시료를 가하여 항원-항체 반응시키는 단계;

   3) 상기 단계 2)를 통해 생성된 항원-항체 반응물을 2차 항체 접합체 및 발 색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및,

   4) 상기 검출된 디펜신-5 단백질이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 좋을 가능성이 있는 개체로, ROD1 단백질의 발현량이 정상인에 비해 증가된 피검체를 외과 수술 이후 예후가 나쁠 가능성이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 대장암 예후 진단의 정보를 제공하기 위해 항원을 검출하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 피검체 유래 시료는 인간으로부터 유래한 세포 또는 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법, 방사능면역분석법, 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 7항에 있어서, 상기 접합체는 HRP(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloidal gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 7항에 있어서, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 삭제
14. 1) 접착성 지지체;

    2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자

    하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

    3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-표지 상호작용인자가 접합된 항-디펜신-5 항체 및 항-ROD1 항체를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

    4) 상기 검체 패드에 연결되어, 상호결합인자 결합 물질이 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항-인간 IgG 항체가 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

    5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 대장암 예후 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
15. 제 14항에 있어서, 단계 3)의 발색제는 콜로이드성 골드 파티클(gold particle)인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
16. 제 14항에 있어서, 상기 상호작용인자는 단백질, 핵산, 소 분자, 기질, 억제제, 약물 또는 약물 후보, 수용체, 항원, 호르몬, 스테로이드, 지질, 인지질, 리포솜, 항체, 보조인자, 시토킨, 글루타치온, 면역 글로불린 도메인, 탄수화물, 말토오즈, 니켈, 디하이드로트립신, 칼모듈린, 비오틴, 렉틴 및 중금속으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
17. 제 14항에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
18. 제 14항에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
19. 삭제
20. 제 14항에 있어서, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타났을 때,

    a) 검출라인에 항-디펜신-5 항체를 고정시킨 경우 피검 시료를 대장암의 예후가 좋을 것으로 판정하고; 및,

    b) 검출라인에 항-ROD1 항체를 고정시킨 경우 피검 시료를 대장암의 예후가 나쁠 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.

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