JPH10262680A - Ｒｈｏ標的タンパク質ヒトｍＤｉａおよびその遺伝子 - Google Patents
Ｒｈｏ標的タンパク質ヒトｍＤｉａおよびその遺伝子Info
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- JPH10262680A JPH10262680A JP9090170A JP9017097A JPH10262680A JP H10262680 A JPH10262680 A JP H10262680A JP 9090170 A JP9090170 A JP 9090170A JP 9017097 A JP9017097 A JP 9017097A JP H10262680 A JPH10262680 A JP H10262680A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト由来の活性型Ｒｈｏタンパク質標的タン
パク質の提供。 【解決手段】 下記の特徴を有するヒト由来のタンパク
質またはその誘導体：（１）活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有する、（２）プロフィリン結合能を有する、
（３）遺伝子がヒト染色体５ｑ３１．２に位置する、
（４）分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１５０
ｋＤａである。このタンパク質をコードする塩基配列を
用いて気道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の診断を行
なうことができる。
パク質の提供。 【解決手段】 下記の特徴を有するヒト由来のタンパク
質またはその誘導体：（１）活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有する、（２）プロフィリン結合能を有する、
（３）遺伝子がヒト染色体５ｑ３１．２に位置する、
（４）分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１５０
ｋＤａである。このタンパク質をコードする塩基配列を
用いて気道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の診断を行
なうことができる。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、ヒト由来のＲｈｏ標的タンパク質に関し、更
に詳細には、その遺伝子およびそれを含む診断薬に関す
る。
に詳細には、その遺伝子およびそれを含む診断薬に関す
る。
【０００２】背景技術 生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量
Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒ
ｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別するこ
とができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機
能を制御していることが明らかになってきており、例え
ば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏ
タンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等を
それぞれ制御していると考えられている。
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量
Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒ
ｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別するこ
とができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機
能を制御していることが明らかになってきており、例え
ば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏ
タンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等を
それぞれ制御していると考えられている。
【０００３】このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／Ｇ
ＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾ
ホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等
のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係し
ているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏ
タンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤ
Ｓ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパ
ク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタン
パク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に
変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標
的タンパク質に作用することによってストレス繊維およ
び接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導
されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-10
2(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性
ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結
合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａ
ｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化
タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. eta
l.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。
ＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾ
ホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等
のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係し
ているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏ
タンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤ
Ｓ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパ
ク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタン
パク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に
変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標
的タンパク質に作用することによってストレス繊維およ
び接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導
されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-10
2(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性
ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結
合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａ
ｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化
タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. eta
l.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。
【０００４】ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子
のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（st
ress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact
）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられ
ている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1
992) ,A. J. Ridley& A. Hall, EMBO J.,1353,2600-261
0(1994)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパ
ク質は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Ce
ll Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,
N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、
T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(19
93) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10629-10633 (1995)、Landanna, C. et al., Sc
ience 271, 981-983 (1996)）、細胞運動（K. Takaishi
et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質分裂（cy
tokinesis ）（K. Kishiet al.,J. Cell Biol.,120,118
7-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,325-331
(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった生理機
能にも関連があると考えられている。更に、Ｒｈｏタン
パク質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Ch
em.,267,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Let
t., 367, 246-250 (1995) 、M. Gong et al.,Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 93,1340〜1345(1996) ）、フォス
ファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナ
ーゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-2
2254 (1993) ）、フォスファチジルイノシトール ４−
リン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）（L.
D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏ
ｓの発現（C. S. Hillet al.,Cell,81,1159-1170(1995)
）の制御にも関与していることが示唆されている。
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子
のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（st
ress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact
）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられ
ている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1
992) ,A. J. Ridley& A. Hall, EMBO J.,1353,2600-261
0(1994)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパ
ク質は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Ce
ll Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,
N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、
T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(19
93) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10629-10633 (1995)、Landanna, C. et al., Sc
ience 271, 981-983 (1996)）、細胞運動（K. Takaishi
et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質分裂（cy
tokinesis ）（K. Kishiet al.,J. Cell Biol.,120,118
7-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,325-331
(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった生理機
能にも関連があると考えられている。更に、Ｒｈｏタン
パク質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Ch
em.,267,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Let
t., 367, 246-250 (1995) 、M. Gong et al.,Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 93,1340〜1345(1996) ）、フォス
ファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナ
ーゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-2
2254 (1993) ）、フォスファチジルイノシトール ４−
リン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）（L.
D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏ
ｓの発現（C. S. Hillet al.,Cell,81,1159-1170(1995)
）の制御にも関与していることが示唆されている。
【０００５】また、最近では、アミノ酸配列を一部置換
したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依
存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏ
タンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫
瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,1
0,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cel
l.Biol.,15,6443-6453(1995)、R.Qiu et al.、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) 、およびLebowi
tz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995) ）。
また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク
質が変異すると、細胞が形質転換することが明らかにさ
れている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,131 〜138(199
6) ）、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,269,62-65 (199
4)、Horii,Y. et al., EMBO J., 13,4776-4786 (1994)
）。更に、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸潤、すな
わちガン転移に関与していることが明らかにされている
（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28 (1995)
）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着能の変
化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は細胞接
着に関与することが明らかにされている（前掲 Morii,
N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusrat,
A.et al.(1995) 、Landanna,C.et al.(1996) ）。
したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依
存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏ
タンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫
瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,1
0,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cel
l.Biol.,15,6443-6453(1995)、R.Qiu et al.、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) 、およびLebowi
tz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995) ）。
また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク
質が変異すると、細胞が形質転換することが明らかにさ
れている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,131 〜138(199
6) ）、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,269,62-65 (199
4)、Horii,Y. et al., EMBO J., 13,4776-4786 (1994)
）。更に、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸潤、すな
わちガン転移に関与していることが明らかにされている
（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28 (1995)
）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着能の変
化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は細胞接
着に関与することが明らかにされている（前掲 Morii,
N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusrat,
A.et al.(1995) 、Landanna,C.et al.(1996) ）。
【０００６】また、Ｒｈｏシグナル伝達におけるホスホ
イノシチドキナーゼの関与が報告されている。Ｒｈｏ
（Chong, L.D. et al., Cell, 79, 507-513 (1994)）お
よびＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の他のメン
バーであるＲａｃ（Hartwig, J.H. et al., Cell, 82,
643-653 (1995)） は、異なる細胞系においてホスファ
チジルイノシトールビスホスフェート（ＰＩＰ２）の合
成を刺激することが証明された。ＰＩＰ２の結合は多数
のアクチン関連タンパク質の機能を調節すると考えられ
る（Janmey, P.A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191
(1994)）ので、細胞内局在的なその生合成によってフォ
ーカルアクチン再構成が促進されると考えられる。ＰＩ
Ｐ２により調節されるタンパク質の１つはプロフィリン
であり、これはアクチンモノマーと複合体を作り、そし
てＰＩＰ２との結合の際アクチンを解離する。プロフィ
リンは、また、チモシンβ４の存在下においてアクチン
フィラメントの界合を促進する（Pantaloni, D., & Crl
ier, M-F, Cell, 75, 1007-1014 (1993)）。従って、プ
ロフィリンの接着部位への蓄積がアクチン再構成におい
て重要であると考えられる（Theriot, J. A. & Mitchis
on, T. J., Cell, 75,835-838 (1993) ）。
イノシチドキナーゼの関与が報告されている。Ｒｈｏ
（Chong, L.D. et al., Cell, 79, 507-513 (1994)）お
よびＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の他のメン
バーであるＲａｃ（Hartwig, J.H. et al., Cell, 82,
643-653 (1995)） は、異なる細胞系においてホスファ
チジルイノシトールビスホスフェート（ＰＩＰ２）の合
成を刺激することが証明された。ＰＩＰ２の結合は多数
のアクチン関連タンパク質の機能を調節すると考えられ
る（Janmey, P.A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191
(1994)）ので、細胞内局在的なその生合成によってフォ
ーカルアクチン再構成が促進されると考えられる。ＰＩ
Ｐ２により調節されるタンパク質の１つはプロフィリン
であり、これはアクチンモノマーと複合体を作り、そし
てＰＩＰ２との結合の際アクチンを解離する。プロフィ
リンは、また、チモシンβ４の存在下においてアクチン
フィラメントの界合を促進する（Pantaloni, D., & Crl
ier, M-F, Cell, 75, 1007-1014 (1993)）。従って、プ
ロフィリンの接着部位への蓄積がアクチン再構成におい
て重要であると考えられる（Theriot, J. A. & Mitchis
on, T. J., Cell, 75,835-838 (1993) ）。
【０００７】ところで、アクチンの細胞骨格は、細胞の
運動性、形態、食作用および細胞質分裂において重要な
役割を果たす。それは空間的および動的に再構成され、
大部分の真核細胞の形態変化および細胞表面運動のため
の力を提供する。アクチンの再構成（rearrangement ）
は細胞外の刺激により急速に引き起こされ、一連のアク
チン結合タンパク質はアクチンフィラメントの重合、架
橋および固定に共調的に作用すると考えられる。低分子
量Ｇタンパク質Ｒｈｏは多数のアクチン依存性細胞プロ
セス、例えば、血小板凝集（Morii, N. et al., J. Bio
l. Chem., 267,20921-20926 (1992) ）、リンパ球接着
（Tominaga, T. et al., J. Cell. Biol., 120, 1529-1
537 (1993 ））、細胞運動性の亢進（Takaishi, K. et
al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）、および収縮環の
形成および細胞質分裂（Kishi, K. et al., J. Cell Bi
ol., 120, 1187-1195 (1993)、およびMabuchi, I. et a
l., Zygote, 1, 325-331 (1993) ）に必要とされること
が示されている。培養した線維芽細胞において、Ｒｈｏ
タンパク質をマイクロインジェクションすると、アクチ
ン・ストレスファイバーやフォーカル接着（focal adhe
sion）の形成を急速に誘導する。逆に、ボツリヌス菌
（botulinum ）のＣ３菌体外酵素（ＡＤＰ−リボシルト
ランスフェラーゼ）によるＲｈｏの不活性化はこのプロ
セスを阻害する（Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 7
0, 389-399 (1992)）。Ｃ３菌体外酵素の処理は、ま
た、フォーカル接着キナーゼ（focal adhesion kinase:
ＦＡＫ）およびパキシリン（paxillin）のリゾホスフ
ァチジン酸（ＬＰＡ）−、エンドセリン−またはＧＴＰ
γＳ−誘導性チロシンリン酸化を阻害する（Kumagai,
N. et al., J. Biol. Chem., 268, 24535-24538 (1993)
、Rankin, S. et al., FEBS Lett., 354, 315-319 (19
94)、Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 70, 389-399
(1992)、およびSeckl, M. J. et al., J. Biol. Chem.
270, 6984-6990 (1995) ）。これらの結果より、Ｒｈｏ
タンパク質が細胞外刺激とアクチン細胞骨格の再構成と
を連結するシグナル伝達経路を調節することが示されて
いる。
運動性、形態、食作用および細胞質分裂において重要な
役割を果たす。それは空間的および動的に再構成され、
大部分の真核細胞の形態変化および細胞表面運動のため
の力を提供する。アクチンの再構成（rearrangement ）
は細胞外の刺激により急速に引き起こされ、一連のアク
チン結合タンパク質はアクチンフィラメントの重合、架
橋および固定に共調的に作用すると考えられる。低分子
量Ｇタンパク質Ｒｈｏは多数のアクチン依存性細胞プロ
セス、例えば、血小板凝集（Morii, N. et al., J. Bio
l. Chem., 267,20921-20926 (1992) ）、リンパ球接着
（Tominaga, T. et al., J. Cell. Biol., 120, 1529-1
537 (1993 ））、細胞運動性の亢進（Takaishi, K. et
al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）、および収縮環の
形成および細胞質分裂（Kishi, K. et al., J. Cell Bi
ol., 120, 1187-1195 (1993)、およびMabuchi, I. et a
l., Zygote, 1, 325-331 (1993) ）に必要とされること
が示されている。培養した線維芽細胞において、Ｒｈｏ
タンパク質をマイクロインジェクションすると、アクチ
ン・ストレスファイバーやフォーカル接着（focal adhe
sion）の形成を急速に誘導する。逆に、ボツリヌス菌
（botulinum ）のＣ３菌体外酵素（ＡＤＰ−リボシルト
ランスフェラーゼ）によるＲｈｏの不活性化はこのプロ
セスを阻害する（Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 7
0, 389-399 (1992)）。Ｃ３菌体外酵素の処理は、ま
た、フォーカル接着キナーゼ（focal adhesion kinase:
ＦＡＫ）およびパキシリン（paxillin）のリゾホスフ
ァチジン酸（ＬＰＡ）−、エンドセリン−またはＧＴＰ
γＳ−誘導性チロシンリン酸化を阻害する（Kumagai,
N. et al., J. Biol. Chem., 268, 24535-24538 (1993)
、Rankin, S. et al., FEBS Lett., 354, 315-319 (19
94)、Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 70, 389-399
(1992)、およびSeckl, M. J. et al., J. Biol. Chem.
270, 6984-6990 (1995) ）。これらの結果より、Ｒｈｏ
タンパク質が細胞外刺激とアクチン細胞骨格の再構成と
を連結するシグナル伝達経路を調節することが示されて
いる。
【０００８】Ｒｈｏタンパク質には多数の標的分子があ
り、上記の多数のシグナル伝達経路を調節していると考
えられている。ごく最近、哺乳類において、いくつかの
候補タンパク質が報告された。これらのタンパク質は、
プロテインキナーゼＮ（ＰＫＮ）（Watanabe, G. et a
l., Science 271, 645-648 (1996); Amano, M. et al.,
Sceince 271, 648-650 (1996) ）、ローフィリン（Wat
anabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）、
シトロン（Madaule, P. et al., FEBS Lett. 377, 243-
248 (1995)）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（Ishizaki, T. et a
l., EMBO J., 15,1885-1896 (1996))、ＲＯＫα（Leun
g, T. et al., J. Biol. Chem. 270, 29051-29054 (199
5)）、Ｒｈｏ結合キナーゼ(Matsui,T.et al.,EMBO J.1
5,1885-1893(1996)）、ローテキン(Reid,T.et al.,J.Bi
ol.Chem.,271,9816-9822(1996) ）、ミオシン軽鎖ホス
ファターゼ（Kimura, K. et al., Science, 273, 245-2
48(1996)）、マウスｍＤｉａ（成宮 周ら、日本生化学
会、日本分子生物学会合同年会講演要旨集、31頁および
319頁（1996年)）である。これらのタンパク質はいずれ
もＧＴＰ結合ＲｈｏＡタンパク質に結合する（ただし、
シトロンだけはＧＴＰ結合Ｒａｃ１タンパク質にも結合
する）。
り、上記の多数のシグナル伝達経路を調節していると考
えられている。ごく最近、哺乳類において、いくつかの
候補タンパク質が報告された。これらのタンパク質は、
プロテインキナーゼＮ（ＰＫＮ）（Watanabe, G. et a
l., Science 271, 645-648 (1996); Amano, M. et al.,
Sceince 271, 648-650 (1996) ）、ローフィリン（Wat
anabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）、
シトロン（Madaule, P. et al., FEBS Lett. 377, 243-
248 (1995)）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（Ishizaki, T. et a
l., EMBO J., 15,1885-1896 (1996))、ＲＯＫα（Leun
g, T. et al., J. Biol. Chem. 270, 29051-29054 (199
5)）、Ｒｈｏ結合キナーゼ(Matsui,T.et al.,EMBO J.1
5,1885-1893(1996)）、ローテキン(Reid,T.et al.,J.Bi
ol.Chem.,271,9816-9822(1996) ）、ミオシン軽鎖ホス
ファターゼ（Kimura, K. et al., Science, 273, 245-2
48(1996)）、マウスｍＤｉａ（成宮 周ら、日本生化学
会、日本分子生物学会合同年会講演要旨集、31頁および
319頁（1996年)）である。これらのタンパク質はいずれ
もＧＴＰ結合ＲｈｏＡタンパク質に結合する（ただし、
シトロンだけはＧＴＰ結合Ｒａｃ１タンパク質にも結合
する）。
【０００９】最近、出芽酵母（Saccharomyces cerevisi
ae）に関して、次のようなＲｈｏタンパク質の標的タン
パク質が報告された：Ｐｋｃ１ｐ（Nonaka, H. et al.,
EMBO J. 14: 5931-5938(1995); Kamada, Y. et al.,
J. Biol. Chem. 271: 9193-9196(1996)）、1,3-β-グ
ルカンシンターゼ（Drgonova, J. et al., Science 27
2: 277-279(1996);Qadota, H. et al., Science 272:
279-281(1996)）およびＢｎｉ１ｐ（Kohno, H. et al.,
EMBO J. 15: 6060-6068(1996)）。一方、ポリ−プロリ
ン領域およびＦＨ２領域を含むタンパク質として、出芽
酵母のＢｎｉ１ｐ（前掲Kohno, H. et al. (1996)）、
ショウジョウバエのディアファノス（diaphanous）（Ca
strillion, D. H. & Wasserman, S. A., Development 1
20: 3367-3377(1994)）およびカプシノ（cappuccino）
（Emons et al., Genes & Dev. 9: 2482-2494(199
5)）、並びにマウスのフォルミン（Woychick et al., N
ature 346: 850-853(1990)）およびｍＤｉａ（前掲、成
宮ら(1996)）が知られている。
ae）に関して、次のようなＲｈｏタンパク質の標的タン
パク質が報告された：Ｐｋｃ１ｐ（Nonaka, H. et al.,
EMBO J. 14: 5931-5938(1995); Kamada, Y. et al.,
J. Biol. Chem. 271: 9193-9196(1996)）、1,3-β-グ
ルカンシンターゼ（Drgonova, J. et al., Science 27
2: 277-279(1996);Qadota, H. et al., Science 272:
279-281(1996)）およびＢｎｉ１ｐ（Kohno, H. et al.,
EMBO J. 15: 6060-6068(1996)）。一方、ポリ−プロリ
ン領域およびＦＨ２領域を含むタンパク質として、出芽
酵母のＢｎｉ１ｐ（前掲Kohno, H. et al. (1996)）、
ショウジョウバエのディアファノス（diaphanous）（Ca
strillion, D. H. & Wasserman, S. A., Development 1
20: 3367-3377(1994)）およびカプシノ（cappuccino）
（Emons et al., Genes & Dev. 9: 2482-2494(199
5)）、並びにマウスのフォルミン（Woychick et al., N
ature 346: 850-853(1990)）およびｍＤｉａ（前掲、成
宮ら(1996)）が知られている。
【００１０】しかしながら、Ｒｈｏタンパク質およびア
クチン細胞骨格の再構成を調節するプロフィリンに結合
するヒトのＲｈｏ標的タンパク質に関する報告は本発明
者が知る限りなされていない。
クチン細胞骨格の再構成を調節するプロフィリンに結合
するヒトのＲｈｏ標的タンパク質に関する報告は本発明
者が知る限りなされていない。
【００１１】
【発明の概要】本発明者は、今般、酵母ツー・ハイブリ
ッド・システムを使用して、Ｒｈｏタンパク質の標的タ
ンパク質（マウスｍＤｉａ）を同定した。これは細胞質
分裂に必要なショウジョウバエ（Drosophila）のディア
ファノス（diaphanous）の哺乳類ホモローグであり、繰
り返し状ポリ−プロリンのストレッチおよびフォルミン
ホモロジー（ＦＨ２）ドメインを含有する。マウスｍＤ
ｉａはＧＴＰ結合型Ｒｈｏのそのアミノ末端領域を介し
て選択的に結合し、アクチン結合タンパク質であるプロ
フィリンに結合する。マウスｍＤｉａ、プロフィリンお
よびＲｈｏタンパク質は、広がった線維芽細胞の膜の波
打ち構造（ruffle）、および分裂細胞の分裂溝（ｃleav
age furrow）に局在化し、フィブロネクチンでコーティ
ングされたラテックスビーズによりビーズ下の原形質膜
にリクルート（recruit ）された。これらの結果から、
Ｒｈｏタンパク質によるアクチン再構成の誘導のメカニ
ズムの１つが、ｍＤｉａを介した細胞の特異的部位にお
けるプロフィラクチン複合体のリクルートメント（recr
uitment ）であることが示唆された。
ッド・システムを使用して、Ｒｈｏタンパク質の標的タ
ンパク質（マウスｍＤｉａ）を同定した。これは細胞質
分裂に必要なショウジョウバエ（Drosophila）のディア
ファノス（diaphanous）の哺乳類ホモローグであり、繰
り返し状ポリ−プロリンのストレッチおよびフォルミン
ホモロジー（ＦＨ２）ドメインを含有する。マウスｍＤ
ｉａはＧＴＰ結合型Ｒｈｏのそのアミノ末端領域を介し
て選択的に結合し、アクチン結合タンパク質であるプロ
フィリンに結合する。マウスｍＤｉａ、プロフィリンお
よびＲｈｏタンパク質は、広がった線維芽細胞の膜の波
打ち構造（ruffle）、および分裂細胞の分裂溝（ｃleav
age furrow）に局在化し、フィブロネクチンでコーティ
ングされたラテックスビーズによりビーズ下の原形質膜
にリクルート（recruit ）された。これらの結果から、
Ｒｈｏタンパク質によるアクチン再構成の誘導のメカニ
ズムの１つが、ｍＤｉａを介した細胞の特異的部位にお
けるプロフィラクチン複合体のリクルートメント（recr
uitment ）であることが示唆された。
【００１２】本発明者等は、また、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質の標的タンパク質であるマウスｍＤｉａのヒト・カ
ウンターパート（ヒトｍＤｉａ）のｃＤＮＡのクローニ
ングに成功した（実施例１０）。更に、ヒトｍＤｉａ
ｃＤＮＡの部分配列からなるプローブおよびプライマー
を用いて、ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置（遺伝
子座）を決定した。その結果、ヒトｍＤｉａ遺伝子座
が、気管支喘息および気道過敏症の遺伝子座、急性骨髄
性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）
で欠失または再構成が求められる染色体上の領域と一致
することを見出した。これらは、ヒトではｍＤｉａ遺伝
子の変異（増幅、欠失または再構成）またはその発現の
低下または亢進が、気管支喘息の危険因子であること、
およびＡＭＬおよびＭＤＳの特徴のひとつであることを
意味している。本発明は、かかる知見に基づくものであ
る。
ク質の標的タンパク質であるマウスｍＤｉａのヒト・カ
ウンターパート（ヒトｍＤｉａ）のｃＤＮＡのクローニ
ングに成功した（実施例１０）。更に、ヒトｍＤｉａ
ｃＤＮＡの部分配列からなるプローブおよびプライマー
を用いて、ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置（遺伝
子座）を決定した。その結果、ヒトｍＤｉａ遺伝子座
が、気管支喘息および気道過敏症の遺伝子座、急性骨髄
性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）
で欠失または再構成が求められる染色体上の領域と一致
することを見出した。これらは、ヒトではｍＤｉａ遺伝
子の変異（増幅、欠失または再構成）またはその発現の
低下または亢進が、気管支喘息の危険因子であること、
およびＡＭＬおよびＭＤＳの特徴のひとつであることを
意味している。本発明は、かかる知見に基づくものであ
る。
【００１３】従って、本発明は、プロフィリン結合能を
有するヒト由来のＲｈｏ標的タンパク質の提供をその目
的とする。
有するヒト由来のＲｈｏ標的タンパク質の提供をその目
的とする。
【００１４】また、本発明によれば、前記タンパク質を
コードする塩基配列、前記塩基配列を含むベクター、前
記ベクターによって形質転換された宿主細胞、前記タン
パク質の製造法、および活性型Ｒｈｏタンパク質または
プロフィリンとその標的タンパク質との結合を阻害する
スクリーニング法等の提供をその目的とする。
コードする塩基配列、前記塩基配列を含むベクター、前
記ベクターによって形質転換された宿主細胞、前記タン
パク質の製造法、および活性型Ｒｈｏタンパク質または
プロフィリンとその標的タンパク質との結合を阻害する
スクリーニング法等の提供をその目的とする。
【００１５】また、本発明は、前記塩基配列の部分断片
を含むプローブ、および該プローブまたは塩基配列を含
む診断薬の提供をその目的とする。
を含むプローブ、および該プローブまたは塩基配列を含
む診断薬の提供をその目的とする。
【００１６】そして、本発明によるタンパク質は、下記
の特徴を有するヒト由来のタンパク質（以下「ヒトｍＤ
ｉａ」ということがある）である： （１）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する、（２）
プロフィリン結合能を有する、（３）遺伝子がヒト染色
体５ｑ３１．２に位置する、（４）分子量がＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる測定で約１５０ｋＤａである。
の特徴を有するヒト由来のタンパク質（以下「ヒトｍＤ
ｉａ」ということがある）である： （１）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する、（２）
プロフィリン結合能を有する、（３）遺伝子がヒト染色
体５ｑ３１．２に位置する、（４）分子量がＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる測定で約１５０ｋＤａである。
【００１７】前述のように活性型Ｒｈｏタンパク質への
結合活性を有するタンパク質として、哺乳類ではプロテ
インキナーゼＮ（ＰＫＮ）、ローフィリン、シトロン、
ｐ１６０ＲＯＣＫ、Ｒｈｏ結合キナーゼ、ＲＯＫα、ロ
ーテキン、ミオシン軽鎖ホスファターゼのミオシン結合
サブユニットおよびマウスｍＤｉａが、出芽酵母ではＰ
ｋｃ１ｐ、1,3-β-グルカンシンターゼおよびＢｎｉ１
ｐが、それぞれ知られているが、本発明者らは、ヒトｍ
Ｄｉａとこれらのタンパク質とは異なるタンパク質であ
ることを確認している。
結合活性を有するタンパク質として、哺乳類ではプロテ
インキナーゼＮ（ＰＫＮ）、ローフィリン、シトロン、
ｐ１６０ＲＯＣＫ、Ｒｈｏ結合キナーゼ、ＲＯＫα、ロ
ーテキン、ミオシン軽鎖ホスファターゼのミオシン結合
サブユニットおよびマウスｍＤｉａが、出芽酵母ではＰ
ｋｃ１ｐ、1,3-β-グルカンシンターゼおよびＢｎｉ１
ｐが、それぞれ知られているが、本発明者らは、ヒトｍ
Ｄｉａとこれらのタンパク質とは異なるタンパク質であ
ることを確認している。
【００１８】これらのうち、出芽酵母のＢｎｉ１ｐは、
活性型Ｒｈｏ結合領域に加え、ポリ−プロリン領域およ
びＦＨ−２領域を有する（実施例２および図４）が、ヒ
トｍＤｉａとＢｎｉ１のアミノ酸配列の同一性は極めて
低い。また、ショウジョウバエのディアファノスおよび
カプシノには、ポリ−プロリン領域およびＦＨ−２領域
が存在し、ディアファノスにはさらに活性型Ｒｈｏ結合
領域に似たアミノ酸配列も存在するが、ヒトｍＤｉａと
ディアファノスおよびカプシノとのアミノ酸配列の同一
性は、Ｂｎｉ１ｐと同様極めて低い。
活性型Ｒｈｏ結合領域に加え、ポリ−プロリン領域およ
びＦＨ−２領域を有する（実施例２および図４）が、ヒ
トｍＤｉａとＢｎｉ１のアミノ酸配列の同一性は極めて
低い。また、ショウジョウバエのディアファノスおよび
カプシノには、ポリ−プロリン領域およびＦＨ−２領域
が存在し、ディアファノスにはさらに活性型Ｒｈｏ結合
領域に似たアミノ酸配列も存在するが、ヒトｍＤｉａと
ディアファノスおよびカプシノとのアミノ酸配列の同一
性は、Ｂｎｉ１ｐと同様極めて低い。
【００１９】
【発明の具体的説明】定義 本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すな
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「ペプチド」と
は、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチ
ドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペ
プチドをも意味するものとする。
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「ペプチド」と
は、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチ
ドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペ
プチドをも意味するものとする。
【００２０】また、本発明において、「アミノ酸」と
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプ
チドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入され
るアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０
種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら
以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸お
よび非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ
−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、
γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天
然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非
天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシ
ン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３
−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプ
チドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入され
るアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０
種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら
以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸お
よび非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ
−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、
γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天
然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非
天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシ
ン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３
−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。
【００２１】また、本明細書において「本発明によるタ
ンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用い
られるものとする。
ンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用い
られるものとする。
【００２２】更にまた、本明細書において「塩基配列」
とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味す
るものとする。
とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味す
るものとする。
【００２３】タンパク質の変異部位は、最初に置換され
る前のアミノ酸残基（一文字表記）、真ん中に置換され
るアミノ酸の位置、そして最後に置換された後のアミノ
酸残基（一文字表記）を記載することで表した。例え
ば、「ヒトｍＤｉａ（Ｄ５５１Ａ）」は、ヒトｍＤｉａ
をコードするアミノ酸配列であって、５５１番目のアミ
ノ酸残基であるＤ（Asp：アスパラギン酸）がＡ（Ala：
アラニン）で置換されたアミノ酸配列を表す。
る前のアミノ酸残基（一文字表記）、真ん中に置換され
るアミノ酸の位置、そして最後に置換された後のアミノ
酸残基（一文字表記）を記載することで表した。例え
ば、「ヒトｍＤｉａ（Ｄ５５１Ａ）」は、ヒトｍＤｉａ
をコードするアミノ酸配列であって、５５１番目のアミ
ノ酸残基であるＤ（Asp：アスパラギン酸）がＡ（Ala：
アラニン）で置換されたアミノ酸配列を表す。
【００２４】タンパク質 本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するタンパク
質またはその誘導体である。ここで、Ｒｈｏタンパク質
としては、ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、
ＲｈｏＣタンパク質、またはＲｈｏＧタンパク質が挙げ
られる。
合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するタンパク
質またはその誘導体である。ここで、Ｒｈｏタンパク質
としては、ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、
ＲｈｏＣタンパク質、またはＲｈｏＧタンパク質が挙げ
られる。
【００２５】本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価される
タンパク質をいい、例えば、実施例１および５と同様の
条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質と
の結合が認められたと評価されるタンパク質を意味する
ものとする。
質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価される
タンパク質をいい、例えば、実施例１および５と同様の
条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質と
の結合が認められたと評価されるタンパク質を意味する
ものとする。
【００２６】本発明によるタンパク質は、Ｒｈｏタンパ
ク質結合領域に加えて、ポリ−プロリン領域、およびＦ
Ｈ２領域を有する（実施例２および実施例１１）。ポリ
−プロリン領域とは、ＩＰＰＰＰＰＬＰＧもしくはこれ
に類似する配列（モチーフ）の繰り返しによって特徴づ
けられる領域をいう。マウスのｍＤｉａタンパク質のポ
リ−プロリン領域は配列番号１の５７１〜７３７番のア
ミノ酸配列に相当し、ヒトｍＤｉａタンパク質のそれは
配列番号３の６２６〜７９７番のアミノ酸配列に相当す
る。本発明によるタンパク質は、そのポリ−プロリン領
域においてプロフィリンと結合することができる（実施
例６）。
ク質結合領域に加えて、ポリ−プロリン領域、およびＦ
Ｈ２領域を有する（実施例２および実施例１１）。ポリ
−プロリン領域とは、ＩＰＰＰＰＰＬＰＧもしくはこれ
に類似する配列（モチーフ）の繰り返しによって特徴づ
けられる領域をいう。マウスのｍＤｉａタンパク質のポ
リ−プロリン領域は配列番号１の５７１〜７３７番のア
ミノ酸配列に相当し、ヒトｍＤｉａタンパク質のそれは
配列番号３の６２６〜７９７番のアミノ酸配列に相当す
る。本発明によるタンパク質は、そのポリ−プロリン領
域においてプロフィリンと結合することができる（実施
例６）。
【００２７】ＦＨ２領域とは、フォルミン関連タンパク
質（例えば、Saccharomyces cerevisiaeのＢｎｉ１ｐ、
マウスのフォルミン、ショウジョウバエのカプチーノ、
およびディアファノスなどの比較的Ｃ末端付近に存在す
る共通領域をいう（Castrillon, D. H. & Wasserman,
S. A., Development, 120, 3367-3377 (1994)）。マウ
スｍＤｉａおよびヒトｍＤｉａタンパク質のＦＨ２領域
はそれぞれ配列番号１の９４５〜１０１０番のアミノ酸
配列および配列番号３の１００５〜１０７０番のアミノ
酸配列に相当する。また、本発明によるタンパク質はマ
ウスの肺、睾丸、胸腺、肝臓、および胃において強く発
現するという特徴を有する。
質（例えば、Saccharomyces cerevisiaeのＢｎｉ１ｐ、
マウスのフォルミン、ショウジョウバエのカプチーノ、
およびディアファノスなどの比較的Ｃ末端付近に存在す
る共通領域をいう（Castrillon, D. H. & Wasserman,
S. A., Development, 120, 3367-3377 (1994)）。マウ
スｍＤｉａおよびヒトｍＤｉａタンパク質のＦＨ２領域
はそれぞれ配列番号１の９４５〜１０１０番のアミノ酸
配列および配列番号３の１００５〜１０７０番のアミノ
酸配列に相当する。また、本発明によるタンパク質はマ
ウスの肺、睾丸、胸腺、肝臓、および胃において強く発
現するという特徴を有する。
【００２８】本発明において、「プロフィリン結合能を
有するタンパク質」とは、当業者によりプロフィリンと
の結合が認められたと評価されるタンパク質をいい、例
えば、実施例６と同様の条件において実験した場合にプ
ロフィリンとの結合が認められたと評価されるタンパク
質を意味するものとする。
有するタンパク質」とは、当業者によりプロフィリンと
の結合が認められたと評価されるタンパク質をいい、例
えば、実施例６と同様の条件において実験した場合にプ
ロフィリンとの結合が認められたと評価されるタンパク
質を意味するものとする。
【００２９】本明細書においてＲｈｏタンパク質は、Ｒ
ｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結合が実
質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパク質を
も含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパク質と
しては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換したＲｈｏ
Ａ変異体（ＲｈｏＡVal14 ）が挙げられる。
ｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結合が実
質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパク質を
も含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパク質と
しては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換したＲｈｏ
Ａ変異体（ＲｈｏＡVal14 ）が挙げられる。
【００３０】本発明によるタンパク質の起源は、ヒトを
由来とするものである。また、本発明によるタンパク質
の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１５０ｋ
Ｄである。
由来とするものである。また、本発明によるタンパク質
の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１５０ｋ
Ｄである。
【００３１】本発明によるタンパク質は、例えば、配列
番号４のｃＤＮＡ配列を宿主において発現させることに
よって得ることができる（実施例４および９）。
番号４のｃＤＮＡ配列を宿主において発現させることに
よって得ることができる（実施例４および９）。
【００３２】本明細書において、「タンパク質の誘導
体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末
端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボ
キシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチ
ドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基
以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基
等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって
修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾
は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全
性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を
目的として行われる。
体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末
端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボ
キシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチ
ドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基
以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基
等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって
修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾
は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全
性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を
目的として行われる。
【００３３】タンパク質の誘導体としては、具体的に
は、（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直
鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブ
チル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、
シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換の
アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイ
ル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フ
タロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカ
ルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシ
カルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレ
ア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェ
ニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル
基）等によって置換されたもの、並びに（２）タンパク
質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基また
は各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全
部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、そ
の水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘ
キシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリ
ルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けてい
るもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルア
ミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロ
ピルアミド）を形成しているもの、並びに（３）タンパ
ク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル
基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ
基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の
置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙
げられる。
は、（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直
鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブ
チル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、
シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換の
アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイ
ル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フ
タロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカ
ルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシ
カルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレ
ア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェ
ニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル
基）等によって置換されたもの、並びに（２）タンパク
質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基また
は各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全
部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、そ
の水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘ
キシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリ
ルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けてい
るもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルア
ミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロ
ピルアミド）を形成しているもの、並びに（３）タンパ
ク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル
基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ
基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の
置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙
げられる。
【００３４】本発明によるタンパク質の例としては、下
記のアミノ酸配列を含むものが挙げられる： （ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号３のアミノ酸配列であって、活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有する
アミノ酸配列。ここにいう付加、挿入、置換、および欠
失とは、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロフィリン結
合能を損なわないようなものをいう。このような置換と
しては、例えば、Ｄ５５１Ａが挙げられる。
記のアミノ酸配列を含むものが挙げられる： （ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号３のアミノ酸配列であって、活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有する
アミノ酸配列。ここにいう付加、挿入、置換、および欠
失とは、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロフィリン結
合能を損なわないようなものをいう。このような置換と
しては、例えば、Ｄ５５１Ａが挙げられる。
【００３５】本発明の別の面によれば、配列番号３の１
１５〜３１２番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタンパク質結合
領域）と６２６〜７９７番のアミノ酸配列（プロフィリ
ン結合領域）とを少なくとも有するタンパク質が提供さ
れる。
１５〜３１２番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタンパク質結合
領域）と６２６〜７９７番のアミノ酸配列（プロフィリ
ン結合領域）とを少なくとも有するタンパク質が提供さ
れる。
【００３６】後記のように、本発明によるタンパク質を
コードする遺伝子は、気道過敏症、気管支喘息、急性骨
髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤ
Ｓ）に関連することが示された。従って、本発明による
タンパク質は、これらの疾患の機構解明に有用である。
コードする遺伝子は、気道過敏症、気管支喘息、急性骨
髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤ
Ｓ）に関連することが示された。従って、本発明による
タンパク質は、これらの疾患の機構解明に有用である。
【００３７】本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能とプロフィリン結合能とを有するもの
である。また、Ｒｈｏタンパク質は腫瘍の形成、転移を
はじめとして細胞形態、細胞運動、細胞接着、細胞質分
裂等の細胞の機能発現に密接にかかわっている（前掲Ta
kai, Y., et al. 、G.C.Prendergast.et al.、Khosravi
-Far, R., et al ．、R. Qiu et al. 、 Lebowitz 、
P., et al., およびYoshioka,K.et al. ）。従って、本
発明によるタンパク質は、腫瘍の形成および転移の機構
解明に有用であると考えられる。
タンパク質結合能とプロフィリン結合能とを有するもの
である。また、Ｒｈｏタンパク質は腫瘍の形成、転移を
はじめとして細胞形態、細胞運動、細胞接着、細胞質分
裂等の細胞の機能発現に密接にかかわっている（前掲Ta
kai, Y., et al. 、G.C.Prendergast.et al.、Khosravi
-Far, R., et al ．、R. Qiu et al. 、 Lebowitz 、
P., et al., およびYoshioka,K.et al. ）。従って、本
発明によるタンパク質は、腫瘍の形成および転移の機構
解明に有用であると考えられる。
【００３８】また、後記実施例によれば、本発明による
タンパク質は、細胞接着に関与することが示された。従
って、本発明によるタンパク質は、ガンの細胞の浸潤お
よび転移、白血球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、好中球、
好酸球、好塩基球、マクロファージ等）の凝集および活
性化、並びに血小板の凝集および活性化等の機能解明に
有用である。
タンパク質は、細胞接着に関与することが示された。従
って、本発明によるタンパク質は、ガンの細胞の浸潤お
よび転移、白血球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、好中球、
好酸球、好塩基球、マクロファージ等）の凝集および活
性化、並びに血小板の凝集および活性化等の機能解明に
有用である。
【００３９】更に、後記実施例によれば、本発明による
タンパク質は、細胞分裂（特に、細胞の増殖）に関与す
ることが示された。従って、本発明によるタンパク質
は、ガンの増殖等の機能解明に有用である。
タンパク質は、細胞分裂（特に、細胞の増殖）に関与す
ることが示された。従って、本発明によるタンパク質
は、ガンの増殖等の機能解明に有用である。
【００４０】ヒトｍＤｉａ遺伝子座 ヒトｍＤｉａ遺伝子の変異（増幅、欠失または再構成）
またはその発現の低下または亢進が、気管支喘息の危険
因子であること、およびＡＭＬおよびＭＤＳの特徴のひ
とつであることを下記に説明する。
またはその発現の低下または亢進が、気管支喘息の危険
因子であること、およびＡＭＬおよびＭＤＳの特徴のひ
とつであることを下記に説明する。
【００４１】〔１〕気管支喘息とｍＤｉａ遺伝子座 本発明者等は後記する実施例１１に示すように、ＦＩＳ
Ｈ法およびradiationhybrid（ＲＨ）法を用いて、ヒト
ｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を詳細に決定した。
３．７ｋｂのヒトｍＤｉａ ｃＤＮＡをプローブとした
ＦＩＳＨの結果、ヒトｍＤｉａ遺伝子は５番染色体長腕
の５ｑ３１．２にマップされた。ヒトｍＤｉａ ｃＤＮ
Ａ由来のプライマー・ペアを用いてＲＨを行った結果、
ヒトｍＤｉａ遺伝子は、５番染色体長腕のマーカーＮＩ
Ｂ１９４８とＷＩ−６３８４の間でＮＩＢ１９４８より
２．０２ｃＲテロメア側にマップされた。５ｑ３１．２
の周辺領域には、気道過敏症の遺伝子の存在が想定され
ていたが、これまでそれは同定されていなかった。本発
明者等は今般、本発明においてヒトｍＤｉａが気道過敏
症の原因遺伝子そのものであるという証拠を得た（表１
および図１８）。
Ｈ法およびradiationhybrid（ＲＨ）法を用いて、ヒト
ｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を詳細に決定した。
３．７ｋｂのヒトｍＤｉａ ｃＤＮＡをプローブとした
ＦＩＳＨの結果、ヒトｍＤｉａ遺伝子は５番染色体長腕
の５ｑ３１．２にマップされた。ヒトｍＤｉａ ｃＤＮ
Ａ由来のプライマー・ペアを用いてＲＨを行った結果、
ヒトｍＤｉａ遺伝子は、５番染色体長腕のマーカーＮＩ
Ｂ１９４８とＷＩ−６３８４の間でＮＩＢ１９４８より
２．０２ｃＲテロメア側にマップされた。５ｑ３１．２
の周辺領域には、気道過敏症の遺伝子の存在が想定され
ていたが、これまでそれは同定されていなかった。本発
明者等は今般、本発明においてヒトｍＤｉａが気道過敏
症の原因遺伝子そのものであるという証拠を得た（表１
および図１８）。
【００４２】
【表１】
【００４３】気管支喘息は発作性の呼吸困難、喘鳴、
咳、喀痰を示す疾患で、その原因は広範な気道狭窄によ
るものである。気道過敏症は気管支喘息の危険因子のひ
とつであり、様々な刺激（例えば肥満細胞が放出するヒ
スタミンなどによる刺激）に対して気道が強く収縮（狭
窄または閉塞）性の反応をおこすことを意味する。気道
過敏症の素因は外因性のものばかりでなく内因性（遺伝
性）のものもある。最近、Postmaらは、ヒスタミンに対
する過敏症を指標として遺伝学的な連鎖解析を行い、気
道過敏症の原因遺伝子の染色体上の位置を決定した（Po
stma, D. S., N.Eng. J. Med. 333:894-900 (1995)
）。その結果、気道過敏症の原因遺伝子は５ｑ３１．
２に存在し、遺伝学的マーカーＤ５Ｓ６５８およびＤ５
Ｓ４３６とその周辺のマーカーと連鎖することが示され
た（表１および図１８）。
咳、喀痰を示す疾患で、その原因は広範な気道狭窄によ
るものである。気道過敏症は気管支喘息の危険因子のひ
とつであり、様々な刺激（例えば肥満細胞が放出するヒ
スタミンなどによる刺激）に対して気道が強く収縮（狭
窄または閉塞）性の反応をおこすことを意味する。気道
過敏症の素因は外因性のものばかりでなく内因性（遺伝
性）のものもある。最近、Postmaらは、ヒスタミンに対
する過敏症を指標として遺伝学的な連鎖解析を行い、気
道過敏症の原因遺伝子の染色体上の位置を決定した（Po
stma, D. S., N.Eng. J. Med. 333:894-900 (1995)
）。その結果、気道過敏症の原因遺伝子は５ｑ３１．
２に存在し、遺伝学的マーカーＤ５Ｓ６５８およびＤ５
Ｓ４３６とその周辺のマーカーと連鎖することが示され
た（表１および図１８）。
【００４４】本発明者等は後記する実施例１１におい
て、ヒトｍＤｉａ遺伝子が５ｑ３１．２に存在し、遺伝
学的マーカー ＮＩＢ１９４８より２．０２ｃＲ長腕テ
ロメア側に存在することをつきとめた。ヒトｍＤｉａ遺
伝子とこれらの遺伝学的なマーカーの存在部位の順序と
距離（単位：ｃＭおよびｃＲ）をＷＩＣＧＲのゲノム解
析サービス（http://www-genome.wi.mit.edu/ ）を用い
て解析したところ、第５染色体短腕テロメア−セントロ
メア−ＮＩＢ１９４８−−Ｄ５Ｓ６５８−ヒトｍＤｉａ
遺伝子−Ｄ５Ｓ４３６−長腕テロメアとなった。即ち、
ヒトｍＤｉａ遺伝子は気道過敏症がマップされた領域
（Ｄ５Ｓ６５８〜Ｄ５Ｓ４３６の間の約５ｃＭ）に含ま
れることがわかった（表１および図１８）。このこと
は、ヒトｍＤｉａ遺伝子の変異が、気道過敏症の原因も
しくは危険因子となっていることを示す。
て、ヒトｍＤｉａ遺伝子が５ｑ３１．２に存在し、遺伝
学的マーカー ＮＩＢ１９４８より２．０２ｃＲ長腕テ
ロメア側に存在することをつきとめた。ヒトｍＤｉａ遺
伝子とこれらの遺伝学的なマーカーの存在部位の順序と
距離（単位：ｃＭおよびｃＲ）をＷＩＣＧＲのゲノム解
析サービス（http://www-genome.wi.mit.edu/ ）を用い
て解析したところ、第５染色体短腕テロメア−セントロ
メア−ＮＩＢ１９４８−−Ｄ５Ｓ６５８−ヒトｍＤｉａ
遺伝子−Ｄ５Ｓ４３６−長腕テロメアとなった。即ち、
ヒトｍＤｉａ遺伝子は気道過敏症がマップされた領域
（Ｄ５Ｓ６５８〜Ｄ５Ｓ４３６の間の約５ｃＭ）に含ま
れることがわかった（表１および図１８）。このこと
は、ヒトｍＤｉａ遺伝子の変異が、気道過敏症の原因も
しくは危険因子となっていることを示す。
【００４５】気道過敏性の亢進の機序のひとつとして、
気道平滑筋収縮の感受性の亢進が考えられる。即ち、上
記の気道過敏症患者では、ヒスタミン刺激に対する気道
平滑筋収縮の感受性が亢進していると考えられる。
気道平滑筋収縮の感受性の亢進が考えられる。即ち、上
記の気道過敏症患者では、ヒスタミン刺激に対する気道
平滑筋収縮の感受性が亢進していると考えられる。
【００４６】一方、活性型Ｒｈｏタンパク質によって、
平滑筋収縮の感受性が亢進することが知られている（K.
Hirata et al., J. Biol. Chem. 267: 8719-8722(199
2) ）。その機序は以下のとおりである。 （１）種々の刺激に応答して細胞内でＲｈｏタンパク質
が活性化される。 （２）活性化型Ｒｈｏタンパク質はＲｈｏキナーゼに結
合し、それを活性化する（Matsui, T. et al., EMBO J.
15: 2208-2216 (1996);前掲 Leung, T. et al. ）。 （３）活性化されたＲｈｏキナーゼは、ミオシン軽鎖ホ
スファターゼを抑制する（Kimura, K. et al., Science
273: 245-248 (1996)）と同時に、直接ミオシン軽鎖を
リン酸化する（Amano, M. et al., J. Biol. Chem 271:
20246-20249 (1996) ）。その結果、ミオシン軽鎖のリ
ン酸化レベルが増加する。 （４）リン酸化によりミオシンＡＴＰａｓｅが活性化さ
れ、ミオシンがアクチンと相互作用する。その結果、平
滑筋が収縮する。
平滑筋収縮の感受性が亢進することが知られている（K.
Hirata et al., J. Biol. Chem. 267: 8719-8722(199
2) ）。その機序は以下のとおりである。 （１）種々の刺激に応答して細胞内でＲｈｏタンパク質
が活性化される。 （２）活性化型Ｒｈｏタンパク質はＲｈｏキナーゼに結
合し、それを活性化する（Matsui, T. et al., EMBO J.
15: 2208-2216 (1996);前掲 Leung, T. et al. ）。 （３）活性化されたＲｈｏキナーゼは、ミオシン軽鎖ホ
スファターゼを抑制する（Kimura, K. et al., Science
273: 245-248 (1996)）と同時に、直接ミオシン軽鎖を
リン酸化する（Amano, M. et al., J. Biol. Chem 271:
20246-20249 (1996) ）。その結果、ミオシン軽鎖のリ
ン酸化レベルが増加する。 （４）リン酸化によりミオシンＡＴＰａｓｅが活性化さ
れ、ミオシンがアクチンと相互作用する。その結果、平
滑筋が収縮する。
【００４７】ところで、ラットのＲｈｏキナーゼはＲＯ
Ｋαと呼ばれることがある（Leung,T. et al., J. Bio
l. Chem. 270: 29051-29054 (1995)）。また、Ｒｈｏキ
ナーゼにはアイソザイム（ＲＯＣＫまたはＲＯＣＫ−
Ｉ；Ishizaki, T. et al., EMBO J. 15: 1885-1893 (19
96); Nakagawa, O. et al., FEBS Lett. 392, 189-193
(1996) ）が知られている。ＲＯＫαおよびＲＯＣＫ
も、Ｒｈｏキナーゼと同様に、平滑筋収縮の感受性の亢
進に関っていると考えられる。
Ｋαと呼ばれることがある（Leung,T. et al., J. Bio
l. Chem. 270: 29051-29054 (1995)）。また、Ｒｈｏキ
ナーゼにはアイソザイム（ＲＯＣＫまたはＲＯＣＫ−
Ｉ；Ishizaki, T. et al., EMBO J. 15: 1885-1893 (19
96); Nakagawa, O. et al., FEBS Lett. 392, 189-193
(1996) ）が知られている。ＲＯＫαおよびＲＯＣＫ
も、Ｒｈｏキナーゼと同様に、平滑筋収縮の感受性の亢
進に関っていると考えられる。
【００４８】Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＫα）および／また
はＲＯＣＫは、細胞のストレスファイバー形成およびフ
ォーカル接着形成を促進することにより（Lim, L. et a
l.,Mol. Cell. Biol., 16: 5313-5327 (1996); Amano,
M. et al., Science 275, 1308-1311 (1997) ）、細胞
を収縮させると考えられる。本発明者等は後記する実施
例９において、細胞内にｍＤｉａを大量発現させると、
活性型Ｒｈｏタンパク質によるストレスファイバー形成
が抑制されることを見出した。従って、大量発現された
ｍＤｉａは、活性型Ｒｈｏタンパク質からＲｈｏキナー
ゼおよび／またはＲＯＣＫを介してストレスファイバー
形成およびフォーカル接着形成に至るシグナル伝達経路
のどこかを阻害していると思われる。なぜならば、Ｒｈ
ｏタンパク質またはＲｈｏキナーゼの機能を阻害する
と、細胞のストレスファイバー形成およびフォーカル接
着形成も阻害されることがわかっているからである（Am
ano,M. et al., Science 275, 1308-1311 (1997) ）。
ｍＤｉａは活性型Ｒｈｏタンパク質と結合するので（実
施例１および５）、大量発現したｍＤｉａは、Ｒｈｏキ
ナーゼおよび／またはＲＯＣＫと活性化型Ｒｈｏタンパ
ク質との結合に関して競合するという可能性が考えられ
る。
はＲＯＣＫは、細胞のストレスファイバー形成およびフ
ォーカル接着形成を促進することにより（Lim, L. et a
l.,Mol. Cell. Biol., 16: 5313-5327 (1996); Amano,
M. et al., Science 275, 1308-1311 (1997) ）、細胞
を収縮させると考えられる。本発明者等は後記する実施
例９において、細胞内にｍＤｉａを大量発現させると、
活性型Ｒｈｏタンパク質によるストレスファイバー形成
が抑制されることを見出した。従って、大量発現された
ｍＤｉａは、活性型Ｒｈｏタンパク質からＲｈｏキナー
ゼおよび／またはＲＯＣＫを介してストレスファイバー
形成およびフォーカル接着形成に至るシグナル伝達経路
のどこかを阻害していると思われる。なぜならば、Ｒｈ
ｏタンパク質またはＲｈｏキナーゼの機能を阻害する
と、細胞のストレスファイバー形成およびフォーカル接
着形成も阻害されることがわかっているからである（Am
ano,M. et al., Science 275, 1308-1311 (1997) ）。
ｍＤｉａは活性型Ｒｈｏタンパク質と結合するので（実
施例１および５）、大量発現したｍＤｉａは、Ｒｈｏキ
ナーゼおよび／またはＲＯＣＫと活性化型Ｒｈｏタンパ
ク質との結合に関して競合するという可能性が考えられ
る。
【００４９】逆に、もしヒトでｍＤｉａ遺伝子が変異
（欠失、再構成またはアミノ酸置換等）するかその遺伝
子発現の程度が低下すると、そのストレスファイバー形
成抑制作用が低下または消失する。従って、気道平滑筋
のストレスファイバー形成が促進され、収縮の感受性が
亢進すると考えられる。以上を総合すると、気道過敏症
患者では、ｍＤｉａ遺伝子が変異（欠失、再構成または
アミノ酸置換等）するかあるいはその遺伝子発現の程度
が低下していると考えられる。従って、後記する本発明
の塩基配列およびプローブは、気道過敏症または気管支
喘息の診断に有用である。
（欠失、再構成またはアミノ酸置換等）するかその遺伝
子発現の程度が低下すると、そのストレスファイバー形
成抑制作用が低下または消失する。従って、気道平滑筋
のストレスファイバー形成が促進され、収縮の感受性が
亢進すると考えられる。以上を総合すると、気道過敏症
患者では、ｍＤｉａ遺伝子が変異（欠失、再構成または
アミノ酸置換等）するかあるいはその遺伝子発現の程度
が低下していると考えられる。従って、後記する本発明
の塩基配列およびプローブは、気道過敏症または気管支
喘息の診断に有用である。
【００５０】〔２〕急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ） 第５染色体の長腕の欠失（del(5q) ）または第５染色体
全体の欠失（5q−）は、悪性の骨髄系疾患、例えば急性
骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤ
Ｓ）の特徴としてよく認知された事実である。このよう
な変異は特に化学療法剤による治療歴のある白血病にお
いて頻度が高く（５０％以上）おきる。第５番染色体の
変異が認められる症例の予後は極めて悪い。
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ） 第５染色体の長腕の欠失（del(5q) ）または第５染色体
全体の欠失（5q−）は、悪性の骨髄系疾患、例えば急性
骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤ
Ｓ）の特徴としてよく認知された事実である。このよう
な変異は特に化学療法剤による治療歴のある白血病にお
いて頻度が高く（５０％以上）おきる。第５番染色体の
変異が認められる症例の予後は極めて悪い。
【００５１】最近、ＡＭＬおよびＭＤＳ患者の第５番染
色体の欠失の最小領域が決定された。Horrigan, S.K. e
t al., Blood 88: 2665-2670(1996)によると、ほとんど
のＡＭＬおよびＭＤＳ患者では、遺伝的マーカーＤ５Ｓ
８０６からＤ５Ｓ８０５に至る領域に存在する１１種類
のマーカー（Ｄ５Ｓ８１６、Ｄ５Ｓ３９３、ＩＬ９、Ｄ
５Ｓ３９９、Ｄ５Ｓ４７９、ＡＦＭ３５０ＹＢ１、Ｄ５
Ｓ１３７２、Ｄ５Ｓ４７６、Ｄ５Ｓ４１４、Ｄ５Ｓ５０
０、Ｄ５Ｓ６５８）の欠失が認められた。
色体の欠失の最小領域が決定された。Horrigan, S.K. e
t al., Blood 88: 2665-2670(1996)によると、ほとんど
のＡＭＬおよびＭＤＳ患者では、遺伝的マーカーＤ５Ｓ
８０６からＤ５Ｓ８０５に至る領域に存在する１１種類
のマーカー（Ｄ５Ｓ８１６、Ｄ５Ｓ３９３、ＩＬ９、Ｄ
５Ｓ３９９、Ｄ５Ｓ４７９、ＡＦＭ３５０ＹＢ１、Ｄ５
Ｓ１３７２、Ｄ５Ｓ４７６、Ｄ５Ｓ４１４、Ｄ５Ｓ５０
０、Ｄ５Ｓ６５８）の欠失が認められた。
【００５２】一方、本発明者等は、ヒトｍＤｉａ遺伝子
を５番染色体長腕のマーカーＮＩＢ１９４８とＷＩ−６
３８４の間でＮＩＢ１９４８より２．０２ｃＲテロメア
側にマップした。その結果、ヒトｍＤｉａ遺伝子はＤ５
Ｓ６５８のごく近傍に存在することが明らかとなった。
このことは、ＡＭＬおよびＭＤＳの細胞で、ヒトｍＤｉ
ａ遺伝子の欠失が高率で検出されることを意味する。従
って、後記する本発明の塩基配列およびプローブは、Ａ
ＭＬおよびＭＤＳにおける５番染色体の欠失を検出する
のに有用である。
を５番染色体長腕のマーカーＮＩＢ１９４８とＷＩ−６
３８４の間でＮＩＢ１９４８より２．０２ｃＲテロメア
側にマップした。その結果、ヒトｍＤｉａ遺伝子はＤ５
Ｓ６５８のごく近傍に存在することが明らかとなった。
このことは、ＡＭＬおよびＭＤＳの細胞で、ヒトｍＤｉ
ａ遺伝子の欠失が高率で検出されることを意味する。従
って、後記する本発明の塩基配列およびプローブは、Ａ
ＭＬおよびＭＤＳにおける５番染色体の欠失を検出する
のに有用である。
【００５３】塩基配列 本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする
塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、
配列番号４のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。
塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、
配列番号４のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。
【００５４】配列番号４のＤＮＡ配列において２８〜３
９７２番の配列がヒトｍＤｉａのオープンリーディング
フレームに相当する。
９７２番の配列がヒトｍＤｉａのオープンリーディング
フレームに相当する。
【００５５】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が
与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする
種々の塩基配列を選択することができる。従って、本発
明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番
号４に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一
のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係に
あるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味する
ものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれ
る。
与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする
種々の塩基配列を選択することができる。従って、本発
明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番
号４に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一
のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係に
あるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味する
ものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれ
る。
【００５６】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。本発明による塩基配列は、染色体ライブラ
リーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野
で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報
を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスク
リーニングを行う方法、等によって得ることができる。
染色体ライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、市
販のものまたは Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Li
braty Construction (Stein, C. およびHolland, P. 編
集） Essential Developmental Biology: A Practical
Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford に記載され
たものを使用できる。スクリーニングは、図３の太い下
線（クローン５０）に対応するオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いることによって実施できる。
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。本発明による塩基配列は、染色体ライブラ
リーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野
で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報
を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスク
リーニングを行う方法、等によって得ることができる。
染色体ライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーは、市
販のものまたは Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Li
braty Construction (Stein, C. およびHolland, P. 編
集） Essential Developmental Biology: A Practical
Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford に記載され
たものを使用できる。スクリーニングは、図３の太い下
線（クローン５０）に対応するオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いることによって実施できる。
【００５７】これ以外にも、染色体ライブラリーまたは
ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を鋳型とし、適当なプ
ライマーを用いて特定領域を増幅することによって本発
明による塩基配列を得ることもできる。
ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を鋳型とし、適当なプ
ライマーを用いて特定領域を増幅することによって本発
明による塩基配列を得ることもできる。
【００５８】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列の例は、配列番号４の塩基配列および配列番号４の
ＤＮＡ配列の一部（例えば、配列番号４の２８〜３９７
２番（オープンリーディングフレームに相当）、３７０
〜９６３番（Ｒｈｏタンパク質結合領域に相当）、およ
び１９０３〜２４１８番（プロフィリン結合領域に相
当）のＤＮＡ配列）である。
配列の例は、配列番号４の塩基配列および配列番号４の
ＤＮＡ配列の一部（例えば、配列番号４の２８〜３９７
２番（オープンリーディングフレームに相当）、３７０
〜９６３番（Ｒｈｏタンパク質結合領域に相当）、およ
び１９０３〜２４１８番（プロフィリン結合領域に相
当）のＤＮＡ配列）である。
【００５９】ベクターおよび宿主細胞 本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジン、ｍｙ
ｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジン、ｍｙ
ｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。
【００６０】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、バキュロウイルス
ベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニッ
クリポソームベクター）等が挙げられる。
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、バキュロウイルス
ベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニッ
クリポソームベクター）等が挙げられる。
【００６１】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるために
は、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列（例えば、プロモーター配列、ターミネータ
ー配列、エンハンサー配列）や宿主細胞を選択するため
の遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、
カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。ま
た、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した
形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これら
は常法に従いベクターに存在させてよく、このベクター
による宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用さ
れているものを用いることができる。
主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるために
は、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列（例えば、プロモーター配列、ターミネータ
ー配列、エンハンサー配列）や宿主細胞を選択するため
の遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、
カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。ま
た、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した
形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これら
は常法に従いベクターに存在させてよく、このベクター
による宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用さ
れているものを用いることができる。
【００６２】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。
【００６３】また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。
【００６４】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパ
ク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様に
よれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供され
る。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、
使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよ
い。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回
収、精製も常法に従って行うことができる。
で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパ
ク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様に
よれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供され
る。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、
使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよ
い。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回
収、精製も常法に従って行うことができる。
【００６５】プローブ 本発明によれば、（ａ）配列番号４の配列中、連続した
少なくとも１５塩基のＤＮＡ配列を含む塩基配列、およ
びそれに相補的な配列、並びに（ｂ）（ａ）の塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列から選択される、塩基配列が提供される。
少なくとも１５塩基のＤＮＡ配列を含む塩基配列、およ
びそれに相補的な配列、並びに（ｂ）（ａ）の塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列から選択される、塩基配列が提供される。
【００６６】上記配列としては、例えば、配列番号４の
２１９４〜５８２２番（クローン１４０−１０）、８６
６〜２２５３番（クローン１４０−１２）、１〜１９０
７番（但し、１６７９番のＡがＣに置換している）（ク
ローン１４０−１２−１７）、１２７４〜１２９３番、
８６６〜１２９３番（実施例１０）、１２２６〜１２４
４番（実施例１１（２））、および１３２７〜１３４７
番の塩基配列、およびこれに相補的な配列が挙げられ
る。
２１９４〜５８２２番（クローン１４０−１０）、８６
６〜２２５３番（クローン１４０−１２）、１〜１９０
７番（但し、１６７９番のＡがＣに置換している）（ク
ローン１４０−１２−１７）、１２７４〜１２９３番、
８６６〜１２９３番（実施例１０）、１２２６〜１２４
４番（実施例１１（２））、および１３２７〜１３４７
番の塩基配列、およびこれに相補的な配列が挙げられ
る。
【００６７】配列番号５の塩基配列は配列番号４の塩基
配列の相補鎖である。従って、上記塩基配列の相補鎖と
しては、それぞれ、配列番号５の１〜３６２９番、３５
７０〜４９５７番、３９１６〜５８２２番（但し、４１
４４番のＣがＡに置換している）、４５３０〜４５４９
番（実施例１０）、４５３０〜４９５７番、４５７９〜
４５９７番、および４４７６〜４４９６番（実施例１１
（２））の塩基配列が挙げられる。
配列の相補鎖である。従って、上記塩基配列の相補鎖と
しては、それぞれ、配列番号５の１〜３６２９番、３５
７０〜４９５７番、３９１６〜５８２２番（但し、４１
４４番のＣがＡに置換している）、４５３０〜４５４９
番（実施例１０）、４５３０〜４９５７番、４５７９〜
４５９７番、および４４７６〜４４９６番（実施例１１
（２））の塩基配列が挙げられる。
【００６８】本発明によれば、また、（ａ）配列番号６
の配列中、連続した少なくとも１５塩基のＤＮＡ配列を
含む塩基配列、およびそれに相補的な配列、並びに
（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする塩基配列から選択される、塩基配列
が提供される。
の配列中、連続した少なくとも１５塩基のＤＮＡ配列を
含む塩基配列、およびそれに相補的な配列、並びに
（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする塩基配列から選択される、塩基配列
が提供される。
【００６９】上記配列としては、例えば、配列番号６の
９５〜７２７番の塩基配列（イントロンに相当）、およ
びこれに相補的な配列が挙げられる。配列番号７の塩基
配列は配列番号６の塩基配列の相補鎖である。従って、
上記塩基配列の相補鎖としては、それぞれ、配列番号７
の２９〜６６１番の塩基配列が挙げられる。配列番号６
の配列はイントロンを含むヒトゲノム由来のＤＮＡ配列
である。イントロンは、配列番号４の塩基配列の１３１
９と１３２０番の塩基間に存在する。
９５〜７２７番の塩基配列（イントロンに相当）、およ
びこれに相補的な配列が挙げられる。配列番号７の塩基
配列は配列番号６の塩基配列の相補鎖である。従って、
上記塩基配列の相補鎖としては、それぞれ、配列番号７
の２９〜６６１番の塩基配列が挙げられる。配列番号６
の配列はイントロンを含むヒトゲノム由来のＤＮＡ配列
である。イントロンは、配列番号４の塩基配列の１３１
９と１３２０番の塩基間に存在する。
【００７０】本発明において、ハイブリダイゼーション
における「ストリンジェントな条件」とは、これらの配
列がプローブやプライマーとして用いられるようなサザ
ンハイブリダイゼーション法（実施例１０）、ＰＣＲ法
（実施例１０および実施例１１（２））、およびＦＩＳ
Ｈ法（実施例１１（１））のハイブリダイズの条件と定
義される。
における「ストリンジェントな条件」とは、これらの配
列がプローブやプライマーとして用いられるようなサザ
ンハイブリダイゼーション法（実施例１０）、ＰＣＲ法
（実施例１０および実施例１１（２））、およびＦＩＳ
Ｈ法（実施例１１（１））のハイブリダイズの条件と定
義される。
【００７１】本発明によれば、上記塩基配列と標識とを
含むプローブが提供される。検出可能な標識は当業者に
周知のものから選択できるが、例えば、相互作用する物
質（例えば、アビジンおよびビオチン）、酵素（例え
ば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）、
放射性同位元素（例えば、３２Ｐおよび３５Ｓ等）、蛍
光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、抗原（例え
ば、ジゴキシゲニン）等が挙げられる。
含むプローブが提供される。検出可能な標識は当業者に
周知のものから選択できるが、例えば、相互作用する物
質（例えば、アビジンおよびビオチン）、酵素（例え
ば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）、
放射性同位元素（例えば、３２Ｐおよび３５Ｓ等）、蛍
光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、抗原（例え
ば、ジゴキシゲニン）等が挙げられる。
【００７２】塩基配列の標識方法は、標識分子に依存し
て決定されてよく、例えば、ニックトランスレーショ
ン、化学的（または光化学的）架橋、オリゴヌクレオチ
ド化学合成、キレート化等によって行うことができる。
標識の検出方法は、標識分子に依存して決定されてよ
く、例えば、蛍光、酵素またはフェリチン−標識化抗
体、アビジン−ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダーゼ、金コ
ロイド等を用いて標識を検出することができる。
て決定されてよく、例えば、ニックトランスレーショ
ン、化学的（または光化学的）架橋、オリゴヌクレオチ
ド化学合成、キレート化等によって行うことができる。
標識の検出方法は、標識分子に依存して決定されてよ
く、例えば、蛍光、酵素またはフェリチン−標識化抗
体、アビジン−ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダーゼ、金コ
ロイド等を用いて標識を検出することができる。
【００７３】前記のように、ヒトｍＤｉａ遺伝子が、気
道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）お
よび骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と関連していることが
明らかにされた。従って、本発明による塩基配列および
プローブ（以下、単に「プローブ」ということがある）
を用いてこれらの病気を診断（例えば、出生前診断等の
前徴候診断を含む）することができる。
道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）お
よび骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と関連していることが
明らかにされた。従って、本発明による塩基配列および
プローブ（以下、単に「プローブ」ということがある）
を用いてこれらの病気を診断（例えば、出生前診断等の
前徴候診断を含む）することができる。
【００７４】本発明によれば、また、前記プローブを含
む診断薬が提供される。診断は、患者から遺伝子試料
（染色体またはゲノムＤＮＡ等）を取り出し、前記プロ
ーブと遺伝子試料とのハイブリダイゼーションの程度を
測定することによって行うことができる。このようなハ
イブリダイゼーションの程度を測定する方法としては、
ＦＩＳＨ法、サザンハイブリダイゼーション法、および
ＰＣＲ法が挙げられる。
む診断薬が提供される。診断は、患者から遺伝子試料
（染色体またはゲノムＤＮＡ等）を取り出し、前記プロ
ーブと遺伝子試料とのハイブリダイゼーションの程度を
測定することによって行うことができる。このようなハ
イブリダイゼーションの程度を測定する方法としては、
ＦＩＳＨ法、サザンハイブリダイゼーション法、および
ＰＣＲ法が挙げられる。
【００７５】（１）ＦＩＳＨ法 ＦＩＳＨ法を用いる場合には、ヒトより単離された細胞
（例えばリンパ球）の染色体を固定した標本と上記プロ
ーブをハイブリダイゼーションさせ、染色体のｍＤｉａ
遺伝子をマッピングする。正常人の細胞では、後記実施
例に記載されるように、ｍＤｉａ遺伝子は一対の５番染
色体の長腕のｑ３１．２部位（５ｑ３１．２）にのみマ
ップされる。
（例えばリンパ球）の染色体を固定した標本と上記プロ
ーブをハイブリダイゼーションさせ、染色体のｍＤｉａ
遺伝子をマッピングする。正常人の細胞では、後記実施
例に記載されるように、ｍＤｉａ遺伝子は一対の５番染
色体の長腕のｑ３１．２部位（５ｑ３１．２）にのみマ
ップされる。
【００７６】一方、気道過敏症、気管支喘息、急性骨髄
性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）
の患者の中には、ｍＤｉａ遺伝子のシグナルが検出され
ない患者（ｍＤｉａ遺伝子が欠失している）、ｍＤｉａ
遺伝子のシグナルが強く検出される患者（ｍＤｉａ遺伝
子が増幅している）あるいはｍＤｉａ遺伝子のシグナル
が５ｑ３１．２以外の部位に検出される患者（ｍＤｉａ
遺伝子が転座している）が見出される。このようなｍＤ
ｉａ遺伝子の変異（欠失、増幅または転座）は、上記の
いずれかの疾患に特徴的な変化である。従って、ＦＩＳ
Ｈ法によってハイブリダイゼーションの程度を測定する
こと、あるいは、ｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を検
出することによって、前記疾患の診断を行うことができ
る。
性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）
の患者の中には、ｍＤｉａ遺伝子のシグナルが検出され
ない患者（ｍＤｉａ遺伝子が欠失している）、ｍＤｉａ
遺伝子のシグナルが強く検出される患者（ｍＤｉａ遺伝
子が増幅している）あるいはｍＤｉａ遺伝子のシグナル
が５ｑ３１．２以外の部位に検出される患者（ｍＤｉａ
遺伝子が転座している）が見出される。このようなｍＤ
ｉａ遺伝子の変異（欠失、増幅または転座）は、上記の
いずれかの疾患に特徴的な変化である。従って、ＦＩＳ
Ｈ法によってハイブリダイゼーションの程度を測定する
こと、あるいは、ｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を検
出することによって、前記疾患の診断を行うことができ
る。
【００７７】ＦＩＳＨ法は、例えば実施例１１（１）に
記載したような条件下で行うことができる。実際には、
実験の目的、プローブやこれをハイブリダイズさせたい
ＤＮＡの種類等に応じて、この条件の範囲内で最適な条
件を選んでハイブリダイゼーションを行う。ＦＩＳＨ法
の条件は、Heng H.H.Q. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,89,9509-9513(1992); Heng H.H.Q. & Tsui L.C., In
situ hybridizationprotocols: Methods in Molecular
Biology. Choo K.H.A.(ed).Humana Press:New Jersey,
pp.109-122(1994) Choo, K. H. A., ed., Methods in M
olecular Biology: In situ hybridization protocole
s. (Choo, K. H. A., ed.). pp35-49 (1994) Humana Pr
ess, Clifton, NJ., USAおよび、Gerhard,D.S.et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 78,3755-3759(1981)を参照する
ことができる。
記載したような条件下で行うことができる。実際には、
実験の目的、プローブやこれをハイブリダイズさせたい
ＤＮＡの種類等に応じて、この条件の範囲内で最適な条
件を選んでハイブリダイゼーションを行う。ＦＩＳＨ法
の条件は、Heng H.H.Q. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,89,9509-9513(1992); Heng H.H.Q. & Tsui L.C., In
situ hybridizationprotocols: Methods in Molecular
Biology. Choo K.H.A.(ed).Humana Press:New Jersey,
pp.109-122(1994) Choo, K. H. A., ed., Methods in M
olecular Biology: In situ hybridization protocole
s. (Choo, K. H. A., ed.). pp35-49 (1994) Humana Pr
ess, Clifton, NJ., USAおよび、Gerhard,D.S.et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 78,3755-3759(1981)を参照する
ことができる。
【００７８】（２）サザンハイブリダイゼーション法 サザンハイブリダイゼーション（J. Sambrook et.al.,
Molecular Cloning 2nd ed. Ch.9 (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York ）を用いる場合に
は、ヒトより単離された細胞（例えばリンパ球）よりゲ
ノムＤＮＡを単離し、これを適当な制限酵素で消化した
後にゲル電気泳動を行って消化されたＤＮＡ断片を分離
する。その後、分離したＤＮＡ断片をフィルターにトラ
ンスファーし、フィルター上で上記プローブとハイブリ
ダイゼーションさせる。上記患者の中には、健常人に比
べてハイブリダイゼーションが認められないか、認めら
れてもその量が少ない患者（ｍＤｉａ遺伝子の一部また
は全部が欠失等されている）、健常人に比べてハイブリ
ダイゼーションの量が多く認められる患者（ｍＤｉａ遺
伝子が増幅している）あるいはプローブがハイブリダイ
ゼーションするＤＮＡ断片のサイズや数が健常人のそれ
と異なる患者等が見出される。
Molecular Cloning 2nd ed. Ch.9 (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York ）を用いる場合に
は、ヒトより単離された細胞（例えばリンパ球）よりゲ
ノムＤＮＡを単離し、これを適当な制限酵素で消化した
後にゲル電気泳動を行って消化されたＤＮＡ断片を分離
する。その後、分離したＤＮＡ断片をフィルターにトラ
ンスファーし、フィルター上で上記プローブとハイブリ
ダイゼーションさせる。上記患者の中には、健常人に比
べてハイブリダイゼーションが認められないか、認めら
れてもその量が少ない患者（ｍＤｉａ遺伝子の一部また
は全部が欠失等されている）、健常人に比べてハイブリ
ダイゼーションの量が多く認められる患者（ｍＤｉａ遺
伝子が増幅している）あるいはプローブがハイブリダイ
ゼーションするＤＮＡ断片のサイズや数が健常人のそれ
と異なる患者等が見出される。
【００７９】また、サザンハイブリダイゼーションをhu
man/rodent somatic cell hybrid panelとを組み合わせ
ることにより、患者のｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置
を検出することができる（Macera,M.J.et al.,Genomic
s, 13,829-831(1992)) 。それにより、患者でのｍＤｉ
ａ遺伝子の欠失や転座の有無を検出することができる。
（実施例１１（２）参照）。
man/rodent somatic cell hybrid panelとを組み合わせ
ることにより、患者のｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置
を検出することができる（Macera,M.J.et al.,Genomic
s, 13,829-831(1992)) 。それにより、患者でのｍＤｉ
ａ遺伝子の欠失や転座の有無を検出することができる。
（実施例１１（２）参照）。
【００８０】このようなｍＤｉａ遺伝子の変異（欠失、
増幅および転座等）は、上記のいずれかの疾患に特徴的
な変化である。従って、サザンハイブリダイゼーション
によってプローブとハイブリダイズするバンドのパター
ンを測定することによって、前記疾患を診断することが
できる。ＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合には、
２〜６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液）、６５℃〜７０℃の
条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うことがで
きる。
増幅および転座等）は、上記のいずれかの疾患に特徴的
な変化である。従って、サザンハイブリダイゼーション
によってプローブとハイブリダイズするバンドのパター
ンを測定することによって、前記疾患を診断することが
できる。ＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合には、
２〜６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液）、６５℃〜７０℃の
条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うことがで
きる。
【００８１】実際には、実験の目的、プローブやこれを
ハイブリダイズさせたいＤＮＡの種類等に応じて、最適
な条件を選んでハイブリダイゼーションを行う。ハイブ
リダイズの条件は高木康敬編著「遺伝子操作マニュア
ル」、講談社、東京、日本（１９８２年）を参照するこ
とができる。
ハイブリダイズさせたいＤＮＡの種類等に応じて、最適
な条件を選んでハイブリダイゼーションを行う。ハイブ
リダイズの条件は高木康敬編著「遺伝子操作マニュア
ル」、講談社、東京、日本（１９８２年）を参照するこ
とができる。
【００８２】（３）ＰＣＲ法 患者から遺伝子試料（染色体、ゲノムＤＮＡ、ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡ、またはｍＲＮＡ等）を取り出し、サザ
ンハイブリダイゼーションの代わりにＰＣＲ法（Saiki,
R. K. et. al., Science, 239, 487-491(1988) ）を用
いて、遺伝子断片の増幅の程度またはｍＲＮＡの発現の
程度を測定することによって診断を実施することもでき
る。ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法を含む）では一対のプラ
イマー（プライマー・ペア）を鋳型となるＤＮＡまたは
ＲＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼま
たは逆転写酵素を用いてＤＮＡ断片を増幅する。上記プ
ローブは対にしてＰＣＲ用のプライマーとして用いるこ
とができる。このようなプライマー・ペアを用いて、取
り出された患者の遺伝子試料を鋳型としてＰＣＲを行う
ことにより、ｍＤｉａ遺伝子またはｍＤｉａｍＲＮＡの
全部または一部を増幅する。増幅されたＤＮＡを電気泳
動または塩基配列分析等により解析することによって、
ｍＤｉａ遺伝子の変異（欠失、増幅、組換え、転座、塩
基置換等）またはｍＤｉａｍＲＮＡの発現の程度の検出
が可能である。
（Ａ）＋ＲＮＡ、またはｍＲＮＡ等）を取り出し、サザ
ンハイブリダイゼーションの代わりにＰＣＲ法（Saiki,
R. K. et. al., Science, 239, 487-491(1988) ）を用
いて、遺伝子断片の増幅の程度またはｍＲＮＡの発現の
程度を測定することによって診断を実施することもでき
る。ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法を含む）では一対のプラ
イマー（プライマー・ペア）を鋳型となるＤＮＡまたは
ＲＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼま
たは逆転写酵素を用いてＤＮＡ断片を増幅する。上記プ
ローブは対にしてＰＣＲ用のプライマーとして用いるこ
とができる。このようなプライマー・ペアを用いて、取
り出された患者の遺伝子試料を鋳型としてＰＣＲを行う
ことにより、ｍＤｉａ遺伝子またはｍＤｉａｍＲＮＡの
全部または一部を増幅する。増幅されたＤＮＡを電気泳
動または塩基配列分析等により解析することによって、
ｍＤｉａ遺伝子の変異（欠失、増幅、組換え、転座、塩
基置換等）またはｍＤｉａｍＲＮＡの発現の程度の検出
が可能である。
【００８３】例えば、ｍＤｉａ遺伝子が欠失している患
者の遺伝子試料をＰＣＲ法に適用した場合には特定領域
が増幅されない。従って、増幅断片の有無を調べること
によってｍＤｉａ遺伝子の欠失を検出できる。また、ｍ
Ｄｉａ遺伝子が増幅している患者の遺伝子試料をＰＣＲ
法に適用した場合には特定領域が健常人に比較して多く
増幅される。従って、増幅断片の量を調べることによっ
てｍＤｉａ遺伝子の増幅またはｍＤｉａｍＲＮＡの発現
の亢進を検出できる。
者の遺伝子試料をＰＣＲ法に適用した場合には特定領域
が増幅されない。従って、増幅断片の有無を調べること
によってｍＤｉａ遺伝子の欠失を検出できる。また、ｍ
Ｄｉａ遺伝子が増幅している患者の遺伝子試料をＰＣＲ
法に適用した場合には特定領域が健常人に比較して多く
増幅される。従って、増幅断片の量を調べることによっ
てｍＤｉａ遺伝子の増幅またはｍＤｉａｍＲＮＡの発現
の亢進を検出できる。
【００８４】ＰＣＲ法は、例えば、Takara LA taq kit
ver.2 を用いて、98℃10秒、55℃30秒、72℃3 分の反応
を30回行うような条件下で行うことができる。実際に
は、実験の目的、プローブやこれの鋳型として用いる遺
伝子試料の種類等に応じて、最適な条件を選んでＰＣＲ
を行う。ＰＣＲ法の条件はSaiki, R. K. et. al., Scie
nce, 239, 487-491(1988) を参照する事ができる。
ver.2 を用いて、98℃10秒、55℃30秒、72℃3 分の反応
を30回行うような条件下で行うことができる。実際に
は、実験の目的、プローブやこれの鋳型として用いる遺
伝子試料の種類等に応じて、最適な条件を選んでＰＣＲ
を行う。ＰＣＲ法の条件はSaiki, R. K. et. al., Scie
nce, 239, 487-491(1988) を参照する事ができる。
【００８５】ｍＤｉａ遺伝子の変異は、前記したように
気道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に特徴的である。従
って、上記診断薬はこれらの疾患の診断薬として用いる
ことができる。
気道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に特徴的である。従
って、上記診断薬はこれらの疾患の診断薬として用いる
ことができる。
【００８６】本発明によれば、前記プローブを、ほ乳類
の遺伝子試料とハイブリダイズさせ、そしてハイブリダ
イズの程度を測定することを含む、ｍＤｉａ遺伝子の変
異の検出方法が提供される。上記検出方法は、上記診断
薬の使用態様と同様にして実施することができる。
の遺伝子試料とハイブリダイズさせ、そしてハイブリダ
イズの程度を測定することを含む、ｍＤｉａ遺伝子の変
異の検出方法が提供される。上記検出方法は、上記診断
薬の使用態様と同様にして実施することができる。
【００８７】スクリーニング法 本発明によれば、（１）スクリーニングの対象を、活性
型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質とを含
むスクリーニング系に存在させ、そして（２）活性型Ｒ
ｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質との結合の
阻害の程度を測定することを含む、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質と、本発明によるタンパク質との結合を阻害する物
質のスクリーニング法が提供される。
型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質とを含
むスクリーニング系に存在させ、そして（２）活性型Ｒ
ｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質との結合の
阻害の程度を測定することを含む、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質と、本発明によるタンパク質との結合を阻害する物
質のスクリーニング法が提供される。
【００８８】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象を、プロフィリンと、本発明によるタンパク
質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）
プロフィリンと、本発明によるタンパク質との結合の阻
害の程度を測定することを含む、プロフィリンと、本発
明によるタンパク質との結合を阻害する物質のスクリー
ニング法が提供される。
ングの対象を、プロフィリンと、本発明によるタンパク
質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）
プロフィリンと、本発明によるタンパク質との結合の阻
害の程度を測定することを含む、プロフィリンと、本発
明によるタンパク質との結合を阻害する物質のスクリー
ニング法が提供される。
【００８９】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、本発明によるタンパク質に対する抗体に
よるイムノブロットを用いて測定する方法、ツー・ハイ
ブリッド・システム（two hybrid system ）（M.Kawaba
ta 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et al.
Cell 74,205-214(1993) ）による方法、オーバーレイ・
アッセイを用いて測定する方法（Ishizaki, T. et al.,
EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）、インビトロ翻訳さ
せたタンパク質を用いて測定する方法（Shibata, H. et
al., FEBS Lett. 385, 221-224 (1996)）、Amano, M.,
et al., Science 271, 648-650 (1996)に記載された無
細胞系での結合測定法等が挙げられ、例えば、実施例
１、５、および６に記載される方法に準じて結合の阻害
の程度を測定することができる。
方法としては、本発明によるタンパク質に対する抗体に
よるイムノブロットを用いて測定する方法、ツー・ハイ
ブリッド・システム（two hybrid system ）（M.Kawaba
ta 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et al.
Cell 74,205-214(1993) ）による方法、オーバーレイ・
アッセイを用いて測定する方法（Ishizaki, T. et al.,
EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）、インビトロ翻訳さ
せたタンパク質を用いて測定する方法（Shibata, H. et
al., FEBS Lett. 385, 221-224 (1996)）、Amano, M.,
et al., Science 271, 648-650 (1996)に記載された無
細胞系での結合測定法等が挙げられ、例えば、実施例
１、５、および６に記載される方法に準じて結合の阻害
の程度を測定することができる。
【００９０】本発明において、「結合を阻害する物質」
とは、当業者により結合の阻害が認められたと評価され
る物質をいい、例えば、実施例１、５、または６と同様
の条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質
またはプロフィリンとの結合が認められないと評価され
る場合を意味するものとする。
とは、当業者により結合の阻害が認められたと評価され
る物質をいい、例えば、実施例１、５、または６と同様
の条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質
またはプロフィリンとの結合が認められないと評価され
る場合を意味するものとする。
【００９１】本明細書において「結合の阻害の程度を測
定する」とは結合の有無の測定を含む意味で用いられる
ものとする。また、「スクリーニング」とは、アッセイ
を含む意味で用いられる。
定する」とは結合の有無の測定を含む意味で用いられる
ものとする。また、「スクリーニング」とは、アッセイ
を含む意味で用いられる。
【００９２】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リ
ンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、およ
び腫瘍細胞が挙げられる。
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リ
ンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、およ
び腫瘍細胞が挙げられる。
【００９３】スクリーニングの対象となるものは、特に
限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナロ
グ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。
限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナロ
グ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。
【００９４】
【実施例】実施例１ 酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いた
ＲｈｏＡ結合ペプチド断片のスクリーニング ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に融合したＮ１９−Ｒ
ｈｏＡ△Ｃ（Ｃ−末端のＡｌａ181 においてトランケー
トしたＲｈｏＡAsn19 ）をバイトとして使用して、酵母
のツー・ハイブリッド・システムにより、新規なＲｈｏ
結合タンパク質をスクリーニングした。酵母のツー・ハ
イブリッド・システムは、既に記載の方法（Vojtek, A.
et al., Cell 74, 205-214 (1993); Modaule, P. et a
l., FEBSLett., 377, 243-248 (1995) ; Watanabe, G.
et al., Science 271, 645-648(1996); Reid, T. et a
l., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1996)）に準
じて実施した。
ＲｈｏＡ結合ペプチド断片のスクリーニング ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に融合したＮ１９−Ｒ
ｈｏＡ△Ｃ（Ｃ−末端のＡｌａ181 においてトランケー
トしたＲｈｏＡAsn19 ）をバイトとして使用して、酵母
のツー・ハイブリッド・システムにより、新規なＲｈｏ
結合タンパク質をスクリーニングした。酵母のツー・ハ
イブリッド・システムは、既に記載の方法（Vojtek, A.
et al., Cell 74, 205-214 (1993); Modaule, P. et a
l., FEBSLett., 377, 243-248 (1995) ; Watanabe, G.
et al., Science 271, 645-648(1996); Reid, T. et a
l., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1996)）に準
じて実施した。
【００９５】ツー・ハイブリッド・システムに使用した
プラスミドｐＢＴＭ１１６およびｐＶＰ１６（Vojtek,
A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）は、Stan Holle
nberg 、Rolf Sternglanz 、Stan Fields およびPaul B
artel より入手した。ｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡを
コードするｃＤＮＡを含むｐＢＴＭ１１６）は、過去に
記載された方法（Watanabe, G. et al., Science, 271,
645-648 (1996) ）に従って調製した。ＲｈｏＡ上にＶ
ａｌ１４またはＡｓｎ１９変異を生じさせるために、Ｒ
ｈｏＡのＮ末端をコードするｐＧＥＸ−ＲｈｏＡのＢａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ（スト
ラタジーン社）中に挿入し、Kunkelの方法（Kunkel,
T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (198
5)）に従って変異誘発させた。次いでｐＧＥＸ−Ｒｈｏ
Ａ（Morii, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 27160-2
7163 (1993) ）の対応する野生型断片を各変異誘発断片
と置換し、ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ−
Ｎ１９ＲｈｏＡを作製した。
プラスミドｐＢＴＭ１１６およびｐＶＰ１６（Vojtek,
A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）は、Stan Holle
nberg 、Rolf Sternglanz 、Stan Fields およびPaul B
artel より入手した。ｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡを
コードするｃＤＮＡを含むｐＢＴＭ１１６）は、過去に
記載された方法（Watanabe, G. et al., Science, 271,
645-648 (1996) ）に従って調製した。ＲｈｏＡ上にＶ
ａｌ１４またはＡｓｎ１９変異を生じさせるために、Ｒ
ｈｏＡのＮ末端をコードするｐＧＥＸ−ＲｈｏＡのＢａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ（スト
ラタジーン社）中に挿入し、Kunkelの方法（Kunkel,
T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (198
5)）に従って変異誘発させた。次いでｐＧＥＸ−Ｒｈｏ
Ａ（Morii, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 27160-2
7163 (1993) ）の対応する野生型断片を各変異誘発断片
と置換し、ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ−
Ｎ１９ＲｈｏＡを作製した。
【００９６】ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ
−Ｎ１９ＲｈｏＡより変異体ＲｈｏＡの全長のコーディ
ング領域をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切
り出した後、ｐＢＴＭ１１６の中に挿入して、ｐＢＴＭ
−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡを得
た。これらの変異体のＡｌａ１８１におけるＣ−末端の
欠失変異体を挿入したｐＢＴＭ１１６（ｐＢＴＭ−Ｖ
１４ＲｈｏＡ△ＣおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△
Ｃ）は、過去に記載された方法（Reid, T. et al.,J. B
iol. Chem., (1996) ）に従って調製した。
−Ｎ１９ＲｈｏＡより変異体ＲｈｏＡの全長のコーディ
ング領域をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切
り出した後、ｐＢＴＭ１１６の中に挿入して、ｐＢＴＭ
−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡを得
た。これらの変異体のＡｌａ１８１におけるＣ−末端の
欠失変異体を挿入したｐＢＴＭ１１６（ｐＢＴＭ−Ｖ
１４ＲｈｏＡ△ＣおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△
Ｃ）は、過去に記載された方法（Reid, T. et al.,J. B
iol. Chem., (1996) ）に従って調製した。
【００９７】ｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△Ｃを有する酵
母Ｌ４０株（MATa trp1 leu2 his3LYS::lexA-HIS3 URA
3::lexA-lacZ）（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-21
4 (1993)）を、マウス胚ｃＤＮＡライブラリー（Kakizu
ka, A. et al. (1993), cDNALibrary Construction (St
ein, C.およびHolland, P. 編集）Essential Developme
ntal Biology : A Practical Approach, pp223-232, IR
L Press, Oxford）と融合したｐＶＰ１６（Vojtek, A.
et al., Cell 74, 205-214 (1993)）で形質転換した。
初期の形質転換体は２．２×１０7 であり、これはＨＩ
Ｓ（−）プレート上に播く前に６時間培養する間に７回
分裂したことを意味する。１．５×１０8 の形質転換体
の内、９７８クローンをＨｉｓ＋およびｌａｃＺ陽性と
して単離し、そして２２０クローンを分離してバイトプ
ラスミドを排除した。種々の被験バイトを有する酵母株
ＡＭＲ７０との交配により、他のタンパク質との相互作
用を評価した。２２０クローンの中で、５５クローンは
Ｎ１９−ＲｈｏＡ△Ｃで陽性のｌａｃＺ活性を示し、陰
性の対照として使用したラミンでは陰性を示した。この
手法により単離した５５クローンは、同一のサイズのｃ
ＤＮＡインサートを有し、それらのいくつかを配列決定
した結果、同一のヌクレオチド配列を有することが見出
された。
母Ｌ４０株（MATa trp1 leu2 his3LYS::lexA-HIS3 URA
3::lexA-lacZ）（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-21
4 (1993)）を、マウス胚ｃＤＮＡライブラリー（Kakizu
ka, A. et al. (1993), cDNALibrary Construction (St
ein, C.およびHolland, P. 編集）Essential Developme
ntal Biology : A Practical Approach, pp223-232, IR
L Press, Oxford）と融合したｐＶＰ１６（Vojtek, A.
et al., Cell 74, 205-214 (1993)）で形質転換した。
初期の形質転換体は２．２×１０7 であり、これはＨＩ
Ｓ（−）プレート上に播く前に６時間培養する間に７回
分裂したことを意味する。１．５×１０8 の形質転換体
の内、９７８クローンをＨｉｓ＋およびｌａｃＺ陽性と
して単離し、そして２２０クローンを分離してバイトプ
ラスミドを排除した。種々の被験バイトを有する酵母株
ＡＭＲ７０との交配により、他のタンパク質との相互作
用を評価した。２２０クローンの中で、５５クローンは
Ｎ１９−ＲｈｏＡ△Ｃで陽性のｌａｃＺ活性を示し、陰
性の対照として使用したラミンでは陰性を示した。この
手法により単離した５５クローンは、同一のサイズのｃ
ＤＮＡインサートを有し、それらのいくつかを配列決定
した結果、同一のヌクレオチド配列を有することが見出
された。
【００９８】これらのクローンを種々のＲｈｏＡ変異体
に融合したＬｅｘＡを有するＡＭＲ７０に交配した。そ
れらのすべてはＲｈｏＡVal14 と強く、ＲｈｏＡAsn19
と弱く、そして野生型ＲｈｏＡとはほとんど無視できる
ほどに弱く結合したが、それらはＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃ
または野生型ＲｈｏＡ△Ｃと強く結合した。同様の結果
が、下記の実験によっても確認された。
に融合したＬｅｘＡを有するＡＭＲ７０に交配した。そ
れらのすべてはＲｈｏＡVal14 と強く、ＲｈｏＡAsn19
と弱く、そして野生型ＲｈｏＡとはほとんど無視できる
ほどに弱く結合したが、それらはＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃ
または野生型ＲｈｏＡ△Ｃと強く結合した。同様の結果
が、下記の実験によっても確認された。
【００９９】ツー・ハイブリッド・システムにおける相
互作用の特異性を試験するために、酵母のクローン５０
から回収されたｐＶＰ１６プラスミド（ｐＶＰ−ｃｌ．
５０）を種々のタンパク質のｃＤＮＡを有するｐＢＴＭ
１１６プラスミドとともにＬ４０株の中に共形質転換
し、相互作用をｌａｃＺアッセイにより試験した。実験
に用いたｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ△およびｐＢＴＭ−ラミン
（Watanabe, G. et al.,Science 271, 645-648 (199
6)）、ｐＢＴＭ−ＲａｃおよびｐＢＴＭ−Ｃｄｃ４２Ｈ
（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-1356
0 (1996)）の調製については、過去に記載されている。
互作用の特異性を試験するために、酵母のクローン５０
から回収されたｐＶＰ１６プラスミド（ｐＶＰ−ｃｌ．
５０）を種々のタンパク質のｃＤＮＡを有するｐＢＴＭ
１１６プラスミドとともにＬ４０株の中に共形質転換
し、相互作用をｌａｃＺアッセイにより試験した。実験
に用いたｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ△およびｐＢＴＭ−ラミン
（Watanabe, G. et al.,Science 271, 645-648 (199
6)）、ｐＢＴＭ−ＲａｃおよびｐＢＴＭ−Ｃｄｃ４２Ｈ
（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-1356
0 (1996)）の調製については、過去に記載されている。
【０１００】その結果、結合の特異性は、代表的なクロ
ーン（クローン５０）から回収されたプラスミド、およ
び種々のＬｅｘＡ−変異体ＲｈｏＡ融合構築物とでＬ４
０株を共形質転換させることによって確認された（図
１）。すなわち、クローン５０）から回収されたプラス
ミドとＬｅｘＡーＲａｃ融合構築物またはＬｅｘＡーＣ
ｄｃ４２Ｈ融合構築物とでＬ４０株を共形質転換させた
ところ、このクローンによりコードされるペプチドはＲ
ａｃおよびＣｄｃ４２Ｈいずれにも特異的に結合しない
ことがわかった。これらの結果は、このクローンにより
コードされるペプチドがＲｈｏＡに特異的に結合するこ
とを示している。
ーン（クローン５０）から回収されたプラスミド、およ
び種々のＬｅｘＡ−変異体ＲｈｏＡ融合構築物とでＬ４
０株を共形質転換させることによって確認された（図
１）。すなわち、クローン５０）から回収されたプラス
ミドとＬｅｘＡーＲａｃ融合構築物またはＬｅｘＡーＣ
ｄｃ４２Ｈ融合構築物とでＬ４０株を共形質転換させた
ところ、このクローンによりコードされるペプチドはＲ
ａｃおよびＣｄｃ４２Ｈいずれにも特異的に結合しない
ことがわかった。これらの結果は、このクローンにより
コードされるペプチドがＲｈｏＡに特異的に結合するこ
とを示している。
【０１０１】実施例２ マウスｍＤｉａの全長のｃＤＮ
Ａのクローニング 全長のコーディング配列を得るために、本発明者はプロ
ーブとしてクローン５０より得られた０．６Ｋｂｐのｃ
ＤＮＡインサート（ｐＶＰ−ｃｌ．５０の32Ｐ標識化
０．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサート）を使用して、２つ
のマウス脳ライブラリー（λＺＡＰ ＩＩ中に作製した
９３６３０９ライブラリー（ストラタジーン社）および
λｇｔ−１０中に作製したＭＬ３０００ａライブラリー
（クロンテック社））をスクリーニングし、次いでこの
スクリーニングから得られた２つのｃＤＮＡ断片をプロ
ーブとして使用してマウス胚ライブラリー（Kakizuka,
A. et al. (1993), cDNA Library Construction (Stei
n, C.およびHolland, P. 編集）Essential Development
al Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRLP
ress, Oxford）をスクリーニングした。
Ａのクローニング 全長のコーディング配列を得るために、本発明者はプロ
ーブとしてクローン５０より得られた０．６Ｋｂｐのｃ
ＤＮＡインサート（ｐＶＰ−ｃｌ．５０の32Ｐ標識化
０．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサート）を使用して、２つ
のマウス脳ライブラリー（λＺＡＰ ＩＩ中に作製した
９３６３０９ライブラリー（ストラタジーン社）および
λｇｔ−１０中に作製したＭＬ３０００ａライブラリー
（クロンテック社））をスクリーニングし、次いでこの
スクリーニングから得られた２つのｃＤＮＡ断片をプロ
ーブとして使用してマウス胚ライブラリー（Kakizuka,
A. et al. (1993), cDNA Library Construction (Stei
n, C.およびHolland, P. 編集）Essential Development
al Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRLP
ress, Oxford）をスクリーニングした。
【０１０２】この手法により、６つのオーバーラップす
るクローンが単離された（図２）。１つの陽性のクロー
ン（クローン５０２）、および２つの陽性のクローン
（クローン５０３および５０４）が、それぞれ、前者お
よび後者のライブラリーから得られた。５０４の５’部
分および５０３の３’部分をプローブとして、クローン
Ｅ５１、Ｅ５２、およびＥ７３がマウス胚ライブラリー
から単離された。
るクローンが単離された（図２）。１つの陽性のクロー
ン（クローン５０２）、および２つの陽性のクローン
（クローン５０３および５０４）が、それぞれ、前者お
よび後者のライブラリーから得られた。５０４の５’部
分および５０３の３’部分をプローブとして、クローン
Ｅ５１、Ｅ５２、およびＥ７３がマウス胚ライブラリー
から単離された。
【０１０３】これらのクローンのヌクレオチド配列をジ
デオキシ・チェーン・ターミネーション法により決定し
たところ、計算上１３９，３３６Ｄａの分子量をもつ
１，２５５アミノ酸のタンパク質をコードする３，７６
５ｂｐのオープンリーディングフレームを含むこれらの
クローンから、完全なｃＤＮＡ配列が決定された（図
３）。クローン５０から得られた初期のｃＤＮＡは、Ｎ
末端部分のＲｈｏ結合ドメインを含む１９８アミノ酸配
列（アミノ酸６３−２６０）をコードする。分子中央の
アミノ酸５７１−７３７の間には、ＩＰＰＰＰＰＬＰＧ
（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｖ）の１４回繰り返し構造、即ち相同配
列により特徴づけられるプロリンに富んだ領域が存在す
る。推定アミノ酸配列とデータベース上の他の配列とを
比較すると、いくつかの相同タンパク質が同定され、そ
れらのすべてはプロリンに富んだ領域を共有する（図
４）。これらのタンパク質は、２つの相同領域、すなわ
ち、プロリンに富んだＦＨ−１領域およびＦＨ−２領域
を有するフォルミン様分子のファミリーに属する。ＦＨ
−２領域は、また、推定配列中のアミノ酸９４５−１０
１０の間にも見出された。この配列に対して最も相同性
が高いタンパク質はショウジョウバエ（Drosophila）の
ディアファノス（diaphanous: 細胞質分裂に必要とされ
ることで特徴づけられたタンパク質）であり、これは同
定されたタンパク質に対してＮ−末端のプロリンに富む
領域において約３０％の同一性およびその領域のＣ−末
端の領域において約３９％の同一性を示した。それは、
また、それぞれの推定Ｒｈｏ結合ドメインおよびＦＨ−
２領域において、同定されたタンパク質に対して約３２
％および５７％のホモロジーを示した。これらの結果に
基づいて、本発明者が同定したタンパク質はショウジョ
ウバエのディアファノスタンパク質の哺乳類のホモロー
グであると結論し、このタンパク質をｍＤｉａ（哺乳類
のディアファノス（ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｉａｐｈａ
ｎｏｕｓ））と命名した（以降「ｍＤｉａ」と呼ぶ）。
デオキシ・チェーン・ターミネーション法により決定し
たところ、計算上１３９，３３６Ｄａの分子量をもつ
１，２５５アミノ酸のタンパク質をコードする３，７６
５ｂｐのオープンリーディングフレームを含むこれらの
クローンから、完全なｃＤＮＡ配列が決定された（図
３）。クローン５０から得られた初期のｃＤＮＡは、Ｎ
末端部分のＲｈｏ結合ドメインを含む１９８アミノ酸配
列（アミノ酸６３−２６０）をコードする。分子中央の
アミノ酸５７１−７３７の間には、ＩＰＰＰＰＰＬＰＧ
（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｖ）の１４回繰り返し構造、即ち相同配
列により特徴づけられるプロリンに富んだ領域が存在す
る。推定アミノ酸配列とデータベース上の他の配列とを
比較すると、いくつかの相同タンパク質が同定され、そ
れらのすべてはプロリンに富んだ領域を共有する（図
４）。これらのタンパク質は、２つの相同領域、すなわ
ち、プロリンに富んだＦＨ−１領域およびＦＨ−２領域
を有するフォルミン様分子のファミリーに属する。ＦＨ
−２領域は、また、推定配列中のアミノ酸９４５−１０
１０の間にも見出された。この配列に対して最も相同性
が高いタンパク質はショウジョウバエ（Drosophila）の
ディアファノス（diaphanous: 細胞質分裂に必要とされ
ることで特徴づけられたタンパク質）であり、これは同
定されたタンパク質に対してＮ−末端のプロリンに富む
領域において約３０％の同一性およびその領域のＣ−末
端の領域において約３９％の同一性を示した。それは、
また、それぞれの推定Ｒｈｏ結合ドメインおよびＦＨ−
２領域において、同定されたタンパク質に対して約３２
％および５７％のホモロジーを示した。これらの結果に
基づいて、本発明者が同定したタンパク質はショウジョ
ウバエのディアファノスタンパク質の哺乳類のホモロー
グであると結論し、このタンパク質をｍＤｉａ（哺乳類
のディアファノス（ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｉａｐｈａ
ｎｏｕｓ））と命名した（以降「ｍＤｉａ」と呼ぶ）。
【０１０４】ｍＤｉａは、また、酵母（Saccharomyces
cerevisiae）細胞の出芽に関与するＢｎｉ１ｐの全体領
域に対して有意なホモロジーを示した。他方、ｍＤｉａ
はフォルミンおよびショウジョウバエのカプシノ（ cap
uccino）に対してＣ末端側の半分の領域においてホモロ
ジーを示した。ｍＤｉａのＲｈｏ結合ドメインはＮ末端
側の部分にマップされた（前述）が、Ｒｈｏ結合ドメイ
ンに類似する配列はフォルミンやカプシノには見い出さ
れなかった。このことより、これらのタンパク質（Ｒｈ
ｏ結合ドメインを含まないフォルミンおよびカプシノ）
は細胞内で同定されたタンパク質と同様な機能を発揮す
るが、ｍＤｉａ、ディアファノスおよびＢｎｉｌｐのみ
がＲｈｏ依存的な様式で機能を発揮することが示唆され
た。
cerevisiae）細胞の出芽に関与するＢｎｉ１ｐの全体領
域に対して有意なホモロジーを示した。他方、ｍＤｉａ
はフォルミンおよびショウジョウバエのカプシノ（ cap
uccino）に対してＣ末端側の半分の領域においてホモロ
ジーを示した。ｍＤｉａのＲｈｏ結合ドメインはＮ末端
側の部分にマップされた（前述）が、Ｒｈｏ結合ドメイ
ンに類似する配列はフォルミンやカプシノには見い出さ
れなかった。このことより、これらのタンパク質（Ｒｈ
ｏ結合ドメインを含まないフォルミンおよびカプシノ）
は細胞内で同定されたタンパク質と同様な機能を発揮す
るが、ｍＤｉａ、ディアファノスおよびＢｎｉｌｐのみ
がＲｈｏ依存的な様式で機能を発揮することが示唆され
た。
【０１０５】実施例３ ｍＤｉａを発現する組織の検索 ｍＤｉａを発現する組織を検索するため、ノザンブロッ
ト解析を実施した。成熟マウスのいくつかの組織からオ
リゴ−ｄＴラテックスビーズ（ファルマシア・バイオテ
ック社）を使用して標準的手法（Sambrook, J. et al.
(1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2n
d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor）に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製
した。６μｇの各ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを２．１％ホルム
アルデヒドを含有する１．０％アガロースゲル上で分離
し、そしてＢｉｏｄｙｎｅ Ａ フィルター（Pall Bio
Suport社）に移した。次いでフィルターを32Ｐ標識化ｃ
ｌ．５０の０．６ＫｂｐのｃＤＮＡ断片とハイブリダイ
ゼーションさせた。最後に、フィルターを０．４×ＳＳ
Ｃおよび０．１％ＳＤＳで６５℃において洗浄し、オー
トラジオグラフィーにかけた。
ト解析を実施した。成熟マウスのいくつかの組織からオ
リゴ−ｄＴラテックスビーズ（ファルマシア・バイオテ
ック社）を使用して標準的手法（Sambrook, J. et al.
(1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2n
d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor）に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製
した。６μｇの各ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを２．１％ホルム
アルデヒドを含有する１．０％アガロースゲル上で分離
し、そしてＢｉｏｄｙｎｅ Ａ フィルター（Pall Bio
Suport社）に移した。次いでフィルターを32Ｐ標識化ｃ
ｌ．５０の０．６ＫｂｐのｃＤＮＡ断片とハイブリダイ
ゼーションさせた。最後に、フィルターを０．４×ＳＳ
Ｃおよび０．１％ＳＤＳで６５℃において洗浄し、オー
トラジオグラフィーにかけた。
【０１０６】その結果、主要な６．３ｋｂの転写物が、
試験したすべての組織において普遍的に（ubiquitousl
y）検出されたが、肺、睾丸、胸腺、肝臓および胃にお
いては特に強い発現が検出された。また、睾丸および肺
において、５ｋｂのもうひとつの別の転写物が見出され
た（図５）。
試験したすべての組織において普遍的に（ubiquitousl
y）検出されたが、肺、睾丸、胸腺、肝臓および胃にお
いては特に強い発現が検出された。また、睾丸および肺
において、５ｋｂのもうひとつの別の転写物が見出され
た（図５）。
【０１０７】実施例４ 抗ｍＤｉａ抗体の調製 細胞におけるｍＤｉａの局在化および他のタンパク質と
の結合を検討するために、クローン５０のｃＤＮＡによ
りコードされるペプチド（配列番号１の６３〜２６０番
のアミノ酸配列を含む）をＨｉｓ標識化タンパク質とし
て発現させ、このペプチドに対する抗体を調製すること
により、ｍＤｉａに対する特異的な抗体を得た。具体的
には下記の方法に従って、実験を実施した。
の結合を検討するために、クローン５０のｃＤＮＡによ
りコードされるペプチド（配列番号１の６３〜２６０番
のアミノ酸配列を含む）をＨｉｓ標識化タンパク質とし
て発現させ、このペプチドに対する抗体を調製すること
により、ｍＤｉａに対する特異的な抗体を得た。具体的
には下記の方法に従って、実験を実施した。
【０１０８】ｐＶＰ−ｃｌ．５０のｃＤＮＡインサート
に近接するＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を使用し
て、ｃｌ．５０ｃＤＮＡをｐＱＥ１１（ＱＩＡＧＥＮ
社）およびｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア社）ベクター
の中に結合した。Ｈｉｓ６標識化ｃｌ．５０を大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株において発現させ、そし
てこれをＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社）で製造業
者のプロトコールに従い精製した。精製されたタンパク
質をフロインドアジュバントと混合し、ウサギに注射し
た。Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13
560 (1992)に記載されている方法に従って、ニトロセル
ロース膜上に固定化されたＧＳＴ−ｃｌ．５０融合タン
パク質を用いて抗体をアフィニティー精製した。具体的
には、ＧＳＴ−ｃｌ．５０を含有する封入体（inclusio
n body）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、レムリ
（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー中で可溶化し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。
ＧＳＴ−ｃｌ．５０のバンドをストリップとして切り出
し、このストリップに吸収された抗体を４℃において１
００ｍＭ グリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．
３）、１００ｍＭ モノエタノールアミンバッファー
（ｐＨ１１．５）、および１０％の１，４−ジオキサン
を含有する１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．
５）で連続的に溶出した。溶出液を直ちに０．２５倍容
量の２５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーで中和し
た（第１および第３の溶出液についてｐＨ８．８、そし
て第２溶出液についてｐＨ７．０）。これらの溶出液を
一緒にし、アフィニティー精製した抗体ＡＰ５０として
使用した。対照の免疫蛍光試験のために、ＡＰ５０のア
リコートを連続的に５片のＧＳＴ−ｃｌ．５０ブロット
膜とインキュベートすることによって、抗体を除去した
ＡＰ５０溶液を調製した。
に近接するＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を使用し
て、ｃｌ．５０ｃＤＮＡをｐＱＥ１１（ＱＩＡＧＥＮ
社）およびｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア社）ベクター
の中に結合した。Ｈｉｓ６標識化ｃｌ．５０を大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株において発現させ、そし
てこれをＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社）で製造業
者のプロトコールに従い精製した。精製されたタンパク
質をフロインドアジュバントと混合し、ウサギに注射し
た。Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13
560 (1992)に記載されている方法に従って、ニトロセル
ロース膜上に固定化されたＧＳＴ−ｃｌ．５０融合タン
パク質を用いて抗体をアフィニティー精製した。具体的
には、ＧＳＴ−ｃｌ．５０を含有する封入体（inclusio
n body）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、レムリ
（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー中で可溶化し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。
ＧＳＴ−ｃｌ．５０のバンドをストリップとして切り出
し、このストリップに吸収された抗体を４℃において１
００ｍＭ グリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．
３）、１００ｍＭ モノエタノールアミンバッファー
（ｐＨ１１．５）、および１０％の１，４−ジオキサン
を含有する１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．
５）で連続的に溶出した。溶出液を直ちに０．２５倍容
量の２５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーで中和し
た（第１および第３の溶出液についてｐＨ８．８、そし
て第２溶出液についてｐＨ７．０）。これらの溶出液を
一緒にし、アフィニティー精製した抗体ＡＰ５０として
使用した。対照の免疫蛍光試験のために、ＡＰ５０のア
リコートを連続的に５片のＧＳＴ−ｃｌ．５０ブロット
膜とインキュベートすることによって、抗体を除去した
ＡＰ５０溶液を調製した。
【０１０９】得られたポリクローナル抗体ＡＰ５０の特
異性は、期待される分子量である５０ｋＤａのタンパク
質、およびＩＰＴＧ誘導後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラ
イゼート中に見出されるその分解産物との反応性により
確認された（図６、レーン１および２）。ＡＰ５０抗体
はＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおいて約１６０
ｋＤａの単一のタンパク質を検出し、このタンパク質は
明らかに内在性のｍＤｉａを示している（レーン３およ
び４）。
異性は、期待される分子量である５０ｋＤａのタンパク
質、およびＩＰＴＧ誘導後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラ
イゼート中に見出されるその分解産物との反応性により
確認された（図６、レーン１および２）。ＡＰ５０抗体
はＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおいて約１６０
ｋＤａの単一のタンパク質を検出し、このタンパク質は
明らかに内在性のｍＤｉａを示している（レーン３およ
び４）。
【０１１０】実施例５ インビトロにおけるＲｈｏタン
パク質とｍＤｉａの結合の検出 ＡＰ５０抗体を使用して、野生型Ｒｈｏファミリー低分
子量Ｇタンパク質と天然ｍＤｉａの結合についてin vit
roにおいて検討した。具体的には下記に記載の方法に従
って実験を実施した。
パク質とｍＤｉａの結合の検出 ＡＰ５０抗体を使用して、野生型Ｒｈｏファミリー低分
子量Ｇタンパク質と天然ｍＤｉａの結合についてin vit
roにおいて検討した。具体的には下記に記載の方法に従
って実験を実施した。
【０１１１】ＧＤＰまたはＧＴＰ結合型のＧＳＴ−低分
子量Ｇタンパク質（ＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄ
ｃ４２Ｈ）の調製は、過去に記載の方法（Reid, T. et
al.,J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1992)）に従
って実施した。ほぼ１×１０7 細胞のコンフルエントＳ
ｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を集め、３．２ｍｌのバッファー
Ａ［１０ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．５％ トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン］中で超音
波処理（５秒、４回）することにより破壊した。超音波
処理したホモジネートを１０，０００ｇにおいて２０分
間遠心し、上清を取り置いた。過去に記載された方法
（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (199
6)）に従って、１０μＭ ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク
質を１ｍＭ ヌクレオチドとインキュベートすることに
よって、各ヌクレオチドのロードを実施した。次いで上
清の１／１０量を４００ｐｍｏｌのＧＴＰγＳまたはＧ
ＤＰをロードした各ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質とイ
ンキュベートした。３０℃において３０分インキュベー
トした後、５μｌのグルタチオン−セファロースを溶液
に添加し、この混合液を４℃において１時間インキュベ
ートした。遠心により回収された免疫複合体を１ｍｌの
バッファーＡで２回洗浄し、レムリ試料バッファー中で
煮沸した。可溶化抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、分
離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。過去に記載
された操作（Kumagai, N. et al., J. Biol. Chem., 26
8, 4535-24538 (1993)）に従い、抗ｃｌ．５０抗血清Ａ
Ｐ５０を使用してイムノブロッティングを実施した。
子量Ｇタンパク質（ＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄ
ｃ４２Ｈ）の調製は、過去に記載の方法（Reid, T. et
al.,J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1992)）に従
って実施した。ほぼ１×１０7 細胞のコンフルエントＳ
ｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を集め、３．２ｍｌのバッファー
Ａ［１０ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．５％ トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン］中で超音
波処理（５秒、４回）することにより破壊した。超音波
処理したホモジネートを１０，０００ｇにおいて２０分
間遠心し、上清を取り置いた。過去に記載された方法
（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (199
6)）に従って、１０μＭ ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク
質を１ｍＭ ヌクレオチドとインキュベートすることに
よって、各ヌクレオチドのロードを実施した。次いで上
清の１／１０量を４００ｐｍｏｌのＧＴＰγＳまたはＧ
ＤＰをロードした各ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質とイ
ンキュベートした。３０℃において３０分インキュベー
トした後、５μｌのグルタチオン−セファロースを溶液
に添加し、この混合液を４℃において１時間インキュベ
ートした。遠心により回収された免疫複合体を１ｍｌの
バッファーＡで２回洗浄し、レムリ試料バッファー中で
煮沸した。可溶化抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、分
離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。過去に記載
された操作（Kumagai, N. et al., J. Biol. Chem., 26
8, 4535-24538 (1993)）に従い、抗ｃｌ．５０抗血清Ａ
Ｐ５０を使用してイムノブロッティングを実施した。
【０１１２】結果は、図７に示したとおりであった。ｍ
ＤｉａはＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏによってのみ沈降した
が、そのＧＤＰ結合型Ｒｈｏ、またはＧＴＰγＳ結合型
ＲａｃまたはＣｄｃ４２によっては沈降しなかった。こ
れらの結果はツー・ハイブリッド・システムにおける結
果を支持し、ｍＤｉａが活性型Ｒｈｏと選択的に結合す
ることを示している。
ＤｉａはＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏによってのみ沈降した
が、そのＧＤＰ結合型Ｒｈｏ、またはＧＴＰγＳ結合型
ＲａｃまたはＣｄｃ４２によっては沈降しなかった。こ
れらの結果はツー・ハイブリッド・システムにおける結
果を支持し、ｍＤｉａが活性型Ｒｈｏと選択的に結合す
ることを示している。
【０１１３】実施例６ インビトロにおけるプロフィリ
ンとｍＤｉａの結合の検出 ｍＤｉａはポリ−プロリンのストレッチの繰り返し構造
を有し、かつプロフィリンはポリ−Ｌ−プロリン配列に
結合することが示されている。そこで、本発明者はプロ
フィリンがｍＤｉａに結合するかどうか、この結合がＲ
ｈｏに依存するかどうかを検討した。具体的には下記に
記載の方法に従って、実験を実施した。
ンとｍＤｉａの結合の検出 ｍＤｉａはポリ−プロリンのストレッチの繰り返し構造
を有し、かつプロフィリンはポリ−Ｌ−プロリン配列に
結合することが示されている。そこで、本発明者はプロ
フィリンがｍＤｉａに結合するかどうか、この結合がＲ
ｈｏに依存するかどうかを検討した。具体的には下記に
記載の方法に従って、実験を実施した。
【０１１４】まず、過去に記載された方法（Janmey, P.
A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191 (1994)）に従っ
て、ヒト血小板プロフィリンをポリ−Ｌ−プロリンアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製した。具体的
には、２５０ｍｇのポリ−Ｌ−プロリン（ＰＬＰ、分子
量１２，０００、シグマ社）をＣＮＢｒ活性化セファロ
ーズ４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。過去に記載
されている方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15,
1885-1893 (1996)）に従って、１００単位の血液のバッ
フィーコート画分から、洗浄したヒト血小板を調製し
た。血小板を２００ｍｌの抽出バッファー［２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２
ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ］＋
５０ｍＭベンズアミジンおよび１ｍｇ／ｍｌ アプロチ
ニン中で超音波処理により破壊した。１００，００００
×ｇで時間遠心した後、上清をＰＬＰ−セファロースカ
ラムに適用した。これを４Ｍ尿素で洗浄後７Ｍ尿素で溶
出することによりプロフィリンの均質調製物が得られ
た。次いで、０．９６ｍｇのプロフィリンを製造業者の
プロトコールに従い１ｍｌのＮＨＳ活性化セファロース
（ファルマシア社）と複合化させ、固定化プロフィリン
・ビーズを得た。対照として、ウシ血清アルブミンを同
様にＮＨＳ活性化セファロースに結合させた。
A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191 (1994)）に従っ
て、ヒト血小板プロフィリンをポリ−Ｌ−プロリンアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製した。具体的
には、２５０ｍｇのポリ−Ｌ−プロリン（ＰＬＰ、分子
量１２，０００、シグマ社）をＣＮＢｒ活性化セファロ
ーズ４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。過去に記載
されている方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15,
1885-1893 (1996)）に従って、１００単位の血液のバッ
フィーコート画分から、洗浄したヒト血小板を調製し
た。血小板を２００ｍｌの抽出バッファー［２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２
ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ］＋
５０ｍＭベンズアミジンおよび１ｍｇ／ｍｌ アプロチ
ニン中で超音波処理により破壊した。１００，００００
×ｇで時間遠心した後、上清をＰＬＰ−セファロースカ
ラムに適用した。これを４Ｍ尿素で洗浄後７Ｍ尿素で溶
出することによりプロフィリンの均質調製物が得られ
た。次いで、０．９６ｍｇのプロフィリンを製造業者の
プロトコールに従い１ｍｌのＮＨＳ活性化セファロース
（ファルマシア社）と複合化させ、固定化プロフィリン
・ビーズを得た。対照として、ウシ血清アルブミンを同
様にＮＨＳ活性化セファロースに結合させた。
【０１１５】１２枚の６ｃｍの培養皿から得られたコン
フルエントＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を２．４ｍｌのバッ
ファーＣ中で可溶化し、ライゼートを１０，０００×ｇ
において１０分間遠心し、上清を回収した。次いで、得
られた上清の１／１０量のアリコートを、ＧＳＴ−低分
子量Ｇタンパク質または遊離ＧＴＰγＳまたはＧＤＰの
存在下または非存在下においてインキュベートした。ま
た、２０μｌの固定化されたプロフィリンを添加した。
混合液を２５℃において３０分間インキュベートした
後、ビーズを１，０００×ｇで２分間遠心した。上清を
取り置き、ビーズを１００ｍＭ ＮａＣｌの代わりに３
００ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーＣ（１００μ
ｌ）で１回洗浄した。５０μｌのレムリ試料バッファー
をビーズに添加し、上清の１／１０量をこれの１／５倍
容量の５×レムリバッファーと混合した。試料を煮沸
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に移
した。イムノブロッティングを前述したように実施し、
検出はＥＣＬシステム（アマシャム社）により実施し
た。
フルエントＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を２．４ｍｌのバッ
ファーＣ中で可溶化し、ライゼートを１０，０００×ｇ
において１０分間遠心し、上清を回収した。次いで、得
られた上清の１／１０量のアリコートを、ＧＳＴ−低分
子量Ｇタンパク質または遊離ＧＴＰγＳまたはＧＤＰの
存在下または非存在下においてインキュベートした。ま
た、２０μｌの固定化されたプロフィリンを添加した。
混合液を２５℃において３０分間インキュベートした
後、ビーズを１，０００×ｇで２分間遠心した。上清を
取り置き、ビーズを１００ｍＭ ＮａＣｌの代わりに３
００ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーＣ（１００μ
ｌ）で１回洗浄した。５０μｌのレムリ試料バッファー
をビーズに添加し、上清の１／１０量をこれの１／５倍
容量の５×レムリバッファーと混合した。試料を煮沸
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に移
した。イムノブロッティングを前述したように実施し、
検出はＥＣＬシステム（アマシャム社）により実施し
た。
【０１１６】結果は図８に示したとおりであった。Ｓｗ
ｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおけるｍＤｉａはプロ
フィリン−アガロースの添加によりほとんど定量的に沈
降したが、ＢＳＡ−アガロースでは沈降しなかった。一
方、この結合は外からのＲｈｏＡの添加またはＧＴＰγ
Ｓの添加により影響を受けなかった。
ｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおけるｍＤｉａはプロ
フィリン−アガロースの添加によりほとんど定量的に沈
降したが、ＢＳＡ−アガロースでは沈降しなかった。一
方、この結合は外からのＲｈｏＡの添加またはＧＴＰγ
Ｓの添加により影響を受けなかった。
【０１１７】実施例７ 広がって移動する細胞の膜の波
打ち構造および分裂する細胞の分裂溝におけるＲｈｏ
Ａ、ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在化 ＨＴ１０８０培養ヒト線維芽肉腫細胞、Ｓｗｉｓｓ ３
Ｔ３細胞、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定的に発現するｓ
ＭＤＣＫ２細胞（K. Takaishi, K. et al.,Oncogene, 1
1, 39-48 (1995)）またはＨｅＬａ細胞において、ｍＤ
ｉａ、プロフィリンおよび内在性Ｒｈｏの分布およびそ
れらのインビボでの共局在化の可能性を、各タンパク質
に対して特異的な抗体を使用した蛍光顕微鏡観察により
検討した。
打ち構造および分裂する細胞の分裂溝におけるＲｈｏ
Ａ、ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在化 ＨＴ１０８０培養ヒト線維芽肉腫細胞、Ｓｗｉｓｓ ３
Ｔ３細胞、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定的に発現するｓ
ＭＤＣＫ２細胞（K. Takaishi, K. et al.,Oncogene, 1
1, 39-48 (1995)）またはＨｅＬａ細胞において、ｍＤ
ｉａ、プロフィリンおよび内在性Ｒｈｏの分布およびそ
れらのインビボでの共局在化の可能性を、各タンパク質
に対して特異的な抗体を使用した蛍光顕微鏡観察により
検討した。
【０１１８】細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中
で増殖させた。ＨＴ１０８０細胞は５×１０4 細胞／３
５ｍｍ皿の密度で播種し、一晩培養し、分析にかけた。
ｓＭＤＣＫ２細胞の分析のために、カバーガラス上に１
０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１×１０4 細胞／
３５ｍｍ培養皿の密度で細胞を播種し、１６時間インキ
ュベートした。次いで培地をＦＣＳを含まないＤＭＥＭ
に変え、２４時間インキュベートした。血清飢餓細胞を
１×１０-7Ｍのホルボールエステル（phorbol myristat
e acetate : PMA ）の存在下または非存在下において１
５分間３７℃において刺激し、固定した。
を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中
で増殖させた。ＨＴ１０８０細胞は５×１０4 細胞／３
５ｍｍ皿の密度で播種し、一晩培養し、分析にかけた。
ｓＭＤＣＫ２細胞の分析のために、カバーガラス上に１
０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１×１０4 細胞／
３５ｍｍ培養皿の密度で細胞を播種し、１６時間インキ
ュベートした。次いで培地をＦＣＳを含まないＤＭＥＭ
に変え、２４時間インキュベートした。血清飢餓細胞を
１×１０-7Ｍのホルボールエステル（phorbol myristat
e acetate : PMA ）の存在下または非存在下において１
５分間３７℃において刺激し、固定した。
【０１１９】間接的免疫蛍光のために、３．７％ パラ
ホルムアルデヒドを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）中で室温において２０分間細胞を固定し、次
いで０．２％ トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで１０
分間で処理し透過性とした。ＰＢＳで数回洗浄した後、
細胞を５％ ＢＳＡを含有するバッファーＢ［２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ］中で室温
において３０分以上インキュベートした。ｍＤｉａの染
色のために、細胞をブロッキング溶液中のＡＰ５０の
１：１０希釈物と室温において１時間インキュベート
し、０．１％のトリトンＸ−１００を含有するバッファ
ーＢで３回洗浄した。次いで細胞をＣｙ２標識化ヤギ抗
ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Life Science 社）で染色
した。アクチンの染色のために、ローダミンファロイジ
ン（Molecular Probe 社）を第２抗体とともに１：２０
０希釈において添加した。Ｍｙｃ−エピトープの染色の
ために、９Ｅ１０モノクローナル抗Ｍｙｃ抗体を１０μ
ｇ／ｍｌの濃度でＡＰ５０とともに１次インキュベーシ
ョンのために添加した。次いでローダミン抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を１：５０希釈で検出のために使用した。
ホルムアルデヒドを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）中で室温において２０分間細胞を固定し、次
いで０．２％ トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで１０
分間で処理し透過性とした。ＰＢＳで数回洗浄した後、
細胞を５％ ＢＳＡを含有するバッファーＢ［２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ］中で室温
において３０分以上インキュベートした。ｍＤｉａの染
色のために、細胞をブロッキング溶液中のＡＰ５０の
１：１０希釈物と室温において１時間インキュベート
し、０．１％のトリトンＸ−１００を含有するバッファ
ーＢで３回洗浄した。次いで細胞をＣｙ２標識化ヤギ抗
ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Life Science 社）で染色
した。アクチンの染色のために、ローダミンファロイジ
ン（Molecular Probe 社）を第２抗体とともに１：２０
０希釈において添加した。Ｍｙｃ−エピトープの染色の
ために、９Ｅ１０モノクローナル抗Ｍｙｃ抗体を１０μ
ｇ／ｍｌの濃度でＡＰ５０とともに１次インキュベーシ
ョンのために添加した。次いでローダミン抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を１：５０希釈で検出のために使用した。
【０１２０】結果は下記に記載したとおりであった。抗
ｍＤｉａ抗体により得られた蛍光の大部分は、ＨＴ１０
８０細胞のより厚い部分、すなわち、核周辺の細胞質領
域において局在化していた。しかしながら、顕著な蛍光
は、また、高度に運動性であることが知られている周囲
領域、例えば、広がって運動する細胞のリーディングラ
メラ（leading lamella ）および膜の波打ち構造（memb
rane ruffles）、においても観察された（図９Ａ）。核
周囲の細胞質領域とリーディング・エッジ（leading ed
ge）との間には、ｍＤｉａの染色が顕著に欠如してい
た。ｍＤｉａとフォーカル接着およびストレスファイバ
ーとの結合は観察されなかった。上記と同様な分布のパ
ターンは培養Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞においても観察さ
れた（図９Ｅ）。
ｍＤｉａ抗体により得られた蛍光の大部分は、ＨＴ１０
８０細胞のより厚い部分、すなわち、核周辺の細胞質領
域において局在化していた。しかしながら、顕著な蛍光
は、また、高度に運動性であることが知られている周囲
領域、例えば、広がって運動する細胞のリーディングラ
メラ（leading lamella ）および膜の波打ち構造（memb
rane ruffles）、においても観察された（図９Ａ）。核
周囲の細胞質領域とリーディング・エッジ（leading ed
ge）との間には、ｍＤｉａの染色が顕著に欠如してい
た。ｍＤｉａとフォーカル接着およびストレスファイバ
ーとの結合は観察されなかった。上記と同様な分布のパ
ターンは培養Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞においても観察さ
れた（図９Ｅ）。
【０１２１】モノクローナル抗プロフィリン抗体（２Ｈ
１１）を使用した二重免疫蛍光顕微鏡観察では、ＨＴ１
０８０細胞の核周囲の細胞質領域および拡大しているラ
メラやベール（lamella and veils）におけるプロフィ
リンの蓄積が検出され、これはｍＤｉａの分布と重複し
た（図９Ｂ）。このプロフィリンの分布はラット線維芽
細胞において過去にされた結果（Buβ, F. et al., Cel
l Mot. Cytoskeleton,22, 51-61 (1992) ）と一致し
た。興味あることには、プロフィリン抗体およびポリク
ローナル抗ＲｈｏＡ抗体を使用した二重免疫蛍光観察に
おいて、内在性ＲｈｏＡの一部分は、また、運動性細胞
の膜ベールにおいてプロフィリンとともに蓄積すること
が明らかにされた（図９ＣおよびＤ）。このことから、
ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡが、細胞の高度
な運動性構造に共局在化していることが示唆された。ま
た、ｍＤｉａの分布をＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞で調べ、
これをＦ−アクチンの分布と比較した。ｍＤｉａはこの
細胞でも、アクチン骨格（actin rib ）がよく発達した
広がったラメラに局在していた（図９Ｅ、Ｆ）。
１１）を使用した二重免疫蛍光顕微鏡観察では、ＨＴ１
０８０細胞の核周囲の細胞質領域および拡大しているラ
メラやベール（lamella and veils）におけるプロフィ
リンの蓄積が検出され、これはｍＤｉａの分布と重複し
た（図９Ｂ）。このプロフィリンの分布はラット線維芽
細胞において過去にされた結果（Buβ, F. et al., Cel
l Mot. Cytoskeleton,22, 51-61 (1992) ）と一致し
た。興味あることには、プロフィリン抗体およびポリク
ローナル抗ＲｈｏＡ抗体を使用した二重免疫蛍光観察に
おいて、内在性ＲｈｏＡの一部分は、また、運動性細胞
の膜ベールにおいてプロフィリンとともに蓄積すること
が明らかにされた（図９ＣおよびＤ）。このことから、
ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡが、細胞の高度
な運動性構造に共局在化していることが示唆された。ま
た、ｍＤｉａの分布をＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞で調べ、
これをＦ−アクチンの分布と比較した。ｍＤｉａはこの
細胞でも、アクチン骨格（actin rib ）がよく発達した
広がったラメラに局在していた（図９Ｅ、Ｆ）。
【０１２２】ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡの
共局在化は、また、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定に発現
し、ホルボールエステルに応答して膜を拡張するｓＭＤ
ＣＫ細胞（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48
(1995) ）においても証明された。図１０に示すよう
に、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡおよびｍＤｉａの双方は、休止細
胞のより厚い部分における細胞質中にむしろ均質に存在
した。ＰＭＡによる２分間の刺激の後、Ｍｙｃ−Ｒｈｏ
Ａの一部はｍＤｉａが共局在化された膜の波打ち構造の
周囲に移動した。プロフィリンの一部も膜の波打ち構造
に移動し、ＲｈｏＡと共局在することが明らかになっ
た。これらの細胞のホルボールエステルによる膜拡張の
誘導はＲｈｏ依存的な様式で起こることが知られている
（Takaishi,K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995)
）ので、これらの結果はｍＤｉａおよびプロフィリン
のリクルートメント（recruitment ）もまた、Ｒｈｏ依
存的であることを示唆している。
共局在化は、また、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定に発現
し、ホルボールエステルに応答して膜を拡張するｓＭＤ
ＣＫ細胞（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48
(1995) ）においても証明された。図１０に示すよう
に、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡおよびｍＤｉａの双方は、休止細
胞のより厚い部分における細胞質中にむしろ均質に存在
した。ＰＭＡによる２分間の刺激の後、Ｍｙｃ−Ｒｈｏ
Ａの一部はｍＤｉａが共局在化された膜の波打ち構造の
周囲に移動した。プロフィリンの一部も膜の波打ち構造
に移動し、ＲｈｏＡと共局在することが明らかになっ
た。これらの細胞のホルボールエステルによる膜拡張の
誘導はＲｈｏ依存的な様式で起こることが知られている
（Takaishi,K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995)
）ので、これらの結果はｍＤｉａおよびプロフィリン
のリクルートメント（recruitment ）もまた、Ｒｈｏ依
存的であることを示唆している。
【０１２３】中間期（interphase）の細胞においては、
ｍＤｉａの大部分は細胞質中に存在し、あるものはスプ
レッディング・エッジの原形質膜へ移行している。他
方、有糸分裂細胞においては、ｍＤｉａの細胞内局在
は、それらが細胞質分裂を行うまで、観察されなかっ
た。この際、ｍＤｉａの一部分は分裂溝部分の原形質膜
に濃縮され、リング様構造物として見えた（図１１Ａお
よびＣ）。この濃縮は細胞質分裂の終わりにおいて消失
し、染色は原形質膜の取り囲む領域に移動した。娘細胞
を接続している細胞間架橋部分には、染色は観察されな
かった。プロフィリンはこれらのプロセスの間で、ｍＤ
ｉａとほとんど重複する染色パターンを示した（図１１
Ｄ）。
ｍＤｉａの大部分は細胞質中に存在し、あるものはスプ
レッディング・エッジの原形質膜へ移行している。他
方、有糸分裂細胞においては、ｍＤｉａの細胞内局在
は、それらが細胞質分裂を行うまで、観察されなかっ
た。この際、ｍＤｉａの一部分は分裂溝部分の原形質膜
に濃縮され、リング様構造物として見えた（図１１Ａお
よびＣ）。この濃縮は細胞質分裂の終わりにおいて消失
し、染色は原形質膜の取り囲む領域に移動した。娘細胞
を接続している細胞間架橋部分には、染色は観察されな
かった。プロフィリンはこれらのプロセスの間で、ｍＤ
ｉａとほとんど重複する染色パターンを示した（図１１
Ｄ）。
【０１２４】実施例８ ＲｈｏＡおよびｍＤｉａはフィ
ブロネクチン（ＦＮ）コーティングされたビーズの周り
にクラスター状に存在する 最近の研究において、Ｒｈｏ活性化および細胞外マトリ
ックスタンパク質のインテグリンのライゲーション（li
gation）の双方が細胞のスプレッディングおよび基質へ
の接着のために必要であり（Hotchin, N.A. & Hall,
A., J. Cell Biol., 131, 1857-1865 (1995)）、そして
フィブロネクチンまたは抗インテグリン抗体のいずれか
でコーティングされたビーズによるインテグリンのライ
ゲーションは、ビーズ直下の原形質膜にＲｈｏをリクル
ートすることが示されている（Burbelo, P. et al., J.
Biol. Chem. 270, 30919-30926 (1995)）。そこで、ｍ
Ｄｉａも、これらのビーズにより原形質膜にＲｈｏとと
もにリクルートされるかどうか、およびこのリクルート
が活性化Ｒｈｏに依存的かどうか、について検討した。
ブロネクチン（ＦＮ）コーティングされたビーズの周り
にクラスター状に存在する 最近の研究において、Ｒｈｏ活性化および細胞外マトリ
ックスタンパク質のインテグリンのライゲーション（li
gation）の双方が細胞のスプレッディングおよび基質へ
の接着のために必要であり（Hotchin, N.A. & Hall,
A., J. Cell Biol., 131, 1857-1865 (1995)）、そして
フィブロネクチンまたは抗インテグリン抗体のいずれか
でコーティングされたビーズによるインテグリンのライ
ゲーションは、ビーズ直下の原形質膜にＲｈｏをリクル
ートすることが示されている（Burbelo, P. et al., J.
Biol. Chem. 270, 30919-30926 (1995)）。そこで、ｍ
Ｄｉａも、これらのビーズにより原形質膜にＲｈｏとと
もにリクルートされるかどうか、およびこのリクルート
が活性化Ｒｈｏに依存的かどうか、について検討した。
【０１２５】ポリスチレンラテックスのビーズ（１１．
９μｍの平均直径、シグマ社）を５０μｇ／ｍｌ ヒト
フィブロネクチン（Collabrative Research 社）または
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（シグマ社）に記
載されているようにコーティングした（Grinnel & Geig
er、Exp. Cell Res., 162, 449-461 (1986) ）。トリプ
シン処理したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞をポリ−リジンで
コーティングしたガラススリップ上にプレートし、１０
％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３７℃で２時間かけ
てスリップに結合させた。次いで、各々異なる型のビー
ズを細胞上に置いた。３７℃において１５分間のインキ
ュベーション後、細胞を固定した。ｍＤｉａの染色は前
述したように実施した。内在性ＲｈｏＡの免疫染色のた
めに、ウサギ抗ＲｈｏＡ抗体（Santa Cruz社）を１：４
０希釈において使用した。抗体を前述したようにＣｙ２
標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して可視化した。
９μｍの平均直径、シグマ社）を５０μｇ／ｍｌ ヒト
フィブロネクチン（Collabrative Research 社）または
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（シグマ社）に記
載されているようにコーティングした（Grinnel & Geig
er、Exp. Cell Res., 162, 449-461 (1986) ）。トリプ
シン処理したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞をポリ−リジンで
コーティングしたガラススリップ上にプレートし、１０
％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３７℃で２時間かけ
てスリップに結合させた。次いで、各々異なる型のビー
ズを細胞上に置いた。３７℃において１５分間のインキ
ュベーション後、細胞を固定した。ｍＤｉａの染色は前
述したように実施した。内在性ＲｈｏＡの免疫染色のた
めに、ウサギ抗ＲｈｏＡ抗体（Santa Cruz社）を１：４
０希釈において使用した。抗体を前述したようにＣｙ２
標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して可視化した。
【０１２６】結果は下記に記載したとおりであった。ま
ず、内在性Ｒｈｏが、ポリ−リジンでコーティングされ
たビーズ直下ではなく（図１２ｄ）、フィブロネクチン
（ＦＮ）でコーティングされたビーズ直下に蓄積される
ことを確認した（図１２ｂ）。この条件では、ｍＤｉａ
もＦＮコーティングされたビーズ直下にリクルートさ
れ、リング様の蓄積がビーズの周囲に観察された（図１
２ａ）。上記結果（ＲｈｏとｍＤｉａ両方の蓄積）に加
えて、細胞を予めＣ３菌体外酵素で処理した場合にはこ
れらの蓄積が阻害されたことから、これらのリクルート
メントが活性化Ｒｈｏ依存的であることが判明した（デ
ータ省略）。同様にして、プロフィリンもｍＤｉａ、Ｒ
ｈｏと共局在することが観察された（データ省略）。
ず、内在性Ｒｈｏが、ポリ−リジンでコーティングされ
たビーズ直下ではなく（図１２ｄ）、フィブロネクチン
（ＦＮ）でコーティングされたビーズ直下に蓄積される
ことを確認した（図１２ｂ）。この条件では、ｍＤｉａ
もＦＮコーティングされたビーズ直下にリクルートさ
れ、リング様の蓄積がビーズの周囲に観察された（図１
２ａ）。上記結果（ＲｈｏとｍＤｉａ両方の蓄積）に加
えて、細胞を予めＣ３菌体外酵素で処理した場合にはこ
れらの蓄積が阻害されたことから、これらのリクルート
メントが活性化Ｒｈｏ依存的であることが判明した（デ
ータ省略）。同様にして、プロフィリンもｍＤｉａ、Ｒ
ｈｏと共局在することが観察された（データ省略）。
【０１２７】実施例９ ｍＤｉａの過剰発現によるアク
チン重合の誘導 ｍＤｉａの機能を調べるため、過去に記載の方法（Ishi
zaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に
準じて、ｍＤｉａのｃＤＮＡ（配列番号１の１〜１２５
５番のアミノ酸配列）および／または他のタンパク質の
ｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞で一過的に発現させた後、細胞
を固定し、抗ｍＤｉａ抗体で染色した。
チン重合の誘導 ｍＤｉａの機能を調べるため、過去に記載の方法（Ishi
zaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に
準じて、ｍＤｉａのｃＤＮＡ（配列番号１の１〜１２５
５番のアミノ酸配列）および／または他のタンパク質の
ｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞で一過的に発現させた後、細胞
を固定し、抗ｍＤｉａ抗体で染色した。
【０１２８】トランスフェクト後４０時間目の細胞を抗
ｍＤｉａ抗体で染色したところ、よく染色され、ｍＤｉ
ａの発現が確認された。トランスフェクトしない細胞で
は核周辺に染色が観察された。これと比較すると、トラ
ンスフェクトした細胞では細胞の輪郭が明瞭にしかも均
等に染色されたことから、ｍＤｉａを過剰発現した場合
にはこの分子が原形質膜全体に局在化することが示され
た（図１３Ａ）。ファロイジンで染色すると、ストレス
ファイバーが消失し、細胞の原形質膜に一致してアクチ
ン染色が亢進されたことが観察された（図１３Ｂ）こと
から、ｍＤｉａは膜に移行し、そこでアクチンの重合を
誘導することが示唆された。ｍＤｉａをＣ３菌体外酵素
とともに発現した場合にはより顕著な結果が得られた。
即ち、Ｃ３菌体外酵素を単独でトランスフェクトする
と、細胞からほとんど全てのアクチンファイバーが消失
し細胞が球形化した（図１３Ｃ及びＤ）。ｍＤｉａをＣ
３菌体外酵素とともにトランスフェクトした時には、細
胞は形態を維持し、ｍＤｉａのみをトランスフェクトし
た細胞で観察されるのものと同様の繊維状アクチンの染
色が観察された（データ省略）。
ｍＤｉａ抗体で染色したところ、よく染色され、ｍＤｉ
ａの発現が確認された。トランスフェクトしない細胞で
は核周辺に染色が観察された。これと比較すると、トラ
ンスフェクトした細胞では細胞の輪郭が明瞭にしかも均
等に染色されたことから、ｍＤｉａを過剰発現した場合
にはこの分子が原形質膜全体に局在化することが示され
た（図１３Ａ）。ファロイジンで染色すると、ストレス
ファイバーが消失し、細胞の原形質膜に一致してアクチ
ン染色が亢進されたことが観察された（図１３Ｂ）こと
から、ｍＤｉａは膜に移行し、そこでアクチンの重合を
誘導することが示唆された。ｍＤｉａをＣ３菌体外酵素
とともに発現した場合にはより顕著な結果が得られた。
即ち、Ｃ３菌体外酵素を単独でトランスフェクトする
と、細胞からほとんど全てのアクチンファイバーが消失
し細胞が球形化した（図１３Ｃ及びＤ）。ｍＤｉａをＣ
３菌体外酵素とともにトランスフェクトした時には、細
胞は形態を維持し、ｍＤｉａのみをトランスフェクトし
た細胞で観察されるのものと同様の繊維状アクチンの染
色が観察された（データ省略）。
【０１２９】更に、ｍＤｉａをＲｈｏVal14 又は野生型
Ｒｈｏと共発現させた。ＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏ
を単独で発現させた場合には、ストレスファイバーや収
縮の誘導が観察された。しかし、ｍＤｉａをＲｈｏ
Val14 又は野生型Ｒｈｏと共発現させた場合には、上記
に記載したｍＤｉａ形質（ストレスファイバーの消失と
細胞の原形質膜に一致したアクチン染色）がＲｈｏ単独
によって誘導される形質（ストレスファイバーや収縮の
誘導）よりも優勢に発現し、ストレスファイバーや収縮
の誘導はほとんど観察されなかった（データ省略）。こ
れらの結果から、ｍＤｉａが過剰発現されると、原形質
膜に自動的に移行する、すなわち、Ｒｈｏタンパク質に
よるアクチン重合とは独立して移行することを示唆して
いる。
Ｒｈｏと共発現させた。ＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏ
を単独で発現させた場合には、ストレスファイバーや収
縮の誘導が観察された。しかし、ｍＤｉａをＲｈｏ
Val14 又は野生型Ｒｈｏと共発現させた場合には、上記
に記載したｍＤｉａ形質（ストレスファイバーの消失と
細胞の原形質膜に一致したアクチン染色）がＲｈｏ単独
によって誘導される形質（ストレスファイバーや収縮の
誘導）よりも優勢に発現し、ストレスファイバーや収縮
の誘導はほとんど観察されなかった（データ省略）。こ
れらの結果から、ｍＤｉａが過剰発現されると、原形質
膜に自動的に移行する、すなわち、Ｒｈｏタンパク質に
よるアクチン重合とは独立して移行することを示唆して
いる。
【０１３０】実施例１０ ヒトｍＤｉａ cDNA のクロー
ニング マウスｍＤｉａと酵母BNI1の塩基配列を比較し、構造上
保存されている部分のマウスの塩基配列をもとに、PCR
プライマー(5'-TGG AGG TAC AGG TAT ACC ACCACC ACC T
CC-3'( 配列番号２の2127-2156 番の塩基配列）、5'-GT
T CTC ACT CTTACG CAG CTC TTC GCA TGC-3' ( 配列番号
２の2929-2958 番の塩基配列）の相補配列）を作製し
た。このプライマーを使い、QUICK-CLONE cDNA Human B
rain（CLONTECH社）2μl を鋳型として、Takara LA PCR
kit Ver.2 （Takara社）を使い、ヒトｍＤｉａの部分c
DNA断片を増幅した。反応は、98℃10秒、55℃30秒、72
℃3 分を30回繰り返した。増幅したcDNA断片は、pBlusc
ript II SK- にサブクローニングし、塩基配列を決定
し、ヒトｍＤｉａであることを確認した。このヒトｍＤ
ｉａの部分cDNA断片をプローブとして、ヒト脳λZAP cD
NA ライブラリーを1.0 ×106 プラーク、スクリーニン
グした。上記スクリーニングは、J. Sambrooket al., M
olecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring
Habor Laboratory, Cold Spring Habor,NY(1989)に準
じて行った。6 ×SSC 、10×Denhardt'ssolution 、1
％SDS 、200μg/ml、中で65℃3 時間プレハイブリダイ
ゼーションを行った。ヒトｍＤｉａ cDNA 断片をSTRATA
GENE社 Primie-it II RandomPrimer Labeling Kit をも
ちいて、32P ラベルし、このプローブを使って、65℃、
一晩ハイブリダイゼーションを行った。2 ×SSC 、0.1
％SDS 、を使い室温で4 回洗浄した。この結果、2 つの
ヒトｍＤｉａ cDNA クローン（クローン140-10（配列番
号４の2194-5822 番の塩基配列）、140-12（配列番号４
の866-2253番の塩基配列））を得た。
ニング マウスｍＤｉａと酵母BNI1の塩基配列を比較し、構造上
保存されている部分のマウスの塩基配列をもとに、PCR
プライマー(5'-TGG AGG TAC AGG TAT ACC ACCACC ACC T
CC-3'( 配列番号２の2127-2156 番の塩基配列）、5'-GT
T CTC ACT CTTACG CAG CTC TTC GCA TGC-3' ( 配列番号
２の2929-2958 番の塩基配列）の相補配列）を作製し
た。このプライマーを使い、QUICK-CLONE cDNA Human B
rain（CLONTECH社）2μl を鋳型として、Takara LA PCR
kit Ver.2 （Takara社）を使い、ヒトｍＤｉａの部分c
DNA断片を増幅した。反応は、98℃10秒、55℃30秒、72
℃3 分を30回繰り返した。増幅したcDNA断片は、pBlusc
ript II SK- にサブクローニングし、塩基配列を決定
し、ヒトｍＤｉａであることを確認した。このヒトｍＤ
ｉａの部分cDNA断片をプローブとして、ヒト脳λZAP cD
NA ライブラリーを1.0 ×106 プラーク、スクリーニン
グした。上記スクリーニングは、J. Sambrooket al., M
olecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring
Habor Laboratory, Cold Spring Habor,NY(1989)に準
じて行った。6 ×SSC 、10×Denhardt'ssolution 、1
％SDS 、200μg/ml、中で65℃3 時間プレハイブリダイ
ゼーションを行った。ヒトｍＤｉａ cDNA 断片をSTRATA
GENE社 Primie-it II RandomPrimer Labeling Kit をも
ちいて、32P ラベルし、このプローブを使って、65℃、
一晩ハイブリダイゼーションを行った。2 ×SSC 、0.1
％SDS 、を使い室温で4 回洗浄した。この結果、2 つの
ヒトｍＤｉａ cDNA クローン（クローン140-10（配列番
号４の2194-5822 番の塩基配列）、140-12（配列番号４
の866-2253番の塩基配列））を得た。
【０１３１】ヒトｍＤｉａ cDNA の足りない5'側領域を
得るために、ヒト脳λgt10cDNAライブラリー（CLONTECH
社）1.0 ×106 プラーク、スクリーニングした。上記ス
クリーニングは、J. Sambrook et al., Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual:Cold Spring Habor Laborat
ory, Cold Spring Habor,NY(1989)に準じて行った。6
×SSC 、10×Denhardt's solution 、1 ％SDS 、200mg/
ml、中で65℃3 時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。クローン140-12の5'領域をプライマー5'-CCG TCC C
TT CAG GTC ATA GG3' （配列番号５の4530-4549 番の塩
基配列、配列番号４の1274-1293 番の塩基配列に対応）
と5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG-3'（pBluscript II
SK- の一部）を使って、PCR によりヒトｍＤｉａ部分c
DNA配列（配列番号４の866-1293番の塩基配列）を増幅
した。このcDNA断片をSTRATAGENE社 Primie-it II Rand
omPrimer Labeling Kit を用いて、32P ラベルし、この
プローブを使って、65℃、一晩ハイブリダイゼーション
を行った。2 ×SSC 、0.1％SDS 、を使い室温で4 回洗
浄した。この結果、1 つの5'側領域をカバーするcDNAク
ローン（クローン140-12-17 （配列番号４の1-1907番の
塩基配列。但し、１６７９番のＡがＣに置換してい
る。））を得た。それぞれのクローンの塩基配列の決定
は、Pharmacia 社製double-stranded Nested Deletion
Kit を使用して整列欠失を作製し、ABI 社の 377 DNAシ
ークエンサーを使って行った。
得るために、ヒト脳λgt10cDNAライブラリー（CLONTECH
社）1.0 ×106 プラーク、スクリーニングした。上記ス
クリーニングは、J. Sambrook et al., Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual:Cold Spring Habor Laborat
ory, Cold Spring Habor,NY(1989)に準じて行った。6
×SSC 、10×Denhardt's solution 、1 ％SDS 、200mg/
ml、中で65℃3 時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。クローン140-12の5'領域をプライマー5'-CCG TCC C
TT CAG GTC ATA GG3' （配列番号５の4530-4549 番の塩
基配列、配列番号４の1274-1293 番の塩基配列に対応）
と5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG-3'（pBluscript II
SK- の一部）を使って、PCR によりヒトｍＤｉａ部分c
DNA配列（配列番号４の866-1293番の塩基配列）を増幅
した。このcDNA断片をSTRATAGENE社 Primie-it II Rand
omPrimer Labeling Kit を用いて、32P ラベルし、この
プローブを使って、65℃、一晩ハイブリダイゼーション
を行った。2 ×SSC 、0.1％SDS 、を使い室温で4 回洗
浄した。この結果、1 つの5'側領域をカバーするcDNAク
ローン（クローン140-12-17 （配列番号４の1-1907番の
塩基配列。但し、１６７９番のＡがＣに置換してい
る。））を得た。それぞれのクローンの塩基配列の決定
は、Pharmacia 社製double-stranded Nested Deletion
Kit を使用して整列欠失を作製し、ABI 社の 377 DNAシ
ークエンサーを使って行った。
【０１３２】塩基配列を決定したところ、全長のヒトｍ
Ｄｉａ ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号４に記載され
るとおりであった。ただし、１６７９番目の塩基は、ク
ローン１４０−１２ではＡであったが、クローン１４０
−１２−１７ではＣであった。この塩基配列の差違は、
各々のクローンの由来が異なるからであると考えられ
る。クローン１４０−１２をクローニングしたｃＤＮＡ
ライブラリー（Clontech社製）とクローン１４０−１２
−１７をクローニングしたｃＤＮＡライブラリー（Stra
tagene社製）とはその由来を異にする。このように、ヒ
トｍＤｉａをコードする塩基配列は、配列番号４の１６
７９番の塩基がＡであるものと、１６７９番の塩基がＣ
であるものとが存在する。このような塩基配列の差違
は、ヒトの個人差（ポリモルフィズム）を反映している
と考えられる。
Ｄｉａ ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号４に記載され
るとおりであった。ただし、１６７９番目の塩基は、ク
ローン１４０−１２ではＡであったが、クローン１４０
−１２−１７ではＣであった。この塩基配列の差違は、
各々のクローンの由来が異なるからであると考えられ
る。クローン１４０−１２をクローニングしたｃＤＮＡ
ライブラリー（Clontech社製）とクローン１４０−１２
−１７をクローニングしたｃＤＮＡライブラリー（Stra
tagene社製）とはその由来を異にする。このように、ヒ
トｍＤｉａをコードする塩基配列は、配列番号４の１６
７９番の塩基がＡであるものと、１６７９番の塩基がＣ
であるものとが存在する。このような塩基配列の差違
は、ヒトの個人差（ポリモルフィズム）を反映している
と考えられる。
【０１３３】この塩基配列の差違の結果、ヒトｍＤｉａ
には２種類の異なる配列を有するものが存在することが
わかった。即ち、５５１番目のアミノ酸配列がＡｓｐの
もの（配列番号３および４のアミノ酸配列）と、５５１
番目のアミノ酸配列がＡｌａのもの（ヒトｍＤｉａ（Ｄ
５５１Ａ））が存在する。
には２種類の異なる配列を有するものが存在することが
わかった。即ち、５５１番目のアミノ酸配列がＡｓｐの
もの（配列番号３および４のアミノ酸配列）と、５５１
番目のアミノ酸配列がＡｌａのもの（ヒトｍＤｉａ（Ｄ
５５１Ａ））が存在する。
【０１３４】ヒトｍＤｉａの推定タンパク質は、1315ア
ミノ酸残基からなり、推定分子量は、約145kDaであっ
た。また、マウスｍＤｉａ（実施例２）との相同性は87
％であった。マウスｍＤｉａのＲｈｏ結合ドメイン（配
列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列）は、ヒトｍ
Ｄｉａのアミノ酸１１５〜３１２番に相当し、これらの
同一性は９４％であった。また、マウスｍＤｉａのプロ
リンに富む領域（配列番号１の５７１〜７３７番のアミ
ノ酸配列）およびＦＨ−２領域（配列番号１の９４５〜
１０１０番のアミノ酸配列）はそれぞれ、ヒトｍＤｉａ
のアミノ酸６２６〜７９７番およびアミノ酸１００５〜
１０７０番に相当し、これらの同一性はそれぞれ７３％
および９４％であった。図１４に得られたそれぞれのク
ローンのcontig map を示した。図１５および１６に、
ヒトおよびマウスｍＤｉａのアミノ酸配列を並べて比較
した。
ミノ酸残基からなり、推定分子量は、約145kDaであっ
た。また、マウスｍＤｉａ（実施例２）との相同性は87
％であった。マウスｍＤｉａのＲｈｏ結合ドメイン（配
列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列）は、ヒトｍ
Ｄｉａのアミノ酸１１５〜３１２番に相当し、これらの
同一性は９４％であった。また、マウスｍＤｉａのプロ
リンに富む領域（配列番号１の５７１〜７３７番のアミ
ノ酸配列）およびＦＨ−２領域（配列番号１の９４５〜
１０１０番のアミノ酸配列）はそれぞれ、ヒトｍＤｉａ
のアミノ酸６２６〜７９７番およびアミノ酸１００５〜
１０７０番に相当し、これらの同一性はそれぞれ７３％
および９４％であった。図１４に得られたそれぞれのク
ローンのcontig map を示した。図１５および１６に、
ヒトおよびマウスｍＤｉａのアミノ酸配列を並べて比較
した。
【０１３５】実施例１１ ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体
上の位置の決定 （１）FISH解析 ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を知るために、蛍
光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）解析を行っ
た。ヒト血液から単離したリンパ球を10% 胎児牛血清、
フィトヘマグルチニン(PHA) を補ったα−最少必須培地
(MEM) 中、37℃で、68から72時間培養した。培養したリ
ンパ球は、BrdU(0.18mg/ml Sigma社）で処理し同調させ
た。同調させたリンパ球は、無血清培地で3 回洗い、チ
ミジン (2.5mg/ml Sigma社）を含むα-MEMで37℃で6 時
間培養した。細胞を集めスライドを作製した。ヒトｍＤ
ｉａの5'側の配列を含むcDNAクローン140-10( 配列番号
４の2194-5822 番の塩基配列) をBRL BioNick labeling
kitを使用してビオチン化した(Heng et. al.1992)。FI
SHの検出方法は、Heng et al., 1992 とHeng and Tuji
1993に従った。スライドは55℃で1 時間熱処理した。RN
ase 処理後、スライドは、70％フォルムアミドを含む2X
SSC で2 分間変性し、70℃でエタノールにより脱水し
た。プローブは、75℃で5 分間ハイブリダイゼーション
液（50％フォルムアミド、10％デキストラン サルフェ
ート）中で変性した。プローブを変性した染色体スライ
ドにのせ、37℃で一晩置いた。スライドを50％ホルムア
ミド、2×SSC で3 分間、3 回洗浄したのち、2 ×SSC
、43℃、3 分間、3 回洗浄し、シグナルを検出した。F
ISHのシグナルとDAPI バンドパターンは別々に写真を
撮り、重ね合わせることによって、染色体上の位置を決
定した。
上の位置の決定 （１）FISH解析 ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を知るために、蛍
光in situ ハイブリダイゼーション（FISH）解析を行っ
た。ヒト血液から単離したリンパ球を10% 胎児牛血清、
フィトヘマグルチニン(PHA) を補ったα−最少必須培地
(MEM) 中、37℃で、68から72時間培養した。培養したリ
ンパ球は、BrdU(0.18mg/ml Sigma社）で処理し同調させ
た。同調させたリンパ球は、無血清培地で3 回洗い、チ
ミジン (2.5mg/ml Sigma社）を含むα-MEMで37℃で6 時
間培養した。細胞を集めスライドを作製した。ヒトｍＤ
ｉａの5'側の配列を含むcDNAクローン140-10( 配列番号
４の2194-5822 番の塩基配列) をBRL BioNick labeling
kitを使用してビオチン化した(Heng et. al.1992)。FI
SHの検出方法は、Heng et al., 1992 とHeng and Tuji
1993に従った。スライドは55℃で1 時間熱処理した。RN
ase 処理後、スライドは、70％フォルムアミドを含む2X
SSC で2 分間変性し、70℃でエタノールにより脱水し
た。プローブは、75℃で5 分間ハイブリダイゼーション
液（50％フォルムアミド、10％デキストラン サルフェ
ート）中で変性した。プローブを変性した染色体スライ
ドにのせ、37℃で一晩置いた。スライドを50％ホルムア
ミド、2×SSC で3 分間、3 回洗浄したのち、2 ×SSC
、43℃、3 分間、3 回洗浄し、シグナルを検出した。F
ISHのシグナルとDAPI バンドパターンは別々に写真を
撮り、重ね合わせることによって、染色体上の位置を決
定した。
【０１３６】FISH解析の結果、分裂している100 細胞の
染色体のうち、92細胞の染色体で、一組の染色体上にシ
グナルが検出された。DAPI バンドをもとに、シグナル
が5番染色体の長腕にあることが解った。詳細な染色体
上の位置は、10枚の写真の結果を総合して決定した（図
１７）。ヒトｍＤｉａ遺伝子は5 番染色体長腕の31.2に
存在することが解った。
染色体のうち、92細胞の染色体で、一組の染色体上にシ
グナルが検出された。DAPI バンドをもとに、シグナル
が5番染色体の長腕にあることが解った。詳細な染色体
上の位置は、10枚の写真の結果を総合して決定した（図
１７）。ヒトｍＤｉａ遺伝子は5 番染色体長腕の31.2に
存在することが解った。
【０１３７】（２）ヒトｍＤｉａ遺伝子のRadiation Pa
nel を使用した、染色体上の位置の決定。 ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を決定するため
に、Research Genetics社のGeneBridge 4 Radiation Hy
brid Panel を使用して、解析を行った。 DNAs25ng を
鋳型として、ヒトｍＤｉａに特異的なプライマー、5'-A
TA TGA GAG TGC AAC TAA A-3' ( 配列番号４の1226-124
4 番の塩基配列）と5'-GAG AAT CTG AAA GAC TTC ATT-3
' （配列番号５の4476-4496 番の塩基配列、配列番号４
の1327-1347 番の塩基配列に対応）を用いて、PCR を行
い決定した。PCR は、Takara LA PCR kit Ver.2 を用い
て、98℃10秒、55℃30秒、72℃1 分を30回繰り返した。
反応液を0.7 ％アガロースゲル電気泳動した結果、755b
p （配列番号６の塩基配列；633bp のイントロン配列を
含む）のヒトｍＤｉａ特異的なDNA 断片が増幅されてい
た。イントロンは、配列番号４の1319と1320番の塩基の
間に存在する。この結果をWI/MIT Radiation Hybrid Ma
pper (http: //www- genome. wi. mit. edu/ cgi- bin/
contig/ rhmapper. pl#instructions) を使って解析し
た。その結果、ヒトｍＤｉａはNIB1948 から2.02cRテロ
メア側の位置にあることが解った。
nel を使用した、染色体上の位置の決定。 ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を決定するため
に、Research Genetics社のGeneBridge 4 Radiation Hy
brid Panel を使用して、解析を行った。 DNAs25ng を
鋳型として、ヒトｍＤｉａに特異的なプライマー、5'-A
TA TGA GAG TGC AAC TAA A-3' ( 配列番号４の1226-124
4 番の塩基配列）と5'-GAG AAT CTG AAA GAC TTC ATT-3
' （配列番号５の4476-4496 番の塩基配列、配列番号４
の1327-1347 番の塩基配列に対応）を用いて、PCR を行
い決定した。PCR は、Takara LA PCR kit Ver.2 を用い
て、98℃10秒、55℃30秒、72℃1 分を30回繰り返した。
反応液を0.7 ％アガロースゲル電気泳動した結果、755b
p （配列番号６の塩基配列；633bp のイントロン配列を
含む）のヒトｍＤｉａ特異的なDNA 断片が増幅されてい
た。イントロンは、配列番号４の1319と1320番の塩基の
間に存在する。この結果をWI/MIT Radiation Hybrid Ma
pper (http: //www- genome. wi. mit. edu/ cgi- bin/
contig/ rhmapper. pl#instructions) を使って解析し
た。その結果、ヒトｍＤｉａはNIB1948 から2.02cRテロ
メア側の位置にあることが解った。
【０１３８】
配列番号：１ 配列の長さ：１２５５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：マウス 配列 Met Glu Pro Ser Gly Gly Gly Leu Gly Pro Gly Arg Gly Thr Arg Asp 1 5 10 15 Lys Lys Lys Gly Arg Ser Pro Asp Glu Leu Pro Ala Thr Gly Gly Asp 20 25 30 Gly Gly Lys His Lys Lys Phe Leu Glu Arg Phe Thr Ser Met Arg Ile 35 40 45 Lys Lys Glu Lys Glu Lys Pro Asn Ser Ala His Arg Asn Ser Ser Ala 50 55 60 Ser Tyr Gly Asp Asp Pro Thr Ala Gln Ser Leu Gln Asp Ile Ser Asp 65 70 75 80 Glu Gln Val Leu Val Leu Phe Glu Gln Met Leu Val Asp Met Asn Leu 85 90 95 Asn Glu Glu Lys Gln Gln Pro Leu Arg Glu Lys Asp Ile Val Ile Lys 100 105 110 Arg Glu Met Val Ser Gln Tyr Leu His Thr Ser Lys Ala Gly Met Asn 115 120 125 Gln Lys Glu Ser Ser Arg Ser Ala Met Met Tyr Ile Gln Glu Leu Arg 130 135 140 Ser Gly Leu Arg Asp Met His Leu Leu Ser Cys Leu Glu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Val Ser Leu Asn Asn Asn Pro Val Ser Trp Val Gln Thr Phe Gly Ala 165 170 175 Glu Gly Leu Ala Ser Leu Leu Asp Ile Leu Lys Arg Leu His Asp Glu 180 185 190 Lys Glu Glu Thr Ser Gly Asn Tyr Asp Ser Arg Asn Gln His Glu Ile 195 200 205 Ile Arg Cys Leu Lys Ala Phe Met Asn Asn Lys Phe Gly Ile Lys Thr 210 215 220 Met Leu Glu Thr Glu Glu Gly Ile Leu Leu Leu Val Arg Ala Met Asp 225 230 235 240 Pro Ala Val Pro Asn Met Met Ile Asp Ala Ala Lys Leu Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Cys Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asp Met Asn Glu Arg Val Leu Glu 260 265 270 Ala Met Thr Glu Arg Ala Glu Met Asp Glu Val Glu Arg Phe Gln Pro 275 280 285 Leu Leu Asp Gly Leu Lys Ser Gly Thr Ser Ile Ala Leu Lys Val Gly 290 295 300 Cys Leu Gln Leu Ile Asn Ala Leu Ile Thr Pro Ala Glu Glu Leu Asp 305 310 315 320 Phe Arg Val His Ile Arg Ser Glu Leu Met Arg Leu Gly Leu His Gln 325 330 335 Val Leu Gln Glu Leu Arg Glu Ile Glu Asn Glu Asp Met Lys Val Gln 340 345 350 Leu Cys Val Phe Asp Glu Gln Gly Asp Glu Asp Phe Phe Asp Leu Lys 355 360 365 Gly Arg Leu Asp Asp Ile Arg Met Glu Met Asp Asp Phe Gly Glu Val 370 375 380 Phe Gln Ile Ile Leu Asn Thr Val Lys Asp Ser Lys Ala Glu Pro His 385 390 395 400 Phe Leu Ser Ile Leu Gln His Leu Leu Leu Val Arg Asn Asp Tyr Glu 405 410 415 Ala Arg Pro Gln Tyr Tyr Lys Leu Ile Glu Glu Cys Val Ser Gln Ile 420 425 430 Val Leu His Lys Asn Gly Thr Asp Pro Asp Phe Lys Cys Arg His Leu 435 440 445 Gln Ile Asp Ile Glu Arg Leu Val Asp Gln Met Ile Asp Lys Thr Lys 450 455 460 Val Glu Lys Ser Glu Ala Lys Ala Thr Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asp 465 470 475 480 Ser Glu Leu Thr Ala Arg His Glu Leu Gln Val Glu Met Lys Lys Met 485 490 495 Glu Asn Asp Phe Glu Gln Lys Leu Gln Asp Leu Gln Gly Glu Lys Asp 500 505 510 Ala Leu Asp Ser Glu Lys Gln Gln Ile Thr Ala Gln Lys Gln Asp Leu 515 520 525 Glu Ala Glu Val Ser Lys Leu Thr Gly Glu Val Ala Lys Leu Ser Lys 530 535 540 Glu Leu Glu Asp Ala Lys Asn Glu Met Ala Ser Leu Ser Ala Val Val 545 550 555 560 Val Ala Pro Ser Val Ser Ser Ser Ala Ala Val Pro Pro Ala Pro Pro 565 570 575 Leu Pro Gly Asp Ser Gly Thr Val Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 580 585 590 Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Pro Ser Pro Pro Leu Pro Pro Gly 595 600 605 Thr Cys Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly Ala Cys Ile Pro 610 615 620 Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gly Ser Ala Ala Ile Pro Pro Pro Pro Pro 625 630 635 640 Leu Pro Gly Val Ala Ser Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ala 645 650 655 Thr Ala Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ala Thr Ala Ile Pro 660 665 670 Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly Thr Gly Ile Pro Pro Pro Pro Pro 675 680 685 Pro Leu Pro Gly Ser Val Gly Val Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly 690 695 700 Gly Pro Gly Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Pro Gly Ala Pro Gly 705 710 715 720 Ile Pro Pro Pro Pro Pro Gly Met Gly Val Pro Pro Pro Pro Pro Phe 725 730 735 Gly Phe Gly Val Pro Ala Ala Pro Val Leu Pro Phe Gly Leu Thr Pro 740 745 750 Lys Lys Val Tyr Lys Pro Glu Val Gln Leu Arg Arg Pro Asn Trp Ser 755 760 765 Lys Phe Val Ala Glu Asp Leu Ser Gln Asp Cys Phe Trp Thr Lys Val 770 775 780 Lys Glu Asp Arg Phe Glu Asn Asn Glu Leu Phe Ala Lys Leu Thr Leu 785 790 795 800 Ala Phe Ser Ala Gln Thr Lys Thr Ser Lys Ala Lys Lys Asp Gln Glu 805 810 815 Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Val Gln Lys Lys Lys Val Lys Glu Leu 820 825 830 Lys Val Leu Asp Ser Lys Thr Ala Gln Asn Leu Ser Ile Phe Leu Gly 835 840 845 Ser Phe Arg Met Pro Tyr Gln Glu Ile Lys Asn Val Ile Leu Glu Val 850 855 860 Asn Glu Ala Val Leu Thr Glu Ser Met Ile Gln Asn Leu Ile Lys Gln 865 870 875 880 Met Pro Glu Pro Glu Gln Leu Lys Met Leu Ser Glu Leu Lys Glu Glu 885 890 895 Tyr Asp Asp Leu Ala Glu Ser Glu Gln Phe Gly Val Val Met Gly Thr 900 905 910 Val Pro Arg Leu Arg Pro Arg Leu Asn Ala Ile Leu Phe Lys Leu Gln 915 920 925 Phe Ser Glu Gln Val Glu Asn Ile Lys Pro Glu Ile Val Ser Val Thr 930 935 940 Ala Ala Cys Glu Glu Leu Arg Lys Ser Glu Asn Phe Ser Ser Leu Leu 945 950 955 960 Glu Leu Thr Leu Leu Val Gly Asn Tyr Met Asn Ala Gly Ser Arg Asn 965 970 975 Ala Gly Ala Phe Gly Phe Asn Ile Ser Phe Leu Cys Lys Leu Arg Asp 980 985 990 Thr Lys Ser Ala Asp Gln Lys Met Thr Leu Leu His Phe Leu Ala Glu 995 1000 1005 Leu Cys Glu Asn Asp His Pro Glu Val Leu Lys Phe Pro Asp Glu Leu 1010 1015 1020 Ala His Val Glu Lys Ala Ser Arg Val Ser Ala Glu Asn Leu Gln Lys 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Asp Gln Met Lys Lys Gln Ile Ala Asp Val Glu Arg Asp Val 1045 1050 1055 Gln Asn Phe Pro Ala Ala Thr Asp Glu Lys Asp Lys Phe Val Glu Lys 1060 1065 1070 Met Thr Ser Phe Val Lys Asp Ala Gln Glu Gln Tyr Asn Lys Leu Arg 1075 1080 1085 Met Met His Ser Asn Met Glu Thr Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Asp Tyr 1090 1095 1100 Phe Val Phe Asp Pro Lys Lys Leu Ser Val Glu Glu Phe Phe Met Asp 1105 1110 1115 1120 Leu His Asn Phe Arg Asn Met Phe Leu Gln Ala Val Lys Glu Asn Gln 1125 1130 1135 Lys Arg Arg Glu Thr Glu Glu Lys Met Arg Arg Ala Lys Leu Ala Lys 1140 1145 1150 Glu Lys Ala Glu Lys Glu Arg Leu Glu Lys Gln Gln Lys Arg Glu Gln 1155 1160 1165 Leu Ile Asp Met Asn Ala Glu Gly Asp Glu Thr Gly Val Met Asp Ser 1170 1175 1180 Leu Leu Glu Ala Leu Gln Ser Gly Ala Ala Phe Arg Arg Lys Arg Gly 1185 1190 1195 1200 Pro Arg Gln Val Asn Arg Lys Ala Gly Cys Ala Val Thr Ser Leu Leu 1205 1210 1215 Ala Ser Glu Leu Thr Lys Asp Asp Ala Met Ala Pro Gly Pro Val Lys 1220 1225 1230 Val Pro Lys Lys Ser Glu Gly Val Pro Thr Ile Leu Glu Glu Ala Lys 1235 1240 1245 Glu Leu Val Gly Arg Ala Ser 1250 1255
【０１３９】配列番号：２ 配列の長さ：４３９９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：c ＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：マウス 配列 GAAGGCTGCT GGGCGGCGGC GGTGGTTGCT GGCTCGGGGC AGCCGGGCGC GAGCGGCGTA 60 GACAAGGGGT CACTTGCCGG CGCTAATCAG GAC ATG GAG CCG TCC GGC GGG GGC 114 Met Glu Pro Ser Gly Gly Gly 1 5 CTG GGG CCC GGC CGC GGT ACC CGG GAC AAG AAG AAG GGT CGG AGC CCG 162 Leu Gly Pro Gly Arg Gly Thr Arg Asp Lys Lys Lys Gly Arg Ser Pro 10 15 20 GAT GAG CTG CCT GCG ACG GGC GGC GAC GGC GGC AAA CAT AAG AAA TTT 210 Asp Glu Leu Pro Ala Thr Gly Gly Asp Gly Gly Lys His Lys Lys Phe 25 30 35 CTG GAG AGA TTT ACC AGC ATG AGG ATT AAG AAG GAG AAA GAA AAG CCC 258 Leu Glu Arg Phe Thr Ser Met Arg Ile Lys Lys Glu Lys Glu Lys Pro 40 45 50 55 AAT TCT GCT CAT AGA AAC TCC TCT GCA TCG TAC GGA GAT GAC CCC ACT 306 Asn Ser Ala His Arg Asn Ser Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Asp Pro Thr 60 65 70 GCT CAG TCA TTG CAG GAC ATC TCA GAC GAG CAA GTT CTT GTC CTC TTT 354 Ala Gln Ser Leu Gln Asp Ile Ser Asp Glu Gln Val Leu Val Leu Phe 75 80 85 GAG CAG ATG CTG GTG GAT ATG AAC CTG AAT GAG GAG AAG CAG CAG CCT 402 Glu Gln Met Leu Val Asp Met Asn Leu Asn Glu Glu Lys Gln Gln Pro 90 95 100 TTG CGA GAG AAG GAC ATT GTC ATC AAG AGG GAG ATG GTG TCG CAA TAT 450 Leu Arg Glu Lys Asp Ile Val Ile Lys Arg Glu Met Val Ser Gln Tyr 105 110 115 CTG CAC ACT TCC AAG GCT GGC ATG AAC CAG AAA GAG AGC TCT AGG TCT 498 Leu His Thr Ser Lys Ala Gly Met Asn Gln Lys Glu Ser Ser Arg Ser 120 125 130 135 GCC ATG ATG TAC ATC CAG GAG CTG AGG TCG GGC TTG CGG GAT ATG CAC 546 Ala Met Met Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Ser Gly Leu Arg Asp Met His 140 145 150 CTG CTT AGC TGC CTT GAG TCC CTT CGA GTC TCT CTC AAC AAT AAC CCT 594 Leu Leu Ser Cys Leu Glu Ser Leu Arg Val Ser Leu Asn Asn Asn Pro 155 160 165 GTC AGT TGG GTG CAG ACA TTT GGT GCT GAG GGC CTA GCC TCC TTA TTG 642 Val Ser Trp Val Gln Thr Phe Gly Ala Glu Gly Leu Ala Ser Leu Leu 170 175 180 GAC ATC CTC AAA CGA CTC CAT GAT GAG AAA GAG GAG ACT TCT GGA AAC 690 Asp Ile Leu Lys Arg Leu His Asp Glu Lys Glu Glu Thr Ser Gly Asn 185 190 195 TAC GAC AGC CGA AAC CAG CAT GAG ATT ATC CGC TGT TTG AAG GCT TTC 738 Tyr Asp Ser Arg Asn Gln His Glu Ile Ile Arg Cys Leu Lys Ala Phe 200 205 210 215 ATG AAC AAC AAG TTT GGA ATC AAA ACT ATG TTG GAG ACG GAA GAA GGA 786 Met Asn Asn Lys Phe Gly Ile Lys Thr Met Leu Glu Thr Glu Glu Gly 220 225 230 ATC CTA CTG CTG GTC AGA GCC ATG GAT CCT GCT GTT CCC AAT ATG ATG 834 Ile Leu Leu Leu Val Arg Ala Met Asp Pro Ala Val Pro Asn Met Met 235 240 245 ATT GAT GCA GCA AAG CTG CTG TCT GCC CTC TGT ATC CTG CCG CAG CCG 882 Ile Asp Ala Ala Lys Leu Leu Ser Ala Leu Cys Ile Leu Pro Gln Pro 250 255 260 GAG GAC ATG AAT GAA CGA GTT CTA GAG GCA ATG ACA GAG AGA GCT GAA 930 Glu Asp Met Asn Glu Arg Val Leu Glu Ala Met Thr Glu Arg Ala Glu 265 270 275 ATG GAT GAG GTC GAA CGC TTC CAG CCA CTT CTG GAC GGA TTA AAA AGT 978 Met Asp Glu Val Glu Arg Phe Gln Pro Leu Leu Asp Gly Leu Lys Ser 280 285 290 295 GGG ACC TCT ATT GCC CTC AAA GTG GGA TGC CTA CAG CTC ATC AAT GCT 1026 Gly Thr Ser Ile Ala Leu Lys Val Gly Cys Leu Gln Leu Ile Asn Ala 300 305 310 CTC ATC ACT CCA GCT GAG GAA CTG GAC TTC CGA GTT CAC ATC CGA AGT 1074 Leu Ile Thr Pro Ala Glu Glu Leu Asp Phe Arg Val His Ile Arg Ser 315 320 325 GAG CTG ATG CGC CTG GGG CTG CAT CAG GTG TTG CAG GAG CTT CGA GAG 1122 Glu Leu Met Arg Leu Gly Leu His Gln Val Leu Gln Glu Leu Arg Glu 330 335 340 ATT GAA AAT GAA GAT ATG AAA GTA CAG CTG TGC GTG TTT GAT GAA CAA 1170 Ile Glu Asn Glu Asp Met Lys Val Gln Leu Cys Val Phe Asp Glu Gln 345 350 355 GGG GAT GAA GAT TTC TTT GAT CTG AAG GGA CGG CTG GAT GAT ATC CGC 1218 Gly Asp Glu Asp Phe Phe Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp Asp Ile Arg 360 365 370 375 ATG GAG ATG GAT GAC TTT GGT GAA GTT TTT CAG ATT ATT TTA AAC ACA 1266 Met Glu Met Asp Asp Phe Gly Glu Val Phe Gln Ile Ile Leu Asn Thr 380 385 390 GTG AAA GAT TCA AAG GCA GAG CCA CAC TTC CTG TCT ATC TTG CAG CAT 1314 Val Lys Asp Ser Lys Ala Glu Pro His Phe Leu Ser Ile Leu Gln His 395 400 405 CTC CTG TTG GTC CGA AAT GAT TAT GAA GCC AGG CCA CAG TAC TAT AAA 1362 Leu Leu Leu Val Arg Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Pro Gln Tyr Tyr Lys 410 415 420 CTG ATT GAA GAA TGT GTT TCT CAG ATA GTT CTA CAC AAA AAT GGA ACT 1410 Leu Ile Glu Glu Cys Val Ser Gln Ile Val Leu His Lys Asn Gly Thr 425 430 435 GAT CCT GAC TTC AAG TGC CGA CAC CTG CAG ATT GAT ATT GAG AGA TTG 1458 Asp Pro Asp Phe Lys Cys Arg His Leu Gln Ile Asp Ile Glu Arg Leu 440 445 450 455 GTT GAT CAA ATG ATT GAT AAA ACA AAG GTG GAA AAA TCT GAG GCC AAA 1506 Val Asp Gln Met Ile Asp Lys Thr Lys Val Glu Lys Ser Glu Ala Lys 460 465 470 GCT ACA GAG CTG GAA AAA AAG TTG GAT TCA GAA TTA ACA GCG CGG CAC 1554 Ala Thr Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Ala Arg His 475 480 485 GAG TTA CAA GTA GAA ATG AAA AAG ATG GAA AAT GAC TTT GAG CAG AAA 1602 Glu Leu Gln Val Glu Met Lys Lys Met Glu Asn Asp Phe Glu Gln Lys 490 495 500 CTT CAG GAT CTT CAA GGA GAA AAG GAT GCC TTG GAT TCT GAA AAG CAG 1650 Leu Gln Asp Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Leu Asp Ser Glu Lys Gln 505 510 515 CAG ATC ACT GCA CAG AAA CAA GAC CTG GAG GCA GAG GTG TCC AAG CTG 1698 Gln Ile Thr Ala Gln Lys Gln Asp Leu Glu Ala Glu Val Ser Lys Leu 520 525 530 535 ACA GGA GAG GTT GCC AAG CTG TCA AAA GAA CTA GAA GAT GCC AAG AAT 1746 Thr Gly Glu Val Ala Lys Leu Ser Lys Glu Leu Glu Asp Ala Lys Asn 540 545 550 GAA ATG GCT TCT CTC TCT GCT GTG GTT GTT GCA CCT TCT GTT TCT AGC 1794 Glu Met Ala Ser Leu Ser Ala Val Val Val Ala Pro Ser Val Ser Ser 555 560 565 AGT GCT GCT GTT CCC CCT GCC CCT CCT CTG CCT GGT GAC TCT GGC ACT 1842 Ser Ala Ala Val Pro Pro Ala Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ser Gly Thr 570 575 580 GTT ATT CCA CCT CCC CCA CCC CCA CCT CCT CTT CCT GGA GGT GTG GTC 1890 Val Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly Val Val 585 590 595 CCA CCA TCC CCT CCT CTG CCT CCA GGT ACT TGT ATC CCT CCA CCT CCT 1938 Pro Pro Ser Pro Pro Leu Pro Pro Gly Thr Cys Ile Pro Pro Pro Pro 600 605 610 615 CCT TTA CCT GGA GGT GCT TGT ATA CCC CCT CCC CCC CAG TTG CCT GGC 1986 Pro Leu Pro Gly Gly Ala Cys Ile Pro Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gly 620 625 630 AGT GCT GCC ATC CCT CCA CCT CCT CCT CTA CCT GGA GTT GCT TCC ATC 2034 Ser Ala Ala Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Val Ala Ser Ile 635 640 645 CCC CCA CCT CCC CCT TTG CCT GGG GCT ACT GCC ATC CCC CCA CCT CCC 2082 Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ala Thr Ala Ile Pro Pro Pro Pro 650 655 660 CCT TTG CCT GGG GCT ACT GCC ATC CCC CCA CCT CCC CCT TTG CCT GGA 2130 Pro Leu Pro Gly Ala Thr Ala Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly 665 670 675 GGT ACA GGT ATA CCA CCA CCA CCT CCT CCT TTG CCT GGA AGT GTT GGC 2178 Gly Thr Gly Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ser Val Gly 680 685 690 695 GTT CCC CCA CCC CCT CCC TTG CCT GGA GGA CCA GGA CTG CCT CCT CCC 2226 Val Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly Pro Gly Leu Pro Pro Pro 700 705 710 CCC CCC CCT TTT CCT GGA GCA CCT GGC ATT CCT CCA CCT CCA CCT GGT 2274 Pro Pro Pro Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ile Pro Pro Pro Pro Pro Gly 715 720 725 ATG GGC GTG CCT CCA CCT CCC CCC TTT GGA TTT GGG GTT CCT GCG GCC 2322 Met Gly Val Pro Pro Pro Pro Pro Phe Gly Phe Gly Val Pro Ala Ala 730 735 740 CCA GTT CTG CCA TTT GGA TTA ACC CCC AAA AAA GTT TAT AAG CCA GAG 2370 Pro Val Leu Pro Phe Gly Leu Thr Pro Lys Lys Val Tyr Lys Pro Glu 745 750 755 GTG CAG CTC CGG AGG CCA AAC TGG TCC AAG TTT GTG GCT GAG GAC CTT 2418 Val Gln Leu Arg Arg Pro Asn Trp Ser Lys Phe Val Ala Glu Asp Leu 760 765 770 775 TCC CAG GAC TGC TTC TGG ACA AAG GTG AAG GAG GAC CGC TTT GAG AAC 2466 Ser Gln Asp Cys Phe Trp Thr Lys Val Lys Glu Asp Arg Phe Glu Asn 780 785 790 AAT GAA CTT TTT GCC AAA CTT ACC CTT GCC TTC TCC GCC CAG ACC AAG 2514 Asn Glu Leu Phe Ala Lys Leu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Gln Thr Lys 795 800 805 ACT TCT AAA GCC AAG AAG GAT CAA GAA GGT GGA GAA GAA AAG AAA TCT 2562 Thr Ser Lys Ala Lys Lys Asp Gln Glu Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser 810 815 820 GTT CAA AAG AAG AAA GTA AAA GAG CTG AAA GTG CTG GAT TCA AAG ACA 2610 Val Gln Lys Lys Lys Val Lys Glu Leu Lys Val Leu Asp Ser Lys Thr 825 830 835 GCG CAG AAT CTC TCA ATC TTT TTG GGT TCA TTC CGC ATG CCC TAT CAA 2658 Ala Gln Asn Leu Ser Ile Phe Leu Gly Ser Phe Arg Met Pro Tyr Gln 840 845 850 855 GAG ATA AAG AAC GTT ATC CTG GAG GTG AAT GAG GCT GTT CTC ACA GAG 2706 Glu Ile Lys Asn Val Ile Leu Glu Val Asn Glu Ala Val Leu Thr Glu 860 865 870 TCT ATG ATC CAG AAC CTC ATT AAA CAG ATG CCA GAG CCA GAG CAG CTA 2754 Ser Met Ile Gln Asn Leu Ile Lys Gln Met Pro Glu Pro Glu Gln Leu 875 880 885 AAG ATG CTC TCT GAA CTG AAG GAG GAG TAC GAT GAT CTG GCT GAG TCA 2802 Lys Met Leu Ser Glu Leu Lys Glu Glu Tyr Asp Asp Leu Ala Glu Ser 890 895 900 GAG CAG TTT GGT GTG GTG ATG GGC ACA GTG CCC CGC CTT CGG CCT CGC 2850 Glu Gln Phe Gly Val Val Met Gly Thr Val Pro Arg Leu Arg Pro Arg 905 910 915 CTC AAC GCC ATC CTC TTC AAG CTA CAG TTC AGT GAG CAA GTT GAG AAC 2898 Leu Asn Ala Ile Leu Phe Lys Leu Gln Phe Ser Glu Gln Val Glu Asn 920 925 930 935 ATC AAG CCA GAG ATC GTG TCT GTC ACC GCC GCA TGC GAA GAG CTG CGT 2946 Ile Lys Pro Glu Ile Val Ser Val Thr Ala Ala Cys Glu Glu Leu Arg 940 945 950 AAG AGT GAG AAC TTC TCC AGC CTC CTG GAG CTC ACA CTG CTG GTC GGA 2994 Lys Ser Glu Asn Phe Ser Ser Leu Leu Glu Leu Thr Leu Leu Val Gly 955 960 965 AAC TAT ATG AAT GCG GGC TCC AGG AAT GCT GGT GCT TTC GGC TTC AAT 3042 Asn Tyr Met Asn Ala Gly Ser Arg Asn Ala Gly Ala Phe Gly Phe Asn 970 975 980 ATC AGC TTC CTT TGT AAG CTT CGA GAC ACC AAG TCT GCA GAT CAG AAG 3090 Ile Ser Phe Leu Cys Lys Leu Arg Asp Thr Lys Ser Ala Asp Gln Lys 985 990 995 ATG ACT CTG TTG CAT TTC TTG GCT GAG TTA TGT GAG AAT GAC CAC CCC 3138 Met Thr Leu Leu His Phe Leu Ala Glu Leu Cys Glu Asn Asp His Pro 1000 1005 1010 1015 GAA GTC CTC AAG TTT CCT GAT GAG CTT GCC CAT GTA GAG AAA GCC AGC 3186 Glu Val Leu Lys Phe Pro Asp Glu Leu Ala His Val Glu Lys Ala Ser 1020 1025 1030 AGA GTC TCT GCT GAG AAC CTG CAG AAG AGC TTA GAT CAG ATG AAG AAG 3234 Arg Val Ser Ala Glu Asn Leu Gln Lys Ser Leu Asp Gln Met Lys Lys 1035 1040 1045 CAG ATT GCG GAC GTG GAG CGC GAT GTT CAG AAT TTC CCA GCT GCC ACT 3282 Gln Ile Ala Asp Val Glu Arg Asp Val Gln Asn Phe Pro Ala Ala Thr 1050 1055 1060 GAC GAG AAG GAC AAG TTT GTT GAG AAG ATG ACC AGC TTT GTG AAG GAT 3330 Asp Glu Lys Asp Lys Phe Val Glu Lys Met Thr Ser Phe Val Lys Asp 1065 1070 1075 GCA CAG GAA CAG TAT AAC AAA CTA CGG ATG ATG CAC TCC AAC ATG GAG 3378 Ala Gln Glu Gln Tyr Asn Lys Leu Arg Met Met His Ser Asn Met Glu 1080 1085 1090 1095 ACC CTC TAT AAG GAG CTA GGT GAC TAC TTC GTC TTT GAC CCT AAG AAG 3426 Thr Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Asp Tyr Phe Val Phe Asp Pro Lys Lys 1100 1105 1110 TTG TCT GTA GAG GAA TTC TTT ATG GAT CTG CAC AAC TTT AGG AAT ATG 3474 Leu Ser Val Glu Glu Phe Phe Met Asp Leu His Asn Phe Arg Asn Met 1115 1120 1125 TTT TTG CAA GCA GTC AAG GAA AAC CAG AAG CGC CGG GAA ACA GAA GAA 3522 Phe Leu Gln Ala Val Lys Glu Asn Gln Lys Arg Arg Glu Thr Glu Glu 1130 1135 1140 AAG ATG CGG AGA GCA AAA TTA GCC AAG GAG AAG GCA GAA AAA GAG CGA 3570 Lys Met Arg Arg Ala Lys Leu Ala Lys Glu Lys Ala Glu Lys Glu Arg 1145 1150 1155 CTG GAG AAG CAG CAG AAG CGC GAG CAG CTC ATC GAC ATG AAC GCA GAG 3618 Leu Glu Lys Gln Gln Lys Arg Glu Gln Leu Ile Asp Met Asn Ala Glu 1160 1165 1170 1175 GGG GAT GAG ACA GGT GTG ATG GAC AGT CTT CTA GAA GCT CTG CAG TCA 3666 Gly Asp Glu Thr Gly Val Met Asp Ser Leu Leu Glu Ala Leu Gln Ser 1180 1185 1190 GGG GCA GCA TTC CGA CGG AAG AGA GGG CCC CGG CAG GTC AAC AGG AAG 3714 Gly Ala Ala Phe Arg Arg Lys Arg Gly Pro Arg Gln Val Asn Arg Lys 1195 1200 1205 GCT GGG TGT GCA GTC ACA TCT CTG CTA GCC TCG GAG CTG ACC AAG GAT 3762 Ala Gly Cys Ala Val Thr Ser Leu Leu Ala Ser Glu Leu Thr Lys Asp 1210 1215 1220 GAT GCC ATG GCT CCT GGT CCT GTT AAG GTA CCC AAG AAA AGT GAA GGA 3810 Asp Ala Met Ala Pro Gly Pro Val Lys Val Pro Lys Lys Ser Glu Gly 1225 1230 1235 GTC CCC ACA ATC CTG GAA GAA GCC AAG GAG CTG GTT GGC CGT GCA AGC 3858 Val Pro Thr Ile Leu Glu Glu Ala Lys Glu Leu Val Gly Arg Ala Ser 1240 1245 1250 1255 TAA GCTGGGCTTT ATGGCCATTG CTGCTCCTAG GCGAAGCCCA GACTGTCGAC 3911 * CTGCAGCATG GGCCTAAATG GTCAAGGAGA TAGTGGCCAC TCCACCACCT GACCCTGTCT 3971 TTCTGTCTGG CCTGCTGCTC TCTGAACACC ACATACAGCT TCAGCTGCCT GGAGGCCAAA 4031 AGGAAGGGGC AGTGTAGGAG TGGCCTGAGC CCAGCCCAGC CAGCCCTGGC TGTTGTATTA 4091 CCAAAGCAGG GTCCGTGTTT GCTGCCTTAA CCCTGTCTCC TCTATGTTAC CCAGAGGTCC 4151 TGGTCTCAGA CAGAACCCAG CCTGCTTTCT CAGCCCCACT CTCTAGTGGG CCTTCCCTAG 4211 GTCAATCTTG CTGCATTTGT GCTTTTCTTT TGTGGTTTCT CTGGCCCTGA GAATAGCATG 4271 GGACTTGTGA ACCTTTGGGC TAGGTCTTTT CACTGCTGTC ACCTCTGCTT TTCCTCCTGG 4331 CAATTATTTA TTACTAGTGC TGTGGCATTG GGAGCTGCTT CTGCAAAGCA GGAAGCAAAT 4391 CCCACCCT 4399
【０１４０】配列番号：３ 配列の長さ：１３１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列 Met Arg Ala Lys Pro Leu Gly Phe Gln Gly Arg Gly Ala Trp Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Arg Glu Gly Val Leu Ala Glu Ala Gly Lys Gly Arg 20 25 30 Arg Gly Pro Gly Ile Pro Gly Gly Val Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser 35 40 45 Val Asn Arg Asp Met Glu Pro Pro Gly Gly Ser Leu Gly Pro Gly Arg 50 55 60 Gly Thr Arg Asp Lys Lys Lys Gly Arg Ser Pro Asp Glu Leu Pro Ser 65 70 75 80 Ala Gly Gly Asp Gly Gly Lys Ser Lys Lys Phe Leu Glu Arg Phe Thr 85 90 95 Ser Met Arg Ile Lys Lys Glu Lys Glu Lys Pro Asn Ser Ala His Arg 100 105 110 Asn Ser Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Asp Pro Thr Ala Gln Ser Leu Gln 115 120 125 Asp Val Ser Asp Glu Gln Val Leu Val Leu Phe Glu Gln Met Leu Leu 130 135 140 Asp Met Asn Leu Asn Glu Glu Lys Gln Gln Pro Leu Arg Glu Lys Asp 145 150 155 160 Ile Ile Ile Lys Arg Glu Met Val Ser Gln Tyr Leu Tyr Thr Ser Lys 165 170 175 Ala Gly Met Ser Gln Lys Glu Ser Ser Lys Ser Ala Met Met Tyr Ile 180 185 190 Gln Glu Leu Arg Ser Gly Leu Arg Asp Met Pro Leu Leu Ser Cys Leu 195 200 205 Glu Ser Leu Arg Val Ser Leu Asn Asn Asn Pro Val Ser Trp Val Gln 210 215 220 Thr Phe Gly Ala Glu Gly Leu Ala Ser Leu Leu Asp Ile Leu Lys Arg 225 230 235 240 Leu His Asp Glu Lys Glu Glu Thr Ala Gly Ser Tyr Asp Ser Arg Asn 245 250 255 Lys His Glu Ile Ile Arg Cys Leu Lys Ala Phe Met Asn Asn Lys Phe 260 265 270 Gly Ile Lys Thr Met Leu Glu Thr Glu Glu Gly Ile Leu Leu Leu Val 275 280 285 Arg Ala Met Asp Pro Ala Val Pro Asn Met Met Ile Asp Ala Ala Lys 290 295 300 Leu Leu Ser Ala Leu Cys Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asp Met Asn Glu 305 310 315 320 Arg Val Leu Glu Ala Met Thr Glu Arg Ala Glu Met Asp Glu Val Glu 325 330 335 Arg Phe Gln Pro Leu Leu Asp Gly Leu Lys Ser Gly Thr Thr Ile Ala 340 345 350 Leu Lys Val Gly Cys Leu Gln Leu Ile Asn Ala Leu Ile Thr Pro Ala 355 360 365 Glu Glu Leu Asp Phe Arg Val His Ile Arg Ser Glu Leu Met Arg Leu 370 375 380 Gly Leu His Gln Val Leu Gln Asp Leu Arg Glu Ile Glu Asn Glu Asp 385 390 395 400 Met Arg Val Gln Leu Asn Val Phe Asp Glu Gln Gly Glu Glu Asp Ser 405 410 415 Tyr Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp Asp Ile Arg Met Glu Met Asp Asp 420 425 430 Phe Asn Glu Val Phe Gln Ile Leu Leu Asn Thr Val Lys Asp Ser Lys 435 440 445 Ala Glu Pro His Phe Leu Ser Ile Leu Gln His Leu Leu Leu Val Arg 450 455 460 Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Pro Gln Tyr Tyr Lys Leu Ile Glu Glu Cys 465 470 475 480 Ile Ser Gln Ile Val Leu His Lys Asn Gly Ala Asp Pro Asp Phe Lys 485 490 495 Cys Arg His Leu Gln Ile Glu Ile Glu Gly Leu Ile Asp Gln Met Ile 500 505 510 Asp Lys Thr Lys Val Glu Lys Ser Glu Ala Lys Ala Ala Glu Leu Glu 515 520 525 Lys Lys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Ala Arg His Glu Leu Gln Val Glu 530 535 540 Met Lys Lys Met Glu Ser Asp Phe Glu Gln Lys Leu Gln Asp Leu Gln 545 550 555 560 Gly Glu Lys Asp Ala Leu His Ser Glu Lys Gln Gln Ile Ala Thr Glu 565 570 575 Lys Gln Asp Leu Glu Ala Glu Val Ser Gln Leu Thr Gly Glu Val Ala 580 585 590 Lys Leu Thr Lys Glu Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Met Ala Ser Leu 595 600 605 Ser Ala Ala Ala Ile Thr Val Pro Pro Ser Val Pro Ser Arg Ala Pro 610 615 620 Val Pro Pro Ala Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ser Gly Thr Ile Ile Pro 625 630 635 640 Pro Pro Pro Ala Pro Gly Asp Ser Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro 645 650 655 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly Val Cys Ile Ser Ser 660 665 670 Pro Pro Ser Leu Pro Gly Gly Thr Ala Ile Ser Pro Pro Pro Pro Leu 675 680 685 Ser Gly Asp Ala Thr Ile Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Glu Gly Val 690 695 700 Gly Ile Pro Ser Pro Ser Ser Leu Pro Gly Gly Thr Ala Ile Pro Pro 705 710 715 720 Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ser Ala Arg Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro 725 730 735 Leu Pro Gly Ser Ala Gly Ile Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly 740 745 750 Glu Ala Gly Met Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Gly Pro Gly 755 760 765 Ile Pro Pro Pro Pro Pro Phe Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Pro Pro 770 775 780 Pro Pro Gly Met Gly Met Pro Pro Pro Pro Pro Phe Gly Phe Gly Val 785 790 795 800 Pro Ala Ala Pro Val Leu Pro Phe Gly Leu Thr Pro Lys Lys Leu Tyr 805 810 815 Lys Pro Glu Val Gln Leu Arg Arg Pro Asn Trp Ser Lys Leu Val Ala 820 825 830 Glu Asp Leu Ser Gln Asp Cys Phe Trp Thr Lys Val Lys Glu Asp Arg 835 840 845 Phe Glu Asn Asn Glu Leu Phe Ala Lys Leu Thr Leu Thr Phe Ser Ala 850 855 860 Gln Thr Lys Thr Ser Lys Ala Lys Lys Asp Gln Glu Gly Gly Glu Glu 865 870 875 880 Lys Lys Ser Val Gln Lys Lys Lys Val Lys Glu Leu Lys Val Leu Asp 885 890 895 Ser Lys Thr Ala Gln Asn Leu Ser Ile Phe Leu Gly Ser Phe Arg Met 900 905 910 Pro Tyr Gln Glu Ile Lys Asn Val Ile Leu Glu Val Asn Glu Ala Val 915 920 925 Leu Thr Glu Ser Met Ile Gln Asn Leu Ile Lys Gln Met Pro Glu Pro 930 935 940 Glu Gln Leu Lys Met Leu Ser Glu Leu Lys Asp Glu Tyr Asp Asp Leu 945 950 955 960 Ala Glu Ser Glu Gln Phe Gly Val Val Met Gly Thr Val Pro Arg Leu 965 970 975 Arg Pro Arg Leu Asn Ala Ile Leu Phe Lys Leu Gln Phe Ser Glu Gln 980 985 990 Val Glu Asn Ile Lys Pro Glu Ile Val Ser Val Thr Ala Ala Cys Glu 995 1000 1005 Glu Leu Arg Lys Ser Glu Ser Phe Ser Asn Leu Leu Glu Ile Thr Leu 1010 1015 1020 Leu Val Gly Asn Tyr Met Asn Ala Gly Ser Arg Asn Ala Gly Ala Phe 1025 1030 1035 1040 Gly Phe Asn Ile Ser Phe Leu Cys Lys Leu Arg Asp Thr Lys Ser Thr 1045 1050 1055 Asp Gln Lys Met Thr Leu Leu His Phe Leu Ala Glu Leu Cys Glu Asn 1060 1065 1070 Asp Tyr Pro Asp Val Leu Lys Phe Pro Asp Glu Leu Ala His Val Glu 1075 1080 1085 Lys Ala Ser Arg Val Ser Ala Glu Asn Leu Gln Lys Asn Leu Asp Gln 1090 1095 1100 Met Lys Lys Gln Ile Ser Asp Val Glu Arg Asp Val Gln Asn Phe Pro 1105 1110 1115 1120 Ala Ala Thr Asp Glu Lys Asp Lys Phe Val Glu Lys Met Thr Ser Phe 1125 1130 1135 Val Lys Asp Ala Gln Glu Gln Tyr Asn Lys Leu Arg Met Met His Ser 1140 1145 1150 Asn Met Glu Thr Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Phe Leu Phe Asp 1155 1160 1165 Pro Lys Lys Leu Ser Val Glu Glu Phe Phe Met Asp Leu His Asn Phe 1170 1175 1180 Arg Asn Met Phe Leu Gln Ala Val Lys Glu Asn Gln Lys Arg Arg Glu 1185 1190 1195 1200 Thr Glu Glu Lys Met Arg Arg Ala Lys Leu Ala Lys Glu Lys Ala Glu 1205 1210 1215 Lys Glu Arg Leu Glu Lys Gln Gln Lys Arg Glu Gln Leu Ile Asp Met 1220 1225 1230 Asn Ala Glu Gly Asp Glu Thr Gly Val Met Asp Ser Leu Leu Glu Ala 1235 1240 1245 Leu Gln Ser Gly Ala Ala Phe Arg Arg Lys Arg Gly Pro Arg Gln Ala 1250 1255 1260 Asn Arg Lys Ala Gly Cys Ala Val Thr Ser Leu Leu Ala Ser Glu Leu 1265 1270 1275 1280 Thr Lys Asp Asp Ala Met Ala Ala Val Pro Ala Lys Val Ser Lys Asn 1285 1290 1295 Ser Glu Thr Phe Pro Thr Ile Leu Glu Glu Ala Lys Glu Leu Val Gly 1300 1305 1310 Arg Ala Ser 1315
【０１４１】配列番号：４ 配列の長さ：５８２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：c ＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２８．．３９７２ 配列 AATATTGCGA GAGGCGGCGG CGGTGAA ATG CGA GCG AAG CCG CTC GGC TTC 51 Met Arg Ala Lys Pro Leu Gly Phe 1 5 CAG GGA AGG GGC GCC TGG GCT GGC GGA GCT GGA GGG AGG GAG GGA GTT 99 Gln Gly Arg Gly Ala Trp Ala Gly Gly Ala Gly Gly Arg Glu Gly Val 10 15 20 CTC GCA GAA GCA GGA AAG GGG AGG AGG GGG CCC GGA ATT CCG GGC GGC 147 Leu Ala Glu Ala Gly Lys Gly Arg Arg Gly Pro Gly Ile Pro Gly Gly 25 30 35 40 GTA GGC GCG GGG TCG CCG GCC AGC GTG AAC CGG GAC ATG GAG CCG CCC 195 Val Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Val Asn Arg Asp Met Glu Pro Pro 45 50 55 GGC GGG AGC CTG GGG CCC GGC CGC GGG ACC CGG GAC AAG AAG AAG GGC 243 Gly Gly Ser Leu Gly Pro Gly Arg Gly Thr Arg Asp Lys Lys Lys Gly 60 65 70 CGG AGC CCA GAT GAG CTG CCC TCG GCG GGC GGC GAC GGC GGC AAA TCT 291 Arg Ser Pro Asp Glu Leu Pro Ser Ala Gly Gly Asp Gly Gly Lys Ser 75 80 85 AAG AAA TTT CTG GAG AGA TTT ACC AGC ATG AGA ATT AAG AAG GAG AAG 339 Lys Lys Phe Leu Glu Arg Phe Thr Ser Met Arg Ile Lys Lys Glu Lys 90 95 100 GAA AAG CCC AAT TCT GCT CAT AGA AAT TCT TCT GCA TCA TAT GGG GAT 387 Glu Lys Pro Asn Ser Ala His Arg Asn Ser Ser Ala Ser Tyr Gly Asp 105 110 115 120 GAT CCC ACA GCA CAG TCA TTG CAA GAT GTT TCA GAT GAA CAA GTG CTG 435 Asp Pro Thr Ala Gln Ser Leu Gln Asp Val Ser Asp Glu Gln Val Leu 125 130 135 GTT CTC TTT GAA CAG ATG CTG CTG GAT ATG AAC CTG AAT GAG GAG AAA 483 Val Leu Phe Glu Gln Met Leu Leu Asp Met Asn Leu Asn Glu Glu Lys 140 145 150 CAG CAA CCT TTG AGG GAG AAG GAC ATC ATC ATC AAG AGG GAG ATG GTG 531 Gln Gln Pro Leu Arg Glu Lys Asp Ile Ile Ile Lys Arg Glu Met Val 155 160 165 TCC CAA TAC TTG TAC ACC TCC AAG GCT GGC ATG AGC CAG AAG GAG AGC 579 Ser Gln Tyr Leu Tyr Thr Ser Lys Ala Gly Met Ser Gln Lys Glu Ser 170 175 180 TCT AAG TCT GCC ATG ATG TAT ATT CAG GAG TTG AGG TCA GGC TTG CGG 627 Ser Lys Ser Ala Met Met Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Ser Gly Leu Arg 185 190 195 200 GAT ATG CCT CTG CTC AGC TGC CTG GAG TCC CTT CGT GTG TCT CTC AAC 675 Asp Met Pro Leu Leu Ser Cys Leu Glu Ser Leu Arg Val Ser Leu Asn 205 210 215 AAC AAC CCT GTC AGT TGG GTG CAA ACA TTT GGT GCT GAA GGC TTG GCC 723 Asn Asn Pro Val Ser Trp Val Gln Thr Phe Gly Ala Glu Gly Leu Ala 220 225 230 TCC TTA TTG GAC ATT CTT AAA CGA CTT CAT GAT GAG AAA GAA GAG ACT 771 Ser Leu Leu Asp Ile Leu Lys Arg Leu His Asp Glu Lys Glu Glu Thr 235 240 245 GCT GGG AGT TAC GAT AGC CGG AAC AAG CAT GAG ATC ATT CGC TGC TTG 819 Ala Gly Ser Tyr Asp Ser Arg Asn Lys His Glu Ile Ile Arg Cys Leu 250 255 260 AAA GCT TTT ATG AAC AAC AAG TTT GGA ATC AAG ACC ATG TTG GAG ACA 867 Lys Ala Phe Met Asn Asn Lys Phe Gly Ile Lys Thr Met Leu Glu Thr 265 270 275 280 GAA GAA GGA ATC CTA CTG CTG GTC AGA GCC ATG GAT CCT GCT GTT CCC 915 Glu Glu Gly Ile Leu Leu Leu Val Arg Ala Met Asp Pro Ala Val Pro 285 290 295 AAC ATG ATG ATT GAT GCA GCT AAG CTG CTT TCT GCT CTT TGT ATT CTA 963 Asn Met Met Ile Asp Ala Ala Lys Leu Leu Ser Ala Leu Cys Ile Leu 300 305 310 CCG CAG CCA GAG GAC ATG AAT GAA AGG 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GAG ATG GAT GAC TTT AAT GAA GTC TTT CAG ATT CTC 1347 Asp Ile Arg Met Glu Met Asp Asp Phe Asn Glu Val Phe Gln Ile Leu 425 430 435 440 TTA AAC ACA GTG AAG GAT TCA AAG GCA GAG CCA CAC TTC CTT TCC ATC 1395 Leu Asn Thr Val Lys Asp Ser Lys Ala Glu Pro His Phe Leu Ser Ile 445 450 455 CTG CAG CAC TTA CTC TTG GTC CGA AAT GAC TAT GAG GCC AGA CCT CAG 1443 Leu Gln His Leu Leu Leu Val Arg Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Pro Gln 460 465 470 TAC TAT AAG TTG ATT GAA GAA TGT ATT TCC CAG ATA GTT CTG CAC AAG 1491 Tyr Tyr Lys Leu Ile Glu Glu Cys Ile Ser Gln Ile Val Leu His Lys 475 480 485 AAC GGG GCT GAT CCT GAC TTC AAG TGC CGG CAC CTC CAG ATT GAG ATT 1539 Asn Gly Ala Asp Pro Asp Phe Lys Cys Arg His Leu Gln Ile Glu Ile 490 495 500 GAG GGA TTA ATT GAT CAA ATG ATT GAT AAG ACA AAG GTG GAG AAA TCT 1587 Glu Gly Leu Ile Asp Gln Met Ile Asp Lys Thr Lys Val Glu Lys Ser 505 510 515 520 GAA GCC AAA GCT GCA GAG CTG GAA AAG AAG TTG GAC TCA GAG TTA ACA 1635 Glu Ala Lys Ala Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asp Ser Glu Leu Thr 525 530 535 GCC CGA CAT GAG CTA CAG GTG GAA ATG AAA AAG ATG GAA AGT GAC TTT 1683 Ala Arg His Glu Leu Gln Val Glu Met Lys Lys Met Glu Ser Asp Phe 540 545 550 GAG CAG AAG CTT CAA GAT CTT CAG GGA GAA AAA GAT GCA CTG CAT TCT 1731 Glu Gln Lys Leu Gln Asp Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Leu His Ser 555 560 565 GAA AAG CAG CAA ATT GCC ACA GAG AAA CAG GAC CTG GAA GCA GAG GTG 1779 Glu Lys Gln Gln Ile Ala Thr Glu Lys Gln Asp Leu Glu Ala Glu Val 570 575 580 TCC CAG CTC ACA GGA GAG GTT GCC AAG CTG ACA AAG GAA CTG GAA GAT 1827 Ser Gln Leu Thr Gly Glu Val Ala Lys Leu Thr Lys Glu Leu Glu Asp 585 590 595 600 GCC AAG AAA GAA ATG GCT TCC CTC TCT GCG GCA GCT ATT ACT GTA CCT 1875 Ala Lys Lys Glu Met Ala Ser Leu Ser Ala Ala Ala Ile Thr Val Pro 605 610 615 CCT TCT GTT CCT AGT CGT GCT CCT GTT CCC CCT GCC CCT CCT TTA CCT 1923 Pro Ser Val Pro Ser Arg Ala Pro Val Pro Pro Ala Pro Pro Leu Pro 620 625 630 GGT GAC TCT GGC ACT ATT ATT CCA CCA CCA CCT GCT CCT GGG GAT AGT 1971 Gly Asp Ser Gly Thr Ile Ile Pro Pro Pro Pro Ala 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Leu Thr Leu Thr Phe Ser Ala Gln Thr Lys Thr Ser Lys Ala Lys 860 865 870 AAG GAT CAA GAA GGT GGA GAA GAA AAG AAA TCT GTG CAA AAG AAA AAA 2691 Lys Asp Gln Glu Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Val Gln Lys Lys Lys 875 880 885 GTA AAA GAG TTA AAG GTG TTG GAT TCA AAG ACA GCC CAG AAT CTC TCA 2739 Val Lys Glu Leu Lys Val Leu Asp Ser Lys Thr Ala Gln Asn Leu Ser 890 895 900 ATC TTT TTG GGT TCC TTC CGC ATG CCC TAT CAA GAG ATT AAG AAT GTC 2787 Ile Phe Leu Gly Ser Phe Arg Met Pro Tyr Gln Glu Ile Lys Asn Val 905 910 915 920 ATC CTG GAG GTG AAT GAG GCT GTT CTG ACT GAG TCT ATG ATC CAG AAC 2835 Ile Leu Glu Val Asn Glu Ala Val Leu Thr Glu Ser Met Ile Gln Asn 925 930 935 CTC ATT AAG CAA ATG CCA GAG CCA GAG CAG TTA AAA ATG CTT TCT GAA 2883 Leu Ile Lys Gln Met Pro Glu Pro Glu Gln Leu Lys Met Leu Ser Glu 940 945 950 CTG AAG GAT GAA TAT GAT GAC CTG GCT GAG TCA GAG CAG TTT GGC GTG 2931 Leu Lys Asp Glu Tyr Asp Asp Leu Ala Glu Ser Glu Gln Phe Gly Val 955 960 965 GTG ATG GGC ACT GTG CCC CGA CTG CGG CCT CGC CTC AAT 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CTT GCC CAT GTG GAG AAA GCC AGC CGA GTT TCT GCT GAA 3315 Pro Asp Glu Leu Ala His Val Glu Lys Ala Ser Arg Val Ser Ala Glu 1085 1090 1095 AAC TTG CAA AAG AAC CTA GAT CAG ATG AAG AAA CAA ATT TCT GAT GTG 3363 Asn Leu Gln Lys Asn Leu Asp Gln Met Lys Lys Gln Ile Ser Asp Val 1100 1105 1110 GAA CGT GAT GTT CAG AAT TTC CCA GCT GCC ACA GAT GAA AAA GAC AAG 3411 Glu Arg Asp Val Gln Asn Phe Pro Ala Ala Thr Asp Glu Lys Asp Lys 1115 1120 1125 TTT GTT GAA AAA ATG ACC AGC TTT GTG AAG GAT GCA CAG GAA CAG TAT 3459 Phe Val Glu Lys Met Thr Ser Phe Val Lys Asp Ala Gln Glu Gln Tyr 1130 1135 1140 AAC AAG CTG CGG ATG ATG CAT TCT AAC ATG GAG ACC CTC TAT AAG GAG 3507 Asn Lys Leu Arg Met Met His Ser Asn Met Glu Thr Leu Tyr Lys Glu 1145 1150 1155 1160 CTG GGC GAG TAC TTC CTC TTT GAC CCC AAG AAG TTG TCT GTT GAA GAA 3555 Leu Gly Glu Tyr Phe Leu Phe Asp Pro Lys Lys Leu Ser Val Glu Glu 1165 1170 1175 TTT TTC ATG GAT CTT CAC AAT TTT CGG AAT ATG TTT TTG CAA GCA GTC 3603 Phe Phe Met Asp Leu His Asn Phe Arg Asn Met Phe Leu Gln Ala Val 1180 1185 1190 AAG GAG AAC CAG AAG CGG CGG GAG ACA GAA GAA AAG ATG AGG CGA GCA 3651 Lys Glu Asn Gln Lys Arg Arg Glu Thr Glu Glu Lys Met Arg Arg Ala 1195 1200 1205 AAA CTA GCC AAG GAG AAG GCA GAG AAG GAG CGG CTA GAG AAG CAG CAG 3699 Lys Leu Ala Lys Glu Lys Ala Glu Lys Glu Arg Leu Glu Lys Gln Gln 1210 1215 1220 AAG AGA GAG CAA CTC ATA GAC ATG AAT GCA GAG GGC GAT GAG ACA GGT 3747 Lys Arg Glu Gln Leu Ile Asp Met Asn Ala Glu Gly Asp Glu Thr Gly 1225 1230 1235 1240 GTG ATG GAC AGT CTT CTA GAA GCC CTG CAG TCA GGG GCA GCA TTC CGA 3795 Val Met Asp Ser Leu Leu Glu Ala Leu Gln Ser Gly Ala Ala Phe Arg 1245 1250 1255 CGG AAG AGA GGG CCC CGT CAA GCC AAC AGG AAG GCC GGG TGT GCA GTC 3843 Arg Lys Arg Gly Pro Arg Gln Ala Asn Arg Lys Ala Gly Cys Ala Val 1260 1265 1270 ACA TCT CTG CTA GCT TCG GAG CTG ACC AAG GAT GAT GCC ATG GCT GCT 3891 Thr Ser Leu Leu Ala Ser Glu Leu Thr Lys Asp Asp Ala Met Ala Ala 1275 1280 1285 GTT CCT GCC AAG GTG TCC AAG AAC AGT GAG ACA TTC CCC ACA ATC CTT 3939 Val Pro 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【０１４２】配列番号：５ 配列の長さ：５８２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：c ＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 他の情報：配列番号４の配列のマイナス鎖 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTTAC TGTTTCAATG CTTTATTAAC AGTTGGAAAC AAAACCAACA 60 AACTGGAGGT GATGACATCC CAGAAGCCTA TGAGGCAAGG GAAATAGGTT TGCATTTTGT 120 CCCTCACACC TCTCTCTCTC TCTCTTTTTT TTTATTAAAT GCATCTTAGC AAAAGTAGAT 180 TAAAAAAGAA AGGGTCAAAG CCCCAGATGT CAGCGAGCAG GGAGGAGGTG ACCCAGGGGA 240 GCAACAGACG CCCTGCATCA GAGTCCTCCC AGGAATAGTC CAAAGGAGCT GCTCTTGCCC 300 CTTTATACAC AAGCGCCAGC AACCAAAACC CTCCCTCCTG GCAATAAGGC CTCACTATAG 360 TTGCCCTCAT GCTTCCTAAG CTCTCTCTTG CTCTAATAAC TCTAATTCTG GGCCAAGCCC 420 AAGAGTGCCA TTCTTTCTTC CTAGCTGGGG ATGGAAAGCT GAGAGGGGCA CAAGGAGGGC 480 AAAAGTATCA CCCTAAGCCA GAGAATTGCA GCTTCCTGTG GTTGGGGCCA CCAAACAGTT 540 CAGTGTGCCC ACCCACTTCT CTTTTAGAAG AGAGCTGGGG TACAGTGTAT GAAGGCACTC 600 CTGGTGCCCA GTTCCCCAGA ATGTCCAGTT AGCATCTGCA CATTTGGCTT GATACATTTA 660 TACATTTATA AAAAACTCTG TGGTCTTAGA GTTCCTGCTA CTCTTAGGCC TGGCCCAGCT 720 CAACCAGAGA AGGGGTTCCT CCTGTGTCGG ATTCCCTGGG AGAGAGGATC TGCCTTGGAC 780 TCAAGGGTCC AGAAGGTCCA GGGGCACATT CAGGATTGGG CCTGTGAGAA GAAATCCCAG 840 AACTCTGTAA CCTGCCACCA AAGCTTCTTA CATTATGGAG GGGAAAGGGG GAAGGAACAG 900 TTTTCTTTAA AAAAATTTTT TTTTTCATAC AAAAATAGAT CCATTTGCAA AACAATTTCT 960 CAGCCAGGAG GCTCCACCTC CCATTTCCTT GTAGACAGAG GGTGAGGTGT TGGGATGGTC 1020 ACAGTACAAC CCATAGTCCA GATGAGATGC ACCAAAGCTC AGGGAAGGCA TGAGGAGGGA 1080 AGGTGGCTCA GTAGCCTGGG GTTGGTGCAG AGCGTCCAGA GAGGCAAGGG CATAAAGCGT 1140 GGCAGAAGCT GGGGGCAGGT CCCACACTGT CGCTATGCCC TGCCTGCCTG CCCACAGGCT 1200 CTGGCCTGGG CCACAGCACA GCAGGGAAAC TGGTCCAGAT CCTTTGCTTT GGAGGCCTTT 1260 CCCAGGAAGG TGGGGTAAAG GTGGGATTTG CTCCCTGCTT CCTTAGGAGC AGCTCCCAGT 1320 GCCACACCAC TAATAATAAA TAACCACAGC CAGGAGAGGG AAGAGCAGAG ACAACAGCAA 1380 TGAAAGGAGG GATCTAGCCC AAAGGTTTAC AAGCCCCATG CTATTCTCAG GGCCAGAGAA 1440 ACCACAAAAG AAAAGCACAA ATCCAGCAAG ACTGACCTAG GGGGGAAAGC CCATTAGAAA 1500 GTCAGGGCTG AGAAAAAGCA GGCTGGGCCT TGTCTGAGAT GAGGCCCTCT GAGTAACAGA 1560 GAGGAGACAG GGTTAAGGCA GCAAACATGG ACCCTGCTTT GGTAATACAA CAGCCAGGGC 1620 TGGCTAAGTC GGGCTCAGGC CTCCCCTGCA CTGCCCTTTC CTTCTGGCCT CCAGGCAGCT 1680 GAAGCTGTAT GTGATGTTGA GAGAGCAGCA GGCCAGAGAG AAAGACAGGG TCAGGGTGGT 1740 GGGAGTGGCC ACCCCAGAGG AATATCCCCT TGAGCCTTTA GGCACATGCT GCAGGGCAGG 1800 ACAGTCTGCG GCTCCGCTGA GGAGCTGCCG CGGTCACAGG ACCCACATTA GCTTGCACGG 1860 CCAACCAACT CCTTGGCTTC CTCAAGGATT GTGGGGAATG TCTCACTGTT CTTGGACACC 1920 TTGGCAGGAA CAGCAGCCAT GGCATCATCC TTGGTCAGCT CCGAAGCTAG CAGAGATGTG 1980 ACTGCACACC CGGCCTTCCT GTTGGCTTGA CGGGGCCCTC TCTTCCGTCG GAATGCTGCC 2040 CCTGACTGCA GGGCTTCTAG AAGACTGTCC ATCACACCTG TCTCATCGCC CTCTGCATTC 2100 ATGTCTATGA GTTGCTCTCT CTTCTGCTGC TTCTCTAGCC GCTCCTTCTC TGCCTTCTCC 2160 TTGGCTAGTT TTGCTCGCCT CATCTTTTCT TCTGTCTCCC GCCGCTTCTG GTTCTCCTTG 2220 ACTGCTTGCA AAAACATATT CCGAAAATTG TGAAGATCCA TGAAAAATTC TTCAACAGAC 2280 AACTTCTTGG GGTCAAAGAG GAAGTACTCG CCCAGCTCCT TATAGAGGGT CTCCATGTTA 2340 GAATGCATCA TCCGCAGCTT GTTATACTGT TCCTGTGCAT CCTTCACAAA GCTGGTCATT 2400 TTTTCAACAA ACTTGTCTTT TTCATCTGTG GCAGCTGGGA AATTCTGAAC ATCACGTTCC 2460 ACATCAGAAA TTTGTTTCTT CATCTGATCT AGGTTCTTTT GCAAGTTTTC AGCAGAAACT 2520 CGGCTGGCTT TCTCCACATG GGCAAGCTCG TCTGGAAACT TGAGGACATC GGGATAGTCA 2580 TTCTCACACA ACTCAGCCAA GAAGTGTAAC AACGTCATCT TCTGATCTGT GGACTTGGTG 2640 TCTCGAAGCT TACAGAGGAA GCTGATATTG AAGCCAAAAG CACCAGCATT TCTGGAGCCA 2700 GCATTCATGT AATTTCCAAC AAGCAAGGTA ATCTCTAGGA GATTGGAAAA GCTCTCACTC 2760 TTACGTAACT CCTCACATGC AGCAGTGACA GACACAATCT CTGGCTTGAT ATTCTCCACT 2820 TGCTCGCTGA ATTGTAGCTT GAAGAGAATG GCATTGAGGC GAGGCCGCAG TCGGGGCACA 2880 GTGCCCATCA CCACGCCAAA CTGCTCTGAC TCAGCCAGGT CATCATATTC ATCCTTCAGT 2940 TCAGAAAGCA TTTTTAACTG CTCTGGCTCT GGCATTTGCT TAATGAGGTT CTGGATCATA 3000 GACTCAGTCA GAACAGCCTC ATTCACCTCC AGGATGACAT TCTTAATCTC TTGATAGGGC 3060 ATGCGGAAGG AACCCAAAAA GATTGAGAGA TTCTGGGCTG TCTTTGAATC CAACACCTTT 3120 AACTCTTTTA CTTTTTTCTT TTGCACAGAT TTCTTTTCTT CTCCACCTTC TTGATCCTTC 3180 TTGGCTTTGG AAGTCTTGGT CTGGGCAGAG AAGGTAAGGG TAAGTTTGGC GAAAAGTTCA 3240 TTGTTCTCAA AGCGGTCCTC CTTCACCTTT GTCCAGAAGC AGTCCTGGGA GAGGTCCTCA 3300 GCCACAAGCT TGGACCAGTT TGGCCTCCGG AGCTGCACCT CTGGCTTATA AAGCTTTTTG 3360 GGGGTTAATC CAAATGGCAG AACTGGGGCT GCAGGAACTC CAAATCCAAA TGGGGGAGGT 3420 GGAGGCATAC CCATTCCGGG TGGAGGTGGA GGAATGCCAG GGCCTCCGGG AAATGGAGGA 3480 GGTGGAGGGA TTCCAGGACC ACCAGGAAGA GGGGGAGGAG GAGGTGGCAT TCCTGCTTCT 3540 CCAGGCAAGG GAGGAGGTGG GGGGGGAATT CCAGCACTCC CAGGCAAAGG AGGTGGTGGT 3600 GGGGGGATTC TAGCACTCCC AGGCAAAGGA GGAGGTGGGG GGATGGCAGT ACCTCCAGGC 3660 AAAGAAGAGG GTGAAGGGAT GCCAACACCC TCAGGCAAAG GAGGGGGTGG AGGGATGGTA 3720 GCATCCCCAG ACAAAGGAGG GGGTGGAGAG ATAGCAGTAC CTCCAGGTAA AGAAGGGGGT 3780 GAGGAGATGC AAACACCCCC AGGCAAAGGA GGTGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA 3840 GGAGGAGTGG TACTATCCCC AGGAGCAGGT GGTGGTGGAA TAATAGTGCC AGAGTCACCA 3900 GGTAAAGGAG GGGCAGGGGG AACAGGAGCA CGACTAGGAA CAGAAGGAGG TACAGTAATA 3960 GCTGCCGCAG AGAGGGAAGC CATTTCTTTC TTGGCATCTT CCAGTTCCTT TGTCAGCTTG 4020 GCAACCTCTC CTGTGAGCTG GGACACCTCT GCTTCCAGGT CCTGTTTCTC TGTGGCAATT 4080 TGCTGCTTTT CAGAATGCAG TGCATCTTTT TCTCCCTGAA GATCTTGAAG CTTCTGCTCA 4140 AAGTCACTTT CCATCTTTTT CATTTCCACC TGTAGCTCAT GTCGGGCTGT TAACTCTGAG 4200 TCCAACTTCT TTTCCAGCTC TGCAGCTTTG GCTTCAGATT TCTCCACCTT TGTCTTATCA 4260 ATCATTTGAT CAATTAATCC CTCAATCTCA ATCTGGAGGT GCCGGCACTT GAAGTCAGGA 4320 TCAGCCCCGT TCTTGTGCAG AACTATCTGG GAAATACATT CTTCAATCAA CTTATAGTAC 4380 TGAGGTCTGG CCTCATAGTC ATTTCGGACC AAGAGTAAGT GCTGCAGGAT GGAAAGGAAG 4440 TGTGGCTCTG CCTTTGAATC CTTCACTGTG TTTAAGAGAA TCTGAAAGAC TTCATTAAAG 4500 TCATCCATCT CCATGCGAAT GTCATCCAGC CGTCCCTTCA GGTCATAGGA ATCCTCTTCC 4560 CCTTGTTCAT CAAACACATT TAGTTGCACT CTCATATCTT CATTTTCAAT CTCTCGAAGG 4620 TCCTGCAACA CCTGATGTAG CCCCAAACGC ATCAGTTCAC TTCTGATGTG AACTCGGAAG 4680 TCAAGTTCCT CCGCTGGTGT GATGAGAGCA TTGATCAGCT GTAGGCATCC AACCTTCAGT 4740 GCAATAGTGG TTCCACTTTT TAATCCATCC AGCAGCGGCT GGAAACGTTC CACTTCATCC 4800 ATCTCAGCTC TTTCTGTCAT TGCCTCCAAA ACCCTTTCAT TCATGTCCTC TGGCTGCGGT 4860 AGAATACAAA GAGCAGAAAG CAGCTTAGCT GCATCAATCA TCATGTTGGG AACAGCAGGA 4920 TCCATGGCTC TGACCAGCAG TAGGATTCCT TCTTCTGTCT CCAACATGGT CTTGATTCCA 4980 AACTTGTTGT TCATAAAAGC TTTCAAGCAG CGAATGATCT CATGCTTGTT CCGGCTATCG 5040 TAACTCCCAG CAGTCTCTTC TTTCTCATCA TGAAGTCGTT TAAGAATGTC CAATAAGGAG 5100 GCCAAGCCTT CAGCACCAAA TGTTTGCACC CAACTGACAG GGTTGTTGTT GAGAGACACA 5160 CGAAGGGACT CCAGGCAGCT GAGCAGAGGC ATATCCCGCA AGCCTGACCT CAACTCCTGA 5220 ATATACATCA TGGCAGACTT AGAGCTCTCC TTCTGGCTCA TGCCAGCCTT GGAGGTGTAC 5280 AAGTATTGGG ACACCATCTC CCTCTTGATG ATGATGTCCT TCTCCCTCAA AGGTTGCTGT 5340 TTCTCCTCAT TCAGGTTCAT ATCCAGCAGC ATCTGTTCAA AGAGAACCAG CACTTGTTCA 5400 TCTGAAACAT CTTGCAATGA CTGTGCTGTG GGATCATCCC CATATGATGC AGAAGAATTT 5460 CTATGAGCAG AATTGGGCTT TTCCTTCTCC TTCTTAATTC TCATGCTGGT AAATCTCTCC 5520 AGAAATTTCT TAGATTTGCC GCCGTCGCCG CCCGCCGAGG GCAGCTCATC TGGGCTCCGG 5580 CCCTTCTTCT TGTCCCGGGT CCCGCGGCCG GGCCCCAGGC TCCCGCCGGG CGGCTCCATG 5640 TCCCGGTTCA CGCTGGCCGG CGACCCCGCG CCTACGCCGC CCGGAATTCC GGGCCCCCTC 5700 CTCCCCTTTC CTGCTTCTGC GAGAACTCCC TCCCTCCCTC CAGCTCCGCC AGCCCAGGCG 5760 CCCCTTCCCT GGAAGCCGAG CGGCTTCGCT CGCATTTCAC CGCCGCCGCC TCTCGCAATA 5820 TT 5822
【０１４３】配列番号：６ 配列の長さ：７５５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ 存在位置：９５．．７２７ 配列 ATATGAGAGT GCAACTAAAT GTGTTTGATG AACAAGGGGA AGAGGATTCC TATGACCTGA 60 AGGGACGGCT GGATGACATT CGCATGGAGA TGGAATATCC TTTTGCTGAC TAGGTTCAAG 120 GCAGATGAGA CATTCATTGT ATTTAGTTCC CTGATCCCTG TGTGGAATGG TTTGGGAGAT 180 GATGACTCAG AACAGAGCAT CAGGCTTATG TGTCTTCTCA TTAAATAAGG CAGGTGTATT 240 TTTATTGCGC TGGCTTTACT TAGCTTATCA TAGATCAGGG AAGTCAGTAA AGGTGATCTG 300 AGGGTTGTTG AGCATGGAAG CCATCAAAAT CAGTGTAAAC TTCCTAGAAT GTGATAGCTT 360 AGCTTACTAA GATGTAGAAC TGGCTTTTAG AGATGTTTGG ACTGACAGAG GGAGTAATTT 420 AGTTACCTGT TAATATTTTC AGTAAGTGAC TTTGAGGCAG TTACCTCTTA TTTTCTGTCT 480 ACTGCCTGAT CTTCAAGCCA AGTACTTACT AGGAATCCTC TGTGTGTATA GTACCACCCA 540 ATTCACTGGT CCCTTAAAGG ACGTTTTAGA AAGCTTAAAG TTTCTGGTGA TGTTTACAGG 600 AAGAACAGCC AGTAGAATGG AAGTGGTGTC TTGCTACTTT TCCCTAGCTT TTTCAAGAGT 660 TAAATAAGCC ACCTGTCAAA CATAATTTCT GCATATTTGC TTTCCTTAGC CTATTTCCCT 720 TTTCCACTGA CTTTAATGAA GTCTTTCAGA TTCTC 755
【０１４４】配列番号：７ 配列の長さ：７５５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 他の情報：配列番号６の配列のマイナス鎖 配列 GAGAATCTGA AAGACTTCAT TAAAGTCAGT GGAAAAGGGA AATAGGCTAA GGAAAGCAAA 60 TATGCAGAAA TTATGTTTGA CAGGTGGCTT ATTTAACTCT TGAAAAAGCT AGGGAAAAGT 120 AGCAAGACAC CACTTCCATT CTACTGGCTG TTCTTCCTGT AAACATCACC AGAAACTTTA 180 AGCTTTCTAA AACGTCCTTT AAGGGACCAG TGAATTGGGT GGTACTATAC ACACAGAGGA 240 TTCCTAGTAA GTACTTGGCT TGAAGATCAG GCAGTAGACA GAAAATAAGA GGTAACTGCC 300 TCAAAGTCAC TTACTGAAAA TATTAACAGG TAACTAAATT ACTCCCTCTG TCAGTCCAAA 360 CATCTCTAAA AGCCAGTTCT ACATCTTAGT AAGCTAAGCT ATCACATTCT AGGAAGTTTA 420 CACTGATTTT GATGGCTTCC ATGCTCAACA ACCCTCAGAT CACCTTTACT GACTTCCCTG 480 ATCTATGATA AGCTAAGTAA AGCCAGCGCA ATAAAAATAC ACCTGCCTTA TTTAATGAGA 540 AGACACATAA GCCTGATGCT CTGTTCTGAG TCATCATCTC CCAAACCATT CCACACAGGG 600 ATCAGGGAAC TAAATACAAT GAATGTCTCA TCTGCCTTGA ACCTAGTCAG CAAAAGGATA 660 TTCCATCTCC ATGCGAATGT CATCCAGCCG TCCCTTCAGG TCATAGGAAT CCTCTTCCCC 720 TTGTTCATCA AACACATTTA GTTGCACTCT CATAT 755
【図１】クローン５０とＲｈｏタンパク質とのツー・ハ
イブリッド・システムでの結合を示した写真である。Ｖ
ａｌ、Ａｓｎ、ＷＴおよびＣｄｃ４２は、それぞれ、Ｒ
ｈｏＡVal14 、ＲｈｏＡAsn19 、野生型ＲｈｏＡおよび
Ｃｄｃ４２Ｈｓを示している。ΔＡｓｎおよびΔＷＴ
は、Ａｌａ１８１でトランケートしたＲｈｏAsn19およ
び野生型ＲｈｏＡを示している。ラミン（Lamin ）およ
び他のタンパク質と融合していないＬｅｘ結合ドメイン
を、ネガティブコントロールとして用いた。Ａｌａ
１８１でトランケートしたＲｈｏＡVal14 は、他のタン
パク質と融合していないＶＰ１６活性化ドメインとも結
合して高ＬａｃＺ活性を示したので、この実験では使わ
なかった。
イブリッド・システムでの結合を示した写真である。Ｖ
ａｌ、Ａｓｎ、ＷＴおよびＣｄｃ４２は、それぞれ、Ｒ
ｈｏＡVal14 、ＲｈｏＡAsn19 、野生型ＲｈｏＡおよび
Ｃｄｃ４２Ｈｓを示している。ΔＡｓｎおよびΔＷＴ
は、Ａｌａ１８１でトランケートしたＲｈｏAsn19およ
び野生型ＲｈｏＡを示している。ラミン（Lamin ）およ
び他のタンパク質と融合していないＬｅｘ結合ドメイン
を、ネガティブコントロールとして用いた。Ａｌａ
１８１でトランケートしたＲｈｏＡVal14 は、他のタン
パク質と融合していないＶＰ１６活性化ドメインとも結
合して高ＬａｃＺ活性を示したので、この実験では使わ
なかった。
【図２】単離されたｐ１４０ｍＤｉａを模式的に示した
図である。ＯＲＦは点のボックスで示した。ヌクレオチ
ド８７番目のＴからＣへの変換および２２２９番目のＣ
からＴへのヌクレオチドの変換が、それぞれ５０３およ
びＥ７３ｃＤＮＡ中に見出された。ライブラリーａ、ｂ
およびＣは、それぞれマウス脳ライブラリー９３６３０
９（ストラタジーン社）、ＭＬ３０００ａ（クロンテッ
ク社）およびマウス胚ライブラリーを示している。Ｅ７
３ ｃＤＮＡには９アミノ酸の挿入が認められた。
図である。ＯＲＦは点のボックスで示した。ヌクレオチ
ド８７番目のＴからＣへの変換および２２２９番目のＣ
からＴへのヌクレオチドの変換が、それぞれ５０３およ
びＥ７３ｃＤＮＡ中に見出された。ライブラリーａ、ｂ
およびＣは、それぞれマウス脳ライブラリー９３６３０
９（ストラタジーン社）、ＭＬ３０００ａ（クロンテッ
ク社）およびマウス胚ライブラリーを示している。Ｅ７
３ ｃＤＮＡには９アミノ酸の挿入が認められた。
【図３】ｐ１４０ｍＤｉａの推定アミノ酸配列を示した
図である。ツー・ハイブリッド・システムで得られたク
ローンの配列は太い下線で、プロリンリッチ領域の繰り
返し構造は点下線で、ＦＨ−２領域は細い下線で、それ
ぞれ示した。矢じり印は９アミノ酸の挿入箇所を示して
いる。
図である。ツー・ハイブリッド・システムで得られたク
ローンの配列は太い下線で、プロリンリッチ領域の繰り
返し構造は点下線で、ＦＨ−２領域は細い下線で、それ
ぞれ示した。矢じり印は９アミノ酸の挿入箇所を示して
いる。
【図４】ｐ１４０ｍＤｉａおよびＦＨ領域を含む他の蛋
白質との模式的な構造比較を示す。ｐ１４０ｍＤｉａの
配列をDrosophilaの diaphanous 、S.cerevisiaeのＢｎ
ｉ１ｐ、ラットｆｏｒｍｉｎ、およびDrosophilaのcapp
ucino と比較した。比較は推定Ｒｈｏ結合領域（Ｒｈｏ
-binding）、Ｎー末端からプロリンリッチ領域（poly-p
roline）、ＦＨ−２領域、プロリンリッチ領域からＣ末
端領域で行った。アミノ酸の同一性は％で示した。フォ
ルミンとカプチーノのＮー末端領域（＊で示した）はホ
モロジーが認められなかった。示した全ての配列は、中
間部分にポリープロリンストレッチを持ち、Ｃ末端側の
半分にホモロジーを持っている。
白質との模式的な構造比較を示す。ｐ１４０ｍＤｉａの
配列をDrosophilaの diaphanous 、S.cerevisiaeのＢｎ
ｉ１ｐ、ラットｆｏｒｍｉｎ、およびDrosophilaのcapp
ucino と比較した。比較は推定Ｒｈｏ結合領域（Ｒｈｏ
-binding）、Ｎー末端からプロリンリッチ領域（poly-p
roline）、ＦＨ−２領域、プロリンリッチ領域からＣ末
端領域で行った。アミノ酸の同一性は％で示した。フォ
ルミンとカプチーノのＮー末端領域（＊で示した）はホ
モロジーが認められなかった。示した全ての配列は、中
間部分にポリープロリンストレッチを持ち、Ｃ末端側の
半分にホモロジーを持っている。
【図５】ノザンブロッティングによるマウスの種々の組
織におけるｐ１４０ｍＤｉａの組織分布を示したＲＮＡ
ブロット（電気泳動写真）である。 ｈｅａｒｔ：心臓、ｌｕｎｇ：肺、ｂｒａｉｎ：脳、ｋ
ｉｄｎｅｙ：腎臓、ｔｅｓｔｉｓ：睾丸、ｓｋｅｌｅｔ
ａｌ ｍｕｓｃｌｅ：骨格筋、ｔｈｙｍｕｓ：胸腺、ｓ
ｐｌｅｅｎ：脾臓、ｌｉｖｅｒ：肝臓、ｓｔｏｍａｃ
ｈ：胃、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：小腸、ｃｏ
ｌｏｎ：結腸。
織におけるｐ１４０ｍＤｉａの組織分布を示したＲＮＡ
ブロット（電気泳動写真）である。 ｈｅａｒｔ：心臓、ｌｕｎｇ：肺、ｂｒａｉｎ：脳、ｋ
ｉｄｎｅｙ：腎臓、ｔｅｓｔｉｓ：睾丸、ｓｋｅｌｅｔ
ａｌ ｍｕｓｃｌｅ：骨格筋、ｔｈｙｍｕｓ：胸腺、ｓ
ｐｌｅｅｎ：脾臓、ｌｉｖｅｒ：肝臓、ｓｔｏｍａｃ
ｈ：胃、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：小腸、ｃｏ
ｌｏｎ：結腸。
【図６】抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体の特異性を示した電気
泳動写真である。抗血清（ＡＰ５０）はツー・ハイブリ
ッド・システムで得られたクローン５０がコードするペ
プチドに対するもので、その特異性を、ＩＰＴＧで誘導
前（レーン１）および誘導後（レーン２）の組換えタン
パク質を発現している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の全ライ
ゼート、あるいはＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ｃ
ｅｌｌｓ）の全ライゼート（レーン３）に対するウエス
タンブロッティングにより検討した。レーン４は細胞の
全ライゼートをＣＢＢ染色したものを示している。
泳動写真である。抗血清（ＡＰ５０）はツー・ハイブリ
ッド・システムで得られたクローン５０がコードするペ
プチドに対するもので、その特異性を、ＩＰＴＧで誘導
前（レーン１）および誘導後（レーン２）の組換えタン
パク質を発現している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の全ライ
ゼート、あるいはＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ｃ
ｅｌｌｓ）の全ライゼート（レーン３）に対するウエス
タンブロッティングにより検討した。レーン４は細胞の
全ライゼートをＣＢＢ染色したものを示している。
【図７】ＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏタンパク質によるｐ１
４０ｍＤｉａの沈降を示した電気泳動写真である。Ｓｗ
ｉｓｓ ３Ｔ３細胞の全ライゼートを、ＧＴＰγＳ結合
型あるいはＧＤＰ結合型のＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＧＳＴ−Ｒ
ａｃ、ＧＳＴ−Ｃｄｃ４２あるいはＧＳＴとともにイン
キュベートした。結合したタンパク質をグルタチオンア
ガロースビーズで沈降させ、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体を
用いたイムノブロッティングにより解析した。レーン９
（cell lysates）では、細胞の全ライゼート中のｐ１４
０ｍＤｉａを抗体で検出した。
４０ｍＤｉａの沈降を示した電気泳動写真である。Ｓｗ
ｉｓｓ ３Ｔ３細胞の全ライゼートを、ＧＴＰγＳ結合
型あるいはＧＤＰ結合型のＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＧＳＴ−Ｒ
ａｃ、ＧＳＴ−Ｃｄｃ４２あるいはＧＳＴとともにイン
キュベートした。結合したタンパク質をグルタチオンア
ガロースビーズで沈降させ、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体を
用いたイムノブロッティングにより解析した。レーン９
（cell lysates）では、細胞の全ライゼート中のｐ１４
０ｍＤｉａを抗体で検出した。
【図８】ｐ１４０ｍＤｉａとプロフィリンのインビトロ
での結合を示した電気泳動写真である。Ｓｗｉｓｓ ３
Ｔ３細胞ライゼートを、ＧＴＰγＳ−またはＧＤＰ結合
型のＧＳＴ−Ｒｈｏタンパク質の存在下または非存在下
（none）で、プロフィリンあるいはＢＳＡをコンジュゲ
ート（immobilized ）したアガロースビーズとインキュ
ベートし、結合タンパク質を沈降させた。沈降物（Pell
et）および上清（Supernatant ）は、抗ｐ１４０ｍＤｉ
ａ抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。
での結合を示した電気泳動写真である。Ｓｗｉｓｓ ３
Ｔ３細胞ライゼートを、ＧＴＰγＳ−またはＧＤＰ結合
型のＧＳＴ−Ｒｈｏタンパク質の存在下または非存在下
（none）で、プロフィリンあるいはＢＳＡをコンジュゲ
ート（immobilized ）したアガロースビーズとインキュ
ベートし、結合タンパク質を沈降させた。沈降物（Pell
et）および上清（Supernatant ）は、抗ｐ１４０ｍＤｉ
ａ抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。
【図９】広がった線維芽細胞の膜ラッフルでのＲｈｏＡ
とｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在を示し
た顕微鏡写真（生物の形態の写真）である。（Ａ−Ｄ）
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞。（ＥとＦ）Ｓｗｉｓｓ
３Ｔ３マウス線維芽細胞。細胞を培養し、固定し、抗
ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（ＡとＥ）、抗ＲｈｏＡポリクロ
ーナル抗体（Ｃ）あるいはマウス抗プロフィリンモノク
ローナル抗体（ＢとＤ）又はローダミン−ファロイジン
（Ｆ）いずれかで同時に細胞を染色し、標準的な蛍光顕
微鏡写真を撮影した。
とｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在を示し
た顕微鏡写真（生物の形態の写真）である。（Ａ−Ｄ）
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞。（ＥとＦ）Ｓｗｉｓｓ
３Ｔ３マウス線維芽細胞。細胞を培養し、固定し、抗
ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（ＡとＥ）、抗ＲｈｏＡポリクロ
ーナル抗体（Ｃ）あるいはマウス抗プロフィリンモノク
ローナル抗体（ＢとＤ）又はローダミン−ファロイジン
（Ｆ）いずれかで同時に細胞を染色し、標準的な蛍光顕
微鏡写真を撮影した。
【図１０】ＰＭＡで刺激した広がったｓＭＤＣＫ細胞の
膜ラッフルにおけるｍｙｃ標識化ＲｈｏＡ、ｐ１４０ｍ
Ｄｉａおよびプロフィリンの共局在化を示した顕微鏡写
真（生物の形態の写真）である。休止期（Resting ）
（Ａ−Ｃ）またはphorbol myristate acetate （Ｄ−
Ｈ）で刺激した（PMA stimulation ）ｓＭＤＣＫ細胞を
固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（Ｂ、ＥおよびＨ）ま
たはモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ｃ、Ｆ）で染色し
た。Ｈには、過剰量の組換えペプチドで予め吸収させた
（preabsorbed ）抗ｐ１４０抗血清を用いた染色が示さ
れている。Ａ、Ｄ、Ｇには、位相差顕微鏡（phase cont
rast）を用いてそれぞれの細胞を撮影した顕微鏡写真が
示されている。写真上段左から、Ａ、Ｂ、Ｃであり、写
真中段左からＤ、Ｅ、Ｆであり、写真下段左からＧ、Ｈ
である。
膜ラッフルにおけるｍｙｃ標識化ＲｈｏＡ、ｐ１４０ｍ
Ｄｉａおよびプロフィリンの共局在化を示した顕微鏡写
真（生物の形態の写真）である。休止期（Resting ）
（Ａ−Ｃ）またはphorbol myristate acetate （Ｄ−
Ｈ）で刺激した（PMA stimulation ）ｓＭＤＣＫ細胞を
固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（Ｂ、ＥおよびＨ）ま
たはモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ｃ、Ｆ）で染色し
た。Ｈには、過剰量の組換えペプチドで予め吸収させた
（preabsorbed ）抗ｐ１４０抗血清を用いた染色が示さ
れている。Ａ、Ｄ、Ｇには、位相差顕微鏡（phase cont
rast）を用いてそれぞれの細胞を撮影した顕微鏡写真が
示されている。写真上段左から、Ａ、Ｂ、Ｃであり、写
真中段左からＤ、Ｅ、Ｆであり、写真下段左からＧ、Ｈ
である。
【図１１】分裂期細胞の分裂溝におけるｐ１４０ｍＤｉ
ａの濃縮を示した顕微鏡写真（生物の形態の写真）であ
る。ＡおよびＢ：Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、Ｃおよび
Ｄ：ＨｅＬａ細胞。抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p14
0 ）で染色（staining）された対数増殖期の細胞（Ａお
よびＣ）およびＤＡＰＩ（Ｂ）または２Ｈ１１モノクロ
ーナル抗プロフィリン抗体（Ｄ）（anti-profilin ）で
同時に染色したものを標準的な蛍光顕微鏡で撮影した。
ａの濃縮を示した顕微鏡写真（生物の形態の写真）であ
る。ＡおよびＢ：Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、Ｃおよび
Ｄ：ＨｅＬａ細胞。抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p14
0 ）で染色（staining）された対数増殖期の細胞（Ａお
よびＣ）およびＤＡＰＩ（Ｂ）または２Ｈ１１モノクロ
ーナル抗プロフィリン抗体（Ｄ）（anti-profilin ）で
同時に染色したものを標準的な蛍光顕微鏡で撮影した。
【図１２】フィブロネクチンでコートされたビーズの回
りにＲｈｏ依存的な様式で出現したＲｈｏＡおよびｐ１
４０ｍＤｉａのクラスターを示した顕微鏡写真である。
４８時間培養したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を用いた。細
胞を播き、フィブロネクチン（ＦＮ−coated）（ａ、
ｂ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ−coated）（ｃお
よびｄ）でコートしたラテックス・ビーズとともに１５
分間インキュベートした。細胞は固定後、抗ｐ１４０ｍ
Ｄｉａ抗体（anti-p140 ）（ａ、ｃ）または抗Ｒｈｏ抗
体（anti-Rho）（ｂ、ｄ）で染色（staining）した。
りにＲｈｏ依存的な様式で出現したＲｈｏＡおよびｐ１
４０ｍＤｉａのクラスターを示した顕微鏡写真である。
４８時間培養したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を用いた。細
胞を播き、フィブロネクチン（ＦＮ−coated）（ａ、
ｂ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ−coated）（ｃお
よびｄ）でコートしたラテックス・ビーズとともに１５
分間インキュベートした。細胞は固定後、抗ｐ１４０ｍ
Ｄｉａ抗体（anti-p140 ）（ａ、ｃ）または抗Ｒｈｏ抗
体（anti-Rho）（ｂ、ｄ）で染色（staining）した。
【図１３】ＣＯＳ−７細胞におけるｐ１４０ｍＤｉａの
一過性の発現を示した顕微鏡写真である。ＣＯＳ細胞は
ｐ１４０ｍＤｉａの発現ベクター単独（ＡおよびＢ）ま
たはＣ３菌体外酵素の発現ベクター単独（ＣおよびＤ）
でトランスフェクトした。Ｃ３菌体外酵素のトランスフ
ェクションは、ＦＬＡＧエピトープを有したＣ３菌体外
酵素発現様ベクターで実施した。細胞を固定し、抗ｐ１
４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）単独（ＡおよびＣ）あ
るいは同時にアクチンをローダミン−ファロイジン（ph
alloidin）染色（staining）した（Ｂ、Ｄ）。
一過性の発現を示した顕微鏡写真である。ＣＯＳ細胞は
ｐ１４０ｍＤｉａの発現ベクター単独（ＡおよびＢ）ま
たはＣ３菌体外酵素の発現ベクター単独（ＣおよびＤ）
でトランスフェクトした。Ｃ３菌体外酵素のトランスフ
ェクションは、ＦＬＡＧエピトープを有したＣ３菌体外
酵素発現様ベクターで実施した。細胞を固定し、抗ｐ１
４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）単独（ＡおよびＣ）あ
るいは同時にアクチンをローダミン−ファロイジン（ph
alloidin）染色（staining）した（Ｂ、Ｄ）。
【図１４】ヒトｍＤｉａ ｃＤＮＡの全長および各クロ
ーン（clone）断片の構造を示した図である。太いバー
はオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を表
す。数字は配列番号４に記載の塩基番号を示す。
ーン（clone）断片の構造を示した図である。太いバー
はオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を表
す。数字は配列番号４に記載の塩基番号を示す。
【図１５】ヒトｍＤｉａ（human）およびマウスｍＤｉ
ａ（mouse）のアミノ酸配列の比較を示した図である。
数字は配列番号１および３に記載のアミノ酸番号を示
す。一致するアミノ酸残基を縦線で示した。ヒト配列
中、アミノ酸残基５５１番の「Ｘ」はアスパラギン酸
（Asp：Ｄ）またはアラニン（Ala：Ａ）を表す。下線Ａ
はＲｈｏ結合領域を表す。
ａ（mouse）のアミノ酸配列の比較を示した図である。
数字は配列番号１および３に記載のアミノ酸番号を示
す。一致するアミノ酸残基を縦線で示した。ヒト配列
中、アミノ酸残基５５１番の「Ｘ」はアスパラギン酸
（Asp：Ｄ）またはアラニン（Ala：Ａ）を表す。下線Ａ
はＲｈｏ結合領域を表す。
【図１６】ヒトｍＤｉａ（human）およびマウスｍＤｉ
ａ（mouse）のアミノ酸配列の比較を示した図である。
図１５の続きである。数字は配列番号１および３に記載
のアミノ酸配列番号を示す。一致するアミノ酸残基を縦
線で示した。下線Ｂはプロリン・リッチ領域、下線Ｃは
ＦＨ−２領域をそれぞれ表す。
ａ（mouse）のアミノ酸配列の比較を示した図である。
図１５の続きである。数字は配列番号１および３に記載
のアミノ酸配列番号を示す。一致するアミノ酸残基を縦
線で示した。下線Ｂはプロリン・リッチ領域、下線Ｃは
ＦＨ−２領域をそれぞれ表す。
【図１７】ヒトｍＤｉａ遺伝子の染色体上の位置を示し
た顕微鏡写真および図である。 （１）ＦＩＳＨ解析の結果を示した顕微鏡写真（染色体
の写真）である。５番染色体上のＦＩＳＨシグナルを矢
印で示した（Ａ）。５番染色体を同定するためにＤＡＰ
Ｉで染色したＡと同一の細胞分裂期の顕微鏡写真である
（Ｂ）。 （２）（１）の結果を模式的に表した図である。
た顕微鏡写真および図である。 （１）ＦＩＳＨ解析の結果を示した顕微鏡写真（染色体
の写真）である。５番染色体上のＦＩＳＨシグナルを矢
印で示した（Ａ）。５番染色体を同定するためにＤＡＰ
Ｉで染色したＡと同一の細胞分裂期の顕微鏡写真である
（Ｂ）。 （２）（１）の結果を模式的に表した図である。
【図１８】ヒトｍＤｉａ遺伝子（ｐ１４０ｍＤｉａ）の
染色体上の位置と、気管支喘息（気道過敏症）に関連す
る染色体上の位置との関係を示した図である。
染色体上の位置と、気管支喘息（気道過敏症）に関連す
る染色体上の位置との関係を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (21)
- 【請求項１】下記の特徴を有するヒト由来のタンパク質
またはその誘導体： （１）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する、（２）
プロフィリン結合能を有する、（３）遺伝子がヒト染色
体５ｑ３１．２に位置する、（４）分子量がＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる測定で約１５０ｋＤａである。 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列を含むタンパク質また
はその誘導体： （ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号３のアミノ酸配列であって、活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有する
アミノ酸配列。 - 【請求項３】配列番号３の１１５〜３１２番のアミノ酸
配列と配列番号３の６２６〜７９７番のアミノ酸配列と
を有する、請求項２に記載のタンパク質またはその誘導
体。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載のタン
パク質をコードする塩基配列。 - 【請求項５】配列番号４のＤＮＡ配列の一部または全部
を有する、請求項４に記載の塩基配列。 - 【請求項６】塩基配列の一部が、配列番号４の２８〜３
９７２番、３７０〜９６３番、または１９０３〜２４１
８番のＤＮＡ配列である、請求項５に記載の塩基配列。 - 【請求項７】請求項４〜６のいずれか一項に記載の塩基
配列を含んでなる、ベクター。 - 【請求項８】プラスミドベクター、ウイルスベクター、
およびリポソームベクターからなる群から選択される、
請求項７に記載のベクター。 - 【請求項９】請求項７または８に記載のベクターによっ
て形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞にあっ
てはヒトから単離された細胞に限る）。 - 【請求項１０】大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、
リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、お
よび腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請
求項９に記載の宿主細胞。 - 【請求項１１】請求項９または１０に記載の宿主細胞を
培養し、そしてその培養物から請求項１〜３のいずれか
一項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単離す
ることを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記
載のタンパク質またはそれらの誘導体の製造法。 - 【請求項１２】（１）スクリーニングの対象を、活性型
Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜３のいずれか一項に記
載のタンパク質またはその誘導体とを含むスクリーニン
グ系に存在させ、そして（２）活性型Ｒｈｏタンパク質
と、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質ま
たはその誘導体との結合の阻害の程度を測定することを
含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜３のいず
れか一項に記載のタンパク質またはその誘導体との結合
を阻害する物質のスクリーニング法。 - 【請求項１３】（１）スクリーニングの対象を、プロフ
ィリンと、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパ
ク質またはその誘導体とを含むスクリーニング系に存在
させ、そして（２）プロフィリンと、請求項１〜３のい
ずれか一項に記載のタンパク質またはその誘導体との結
合の阻害の程度を測定することを含む、プロフィリン
と、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質ま
たはその誘導体との結合を阻害する物質のスクリーニン
グ法。 - 【請求項１４】スクリーニングの系が細胞系または無細
胞系である、請求項１２または１３に記載のスクリーニ
ング法。 - 【請求項１５】下記から選択される、塩基配列： （ａ）配列番号４の配列中、連続した少なくとも１５塩
基のＤＮＡ配列を含む塩基配列、およびそれに相補的な
配列、並びに（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする塩基配列。 - 【請求項１６】配列番号４の２１９４〜５８２２番、８
６６〜２２５３番、１〜１９０７番（但し、１６７９番
のＡはＣである）、１２７４〜１２９３番、８６６〜１
２９３番、１２２６〜１２４４番、および１３２７〜１
３４７番の塩基配列、並びに配列番号５の１〜３６２９
番、３５７０〜４９５７番、３９１６〜５８２２番（但
し、４１４４番のＴはＧである）、４５３０〜４５４９
番、４５３０〜４９５７番、４５７９〜４５９７番、お
よび４４７６〜４４９６番の塩基配列からなる群から選
択される、請求項１５に記載の塩基配列。 - 【請求項１７】下記から選択される、塩基配列： （ａ）配列番号６の配列中、連続した少なくとも１５塩
基のＤＮＡ配列を含む塩基配列、およびそれに相補的な
配列、並びに（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする塩基配列。 - 【請求項１８】請求項１５〜１７のいずれか一項に記載
の塩基配列と標識とを含む、プローブ。 - 【請求項１９】標識が酵素、放射性同位元素、蛍光、お
よび抗原からなる群から選択される、請求項１８に記載
のプローブ。 - 【請求項２０】請求項１５〜１７のいずれか一項に記載
の塩基配列、または請求項１８または１９に記載のプロ
ーブを含む、診断薬。 - 【請求項２１】気道過敏症、気管支喘息、急性骨髄性白
血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から
なる群から選択される疾患の診断に用いられる、請求項
２０に記載の診断薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9090170A JPH10262680A (ja) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Ｒｈｏ標的タンパク質ヒトｍＤｉａおよびその遺伝子 |
| US08/899,595 US6111072A (en) | 1996-08-26 | 1997-07-24 | Rho target protein human mDia and gene encoding same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9090170A JPH10262680A (ja) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Ｒｈｏ標的タンパク質ヒトｍＤｉａおよびその遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10262680A true JPH10262680A (ja) | 1998-10-06 |
Family
ID=13991026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9090170A Pending JPH10262680A (ja) | 1996-08-26 | 1997-03-25 | Ｒｈｏ標的タンパク質ヒトｍＤｉａおよびその遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10262680A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999022028A1 (en) * | 1997-10-29 | 1999-05-06 | The University Of Washington | Modulators of actin |
| JP2008529008A (ja) * | 2005-01-28 | 2008-07-31 | チルドレンズ メディカル センター コーポレイション | 上皮癌の診断および予後診断のための方法 |
-
1997
- 1997-03-25 JP JP9090170A patent/JPH10262680A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999022028A1 (en) * | 1997-10-29 | 1999-05-06 | The University Of Washington | Modulators of actin |
| JP2008529008A (ja) * | 2005-01-28 | 2008-07-31 | チルドレンズ メディカル センター コーポレイション | 上皮癌の診断および予後診断のための方法 |
| US8685659B2 (en) | 2005-01-28 | 2014-04-01 | Children's Medical Center Corporation | Method for diagnosis and prognosis of epithelial cancers |
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