JP2690266B2 - ヒト細胞接着分子および核酸配列 - Google Patents
ヒト細胞接着分子および核酸配列Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
-
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞接着分子および細
胞接着分子をコードする核酸配列に関する。特定すれ
ば、本発明は、ヒト細胞接着分子および該分子をコード
する核酸配列に関する。
胞接着分子をコードする核酸配列に関する。特定すれ
ば、本発明は、ヒト細胞接着分子および該分子をコード
する核酸配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞間の接着は、組織の形態および機能
の分化および維持において必須の機能を担う。細胞間の
接着は、あるクラスの接着性細胞表面蛋白質、即ち、一
般的な呼称としては「細胞接着分子」または「ＣＡＭ
ｓ」により媒介される。これらの蛋白質は、系統的に異
なる範囲の生物において同定および特徴付けられ、そし
て多くの場合、構造において高度に保存されていること
がわかった。特定の細胞表面ＣＡＭｓは、構造的にイム
ノグロブリンと関連する糖蛋白質のスーパーファミリー
のメンバーであり、即ち、それらの構造は、細胞外イム
ノグロブリン様およびフィブロネクチンタイプＩＩＩ様
ドメインのメンバーを含む。
の分化および維持において必須の機能を担う。細胞間の
接着は、あるクラスの接着性細胞表面蛋白質、即ち、一
般的な呼称としては「細胞接着分子」または「ＣＡＭ
ｓ」により媒介される。これらの蛋白質は、系統的に異
なる範囲の生物において同定および特徴付けられ、そし
て多くの場合、構造において高度に保存されていること
がわかった。特定の細胞表面ＣＡＭｓは、構造的にイム
ノグロブリンと関連する糖蛋白質のスーパーファミリー
のメンバーであり、即ち、それらの構造は、細胞外イム
ノグロブリン様およびフィブロネクチンタイプＩＩＩ様
ドメインのメンバーを含む。
【０００３】ＣＡＭｓのイムノグロブリンスーパーファ
ミリーは、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、Ｌ１抗
原、Ｎｇ−ＣＡＭ、ＴＡＧ−１およびその他を含む。こ
れらＣＡＭは、細胞間の同種親和性結合を媒介している
と信じられ、そして、他の細胞表面分子、細胞外マトリ
ックス蛋白質およびプロテオグリカンとの異種親和性相
互作用に関与していることも最近認識された。多くは、
細胞の形態、細胞の代謝および細胞の接着性を変化させ
る、細胞内部への伝達シグナルに含まれるとも信じられ
ている。これらの分子がシグナルを細胞内部へ伝達する
手段は明らかでない。
ミリーは、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、Ｌ１抗
原、Ｎｇ−ＣＡＭ、ＴＡＧ−１およびその他を含む。こ
れらＣＡＭは、細胞間の同種親和性結合を媒介している
と信じられ、そして、他の細胞表面分子、細胞外マトリ
ックス蛋白質およびプロテオグリカンとの異種親和性相
互作用に関与していることも最近認識された。多くは、
細胞の形態、細胞の代謝および細胞の接着性を変化させ
る、細胞内部への伝達シグナルに含まれるとも信じられ
ている。これらの分子がシグナルを細胞内部へ伝達する
手段は明らかでない。
【０００４】Ｆ１１抗原（Ｆ１１）は、神経突起−神経
突起の相互作用に関与していると信じられている、ニワ
トリ神経細胞表面関連糖蛋白質である。Ｆ１１のｃＤＮ
Ａ配列は決定され、１０１０アミノ酸蛋白質をコードす
る（ブリュメンドルフ（Ｂｒｕｍｍｅｎｄｏｒｆ）ら、
１９８９、Ｎｅｕｒｏｎ ２：１３５１−１３６１）。
Ｆ１１分子は、イムノグロブリンドメインタイプＣに関
連した６つのドメインおよびフィブロネクチンタイプＩ
ＩＩの繰り返しと同様の４つのドメインからなる。これ
らの構造は、Ｌ１およびＮ−ＣＡＭにも存在する。Ｆ１
１のｃＤＮＡ配列は、ニワトリ神経糖蛋白質コンタクチ
ンのｃＤＮＡ配列とほとんど同一であることがわかり
（ランシュ（Ｒａｎｓｃｈｔ）ら、１９８８、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ． １０７：１５６１−１５７３；ツイ
ッシュ（Ｚｉｓｃｈ）ら、１９９２、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．１１９：２０３−２１３）、そしてこれら分子
（コンタクチン／Ｆ１１）は同一であると現在信じられ
ている。しかしながら、本発明の出願以前に、この点は
明らかでなかった。マウスの神経細胞表面蛋白質として
Ｆ３が同定されており、ニワトリの細胞接着蛋白質であ
るコンタクチン／Ｆ１１と相同である。Ｆ３をコードす
るｃＤＮＡはクローン化されて配列が決定されている
が、イムノグロブリンスーパーファミリーの特徴を有す
る１０２０アミノ酸蛋白質をコードするオープンリーデ
ィングフレームが明らかにされた（ゲナリニ（Ｇｅｎｎ
ａｒｉｎｉ）ら、１９８９、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０９：７７５−７８８）。
突起の相互作用に関与していると信じられている、ニワ
トリ神経細胞表面関連糖蛋白質である。Ｆ１１のｃＤＮ
Ａ配列は決定され、１０１０アミノ酸蛋白質をコードす
る（ブリュメンドルフ（Ｂｒｕｍｍｅｎｄｏｒｆ）ら、
１９８９、Ｎｅｕｒｏｎ ２：１３５１−１３６１）。
Ｆ１１分子は、イムノグロブリンドメインタイプＣに関
連した６つのドメインおよびフィブロネクチンタイプＩ
ＩＩの繰り返しと同様の４つのドメインからなる。これ
らの構造は、Ｌ１およびＮ−ＣＡＭにも存在する。Ｆ１
１のｃＤＮＡ配列は、ニワトリ神経糖蛋白質コンタクチ
ンのｃＤＮＡ配列とほとんど同一であることがわかり
（ランシュ（Ｒａｎｓｃｈｔ）ら、１９８８、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ． １０７：１５６１−１５７３；ツイ
ッシュ（Ｚｉｓｃｈ）ら、１９９２、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．１１９：２０３−２１３）、そしてこれら分子
（コンタクチン／Ｆ１１）は同一であると現在信じられ
ている。しかしながら、本発明の出願以前に、この点は
明らかでなかった。マウスの神経細胞表面蛋白質として
Ｆ３が同定されており、ニワトリの細胞接着蛋白質であ
るコンタクチン／Ｆ１１と相同である。Ｆ３をコードす
るｃＤＮＡはクローン化されて配列が決定されている
が、イムノグロブリンスーパーファミリーの特徴を有す
る１０２０アミノ酸蛋白質をコードするオープンリーデ
ィングフレームが明らかにされた（ゲナリニ（Ｇｅｎｎ
ａｒｉｎｉ）ら、１９８９、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１０９：７７５−７８８）。
【０００５】本発明は、ヒト神経細胞接着に関与するＣ
ＡＭｓに関する。特定すれば、本発明は、マウスＦ３お
よびニワトリコンタクチン／Ｆ１１蛋白質のヒトの同等
物の精製および特徴、ヒトコンタクチンに対するモノク
ローナルおよびポリクローナル抗体の調製法およびヒト
コンタクチンをコードする核酸配列を提供する。ベーグ
ランド（Ｅ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ）ら（１９８７，Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．４８：８０９−８１５）は、モノク
ローナル抗体を用いてヒトの脳の糖蛋白質の特徴を明ら
かにし、そしてＧｐ１３５として同定された分子の単離
および特徴を報告している（ベーグランド（Ｅ．Ｂｅｒ
ｇｌｕｎｄ）ら、１９９１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１９７：５４９−５５４；ベーグランド（Ｅ．Ｂｅ
ｒｇｌｕｎｄ）ら、１９９１，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５
４９：２９２−２９６）。これらの著者らは、蛋白質の
アミノ末端および内部のペプチドの配列を決定した。こ
れらの配列を基にして、彼らは、ニワトリのコンタクチ
ン／Ｆ１１とマウスのＦ３の同一性を明らかにしたが、
しかし、Ｇｐ１３５のアミノ酸配列は、本明細書の記載
のとおりヒトのコンタクチン分子とは異なる。したがっ
て、本出願以前には、ヒトのＧｐ１３５がＦ３、コンタ
クチン／Ｆ１１の直系の類似体であったか否かは明らか
でなかった。ベーグランド（Ｅ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ）お
よびランシュット（Ｂ．Ｒａｎｓｃｈｔ）は、後に、Ｇ
ｐ１３５をコードするｃＤＮＡクローンの単離と部分的
な特徴を報告した（１９９２，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．Ａｂｓｔ．１８：１３２５，Ａｂｓｔ．＃５６０．
５）。
ＡＭｓに関する。特定すれば、本発明は、マウスＦ３お
よびニワトリコンタクチン／Ｆ１１蛋白質のヒトの同等
物の精製および特徴、ヒトコンタクチンに対するモノク
ローナルおよびポリクローナル抗体の調製法およびヒト
コンタクチンをコードする核酸配列を提供する。ベーグ
ランド（Ｅ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ）ら（１９８７，Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．４８：８０９−８１５）は、モノク
ローナル抗体を用いてヒトの脳の糖蛋白質の特徴を明ら
かにし、そしてＧｐ１３５として同定された分子の単離
および特徴を報告している（ベーグランド（Ｅ．Ｂｅｒ
ｇｌｕｎｄ）ら、１９９１．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
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ｒｇｌｕｎｄ）ら、１９９１，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５
４９：２９２−２９６）。これらの著者らは、蛋白質の
アミノ末端および内部のペプチドの配列を決定した。こ
れらの配列を基にして、彼らは、ニワトリのコンタクチ
ン／Ｆ１１とマウスのＦ３の同一性を明らかにしたが、
しかし、Ｇｐ１３５のアミノ酸配列は、本明細書の記載
のとおりヒトのコンタクチン分子とは異なる。したがっ
て、本出願以前には、ヒトのＧｐ１３５がＦ３、コンタ
クチン／Ｆ１１の直系の類似体であったか否かは明らか
でなかった。ベーグランド（Ｅ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ）お
よびランシュット（Ｂ．Ｒａｎｓｃｈｔ）は、後に、Ｇ
ｐ１３５をコードするｃＤＮＡクローンの単離と部分的
な特徴を報告した（１９９２，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．Ａｂｓｔ．１８：１３２５，Ａｂｓｔ．＃５６０．
５）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】モノクローナル抗体を
用いて、マウスのＦ３およびニワトリのコンタクチン／
Ｆ１１接着分子と相同のヒトの脳の糖蛋白質が単離およ
び特徴付けられた。ヒトのコンタクチン遺伝子の完全コ
ード配列は、ヒトの神経芽細胞腫のｃＤＮＡクローンの
配列決定により決定された。この遺伝子は潜在的に別の
ものをコードし、択一的に完全コーディング領域をスプ
ライスもした。ヌクレオチドレベルにおいては、ヒトｃ
ＤＮＡはマウスＦ３のｃＤＮＡと８６％相同である。推
定されるアミノ酸配列は９５％相同であり、予測される
幾つかの共通構造は、６つのイムノグロブリン様ドメイ
ンおよび４つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ様ドメイ
ン、並びにＡｓｎ結合グリコシル化部位を含むことを特
徴とする。マウス、ニワトリおよびヒトの糖蛋白質のす
べてが、ホスファチジルイノシトールアンカーを通した
細胞表面への蛋白質の結合に重要であるらしいカルボキ
シル末端疎水性セグメントを含む。
用いて、マウスのＦ３およびニワトリのコンタクチン／
Ｆ１１接着分子と相同のヒトの脳の糖蛋白質が単離およ
び特徴付けられた。ヒトのコンタクチン遺伝子の完全コ
ード配列は、ヒトの神経芽細胞腫のｃＤＮＡクローンの
配列決定により決定された。この遺伝子は潜在的に別の
ものをコードし、択一的に完全コーディング領域をスプ
ライスもした。ヌクレオチドレベルにおいては、ヒトｃ
ＤＮＡはマウスＦ３のｃＤＮＡと８６％相同である。推
定されるアミノ酸配列は９５％相同であり、予測される
幾つかの共通構造は、６つのイムノグロブリン様ドメイ
ンおよび４つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ様ドメイ
ン、並びにＡｓｎ結合グリコシル化部位を含むことを特
徴とする。マウス、ニワトリおよびヒトの糖蛋白質のす
べてが、ホスファチジルイノシトールアンカーを通した
細胞表面への蛋白質の結合に重要であるらしいカルボキ
シル末端疎水性セグメントを含む。
【０００７】ヒトのコンタクチン糖蛋白質は１３５ｋＤ
の分子量であり、モノクローナル抗体を用いた免疫親和
性法により精製される。内部のペプチドの部分的配列決
定によると、ｃＤＮＡから予測されるのと同一のアミノ
酸配列であった。ｃＤＮＡは組換え宿主微生物中で発現
され、そして遺伝子産物は、モノクローナル抗体により
精製されたヒトのコンタクチン抗原に対するポリクロー
ナル抗血清と免疫反応性であることが示された。さまざ
まなヒトの組織のＲＮＡのノーザンブロット分析によ
り、成人の脳における単一の主要な約６．５ｋｂのヒト
コンタクチン転写物が証明された。複数の転写物（６．
８ｋｂと６．０ｋｂの二重の縞（ｄｏｕｂｌｅｔ）およ
び４．２ｋｂ）が網膜芽細胞腫瘍および神経細胞芽腫瘍
セルラインにおいて発現される。トランスフォームされ
たセルラインにおいて観察されるのと同様の約６．８ｋ
ｂおよび約６．０ｋｂの転写物の低いレベルの発現も、
ヒトの肺および膵臓において検出された。極めて弱い
６．８ｋｂおよび６．０ｋｂのバンドが、腎臓および骨
格筋において観察された。
の分子量であり、モノクローナル抗体を用いた免疫親和
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酸配列であった。ｃＤＮＡは組換え宿主微生物中で発現
され、そして遺伝子産物は、モノクローナル抗体により
精製されたヒトのコンタクチン抗原に対するポリクロー
ナル抗血清と免疫反応性であることが示された。さまざ
まなヒトの組織のＲＮＡのノーザンブロット分析によ
り、成人の脳における単一の主要な約６．５ｋｂのヒト
コンタクチン転写物が証明された。複数の転写物（６．
８ｋｂと６．０ｋｂの二重の縞（ｄｏｕｂｌｅｔ）およ
び４．２ｋｂ）が網膜芽細胞腫瘍および神経細胞芽腫瘍
セルラインにおいて発現される。トランスフォームされ
たセルラインにおいて観察されるのと同様の約６．８ｋ
ｂおよび約６．０ｋｂの転写物の低いレベルの発現も、
ヒトの肺および膵臓において検出された。極めて弱い
６．８ｋｂおよび６．０ｋｂのバンドが、腎臓および骨
格筋において観察された。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のヒトのコンタク
チン細胞接着蛋白質は、該蛋白質が発現されるあらゆる
ヒト神経組織から単離してよい。好ましい源は、ヒトの
脳の組織である。慣用的な化学および生化学の単離法を
用いてよいが、ヒトのコンタクチン細胞接着蛋白質は、
該蛋白質を認識および結合する抗体を用いて免疫親和法
により単離するのがもっとも好ましい。抗原を単離する
ための免疫親和法は当該分野において公知であり、ヒト
のコンタクチン分子を認識する適切なモノクローナルま
たはポリクローナル抗体を用いて本発明のヒトノコンタ
クチンを単離するために用いられる。モノクローナル抗
体としては、例えばベーグランドら（前記）に記載され
たＣＦ３抗体、または下記のＮｅｕｒｏ−１抗体が好ま
しく、Ｎｅｕｒｏ−１抗体が、ヒトのコンタクチン蛋白
質の単離のためにもっとも好ましい。
チン細胞接着蛋白質は、該蛋白質が発現されるあらゆる
ヒト神経組織から単離してよい。好ましい源は、ヒトの
脳の組織である。慣用的な化学および生化学の単離法を
用いてよいが、ヒトのコンタクチン細胞接着蛋白質は、
該蛋白質を認識および結合する抗体を用いて免疫親和法
により単離するのがもっとも好ましい。抗原を単離する
ための免疫親和法は当該分野において公知であり、ヒト
のコンタクチン分子を認識する適切なモノクローナルま
たはポリクローナル抗体を用いて本発明のヒトノコンタ
クチンを単離するために用いられる。モノクローナル抗
体としては、例えばベーグランドら（前記）に記載され
たＣＦ３抗体、または下記のＮｅｕｒｏ−１抗体が好ま
しく、Ｎｅｕｒｏ−１抗体が、ヒトのコンタクチン蛋白
質の単離のためにもっとも好ましい。
【０００９】本発明のヒトのコンタクチン蛋白質を認識
するモノクローナル抗体は、当該分野において公知のと
おり、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ）（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５）の方法により調製される。免疫化のための好まし
い抗原は、成人のヒトの脳膜の調製物であり、最も好ま
しい抗原は、細胞表面糖蛋白質が豊富な、これらの膜の
シナプトソーム画分である。マウスをこの抗原調製物に
より免疫化し、脾臓を融合し、そしてその結果得られる
ハイブリドーマを最初の免疫源に対してスクリーニング
してハイブリドーマを選択する。
するモノクローナル抗体は、当該分野において公知のと
おり、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ）（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５）の方法により調製される。免疫化のための好まし
い抗原は、成人のヒトの脳膜の調製物であり、最も好ま
しい抗原は、細胞表面糖蛋白質が豊富な、これらの膜の
シナプトソーム画分である。マウスをこの抗原調製物に
より免疫化し、脾臓を融合し、そしてその結果得られる
ハイブリドーマを最初の免疫源に対してスクリーニング
してハイブリドーマを選択する。
【００１０】これらの方法を用いて、本明細書において
Ｎｅｕｒｏ−１と呼ぶモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマが同定された。粗シナプトソーム膜画分
を、成人ヒト脳組織から調製した（カーリン（Ｃａｒｌ
ｉｎ，Ｒ．Ｋ．）ら、１９８０Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ． ８６：８３１−８４３）。膜糖蛋白質をＴＥＲＧ
ＩＴＯＬタイプＮＰ−４０（ポリグリコールエーテル表
面活性剤、ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ）を用
いて抽出し、そして固定化されたレンチルレクチン（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の親和性クロマトグラフィーを
用いて単離することにより、粗脳糖蛋白質画分を得た。
この物質を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した
（４０μｇ／マウス）。免疫源に対して高い血清力価を
有する動物から得られたリンパ節を、ＰｃＸ６３Ａｇ
８．６５３細胞（ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．
Ｗ．）（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．３９：
２８５−３０８；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）と融合
した。その結果得られたハイブリドーマを免疫源との反
応活性に関して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
ｓ）によりスクリーニングし、そしてイムノブロットに
おける反応活性に関して試験した。Ｎｅｕｒｏ−１と呼
ぶ抗体を分泌するハイブリドーマを限定希釈法によりサ
ブクローン化した。Ｎｅｕｒｏ−１モノクローナル抗体
は、プリステン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）で感作されたＢａ
ｌｂ／Ｃマウスの腹水において生産され、プロテインＡ
セファロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のクロマトグラフィー
により精製された。
Ｎｅｕｒｏ−１と呼ぶモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマが同定された。粗シナプトソーム膜画分
を、成人ヒト脳組織から調製した（カーリン（Ｃａｒｌ
ｉｎ，Ｒ．Ｋ．）ら、１９８０Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ． ８６：８３１−８４３）。膜糖蛋白質をＴＥＲＧ
ＩＴＯＬタイプＮＰ−４０（ポリグリコールエーテル表
面活性剤、ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ）を用
いて抽出し、そして固定化されたレンチルレクチン（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の親和性クロマトグラフィーを
用いて単離することにより、粗脳糖蛋白質画分を得た。
この物質を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した
（４０μｇ／マウス）。免疫源に対して高い血清力価を
有する動物から得られたリンパ節を、ＰｃＸ６３Ａｇ
８．６５３細胞（ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．
Ｗ．）（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．３９：
２８５−３０８；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）と融合
した。その結果得られたハイブリドーマを免疫源との反
応活性に関して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
ｓ）によりスクリーニングし、そしてイムノブロットに
おける反応活性に関して試験した。Ｎｅｕｒｏ−１と呼
ぶ抗体を分泌するハイブリドーマを限定希釈法によりサ
ブクローン化した。Ｎｅｕｒｏ−１モノクローナル抗体
は、プリステン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）で感作されたＢａ
ｌｂ／Ｃマウスの腹水において生産され、プロテインＡ
セファロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のクロマトグラフィー
により精製された。
【００１１】Ｎｅｕｒｏ−１、アイソタイプＩｇＧ２ｂ
は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）におい
て最初の免疫源と強固に反応し、イムノブロットにおい
て約１３５ｋＤのポリペプチドを認識する。場合によっ
ては、Ｎｅｕｒｏ−１抗原は、接近した範囲の二重の縞
（ｄｏｕｂｌｅｔ）としてイムノブロット上に出現す
る。Ｎｅｕｒｏ−１を生産するハイブリドーマは、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤ）に、１９９３年３月３日付けで、寄託番号
ＨＢ１１２８２として寄託されており、該ハイブリドー
マはヒトのコンタクチン細胞接着分子の単離および特徴
付けのためのもっとも好ましいモノクローナル抗体であ
る。
は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）におい
て最初の免疫源と強固に反応し、イムノブロットにおい
て約１３５ｋＤのポリペプチドを認識する。場合によっ
ては、Ｎｅｕｒｏ−１抗原は、接近した範囲の二重の縞
（ｄｏｕｂｌｅｔ）としてイムノブロット上に出現す
る。Ｎｅｕｒｏ−１を生産するハイブリドーマは、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤ）に、１９９３年３月３日付けで、寄託番号
ＨＢ１１２８２として寄託されており、該ハイブリドー
マはヒトのコンタクチン細胞接着分子の単離および特徴
付けのためのもっとも好ましいモノクローナル抗体であ
る。
【００１２】Ｎｅｕｒｏ−１モノクローナル抗体は、メ
チルピペリミデート（ハロー（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ）およ
びレーン（Ｌａｎｅ，Ｄ．）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
ｐ．５２２）を用いてプロテインＡセファロースにカッ
プリングさせた。次に、上記の膜抽出物を親和性カラム
に通過させ、そして結合した抗原を０．１Ｍのジエチル
アミン（ｐＨ１１．５）により溶出した。溶出した物質
は、０．０１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中のジエチルアミノ
エチルセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ ＤＥ５２，Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ，ＰＡ）への結合により濃縮し、そして１ＭのＮａＣ
ｌを用いて溶出した。凍結させた膜抽出物を単離工程に
おいて用いると、Ｎｅｕｒｏ−１抗原は不溶性になりや
すいことがわかった。これらの場合、沈殿物質をデオキ
シコレート中で溶解し、ＮＰ−４０含有カラム緩衝液に
対して透析し、そして上記のとおり処理した。
チルピペリミデート（ハロー（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ）およ
びレーン（Ｌａｎｅ，Ｄ．）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
ｐ．５２２）を用いてプロテインＡセファロースにカッ
プリングさせた。次に、上記の膜抽出物を親和性カラム
に通過させ、そして結合した抗原を０．１Ｍのジエチル
アミン（ｐＨ１１．５）により溶出した。溶出した物質
は、０．０１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中のジエチルアミノ
エチルセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ ＤＥ５２，Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ，ＰＡ）への結合により濃縮し、そして１ＭのＮａＣ
ｌを用いて溶出した。凍結させた膜抽出物を単離工程に
おいて用いると、Ｎｅｕｒｏ−１抗原は不溶性になりや
すいことがわかった。これらの場合、沈殿物質をデオキ
シコレート中で溶解し、ＮＰ−４０含有カラム緩衝液に
対して透析し、そして上記のとおり処理した。
【００１３】ポリクローナル抗体は、結合物質を用いて
動物を免疫化することにより生じさせ、Ｎｅｕｒｏ−１
固定化親和性カラムから溶出した。ポリクローナル抗体
をさらに、Ｎｅｕｒｏ−１抗原固定化親和性カラムによ
り濃縮した。
動物を免疫化することにより生じさせ、Ｎｅｕｒｏ−１
固定化親和性カラムから溶出した。ポリクローナル抗体
をさらに、Ｎｅｕｒｏ−１抗原固定化親和性カラムによ
り濃縮した。
【００１４】１３５ｋＤのＮｅｕｒｏ−１抗原は、レン
チルレクチン−セファロースへの結合およびグルコース
により溶出する特徴を有することから、このポリペプチ
ドはグリコシル化されていることが示唆される。アスパ
ラギン結合糖質の存在は、抗原をエンドグリコシダーゼ
Ｆ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で処
理して低分子量にシフトすることが示されることにより
確認された。この抗原が、ホスファチジルイノシトール
特異的ホスホリパーゼＣにより細胞表面から放出される
ことが発見されたことから、この分子は脂質結合により
表面につながれる（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ことが示され
る。これらの分析は、粗ヒト脳シナプトソーム膜調製物
を洗浄して０．０２ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）に懸
濁することにより実施された。この酵素を添加して、サ
ンプルを４時間３７℃においてインキュベートした。膜
を遠心分離により回収して、膜相当量および上清をイム
ノブロッティングにより分析した。亜鉛またはｏ−フェ
ナンスロリンでこの反応混合物を処理すると、それぞ
れ、放出の阻害または非阻害が示された。イムノブロッ
ト上に見られる二重縞の両ポリペプチドは、ホスホリパ
ーゼＣ処理により放出されることから、これらは表面に
つながれた（ａｎｃｈｏｒｅｄ）状態で存在せずに、内
因性の放出形態のヒトコンタクチン分子であると信じら
れる。
チルレクチン−セファロースへの結合およびグルコース
により溶出する特徴を有することから、このポリペプチ
ドはグリコシル化されていることが示唆される。アスパ
ラギン結合糖質の存在は、抗原をエンドグリコシダーゼ
Ｆ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で処
理して低分子量にシフトすることが示されることにより
確認された。この抗原が、ホスファチジルイノシトール
特異的ホスホリパーゼＣにより細胞表面から放出される
ことが発見されたことから、この分子は脂質結合により
表面につながれる（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ことが示され
る。これらの分析は、粗ヒト脳シナプトソーム膜調製物
を洗浄して０．０２ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）に懸
濁することにより実施された。この酵素を添加して、サ
ンプルを４時間３７℃においてインキュベートした。膜
を遠心分離により回収して、膜相当量および上清をイム
ノブロッティングにより分析した。亜鉛またはｏ−フェ
ナンスロリンでこの反応混合物を処理すると、それぞ
れ、放出の阻害または非阻害が示された。イムノブロッ
ト上に見られる二重縞の両ポリペプチドは、ホスホリパ
ーゼＣ処理により放出されることから、これらは表面に
つながれた（ａｎｃｈｏｒｅｄ）状態で存在せずに、内
因性の放出形態のヒトコンタクチン分子であると信じら
れる。
【００１５】Ｎｅｕｒｏ−１抗原のアミノ酸配列および
内部ペプチドの配列が決定され、そして公表されたマウ
スＦ３およびニワトリコンタクチン／Ｆ１１のアミノ酸
配列と比較した。アミノ末端の配列は、ＩＭＭＯＢＩＬ
ＯＮ−Ｐ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｇｌｅｎ Ｃｏｖ
ｅ，ＮＹ）にブロットされた、免疫親和性により精製さ
れた物質を用いて決定された。アミノ酸配列は解釈する
のが難しく、多数の不明な残基を含んでいた。これら曖
昧なものの多くは、配列分析によりときには検出困難で
あるアミノ酸を含んだが、この分子の蛋白質分解により
アミノ末端に不均一性を作ることも可能である。内部ペ
プチドは、エンドペプチダーゼｌｙｓ−ｃによる分解に
より作り、ＨＰＬＣにより分離し、そして配列を決定し
た。内部ペプチドの配列は明らかにされ、そしてＦ３お
よびコンタクチン／Ｆ１１中のペプチドと極めて類似し
ていることがわかった。さらに、ヒトのペプチドはエン
ドペプチダーゼｌｙｓ−ｃの分解により生じたため、リ
ジン残基で終わっているものがほとんどである。これら
の残基は、マウスおよびニワトリにおいても保存されて
いる。アミノ酸配列相同性を基にすると、Ｎｅｕｒｏ−
１抗原はＦ３およびコンタクチン／Ｆ１１のヒトにおけ
る同等物であると信じられる。したがって、本明細書に
おいてはこれをヒトのコンタクチンと呼ぶ。
内部ペプチドの配列が決定され、そして公表されたマウ
スＦ３およびニワトリコンタクチン／Ｆ１１のアミノ酸
配列と比較した。アミノ末端の配列は、ＩＭＭＯＢＩＬ
ＯＮ−Ｐ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｇｌｅｎ Ｃｏｖ
ｅ，ＮＹ）にブロットされた、免疫親和性により精製さ
れた物質を用いて決定された。アミノ酸配列は解釈する
のが難しく、多数の不明な残基を含んでいた。これら曖
昧なものの多くは、配列分析によりときには検出困難で
あるアミノ酸を含んだが、この分子の蛋白質分解により
アミノ末端に不均一性を作ることも可能である。内部ペ
プチドは、エンドペプチダーゼｌｙｓ−ｃによる分解に
より作り、ＨＰＬＣにより分離し、そして配列を決定し
た。内部ペプチドの配列は明らかにされ、そしてＦ３お
よびコンタクチン／Ｆ１１中のペプチドと極めて類似し
ていることがわかった。さらに、ヒトのペプチドはエン
ドペプチダーゼｌｙｓ−ｃの分解により生じたため、リ
ジン残基で終わっているものがほとんどである。これら
の残基は、マウスおよびニワトリにおいても保存されて
いる。アミノ酸配列相同性を基にすると、Ｎｅｕｒｏ−
１抗原はＦ３およびコンタクチン／Ｆ１１のヒトにおけ
る同等物であると信じられる。したがって、本明細書に
おいてはこれをヒトのコンタクチンと呼ぶ。
【００１６】Ｎｅｕｒｏ−１抗原をコードする複数のｃ
ＤＮＡをクローン化してヒトのコンタクチンとしての特
徴を確認した。マウスＦ３プローブを用いて、ヒトの神
経芽細胞腫のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をスクリーニングし
た。プローブは、ゲナリニ（Ｇｅｎｎａｒｉｎｉ）ら、
前記に報告されたマウスＦ３配列に基づくプライマーの
ペアを用いてマウス脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡの逆転写酵素
−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生じさせ
た（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ：マウスＦ３、アクセ
ション＃Ｘ１４９４３）。ＲＴ−ＰＣＲを実施するため
に、オリゴｄ（Ｔ）セルロース法（マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．１９８２）を用いて、マウス脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ
を調製した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応は、ゴブレット（Ｇ
ｏｂｌｅｔ）ら（１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１７：２１４４）に記載された一段階プロ
トコルに基づいた。６６μｌのＤＥＰＣ水中のｐｏｌｙ
Ａ＋ＲＮＡ（１μｇ）および３００ｎｇの各プライマー
（下記）を６５℃において１５分間インキュベートした
のち、氷上で冷却した。３３μｌの３×ＲＴ−ＰＣＲ試
薬混合物（３×ＰＣＲ緩衝液、１５０ｍＭ ＫＣｌ，３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，４．５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，０．３％ゼラチン、５００μＭ ｄＮＴＰ
ｓ，２００Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、４Ｕ ｒＲＮＡ
ｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、
２．５Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））を加え、こ
の反応物を３７℃において３０分間インキュベートした
のち、９４℃に１分間、５０℃に２分間、そして７２℃
に２分間おいた。増幅反応は、４０サイクル繰り返され
た。プライマーペアＡ／ＢおよびＣ／Ｄは、マウスＦ３
プローブ： プライマー 配列番号 配列 マウスＦ３中の （図１） ヌクレオチド位置 Ａ ３ CTCTGGTGATCACAAATC １７４２−１７５９ Ｂ ４ TCATCTGAGAGAATCGTC ２１８１−２１９８ Ｃ １ TAGACCGGATGGCCAACA ３０８７−３１０４ Ｄ ２ CTCGACAACATACTCTCC ３１６３−３１８０ の増幅に用いた（プライマーＢとＤは互いにマウスＦ３
の逆相補体である）。
ＤＮＡをクローン化してヒトのコンタクチンとしての特
徴を確認した。マウスＦ３プローブを用いて、ヒトの神
経芽細胞腫のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をスクリーニングし
た。プローブは、ゲナリニ（Ｇｅｎｎａｒｉｎｉ）ら、
前記に報告されたマウスＦ３配列に基づくプライマーの
ペアを用いてマウス脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡの逆転写酵素
−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生じさせ
た（ＧＥＮＢＡＮＫ ｌｏｃｕｓ：マウスＦ３、アクセ
ション＃Ｘ１４９４３）。ＲＴ−ＰＣＲを実施するため
に、オリゴｄ（Ｔ）セルロース法（マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．１９８２）を用いて、マウス脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ
を調製した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応は、ゴブレット（Ｇ
ｏｂｌｅｔ）ら（１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１７：２１４４）に記載された一段階プロ
トコルに基づいた。６６μｌのＤＥＰＣ水中のｐｏｌｙ
Ａ＋ＲＮＡ（１μｇ）および３００ｎｇの各プライマー
（下記）を６５℃において１５分間インキュベートした
のち、氷上で冷却した。３３μｌの３×ＲＴ−ＰＣＲ試
薬混合物（３×ＰＣＲ緩衝液、１５０ｍＭ ＫＣｌ，３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，４．５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，０．３％ゼラチン、５００μＭ ｄＮＴＰ
ｓ，２００Ｕ Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、４Ｕ ｒＲＮＡ
ｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、
２．５Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））を加え、こ
の反応物を３７℃において３０分間インキュベートした
のち、９４℃に１分間、５０℃に２分間、そして７２℃
に２分間おいた。増幅反応は、４０サイクル繰り返され
た。プライマーペアＡ／ＢおよびＣ／Ｄは、マウスＦ３
プローブ： プライマー 配列番号 配列 マウスＦ３中の （図１） ヌクレオチド位置 Ａ ３ CTCTGGTGATCACAAATC １７４２−１７５９ Ｂ ４ TCATCTGAGAGAATCGTC ２１８１−２１９８ Ｃ １ TAGACCGGATGGCCAACA ３０８７−３１０４ Ｄ ２ CTCGACAACATACTCTCC ３１６３−３１８０ の増幅に用いた（プライマーＢとＤは互いにマウスＦ３
の逆相補体である）。
【００１７】プローブは、ミホビロビック（Ｍｉｈｏｖ
ｉｌｏｖｉｃ，１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
７：１４−１６）により記載されたとおり、ＳＥＱＵ
ＥＮＡＳＥ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏ
Ｈ）を用いて直接配列決定することにより、マウスＦ３
であることが確認された。この方法は、ＰＣＲで増幅さ
れたＤＮＡ配列を決定するために効果的な方法である。
プライマーペア：配列番号１／配列番号２（９４ｂｐ）
および配列番号３／配列番号４（４５７ｂｐ）をゲルを
用いて精製し、非対象プライマー濃縮物を用いて再度増
幅して一本鎖配列決定鋳型を生成した。
ｉｌｏｖｉｃ，１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
７：１４−１６）により記載されたとおり、ＳＥＱＵ
ＥＮＡＳＥ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏ
Ｈ）を用いて直接配列決定することにより、マウスＦ３
であることが確認された。この方法は、ＰＣＲで増幅さ
れたＤＮＡ配列を決定するために効果的な方法である。
プライマーペア：配列番号１／配列番号２（９４ｂｐ）
および配列番号３／配列番号４（４５７ｂｐ）をゲルを
用いて精製し、非対象プライマー濃縮物を用いて再度増
幅して一本鎖配列決定鋳型を生成した。
【００１８】上記により調製されたマウス配列番号１／
配列番号２のプローブを用いて、ヒト、ケリー（Ｋｅｌ
ｌｙ）神経芽細胞腫ラムダｇｔ１０のｃＤＮＡライブラ
リー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
を、製造者の指示するとおりにスクリーニングした。２
つのｃＤＮＡクローンが単離されたが、図１に示すｃＤ
ＮＡを含むクローンＮＸ−７を含んだ。上流配列を含む
クローンを得るために、マウスの配列番号３／配列番号
４のプローブを用いて、神経芽細胞腫ライブラリーをス
クリーニングした、３つのクローンがこのスクリーニン
グにより同定され、完全なコード配列を含む完全長のク
ローンを一つ含んだ。このクローンはＮＸＩＩ−７と名
付けられた。ラムダｃＤＮＡ挿入物は、ラムダｇｔ１０
のＥｃｏＲＩフォワードプライマーおよびリバースプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅して直接配列決定するか、ま
たは配列決定の前にｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（ＳＫ＋）
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に
サブクローン化した。ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴサブクロ
ーンは、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥを用いたマニュアルによる
ジデオキシターミネーション法によるか、または染料タ
ーミネーション法または染料標識プライマー法を用いた
自動化配列決定（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，モデル３７３Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
において製造者の指示により配列決定した。配列決定プ
ライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成機により合成し
て指示されたとおりにＯＰＣカートリッジ（ＡＢＩ）で
精製した。配列の順序、翻訳、および特徴部分の位置
は、ＩＧ−Ｓｕｉｔｅソフトウエア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）
を用いて決定した。この方法により生産されたｃＤＮＡ
をプローブとして用いて、ヒトのコンタクチンをコード
するゲノミックＤＮＡを単離する。
配列番号２のプローブを用いて、ヒト、ケリー（Ｋｅｌ
ｌｙ）神経芽細胞腫ラムダｇｔ１０のｃＤＮＡライブラ
リー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
を、製造者の指示するとおりにスクリーニングした。２
つのｃＤＮＡクローンが単離されたが、図１に示すｃＤ
ＮＡを含むクローンＮＸ−７を含んだ。上流配列を含む
クローンを得るために、マウスの配列番号３／配列番号
４のプローブを用いて、神経芽細胞腫ライブラリーをス
クリーニングした、３つのクローンがこのスクリーニン
グにより同定され、完全なコード配列を含む完全長のク
ローンを一つ含んだ。このクローンはＮＸＩＩ−７と名
付けられた。ラムダｃＤＮＡ挿入物は、ラムダｇｔ１０
のＥｃｏＲＩフォワードプライマーおよびリバースプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅して直接配列決定するか、ま
たは配列決定の前にｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（ＳＫ＋）
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に
サブクローン化した。ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴサブクロ
ーンは、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥを用いたマニュアルによる
ジデオキシターミネーション法によるか、または染料タ
ーミネーション法または染料標識プライマー法を用いた
自動化配列決定（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，モデル３７３Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
において製造者の指示により配列決定した。配列決定プ
ライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成機により合成し
て指示されたとおりにＯＰＣカートリッジ（ＡＢＩ）で
精製した。配列の順序、翻訳、および特徴部分の位置
は、ＩＧ−Ｓｕｉｔｅソフトウエア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）
を用いて決定した。この方法により生産されたｃＤＮＡ
をプローブとして用いて、ヒトのコンタクチンをコード
するゲノミックＤＮＡを単離する。
【００１９】ヒトのコンタクチンｃＤＮＡを完全にコー
ドする配列および５’と３’の非翻訳配列は、ｃＤＮＡ
の両鎖（配列番号５；ＥＭＢＬアクセション番号＃Ｚ２
１４８８）を配列決定することにより決定された。さま
ざまなｃＤＮＡクローンの間で、第２４２４番目および
第２５１３番目の２カ所の１塩基置換が観察された。こ
れらの置換は、それぞれ、バリンからアラニン、および
ロイシンからバリンへの変異をもたらす。ヒトのコンタ
クチンｃＤＮＡは、３０５４ｂｐのオープンリーディン
グフレームを含み、該フレームは１０１８の長さのアミ
ノ酸からなるポリペプチド（配列番号６）をコードしう
る。予測されるポリペプチドは、アミノ末端とカルボキ
シル末端に疎水性セグメントを含む。アミノ末端の疎水
性セグメントは、コンセンサスプロセシング部位を含
み、分断されて成熟ポリペプチドのアミノ末端を生じる
シグナル配列であると信じられる。カルボキシル末端の
疎水性成熟は、他のホスファチジルイノシトール結合膜
蛋白質のカルボキシル末端にみられるセグメントと同様
のものであり、糖脂質への結合に際して除去されると信
じられる。Ｎｅｕｒｏ−１抗原がホスファチジルイノシ
トール特異的ホスホリパーゼＣにより細胞表面から放出
されるという事実はこの仮説と合致する。このポリペプ
チドの予測されるアミノ酸配列には、第８３６番目から
第８５０番目に、上記Ｎｅｕｒｏ−１抗原ｌｙｓ−ｃペ
プチドの配列が含まれることから、Ｎｅｕｒｏ−１抗原
はヒトのコンタクチン細胞接着分子であることが確認さ
れた。
ドする配列および５’と３’の非翻訳配列は、ｃＤＮＡ
の両鎖（配列番号５；ＥＭＢＬアクセション番号＃Ｚ２
１４８８）を配列決定することにより決定された。さま
ざまなｃＤＮＡクローンの間で、第２４２４番目および
第２５１３番目の２カ所の１塩基置換が観察された。こ
れらの置換は、それぞれ、バリンからアラニン、および
ロイシンからバリンへの変異をもたらす。ヒトのコンタ
クチンｃＤＮＡは、３０５４ｂｐのオープンリーディン
グフレームを含み、該フレームは１０１８の長さのアミ
ノ酸からなるポリペプチド（配列番号６）をコードしう
る。予測されるポリペプチドは、アミノ末端とカルボキ
シル末端に疎水性セグメントを含む。アミノ末端の疎水
性セグメントは、コンセンサスプロセシング部位を含
み、分断されて成熟ポリペプチドのアミノ末端を生じる
シグナル配列であると信じられる。カルボキシル末端の
疎水性成熟は、他のホスファチジルイノシトール結合膜
蛋白質のカルボキシル末端にみられるセグメントと同様
のものであり、糖脂質への結合に際して除去されると信
じられる。Ｎｅｕｒｏ−１抗原がホスファチジルイノシ
トール特異的ホスホリパーゼＣにより細胞表面から放出
されるという事実はこの仮説と合致する。このポリペプ
チドの予測されるアミノ酸配列には、第８３６番目から
第８５０番目に、上記Ｎｅｕｒｏ−１抗原ｌｙｓ−ｃペ
プチドの配列が含まれることから、Ｎｅｕｒｏ−１抗原
はヒトのコンタクチン細胞接着分子であることが確認さ
れた。
【００２０】上記のとおり、ベーグランドらは、Ｇｐ１
３５と呼ばれる分子について報告しており、彼らは該分
子がマウスＦ３およびニワトリコンタクチン／Ｆ１１の
ヒトにおける同等物の可能性があることを記載してい
る。しかしながら、ベーグランドらは、内部ペプチド配
列は、本発明の対応するペプチドの予測されるアミノ酸
配列（６７９−６９３残基）とは７１％の相同性しかな
いと記載している。
３５と呼ばれる分子について報告しており、彼らは該分
子がマウスＦ３およびニワトリコンタクチン／Ｆ１１の
ヒトにおける同等物の可能性があることを記載してい
る。しかしながら、ベーグランドらは、内部ペプチド配
列は、本発明の対応するペプチドの予測されるアミノ酸
配列（６７９−６９３残基）とは７１％の相同性しかな
いと記載している。
【００２１】ヒトのコンタクチンの予測されるアミノ酸
配列は、６つのイムノグロブリン様ドメインおよび４つ
のフィブロネクチンタイプＩＩＩ様繰り返しを含む。こ
の構造は、マウスＦ３およびニワトリコンタクチン／Ｆ
１１と類似している。２番目のフィブロネクチンタイプ
ＩＩＩ繰り返し中において、カルボキシル末端の保存さ
れたチロシンがマウスＦ３のようにフェニルアラニンに
より置換されている。アスパラギン結合グリコシル化の
ための９つのコンセンサス部位が存在し、これらすべて
はヒトとマウスの間で保存されている。予測されたヒト
およびマウスのポリペプチド配列は９５％相同性であり
２つのアミノ酸だけしかサイズが異ならない。マウスＦ
３は、６番目のイムノグロブリン様ドメイン中に一か所
ジペプチドの挿入物を含むが、ヒトコンタクチンおよび
ニワトリコンタクチン／Ｆ１１にはこれが存在しない。
この配列の違いが、ＲＮＡスプライシングの違いによる
ものなのか、あるいは種間のイントロンーエクソンの差
異を反映しているのかは不明である。配列相同性の低い
領域は約７０％の相同性であり、疎水性アミノ末端およ
びカルボキシル末端セグメントに位置する。
配列は、６つのイムノグロブリン様ドメインおよび４つ
のフィブロネクチンタイプＩＩＩ様繰り返しを含む。こ
の構造は、マウスＦ３およびニワトリコンタクチン／Ｆ
１１と類似している。２番目のフィブロネクチンタイプ
ＩＩＩ繰り返し中において、カルボキシル末端の保存さ
れたチロシンがマウスＦ３のようにフェニルアラニンに
より置換されている。アスパラギン結合グリコシル化の
ための９つのコンセンサス部位が存在し、これらすべて
はヒトとマウスの間で保存されている。予測されたヒト
およびマウスのポリペプチド配列は９５％相同性であり
２つのアミノ酸だけしかサイズが異ならない。マウスＦ
３は、６番目のイムノグロブリン様ドメイン中に一か所
ジペプチドの挿入物を含むが、ヒトコンタクチンおよび
ニワトリコンタクチン／Ｆ１１にはこれが存在しない。
この配列の違いが、ＲＮＡスプライシングの違いによる
ものなのか、あるいは種間のイントロンーエクソンの差
異を反映しているのかは不明である。配列相同性の低い
領域は約７０％の相同性であり、疎水性アミノ末端およ
びカルボキシル末端セグメントに位置する。
【００２２】さらに、Ｎｅｕｒｏ−１抗原がＦ３および
コンタクチン／Ｆ１１のヒトにおける同等物であること
を確認するために、免疫親和性により精製したヒトコン
タクチンを用いて、ウサギにおいてポリクローナル血清
を作成した。この血清は、１：１２，０００希釈にてイ
ムノブロットにおいて免疫原を認識した。また、この血
清は、バクテリアにおいて発現されたグルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ／ヒトコンタクチン融合蛋白質とも
反応した。この融合蛋白質のヒトコンタクチン部分は、
ヒトコンタクチンのカルボキシル末端領域からなり、ｐ
ＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ）中にクローン化されたクローンＮＸ−７中
のｃＤＮＡに相当する。
コンタクチン／Ｆ１１のヒトにおける同等物であること
を確認するために、免疫親和性により精製したヒトコン
タクチンを用いて、ウサギにおいてポリクローナル血清
を作成した。この血清は、１：１２，０００希釈にてイ
ムノブロットにおいて免疫原を認識した。また、この血
清は、バクテリアにおいて発現されたグルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ／ヒトコンタクチン融合蛋白質とも
反応した。この融合蛋白質のヒトコンタクチン部分は、
ヒトコンタクチンのカルボキシル末端領域からなり、ｐ
ＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ）中にクローン化されたクローンＮＸ−７中
のｃＤＮＡに相当する。
【００２３】ＮＸＩＩ−７のｃＤＮＡ挿入物の上流のＥ
ｃｏＲＩ断片およびＮＸ−７の完全ｃＤＮＡ挿入物をプ
ローブとして用いて、さまざまな組織中のヒトのコンタ
クチンの発現パターンを特徴付けた。ヒトの脳は、一つ
の主要な約６．５ｋｂのｍＲＮＡを含んだ。この転写物
は、ヒトのコンタクチンをコードするのに必要な大きさ
より大きく、単離されたｃＤＮＡクローンにおいて完全
に現れない大きな３’非翻訳領域を含むと信じられる。
この単離されたｃＤＮＡは、ヒトのコンタクチン分子の
カルボキシル末端を過ぎてわずか約１．２ｋｂに及ぶ。
ｃｏＲＩ断片およびＮＸ−７の完全ｃＤＮＡ挿入物をプ
ローブとして用いて、さまざまな組織中のヒトのコンタ
クチンの発現パターンを特徴付けた。ヒトの脳は、一つ
の主要な約６．５ｋｂのｍＲＮＡを含んだ。この転写物
は、ヒトのコンタクチンをコードするのに必要な大きさ
より大きく、単離されたｃＤＮＡクローンにおいて完全
に現れない大きな３’非翻訳領域を含むと信じられる。
この単離されたｃＤＮＡは、ヒトのコンタクチン分子の
カルボキシル末端を過ぎてわずか約１．２ｋｂに及ぶ。
【００２４】試験された他の組織においては、膵臓およ
び肺が、セルラインにおいて観察されるパターンと同様
の６．８ｋｂ転写物と６．０ｋｂの二重縞に関して、
（脳に比較して）低いレベルの発現を示した（以下を参
照）。骨格筋および腎臓も同様のことを示したが、極め
て微量の６．８および６．０ｋｂ転写物であった。心臓
および肝臓はヒトのコンタクチンに関してネガティブで
あった。ヒト神経芽細胞腫セルライン、ＩＭＲ−３２，
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＳＭＳＫＡＮおよびＳＫ−Ｎ−ＳＨ
は、網膜芽細胞腫セルラインＹ７９のように、ヒトのコ
ンタクチンのｍＲＮＡを含んだ。これらのセルラインに
おいては、脳の転写物パターンとは対照的に、複数のＲ
ＮＡ種、即ち６．８ｋｂ種、６．０ｋｂ二重縞および
４．２ｋｂ種が観察された。すべての場合において、約
６．８ｋｂ転写物と約６．５ｋｂ転写物が全く異なるも
のなのかは明らかでない。横紋筋肉腫（Ａ２０４，ＲＤ
およびＡ６７３）、造血組織（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔ
ｉｃ）（ＫＧ１ａ．５）、小細胞肺癌腫（ＳＨＰ７７）
およびユーイング肉腫（ＲＤ−ＥＳ）セルラインはヒト
のコンタクチンＲＮＡを発現しなかった。
び肺が、セルラインにおいて観察されるパターンと同様
の６．８ｋｂ転写物と６．０ｋｂの二重縞に関して、
（脳に比較して）低いレベルの発現を示した（以下を参
照）。骨格筋および腎臓も同様のことを示したが、極め
て微量の６．８および６．０ｋｂ転写物であった。心臓
および肝臓はヒトのコンタクチンに関してネガティブで
あった。ヒト神経芽細胞腫セルライン、ＩＭＲ−３２，
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＳＭＳＫＡＮおよびＳＫ−Ｎ−ＳＨ
は、網膜芽細胞腫セルラインＹ７９のように、ヒトのコ
ンタクチンのｍＲＮＡを含んだ。これらのセルラインに
おいては、脳の転写物パターンとは対照的に、複数のＲ
ＮＡ種、即ち６．８ｋｂ種、６．０ｋｂ二重縞および
４．２ｋｂ種が観察された。すべての場合において、約
６．８ｋｂ転写物と約６．５ｋｂ転写物が全く異なるも
のなのかは明らかでない。横紋筋肉腫（Ａ２０４，ＲＤ
およびＡ６７３）、造血組織（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔ
ｉｃ）（ＫＧ１ａ．５）、小細胞肺癌腫（ＳＨＰ７７）
およびユーイング肉腫（ＲＤ−ＥＳ）セルラインはヒト
のコンタクチンＲＮＡを発現しなかった。
【００２５】ヒトのコンタクチンを認識する抗体および
ヒトのコンタクチンをコードするヌクレオチド配列に由
来するヌクレオチドプローブは、それぞれ、蛋白質およ
び核酸配列の検出のための方法に有用である。ヌクレオ
チドプローブは、クローン化されたｃＤＮＡの全配列ま
たはその一部を含む。当業者は、ヌクレオチドプローブ
が、クローン化された配列に相補的な配列のすべてまた
は一部からなるように構成されることをさらに認識する
であろう。コンタクチン蛋白質を検出するために、蛋白
質とその抗体の間の結合を含むイムノアッセイ法、例え
ばＥＬＩＳＡ、およびイムノブロットを、本明細書にお
いて開示される抗体およびコンタクチン糖蛋白質に、容
易に適合させることができる。これらのイムノアッセイ
法は当該分野において公知である。通常は、蛋白質と抗
体の間の結合の検出は、結合反応におけるシグナルモイ
エティを含むことにより達成される。これは、通常は、
抗体または蛋白質に結合された検出可能な標識の形態で
ある。検出可能な標識は、直接検出可能なもの（例え
ば、染料、放射性標識または蛍光色素）、またはさらな
る化学反応後に検出可能なもの（例えば、反応して発色
生成物を生成する酵素または標識アビジンに結合させう
るビオチン）でありうる。
ヒトのコンタクチンをコードするヌクレオチド配列に由
来するヌクレオチドプローブは、それぞれ、蛋白質およ
び核酸配列の検出のための方法に有用である。ヌクレオ
チドプローブは、クローン化されたｃＤＮＡの全配列ま
たはその一部を含む。当業者は、ヌクレオチドプローブ
が、クローン化された配列に相補的な配列のすべてまた
は一部からなるように構成されることをさらに認識する
であろう。コンタクチン蛋白質を検出するために、蛋白
質とその抗体の間の結合を含むイムノアッセイ法、例え
ばＥＬＩＳＡ、およびイムノブロットを、本明細書にお
いて開示される抗体およびコンタクチン糖蛋白質に、容
易に適合させることができる。これらのイムノアッセイ
法は当該分野において公知である。通常は、蛋白質と抗
体の間の結合の検出は、結合反応におけるシグナルモイ
エティを含むことにより達成される。これは、通常は、
抗体または蛋白質に結合された検出可能な標識の形態で
ある。検出可能な標識は、直接検出可能なもの（例え
ば、染料、放射性標識または蛍光色素）、またはさらな
る化学反応後に検出可能なもの（例えば、反応して発色
生成物を生成する酵素または標識アビジンに結合させう
るビオチン）でありうる。
【００２６】プローブへのハイブリダイゼーションによ
る核酸の検出も当該分野において公知である。サザンブ
ロット、ドットブロッティング等の方法は、配列番号５
のヌクレオチド配列情報を適切なプローブの構成に用い
て、ヒトのコンタクチンをコードする核酸配列のすべて
または一部を含むオリゴヌクレオチドの検出に容易に適
合されうる。本発明の目的において、単語「コードす
る」は、転写およびまたは翻訳されてヒトのコンタクチ
ンを生産することができる配列を含む核酸を包含するよ
うに意図される。即ち、ＤＮＡおよびそれから転写され
たＲＮＡは、ヒトのコンタクチンをコードすると考えら
れる。開示された核酸配列に由来するプローブを用いて
開示されたコーディング配列を検出することも認識され
るであろう。イムノアッセイに関して、コンタクチンヌ
クレオチド配列へのプローブのハイブリダイゼーション
は、プローブに関連した（即ち、プローブへ取り込まれ
るかまたはプローブへ結合させた）直接または間接の検
出可能な標識手段により検出される。通常、抗体および
抗原を標識するのに用いられるのと同じ標識を用いてオ
リゴヌクレオチドを標識してよい。さらに、配列番号５
のヌクレオチド配列を用いて相補的配列を誘導し、この
配列を用いてプローブを作成し、また、プローブへのハ
イブリダイゼーションにより検出されることは、当該分
野の範囲内のことである。さらに、ＤＮＡ配列としての
配列番号５の開示により、配列番号５またはその相補的
配列のいずれかを有するＲＮＡ配列が誘導される。この
ような均等なＲＮＡ配列はプローブへのハイブリダイゼ
ーションによっても検出される。
る核酸の検出も当該分野において公知である。サザンブ
ロット、ドットブロッティング等の方法は、配列番号５
のヌクレオチド配列情報を適切なプローブの構成に用い
て、ヒトのコンタクチンをコードする核酸配列のすべて
または一部を含むオリゴヌクレオチドの検出に容易に適
合されうる。本発明の目的において、単語「コードす
る」は、転写およびまたは翻訳されてヒトのコンタクチ
ンを生産することができる配列を含む核酸を包含するよ
うに意図される。即ち、ＤＮＡおよびそれから転写され
たＲＮＡは、ヒトのコンタクチンをコードすると考えら
れる。開示された核酸配列に由来するプローブを用いて
開示されたコーディング配列を検出することも認識され
るであろう。イムノアッセイに関して、コンタクチンヌ
クレオチド配列へのプローブのハイブリダイゼーション
は、プローブに関連した（即ち、プローブへ取り込まれ
るかまたはプローブへ結合させた）直接または間接の検
出可能な標識手段により検出される。通常、抗体および
抗原を標識するのに用いられるのと同じ標識を用いてオ
リゴヌクレオチドを標識してよい。さらに、配列番号５
のヌクレオチド配列を用いて相補的配列を誘導し、この
配列を用いてプローブを作成し、また、プローブへのハ
イブリダイゼーションにより検出されることは、当該分
野の範囲内のことである。さらに、ＤＮＡ配列としての
配列番号５の開示により、配列番号５またはその相補的
配列のいずれかを有するＲＮＡ配列が誘導される。この
ような均等なＲＮＡ配列はプローブへのハイブリダイゼ
ーションによっても検出される。
【００２７】これらイムノアッセイおよびハイブリダイ
ゼーションアッセイを実施するための試薬は、キットの
形態で販売または使用のために共に便利にパッケージさ
れる。イムノアッセイのためのキットは、選択された標
識に結合したヒトのコンタクチンを認識または結合する
抗体、および必要であれば、アッセイを実施するためお
よび標識を検出するために必要なあらゆる試薬を含む。
ハイブリダイゼーションアッセイのためのキットは、配
列番号５に含まれるひとつまたは複数のヌクレオチド配
列にハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドプロー
ブを含むが、その際プローブは選択された標識に結合し
ている。必要であれば、ハイブリダイゼーションキット
は、ハイブリダイゼーションアッセイを実施するためお
よび標識を検出するために必要なあらゆる試薬を含む。
ゼーションアッセイを実施するための試薬は、キットの
形態で販売または使用のために共に便利にパッケージさ
れる。イムノアッセイのためのキットは、選択された標
識に結合したヒトのコンタクチンを認識または結合する
抗体、および必要であれば、アッセイを実施するためお
よび標識を検出するために必要なあらゆる試薬を含む。
ハイブリダイゼーションアッセイのためのキットは、配
列番号５に含まれるひとつまたは複数のヌクレオチド配
列にハイブリダイズする短いオリゴヌクレオチドプロー
ブを含むが、その際プローブは選択された標識に結合し
ている。必要であれば、ハイブリダイゼーションキット
は、ハイブリダイゼーションアッセイを実施するためお
よび標識を検出するために必要なあらゆる試薬を含む。
【００２８】上記の開示は本発明を例示することを意図
しており、本発明の範囲を限定するように意図されたも
のではない。本開示を読めば、熟練を要する練習なし
に、そして本発明の精神から逸脱することなく、特定の
均等物および変更が当業者には明らかとなろう。このよ
うな均等物および変更は、本発明の範囲に含まれる。
しており、本発明の範囲を限定するように意図されたも
のではない。本開示を読めば、熟練を要する練習なし
に、そして本発明の精神から逸脱することなく、特定の
均等物および変更が当業者には明らかとなろう。このよ
うな均等物および変更は、本発明の範囲に含まれる。
【００２９】
配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 TAGACCGGAT GGCCAACA 18 配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CTCGACAACA TACTCTCC 18 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CTCTGGTGAT CACAAATC 18 配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 TCATCTGAGA GAATCGTC 18 配列番号：５ 配列の長さ：３３６０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１２２．．３１７５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１８２．．３１００ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１２２．１８１ 配列の特徴 特徴を表す記号：５’ＵＴＲ 存在位置：１０．．１２１ 配列の特徴 特徴を表す記号：３’ＵＴＲ 存在位置：３１７６．．３３６０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｏｌｙＡ ｓｉｔｅ 存在位置：３２８１．．３２８６ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１．．９ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：３１０１．．３１７５ 配列
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】 配列番号：６ 配列の長さ：１０１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 存在位置：４５．．９４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 存在位置：１３８．．１９１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 存在位置：２４３．．２９０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 存在位置：３３２．．３７１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 存在位置：４１６．．４６４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 存在位置：５０６．．５６３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：６０４．．６５７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：７０７．．７６０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：８０９．．８５７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：９０５．．９５２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：１８８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：２３８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：３１８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：４３７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：４５３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：４７４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：５０１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：５７１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ 存在位置：９１３ 配列
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【図１】図１は、ヒトのコンタクチンｃＤＮＡをクロー
ン化するために用いられるマウスＦ３プローブ、ＮＸ−
７およびＮＸＩＩ−７クローンに含まれる上記ｃＤＮＡ
と、ヒトのコンタクチンコード配列の関係を示す。
ン化するために用いられるマウスＦ３プローブ、ＮＸ−
７およびＮＸＩＩ−７クローンに含まれる上記ｃＤＮＡ
と、ヒトのコンタクチンコード配列の関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ 33/577 9282−4Ｂ ＺＮＡＡ (72)発明者 ジョン・ジャコブ・ヘンパーリー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27502，アペックス，パインウッド・ド ライブ 602 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．197，Ｎｏ．２ （1991） Ｐ．549 −554 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 109， （1989） Ｐ．775−788 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 107， （1988） Ｐ．1561−1573
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号５の核酸配列、配列番号５の１
２２−３１７５の核酸配列または配列番号５の１８２−
３１００の核酸配列を有するポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列番号６のアミノ酸配列または配列番
号６の１−９７３のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項３】 配列番号６のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドに結合するＮｅｕｒｏ−１抗体。 - 【請求項４】 ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１２８２のハイ
ブリドーマから生産される、請求項３記載の抗体。 - 【請求項５】 請求項３に記載された抗体を生産する、
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１２８２のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 ヒトのコンタクチンに下記抗体を結合さ
せるのに適した条件下で請求項３記載の抗体にサンプル
を接触させ、そして抗体の結合を検出する工程からな
る、上記サンプル中のヒトのコンタクチンを検出する方
法。 - 【請求項７】 上記抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１２
８２のハイブリドーマから生産されるものである、請求
項６記載の方法。 - 【請求項８】 配列番号５の核酸配列、配列番号５の１
２２−３１７５の核酸配列もしくは配列番号５の１８２
−３１００の核酸配列、またはこれらの核酸配列のいず
れかに相補的な核酸配列を有するヌクレオチドプローブ
に、核酸ハイブリダイゼーションに適した条件下で下記
サンプルを接触させ、そしてヒトのコンタクチンをコー
ドする核酸配列への上記プローブのハイブリダイゼーシ
ョンを検出する工程からなる、上記サンプル中の、ヒト
のコンタクチンをコードする核酸配列を検出する方法。 - 【請求項９】 配列番号６のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドに結合するモノクローナル抗体Ｎｅｕｒｏ−１
およびヒトのコンタクチンへの上記抗体の結合を検出す
る手段を含む、サンプル中のヒトのコンタクチンを検出
するための材料キット。 - 【請求項１０】 配列番号５の核酸配列、配列番号５の
１２２−３１７５の核酸配列もしくは配列番号５の１８
２−３１００の核酸配列、またはこれらの核酸配列のい
ずれかに相補的な核酸配列を有するヌクレオチドプロー
ブ、ならびに上記核酸配列への上記ヌクレオチドプロー
ブのハイブリダイゼーションを検出するための手段を含
む、配列番号５の核酸配列もしくはその相補的配列、ま
たはそれらの均等物に含まれる核酸配列をサンプル中か
ら検出するための材料キット。
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