JP2001122900A - 抗−ＤＮａｓｅγ抗体並びにその製造及び使用 - Google Patents
抗−ＤＮａｓｅγ抗体並びにその製造及び使用Info
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- JP2001122900A JP2001122900A JP29982499A JP29982499A JP2001122900A JP 2001122900 A JP2001122900 A JP 2001122900A JP 29982499 A JP29982499 A JP 29982499A JP 29982499 A JP29982499 A JP 29982499A JP 2001122900 A JP2001122900 A JP 2001122900A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 DNaseγに特異的なポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体、抗 DNaseγモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた DNaseγの
免疫学的検出法および精製法を提供する。 【解決手段】 DNaseγ分子中のＣ末端部分の配列を含
むペプチドを免疫原に用いることにより、 DNaseγを特
異的に認識する抗 DNaseγ抗体を得ることができる。本
発明の抗 DNaseγモノクローナル抗体およびポリクロー
ナル抗体は、 DNaseγタンパクを特異的に認識する特徴
を有する。
びモノクローナル抗体、抗 DNaseγモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた DNaseγの
免疫学的検出法および精製法を提供する。 【解決手段】 DNaseγ分子中のＣ末端部分の配列を含
むペプチドを免疫原に用いることにより、 DNaseγを特
異的に認識する抗 DNaseγ抗体を得ることができる。本
発明の抗 DNaseγモノクローナル抗体およびポリクロー
ナル抗体は、 DNaseγタンパクを特異的に認識する特徴
を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アポトーシスに関
与する酵素 DNaseγに対する特異的なポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ、並びに該抗体を用いた DNase
γの免疫学的検出法および精製法に関する。
与する酵素 DNaseγに対する特異的なポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ、並びに該抗体を用いた DNase
γの免疫学的検出法および精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞の死に関して、アポトーシス
(apoptosis)が注目されている。このアポトーシスは、
火傷や打撲などの突発的で受動的な細胞死である壊死
（ネクローシス）とは異なり、細胞自身の遺伝子に最初
から組み込まれている生理的及び病理的細胞死であると
考えられている。すなわち、何らかの外部的または内部
的要因が引き金となって、アポトーシスをプログラムす
る遺伝子が活性化され、当該自壊プログラムが発動する
ことによって起こる能動的な細胞死であると考えられて
いる。
(apoptosis)が注目されている。このアポトーシスは、
火傷や打撲などの突発的で受動的な細胞死である壊死
（ネクローシス）とは異なり、細胞自身の遺伝子に最初
から組み込まれている生理的及び病理的細胞死であると
考えられている。すなわち、何らかの外部的または内部
的要因が引き金となって、アポトーシスをプログラムす
る遺伝子が活性化され、当該自壊プログラムが発動する
ことによって起こる能動的な細胞死であると考えられて
いる。
【０００３】アポトーシスは、非常に多くの生命現象に
関わっている。すなわち、発生過程での形態形成のみな
らず、成熟した個体における皮膚の表皮細胞、小腸や胃
の上皮細胞といった正常細胞の交代（古くなった細胞の
除去）、ホルモン依存性の組織である胸腺のグルココル
チコイドによる萎縮、去勢による前立腺の萎縮、さらに
自己成分に反応してしまう免疫担当細胞の排除や、神経
栄養因子の除去による神経細胞死もアポトーシスによる
ことが示唆されている。
関わっている。すなわち、発生過程での形態形成のみな
らず、成熟した個体における皮膚の表皮細胞、小腸や胃
の上皮細胞といった正常細胞の交代（古くなった細胞の
除去）、ホルモン依存性の組織である胸腺のグルココル
チコイドによる萎縮、去勢による前立腺の萎縮、さらに
自己成分に反応してしまう免疫担当細胞の排除や、神経
栄養因子の除去による神経細胞死もアポトーシスによる
ことが示唆されている。
【０００４】また、アポトーシスは、このような生理的
な細胞死だけでなく、放射線照射を受けた細胞や、ウイ
ルス感染した細胞の病理的な細胞死にも見られる。さら
にAIDSウイルスによるＴ細胞の減少もアポトーシスによ
る細胞死が原因であることが報告され、注目を集めてい
る。この他に、薬物や毒物の投与、熱といった化学的お
よび物理的刺激によってもアポトーシスが起こる。さら
にアルツハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞
死、がん病巣内での腫瘍細胞の自然消失や制がん剤によ
る細胞死にもアポトーシスが関与していることが明らか
になっている。
な細胞死だけでなく、放射線照射を受けた細胞や、ウイ
ルス感染した細胞の病理的な細胞死にも見られる。さら
にAIDSウイルスによるＴ細胞の減少もアポトーシスによ
る細胞死が原因であることが報告され、注目を集めてい
る。この他に、薬物や毒物の投与、熱といった化学的お
よび物理的刺激によってもアポトーシスが起こる。さら
にアルツハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞
死、がん病巣内での腫瘍細胞の自然消失や制がん剤によ
る細胞死にもアポトーシスが関与していることが明らか
になっている。
【０００５】したがって、アポトーシスの分子機構を解
明することは、個体発生および成体の維持さらには発が
んの制御（調整）といった生命の根幹における細胞死の
生物学的意義、生理的役割を理解する上で重要である。
明することは、個体発生および成体の維持さらには発が
んの制御（調整）といった生命の根幹における細胞死の
生物学的意義、生理的役割を理解する上で重要である。
【０００６】アポトーシスに共通する特徴的な現象は、
細胞膜の変化（微絨毛の消失）を伴う細胞の縮小、クロ
マチンの凝縮等といった形態上の変化およびクロマチン
DNAの断片化である〔Br. J Cancer 26, 239-257 (197
2), Nature 284, 555-556 (1980) 〕。中でもクロマチ
ンDNA のヌクレオソーム単位での断片化は、アポトーシ
スの発生要因等の多様性にかかわらず、いずれのアポト
ーシス細胞にも共通して見られる最も顕著な現象であ
り、このことからアポトーシスのカスケードはクロマチ
ンDNA の断片化というプロセスに収束することが示唆さ
れている。
細胞膜の変化（微絨毛の消失）を伴う細胞の縮小、クロ
マチンの凝縮等といった形態上の変化およびクロマチン
DNAの断片化である〔Br. J Cancer 26, 239-257 (197
2), Nature 284, 555-556 (1980) 〕。中でもクロマチ
ンDNA のヌクレオソーム単位での断片化は、アポトーシ
スの発生要因等の多様性にかかわらず、いずれのアポト
ーシス細胞にも共通して見られる最も顕著な現象であ
り、このことからアポトーシスのカスケードはクロマチ
ンDNA の断片化というプロセスに収束することが示唆さ
れている。
【０００７】本発明者らは、アポトーシスに特徴的なDN
A 断片化を起こす新規なエンドヌクレアーゼ DNaseγを
見出し、単離精製した。さらなる研究遂行の結果、 DNa
seγがアポトーシスのクロマチンDNA の断片化に関与す
るエンドヌクレアーゼの一つであることを確認し、さら
に DNaseγの一次構造およびその遺伝子の塩基配列を決
定、取得することに成功した（特開平8-187079）。
A 断片化を起こす新規なエンドヌクレアーゼ DNaseγを
見出し、単離精製した。さらなる研究遂行の結果、 DNa
seγがアポトーシスのクロマチンDNA の断片化に関与す
るエンドヌクレアーゼの一つであることを確認し、さら
に DNaseγの一次構造およびその遺伝子の塩基配列を決
定、取得することに成功した（特開平8-187079）。
【０００８】DNaseγがアポトーシスにおけるDNA 断片
化を起こすことから、 DNaseγおよびその制御機構の解
明は、アポトーシスの分子機構の全容、さらには細胞生
存および細胞死のメカニズムを理解するうえで極めて重
要である。さらには、アポトーシスが関与するがん、自
己免疫疾患、AIDS、アルツハイマー病等の神経変性疾患
などの疾患の診断、予防もしくは治療薬を開発する手立
てとなる点で有用である。
化を起こすことから、 DNaseγおよびその制御機構の解
明は、アポトーシスの分子機構の全容、さらには細胞生
存および細胞死のメカニズムを理解するうえで極めて重
要である。さらには、アポトーシスが関与するがん、自
己免疫疾患、AIDS、アルツハイマー病等の神経変性疾患
などの疾患の診断、予防もしくは治療薬を開発する手立
てとなる点で有用である。
【０００９】本発明者らは、さらに研究を進め以下のよ
うな知見を得た。すなわち、がん病巣部位において DNa
seγ発現が著しく減少し、がん細胞においては DNaseγ
の発現がほとんど見られず、アポトーシスを起こしにく
くなっており、また DNaseγ遺伝子を導入することによ
りアポトーシス能が回復することを見出した。そして、
DNaseγに対する抗体を創製すれば、がんの悪性度や予
後の診断等に利用できる可能性があり、有用であること
に着目した。さらに、 DNaseγに対する抗体は、がん、
AIDS、自己免疫疾患、アルツハイマー病等の神経変性疾
患などアポトーシスの関与する疾患の病態の解析・診断
および治療等に利用できる可能性があり、有用であるこ
とに着目した。
うな知見を得た。すなわち、がん病巣部位において DNa
seγ発現が著しく減少し、がん細胞においては DNaseγ
の発現がほとんど見られず、アポトーシスを起こしにく
くなっており、また DNaseγ遺伝子を導入することによ
りアポトーシス能が回復することを見出した。そして、
DNaseγに対する抗体を創製すれば、がんの悪性度や予
後の診断等に利用できる可能性があり、有用であること
に着目した。さらに、 DNaseγに対する抗体は、がん、
AIDS、自己免疫疾患、アルツハイマー病等の神経変性疾
患などアポトーシスの関与する疾患の病態の解析・診断
および治療等に利用できる可能性があり、有用であるこ
とに着目した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】こうした解析を行う上
で、特異性の高い抗体は非常に有用な手段を提供する。
特異性の高い抗体を用いることにより、 DNaseγの特異
的かつ高感度な検出が可能となり、 DNaseγの測定によ
りアポトーシスの関与する病態の解析や診断に有用な情
報を得ることができる。また、 DNaseγの精製に用いる
ことも可能となる。
で、特異性の高い抗体は非常に有用な手段を提供する。
特異性の高い抗体を用いることにより、 DNaseγの特異
的かつ高感度な検出が可能となり、 DNaseγの測定によ
りアポトーシスの関与する病態の解析や診断に有用な情
報を得ることができる。また、 DNaseγの精製に用いる
ことも可能となる。
【００１１】しかしながらこれまで、 DNaseγに対する
特異性の高い抗体を得ることは困難であった。本発明者
らにより DNaseγが単離され、遺伝子配列、アミノ酸配
列が明らかになったことで、免疫に用いる抗原の作成法
が示され、抗体を得るための一つの条件が満たされた。
一般的にある程度純粋な抗原を得ることができれば、そ
れに対する抗体を作製することは可能と考えられる。し
かしながら、抗原の性質により抗体を作製することが困
難な場合も多い。こうした抗原の場合、特異性・結合性
の高い有用な抗体を得るためには、これまでの一般的知
見に加え、それぞれの抗原についてさらに研究、試行錯
誤を重ね抗体の得られる条件を検討する必要がある。
特異性の高い抗体を得ることは困難であった。本発明者
らにより DNaseγが単離され、遺伝子配列、アミノ酸配
列が明らかになったことで、免疫に用いる抗原の作成法
が示され、抗体を得るための一つの条件が満たされた。
一般的にある程度純粋な抗原を得ることができれば、そ
れに対する抗体を作製することは可能と考えられる。し
かしながら、抗原の性質により抗体を作製することが困
難な場合も多い。こうした抗原の場合、特異性・結合性
の高い有用な抗体を得るためには、これまでの一般的知
見に加え、それぞれの抗原についてさらに研究、試行錯
誤を重ね抗体の得られる条件を検討する必要がある。
【００１２】そこで本発明は、 DNaseγを特異的に認識
する抗体を作製する方法、および生化学的分析、各種疾
病の治療、診断等に有用な DNaseγを特異的に認識する
抗体を提供することを目的とする。
する抗体を作製する方法、および生化学的分析、各種疾
病の治療、診断等に有用な DNaseγを特異的に認識する
抗体を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々の D
Naseγ抗原を作製し免疫を試み、解析することによりDN
aseγ特異的抗体を作製する方法を見出した。すなわ
ち、通常のリコンビナントタンパクを免疫することでは
特異的な抗体を作製することが困難であり、また、３種
の DNaseγ部分ペプチドに対する抗体も DNaseγタンパ
クは認識しないことを見出した。これに対し、 DNaseγ
のＣ末端部分に相当するペプチドを免疫原に用いること
により、 DNaseγタンパク特異的な抗体を得られること
を見出した。
Naseγ抗原を作製し免疫を試み、解析することによりDN
aseγ特異的抗体を作製する方法を見出した。すなわ
ち、通常のリコンビナントタンパクを免疫することでは
特異的な抗体を作製することが困難であり、また、３種
の DNaseγ部分ペプチドに対する抗体も DNaseγタンパ
クは認識しないことを見出した。これに対し、 DNaseγ
のＣ末端部分に相当するペプチドを免疫原に用いること
により、 DNaseγタンパク特異的な抗体を得られること
を見出した。
【００１４】本発明者は、 DNaseγに対する特異的な抗
体を調製するために、 DNaseγのアミノ酸配列をもと
に、免疫原として種々のリコンビナント DNaseγタンパ
クおよび種々の合成ペプチドを試みた。リコンビナント
DNaseγタンパクを免疫した場合、 DNaseγに対する抗
体価はあまり上昇せず抗 DNaseγ特異抗体の作製は困難
であり、また、Ｃ末端部分以外の３種のペプチドを免疫
原に用いた場合、得られる抗体は DNaseγタンパクを認
識しないことを見出した。鋭意研究の結果、抗 DNaseγ
抗体を得るためには、 DNaseγのＣ末端部分のペプチド
を免疫原として用いる方法が有用であることを見出し
た。
体を調製するために、 DNaseγのアミノ酸配列をもと
に、免疫原として種々のリコンビナント DNaseγタンパ
クおよび種々の合成ペプチドを試みた。リコンビナント
DNaseγタンパクを免疫した場合、 DNaseγに対する抗
体価はあまり上昇せず抗 DNaseγ特異抗体の作製は困難
であり、また、Ｃ末端部分以外の３種のペプチドを免疫
原に用いた場合、得られる抗体は DNaseγタンパクを認
識しないことを見出した。鋭意研究の結果、抗 DNaseγ
抗体を得るためには、 DNaseγのＣ末端部分のペプチド
を免疫原として用いる方法が有用であることを見出し
た。
【００１５】従って本発明は一般に、 DNaseγタンパク
を特異的に認識する抗体を提供する。より具体的には、
本発明は、 DNaseγタンパクのＣ末端アミノ酸配列を含
むペプチドを認識する抗体を提供する。さらに具体的に
は、本発明は、ヒト DNaseγタンパクのＣ末端の１２ア
ミノ酸配列：Val-Thr-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-Lys-Ser-Ly
s-Arg-Ser(配列番号：１）を含むペプチドを認識する抗
体を提供する。具体例として、ハイブリドーマhg302 (F
ERM P-17471)により生産されるモノクローナル抗体hg30
2 、またはハイブリドーマhg303 (FERM P-17472)により
生産されるモノクローナル抗体hg303 が挙げられる。
を特異的に認識する抗体を提供する。より具体的には、
本発明は、 DNaseγタンパクのＣ末端アミノ酸配列を含
むペプチドを認識する抗体を提供する。さらに具体的に
は、本発明は、ヒト DNaseγタンパクのＣ末端の１２ア
ミノ酸配列：Val-Thr-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-Lys-Ser-Ly
s-Arg-Ser(配列番号：１）を含むペプチドを認識する抗
体を提供する。具体例として、ハイブリドーマhg302 (F
ERM P-17471)により生産されるモノクローナル抗体hg30
2 、またはハイブリドーマhg303 (FERM P-17472)により
生産されるモノクローナル抗体hg303 が挙げられる。
【００１６】本発明はさらに、上記いずれかに記載の抗
体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドー
マの具体例としてハイブリドーマhg302 (FERM P-17471)
又はハイブリドーマhg303 (FERM P-17472)が挙げられ
る。本発明はさらに、 DNaseγタンパクのＣ末端部分の
５〜２０個のアミノ酸配列を含むペプチドで免疫した哺
乳動物の脾細胞と同種のミエローマ細胞を融合させて得
られる細胞をクローニングすることを特徴とする上記の
ハイブリドーマの製造法を提供する。この配列の具体例
として、次の配列：Cys-Val-Thr-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-
Lys-Ser-Lys-Arg-Ser(配列番号：２）が挙げられる。
体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドー
マの具体例としてハイブリドーマhg302 (FERM P-17471)
又はハイブリドーマhg303 (FERM P-17472)が挙げられ
る。本発明はさらに、 DNaseγタンパクのＣ末端部分の
５〜２０個のアミノ酸配列を含むペプチドで免疫した哺
乳動物の脾細胞と同種のミエローマ細胞を融合させて得
られる細胞をクローニングすることを特徴とする上記の
ハイブリドーマの製造法を提供する。この配列の具体例
として、次の配列：Cys-Val-Thr-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-
Lys-Ser-Lys-Arg-Ser(配列番号：２）が挙げられる。
【００１７】本発明はさらに、 DNaseγを含むと疑われ
るヒトまたは動物由来の試料に対して、前記の抗 DNase
γ抗体を接触させることを含んで成る免疫学的に DNase
γを検出または測定する方法を提供する。本発明はさら
に、前記の抗体を含んで成る、がん、AIDS、自己免疫疾
患、アルツハイマー病等の神経変性疾患などアポトーシ
スの関与する病態の診断用試薬を提供する。本発明はさ
らに、前記の抗体を高分子担体に結合したアフィニティ
ー担体に、DNaseγを含む溶液を接触させて特異的に結
合させた後、 DNaseγを溶出することを含んで成る DNa
seγの精製方法を提供する。
るヒトまたは動物由来の試料に対して、前記の抗 DNase
γ抗体を接触させることを含んで成る免疫学的に DNase
γを検出または測定する方法を提供する。本発明はさら
に、前記の抗体を含んで成る、がん、AIDS、自己免疫疾
患、アルツハイマー病等の神経変性疾患などアポトーシ
スの関与する病態の診断用試薬を提供する。本発明はさ
らに、前記の抗体を高分子担体に結合したアフィニティ
ー担体に、DNaseγを含む溶液を接触させて特異的に結
合させた後、 DNaseγを溶出することを含んで成る DNa
seγの精製方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明の抗 DNaseγ抗体は、 DNa
seγ分子中のＣ末端部分のアミノ酸配列を含むペプチド
を特異的に認識する抗 DNaseγ抗体であることを特徴と
する。また本発明の抗 DNaseγ抗体は、 DNaseγタンパ
クを特異的に認識することができることを特徴とする。
seγ分子中のＣ末端部分のアミノ酸配列を含むペプチド
を特異的に認識する抗 DNaseγ抗体であることを特徴と
する。また本発明の抗 DNaseγ抗体は、 DNaseγタンパ
クを特異的に認識することができることを特徴とする。
【００１９】DNaseγ分子中のＣ末端部分のアミノ酸配
列は種間で異なっており（図４；配列番号：３，４及び
５）、この部分に対して抗体を作製すれば種特異性の高
い抗体を得ることができる。すなわちヒト DNaseγのＣ
末端部分のアミノ酸配列を免疫に用いればヒト DNaseγ
に特異的な抗体が、ラット DNaseγのＣ末端部分のアミ
ノ酸配列を免疫に用いればラット DNaseγに特異的な抗
体が得られる。本発明の方法は抗ヒト DNaseγ抗体のみ
に関するものではなく、他の動物種の DNaseγに対する
抗体の作成にも応用できる。
列は種間で異なっており（図４；配列番号：３，４及び
５）、この部分に対して抗体を作製すれば種特異性の高
い抗体を得ることができる。すなわちヒト DNaseγのＣ
末端部分のアミノ酸配列を免疫に用いればヒト DNaseγ
に特異的な抗体が、ラット DNaseγのＣ末端部分のアミ
ノ酸配列を免疫に用いればラット DNaseγに特異的な抗
体が得られる。本発明の方法は抗ヒト DNaseγ抗体のみ
に関するものではなく、他の動物種の DNaseγに対する
抗体の作成にも応用できる。
【００２０】ここで DNaseγ分子中のＣ末端部分のアミ
ノ酸配列を含むペプチドとは、 DNaseγ分子中のＣ末端
を含む５アミノ酸残基以上の配列を含むペプチドであ
り、他のペプチド・タンパクとの融合ペプチドを含む。
また、免疫原性を向上させるため、これらのペプチドを
ウシ血清アルブミン（BSA)、オボアルブミン（OVA)など
のキャリアタンパクと結合させた物も含む。本発明のハ
イブリドーマは、 DNaseγ中のＣ末端部分の配列を特異
的に認識することができ、或いは DNaseγタンパクを特
異的に認識することができるモノクローナル抗体産生能
力を有するハイブリドーマである。
ノ酸配列を含むペプチドとは、 DNaseγ分子中のＣ末端
を含む５アミノ酸残基以上の配列を含むペプチドであ
り、他のペプチド・タンパクとの融合ペプチドを含む。
また、免疫原性を向上させるため、これらのペプチドを
ウシ血清アルブミン（BSA)、オボアルブミン（OVA)など
のキャリアタンパクと結合させた物も含む。本発明のハ
イブリドーマは、 DNaseγ中のＣ末端部分の配列を特異
的に認識することができ、或いは DNaseγタンパクを特
異的に認識することができるモノクローナル抗体産生能
力を有するハイブリドーマである。
【００２１】上記のペプチドを用いて抗体を得るために
は、５アミノ酸残基以上、好ましくは５〜２０アミノ酸
残基からなるペプチドを免疫原として用いることができ
る。ペプチドは、KLH, BSA, OVA などのキャリアタンパ
クと化学的に結合させ、免疫原性を高める方法がよく用
いられる。この化学結合のため、結合したい部位にシス
テインを含むペプチドを作製し、システインの−ＳＨ基
を用いてキャリアタンパクに結合させることができる。
Ｃ末端部分のペプチドを用いる場合、ペプチドのＮ末端
にシステインをおいてキャリアタンパクと結合させるの
が一般的である。
は、５アミノ酸残基以上、好ましくは５〜２０アミノ酸
残基からなるペプチドを免疫原として用いることができ
る。ペプチドは、KLH, BSA, OVA などのキャリアタンパ
クと化学的に結合させ、免疫原性を高める方法がよく用
いられる。この化学結合のため、結合したい部位にシス
テインを含むペプチドを作製し、システインの−ＳＨ基
を用いてキャリアタンパクに結合させることができる。
Ｃ末端部分のペプチドを用いる場合、ペプチドのＮ末端
にシステインをおいてキャリアタンパクと結合させるの
が一般的である。
【００２２】ペプチドとキャリアタンパクとの化学結合
には、種々の化学的架橋試薬を用いることができる。架
橋剤は、目的とする官能基により適当な反応性のものが
選択される。たとえばアミノ基と−ＳＨ基とを架橋する
場合、サクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］
シクロヘキサン−１カルボキシレート（SMCC）、Ｎ−サ
クシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオ
ネート（SPDP）などが用いられる。
には、種々の化学的架橋試薬を用いることができる。架
橋剤は、目的とする官能基により適当な反応性のものが
選択される。たとえばアミノ基と−ＳＨ基とを架橋する
場合、サクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］
シクロヘキサン−１カルボキシレート（SMCC）、Ｎ−サ
クシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオ
ネート（SPDP）などが用いられる。
【００２３】モノクローナル抗体を得るためには、モル
モット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、製
造、操作の簡便性より、マウスを使うことが好ましい。
免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、皮
下、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主として腹腔内、皮下、静脈内に注入す
るのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可変度は
高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約
２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは
約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用
いられる。
モット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、製
造、操作の簡便性より、マウスを使うことが好ましい。
免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、皮
下、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主として腹腔内、皮下、静脈内に注入す
るのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可変度は
高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約
２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは
約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用
いられる。
【００２４】免疫量は１回にペプチド量として、マウス
当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１μｇ〜３０μｇ
用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分
採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓
細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。上記脾臓
細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘出したマ
ウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフェラーゼ欠損(HGPRT- ) や、チミジ
ンキナーゼ欠損（TK- ）の様なマーカーを持った適切な
同種または異種（好ましくは同種）のミエローマ（例、
SP2, P3-X63-Ag・8UI)等の、リンパ球様細胞株との間で
融合させる。
当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１μｇ〜３０μｇ
用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分
採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓
細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。上記脾臓
細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘出したマ
ウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフェラーゼ欠損(HGPRT- ) や、チミジ
ンキナーゼ欠損（TK- ）の様なマーカーを持った適切な
同種または異種（好ましくは同種）のミエローマ（例、
SP2, P3-X63-Ag・8UI)等の、リンパ球様細胞株との間で
融合させる。
【００２５】例えばレーンの方法（Methods in Enzymol
ogy 121, 1980 ; 183-192 ) に準じて融合させることに
より製造される。すなわち、たとえばミエローマ細胞と
脾細胞とを約３：５の割合で、例えばRPMI1640培地に懸
濁させ、ポリエチレングリコール（PEG)、センダイウイ
ルス等の融合剤が用いられる。PEG の重合度は、ふつう
約 1,000〜6,000 、時間は約０．５〜３０分、濃度は約
１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例
として、PEG 1,500 を約３５％で約４〜１０分間処理す
ることにより、効率よく融合させることが出来る。
ogy 121, 1980 ; 183-192 ) に準じて融合させることに
より製造される。すなわち、たとえばミエローマ細胞と
脾細胞とを約３：５の割合で、例えばRPMI1640培地に懸
濁させ、ポリエチレングリコール（PEG)、センダイウイ
ルス等の融合剤が用いられる。PEG の重合度は、ふつう
約 1,000〜6,000 、時間は約０．５〜３０分、濃度は約
１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例
として、PEG 1,500 を約３５％で約４〜１０分間処理す
ることにより、効率よく融合させることが出来る。
【００２６】融合細胞は、ヒポキサンチン−アザセリン
培地（ＨＡ培地）等を用いて、選択的且つ、効率的に増
殖させることが出来る。増殖して来た細胞の培養上清
は、目的とする抗体産生があるか否かについてスクリー
ニングを行うことができるが、抗体価のスクリーニング
は次の様に行うことが出来る。即ち、この場合には、免
疫したペプチドに対する抗体産生の有無を、エンザイム
イムノアッセイ（EIA)法またはラジオイムノアッセイ
（RIA)法等の方法で調べることが出来るが、これらの方
法についても種々の変法が可能である。
培地（ＨＡ培地）等を用いて、選択的且つ、効率的に増
殖させることが出来る。増殖して来た細胞の培養上清
は、目的とする抗体産生があるか否かについてスクリー
ニングを行うことができるが、抗体価のスクリーニング
は次の様に行うことが出来る。即ち、この場合には、免
疫したペプチドに対する抗体産生の有無を、エンザイム
イムノアッセイ（EIA)法またはラジオイムノアッセイ
（RIA)法等の方法で調べることが出来るが、これらの方
法についても種々の変法が可能である。
【００２７】好ましい測定法の一例として、EIA を用い
る一つの方法について述べる。９６穴マイクロテストプ
レートに、免疫したペプチドを常法に従ってコートさせ
ておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を
加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下にお
いても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗
った後、酵素で標識した例えば抗マウス免疫グロブリン
抗体（酵素と抗体を常法に従いカプリングさせた後精製
したもの）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応
物をよく洗った後、酸素基質を加え、一定時間、定温で
反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等
で測定する。
る一つの方法について述べる。９６穴マイクロテストプ
レートに、免疫したペプチドを常法に従ってコートさせ
ておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を
加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下にお
いても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗
った後、酵素で標識した例えば抗マウス免疫グロブリン
抗体（酵素と抗体を常法に従いカプリングさせた後精製
したもの）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応
物をよく洗った後、酸素基質を加え、一定時間、定温で
反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等
で測定する。
【００２８】選択培地で増殖を示し、免疫に用いたペプ
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界
稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。ク
ローン化された細胞の上清について同様にスクリーニン
グを行い抗体活性の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマクローンが得られる。このように
してクローン化されたハイブリドーマを、液体培地中で
増殖させることにより、培養液から該モノクローナル抗
体を得ることができる。
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界
稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。ク
ローン化された細胞の上清について同様にスクリーニン
グを行い抗体活性の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマクローンが得られる。このように
してクローン化されたハイブリドーマを、液体培地中で
増殖させることにより、培養液から該モノクローナル抗
体を得ることができる。
【００２９】また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を
増殖させ、腹水を採取することにより抗体を取得するこ
とが出来る。このためには、例えばマウスの場合、プリ
スタン（テトラメチルペンタデカン）やミネラルオイル
等を前もって接種したBALB/c等のマウスに約 1×104 〜
1×107 個、好ましくは約 5×105 〜 2×106 個のハイ
ブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好まし
くは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水に蓄積
した抗体は、例えば硫安分画、プロテインＡアフィニテ
ィークロマトグラフィー等により、容易にモノクローナ
ル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することがで
きる。
増殖させ、腹水を採取することにより抗体を取得するこ
とが出来る。このためには、例えばマウスの場合、プリ
スタン（テトラメチルペンタデカン）やミネラルオイル
等を前もって接種したBALB/c等のマウスに約 1×104 〜
1×107 個、好ましくは約 5×105 〜 2×106 個のハイ
ブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好まし
くは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水に蓄積
した抗体は、例えば硫安分画、プロテインＡアフィニテ
ィークロマトグラフィー等により、容易にモノクローナ
ル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することがで
きる。
【００３０】本発明の免疫学的に DNaseγを検出する方
法は、 DNaseγを含むと疑われるヒトまたは動物の組
織、体液、細胞または細胞株を含む試料に対して、前記
モノクローナル抗体を接触させて、 DNaseγを検出する
ことを特徴とする。本発明で適用可能な免疫化学的な検
出方法には、例えば、免疫組織染色、ウエスタンブロッ
ティング、凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散法、免疫
比漏法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合反応法
（固相法、第二抗体法等）、サンドイッチ法、イムノメ
トリック法、リポソームイムノライシスアッセイ（LIL
A）等があり、また標識物質を用いる検出方法には、ラ
ジムオイムノアッセイ（RIA)、エンザイムイムノアッセ
イ（EIA)、蛍光イムノアッセイ（FIA)、化学発光イムノ
アッセイ、金属イムノアッセイ、スピンイムノアッセイ
等が挙げられる。
法は、 DNaseγを含むと疑われるヒトまたは動物の組
織、体液、細胞または細胞株を含む試料に対して、前記
モノクローナル抗体を接触させて、 DNaseγを検出する
ことを特徴とする。本発明で適用可能な免疫化学的な検
出方法には、例えば、免疫組織染色、ウエスタンブロッ
ティング、凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散法、免疫
比漏法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合反応法
（固相法、第二抗体法等）、サンドイッチ法、イムノメ
トリック法、リポソームイムノライシスアッセイ（LIL
A）等があり、また標識物質を用いる検出方法には、ラ
ジムオイムノアッセイ（RIA)、エンザイムイムノアッセ
イ（EIA)、蛍光イムノアッセイ（FIA)、化学発光イムノ
アッセイ、金属イムノアッセイ、スピンイムノアッセイ
等が挙げられる。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、 DNaseγに特異的な抗体
を作製する手段が得られる。本発明では DNaseγタンパ
クに特異的なアミノ酸配列で免疫を行うため、DNaseI,
DNaseXをはじめとする他のDNase タンパクとは交叉反応
しない DNaseγ特異抗体が得られる。また、 DNaseγの
Ｃ末端部分のアミノ酸配列は動物種間の保存性が低い
（図４）ため、この部分に対する抗体は種特異性の高い
ものが得られる。すなわち本発明の抗ヒト DNaseγ抗体
は、他の種の DNaseγとは交差反応しない。本発明の抗
DNaseγ抗体作成法は、動物種に限定されない。ヒト D
Naseγのみならず、他の動物腫の DNaseγに対する抗体
作製にも応用できる。
を作製する手段が得られる。本発明では DNaseγタンパ
クに特異的なアミノ酸配列で免疫を行うため、DNaseI,
DNaseXをはじめとする他のDNase タンパクとは交叉反応
しない DNaseγ特異抗体が得られる。また、 DNaseγの
Ｃ末端部分のアミノ酸配列は動物種間の保存性が低い
（図４）ため、この部分に対する抗体は種特異性の高い
ものが得られる。すなわち本発明の抗ヒト DNaseγ抗体
は、他の種の DNaseγとは交差反応しない。本発明の抗
DNaseγ抗体作成法は、動物種に限定されない。ヒト D
Naseγのみならず、他の動物腫の DNaseγに対する抗体
作製にも応用できる。
【００３２】そして、本発明抗体により特異的かつ簡便
に DNaseγタンパクを検出でき、医学生物学分野におけ
る DNaseγタンパクの機能と病理学的意義の解析手段を
提供することができる。さらに、 DNaseγタンパクがア
ポトーシスに関連するDNaseであること、 DNaseγの発
現ががん化およびがんの悪性化に伴い低下することなど
から、がんやAIDS、自己免疫疾患、アルツハイマー病な
どの神経変性疾患などアポトーシスの関連した疾患の研
究および診断や治療に関る薬品、医療産業分野で本発明
抗体を利用することが可能である。アポトーシスの関連
した疾患モデル動物を用いた病態の解析にも、本発明の
抗体は有用となる。このことは、アポトーシス感受性の
予知、検出等に役立ち、特にアポトーシスの関与する病
態に関連する分析、治療、診断等に役立つものとして期
待される。
に DNaseγタンパクを検出でき、医学生物学分野におけ
る DNaseγタンパクの機能と病理学的意義の解析手段を
提供することができる。さらに、 DNaseγタンパクがア
ポトーシスに関連するDNaseであること、 DNaseγの発
現ががん化およびがんの悪性化に伴い低下することなど
から、がんやAIDS、自己免疫疾患、アルツハイマー病な
どの神経変性疾患などアポトーシスの関連した疾患の研
究および診断や治療に関る薬品、医療産業分野で本発明
抗体を利用することが可能である。アポトーシスの関連
した疾患モデル動物を用いた病態の解析にも、本発明の
抗体は有用となる。このことは、アポトーシス感受性の
予知、検出等に役立ち、特にアポトーシスの関与する病
態に関連する分析、治療、診断等に役立つものとして期
待される。
【００３３】
【実施例】以下、実施例および参考例を挙げて本発明を
より明確に説明するが、本発明はこれらの実施例によっ
て何ら限定されるものではない。実施例１ ．モノクローナル抗体の作製 ヒト DNaseγペプチド抗原の作成 ヒト DNaseγのＣ末端配列に相当する１２アミノ酸配列
を含む１３アミノ酸からなるペプチドhg3 (Cys-Val-Thr
-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-Lys-Ser-Lys-Arg-Ser)（配列番
号２）を、Fmoc法にて化学合成し、脱塩、精製した。
より明確に説明するが、本発明はこれらの実施例によっ
て何ら限定されるものではない。実施例１ ．モノクローナル抗体の作製 ヒト DNaseγペプチド抗原の作成 ヒト DNaseγのＣ末端配列に相当する１２アミノ酸配列
を含む１３アミノ酸からなるペプチドhg3 (Cys-Val-Thr
-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-Lys-Ser-Lys-Arg-Ser)（配列番
号２）を、Fmoc法にて化学合成し、脱塩、精製した。
【００３４】キャリアタンパクとしてウシ血清アルブミ
ン（BSA)およびオボアルブミン（OVA)を０．１Ｍリン酸
緩衝液（pH７．０）に溶解し、５０倍モル等量のSMCC
（ピアス社）を添加し、キャリアタンパクのアミノ基と
反応させてNHS 基を導入し、未反応物をゲルろ過にて除
いた。上記ペプチドhg3 を０．５mM EDTA、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH６．０）に溶解し、５０倍モル等量をＮ
ＨＳ基を導入したキャリアタンパクと混合してペプチド
のＳＨ基と反応させた。透析により未反応物を除き、hg
3-BSA, hg3-OVAコンジュゲートを作成した。
ン（BSA)およびオボアルブミン（OVA)を０．１Ｍリン酸
緩衝液（pH７．０）に溶解し、５０倍モル等量のSMCC
（ピアス社）を添加し、キャリアタンパクのアミノ基と
反応させてNHS 基を導入し、未反応物をゲルろ過にて除
いた。上記ペプチドhg3 を０．５mM EDTA、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（pH６．０）に溶解し、５０倍モル等量をＮ
ＨＳ基を導入したキャリアタンパクと混合してペプチド
のＳＨ基と反応させた。透析により未反応物を除き、hg
3-BSA, hg3-OVAコンジュゲートを作成した。
【００３５】ハイブリドーマの作製 （１）免疫 上記のhg3-BSA を１匹あたり２０μｇフロイント完全ア
ジュバント（FCA)とともにBALB/cマウス腹腔に投与し
た。２，４，７および９週間後にhg3-BSA ５〜１０μｇ
をフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）とともにマ
ウスの腹 腔内に追加免疫した。
ジュバント（FCA)とともにBALB/cマウス腹腔に投与し
た。２，４，７および９週間後にhg3-BSA ５〜１０μｇ
をフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）とともにマ
ウスの腹 腔内に追加免疫した。
【００３６】（２）細胞融合 上記の免疫マウスに５μｇのhg3-BSA を静脈投与し、投
与３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を得た。常法に従い、
ポリエチレングリコールを用いて脾細胞とマウスミエロ
ーマ細胞SP2/0 Ag14を細胞融合し、さらに、HAT 培地を
用いて雑種細胞を選択的に増殖させた。
与３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を得た。常法に従い、
ポリエチレングリコールを用いて脾細胞とマウスミエロ
ーマ細胞SP2/0 Ag14を細胞融合し、さらに、HAT 培地を
用いて雑種細胞を選択的に増殖させた。
【００３７】（３）抗体産生細胞のスクリーニングとク
ローニング hg3-OVA を予め、ポリスチレン製９６穴マイクロテスト
プレートに固定し、これに雑種細胞の培養上清を反応さ
せ、HRP 標識−ヤギ抗マウスIgG 抗体（ジャクソン社、
生化学工業）を用いた固相酵素免疫測定法（ELISA)に
て、抗ヒト DNaseγ抗体産生細胞を一次スクリーニング
した。さらにリコンビナントヒト DNaseγを固相化した
プレートを用いた同様のELISA により、二次スクリーニ
ングした。
ローニング hg3-OVA を予め、ポリスチレン製９６穴マイクロテスト
プレートに固定し、これに雑種細胞の培養上清を反応さ
せ、HRP 標識−ヤギ抗マウスIgG 抗体（ジャクソン社、
生化学工業）を用いた固相酵素免疫測定法（ELISA)に
て、抗ヒト DNaseγ抗体産生細胞を一次スクリーニング
した。さらにリコンビナントヒト DNaseγを固相化した
プレートを用いた同様のELISA により、二次スクリーニ
ングした。
【００３８】続いてヒト DNaseγタンパク特異的な抗体
産生陽性ウエルを選び、限界希釈法によりクローニング
した。その結果、２種のハイブリドーマクローンが得ら
れ、それぞれハイブリドーマhg302 及びhg303 と命名し
た。このハイブリドーマhg302 およびhg303 は平成１１
年７月１６日にそれぞれ受託番号FERM P-17471およびFE
RN P-17472として工業技術院生命工学工業研究所特許微
生物寄託センターに寄託された。
産生陽性ウエルを選び、限界希釈法によりクローニング
した。その結果、２種のハイブリドーマクローンが得ら
れ、それぞれハイブリドーマhg302 及びhg303 と命名し
た。このハイブリドーマhg302 およびhg303 は平成１１
年７月１６日にそれぞれ受託番号FERM P-17471およびFE
RN P-17472として工業技術院生命工学工業研究所特許微
生物寄託センターに寄託された。
【００３９】モノクローナル抗体の精製とイムノグロブ
リンクラス ヒト DNaseγタンパク特異的なモノクローナル抗体を産
生するマウスハイブリドーマ細胞を、予めプリスタン
（テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投与しておい
た成熟BALB/cマウスの腹腔内に接種し、１０〜１４日後
ハイブリドーマの増殖により肥大したマウスの腹部を切
開し、腹水を回収した。得られた腹水より、HiTrapプロ
テインＡカラム（ファルマシア社）を用いて抗体を精製
した。精製した抗体のイムノグロブリンクラスは、マウ
スモノクローナル抗体サブクラス判定キット(Zymed社）
を用いて決定した。その結果、抗ヒト DNaseγタンパク
モノクローナル抗体hg302 及びhg303 は、共にIgG1, κ
であった。
リンクラス ヒト DNaseγタンパク特異的なモノクローナル抗体を産
生するマウスハイブリドーマ細胞を、予めプリスタン
（テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投与しておい
た成熟BALB/cマウスの腹腔内に接種し、１０〜１４日後
ハイブリドーマの増殖により肥大したマウスの腹部を切
開し、腹水を回収した。得られた腹水より、HiTrapプロ
テインＡカラム（ファルマシア社）を用いて抗体を精製
した。精製した抗体のイムノグロブリンクラスは、マウ
スモノクローナル抗体サブクラス判定キット(Zymed社）
を用いて決定した。その結果、抗ヒト DNaseγタンパク
モノクローナル抗体hg302 及びhg303 は、共にIgG1, κ
であった。
【００４０】実施例２．モノクローナル抗体の特性解析 本発明抗体の特異性、反応性は極めて高く、ウエスター
ンブロッティング、免疫沈降、免疫染色等で利用できる
他、ヒト DNaseγタンパクの機能であるDNA の切断およ
びアポトーシスの解析に用いることができる。以下にそ
の例を示す。図１〜３においては代表してhg303 モノク
ローナル抗体を用いた結果を示すが、hg302 モノクロー
ナル抗体においても同様の結果が得られる。
ンブロッティング、免疫沈降、免疫染色等で利用できる
他、ヒト DNaseγタンパクの機能であるDNA の切断およ
びアポトーシスの解析に用いることができる。以下にそ
の例を示す。図１〜３においては代表してhg303 モノク
ローナル抗体を用いた結果を示すが、hg302 モノクロー
ナル抗体においても同様の結果が得られる。
【００４１】（１）解析に用いる抗原タンパク発現細胞
の作成 下記のプライマー対を用いてヒト DNaseγの終止コドン
を含むオープンリーディングフレームを脾臓由来ポリA
(+)RNA を鋳型に作製したcDNAよりPCR により増幅、pBl
uescript II KS+にサブクローニングした。 DNaseγセンスプライマー：GCTAGCCACCATGTCACGGGAGCTGGCC（配列番号６） DNaseγアンチセンスプライマー１：GCTAGCCTAGGAGCGTTTGCTCTTTG（配列番号７ ）
の作成 下記のプライマー対を用いてヒト DNaseγの終止コドン
を含むオープンリーディングフレームを脾臓由来ポリA
(+)RNA を鋳型に作製したcDNAよりPCR により増幅、pBl
uescript II KS+にサブクローニングした。 DNaseγセンスプライマー：GCTAGCCACCATGTCACGGGAGCTGGCC（配列番号６） DNaseγアンチセンスプライマー１：GCTAGCCTAGGAGCGTTTGCTCTTTG（配列番号７ ）
【００４２】（５′末端にNhe I 認識部位 (GCTAGC) を
含むリンカー配列を付加している）サイクルシークエン
スにより配列を確認した後、Nhe I 消化により切り出し
たDNaseγインサートDNA を、pcDNA3.1-Myc-His B(Invi
torogen社）のXba I 部位にリクローニングし、自然型
DNaseγをコードする発現ベクター、 phDNaseγを得
た。さらに、下記のプライマー対を用いて、ヒト DNase
γ, DNase I, DNase X、及びDNASlL2 の終止コドンをの
ぞくオープンリーディングフレームを、それぞれ脾臓、
胎盤、GOTO細胞、及びHeLa細胞由来ポリA(+)RNA を鋳型
に作製したcDNAよりPCR により増幅、pBluescript II K
S+にサブクローニングした。
含むリンカー配列を付加している）サイクルシークエン
スにより配列を確認した後、Nhe I 消化により切り出し
たDNaseγインサートDNA を、pcDNA3.1-Myc-His B(Invi
torogen社）のXba I 部位にリクローニングし、自然型
DNaseγをコードする発現ベクター、 phDNaseγを得
た。さらに、下記のプライマー対を用いて、ヒト DNase
γ, DNase I, DNase X、及びDNASlL2 の終止コドンをの
ぞくオープンリーディングフレームを、それぞれ脾臓、
胎盤、GOTO細胞、及びHeLa細胞由来ポリA(+)RNA を鋳型
に作製したcDNAよりPCR により増幅、pBluescript II K
S+にサブクローニングした。
【００４３】 DNaseγセンスプライマー：GCTAGCCACCATGTCACGGGAGCTGGCC（配列番号６） DNaseγアンチセンスプライマー２：GCTAGCGAGCGTTTGCTCTTTG（配列番号８） （５′末端にNhe I 認識部位 (GCTAGC) を含むリンカー配列を付加している） DNase Iセンスプライマー：CTCGAGCCACCATGAGGGGCATGAAGCTGCTG( 配列番号９） DNase Iアンチセンスプライマー：CTCGAGACTTCAGCATCACCTCCACTG(配列番号１０ ）
【００４４】 DNase Xセンスプライマー：CTCGAGCCACCATGCACTACCCAACTGCAC（配列番号１１） DNase Xアンチセンスプライマー：CTCGAGAGGCAGCAGGGCACAGCTGA（配列番号１２ ） DNASlL2 センスプライマー：CTCGAGCCACCATGGGCGGGCCCCGGGCT(配列番号１３） DNASlL2 アンチセンスプライマー：CTCGAGATCGGTGGAACTTGAGGGTCAC（配列番号１ ４） （それぞれ５′末端にXho I 認識部位 (CTCGAG) を含むリンカー配列を付加して いる）
【００４５】サイクルシークエンスにより配列を確認し
た後、Nhe I 消化により切り出したDNaseγインサートD
NA を、pcDNA3.1-Myc-His B(Invitorogen社）のXba I
部位にリクローニングし、Ｃ末端にMyc 及びヒスチジン
タグを含む DNaseγをコードする発現ベクター、 phDNa
seγ-Myc-Hisを得た。また、Xho I 消化により切り出し
たインサートDNA を、pcDNA3.1-Myc-His C(Invitorogen
社）のXho I 部位にリクローニングし、Ｃ末端にMyc 及
びヒスチジンタグを含むDNase I, DNase X、及びDNASlL
2 をコードする発現ベクター、phDNase I-Myc-His, phD
Nase X-Myc-His、及びphDNASlL2-Myc-His を得た。
た後、Nhe I 消化により切り出したDNaseγインサートD
NA を、pcDNA3.1-Myc-His B(Invitorogen社）のXba I
部位にリクローニングし、Ｃ末端にMyc 及びヒスチジン
タグを含む DNaseγをコードする発現ベクター、 phDNa
seγ-Myc-Hisを得た。また、Xho I 消化により切り出し
たインサートDNA を、pcDNA3.1-Myc-His C(Invitorogen
社）のXho I 部位にリクローニングし、Ｃ末端にMyc 及
びヒスチジンタグを含むDNase I, DNase X、及びDNASlL
2 をコードする発現ベクター、phDNase I-Myc-His, phD
Nase X-Myc-His、及びphDNASlL2-Myc-His を得た。
【００４６】これらの発現ベクターを、それぞれHeLa S
3 細胞 1×106 個にトランスフェクトし、39時間培養
後、ヒト DNaseγおよびヒト、マウス、ラット DNaseγ
-Myc-His6 タグ融合タンパク、および類縁タンパクであ
るヒトDNase I-Myc-His6, DNase X-Myc-His6, DNASlL2-
Myc-His6を発現させた細胞を回収した。
3 細胞 1×106 個にトランスフェクトし、39時間培養
後、ヒト DNaseγおよびヒト、マウス、ラット DNaseγ
-Myc-His6 タグ融合タンパク、および類縁タンパクであ
るヒトDNase I-Myc-His6, DNase X-Myc-His6, DNASlL2-
Myc-His6を発現させた細胞を回収した。
【００４７】（２）ウエスタンブロットにおける各動物
種の DNaseγとの反応性 ヒト DNaseγおよびヒト、マウス、ラット DNaseγ-Myc
-His6 タグ融合タンパク発現細胞を、それぞれ 2×105
個／レーンSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-
PAGE) した。ゲル中のタンパクをニトロセルロース膜に
転写し、この膜を2.5%ドライミルクによりブロッキイン
グ後、抗ヒト DNaseγモノクローナル抗体hg302, hg303
と室温１時間反応させた。洗浄した後、さらにアルカリ
フォスファターゼ標識抗マウスIgG (NEW ENGLAND BioLa
bs社）を室温１時間反応させ、洗浄後、BCIP/NBTを基質
として呈色を検出した。
種の DNaseγとの反応性 ヒト DNaseγおよびヒト、マウス、ラット DNaseγ-Myc
-His6 タグ融合タンパク発現細胞を、それぞれ 2×105
個／レーンSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-
PAGE) した。ゲル中のタンパクをニトロセルロース膜に
転写し、この膜を2.5%ドライミルクによりブロッキイン
グ後、抗ヒト DNaseγモノクローナル抗体hg302, hg303
と室温１時間反応させた。洗浄した後、さらにアルカリ
フォスファターゼ標識抗マウスIgG (NEW ENGLAND BioLa
bs社）を室温１時間反応させ、洗浄後、BCIP/NBTを基質
として呈色を検出した。
【００４８】図１上パネルは、抗 DNaseγモノクローナ
ル抗体hg303 の反応を示す。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ レーン３ 組換えヒト DNaseγ-MycHis6タグ融合 レーン４ 組換えマウス DNaseγ-MycHis6タグ融合 レーン５ 組換えラット DNaseγ-MycHis6タグ融合 これより、本発明の抗体は分子量33kDa のヒト DNaseγ
タンパクおよび36kDaのヒト DNaseγ-Myc-His6 融合タ
ンパクに特異的に反応し、マウスおよびラットの DNase
γとは交差反応しないことがわかる。すなわち、本発明
の抗体の動物種特異性が高いことが示された。
ル抗体hg303 の反応を示す。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ レーン３ 組換えヒト DNaseγ-MycHis6タグ融合 レーン４ 組換えマウス DNaseγ-MycHis6タグ融合 レーン５ 組換えラット DNaseγ-MycHis6タグ融合 これより、本発明の抗体は分子量33kDa のヒト DNaseγ
タンパクおよび36kDaのヒト DNaseγ-Myc-His6 融合タ
ンパクに特異的に反応し、マウスおよびラットの DNase
γとは交差反応しないことがわかる。すなわち、本発明
の抗体の動物種特異性が高いことが示された。
【００４９】各タンパク発現細胞 1×105 個／レーンを
dsDNA を含むゲルにてSDS-PAGE後、ゲルを5mM2メルカプ
トエタノール (2-ME), 10mM Tris-HCl (pH7.8)溶液中で
50℃１時間洗浄し、さらに10mM Tris-HCl (pH7.8) 溶液
中で４℃３時間ゲル中のタンパクをリフォールディング
させた。このゲルを1mM 2-ME, 3mM CaCl2, 3mM MgCl2,
10mM Tris-HCl (pH7.8) 溶液に移し、３７℃１０時間DN
ase によるdsDNA の分解反応を行った。エチジウムブロ
マイドにより蛍光染色し、残ったdsDNA を検出した。DN
ase によりdsDNA が分解された部分は黒く見える。結果
を図１の下パネルに示す。レーン２−５において、ほぼ
同等の酵素活性が示され、ほぼ同等のDNase タンパク量
となっていることがわかる。
dsDNA を含むゲルにてSDS-PAGE後、ゲルを5mM2メルカプ
トエタノール (2-ME), 10mM Tris-HCl (pH7.8)溶液中で
50℃１時間洗浄し、さらに10mM Tris-HCl (pH7.8) 溶液
中で４℃３時間ゲル中のタンパクをリフォールディング
させた。このゲルを1mM 2-ME, 3mM CaCl2, 3mM MgCl2,
10mM Tris-HCl (pH7.8) 溶液に移し、３７℃１０時間DN
ase によるdsDNA の分解反応を行った。エチジウムブロ
マイドにより蛍光染色し、残ったdsDNA を検出した。DN
ase によりdsDNA が分解された部分は黒く見える。結果
を図１の下パネルに示す。レーン２−５において、ほぼ
同等の酵素活性が示され、ほぼ同等のDNase タンパク量
となっていることがわかる。
【００５０】（３）ウエスタンブロットにおける DNase
γ類縁タンパクとの反応性 ヒト DNaseγ-Myc-His6, DNase I-Myc-His6, DNase X-M
yc-His6, DNASlL2-Myc-His6 融合タンパクそれぞれの発
現細胞を、各 2×105 個／レーンSDS-PAGEした。ゲル中
のタンパクをニトロセルロース膜に転写し、この膜を2.
5%ドライミルクによりブロッキイング後、抗ヒト DNase
γモノクローナル抗体hg302, hg303と室温１時間反応さ
せた。洗浄した後、さらにアルカリフォスファターゼ標
識抗マウスIgG (NEW ENGLAND BioLabs社）を室温１時間
反応させ、洗浄後、BCIP/NBTを基質として呈色を検出し
た。
γ類縁タンパクとの反応性 ヒト DNaseγ-Myc-His6, DNase I-Myc-His6, DNase X-M
yc-His6, DNASlL2-Myc-His6 融合タンパクそれぞれの発
現細胞を、各 2×105 個／レーンSDS-PAGEした。ゲル中
のタンパクをニトロセルロース膜に転写し、この膜を2.
5%ドライミルクによりブロッキイング後、抗ヒト DNase
γモノクローナル抗体hg302, hg303と室温１時間反応さ
せた。洗浄した後、さらにアルカリフォスファターゼ標
識抗マウスIgG (NEW ENGLAND BioLabs社）を室温１時間
反応させ、洗浄後、BCIP/NBTを基質として呈色を検出し
た。
【００５１】図２にhg303 モノクローナル抗体での結果
を示す。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン３ 組換えヒト DNase I-Myc-His6 タグ融合 レーン４ 組換えヒト DNase X-Myc-His6 タグ融合 レーン５ 組換えヒト DNASlL2-Myc-His6 タグ融合 図２より、本発明の抗体は分子量36kDa のヒト DNaseγ
-Myc-His6 融合タンパクに特異的に反応し、 DNaseγと
相同性のある類縁タンパクDNase I, DNase XおよびDNAS
lL2 とは交差反応しないことがわかる。
を示す。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン３ 組換えヒト DNase I-Myc-His6 タグ融合 レーン４ 組換えヒト DNase X-Myc-His6 タグ融合 レーン５ 組換えヒト DNASlL2-Myc-His6 タグ融合 図２より、本発明の抗体は分子量36kDa のヒト DNaseγ
-Myc-His6 融合タンパクに特異的に反応し、 DNaseγと
相同性のある類縁タンパクDNase I, DNase XおよびDNAS
lL2 とは交差反応しないことがわかる。
【００５２】（４）免疫沈降法における反応性 ヒト DNaseγおよびヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合タ
ンパク発現細胞 1×10 6 個を0.3% NP-40溶解液で溶解
し、遠心分離後上清に抗ヒト DNaseγモノクローナル抗
体hg302, hg303または抗myc 抗体 (Invitrogen社）を加
え４℃９０分間反応させた。プロテインＧセファロース
ＦＦを反応液の１／１０容量加えさらに６０分間反応後
遠心し、上清（Ｓ）を得た。沈殿はNP-40 溶解液で３回
洗浄後SDS-PAGEサンプルバッファーに溶解し、沈殿
（Ｐ）とした。これらＳ，Ｐを 1×105細胞相当／レー
ンdsDNA を含むゲルにアプライし、SDS-PAGE後、上記同
様にDNA分解活性を解析した。
ンパク発現細胞 1×10 6 個を0.3% NP-40溶解液で溶解
し、遠心分離後上清に抗ヒト DNaseγモノクローナル抗
体hg302, hg303または抗myc 抗体 (Invitrogen社）を加
え４℃９０分間反応させた。プロテインＧセファロース
ＦＦを反応液の１／１０容量加えさらに６０分間反応後
遠心し、上清（Ｓ）を得た。沈殿はNP-40 溶解液で３回
洗浄後SDS-PAGEサンプルバッファーに溶解し、沈殿
（Ｐ）とした。これらＳ，Ｐを 1×105細胞相当／レー
ンdsDNA を含むゲルにアプライし、SDS-PAGE後、上記同
様にDNA分解活性を解析した。
【００５３】図３にhg303 モノクローナル抗体での免疫
沈降結果を示す。 レーン１：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 をhg303 抗体
を用いて免疫沈降法を行った沈殿 レーン２：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 をhg303 抗体
を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン３：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を抗Myc 抗体
を用いて免疫沈降法を行った沈殿
沈降結果を示す。 レーン１：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 をhg303 抗体
を用いて免疫沈降法を行った沈殿 レーン２：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 をhg303 抗体
を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン３：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を抗Myc 抗体
を用いて免疫沈降法を行った沈殿
【００５４】レーン４：組換えヒト DNaseγ-Myc-His6
を抗Myc 抗体を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン５：組換えヒト DNaseγをhg303 抗体を用いて免
疫沈降法を行った沈殿 レーン６：組換えヒト DNaseγをhg303 抗体を用いて免
疫沈降法を行った上清 レーン７：組換えヒト DNaseγを抗Myc 抗体を用いて免
疫沈降法を行った沈殿 レーン８：組換えヒト DNaseγを抗Myc 抗体を用いて免
疫沈降法を行った上清
を抗Myc 抗体を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン５：組換えヒト DNaseγをhg303 抗体を用いて免
疫沈降法を行った沈殿 レーン６：組換えヒト DNaseγをhg303 抗体を用いて免
疫沈降法を行った上清 レーン７：組換えヒト DNaseγを抗Myc 抗体を用いて免
疫沈降法を行った沈殿 レーン８：組換えヒト DNaseγを抗Myc 抗体を用いて免
疫沈降法を行った上清
【００５５】図３より、ヒト DNaseγは抗ヒト DNaseγ
hg303抗体で沈降されるが抗myc 抗体では沈降されず、
ヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合タンパクは抗ヒト DNa
seγhg303抗体および抗myc 抗体で沈降されることがわ
かる。この結果、抗ヒト DNaseγ hg303抗体は溶液状態
のヒト DNaseγとも反応することが示された。
hg303抗体で沈降されるが抗myc 抗体では沈降されず、
ヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合タンパクは抗ヒト DNa
seγhg303抗体および抗myc 抗体で沈降されることがわ
かる。この結果、抗ヒト DNaseγ hg303抗体は溶液状態
のヒト DNaseγとも反応することが示された。
【００５６】参考例１．リコンビナントヒト DNaseγの
作製 ヒト DNaseγ cDNA をチオレドキシン（Trx)−ヒスチジ
ンタグ融合タンパク発現ベクター（pET32a、ノバジェン
社）およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST)融
合タンパク発現ベクター（pGEX3X、ファルマシア社）に
組み込み、それぞれ大腸菌AD494 (DE3) 株に Trx-DNase
γを、 DH5α株に GST-DNaseγを発現させた。この大腸
菌を培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体
を溶解後、それぞれのリコンビナントタンパクをコバル
ト結合カラム、およびグルタチオン結合カラムを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
作製 ヒト DNaseγ cDNA をチオレドキシン（Trx)−ヒスチジ
ンタグ融合タンパク発現ベクター（pET32a、ノバジェン
社）およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST)融
合タンパク発現ベクター（pGEX3X、ファルマシア社）に
組み込み、それぞれ大腸菌AD494 (DE3) 株に Trx-DNase
γを、 DH5α株に GST-DNaseγを発現させた。この大腸
菌を培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体
を溶解後、それぞれのリコンビナントタンパクをコバル
ト結合カラム、およびグルタチオン結合カラムを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００５７】参考例２．リコンビナントヒト DNaseγの
免疫 上記の Trx-DNaseγおよび GST-DNaseγ 20μｇをFCA
とともにBALB/cマウス腹腔に投与した。２および４週間
後に５〜１０μｇをFIA とともにマウスの腹腔内に追加
免疫した。最終免疫１週間後尾採血し、抗原固相ELISA
にて抗体価を測定したところ、それぞれTrx, GSTに対す
る抗体価は上昇していたが、 DNaseγに対する抗体価は
上昇しなかった。したがって、通常のリコンビナントタ
ンパクの免疫では抗 DNaseγ抗体の作製は困難であるこ
とが示された。
免疫 上記の Trx-DNaseγおよび GST-DNaseγ 20μｇをFCA
とともにBALB/cマウス腹腔に投与した。２および４週間
後に５〜１０μｇをFIA とともにマウスの腹腔内に追加
免疫した。最終免疫１週間後尾採血し、抗原固相ELISA
にて抗体価を測定したところ、それぞれTrx, GSTに対す
る抗体価は上昇していたが、 DNaseγに対する抗体価は
上昇しなかった。したがって、通常のリコンビナントタ
ンパクの免疫では抗 DNaseγ抗体の作製は困難であるこ
とが示された。
【００５８】参考例３．hg1, hg2 #1740ペプチドの合成
・免疫 ヒト DNaseγ(76-86）に相当する１１アミノ酸配列を含
む１２アミノ酸からなるペプチドhg1(配列番号１５）、
ヒト DNaseγ(139−148)に相当する１０アミノ酸配列を
含む１１アミノ酸からなるペプチドhg2(配列番号１６）
およびヒト DNaseγ(79-87）に相当する９アミノ酸配列
を含む１０アミノ酸からなるペプチド#1740(配列番号１
７）をFmoc法にて化学合成し、脱塩、精製した。
・免疫 ヒト DNaseγ(76-86）に相当する１１アミノ酸配列を含
む１２アミノ酸からなるペプチドhg1(配列番号１５）、
ヒト DNaseγ(139−148)に相当する１０アミノ酸配列を
含む１１アミノ酸からなるペプチドhg2(配列番号１６）
およびヒト DNaseγ(79-87）に相当する９アミノ酸配列
を含む１０アミノ酸からなるペプチド#1740(配列番号１
７）をFmoc法にて化学合成し、脱塩、精製した。
【００５９】ウシ血清アルブミン（BSA)およびオボアル
ブミン（OVA)にSMCC（ピアス社）を反応させてNHS 基を
導入した。未反応物を除いた後、これに上記ペプチドhg
1, hg2, #1740 のSH基を反応させ、hg1-BSA, hg1-OVA,
hg2-BSA, hg2-OVA, #1740-BSA, #1740-OVAコンジュゲー
トを作成した。上記のhg1-BSA, hg2-BSA, #1740-BSAそ
れぞれ２０μｇをFCA とともにBALB/cマウス腹腔に投与
した。
ブミン（OVA)にSMCC（ピアス社）を反応させてNHS 基を
導入した。未反応物を除いた後、これに上記ペプチドhg
1, hg2, #1740 のSH基を反応させ、hg1-BSA, hg1-OVA,
hg2-BSA, hg2-OVA, #1740-BSA, #1740-OVAコンジュゲー
トを作成した。上記のhg1-BSA, hg2-BSA, #1740-BSAそ
れぞれ２０μｇをFCA とともにBALB/cマウス腹腔に投与
した。
【００６０】２および４週間後にhg1-BSA, hg2-BSA, #1
740-BSA それぞれ１０μｇをフロイント不完全アジュバ
ント（FIA)とともにマウスの腹腔内に追加免疫した。最
終免疫１週間後尾採血し、抗原固相ELISA にて抗体価を
測定した。それぞれhg1-OVA,hg2-OVA, #1740-OVA に対
する抗体価すなわちペプチドに対する抗体価は上昇して
いたが、 DNaseγタンパクに対する抗体価は上昇しなか
った。したがって、hg1, hg2, #1740 ペプチドに対する
抗体は DNaseγタンパクを認識できないことが示され
た。
740-BSA それぞれ１０μｇをフロイント不完全アジュバ
ント（FIA)とともにマウスの腹腔内に追加免疫した。最
終免疫１週間後尾採血し、抗原固相ELISA にて抗体価を
測定した。それぞれhg1-OVA,hg2-OVA, #1740-OVA に対
する抗体価すなわちペプチドに対する抗体価は上昇して
いたが、 DNaseγタンパクに対する抗体価は上昇しなか
った。したがって、hg1, hg2, #1740 ペプチドに対する
抗体は DNaseγタンパクを認識できないことが示され
た。
【００６１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Advanced Life Science Institute, Inc. <120> Anti-DNase gamma antibody, as well as production and use thereof <130> 993721 <160> <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <223> A part of human DNase gamma <400> 1 Val Thr Leu Arg Lys Lys Thr Lys Ser Lys Arg Ser 1 5 10
【００６２】 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <223> A part of human DNase gamma <400> 2 Cys Val Thr Leu Arg Lys Lys Thr Lys Ser Lys Arg Ser 1 5 10
【００６３】 <210> 3 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Amino acid sequence of human DNase gamma <400> 3 Met Ser Arg Glu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile His 1 5 10 15 Ser Ala Leu Ala Met Arg Ile Cys Ser Phe Asn Val Arg Ser Phe Gly 20 25 30 Glu Ser Lys Gln Glu Asp Lys Asn Ala Met Asp Val Ile Val Lys Val 35 40 45 Ile Lys Arg Cys Asp Ile Ile Leu Val Met Glu Ile Lys Asp Ser Asn 50 55 60 Asn Arg Ile Cys Pro Ile Leu Met Glu Lys Leu Asn Arg Asn Ser Arg 65 70 75 80 Arg Gly Ile Thr Tyr Asn Tyr Val Ile Ser Ser Arg Leu Gly Arg Lys 85 90 95 Thr Tyr Lys Glu Gln Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys Glu Lys Leu Val Ser 100 105 110 Val Lys Arg Ser Tyr His Tyr His Asp Tyr Gln Asp Gly Asp Ala Asp 115 120 125 Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val Val Trp Phe Gln Ser Pro His Thr 130 135 140 Ala Val Lys Asp Phe Val Ile Ile Pro Leu His Thr Thr Pro Glu Thr 145 150 155 160 Ser Val Lys Glu Ile Asp Glu Leu Val Glu Val Tyr Thr Asp Val Lys 165 170 175 His Arg Trp Lys Ala Glu Asn Phe Ile Phe Met Gly Asp Phe Asn Ala 180 185 190 Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys Ala Trp Lys Asn Ile Arg Leu Arg 195 200 205 Thr Asp Pro Arg Phe Val Trp Leu Ile Gly Asp Gln Glu Asp Thr Thr 210 215 220 Val Lys Lys Ser Thr Asn Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Leu Arg Gly 225 230 235 240 Gln Glu Ile Val Ser Ser Val Val Pro Lys Ser Asn Ser Val Phe Asp 245 250 255 Phe Gln Lys Ala Tyr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp Val Ser 260 265 270 Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys Leu Gln Ser Ser Arg Ala Phe Thr 275 280 285 Asn Ser Lys Lys Ser Val Thr Leu Arg Lys Lys Thr Lys Ser Lys Arg 290 295 300 Ser 305
【００６４】 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Rat <223> Amino acid sequence of rat DNase gamma <400> 4 Met Ser Leu Tyr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Ala Ser Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ile Leu Ala Leu His Gly Ala Leu Ser Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asn 20 25 30 Val Arg Ser Phe Gly Glu Ser Lys Lys Glu Asn His Asn Ala Met Asp 35 40 45 Ile Ile Val Lys Ile Ile Lys Arg Cys Asp Leu Ile Leu Leu Met Glu 50 55 60 Ile Lys Asp Ser Asn Asn Asn Ile Cys Pro Met Leu Met Glu Lys Leu 65 70 75 80 Asn Gly Asn Ser Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Val Ile Ser Ser 85 90 95 Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr Lys Glu Gln Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys 100 105 110 Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Ala Lys Tyr Leu Tyr His Asp Tyr Gln 115 120 125 Asp Gly Asp Thr Asp Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val Val Trp Phe 130 135 140 Gln Ala Pro Phe Thr Ala Ala Lys Asp Phe Val Ile Val Pro Leu His 145 150 155 160 Thr Thr Pro Glu Thr Ser Val Lys Glu Ile Asp Glu Leu Ala Asp Val 165 170 175 Tyr Thr Asp Val Arg Arg Arg Trp Lys Ala Glu Asn Phe Ile Phe Met 180 185 190 Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys Ala Trp Lys 195 200 205 Asn Ile Arg Leu Arg Thr Asp Pro Asn Phe Val Trp Leu Ile Gly Asp 210 215 220 Gln Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser Thr Ser Cys Ala Tyr Asp Arg 225 230 235 240 Ile Val Leu Arg Gly Gln Glu Ile Val Asn Ser Val Val Pro Arg Ser 245 250 255 Ser Gly Val Phe Asp Phe Gln Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Glu 260 265 270 Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys Leu Gln Ser 275 280 285 Ser Arg Ala Phe Thr Asn Ser Arg Lys Ser Val Ser Leu Lys Lys Lys 290 295 300 Lys Lys Gly Ser Arg Ser 305 310
【００６５】 <210> 5 <211> 310 <212> PRT <213> Mouse <223> Amino acid sequence of mouse DNase gamma <400> 5 Met Ser Leu His Pro Ala Ser Pro Arg Leu Ala Ser Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ile Leu Ala Leu His Asp Thr Leu Ala Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asn 20 25 30 Val Arg Ser Phe Gly Ala Ser Lys Lys Glu Asn His Glu Ala Met Asp 35 40 45 Ile Ile Val Lys Ile Ile Lys Arg Cys Asp Leu Ile Leu Leu Met Glu 50 55 60 Ile Lys Asp Ser Ser Asn Asn Ile Cys Pro Met Leu Met Glu Lys Leu 65 70 75 80 Asn Gly Asn Ser Arg Arg Ser Thr Thr Tyr Asn Tyr Val Ile Ser Ser 85 90 95 Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr Lys Glu Gln Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys 100 105 110 Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Thr Lys Tyr His Tyr His Asp Tyr Gln 115 120 125 Asp Gly Asp Thr Asp Val Phe Ser Arg Glu Pro Phe Val Val Trp Phe 130 135 140 His Ser Pro Phe Thr Ala Val Lys Asp Phe Val Ile Val Pro Leu His 145 150 155 160 Thr Thr Pro Glu Thr Ser Val Lys Glu Ile Asp Glu Leu Val Asp Val 165 170 175 Tyr Thr Asp Val Arg Ser Gln Trp Lys Thr Glu Asn Phe Ile Phe Met 180 185 190 Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys Ala Trp Gln 195 200 205 Asn Ile Arg Leu Arg Thr Asp Pro Lys Phe Val Trp Leu Ile Gly Asp 210 215 220 Gln Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser Thr Ser Cys Ala Tyr Asp Arg 225 230 235 240 Ile Val Leu Cys Gly Gln Glu Ile Val Asn Ser Val Val Pro Arg Ser 245 250 255 Ser Gly Val Phe Asp Phe Gln Lys Ala Tyr Asp Leu Ser Glu Glu Glu 260 265 270 Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys Leu Gln Ser 275 280 285 Ser Arg Ala Phe Thr Asn Asn Arg Lys Ser Val Ser Leu Lys Lys Arg 290 295 300 Lys Lys Gly Asn Arg Ser 305 310
【００６６】 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase gamma sense primer <400> 6 gctagccacc atgtcacggg agctggcc 28
【００６７】 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase gamma antisense primer 1 <400> 7 gctagcctag gagcgtttgc tctttg 26
【００６８】 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase gamma antisence primer 2 <400> 8 gctagcgagc gtttgctctt tg 22
【００６９】 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase 1 sense primer <400> 9 ctcgagccac catgaggggc atgaagctgc tg 32
【００７０】 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase 1 antisense primer <400> 10 ctcgagactt cagcatcacc tccactg 27
【００７１】 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase X sense primer <400> 11 ctcgagccac catgcactac ccaactgcac 30
【００７２】 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase X antisense primer <400> 12 ctcgagaggc agcagggcac agctga 26
【００７３】 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNASlL2 sense primer <400> 13 ctcgagccac catgggcggg ccccgggct 29
【００７４】 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNASlL2 antisense primer <400> 14 ctcgagatcg gtggaacttg agggtcac 28
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【図１】図１の上パネルは、本発明のモノクローナル抗
体と各種の生物種の DNaseγとの反応性を示すウエスタ
ンブロット像であり、下パネルは各 DNaseγの酵素活性
を示す電気泳動像（ザイモグラフィー）の結果を示す図
面代用写真である（実施例２（２））。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ レーン３ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン４ 組換えマウス DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン５ 組換えラット DNaseγ-Myc-His6 タグ融合
体と各種の生物種の DNaseγとの反応性を示すウエスタ
ンブロット像であり、下パネルは各 DNaseγの酵素活性
を示す電気泳動像（ザイモグラフィー）の結果を示す図
面代用写真である（実施例２（２））。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ レーン３ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン４ 組換えマウス DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン５ 組換えラット DNaseγ-Myc-His6 タグ融合
【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体と、ヒト
由来の各種のDNase との反応性を示す電気泳動後のウエ
スタンブロット像（実施例２（２））であり、その結果
を示す図面代用写真である。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン３ 組換えヒトDNaseI-Myc-His6 タグ融合 レーン４ 組換えヒトDNaseX-Myc-His6 タグ融合 レーン５ 組換えヒトDNASlL2-Myc-His6タグ融合
由来の各種のDNase との反応性を示す電気泳動後のウエ
スタンブロット像（実施例２（２））であり、その結果
を示す図面代用写真である。 レーン１ ネガティブコントロール レーン２ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 タグ融合 レーン３ 組換えヒトDNaseI-Myc-His6 タグ融合 レーン４ 組換えヒトDNaseX-Myc-His6 タグ融合 レーン５ 組換えヒトDNASlL2-Myc-His6タグ融合
【図３】図３は、組換えヒト DNaseγを、本発明のモノ
クローナル抗体hg303 又は抗Myc 抗体を用いて免疫沈降
法を行った場合の結果を示す電気泳動像（ザイモグラフ
ィー）であり、DNase 活性を示す図面代用写真である。 レーン１ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、hg303 抗
体を用いて免疫沈降法を行った沈殿 レーン２ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、hg303 抗
体を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン３ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、抗Myc 抗
体を用いて免疫沈降法を行った沈殿 レーン４ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、抗Myc 抗
体を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン５ 組換えヒト DNaseγを、hg303 抗体を用いて
免疫沈降法を行った沈殿 レーン６ 組換えヒト DNaseγを、hg303 抗体を用いて
免疫沈降法を行った上清 レーン７ 組換えヒト DNaseγを、抗Myc 抗体を用いて
免疫沈降法を行った沈殿 レーン８ 組換えヒト DNaseγを、抗Myc 抗体を用いて
免疫沈降法を行った上清
クローナル抗体hg303 又は抗Myc 抗体を用いて免疫沈降
法を行った場合の結果を示す電気泳動像（ザイモグラフ
ィー）であり、DNase 活性を示す図面代用写真である。 レーン１ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、hg303 抗
体を用いて免疫沈降法を行った沈殿 レーン２ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、hg303 抗
体を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン３ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、抗Myc 抗
体を用いて免疫沈降法を行った沈殿 レーン４ 組換えヒト DNaseγ-Myc-His6 を、抗Myc 抗
体を用いて免疫沈降法を行った上清 レーン５ 組換えヒト DNaseγを、hg303 抗体を用いて
免疫沈降法を行った沈殿 レーン６ 組換えヒト DNaseγを、hg303 抗体を用いて
免疫沈降法を行った上清 レーン７ 組換えヒト DNaseγを、抗Myc 抗体を用いて
免疫沈降法を行った沈殿 レーン８ 組換えヒト DNaseγを、抗Myc 抗体を用いて
免疫沈降法を行った上清
【図４】図４は、ヒト、ラットおよびマウスの DNaseγ
のアミノ酸配列（配列番号：３，４および５）の比較を
示す。
のアミノ酸配列（配列番号：３，４および５）の比較を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/566 ＺＮＡＡ (72)発明者 木村 達治 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡１丁目３番１ 号 株式会社先端生命科学研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 AA14 BA53 BA61 CA04 CA07 DA03 GA03 GA11 HA15 4B050 DD07 FF16C LL10 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ34 QR48 QR51 QR59 QR62 QR77 QS05 QS33 QS35 4B064 AG01 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 CE13 DA01 DA14 DA15 4B065 AA90Y AA92X AA93X AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA31 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA16 BA42 CA40 DA75 DA76 DA86 DA89 EA51 EA53 FA34 FA58 FA72 GA26 HA03 HA05 HA06
Claims (11)
- 【請求項１】 DNaseγタンパクを特異的に認識する抗
体。 - 【請求項２】 DNaseγタンパクのＣ末端アミノ酸配列
を含むペプチドを認識する請求項１に記載の抗体。 - 【請求項３】 ヒト DNaseγタンパクのＣ末端の１２ア
ミノ酸配列：Val-Thr-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-Lys-Ser-Ly
s-Arg-Ser(配列番号：１）を含むペプチドを認識する請
求項１または２に記載の抗体。 - 【請求項４】 ハイブリドーマhg302 (FERM P-17471)に
より生産されるモノクローナル抗体hg302 、またはハイ
ブリドーマhg303 (FERM P-17472)により生産されるモノ
クローナル抗体hg303 である、請求項１〜３のいずれか
１項に記載の抗体。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗
体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項６】 ハイブリドーマhg302 (FERM P-17471)又
はハイブリドーマhg303 (FERM P-17472)である、請求項
５に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項７】 DNaseγタンパクのＣ末端部分の５〜２
０個のアミノ酸配列を含むペプチドで免疫した哺乳動物
の脾細胞と同種のミエローマ細胞を融合させて得られる
細胞をクローニングすることを特徴とする請求項５に記
載のハイブリドーマの製造法。 - 【請求項８】 前記Ｃ末端部分のアミノ酸配列が次の配
列：Cys-Val-Thr-Leu-Arg-Lys-Lys-Thr-Lys-Ser-Lys-Ar
g-Ser(配列番号：２）である、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 DNaseγを含むと疑われるヒトまたは動
物由来の試料に対して、請求項１〜４のいずれか１項に
記載の抗 DNaseγ抗体を接触させることを含んで成る免
疫学的に DNaseγを検出または測定する方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
抗体を含んで成る、がん、AIDS、自己免疫疾患、アルツ
ハイマー病等の神経変性疾患などアポトーシスの関与す
る疾患の病態の診断用試薬。 - 【請求項１１】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
抗体を高分子担体に結合したアフィニティー担体に、 D
Naseγを含む溶液を接触させて特異的に結合させた後、
DNaseγを溶出することを含んで成る DNaseγの精製方
法。
Priority Applications (3)
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-
1999
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-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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