DE69522799T2 - Neuartige desoxyribonuklease - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Desoxyribonuclease (DNase), die die Fragmentierung von DNA, d. h. den Abbau von Chromatin-DNA in Mono- oder Oligonucleosomeinheiten, ein charakteristisches Phänomen bei der Apoptose, katalysiert.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine DNA, die die Aminosäuresequenz der oben genannten neuen DNasen codiert, einen Vektor, der die DNA enthält, eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist, ein Verfahren zur Herstellung der DNase, das das Kultivieren der Wirtszelle umfasst, und einen Antikörper, der Affinität zu der DNase, einem Vorläuferpeptid davon oder einem Fragment davon aufweist.
- Apoptose hat in jüngerer Zeit in Bezug auf den Tod von Zellen oder Geweben Aufmerksamkeit erregt. Im Unterschied zum pathologischen Tod von Zellen (Nekrose) wird Apoptose als Tod angesehen, der von Anfang an in den Genen von Zellen programmiert ist. Bestimmte externe oder interne Faktoren lösen eine Aktivierung der Gene aus, die die Apoptose programmieren, und der aktive Tod ereilt die Zelle als Ergebnis der Aktivierung dieses Selbstzerstörungsprogramms.
- Entwicklungsstadium Morphogenese, Metamorphose, Entstehung des Nervensystems
- Veränderung normaler Zellen Hämocyten, Epidermiszellen, Epithelzellen des Dünndarms und des Magens
- Nervensystem Tod von Neuronen aufgrund der Entfernung von neurotrophen Faktoren
- endokrin Tod von Thymocyten durch Glucocorticoid- Atrophie der Prostata durch Entfernung von An- drogenen
- Immunsystem Tod von Autoimmunzellen Tod von Tumorzellen durch cytotoxische T-Lym- phocyten
- Bestrahlung Tod von Thymocyten hochgradig empfindlich gegenüber Bestrahlung
- Virusinfektion Zelltod durch Infektion mit AIDS oder Influenzavirus
- Krebs Tod von Tumorzellen in bösartigen Geweben
- Medikament, Gift Zelltod durch Antitumormittel oder bakterielle Toxine
- Hitze Tod von Tumorzellen durch Thermotherapie
- Wie oben in Tabelle 1 gezeigt ist, ist die Apoptose an einer großen Zahl von Lebenserscheinungen beteiligt. Es wird vorgeschlagen, dass Apoptose nicht nur für die Morphogenese während Entwicklungsstadien verantwortlich ist, sondern auch für die Veränderung normaler Zellen (Entfernung alter Zellen), wie Epidermiszellen der Haut und Epithelzellen des Dünndarms und des Magens reifer Individuen, Atrophie von hormonabhängigem Gewebethymus durch Glucocorticoid, Atrophie der Prostata durch Kastration, Eliminierung immunkompetenter Zellen, die mit Selbstkomponenten reagieren, und Tod von Neuronen aufgrund der Entfernung von neurotrophen Faktoren.
- Neben einem solchen physiologischen Tod von Zellen findet man Apoptose auch beim Tod von Zellen, die einer Bestrahlung ausgesetzt sind, und bei virusinfizierten Zellen. Es wurde beschrieben, dass die Abnahme der Zahl der T-Lymphocyten aufgrund des AIDS-Virus auch durch Apoptose verursacht wird, was viel Aufmerksamkeit erregte. Daneben wird Apoptose durch chemische oder physikalische Stimulation verursacht, wie die Verabreichung von Medikamenten und giftigen Substanzen sowie Hitze. Es hat sich gezeigt, dass der Tod von Neuronen bei neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimerschen Krankheit, und die natürliche Apoptose von Tumorzellen sowie der Zelltod durch Antitumormittel, die bei Läsion maligner Tumore vorkommen, durch Apoptose verursacht werden.
- Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der Apoptose ist also entscheidend für das Verständnis der biochemischen Bedeutung und der Rolle des Zelltodes in der Ontogenese und der Unterdrückung der Carcinogenese.
- Die charakteristischen Phänomene, die man bei Apoptose gewöhnlich beobachtet, sind morphologische Veränderungen, wie Kontraktion von Zellen zusammen mit den Veränderungen in der Zellmembran (Eliminierung von Mikrovilli) und der Verdichtung von Chromatin sowie die Fragmentierung der Chromatin-DNA [Br. J. Cancer 26, 239-257 (1972), Nature 284, 555-556 (1980)]. Insbesondere die Fragmentierung von Chromatin-DNA in nucleosomale Einheiten (Fig. 1) ist das bemerkenswerteste Phänomen, das man normalerweise bei jeder apoptotischen Zelle beobachtet, unabhängig von der Vielfalt der verursachenden Faktoren der Apoptose, was vermuten lässt, dass die Apoptosekaskade im Vorgang der Fragmentierung von Chromatin-DNA endet.
- Herkömmlicherweise wurde vorgeschlagen, dass die bei der Apoptose gefundene Spaltung von Chromatin-DNA durch eine Zn²&spplus;-empfindliche endogene Ca²&spplus;-abhängige Endonuclease katalysiert wird [J. Immunol. 132, 38-42 (1984), J. Biol. Chem. 266, 18580-18585 (1991), EMBO J. 12, 371-377 (1993), Biochemistry 32, 9129-9136 (1993)].
- Motiviert durch diesen Vorschlag wurden vor kurzem mehrere Arten von Endonucleasen (Nuc 118, DNase I, DNase II), die als die Enzyme angesehen wurden, die möglicherweise an der Apoptose beteiligt sind, aus Thymus oder kultivierten Zellen gereinigt [Biochem. Biophys. Res. Commun. 39, 254-259 (1970), J. Biol. Chem. 266, 18580-18585 (1991), EMBO J. 12, 371-377 (1993), Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-450 (1993)].
- Diese Enzyme wurden jedoch aus normalen Zellen gereinigt, und es gibt keinen schlüssigen Beweis, der die tatsächliche Beteiligung dieser Enzyme an der Apoptose zeigt.
- Daher ist die Aufklärung der Endonuclease, die bei der Apoptose an der Fragmentierung von Chromatin-DNA beteiligt ist, und ihres Steuermechanismus äußerst wichtig, um das ganze Bild des molekularen Mechanismus der Apoptose sowie den Mechanismus der Lebensfähigkeit und des Todes von Zellen zu verstehen. Sie ist auch nützlich für die Entwicklung eines Mittels für die Diagnose, Prävention oder Therapie von Krebs, Autoimmunkrankheiten, AIDS und dergleichen, bei denen die Apoptose eine gewisse Rolle spielt.
- Der Erfinder hat Endonuclease untersucht, die an der Apoptose beteiligt ist, und fand drei Arten von neuen Endonucleasen ("DNase α", "DNase β" und "DNase γ") in Rattenthymocyten-Zellkernfraktionen, wobei diese Endonucleasen selektiv die Verknüpfungsstellen von Chromatin-DNA spalten, was eine DNA-Fragmentierung bewirkt, die die Apoptose charakterisiert. Die drei Arten von Endonucleasen wurden isoliert und gereinigt, und weitere Untersuchungen an diesen ermöglichten die Bestätigung, dass eine davon ("DNase γ") die Endonuclease ist, die für die Fragmentierung von Chromatin-DNA bei der Apoptose verantwortlich ist.
- Dem Erfinder ist es gelungen, die Primärstruktur dieser Endonuclease und die Nucleotidsequenz des entsprechenden Gens zu identifizieren und zu erhalten, was zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung führte.
- Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung folgendes bereit:
- (1) eine neue DNase (DNase γ), bei der es sich um eine Endonuclease handelt, die die Verknüpfungsstellen von Chromatin-DNA selektiv zu spalten vermag und die die folgenden Eigenschaften hat:
- 1. Lokalisierung Zellkern
- 2. Molekulargewicht (i) 33 000 (SDS-PAGE)
- (ii) 31000 (Gelfiltration)
- 3. pH-Optimum 7,2
- 4. Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen Ca²&spplus;/Mg²&spplus;, Mn²&spplus;-abhängig
- 5. Hemmung durch Zn²&spplus; IC&sub5;&sub0; = 40 uM
- 6. DNA-Spaltungsmodus 3'-OH,5'-P-Terminus-bildender Typ.
- (2) Desoxyribonuclease gemäß (1) mit der Aminosäuresequenz der Positionen 26-310 von SEQ ID NO: 1 oder einer partiellen Substitution, Deletion, Insertion oder Modifikation dieser Aminosäuresequenz, welche die in (1) definierten Eigenschaften der Desoxyribonuclease nicht verändert.
- (3) Vorläufer einer Desoxyribonuclease gemäß (1), der einen N-terminalen Vorläuferpeptidbereich aufweist, der von Proteasen in Zellen abgespalten wird.
- (4) Vorläufer einer Desoxyribonuclease gemäß (2), der einen N-terminalen Vorläuferpeptidbereich mit der Aminosäuresequenz der Positionen 1-25 von SEQ ID NO: 1 oder einer partiellen Substitution, Deletion, Insertion oder Modifikation dieser Aminosäuresequenz, welche die in (1) definierten Eigenschaften der Desoxyribonuclease nicht verändert und eine normale Prozessierung erlaubt, aufweist.
- (5) DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die die Desoxyribonuclease gemäß (1) oder (2) oder den Vorläufer gemäß (3) oder (4) codiert.
- (6) DNA gemäß (5), die die Nucleotidsequenz der Nucleotide Nr. 87-941 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
- (7) DNA gemäß (6), die die Nucleotidsequenz der Nucleotide Nr. 12-941 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
- (8) Rekombinanter Vektor, der die DNA gemäß einem der Punkte (5)-(7) umfasst.
- (9) Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Vektor (8) transformiert ist.
- (10) Verfahren zur Herstellung der Desoxyribonuclease gemäß (1) oder (2) oder des Vorläufers gemäß (3) oder (4), welches das Kultivieren der Wirtszelle von (9) und das Ernten der Desoxyribonuclease oder des Vorläufers umfasst.
- (11) Antikörper mit einer Affinität zu einer Desoxyribonuclease gemäß (1) oder (2) oder einem Vorläufer gemäß (3) oder (4).
- Fig. 1 zeigt schematisch die Fragmentierung von DNA bei der Apoptose zusammen mit einem Foto einer Agarose-Gelelektrophorese der fragmentierten DNA.
- Fig. 2 enthält Fotos (a, b), die das Autoradiogramm eines Teils der DNA, die unter Apoptose aus Rattenthymus extrahiert und nach dem Endmarkierungsverfahren analysiert wurde, nach Elektrophorese in 2%igem Agarose-Gel zeigen, wobei a DNA ist, die aus apoptotischem Rattenthymus extrahiert wurde, der Bestrahlung ausgesetzt war, und b DNA ist, die aus apoptotischem Rattenthymus extrahiert wurde, der mit Dexamethason behandelt wurde:
- Spur 1; DNA mit Alkalischer Phosphatase (APase) inkubiert, bevor das 3'-Ende markiert wurde;
- Spur 2: DNA in Abwesenheit von APase inkubiert, bevor das 3'-Ende markiert wurde;
- Spur 3: DNA in Anwesenheit von APase inkubiert, bevor das 5'-Ende markiert wurde;
- Spur 4: DNA in Abwesenheit von APase inkubiert, bevor das 5'-Ende markiert wurde.
- Fig. 3 zeigt das HPLC-Profil (CMSPW-Säule) von unter Verwendung von S-Sepharose erhaltenen DNase-aktiven Fraktionen, die aus normalem Rattenthymus stammen, sowie ein Agarose-Gel-elektrophoretisches Bild jeder Fraktion.
- Fig. 4 zeigt das HPLC-Profil (CMSPW-Säule) von unter Verwendung von S-Sepharose erhaltenen DNase-aktiven Fraktionen, die aus Rattenthymus unter Apoptose stammen, sowie ein Agarose-Gel-elektrophoretisches Bild jeder Fraktion.
- Fig. 5 ist ein Foto, das eine Aktivitätsgelanalyse (elektrophoretische Bilder) der DNasen α, β und γ zeigt:
- Spur 1: Molekulargewicht von DNase α, die aus normalen Rattenthymus-Zellkernen gereinigt wurde, analysiert durch ein Aktivitätsgelsystem;
- Spur 2: Molekulargewicht von DNase β, die aus normalen Rattenthymus-Zellkernen gereinigt wurde, analysiert durch ein Aktivitätsgelsystem;
- Spur 3: Molekulargewicht von DNase γ, die aus Apoptosezelien gereinigt wurde, welche γ-Strahlung ausgesetzt waren, analysiert durch ein Aktivitätsgelsystem;
- wobei die Proteinmolekulargewichtsmarker Phosphorylase b (97 400), Rinderserumalbumin (66 200), Ovalbumin (45 000), Kohlensäure-Anhydrase (31 500), Soja-Trypsin-Inhibitor (21 500) bzw. Lysozym (14 400) waren.
- Fig. 6 zeigt das TSKG-2000SW-Gelfiltrations-HPLC-Profil von DNase α (Figur a), DNase β (Figur b) und DNase γ (Figur c), wobei die Elution mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min erfolgte. Man beachte, dass der Einschub in Figur a eine Eichung des Molekulargewichtsstandardprodukts zeigt [IgG (158 000), Ovalbumin (44 000) und Myoglobin (17 000)].
- Fig. 7 sind Fotos Agarose-Gel-elektrophoretische Bilder, die die pH-Abhängigkeit von DNase α (Figur a), DNase β (Figur b) und DNase γ (Figur c) zeigen. Die Aktivität der gereinigten DNasen α, β und γ wurde jeweils in sauren bis basischen (von links nach rechts, vom Betrachter aus gesehen) Puffern bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgehend von der linken Spur im Foto gezeigt in Essigsäure- KOH-Puffer (pH 4,0, pH 4,4, pH 4,8, pH 5,2 und pH 5,6), MES-NaOH-Puffer (pH 5,6 und pH 6,2), MOPS-NaOH-Puffer (pH 6,8, pH 7,2 und pH 7,6), Tris-HCl- Puffer (pH 7,4, pH 7,8, pH 8,2 und pH 9,0) und CHES-NaOH-Puffer (pH 8,6, pH 9,4 und pH 10,4).
- Fig. 8 zeigt die Wirkungen zweiwertiger Kationen auf die Aktivität der DNasen α, β und γ, wobei a die Aktivität der gereinigten DNase α (-Δ-), DNase β (- -) und DNase γ (- -) ist, die in Gegenwart von 3 mM CaCl&sub2; mit steigenden Konzentrationen von MgCl&sub2; bestimmt wurde, b die Aktivität der gereinigten DNase α (-Δ-), DNase β (- -) und DNase γ (- -) ist, die in Gegenwart von 3 mM MgCl&sub2; mit steigenden Konzentrationen von CaCl&sub2; bestimmt wurde, und c die Aktivität ist, die unter optimalen Bedingungen der jeweiligen DNase mit steigenden Konzentrationen von ZnCl&sub2; bestimmt wurde.
- Fig. 9 enthält Fotos, die die Fragmentierung von DNA durch die DNasen α, β und γ zeigen (auf Autoradiogramm nach Elektrophorese in 2%igem Agarose- Gel), wobei Foto a fragmentierte DNA zeigt, die aus mit DNase α abgebauten HeLa-S3-Zellkernen extrahiert wurde; Foto b zeigt fragmentierte DNA, die aus mit DNase β abgebauten HeLa-S3-Zellkernen extrahiert wurde; und Foto c zeigt fragmentierte DNA, die aus mit DNase γ abgebauten HeLa-S3-Zellkernen extrahiert wurde:
- Spur 1: Vorbehandlung mit Alkalischer Phosphatase (APase) und dann 3'-Endmarkierung;
- Spur 2: 3'-Endmarkierung ohne Vorbehandlung mit APase;
- Spur 3: 5'-Endmarkierung nach Vorbehandlung mit APase;
- Spur 4: 5'-Endmarkierung ohne Vorbehandlung mit APase.
- Fig. 10 zeigt ein SPSPW-HPLC-Profil, wobei die DNase-Aktivität jeder Fraktion durch - - gezeigt ist, die Extinktion jeder Fraktion bei 280 nm durch --- gezeigt ist und der NaCl-Konzentrationsgradient durch - - gezeigt ist.
- Fig. 11 zeigt die Trennung von mit Endopeptidase partiell abgebauten DNase-γ- Fragmenten durch Umkehrphasen-HPLC, wobei a die durch den Abbau mit Lys- C-Endopeptidase freigesetzten Fragmente und b die durch den Abbau mit Asp-N- Endopeptidase freigesetzten Fragmente des Peptids zeigt, das nach Behandlung mit Lys-C-Endopeptidase auf der PVDF-Membran zurückbleibt.
- Der Ansatz zum Identifizieren der an der Apoptose beteiligten Endonuclease besteht darin, die Natur jedes Fragments von Chromatin-DNA, das in apoptotischen Zellen beobachtet wird, und das von DNA-Fragmenten, die durch die aus den Zellkernen apoptotischer Zellen gereinigten Endonucleasen fragmentiert wurden, miteinander zu vergleichen.
- Die in apoptotischen Zellen beobachteten Fragmente von Chromatin-DNA zeigen einen steigenden Anteil von kleinen DNA-Fragmenten, wie nucleosomalem Monomer und Dimer, mit zunehmendem Fortschritt der Apoptose; die Apoptose fragmentiert jedoch nicht die gesamte DNA zu Monomeren, sondern bricht in einem bestimmten Stadium ab. Dementsprechend zeigt DNA, die aus den apoptotischen Zellen extrahiert und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert wurde, DNA-elektrophoretische Bilder mit einer Leiterstruktur, die eine Länge aufweist, die um einen ganzzahligen Faktor länger ist als die DNA (etwa 180 bp), die in nucleosomalem Monomer enthalten ist.
- Die Fragmentierung von DNA, die bei der Apoptose erfolgt, ist Ca²&spplus;/Mg²&spplus;- abhängig und kann durch Zn²&spplus; gehemmt werden. Die erzeugten DNA-Fragmente sind Doppelstränge des Typs 3'-OH/5'-P mit Phosphorsäuregruppen an den 5'- Termini.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung ist eine Endonuclease, die in den Zellkernen von tierischen Zellen vorkommt, vorzugsweise in den Zellkernen von Zellen, die aus dem Thymus, der Milz oder Leber von Säugern wie Ratten und Kälbern stammen, und besonders bevorzugt in den Zellkernen von Zellen, die aus Kalbsthymus oder Rattenmilz stammen. Diese DNase γ kommt mit demselben Grad an Aktivität in den Zellkernen normaler Zellen und den Zellkernen apoptotischer Zellen vor; unabhängig davon, ob eine Apoptose induziert wurde oder nicht. Die DNase γ unterscheidet sich von der DNase α und DNase β, die durch die Induktion von Apoptose Aktivität verlieren. Wie er hier verwendet wird, unterliegt der Ausdruck "Apoptose" keiner besonderen Einschränkung durch die Auslösefaktoren und umfasst nicht nur spontan erzeugte Apoptose, sondern auch künstlich erzeugte Apoptose als Ergebnis der Einwirkung von Strahlung, Glucocorticoidbehandlung und dergleichen.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung ist ein monomeres Polypeptid mit einem durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (im folgenden als SDS-PAGE bezeichnet) bestimmten Molekulargewicht von etwa 33 000 und einem durch Gelfiltrationschromatographie bestimmten Molekulargewicht von etwa 31000. Der bevorzugte Modus der SDS-PAGE ist im Einzelnen in Bezugsbeispiel 4 beschrieben, das in dem später zu erwähnenden Beispiel 2(1) zitiert wird, und der bevorzugte Modus der Gelfiltrationschromatographie ist im Einzelnen in dem später zu erwähnenden Beispiel 2(1) beschrieben.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung ist eine DNase des 3'-OH/5'-P-bildenden Typs, die selektiv die Verknüpfungsstellen von Chromatin-DNA spaltet, wobei Mono- oder Oligonucleosomen entstehen, die an den 5'-Enden Phosphorsäuregruppen aufweisen. Das pH-Optimum für die Aktivität der DNase ist neutral, vorzugsweise etwa 6,8 bis etwa 7,6, besonders bevorzugt etwa 7,2, in MOPS- NaOH-Puffer oder Tris-HCl.
- Die Aktivierung der DNase γ erfordert die Anwesenheit von wenigstens sowohl Ca²&spplus; als auch Mg²&spplus; oder Mn²&spplus; allein, was in der vorliegenden Erfindung als Ca²&spplus;/Mg²&spplus;- oder Mn²&spplus;-abhängig zu bezeichnen ist. Die Konzentration des Ca²&spplus;, Mg²&spplus; und Mn²&spplus; beträgt 1-3 mM, vorzugsweise 3 mM. Besonders bevorzugt sind sowohl 3 mM Ca²&spplus; als auch 3 mM Mg²&spplus; vorhanden.
- Die Aktivität von DNase γ ist empfindlich gegenüber Zn²&spplus; in Mikromolkonzentrationen, bei denen Zn²&spplus; die Apoptose bekanntermaßen hemmt, und Zn²&spplus; mit einer geringen Konzentration von 40 uM hemmt 50% der Aktivität (IC&sub5;&sub0; = 40 uM). Die Aktivität wird durch Aurintricarbonsäure, einen Inhibitor von DNase und RNase, bei einer Konzentration von 100 uM vollständig gehemmt. Die Aktivität der DNase γ wird jedoch nicht von G-Actin gehemmt, von dem man weiß, dass es DNase I hemmt.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung kann nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden, wie einem Verfahren, das die Extraktion und Reinigung aus den Zellkernen von tierischen Geweben oder Zellen als Ausgangsmaterial beinhaltet, einem Verfahren durch chemische Synthese oder genetische Rekombination. Zu den speziellen Beispielen gehört das folgende Verfahren.
- Die als Ausgangsmaterial verwendeten Zellen, die aus dem Thymus, der Milz oder Leber von Säugern, wie Ratte oder Kalb, stammen, vorzugsweise die Zellen, die aus dem Thymus oder der Milz von Ratte oder Kalb stammen, werden homogenisiert, wobei man einen Puffer mit einem pH-Wert im neutralen Bereich, vorzugsweise etwa 7, 8, in Gegenwart eines nichtionischen Tensids verwendet, um den Zellkern zu isolieren. Dann werden die erhaltenen isolierten Zellkerne gegebenenfalls einer Ultraschallbehandlung in Gegenwart von Ammoniumsulfat (wobei der bevorzugte Modus die Verwendung von 0,4-0,5 M Ammoniumsulfat ist) zur Solubilisierung unterzogen, und anschließend erfolgt eine Zentrifugation, was eine Überstandsfraktion ergibt.
- Die erhaltene Überstandsfraktion wird auf eine Chromatographiesäule aufgetragen, wobei man als Träger einen Kationenaustauscher, vorzugsweise einen stark sauren Kationenaustauscher, verwendet und mit der Methode des linearen Gradienten der Salzkonzentration entwickelt, so dass man eine eluierte aktive Fraktion erhält. Dann wird die aktive Fraktion auf eine Säule für HPLC (high performance liquid chromatography) aufgetragen, wobei man als Träger einen Kationenaustauscher, vorzugsweise einen schwach sauren Kationenaustauscher, verwendet und wiederum mit der Methode des linearen Gradienten der Salzkonzentration entwickelt. Wenn die Fraktion mit einem Konzentrationsgradienten von KCl entwickelt wird, wobei man eine CMSPW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm, hergestellt von Tosoh) als Säule sowie 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8), der 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM PMSF und 10% Ethylenglycol enthält, als Eluent verwendet, wird die DNase γ der vorliegenden Erfindung bei einer KCl-Konzentration von etwa 0,55 M eluiert.
- Dann wird die eluierte aktive Fraktion einer bekannten Reinigungschromatographie, wie HPLC unter Verwendung einer Heparinsäule, Gelfiltrations-HPLC und HPLC unter Verwendung eines Kationenaustauschers, die in geeigneter Weise miteinander kombiniert werden, unterzogen, so dass man hochgereinigte Monomer-DNase γ erhält. Die so erhaltene DNase γ wird einer Dialyse, Zentrifugationstrennung, Lyophilisierung und dergleichen unterzogen.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung wird als Enzym angesehen, das an der DNA-Fragmentierung durch Apoptose in Thymus oder Milz, insbesondere in Rattenthymus oder -milz, beteiligt ist, da der Modus der Spaltung von DNA- Fragmenten durch das Enzym mit dem der DNA-Fragmente zusammenfällt, die in Rattenthymus- oder -milzzellen unter Apoptose erzeugt werden, sie haben eine ähnliche Ionenabhängigkeit, und das Enzym ist unter Apoptose in Rattenthymus- oder -milzzellen vorhanden.
- Die DNase γ eignet sich als Werkzeug zur Aufklärung der Apoptose, die in Säugern (z. B. Kuh, Pferd, Maus, Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen) einschließlich des Menschen auftritt, auf molekularer Ebene sowie für die Entwicklung von Diagnostika unter Verwendung eines Antikörpers gegen DNase γ, von apoptoseregulierenden pharmazeutischen Produkten, die einen Inhibitor oder Aktivator der DNase γ enthalten, zur Bewertung von Apoptose sowie als Basis zum Aufbau einer apoptotischen Gentherapie für Krebs und Autoimmunkrankheiten.
- Die bevorzugte DNase γ der vorliegenden Erfindung ist eine DNase mit der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 26-310 in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz unterliegt jedoch keiner besonderen Einschränkung, solange sie die oben definierten Eigenschaften der DNase γ nicht verändert, und kann eine partielle Substitution, Deletion, Insertion oder Modifikation in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 beinhalten.
- Die DNase γ mit einer solchen Aminosäuresequenz kann in geeigneter Weise unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden, wie Verfahren, die die Extraktion und Reinigung aus Zellkernen von tierischen Geweben oder Zellen, chemische Synthese und Genrekombination beinhalten. Spezielle Beispiele dafür sind die Extraktion und Reinigung der Zellen, die aus dem Thymus, der Milz oder Leber von Säugern, wie Ratte oder Kalb, stammen, und besonders bevorzugt der Zellen, die aus Rattenmilz stammen, in derselben Weise wie oben unter (a) beschrieben. Die Aminosäuresequenz der DNase γ wird mit einem direkten Verfahren bestimmt, indem man die nach den folgenden Punkten 1-4 erhaltenen Daten zusammenfassend auswertet:
- 1 vollständige Hydrolyse des Enzyms zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung;
- 2 Bestimmung der N-terminalen Sequenz mit der Edman-Methode und dergleichen und der C-terminalen Sequenz durch Zersetzung unter Zugabe von Hydrazin;
- 3 partieller Abbau unter Verwendung einer Protease oder chemischen Substanz mit anschließender Bestimmung der Aminosäuresequenz jedes Fragments durch einen Aminosäuresequencer; und
- 4 dasselbe Verfahren wie in 3, wobei man eine andere Protease oder chemische Substanz verwendet;
- oder durch ein indirektes Verfahren, das die Klonierung der cDNA oder genomischen DNA von DNase γ und die Bestimmung der Aminosäuresequenz, die der Nucleotidsequenz von deren codierendem Bereich (ORF) entspricht, beinhaltet.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung wird in Zellen zuerst als Vorläufer- DNase-γ mit einem Vorläuferpeptidbereich am N-Terminus synthetisiert, und dann wird der N-terminale Vorläuferpeptidbereich mit Peptidase gespalten, um reife DNase γ zu erhalten.
- Der N-terminale Vorläuferpeptidbereich hat typischerweise die Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 1-25 in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz unterliegt jedoch keiner besonderen Einschränkung, solange sie die oben definierten Eigenschaften der DNase γ nicht verändert und eine normale Prozessierung erlaubt, und kann eine partielle Substitution, Deletion, Insertion oder Modifikation in der Aminosäuresequenz beinhalten.
- Die Aminosäuresequenz des N-terminalen Vorläuferpeptidbereichs kann bestimmt werden, indem man cDNA oder genomische DNA kloniert, um ihre Nucleotidsequenz zu bestimmen, und die Aminosäuresequenz, die der Nucleotidsequenz des in der Nucleotidsequenz enthaltenen ORF entspricht, mit der Aminosäuresequenz in der Nähe des N-Terminus der reifen DNase γ vergleicht.
- Während die DNA der vorliegenden Erfindung keiner besonderen Einschränkung unterliegt, solange es sich um eine DNA mit einer Nucleotidsequenz handelt, die die Aminosäuresequenz der DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert, handelt es sich vorzugsweise um eine DNA, die die Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 26-310 in der Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, codiert, besonders bevorzugt eine DNA mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotide Nr. 87-941 in der Nucleotidsequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
- Die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst die DNA, die das Vorläuferpolypeptid der DNase γ der vorliegenden Erfindung mit einem N-terminalen Vorläuferpeptidbereich codiert. Um genau zu sein: Es handelt sich um eine DNA, die eine DNase γ codiert, welche als N-terminalen Vorläuferpeptidbereich die Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1-25 in der Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, codiert, vorzugsweise eine DNA, die die Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1-310 in der Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, codiert, und besonders bevorzugt eine DNA mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotide Nr. 12-941 in der Nucleotidsequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
- Außerdem kann die DNA der vorliegenden Erfindung durch ein beliebiges Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel umfasst die DNA der vorliegenden Erfindung eine komplementäre DNA (cDNA), die aus mRNA hergestellt wird, eine DNA, die aus genomischer DNA hergestellt wird, eine DNA, die durch chemische Synthese erhalten wird, eine DNA, die durch Amplifikation nach dem PCR- Verfahren unter Verwendung von RNA (cDNA) oder DNA als Matrize erhalten wird, sowie eine DNA, die durch eine geeignete Kombination dieser Verfahren erhalten wird.
- Ein Verfahren zur Klonierung der cDNA von DNase γ aus einer cDNA-Bibliothek, die von den Zellen abgeleitet ist, die DNase γ erzeugen, beinhaltet zum Beispiel folgendes.
- Zuerst wird mRNA [Poly-(A)-RNA] aus den Zellen hergestellt, die zur Expression und Erzeugung von DNase γ befähigt sind, wie Thymocyten und Splenocyten. Die mRNA kann hergestellt werden, indem man eine Voll-RNA, die nach einem bekannten Verfahren, wie dem Guanidinthiocyanatverfahren [Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 5294 (1979)], dem Verfahren mit heißem Phenol und dem Guanidin-Phenol-Chloroform-(AGPC)-Verfahren, hergestellt wird, einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von Oligo(dT)cellulose und Poly-U-sepharose unterzieht. Unter Verwendung der erhaltenen mRNA als Matrize wird dann ein cDNA-Strang nach einem bekannten Verfahren unter Verwendung einer Reversen Transcriptase [Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982), und ibid, 3, 280 (1983), Gubler, H. und Hoffman, B. J., Gene, 25, 263 (1983)] synthetisiert, unter Verwendung von RNase H wird ein Einzelstrangbruch in die Matrizen-RNA eingeführt, und mit DNA-Polymerase I wird doppelsträngige cDNA hergestellt. Nach dem Glattmachen der Enden und der Ligasierung eines Linkers wird die cDNA in einen Plasmidvektor oder einen Phagenvektor eingebaut, und anschließend erfolgt eine Transformation von Escherichia coli oder die in-vitro- Verpackung zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek.
- Der hier zu verwendende Plasmidvektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er replizierbar ist und im Wirt aufrechterhalten werden kann, und der zu verwendende Phagenvektor kann ein beliebiger sein, solange er sich im Wirt vermehren kann. Beispiele für herkömmlicherweise verwendete Klonierungsvektoren sind pUC119, λgt10 und λgt11. Wenn er der später zu erwähnenden Antikörperdurchmusterung unterzogen wird, handelt es sich jedoch vorzugsweise um einen Vektor mit einem Promotor, der zur Expression des DNaseγ-Gens in dem Wirt befähigt ist.
- Das Verfahren zum Einbau von cDNA in ein Plasmid umfasst zum Beispiel das Verfahren, das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989), beschrieben ist. Das Verfahren zum Einbau von cDNA in einen Phagenvektor umfasst zum Beispiel das Verfahren, das in T. V. Hyunh, DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985), beschrieben ist. Der Einfachheit halber kann zum Beispiel ein kommerziell erhältlicher Ligasierungskit, der von Takara Shuzo hergestellt wird, und dergleichen verwendet werden. Das rekombinante Plasmid und der Phagenvektor werden in einen geeigneten Wirt, wie prokaryontische Zellen (z. B. E. coli HB 101, DH 5 und MC1061/P3), eingeschleust.
- Das Verfahren zum Einbau eines Plasmids in einen Wirt umfasst zum Beispiel das Calciumchloridverfahren, das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989), beschrieben ist, das Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahren und die Elektroporation. Das Verfahren zum Einbau eines Phagenvektors in den Wirt umfasst zum Beispiel ein Verfahren, das die in-vitro-Verpackung der Phagen-DNA mit anschließender Einführung derselben in einen gezüchteten Wirt umfasst. Die in-vitro-Verpackung kann leicht unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen in-vitro- Verpackungskits, wie er von Stratagene und Amersham hergestellt wird, durchgeführt werden.
- Das Verfahren zum Isolieren der cDNA, die die DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert, aus der nach dem obigen Verfahren hergestellten cDNA-Bibliothek kann eine Kombination von allgemeinen cDNA-Durchmusterungsverfahren sein.
- Zum Beispiel wird ein Oligonucleotid, von dem man annimmt, dass es der partiellen Aminosäuresequenz von DNase γ entspricht, getrennt chemisch synthetisiert und mit ³²P markiert, so dass man eine Sonde erhält, und es wird eine bekannte Koloniehybridisierung [Crunstein, M. und Hogness, D. S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)] oder Plaquehybridisierung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, 2.108 (1989)] angewendet, um einen Klon herauszusuchen, der die Ziel-cDNA enthält, oder ein PCR-Primer wird hergestellt, ein bestimmter Bereich der DNase γ wird mit dem PCR-Verfahren amplifiziert, und ein Klon, der ein für diesen Bereich codierendes DNA-Fragment aufweist, wird ausgewählt. Wenn eine cDNA-Bibliothek verwendet wird, die unter Verwendung eines Vektors, der cDNA zu exprimieren vermag, wie λgt11-Phagenvektor, aufgebaut wurde, kann der Zielklon durch Immunscreening ausgewählt werden, wobei man einen Antikörper gegen DNase γ verwendet. Wenn eine große Menge des Klons behandelt wird, ist ein Screening nach dem PCR-Verfahren vorteilhaft.
- Die Nucleotidsequenz der so erhaltenen DNA kann nach dem Maxam-Gilbert- Verfahren [Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)] oder nach dem Didesoxy-Terminationsverfahren unter Verwendung von Phage M13 [Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] bestimmt werden. Die DNase-γ-cDNA kann erhalten werden, indem man einen Teil davon oder die gesamte cDNA aus dem oben erhaltenen Klon herausspaltet, indem man ein Restriktionsenzym und dergleichen verwendet.
- Das Verfahren zur Isolierung der DNA, die die DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert, aus einer genomischen DNA-Bibliothek wird im folgenden beispielhaft erläutert.
- Genomische DNA wird nach einem bekannten Verfahren, wie dem SDS-Phenol- Verfahren oder Cetyltrimethylammoniumbromid-(CTAB)-Verfahren, aus den Zellen von Rattenthymus oder -milz hergestellt. RNA wird vorzugsweise durch Zersetzung mit Ribonuclease entfernt. Die erhaltene DNA wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym partiell abgebaut, und das erhaltene DNA- Fragment wird mit einem geeigneten Phagen oder Cosmid amplifiziert, um eine Bibliothek herzustellen. Der Klon mit der Zielsequenz wird zum Beispiel nach einem Verfahren nachgewiesen, bei dem man eine radioaktiv markierte DNA- Sonde verwendet, und ein Teil oder das gesamte DNase-γ-Gen wird mit einem Restriktionsenzym aus dem Klon gespalten.
- Die DNA der vorliegenden Erfindung kann aus der Nucleotidsequenz mit den Nucleotiden Nr. 12-941 in der Nucleotidsequenz, die als SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, chemisch synthetisiert werden, indem man die DNA zum Teil oder vollständig synthetisiert.
- (e) Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen rekombinanten Vektor, der die oben genannte DNA enthält, die DNase γ codiert. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er durch Replikation oder Autoproliferation in verschiedenen Wirten, wie prokaryontischen Zellen und/oder eukaryontischen Zellen, aufrechterhalten werden kann, und es kann sich um einen Plasmidvektor oder Phagenvektor handeln.
- Der rekombinante Vektor kann hergestellt werden, indem man die DNA, die die DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert, nach einem herkömmlichen Verfahren mit einem kommerziell erhältlichen rekombinanten Vektor (Plasmid-DNA und Bakteriophagen-DNA) ligasiert. Beispiele für geeignete rekombinante Vektoren sind pBR322, pBR325, pUCIZ, pUC13 als Plasmide, die von Escherichia coli abgeleitet sind; pSH19, pSHIS als Plasmide, die von Hefe abgeleitet sind; und pUB110, pTP5, pC194 als Plasmide, die von Bad//us subtilis abgeleitet sind. Beispiele für Phagen sind Bakteriophagen, wie der λ-Phage, und Tier- und Insektenviren, wie Retroviren, Vacciniavirus und polynukleares Virus [pVL1393 (hergestellt von Invitrogen)].
- Für die Expression und Erzeugung von DNase γ sind Expressionsvektoren von Vorteil. Der Expressionsvektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange er in der Lage ist, DNase γ in verschiedenen Wirtszellen, wie prokaryontischen Zellen und/oder eukaryontischen Zellen, zu exprimieren und das Enzym zu erzeugen.
- Wenn Bakterien, insbesondere Escherichia coli, als Wirtszelle verwendet werden, besteht der Expressionsvektor im allgemeinen wenigstens aus einem Promotor- Operator-Bereich, einem Startcodon, DNA, die die DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert, einem Stopcodon, einem Terminatorbereich und einer replizierbaren Einheit.
- Wenn Hefe, Tierzellen oder Insektenzellen als Wirtszelle verwendet werden, besteht der Expressionsvektor vorzugsweise wenigstens aus einem Promotor, einem Startcodon, DNA, die die DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert und einem Stopcodon. Außerdem kann er noch DNA, die ein Signalpeptid codiert, eine Enhancer-Sequenz, einen nichttranslationalen Bereich auf der 5'-Seite und auf der 3'-Seite des DNase-γ-Gens der vorliegenden Erfindung, eine Spleißverbindung, eine Polyadenylierungsstelle, einen Selektionsmarkerbereich oder eine replizierbare Einheit enthalten.
- Der Promotor-Operator-Bereich zum Exprimieren der DNase γ der vorliegenden Erfindung in Bakterien umfasst einen Promotor, einen Operator und eine Shine- Dalgarno-(SD)-Sequenz (z. B. AAGG). Wenn der Wirt zum Beispiel ein Bakterium ist, das zur Gattung Escherichia gehört, enthält der Bereich vorzugsweise einen Trp-Promotor, einen lac-Promotor, einen recA-Promotor, einen λPL-Promotor, einen Ipp-Promotor, einen tac-Promotor und dergleichen. Wenn der Wirt ein Bakterium ist, das zur Gattung Bach/us gehört, sind ale Beispiele ein SL01- Promotor, ein SP02-Promotor, ein penP-Promotor und dergleichen zu nennen. Beispiele für den Promotor zum Exprimieren der DNase γ der vorliegenden Erfindung in Hefe als eukaryontischer Zelle sind ein PH05-Promotor, ein PGK- Promotor, ein GAP-Promotor, ein ADH-Promotor und dergleichen, und wenn es sich bei dem Wirt um Säugerzellen handelt, können als Beispiele ein von SV40 abgeleiteter Promotor, ein Retroviruspromotor, ein Hitzeschockpromotor und dergleichen genannt werden, wobei unter anderem SV-40 und Retrovirus der Vorzug gegeben wird. Die Verwendung eines Enhancers ist für die Expression ebenfalls wirkungsvoll.
- Beispiele für geeignete Startcodons umfassen das Methionincodon (ATG). Beispiele für ein Stopcodon sind herkömmliche Stopcodons, wie TAG, TGA und TAA. Der Terminatorbereich kann ein herkömmlicherweise verwendeter natürlicher oder synthetischer Terminator sein.
- Die replizierbare Einheit bedeutet DNA, die in der Lage ist, die DNA-Sequenz in voller Länge in der Wirtszelle zu replizieren, und umfasst zum Beispiel ein natürliches Plasmid, ein künstlich modifiziertes Plasmid (aus einem natürlichen Plasmid hergestelltes DNA-Fragment) und ein synthetisches Plasmid. Ein geeignetes Plasmid ist zum Beispiel das Plasmid pBR322 oder eine künstliche Modifikation davon (DNA-Fragment, das man durch Behandlung von pBR322 mit einem geeigneten Restriktionsenzym erhält) für E. coli; ein Hefe-2-u-Plasmid oder chromosomale Hefe-DNA für Hefe; und Plasmid pRSVneo ATCC 37198, Plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, Plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, Plasmid pSV2neo ATCC 37149 und dergleichen für Säugerzellen.
- Die Enhancer-Sequenz, die Polyadenylierungsstelle und die Spleißverbindungsstelle können solche sein, wie sie der Fachmann im allgemeinen verwendet, wie solche, die von SV40 abgeleitet sind.
- Bei dem Selektionsmarker kann es sich um solche handeln, wie sie in einem herkömmlichen Verfahren im allgemeinen verwendet werden. Ein Beispiel dafür ist ein Gen, das resistent macht gegen Antibiotika, wie Tetracyclin, Ampicillin und Kanamycin.
- Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem man den oben genannten Promotor, das Startcodon, die DNA, die für die DNase γ der vorliegenden Erfindung codiert, das Stopcodon und den Terminatorbereich hintereinander und cyclisch zu einer geeigneten replizierbaren Einheit ligasiert. Falls gewünscht, kann ein geeignetes DNA-Fragment (z. B. ein Linker und eine weitere Restriktionsstelle) nach einem herkömmlichen Verfahren, wie Abbau mit einem Restriktionsenzym und Ligasierung unter Verwendung von T4- DNA-Ligase, verwendet werden.
- (f) Die transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem man den oben genannten Expressionsvektor in eine Wirtszelle einschleust.
- Die Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange sie in der Lage ist, sich an den oben genannten Expressionsvektor anzupassen, und transformiert werden kann, und Beispiele dafür sind verschiedene Zellen, wie natürliche Zellen und künstlich hergestellte rekombinante Zellen, die herkömmlicherweise auf dem technische Gebiet der vorliegenden Erfindung verwendet werden [z. B. Bakterien (Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören, und Bakterien, die zur Gattung Bad/us gehören), Hefe (Gattung Saccharomyces und Gattung Pichia), Tierzellen und Insektenzellen].
- Bevorzugt werden Escherichia coli und Tierzellen, zum Beispiel Escherichia coIl (DH5, HB101), von Mäusen abgeleitete Zellen (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1 und NIH3T3), von Ratten abgeleitete Zellen, von Hamstern abgeleitete Zellen (BHK und CHO), von Affen abgeleitete Zellen (COS1, COS3, COS7, CV1 und Velo) und von Menschen abgeleitete Zellen (HeLa, von diploiden Fibroblasten abgeleitete Zellen, Myelvmzellen und Namalwa).
- Der Expressionsvektor kann nach einem an sich bekannten Verfahren (Transformation oder Transfektion) in die Wirtszelle eingeschleust werden. Für Bakterien (Escherichia coli, Bad/us subtilis) können für die Transformation zum Beispiel das Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], das Protoplastenverfahren [Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)] oder das kompetente Verfahren [J. Mol. Biol. 56, 209 (1971)] verwendet werden; für Saccharomyces cerevisiae können das Verfahren von Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)] oder das Lithiumverfahren [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] verwendet werden; für Tierzellen kann das Verfahren von Graham [Virology 52, 456 (1973)) verwendet werden; und für Insektenzellen kann das Verfahren von Summers et al. [Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165 (1983)] verwendet werden.
- (g) Die DNase γ der vorliegenden Erfindung kann erzeugt werden, indem man die transformierten Zellen (im folgenden in dem Sinn verwendet, der Transfektanten einschließt), die den Expressionsvektor enthalten und so hergestellt wurden, wie es oben erwähnt ist, in einem Nährmedium kultiviert.
- Das Nährmedium enthält vorzugsweise eine Kohlenstoffquelle, eine anorganische Stickstoffquelle oder eine organische Stickstoffquelle, die für das Wachstum der Wirtszelle (Transformante) notwendig sind. Beispiele für die Kohlenstoffquelle sind Glucose, Dextran, lösliche Stärke und Saccharose; Beispiele für die anorganische oder organische Stickstoffquelle sind Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabodensatz, Kartoffelextraktlösung und dergleichen. Falls gewünscht, können noch weitere Nährstoffquellen, wie anorganische Salze (z. B. Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid), Vitamine und Antibiotika (z. B. Tetracyclin, Neomycin, Ampicillin, Kanamycin und dergleichen), hinzugefügt werden.
- Die Kultur wird nach einem Verfahren durchgeführt, das auf dem betreffenden Gebiet bekannt ist. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH des Mediums und Kulturzeit, werden in geeigneter Weise ausgewählt, um die Massenproduktion von DNase γ zu ermöglichen.
- Spezielle Beispiele für Medium und Kulturbedingungen, die je nach der Wirtszelle zu bestimmen sind, werden im folgenden anhand von nichteinschränkenden Beispielen gezeigt.
- Wenn es sich bei dem Wirt um Bakterien, Actinomyceten, Hefe oder Fadenpilze handelt, ist ein flüssiges Medium, das die oben genannten Nährstoffquellen enthält, zu bevorzugen, wobei einem Medium mit einem pH von 5-8 der Vorzug gegeben wird.
- Wenn es sich bei dem Wirt um E. coli handelt, umfasst das bevorzugte Medium zum Beispiel LB-Medium und M9-Medium [Miller J., Exp. Mol. Genet., S. 431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. In diesem Fall wird die Kultur etwa 3-24 Stunden Lang bei 14-43ºC gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren durchgeführt.
- Wenn es sich bei dem Wirt um Bakterien handelt, die zur Gattung Bacillus gehören, wird die Kultur etwa 16-96 Stunden lang bei 30-40ºC gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren durchgeführt.
- Wenn der Wirt eine Hefe ist, umfassen Beispiele für das Medium Burkholder's Minimalmedium [Bostian K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)], und der pH-Wert beträgt vorzugsweise 5-8. Die Kultur wird etwa 14- 144 Stunden lang bei 20-35ºC gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren durchgeführt.
- Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, umfassen Beispiele für das Medium MEM- Medium, das etwa 5-20% fetales Kälberserum enthält [Science 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [J. Am. Med. Assoc. 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)] und dergleichen. Der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6-8, und die Kultur wird etwa 15-72 Stunden lang bei 30-40ºC gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren durchgeführt.
- Wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, umfassen Beispiele für das Medium Grace- Medium, das fetales Kälberserum enthält [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)], und der pH-Wert beträgt vorzugsweise etwa 5-8. Die Kultur wird etwa 15-100 Stunden lang bei 20-40ºC gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren durchgeführt.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung kann nach dem folgenden Verfahren aus der Kultur erhalten werden, die man durch die oben genannte Inkubation erhält.
- Das heißt, wenn die DNase γ der vorliegenden Erfindung in der Kulturflüssigkeit in der Kultur vorliegt, erhält man das Kulturfiltrat (den Überstand) durch Filtration oder zentrifugale Trennung der Kultur, und anschließend erfolgt die Reinigung und Isolierung der DNase γ nach einem herkömmlichen Verfahren, das allgemein für die Reinigung und Isolierung natürlicher oder synthetischer Proteine aus einem solchen Kulturfiltrat verwendet wird.
- Beispiele für das Verfahren zur Reinigung und Isolierung sind ein Verfahren, das sich die Löslichkeit zunutze macht, wie Aussalzen und Lösungsmittelfällung, ein Verfahren, das sich den Unterschied in den Molekulargewichten zunutze macht, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, ein Verfahren, das sich Ladungen zunutze macht, wie Ionenaustauscherchromatographie und Hydroxylapatitchromatographie, ein Verfahren, das sich eine spezifische Affinität zunutze macht, wie Affinitätschromatographie, ein Verfahren, das sich den Unterschied in der Hydrophobie zunutze macht, wie Umkehrphasen-HPLC, sowie ein Verfahren, das sich den Unterschied im isoelektrischen Punkt zunutze macht, wie isoelektrische Fokussierung.
- Wenn die DNase γ der vorliegenden Erfindung im Periplasma oder Cytoplasma der kultivierten Transformante vorliegt, wird die Kultur nach einem herkömmlichen Verfahren, wie Filtration und zentrifugale Trennung, behandelt, um Mikrobenzellen oder Zellen, die in einem geeigneten Puffer suspendiert sind, zu gewinnen, einer Ultraschallbehandlung, Behandlung mit Lysozym, Gefrieren- Auftauen und dergleichen unterzogen, um die Zellwand und/oder Zellmembran der Zellen zu zerstören, und einer zentrifugalen Trennung, Filtration und dergleichen unterzogen, was eine Membranfraktion ergibt, die DNase γ enthält. Die Membranfraktion wird mit einem Tensid, wie Triton X100 solubilisiert, was eine rohe Lösung ergibt. Diese rohe Lösung wird mit einem herkömmlichen Verfahren behandelt, das oben als Beispiel für die Isolierung oder Reinigung genannt wurde. Wenn die DNase γ in den Zellkernen der kultivierten transformanten Zellen vorliegt, werden die Zellwand und die Zellmembran nach einem herkömmlichen Verfahren zerstört, um die Zellkerne zu isolieren, und anschließend erfolgt eine Ultraschallbehandlung und dergleichen, um die Kernmembran zu zerstören, eine Zentrifugationsbehandlung, so dass ein Überstand entsteht, und eine Behandlung des Überstandes nach einem oben genannten herkömmlichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung.
- (h) Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf einen Antikörper mit Affinität zu der oben genannten DNase oder ihrem Vorläuferpolypeptid. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper mit den obigen Eigenschaften. Der monoklonale Antikörper umfasst monoklonale Antikörper, die zu einer Immunglobulinklasse gehören, wie IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, wobei monoklonalen Antikörpern der Immunglobulinklasse IgG oder IgM der Vorzug gegeben wird.
- Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann nach einem herkömmlichen Verfahren erhalten werden (Zoku-Seikagaku Jikken Koza 5, Men-eki Seikagaku Kenkyuho, Hrsg., The Japanese Biochemical Society: veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin und anderen). Zum Beispiel kann der polyklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Ein Gemisch aus einem Komplex eines (Poly)peptids mit einer partiellen oder der vollen Länge der Aminosäuresequenz der DNase γ der vorliegenden Erfindung, das mit einem Trägerprotein, wie Rinderserumalbumin und Schlitzschnecken- Hämocyanin (KLH), vernetzt ist, und Freunds vollständigem (unvollständigem) Adjuvans [FCA (FIA)] wird als Antigen verwendet, um Säuger, wie Kaninchen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Hamster, zu immunisieren. Der Säuger erhält eine bis vier Auffrischimpfungen alle 1-4 Wochen nach der Anfangsimmunisierung, ein Teil des Blutes wird etwa 3-10 Tage nach jeder Auffrischimpfung entnommen, und der Antikörpertiter des Serums der Blutprobe wird anhand der Antigen-Antikörper-Reaktion gemessen, um deren Erhöhung zu bestätigen. Das volle Blut wird etwa 3-10 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, und Antiserum wird gereinigt.
- Der monoklonale Antikörper gegen die DNase γ der vorliegenden Erfindung kann aus Hybridomen (fusionierten Zellen) hergestellt werden, die man durch sogenannte Zellfusion erhält. Das heißt, ein fusioniertes Hybridom wird aus antikörperproduzierenden Zellen und Myelomzellen gebildet, und das Hybridom wird kloniert. Indem man als Antigen ein Polypeptid mit einer partiellen oder der vollen Länge der Aminosäuresequenz der DNase γ oder von deren Vorläufer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, wird ein Klon selektiert, der einen Antikörper mit einer spezifischen Affinität zu diesen erzeugt. Die notwendigen Schritte sind per se bekannt, abgesehen davon, dass man als Immunogen ein (Poly)peptid mit einer partiellen oder der vollen Länge der Aminosäuresequenz der DNase γ oder von deren Vorläufer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.
- Das Immunogen kann hergestellt werden, indem man ein (Poly)peptid mit einer partiellen oder der vollen Länge der Aminosäuresequenz der DNase γ oder von deren Vorläufer gemäß der vorliegenden Erfindung mit Freunds vollständigem (unvollständigem) Adjuvans mischt. Beispiele für das Tier, das das Ziel der Immunisierung sein soll, sind Säuger wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Hamster und Kaninchen, wobei Mäuse und Ratten bevorzugt werden und Mäuse besonders bevorzugt werden. Die Immunisierung erfolgt durch subkutane, intramuskuläre, intravenöse, in den Fußballen erfolgende oder intraperitoneale ein- bis mehrmalige Injektion an die Säuger. Im allgemeinen wird eine Auffrischimpfung einmal bis viermal etwa eine bis vier Wochen nach der Anfangsimmunisierung verabreicht, und die letzte Immunisierung erfolgt etwa eine bis vier Wochen danach. Etwa 3-10 Tage nach der letzten Immunisierung werden antikörpererzeugende Zellen aus den immunisierten Tieren gewonnen.
- Das Hybridom, das monoklonalen Antikörper sezerniert, kann nach dem Verfahren von Kohler und Milstein et al. (Nature, Vol. 256, S. 495-497, 1975) oder einem analogen modifizierten Verfahren hergestellt werden. Das heißt, der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung wird hergestellt, indem man Hybridome kultiviert, die erhalten wurden durch die Fusion der antikörpererzeugenden Zelle, die in Milz, Lymphknoten, Knochenmark oder Mandeln, vorzugsweise Milz, enthalten ist und die aus dem gemäß dem obigen Verfahren immunisierten Tier erhalten wurde, und einem Myelom derselben Säugerspezies, wie Maus, Ratte, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen und Mensch, besonders bevorzugt Maus, Ratte oder Mensch. Die Kultur kann in vitro oder in vivo, wie in Säugern (z. B. Maus, Ratte, Meerschweinchen, Hamster und Kaninchen), vorzugsweise Maus und Ratte, besonders bevorzugt Aszites von der Maus, durchgeführt werden, und der Antikörper kann aus dem jeweiligen Kulturüberstand oder dem Aszites von Säugern erhalten werden.
- Zu den Myelomzellen, die für die Zellfusion verwendet werden können, gehören zum Beispiel die von der Maus stammenden Myelome P3/X63-AG8, P3/NSI/1- Ag4-1, P3/X63-Ag8.U1, SP2/O-Ag14, FO und BW5147; das von der Ratte stammende Myelom 21ORCY3-Ag1.2.3.; und die vom Menschen abgeleiteten Myelome U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, DIR11 und CEM-T15.
- Der fusionierte Zellklon, der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugt, kann durchmustert werden, indem man zum Beispiel die fusionierten Zellen in einer Mikrotiterplatte kultiviert und die Reaktivität des Kulturüberstands in dem Napf, der Wachstum vermuten lässt, durch ein Enzym-Antikörper- Verfahren, wie RIA und ELISA, bestimmt.
- Der monoklonale Antikörper kann isoliert und gereinigt werden, indem man die Seren oder Aszites, die den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten, der nach dem oben genannten Verfahren erhalten wurde, einer Ionenaustausch-Chromatographie (DEAE oder DE52) oder Affinitätssäulenchromatographie unterzieht, wobei man eine Anti-Immunglobulin-Säule oder Protein- A-Säule verwendet.
- Die Erzeugung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die oben genannten Herstellungsverfahren beschränkt, sondern er kann nach einem beliebigen Verfahren erhalten werden. Im allgemeinen weist der monoklonale Antikörper je nach der Art des zu immunisierenden Säugers strukturell unterschiedliche Zuckerketten auf. Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist nicht durch den strukturellen Unterschied der Zuckerkette beschränkt, sondern umfasst · monoklonale Antikörper, die von einem beliebigen Säuger abgeleitet sind. Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst außerdem humanen monoklonalen Antikörper, den man erhält, indem man transgene Mäuse verwendet, die gentechnisch erzeugt werden, indem man humanes Immunglobulin-Gen einbaut, so dass es humanen Antikörper erzeugen kann; chimärischen monoklonalen Antikörper, der erzeugt wird, indem man bestimmte konstante Bereiche von monoklonalen, von Säugern stammenden Antikörpern (Fc-Bereiche) anstelle des Fc-Bereichs des humanen monoklonalen Antikörpers durch genetische Rekombination rekombiniert; und chimärischen monoklonalen Antikörper, bei dem der gesamte Bereich außer CDR (komplementaritätsbestimmender Bereich), der direkt komplementär an ein Antigen zu binden vermag, anstelle des entsprechenden Bereichs des humanen monoklonalen Antikörpers rekombiniert wurde.
- Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und Bezugsbeispielen, auf die die Erfindung nicht beschränkt ist, näher erläutert.
- Der Thymus von 10 Wochen alten männlichen Ratten (Albino-Wistar-Ratte) wurde entnommen und in Krebs-Ringer-Phosphatlösung, die 10 mM Glucose enthielt, suspendiert. Der Thymus wurde 10 Gy &sup6;&sup0;Co-γ-Strahlung ausgesetzt oder mit 10&supmin;&sup7; M Dexamethason behandelt, und anschließend wurde 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um die Apoptose zu induzieren. Der behandelte apoptotische Thymus wurde mit einem Elektronenmikroskop morphologisch beobachtet und durch Elektrophorese auf 2%igem Agarose-Gel auf DNA-Fragment analysiert.
- Die Apoptose in Rattenthymocyten, die durch γ-Strahlung oder Behandlung mit Dexamethason gemäß Bezugsbeispiel 1 induziert wurde, wurde durch morphologische Veränderungen apoptotischer Zellen und die Eigenschaft des DNA Fragments charakterisiert.
- Der Rattenthymus, der γ-Strahlung ausgesetzt war, wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet. Ein Vergleich mit normalem Thymus zeigte eindeutig morphologische Veränderungen, wie Verdichtung von Chromatin im Zellkern und Verschwinden von Mikrovilli auf der Zelloberfläche, wa man bei Apoptose charakteristischerweise beobachtet. Ähnliche morphologische Veränderungen wurden in dem Rattenthymus beobachtet, der mit Dexamethason behandelt worden war.
- Die durch γ-Strahlung induzierten apoptotischen Zellen wurden in Lysepuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7, 8), 10 mM EDTA, 0,5% (w/v) N-Lauronylsarcosylat-Na] gelöst. Die erhaltene DNA wurde gründlich 20 Minuten lang mit 0,5 mg/ml RNase A und 30 Minuten lang mit 0,5 mg/ml Proteinase K behandelt, und danach wurde sie einer Elektrophorese auf 2%igem Agarose-Gel unterzogen. Das Muster des mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-Fragments wurde in einem Foto beobachtet, das unter UV-Beleuchtung aufgenommen worden war [Biochem. Biophys. Res. Commun. 194 (1993), S. 30-31].
- Als Ergebnis zeigte die Elektrophorese der Kern-DNA-Fraktion der von bestrahltem Thymus abgeleiteten Zellen auf 2%igem Agarose-Gel ein Leitermuster, das für Apoptose charakteristisch ist und auf eine Spaltung der Chromatin-DNA zwischen den Nucleosomen hinweist. Die Agarose-Gelelektrophorese der DNA der von Dexamethason-behandeltem Thymus abgeleiteten Zellen zeigte ebenfalls ein ähnliches Verhalten.
- Der DNA-Spaltungsmodus bei apoptotischen Thymocyten, die durch Bestrahlung oder Behandlung mit Dexamethason induziert wurden, wurde nach dem später zu erwähnenden Endmarkierungsverfahren untersucht. Wenn die erzeugten nucleosomalen DNA-Fragmente von dem Typ sind, der Phosphorsäuregruppen an den 5'-Enden und freie 3'-Enden aufweist (3'-OH/5'-P-bildender Typ), könnte diese DNA an den 3'-Termini markiert werden, indem man sie mit terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase (im folgenden als TdT bezeichnet) und α-³²P-Desoxycytidintriphosphat [im folgenden als (α-³²P)-dCTP bezeichnet] behandelt, ohne mit Alkalischer Phosphatase vorzubehandeln, und nur wenn mit Alkalischer Phosphatase vorbehandelt wird, können 5'-Termini durch die Behandlung mit Polynucleotid-Kinase und γ-³²P-Adenosintriphosphat [im folgenden als (γ-³²P)ATP bezeichnet] markiert werden.
- DNA wurde aus apoptotischem Rattenthymus isoliert, der in Bezugsbeispiel 1 durch Extraktion mit Phenol/Chloroform erhalten wurde.
- Der 3'-Terminus der erhaltenen DNA wurde durch Inkubation von DNA- Fragmenten mit TdT (5U; hergestellt von Takara Shuzo) und [α-³²P]dCTP (0,83 mCi/ml; hergestellt von DuPont) in Gegenwart von 25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM DTT und 1 mM CaCl&sub2; markiert.
- Der 5'-Terminus wurde durch Inkubation von DNA-Fragmenten mit T4- Polynucleotid-Kinase (5U; hergestellt von Takara Shuzo) und (γ-³²P]ATP (0,83 mCi/ml; hergestellt von DuPont) in Gegenwart von 100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 0,2 mM Spermidin markiert.
- Wenn der Terminus des DNA-Strangs eine Phosphorsäuregruppe aufweist, wird er durch die Vorbehandlung mit Alkalischer Phosphatase aus Kalbsdünndarm (20U; hergestellt von Takara Shuzo) in Gegenwart von 36 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM MgCl&sub2; entfernt.
- Nach der Markierung wurde die markierte DNA aus dem Nucleotid, das nicht für die Markierung verwendet wurde, durch Behandlung mit Ammoniumacetat/Isopropanol zur Ausfällung zurückgewonnen. Die markierte DNA wurde einer Elektrophorese auf 2%igem Agarose-Gel unterzogen, und die DNA im Gel wurde auf eine Nylonmembran übertragen, die dann einer Autoradiographie unterzogen wurde.
- Das erhaltene Autoradiogramm ist in Fig. 2 gezeigt, wobei a DNA ist, die aus Thymus unter strahlungsinduzierter Apoptose extrahiert wurde, und b DNA ist, die aus Thymus unter durch Behandlung mit Dexamethason induzierter Apoptose extrahiert wurde. Wie aus der Figur zu erkennen ist, wurde die Erzeugung eines DNA-Fragments mit einem 3'-OH- und einem 5'-P-Terminus in dem apoptotischen Thymus belegt, der durch die Einwirkung von Strahlung oder die Behandlung mit Dexamethason induziert wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Apoptose durch Endonuclease katalysiert wurde, die 3'-OH/5'-P-Spaltungstermini eines DNA-Strangs erzeugte.
- Die Aktivität von Endonuclease (DNase) kann bestimmt werden, indem man die Fragmentierung von chromosomaler DNA im Zellkern durch Elektrophorese auf 2%igem Agarose-Gel beobachtet, wobei man als Substrat den Zellkern von HeLa-S3-Zeilen (Hurnan-Cervixkarzinom-Epithelzellen) verwendet, der völlig frei von endogener Endonuclease ist [Biochem. Biophys. Res. Commun. 194, 1993), S. 30-31].
- Genauer gesagt, wird ein Reaktionsgemisch (30 ul) von HeLa-S3-Zelfen (1,67 · 10&sup7;/ml) und DNase-Fraktion 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wird durch Kühlen derselben auf Eis abgebrochen. Dann wird das Reaktionsgemisch nach der Reaktion 20 Sekunden lang mit 20 000 x g zentrifugiert, und die ausgefällten Zellkerne werden in einem Lysepuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM EDTA, 0,5% (w/v) N-Lauronylsarcosylat-Na] gelöst. Die erhaltene DNA wird gründlich 20 Minuten lang mit 0,5 mg/ml RNase A und 30 Minuten lang mit 0,5 mg/ml Proteinase K behandelt, und danach wird sie einer Elektrophorese auf 2%igem Agarose-Gel unterzogen. Das Muster der mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-Fragmente wird in einem Foto beobachtet, das unter UV- Beleuchtung aufgenommen wurde. Der Anteil der Fragmentierung (prozentuale Fragmentierung) wird aus der Dichte der DNA-Fragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als 5 kb berechnet.
- Die Aktivität von Endonuclease (DNase) kann bestimmt werden, indem man die Fragmentierung von chromosomaler DNA durch Elektrophorese auf 0,8%igem Agarose-Gel beobachtet, wobei man als Substrat superspiralisiertes pBSIISK(-)- Plasmid verwendet.
- Genauer gesagt, wird ein Reaktionsgemisch (30 ul) von superspiralisiertem pBSIISK(-)-Plasmid (6,67 mg/ml) und DNase-Fraktion 10 Minuten lang bei 37ºC behandelt, und die Reaktion wird durch Kühlen derselben auf Eis abgebrochen. Dann wird das Reaktionsgemisch nach der Reaktion mit Phenol/Chloroform behandelt, um Plasmid-DNA zu extrahieren. Die wässrige Schicht wird einer Elektrophorese auf 0,8%igem Agarose-Gel unterzogen. Das Muster der mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-Fragmente wird in einem Foto beobachtet, das unter UV-Beleuchtung aufgenommen wurde. Der Anteil der Fragmentierung (prozentuale Fragmentierung) wird aus der Dichte der DNA-Fragmente mit einem Molekulargewicht von weniger als 5 kb berechnet.
- Als geeignete Reaktionslösung für den Assay der Aktivität der DNasen α und β wird 50 mM MES-NaOH-Puffer (pH 5,6) verwendet, der 3 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2- Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF enthält. Als geeignete Reaktionslösung für den Assay der Aktivität der DNase γ wird 50 mM MOPS-NaOH-Puffer (pH 7,2) verwendet, der 3 mM CaCl&sub2;, 3 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF enthält.
- Das DNase-Aktivitätsgelsystem von Rosenthal et al. [Anal. Biochem. 80, 76-90 (1977)] wurde nach einiger Modifizierung verwendet, um das aktive Produkt der DNase zu identifizieren und sein Molekulargewicht zu bestimmen.
- Das heißt, verschiedene DNasen, die in Beispiel 1 gereinigt und erhalten wurden, wurden durch Elektrophorese in Laemmli-SDS-PAGE-Gel, das native Kalbsthymus-DNA (200 ug/ml) enthielt, aufgetrennt. Die Kalibrierung des Molekulargewichts unter Verwendung von Standardproteinen auf SDS-Gel wurde durch die Anwesenheit von doppelsträngiger DNA (200 ug/ml) in SDS-Gel nicht beeinflusst.
- Nach der Elektrophorese wurde das Gel eine Stunden lang bei 50ºC mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,8) und 5 mM 2-Mercaptoethanol gewaschen, um SDS zu entfernen, und man ließ es über Nacht bei 4ºC in 10 mM Tris-HCl (pH 7,8) stehen, um eine Neufaltung der DNase zu ermöglichen. Das Gel wurde während einer geeigneten Zeitspanne bei 37ºC inkubiert, wobei man eine Lösung verwendete, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 3 mM CaCl&sub2; und 3 mM MgCl&sub2; enthielt.
- Nach dem Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid und UV-Durchleuchtung wurde auf dem fluoreszierenden Hintergrund offensichtliche Nuclease-Aktivität als dunkler Bereich nachgewiesen.
- Wenn nichts Besonderes angegeben ist, wurden die folgenden Behandlungen bei 0-4ºC durchgeführt.
- Der Rattenthymus wurde in Puffer A [10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 2 mM 2- Mercaptoethanol, 0,3 mM PMSF, 3 mM MgCl&sub2;], der 0,1% Noidet P-40 (NP-40) enthielt, homogenisiert. Das Homogenisat wurde 10 Minuten lang bei 600 · g zentrifugiert. Die sedimentierten Zellkernfraktionen, die Mitochondrien enthielten, wurden isoliert, und der Überstand wurde eine Stunden lang mit 150 000 · g zentrifugiert. Die Sedimentfraktion wurde als Membranfraktion bezeichnet, die Mikrosomen enthielt, und die Überstandfraktion wurde als Cytosolfraktion bezeichnet.
- Die in der erhaltenen Fraktion jeweils vorhandene Endonuclease-Aktivität wurde nach dem Verfahren bestimmt, das in Bezugsbeispiel 3 beschrieben ist. Als Ergebnis wurde in der Zellkernfraktion, die Mitochondrien enthielt, der Membranfraktion, die Mikrosomen enthielt, und der Cytosolfraktion etwa 65%, 25% bzw. 10% gefunden. Dann wurde unter Verwendung der Zellkernfraktion als Ausgangsmaterial die Endonuclease gereinigt.
- Das DNase-aktive Produkt in der Zellkernfraktion wurde durch Ultraschallbehandlung in Puffer A, der 0,5 M Ammoniumsulfat enthielt, solubilisiert, und die Trümmer der Zellkerne wurden durch eine Stunde Zentrifugation mit 150 000 · g entfernt.
- Der erhaltene Überstand (Extrakt von Zellkernen) wurde auf eine S-Sepharose- Säule (1 cm Innendurchmesser · 13 cm; hergestellt von Pharmacia) gegeben, die mit Puffer N [20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM PMSF, 10% Ethylenglycol] äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Puffer N gewaschen und entwickelt, indem man die Salzkonzentration (KCl) des PufFers N linear von 0 M bis 1 M erhöhte (300 Minuten, Fließgeschwindigkeit 0,15 ml/min). Als Ergebnis des Assays gemäß Assay 1 des Bezugsbeispiels 3 wurde das DNaseaktive Produkt als einziger Peak gewonnen, der bei 0,6 M KCl eluierte. Dieses aktive Produkt wurde einer HPLC unterzogen, wobei man eine CMSPW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm; hergestellt von Tosoh) verwendete, die mit Puffer N äquilibriert worden war, und es wurde mit einem linearen Gradienten von 0-1 M KCl (35 min) Puffer N (Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min) eluiert.
- Als Ergebnis wurde die Endonuclease-Aktivität in drei Fraktionen gefunden, die bei einer Konzentration von etwa 0,24 M, 0,34 M bzw. 0,55 M KCl eluierten und die gemäß der Reihenfolge der Elution DNase α, β und γ genannt wurden (Fig. 3).
- Die jeweiligen aktiven Fraktionen (DNase α, DNase β und DNase γ) wurden durch sukzessive HPLC unter Verwendung von Heparin-5PW-, G2000SW- und CMSPW- Säulen gereinigt.
- Insbesondere wurde jede DNase-Fraktion auf eine Heparin-5PW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm; hergestellt von Tosoh) aufgetragen, die mit Puffer N äquilibriert worden war, und das Protein wurde mit Puffer N mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M KCl (35 min. Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min) entwickelt und eluiert. Dann wurde die eluierte aktive Fraktion durch Gelfiltrations- HPLC (Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min) gereinigt, wobei man eine G2000SW- Säule (8 mm Innendurchmesser · 30 cm; hergestellt von Tosoh) verwendete, die mit Puffer S [20 mM MOPS-NaOH (pH 7,0), 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM PMSF, 5% Ethylenglycol], der 0,3 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Die erhaltene DNase-Fraktion wurde schließlich einer HPLC unterzogen, wobei man eine CMSPW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm; hergestellt von Tosoh) verwendete, die mit Puffer S. der 0,3 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war, und die gewünschte DNase wurde mit Puffer S mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 1,5 M NaCl (35 min. Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min) entwickelt und eluiert.
- Die erhaltene DNase-Fraktion wurde gegen Puffer S dialysiert und bei 0 bis 4ºC konserviert.
- Die DNase-Aktivität in jeder durch HPLC erhaltenen Fraktion wurde nach dem Verfahren bestimmt, das in Bezugsbeispiel 3 (1) beschrieben wurde.
- Als Ergebnis dieser Chromatographie wurde gefunden, dass keine DNase eine Bildung einer komplexen oder strukturellen interconversion zeigte. Das heißt, die DNasen α, β und γ liegen offenbar als monomeres Polypeptid vor.
- Das CM5PW-HPLC-Profil für die Reinigung der Zellkerne der Zellen, die von apoptotischem Thymus abgeleitet sind, der einer Bestrahlung ausgesetzt war, ist in Fig. 4 gezeigt. Es wurde gefunden, dass die Aktivität der DNasen α und β abnimmt, wenn die Apoptose durch Bestrahlung induziert wurde, während die Aktivität der DNase γ überhaupt nicht beeinflusst wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem apoptotischen Thymus gefunden, der mit Dexamethason behandelt worden war.
- Das Molekulargewicht der gemäß Beispiel 1 gereinigten DNasen α, β und γ wurde durch SDS-PAGE-Regeneration (Aktivitätsgelsystem) bestimmt, das in Bezugsbeispiel 4 beschrieben ist. Dieses Aktivitätsgelsystem beruht auf der Fähigkeit von DNase, die nach der Entfernung von SDS regeneriert wird und während der Inkubation DNA zersetzt.
- Die Lokalisierung von DNase in dem Gel kann als dunkle Bande des Ethidiumbromid-fluoreszenten Hintergrunds aufgrund des Verschwindens der DNA-Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Die Zugabe von Ca²&spplus;/Mg²&spplus; zu dem Lösungsmittel für die Inkubation mit DNase γ führte zu einer nichtfluoreszenten Bande an der Stelle, die einem 33-kDa-Protein entspricht (Spur 3). DNase α (Spur 1) und DNase β (Spur 2) zeigten beide nichtfluoreszente Banden an den Stellen, die einem 32-kDa-Protein entsprechen.
- Die DNasen α, β und γ wurden jeweils einer Gelfiltrations-HPLC (Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min. Eluat: Puffer S [20 mM MOPS-NaOH (7,0), 1 mM 2- Mercaptoethanol, 0,1 mM PMSF, 5% Ethylenglycol], der 0,3 M NaCl enthielt) unter Verwendung einer G2000SW-Säule (8 mm Innendurchmesser · 30 cm; hergestellt von Tosoh) unterzogen; als Ergebnis wurden sie als einziger Peak bei 28 kDa (a in Fig. 6), 30 kDa (b in Fig. 6) bzw. 31 kDa (c in Fig. 6) nachgewiesen (Fig. 6).
- Der optimale pH-Wert für die Aktivität der DNasen α, β und γ wurde bestimmt, indem man HeLa-S3-Zellkerne einem Assay in verschiedenen Puffern von sauer nach basisch unterzog (Bezugsbeispiel 3, Assay 1) und anhand des Prozentanteils der DNA-Fragmentierung berechnete.
- Die Ergebnisse [pH-Abhängigkeit der DNasen α (Figur a), β (Figur b) und γ (Figur c) im HeLa-53-Kernassaysystem] sind in Fig. 7 gezeigt. Die für den Assay verwendeten Puffer waren von der linken Spur von Fig. 7: Essigsäure-KOH-Puffer (pH 4,0, pH 4,4, pH 4,8, pH 5,2 und pH 5,6), MES-NaOH-Puffer (pH 5,6 und pH 6,2), MOPS-NaOH-Puffer (pH 6,8, pH 7,2 und pH 7,6), Tris-HCl-Puffer (pH 7,4, pH 7,8, pH 8,2 und pH 9,0) und CHES-NaOH-Puffer (pH 8,6, pH 9,4 und pH 10,4). Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, wurde die Aktivität von DNase α in Essigsäure-KOH-Puffer (pH 5,6) - MES-NaOH-Puffer (pH 5,6) beobachtet, die Aktivität von DNase β wurde in Essigsäure-KOH-Puffer (pH 5,6) - MES-NaOH- Puffer (pH 5,6 und 6,2) beobachtet, und das pH-Optimum betrug für beide etwa 5,6. Andererseits war die Aktivität von DNase γ in der Nähe von pH 7,2 in MOPS- NaOH-Puffer maximal, und für das pH-Optimum wird etwa 7,2 angenommen.
- Wirkungen zweiwertiger Kationen auf die Aktivität von DNase α, DNase β und DNase γ wurden bestimmt. Genauer gesagt, die Wirkung von Mg²&spplus; wurde untersucht, indem man die Aktivität der gereinigten DNasen α, β und γ in Gegenwart von 3 mM CaCl&sub2; mit steigenden Konzentrationen von MgCl&sub2; bestimmte. Die Wirkung von Ca²&spplus; wurde untersucht, indem man die Aktivität der in der gleichen Weise gereinigten DNasen α, β und γ mit steigenden Konzentrationen von CaCl&sub2; in Gegenwart von 3 mM MgCl&sub2; bestimmte. Die Wirkung von Zn²&spplus; wurde in Bezug auf die DNasen α und β in 50 mM MES-NaOH-Puffer (pH 5, 6), der 3 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF enthielt, mit steigenden Konzentrationen von ZnCl&sub2; untersucht, und sie wurde in Bezug auf DNasen γ in 50 mM MOPS-NaOH-Puffer (pH 7,2), der 3 mM CaCl&sub2;, 3 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF enthielt, mit steigenden Konzentrationen von ZnCl&sub2; untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Als Ergebnis erforderte die DNase γ für eine volle Aktivität sowohl Ca²&spplus; als auch Mg²&spplus;, wobei die optimale Konzentration der beiden 1-3 mM betrug (Fig. 8a, b). DNase γ war gegenüber Zn²&spplus; empfindlich, und ihre Aktivität wurde durch Zn²&spplus; in einer geringen Konzentration von 40 uM um 50% gehemmt (Fig. 8c).
- Andererseits wurde die Aktivität von DNase α und DNase β durch Mg²&spplus; oder Ca²&spplus; nicht beeinflusst und wurde durch Zn²&spplus; bis zu einer Konzentration von 1 mM nicht beeinflusst. Die Anwesenheit von Metallionen mit hohen Konzentrationen von 10-30 mM hemmte jedoch die DNase-Aktivität der DNasen α und β wie die der DNase γ.
- Die Endonucleaseaktivität jeder DNase unter den in Tabelle 2 gezeigten Bedingungen ist gezeigt [gemäß Bezugsbeispiel 2 (1), Assay 1].
- Die Aktivität der DNasen α und β wurde relativ zu der Endonucleaseaktivität berechnet, die unter Verwendung von HeLa-S3-Zellkernchromatin-DNA als Substrat und 50 mM MES-NaOH-Puffer (pH 5,6), der 3 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF als Reaktionslösung bestimmt und als 100% gesetzt wurde; und die Aktivität der DNase γ wurde relativ zu der Endonucleaseaktivität berechnet, die unter Verwendung von HeLa-S3-Zellkernchromatin-DNA als Substrat und 50 mM MOPS-NaOH-Puffer (pH 7,2), der 3 mM CaCl&sub2;, 3 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF als Reaktionslösung bestimmt und als 100% gesetzt wurde. In der Tabelle bedeutet "-" ein Weglassen der Komponenten aus dem oben genannten optimalen Reaktionsgemisch, und "+" bedeutet die Zugabe der Komponenten zu dem oben genannten optimalen Reaktionsgemisch. Tabelle 2
- Die oben in (1) bis (3) gezeigten Eigenschaften der DNase γ lassen vermuten, dass DNase γ möglicherweise die Endonuclease ist, die an der DNA-Fragmentierung bei der Apoptose beteiligt ist. Dann wurde nach dem in Bezugsbeispiel 2 (2) (ii) beschriebenen Endmarkierungsverfahren untersucht, ob die mit DNase γ behandelte DNA ein Fragment mit 3'-OH/5'-P-Termini erzeugt. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, fand man dasselbe Markierungsmuster wie bei Bezugsbeispiel 2 (Fig. 2a, b), als die gereinigte DNA, die von HeLa-S3-Zellkernen stammte und mit DNase γ abgebaut worden war (c in der Figur) endmarkiert wurde. Während der Endmarkierung wurden die 5'-Termini der DNA-Fragmente nicht markiert, es sei denn, sie wurden mit Alkalischer Phosphatase vorbehandelt (Fig. 9, Spur 4). Daraus wurde klar, dass die DNase γ 3'-OH/5'-P-Termini von DNA-Strängen erzeugte.
- Andererseits wurden die 3'-Termini der DNA-Fragmente, die von DNasen α (a in der Figur) und β (b in der Figur) erzeugt wurden, erst nach der Vorbehandlung mit Alkalischer Phosphatase mit TdT markiert, und die 5'-Termini reagierten alle ohne Vorbehandlung mit Alkalischer Phosphatase, was klarstellte, dass sie 3'-P/ 5'-OH-Termini aufwiesen.
- Aus den obigen experimentellen Ergebnissen lässt sich Folgendes über die Eigenschaften und die physiologische Bedeutung der DNasen α, β und γ sagen:
- Diese drei Arten von DNase sind als monomere Polypeptide in den Zellkernen vorhanden und spalten die Linkerbereiche von Chromatin-DNA unter Bildung nucleosomaler Oligomere. Die DNasen α und β wurden beide durch leichte Solubilisierung aus den Zellkernen erhalten, und daher geht man davon aus, dass es sich um Endonucleasen handelt, die im Nucleoplasma vorhanden sind. Andererseits konnte DNase γ unter Hochsalzbedingungen ohne Ultraschallbehandlung nicht solubilisiert werden, was vermuten ließ, dass sie stark an eine bestimmte Kernstruktur gebunden war.
- Die DNase γ der vorliegenden Erfindung ist eine Endonuclease, die in Zellkernen vorhanden ist und für ihre Aktivität sowohl Ca²&spplus; als auch Mg²&spplus; erfordert. Die Termini der mit dieser DNase γ gespaltenen DNA-Fragmente sind von demselben Typ wie die Termini der DNA-Fragmente, die von apoptotischem Rattenthymus erzeugt wurden und sind vom 3'-OH/5'-P-bildenden Typ. Die Aktivität der DNase γ wird auch von Zn²&spplus; in einer uM-Größenordnung gehemmt, von der man weiß, dass sie auch die Apoptose hemmt. Daher kann man davon ausgehen, dass DNase γ die Endonuclease ist, die an der DNA-Fragmentierung bei der thymischen Apoptose beteiligt ist.
- Die DNasen α und β unterscheiden sich von der oben genannten DNase γ in Bezug auf physikalische und enzymatische Eigenschaften, und der Unterschied war im Spaltungsmodus von chromosomaler DNA und in der Abhängigkeit von zweiwertigen Metallkationen bemerkbar.
- Die Anwesenheit eines Enzyms, das dieselbe Form hat wie die DNasen α und β, in den Zellkernen von Kalbsthymus und in den Zellkernen von Rattenmilz und -leber weist auf die wichtige Rolle der DNasen α und β im DNA-Stoffwechsel und beim Abbau viraler DNA unter den Kernfunktionen hin.
- Die Rattenthymocyten hatten eine geringe DNase-γ-Aktivität (Proteinmenge), und eine ausreichende Menge Protein für die Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz war nicht verfügbar. So wurde DNase γ aus Splenocyten mit hoher DNase-γ-Aktivität gereinigt.
- Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die folgenden Behandlungen bei 4ºC durchgeführt.
- Die Ratten-Splenocyten (100 g) wurden in Puffer A [10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3 mM PMSF, 3 mM MgCl&sub2;], der 0,3% Noidet P-40 (NP-40) enthielt, homogenisiert. Das Homogenisat wurde 10 Minuten lang bei 600 x g zentrifugiert. Die sedimentierten Kernfraktionen wurden isoliert, und die DNase-aktive Substanz in den Kernfraktionen wurde durch Ultraschallbehandlung in Puffer A, der 0,3 M Ammoniumsulfat enthielt, solubilisiert. Die Trümmer der Zellkerne wurden durch eine Stunde Zentrifugation mit 150 000 x g entfernt.
- Der erhaltene Überstand (Extrakt von Zellkernen) wurde auf eine S-Kartusche (hergestellt von Bio-Rad) gegeben, die mit Puffer N [20 mM Tris-HCl (p'H 7,8), 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM PMSF, 2,5% Ethylenglycol] äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Puffer N gewaschen und entwickelt, indem man die Salzkonzentration (KCl) des Puffers N linear von 0 M bis 1 M erhöhte (50 Minuten, Fließgeschwindigkeit 2,0 ml/min). Als Ergebnis des Assays gemäß Assay 1 des Bezugsbeispiels 3 wurde die DNase-aktive Substanz als einziger Peak gewonnen, der bei 0,6 M KCl eluierte. Die Fraktionen mit aktiver Substanz wurden einer HPLC unterzogen, wobei man eine CM5PW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm; hergestellt von Tosoh) verwendete, die mit Puffer N äquilibriert worden war, und es wurde mit einem linearen Gradienten von 0-1 M KCl (30 min) Puffer N (Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min) eluiert.
- Die bei 0,55 M KCi eluierten DNase-γ-aktiven Fraktionen wurden durch sukzessive HPLC unter Verwendung von Heparin-SPW-, TSKG2000SW- und SPSPW- Säulen gereinigt.
- Insbesondere wurde jede DNase-Fraktion auf eine Heparin-5PW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm; hergestellt von Tosoh) aufgetragen, die mit Puffer N äquilibriert worden war, und das Protein wurde mit Puffer N mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M KCl (30 min. Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min) entwickelt und eluiert. Dann wurden die eluierten aktiven Fraktionen durch Gelfiltrations-HPLC (Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min) gereinigt, wobei man eine TSKG2000SW-Säule (8 mm Innendurchmesser · 30 cm; hergestellt von Tosoh) verwendete, die mit Puffer M [20 mM MES-NaOH (pH 5,6), 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM PMSF, 2,55% Ethylenglycol], der 0,3 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Die erhaltenen DNase-y-Fraktionen wurden schließlich einer HPLC unterzogen, wobei man eine SPSPW-Säule (5 mm Innendurchmesser · 50 mm; hergestellt von Tosoh) verwendete, die mit Puffer M äquilibriert worden war, und es wurde mit Puffer S mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 0,7 M NaCl (35 min. Fließgeschwindigkeit 0,3 ml/min) entwickelt und eluiert. Das Profil der SPSPW-HPLC ist in Fig. 10 gezeigt. Die bei 0,58 M NaCl eluierten DNase-γ- aktiven Fraktionen wurden isoliert und einer SDS-PAGE unterzogen. Die DNase- Aktivität (Fig. 10) wurde nach dem Verfahren von Bezugsbeispiel 3 (1) bestimmt.
- Die durch SPSPW-HPLC erhaltenen gereinigten DNase-γ-Fraktionen wurden mit Trichloressigsäure ausgefällt und einer SDS-PAGE auf 10%igem Acrylamid nach einem herkömmlichen Verfahren [Laemmli, U. K., Nature, 227 : 680-685 (1970)] unterzogen, wobei man durch Anfärben mit Silber eine 33-kDa-Bande nachwies (Fig. 10). Dann wurde die Bande des DNase-γ-Proteins durch Elektroblotting unter Verwendung einer Minitrans-Blot-Zelle (hergestellt von Bio-Rad) auf eine PVDF-Membran (hergestellt von Millipore) übertragen. Unter Verwendung eines Teils derselben wurde die N-terminale Aminosäuresequenz (Tabelle 3) mit einem Gasphasen-Proteinsequencer (PSQ-1, hergestellt von Shimazu Corporation) bestimmt.
- Zu dem Rest wurde überschüssiges Mercaptoethanol gegeben, um die Disulfidbindung im Protein zu Sulfhydryl zu reduzieren, und das Sulfhydryl wurde mit Iodessigsäure alkyliert, was ein S-Carboxymethyl-Derivat ergab. Die PVDF- Membran mit dem daran gebundenen DNase-γ-Protein wurde in einen Puffer gelegt, der eine Lys-C-Endopeptidase (ein Enzym, das spezifisch die Peptidbindung auf der Carboxyseite des Lysinrests des Peptids spaltet) enthielt, und bei 37ºC umgesetzt. Nach dem Enzymabbau wurde jedes aus der Membran freigesetzte Peptidfragment abgetrennt und durch Umkehrphasen-HPLC isoliert. Die peptidhaltige Fraktion wurde bei einer Wellenlänge von 214 nm (Fig. 11a) überwacht.
- Jede Fraktion des Fragments, die als Peak nachgewiesen wurde, wurde mit einem Zentrifugalverdampfer getrocknet, in SDS-Lösung gelöst und für die Aminosäureanalyse mit einem Gasphasen-Proteinsequencer (PSQ-1, hergestellt von Shimazu Corporation) bearbeitet, um die partielle Aminosäuresequenz jedes Peptidfragments zu bestimmen [Tabelle 3, wobei (K) einen durch enzymatischen Abbau abgespaltenen Lysinrest bedeutet].
- Das noch an die Membran gebundene Peptid wurde nach dem oben genannten Verfahren mit Asp-N-Endopeptidase (Enzym, das spezifisch die Peptidbindung auf der Aminoseite des Asparaginsäurerests des Peptids spaltet) behandelt, und die erhaltenen Peptidfragmente wurden abgetrennt und in derselben Weise durch Umkehrphasen-HPLC (Fig. 11b) gewonnen, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen (Tabelle 3).
- N-terminal LRLTSFNXR
- Lys-C-End-Peptidase-Abbau (K) ENHNAMDIIV
- (K) EQYAFLYK
- (K) DFVIVPLHTTPE
- (K) AENFIFMG
- Asp-N-End-Peptidase-Abbau DVFS
- X: unidentifizierte Aminosäure
- Als Rattenmilz-cDNA-Bibliothek wurde eine kommerziell erhältliche Rattenmilz- 5'-STRETCH-cDNA-Bibliothek (hergestellt von Clonetech) verwendet. Diese Bibliothek umfasste cDNA-Klone (mittlere Größe: 1,8 kb) (2 · 10&sup6; unabhängige Klone), die aus mRNA hergestellt wurden, die unter Verwendung von statistischem Oligo(dT)-Primer aus der vollen Milz von erwachsenen Ratten (männlich, Sprague-Dawley) extrahiert und gereinigt und über einen Adapter in die EcoRI- Stelle des Xgt11-Vektors eingesetzt wurde.
- Auf der Basis der Nucleotidsequenzen, die aus den unterstrichenen Sequenzen unter den partiellen Aminosäuresequenzen von DNase γ angenommen wurden, wie es in Tabelle 3 gezeigt ist, wurden Oligo-DNA-Sonden synthetisiert. Die Nucleotidsequenzen der Oligo-DNA-Sonden sind in Tabelle 4 gezeigt. Wenn das Codon, das der letzten Aminosäure entspricht, nicht auf ein einziges fokussiert werden konnte, wurde keine Synthese durchgeführt. Tabelle 4 Nucleotidsequenzen von Oligo-DNA-Sonden
- R: A oder G; Y: T oder C; N: A, G, T oder C; H: T, C oder A
- Escherichia coli Y1090r- wurde über Nacht in einem LB-Medium (40 ml) inkubiert, das 0,2% Maltose und 10 mM MgSO&sub4; enthielt, und die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation gewonnen. Dann wurden die Zellen in 30 bis 40 ml 10 mM MgSO&sub4; suspendiert. Die Suspension (200 ul) sowie eine λgt11- Phagenlösung von (3) oben, die Ratten-cDNA enthielt, wurden miteinander gemischt, und SM-10-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 68 mM NaCl, 0,1 mg/ml Gelatine] wurden hinzugefügt, so dass man eine Gesamtmenge von 400 ul erhielt, und anschließend wurde 20-30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
- Das Gemisch von Escherichia coü und dem Phagen wurde auf einem 1,5%-LB- Agarmedium, das 10 mM MgSO&sub4; enthielt, ausgestrichen, und LB-Top-Agarose (6 ml, 60-65ºC) wurde hinzugefügt, und es wurde gründlich gemischt. Als die Top-Agarose fest wurde, wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert.
- Nach der Inkubation wurde die Platte eine Stunde lang bei 4ºC stillgestellt. Dann wurde ein Nylonfilter (hergestellt von Pall Corporation) auf die Top-Agarose gelegt, um eine Übertragung zu bewirken. Der Nylonfilter wurde 20 Sekunden lang in einer Denaturierungslösung und dann 20 Sekunden lang in einer Neutralisierungslösung behandelt. Der Filter wurde auf einem Filterpapier getrocknet und durch UV-Bestrahlung immobilisiert.
- Die oben in (4) hergestellte Oligo-DNA-Sonde wurde am 5'-Terminus mit ³²P markiert, wobei man [γ-³²P]ATP und T4-Kinase verwendete. Eine Reaktionslösung mit der folgenden Zusammensetzung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
- 10 ng/ul Oligo-DNA 1 ul
- 10 x Kinasepuffer 4 ul
- [γ-³²P]ATP 10 ul
- UPW 23 ul
- T4-Kinase 2 ul
- Eine Vorhybridisierungslösung wurde wie folgt hergestellt.
- 5 x Denhardt-Lösung
- 6 x SSPE-Lösung
- 0,25% SDS
- 40 ug/ml hitzedenaturierte Lachssperma-DNA
- Der oben in 1 hergestellte Filter wurde in die Vorhybridisierungslösung gelegt und über Nacht bei 37ºC stehen gelassen. Dann wurde die oben in 2 hergestellte markierte Sonde mit einer geeigneten Menge Vorhybridisierungslösung gemischt und 18 Stunden lang bei 37ºC hybridisiert, wobei man 5 ul Sondenlösung pro Filter verwendete.
- Nach der Hybridisierung wurde der Filter mit 2 x SSC gewaschen, das 0,1% SDS enthielt, und der Filter wurde in 2 x SSC gelegt, das 0,1% SDS enthielt, und anschließend wurde 1-1,5 Stunden lang unter Schütteln gewaschen. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Der Filter wurde auf einem Filterpapier getrocknet und einer Autoradiographie (3 Tage) unterzogen.
- Gemäß der Autoradiographie wurde die Top-Agarose, die dem Signal entsprach, das auf einen positiven Klon hinwies, herausgenommen und in 500 ul 1 x λ- Puffer gelegt, den man 30-60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen ließ. Eine 10³-fache Verdünnung (1-10 ul) wurde mit einer Suspension (200 ul) Escherichia coli Y1090r- gemischt. Unter Verwendung dieses Gemischs wurden die obigen Schritte 1-3 wiederholt, um ein sekundäres Screening durchzuführen, wodurch einzelne Plaques aufgetrennt wurden. Als Ergebnis wurden 16 positive Klone erhalten. Die positiven Klone wurden wiederum mit Escherichia coli Y1090r- infiziert und so ausgestrichen, dass das Wachstum des Plaques in der Gesamtheit einer Platte aus LB-Agarmedium ermöglicht wurde, und die λgt11-Phagen-DNA wurde gewonnen. Die Einzelheiten des Phagen-DNA-Gewinnungsverfahrens folgten der Methode von Maniatis et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. 2.64 (1989)].
- Die gewonnene Phagen-DNA wurde mit BsiwI behandelt, um einen cDNA-Einschub herauszuspalten. Ein Teil davon wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, und die Länge des Einschubs wurde durch Anfärben mit Ethidiumbromid bestätigt. Nach der Elektrophorese wurde die DNA nach dem Verfahren von Southern et al. [J. Mol. Biol., 98, S. 503 (1975)] auf eine Nylonmembran [Biodine, hergestellt von Pall Corporation] übertragen und in derselben Weise wie beim Screening einer Hybridisierung unterzogen.
- Eine mit BsiwI behandelte Phagen-DNA wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, und die Einschub-DNA wurde mit Hilfe des GENECLEAN-II-Kits gewonnen. Die DNA erhielt mit Hilfe eines Klenow-Enzyms glatte Enden, und die Einschub-DNA wurde unter Verwendung von T4-Ligase in die SmaI-Stelle von pBSIIKS(+) eingebaut, das mit BAP behandelt worden war. Die Ligasierungslösung wurde verwendet, um kompetentes Escherichia coli DH5α zu transformieren. Das heißt, kompetentes Escherichia coli (0,3 ml) wurde zu einer Gesamtmenge von 7 ul Ligasierungslösung gegeben, und man ließ das Gemisch mehrere Stunden fang auf Eis stehen. Das Gemisch wurde 40 Sekunden lang bei 42ºC hitzestimuliert und zurück auf das Eis gestellt. Ein LB-Medium (200 ul) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, dann in eine LB-Agarmediumplatte, die Ampicillin enthielt, gegossen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Einzelne Kolonien wurden gewonnen und in 1,5 ml LB-Medium gegeben, und anschließend führte man 5 Stunden lang eine Schüttelkultur durch, pBSIIKS(+)-DNA wurde nach dem Alkaliverfahren [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. 1.25 (1989)] aus dem abzentrifugierten Niederschlag gewonnen.
- Die Nucleotidsequenz des DNase-γ-cDNA-Einschubs wurde aus pBSIIKS(+)-DNA, die in (7) erhalten wurde, mit einem DNA-Sequencer (DSQ-1000, hergestellt von Shimazu Corporation) bestimmt, wobei man ein TaKaRa-Taq-Cyclussequenz-Kit (für SIMAZU, hergestellt von Takara Shuzo) verwendet. Als Ergebnis zeigte sich, dass alle 16 positiven Klone die gesamte Länge der DNase γ codierten (Sequenzprotokoll, SEQ ID NO: 2). Die gesamte Länge des cDNA-Klons betrug 1208 bp und enthielt ein offenes Leseraster, das aus 933 bp bestand (SEQ ID NO: 2, Nucleotide Nr. 12-944), und codierte 310 Aminosäurereste (Sequenzprotokoll, SEQ ID NO: 1). Ein Vergleich der Analyse der Aminosäuresequenz des Nterminalen Teils von gereinigtem DNase-γ-Protein zeigte, dass das primäre Translationsprodukt des DNase-γ-Gens einen Vorläuferpeptidbereich hatte, der aus 25 Aminosäureresten (SEQ ID NO: 1, Aminosäuren Nr. 1-25) auf der N-terminalen Seite besteht. Dementsprechend bestand das reife DNase-γ-Protein aus 285 Aminosäureresten (SEQ ID NO: 1, Aminosäuren Nr. 26-310), und das anhand dieser Aminosäuresequenz angenommene Molekulargewicht des Proteins betrug 33 027. Dieser Wert passte gut zu dem durch SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht des Proteins.
- Indem man als Antigene zwei Arten von Peptiden (Tabelle 5) verwendete, die auf der Basis der in Beispiel 3 (2) bestimmten partiellen Aminosäuresequenz der DNase γ der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden, wurde ein polyklonaler Antikörper gegen DNase γ hergestellt.
- KENHNAMDI
- KEQYAFLYK
- Ein Gemisch aus einem Komplex, bei dem die oben genannten beiden Arten von synthetischen Peptiden jeweils nach dem Maleinimidverfahren mit Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH, Trägerprotein) vernetzt wurden, und Freunds vollständigem Adjuvans wurde als Antigen verwendet, um Kaninchen [Kbl : JW, 15 Wochen alt, männlich, Gewicht 3-3,5 kg (bei der Anfangsimmunisierung), jeweils zwei wurden für jedes Antigen verwendet] durch subkutane Injektion (0,5 mg) auf dem Rücken zu immunisieren. Auffrischimpfungen wurden dreimal durch 0,5 mg alle 3 Wochen nach der Anfangsimmunisierung durchgeführt, und ein Teil des Blutes wurde 10 Tage nach jeder Auffrischimpfung entnommen. Der Antikörpertiter wurde bestimmt, und 10 Tage nach der letzten Immunisierung (dritten Auffrischimpfung) wurde das volle Blut entnommen, aus dem Antiserum erhalten wurde.
- Der Antikörpertiter wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
- Das Antigen wurde in einer Konzentration von 10 ug/ml auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach dem Blockieren wurde ein Teil des Blutes (0,31 bzw. 52 Tage nach der Anfangsimmunisierung) von sensibilisiertem Kaninchen auf das 10¹-10&sup8;-fache verdünnt und mit dem Antigen umgesetzt. Nach dem Waschen wurde mit Peroxidase markierter sekundärer Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper umgesetzt, und nach dem Waschen wurde der Antikörpertiter anhand der Farbentwicklung des Substratlösung-ABTS bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass der Antikörpertiter in jedem Fall mit der Zeit zunimmt (Tabelle 6). Tabelle 6 Antikörpertitertest des Anti-DNase-γ-Serums verwendetes Antigen: KENHNAMDI verwendetes Antigen: KEQYAFLYK
- Die vorliegende Erfindung stellt eine neue DNase γ bereit, die die selektive Spaltung von Verknüpfungsstellen von Chromatin-DNA katalysiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Aminosäuresequenz von Ratten-DNase γ, DNA, die die Aminosäuresequenz codiert, die Nucleotidsequenz der DNA, einen rekombinanten Vektor, der die DNA enthält, eine mit dem rekombinanten Vektor transformierte Wirtszelle, ein Verfahren zur Herstellung der DNase γ, das das Kultivieren der Wirtszelle umfasst, sowie einen Antikörper gegen die DNase γ oder ihren Vorläufer oder ihre Fragmente bereit.
- Durch Verwendung der DNase γ der vorliegenden Erfindung wird eine Aufklärung des Kontrollmechanismus der Karzinogenese im Körper durch Apoptose auf molekularer Ebene, der Kontrollmechanismen von Autoimmunsystemen und des Einsetzens von AIDS ermöglicht. Das Enzym der Erfindung trägt effektiv zur Entwicklung von Medikamenten für die Prävention, Behandlung und Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten und Virusinfektionen bei. Es wird auch davon ausgegangen, dass ein aus der DNase γ der vorliegenden Erfindung hergestellter Antikörper als Reagens zum Diagnostizieren der Bösartigkeit von Krebs insofern geeignet ist, als eine höhere Bösartigkeit eine geringere Aktivität von DNase γ in den Krebszellen verursacht. Inhibitoren und Aktivierungsmittel, die gesucht werden, um die DNase-γ-Aktivität als Index zu verwenden, sind insofern von Vorteil, als es sich um neue "apoptoseregulierende pharmazeutische Produkte" handeln kann, und das Gen von DNase γ eignet sich als Informations- und Testprobe zum Aufstellen einer Apoptose-Gentherapie gegen Krebs (Stimulation der Apoptose durch Anreicherung von Sense-DNA) und Autoimmunkrankheiten (Hemmung der Apoptose durch Antisense-DNA).
- (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: TANUMA Bei-ichi
- (B) STRASSE: 2-21-8-707, Bessho, Hachioji-shi
- (C) ORT: Tokyo
- (E) LAND: Japan
- (F) POSTLEITZAHL: 192-03
- (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neuartige Desoxyribonuklease
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 12
- (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC compatible
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
- (v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
- ANMELDENUMMER: EP 95930710.9
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 310 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 1208 Basenpaare
- (B) ART: Nucleotid
- (C) STRANGFORM: Doppelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
- (B) LAGE: 12..941
- (C) IDENTIFIZIERUNG: METHODE E (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nucleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure, synthetische DNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
- AARGARAAYC AYAAYGC 17
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nucleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure, synthetische DNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
- AARGARCART AYGCNTTYYT 20
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nucleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure, synthetische DNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
- AARGAYTTYG TNATHGT 17
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 11 Basenpaare
- (B) ART: Nucleotid
- (C) STRANGFORM: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure, synthetische DNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
- GAYGTNTTYT C 11
Claims (11)
1. Desoxyribonuclease, bei der es sich um eine Endonuclease handelt, die die
Verknüpfungsstellen von Chromatin-DNA selektiv zu spalten vermag und
die die folgenden Eigenschaften hat:
1. Lokalisierung Zellkern
2. Molekulargewicht (i) 33000 (SDS-PAGE)
(ii) 31000 (Gelfiltration)
3. pH-Optimum 7,2
4. Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen Ca²&spplus;/Mg²&spplus;, Mn²&spplus;-abhängig
5. Hemmung durch Zn²&spplus; IC&sub5;&sub0; = 40 uM
6. DNA-Spaltungsmodus 3'-OH,5'-P-Terminus-bildender Typ.
2. Desoxyribonuclease gemäß Anspruch 1 mit der Aminosäuresequenz der
Positionen 26-310 von SEQ ID NO: 1 oder einer partiellen Substitution,
Deletion, Insertion oder Modifikation dieser Aminosäuresequenz, welche
die in Anspruch 1 definierten Eigenschaften der Desoxyribonuclease nicht
verändert.
3. Vorläufer einer Desoxyribonuclease gemäß Anspruch 1, der einen
N-terminalen Vorläuferpeptidbereich aufweist, der von Proteasen in Zellen
abgespalten wird.
4. Vorläufer einer Desoxyribonuclease gemäß Anspruch 2, der einen
N-terminalen Vorläuferpeptidbereich mit der Aminosäuresequenz der Positionen
1-25 von SEQ ID NO: 1 oder einer partiellen Substitution, Deletion,
Insertion oder Modifikation dieser Aminosäuresequenz, welche die in Anspruch
1 definierten Eigenschaften der Desoxyribonuclease nicht verändert und
eine normale Prozessierung erlaubt, aufweist.
5. DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die die Desoxyribonuclease
gemäß Anspruch 1 oder 2 oder den Vorläufer gemäß Anspruch 3 oder 4
codiert.
6. DNA gemäß Anspruch 5, die die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern
87-941 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
7. DNA gemäß Anspruch 6, die die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern
12-941 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
8. Rekombinanter Vektor, der die DNA gemäß einem der Ansprüche 5-7
umfasst.
9. Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Vektor von Anspruch 8
transformiert ist.
10. Verfahren zur Herstellung der Desoxyribonuclease gemäß Anspruch 1 oder
2 oder des Vorläufers gemäß Anspruch 3 oder 4, welches das Kultivieren
der Wirtszelle von Anspruch 9 und das Ernten der Desoxyribonuclease
oder des Vorläufers umfasst.
11. Antikörper mit einer Affinität zu einer Desoxyribonuclease gemäß
Anspruch 1 oder 2 oder einem Vorläufer gemäß Anspruch 3 oder 4.
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8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |