DE69233724T2

DE69233724T2 - Bindungsdomänen des Serrate-Proteins

Info

Publication number: DE69233724T2
Application number: DE69233724T
Authority: DE
Inventors: Spyridon Brookline Artavanis-Tsakonas; Richard Grant New Heaven Fehon; Ilaria New Heaven Rebay
Original assignee: Yale University; Indiana University Foundation
Current assignee: Yale University; Indiana University Foundation
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2012-05-02
Also published as: AU675203B2; ATE386116T1; DE69233724D1; DK0576623T4; ATE397661T1; ATE226633T1; JP2011135886A; DE69232832T3; JP2007330258A; EP0933082B1; EP0576623B1; JP2004065243A; IE921367A1; IL101728A0; EP0930366B1; EP0930365B1; DK0576623T3; JP4430891B2; JP2007330259A; DK0930366T3

Description

Diese Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung durch die Regierung unter den „Grant Numbers" GM 19093 und NS 26084, gewährt durch das Department of Health and Human Services, gemacht. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
1. EINFÜHRUNG
Die Erfindung betrifft die humanen Notch- und Delta-Gene und die Produkte, die diese kodieren. Die Erfindung betrifft auch Sequenzen (die hier als „adhäsive Sequenzen" bezeichnet werden) innerhalb der Proteine, die durch toporhythmische Gene kodiert werden, die eine homotypische oder heterotypische Bindung an Sequenzen innerhalb von Proteinen, die durch toporhythmische Gene kodiert werden, vermitteln. Solche Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Notch, Delta und Serrate.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Genetische Analysen in Drosophila sind extrem nützlich gewesen, um die Komplexität von entwicklungsbezogenen Stoffwechselwegen aufzuschlüsseln und wechselwirkende Genorte zu identifizieren. Jedoch erfordert ein Verständnis der genauen Natur der Prozesse, die genetischen Wechselwirkungen zugrunde liegen, eine Kenntnis der biochemischen Eigenschaften der Proteinprodukte der fraglichen Gene.
Nullmutationen in einem jeglichen der zygotischen neurogenen Loci – Notch (N), Delta (Dl), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl)), neuralized (neu) und big brain (bib) – führen zu einer Hypertrophie des Nervensystems auf Kosten von ventralen und lateralen epidermalen Strukturen. Dieser Effekt ist auf die Fehlleitung von epidermalen Vorläuferzellen in einen neuronalen Weg zurückzuführen und impliziert, dass neurogene Genfunktion notwendig ist, um Zellen innerhalb der neurogenen Region von einem neuronalen Schicksal zu einem epithelialen Schicksal umzulenken. Untersuchungen, die die Wirkungen einer Laser-Ablation von speziellen embryonalen Neuroblasten in Grashüpfern untersuchten (Doe und Goodman 1985, Dev. Biol. 111, 206–219), haben gezeigt, dass zelluläre Wechselwirkungen zwischen Neuroblasten und den umgebenden akzessorischen Zellen dazu dienen, diese akzessorischen Zellen daran zu hindern, ein Neuroblasten-Schicksal zu erleiden. Zusammen genommen, haben diese genetischen und entwicklungsbezogenen Beobachtungen zu der Hypothese geführt, dass die Proteinprodukte der neurogenen Genorte als Komponenten eines zellulären Wechselwirkungsmechanismus, der für eine korrekte epidermale Entwicklung erforderlich ist, funktionieren (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95–100).
Sequenzanalysen (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094–3108; Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431–3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735) haben gezeigt, dass zwei der neurogenen Genorte, Notch und Delta, offensichtlich Transmembranproteine kodieren, die die Membran ein einziges Mal durchziehen. Das Notch-Gen kodiert ein ~ 300 kD-Protein (wir verwenden „Notch", um dieses Protein zu bezeichnen) mit einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne, die 36 epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)-artige Tandem-Wiederholungen, gefolgt von drei anderen cysteinreichen Wiederholungen, welche als Notch/lin-12-Wiederholungen oder -Repeats bezeichnet werden (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094–3108; Yochem et al., 1988, Nature 335, 547–550), umfasst. Delta kodiert ein ~ 100 kD-Protein (wir verwenden „Delta", um DLZM, das Proteinprodukt der vorherrschenden zygotischen und maternalen Transkripte, zu bezeichnen; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735), das neun EGF-artige Wiederholungen innerhalb von seiner extrazellulären Domäne aufweist (Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431–3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735). Obwohl wenig über die funktionelle Signifikanz von diesen Wiederholungen bekannt ist, ist das EGF-artige Motiv in verschiedenen Proteinen, einschließlich jenen, die an der Blutgerinnungskaskase beteiligt sind (Furie und Furie, 1988, Cell 53, 505–518), gefunden worden. Insbesondere ist dieses Motiv in extrazellulären Proteinen, wie den Blutgerinnungsfaktoren IX und X (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061; Furie und Furie, 1988, Cell 53, 505–518), in anderen Drosophila-Genen (Knust et al., 1987, EMBO J. 761–766; Rothberg et al., 1988, Cell 55, 1047–1059) und in einigen Zelloberflächenrezeptorproteinen, wie Thrombomodulin (Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6, 1891–1897) und dem LDL-Rezeptor (Sudhof et al., 1985, Science 228, 815–822), gefunden worden. Eine Proteinbindungsstelle ist auf die EGF-Wiederholungsdomäne in Thrombomodulin und Urokinase kartiert worden (Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993–5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437–4440).
Es ist ein interessantes Spektrum von Wechselwirkungen zwischen Notch- und Delta-Mutationen beschrieben worden (Vassin et al., 1985, J. Neurogenet. 2, 291–308; Shepard et al., 1989, Genetics 122, 429–438; Xu et al., 1990, Genes Dev., 4, 464–475). Verschiedene genetische Untersuchungen (zusammengefasst in Alton et al., 1989, Dev. Genet. 10, 261–272) hat darauf hingewiesen, dass die Gendosen von Notch und Delta in Beziehung zu einander für eine normale Entwicklung entscheidend sind. Eine 50%-ige Verringerung der Dosis von Delta in einem Wildtyp-Notch-Hintergrund bewirkt eine Verbreiterung der Flügelvenen, was an der Basis ein „Del ta" erzeugt (Lindsley und Grell, 1968, Publication Number 627, Washington, D. C., Carnegie Institute of Washington). Ein ähnlicher Phänotyp wird durch eine 50%-ige Zunahme der Dosis von Notch in einem Wildtyp-Delta-Hintergrund bewirkt (ein „Confluens"-Phänotyp; Welshons, 1965, Science 150, 1122–1129). Dieser Delta-Phänotyp wird durch eine Verringerung bei der Notch-Dosis teilweise unterdrückt. Neuere Arbeiten in unseren Laboratorien haben gezeigt, dass letale Wechselwirkungen zwischen Allelen, die mit Veränderungen in den EGF-artigen Wiederholungen in Notch korrelieren, gerettet werden können, indem die Dosis von Delta verringert wird (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464–475). Xu et al. (1990, Genes Dev. 4, 464–475) haben festgestellt, dass Nullmutationen bei entweder Delta oder mam letale Wechselwirkungen zwischen heterozygoten Kombinationen von bestimmten Notch-Allelen, die als Abruptex (Ax)-Mutationen bekannt sind, unterdrücken. Ax-Allele sind mit Fehlsinnmutationen innerhalb der EGF-artigen Wiederholungen der extrazellulären Domäne von Notch assoziiert (Kelley et al., 1987, Cell 51, 539–548; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407–3417).
Notch wird an axonalen Auswüchsen während des Auswachsens von embryonalen Neuronen exprimiert (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427–2440; Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113–1129).
Eine Untersuchung hat gezeigt, dass bestimmte Ax-Allele von Notch die Wegfindung bzw. Bannung von Axonen während des sensorischen neuralen Auswachsens in den Imaginalscheiben schwerwiegend verändern können, obwohl noch nicht bekannt ist, ob eine aberrante Notch-Expression in dem Axon selbst oder in dem Epithel, entlang von welchem es wachst, für diesen Defekt verantwortlich ist (Palka et al., 1990, Development 109, 167–175).
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein im Wesentlichen gereinigtes Fragment eines Serrate-Proteins nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, ein chimäres Protein nach Anspruch 5 oder Anspruch 7, ein Derivat eines Fragments nach Anspruch 6, eine im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäure nach Anspruch 8, einen Nukleinsäurevektor nach Anspruch 9, eine Zelle nach Anspruch 10, einen Antikörper nach Anspruch 11 und ein Verfahren nach Anspruch 13 zur Verfügung. Die Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen der humanen Notch- und Delta-Gene und Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch diese kodiert werden, wie auch Fragmente davon, welche eine antigene Determinante enthalten oder die funktional aktiv sind. Die Erfindung betrifft auch Fragmente (welche hier als „adhäsive Fragmente" bezeichnet werden), und die Sequenzen von diesen, der Proteine („toporhythmische Proteine"), die durch toporhythmische Gene kodiert werden, die eine homotypische oder heterotypische Bindung an toporhythmische Proteine vermitteln. Toporhythmische Gene, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Gene Notch, Delta und Serrate wie auch andere Mitglieder der Delta/Serrate-Familie, die z. B. durch die in Abschnitt 5.3 unten beschriebenen Verfahren identifiziert werden können. Analoga und Derivate der adhäsiven Fragmente, die Bindungsaktivität bewahren, werden auch offenbart. Antikörper gegen humanes Notch und gegen adhäsive Fragmente werden zusätzlich offenbart.
Das adhäsive Fragment von Notch ist jenes Fragment, welches die Notch-Sequenz umfasst, die am stärksten homolog zu den EGF-artigen Wiederholungen 11 und 12 von Drosophila-Notch ist; das adhäsive Fragment von Delta, welches eine heterotypische Bindung vermittelt, ist jenes Fragment, welches die Sequenz umfasst, die am stärksten homolog zu den Aminosäuren 1–230 von Drosophila-Delta ist; das adhäsive Fragment von Delta, welches eine homotypische Bindung vermittelt, ist jenes Fragment, welches die Sequenz umfasst, die am stärksten homolog zu den Aminosäuren 32–230 von Drosophila-Delta ist; und das adhäsive Fragment von Serrate ist jenes Fragment, welches die Sequenz umfasst, die am stärksten homolog zu den Aminosäuren 85–283 oder 79–282 von Drosophila-Serrate ist.
3.1. DEFINITIONEN
Wie hier verwendet, sollen die folgenden Begriffe die angegebenen Bedeutungen haben:

AS: = Aminosäure
EGF: = epidermaler Wachstumsfaktor
ELF: = EGF-artige (homologe) Wiederholung
IC: = intrazellulär
PCR: = Polymerasekettenreaktion.

Wie hier verwendet, soll eine Unterstreichung des Namens eines Gens das Gen angeben im Gegensatz zu dem Protein, das durch dieses kodiert wird, das durch den Namen des Gens in Abwesenheit von einer jeglichen Unterstreichung angegeben wird. Beispielsweise soll „Notch" das Notch-Gen bedeuten, wohingegen „Notch" das Proteinprodukt des Notch-Gens bezeichnen soll.
4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Expressionskonstrukte und Versuchsgestaltung für das Untersuchen von Notch-Delta-Wechselwirkungen. S2-Zellen in der log-Phase der Vermehrung wurden vorübergehend mit einem der drei gezeigten Konstrukte transfiziert. Notch, das durch das MG11a-Minigen (ein chimäres cDNA/genomisches Konstrukt: von cDNA abgeleitete Sequenzen sind durch Punktierung, genomisch abgeleitete Sequenzen durch diagonale Schraffierung dargestellt (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337–348)) kodiert wird, wurde nach Insertion in den Metallothionein-Promotor-Vektor pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043–1061) exprimiert. Delta, das durch die Dl1-cDNA kodiert wird (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735) wurde nach Insertion in den gleichen Vektor exprimiert. Die extrazelluläre Notch (ECN1)-Variante wurde abgeleitet von einem genomischen Cosmid, welches den vollständigen Notch-Genort enthielt (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337–348), durch Deletieren der kodierenden Sequenz für die Aminosäuren 1790–2625 aus der intrazellulären Domäne (bezeichnet durch δ; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581), was 25 zu der Membran proximal gelegene Reste aus der Wildtypsequenz fusioniert an einen neuen 59 Aminosäuren-Schwanz zurückließ (siehe Experimentelle Vorgehensweisen, Abschnitt 6.1, unten). Dieses Konstrukt wurde unter der Kontrolle der Notch-Promotorregion exprimiert. Für Konstrukte, an welchen der Metallothionein-Vektor beteiligt war, wurde eine Expression mit CuSO₄ nach Transfektion induziert. Zellen wurden dann gemischt, unter Aggregationsbedingungen inkubiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, zu aggregieren, unter Verwendung von spezifischen Antiseren und Immunfluoreszenzmikroskopie, um exprimierende Zellen sichtbar zu machen, bewertet. MT, Metallothionein-Promotor; ATG, Translationsstartstelle; TM, Transmembrandomäne; 3' N, Notch-Gen-Polyadenylierungssignal; 3' Adh, Polyadenylierungssignal aus dem Adh-Gen; 5' N, Notch-Gen-Promotorregion.
2. Expression von Notch und Delta in kultivierten Zellen. (A) Lysate von nicht-transfizierten (S2) und Notch-transfizierten (N) Zellen, die mit 0,7 mM CuSO₄ 12–16 h induziert worden waren, wurden für eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) hergestellt, auf 3%–15%-Gradientengelen aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Notch wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (MAb C17.9C6) gegen die intrazelluläre Domäne von Notch sichtbar gemacht. Eine Mehrzahl von Banden unterhalb der Hauptbande bei 300 kD könnte Abbauprodukte von Notch darstellen. (B) Lysate von nicht-transfizierten (S2) und Delta-transfizierten (Dl) Zellen, sichtbar gemacht mit einem monoklonalen Antikörper (MAb 201) gegen Delta. Es wird eine einzelne Bande von ~ 105 kD detektiert. In beiden Fällen gibt es in der S2-Zelllinie kein nachweisbares endogenes Notch oder Delta noch gibt es kreuzreaktive Spezies. In jeder Bahn wurden 10 μl Probe (hergestellt, wie in den Experimentellen Vorgehensweisen beschrieben) aufgetragen.
3. S2-Zellen, die Notch und Delta exprimieren, bilden Aggregate. In allen Feldern ist Notch in grün und Delta in rot gezeigt.

(A) Eine einzelne Notch⁺-Zelle. Es ist auf die hervorstechende intrazelluläre Anfärbung, einschließlich vesikulärer Strukturen, wie auch einen offensichtlich nicht angefärbten Zellkern hinzuweisen.
(A) Hellfeld-Mikrobild desselben Felds, welches die Spezifität der Antikörperfärbung zeigt.
(B) Eine einzelne Delta⁺-Zelle. Die Anfärbung befindet sich hauptsächlich an der Zelloberfläche.
(B) Hellfeld-Mikrobild desselben Felds.
(C) Aggregat von Delta⁺-Zellen aus einem 24 h-Aggregationsexperiment. Es ist erneut darauf hinzuweisen, dass die Anfärbung sich hauptsächlich an der Zelloberfläche befindet.
(D)–(F) Ein Aggregat von Notch⁺- und Delta⁺-Zellen, gebildet ausgehend von einer 1:1-Mischung von einzeln transfizierten Zellpopulationen, die man über Nacht bei Raumtemperatur hatte aggregieren lassen. (D) zeigt Notch⁺-Zellen in diesem Aggregat; (E) zeigt Delta⁺-Zellen; und (F) ist eine Doppelexposition, welche beide Zellarten zeigt. Banden von Notch und Delta sind hervorstechend an Kontaktstellen zwischen Notch⁺- und Delta⁺-Zellen (Pfeile). In (F) erscheinen diese Banden aufgrund der Koinzidenz von grün und rot an diesen Stellen gelb. Die offensichtlich doppelt angefärbte einzelne Zelle (*) besteht tatsächlich aus zwei Zellen (eine auf der anderen), wobei eine Notch und die andere Delta exprimiert.
(G) und (H) Konfokale Pseudofarb-Mikrophotographien von Notch⁺-Delta⁺-Zellaggregaten. Es ist darauf hinzuweisen, dass in (G) Ausdehnungen (Pfeile), die aus mindestens zwei Delta⁺-Zellen gebildet werden, die Notch⁺-Zelle im Zentrum des Aggregats vollständig einkreisen. (H) zeigt ein Aggregat, das ausgehend von einem bei 4°C ausgeführten zweistündigen Aggregationsexperiment gebildet worden ist. Intensive Banden von Notch sind innerhalb von Kontaktbereichen mit Delta⁺-Zellen erkennbar.
(I) Ein aus Delta⁺-Zellen und Zellen, die nur die extrazelluläre Domäne von Notch exprimieren (ECN1-Konstrukt), gebildetes Aggregat. Skalenbalken = 10 μm.

4. Notch und Delta sind in kotransfizierten Zellen assoziiert. Die Anfärbung auf Notch ist in der linken Spalte (A, C und E) gezeigt und jene auf Delta ist in der rechten Spalte (B, D und F) gezeigt.

(A) und (B) S2-Zelle, die mit beiden Notch- und Delta-Konstrukten kotransfiziert ist. Im Allgemeinen gab es eine gute Korrelation zwischen der Notch- und Delta-Lokalisierung an der Zelloberfläche (Pfeile).
(C) und (D) Cotransfizierte Zellen wurden 1 h bei Raumtemperatur gegenüber einem polyklonalen anti-Notch-Antiserum (eine 1:250-Verdünnung von jedem anti-extrazellulare Do mäne-Antiserum) exponiert vor Fixierung und Anfärbung mit spezifischen Antiseren. Es ist auf die punktartige Anfärbung von Notch und Delta und die Korrelation von deren jeweiliger Anfärbung (Pfeile) hinzuweisen.
(E) und (F) Zellen, die mit den extrazellulären Notch (ECN1)- und Delta-Konstrukten cotransfiziert, induziert und dann unter Verwendung von polyklonalem anti-Notch-Antiserum in abgegrenzten Bereichen angefärbt bzw. gepatcht („patched") wurden. Es gab eine enge Korrelation zwischen der ECN1- und Delta-Anfärbung an der Oberfläche, wie sie für Volllängen-Notch beobachtet wurde. Skalenbalken = 10 μm.

5. Eine Coimmunpräzipitation zeigt, dass Delta und Notch in Lysaten von transfizierten S2- und embryonalen Drosophila-Zellen assoziiert sind. In allen Experimenten wurde Delta aus NP-40/Desoxycholat-Lysaten präzipitiert unter Verwendung eines polyklonalen anti-Delta-Ratten-Antiserums, präzipitiert mit fixierten Staph A-Zellen, und Proteine in der präzipitierten Fraktion wurden auf Western-Blots sichtbar gemacht (für Details siehe Experimentelle Vorgehensweisen). Bahnen 1, 2, 3 und 5: Notch, sichtbar gemacht mit MAb C17.9C6; Bahnen 4 und 6: Delta, sichtbar gemacht unter Verwendung von MAb 201.

In (A) sind die Bahnen 1 und 2 Kontrollen für diese Experimente. Bahn 1 zeigt eine polyklonale anti-Delta-Immunpräzipitation aus Zellen, die Notch alleine exprimieren, sichtbar gemacht für Notch. In dieser Probe war kein Notch detektierbar, was anzeigt, dass das polyklonale anti-Delta mit Notch nicht kreuzreagiert. Bahn 2 zeigt Notch-Delta-cotransfizierte Zellen, die mit Staph A ohne eine anfängliche Behandlung mit anti-Delta-Antiserum immunpräzipitiert worden sind und hinsichtlich Notch sichtbar gemacht wurden, was zeigt, dass Notch nicht nichtspezifisch durch das Staph A oder den sekundären Antikörper präzipitiert wird. Bahn 3 zeigt Protein, das mit anti-Delta-Antiserum präzipitiert worden ist, sichtbar gemacht für Delta (Dl) und Bahn 4 zeigt die gleiche Probe, sichtbar gemacht für Notch (N). Bahn 4 zeigt, dass Notch mit immunpräzipitiertem Delta copräzipitiert. Es ist anzumerken, dass Notch als ein Dublett erscheint, wie dies für Notch in Immunpräzipitaten typisch ist.
(B) zeigt das gleiche Experiment unter Verwendung von embryonalen Lysaten anstelle von Lysaten von transfizierten Zellen. Bahn 5 zeigt Protein, das mit anti-Delta-Antiserum präzipitiert worden ist, sichtbar gemacht für Delta (Dl) und Bahn 6 zeigt die gleiche Probe, sichtbar gemacht für Notch (N). Diese Bahnen zeigen, dass Notch und Delta in Embryo-Lysaten stabil assoziiert sind. Banden (in allen Bahnen) unterhalb der Delta-Bande stammen von Staph A (SA) und den schweren (H) und leichten (L) Ketten des anti-Delta-Antiserums.

6. Notch-Expressionskonstrukte und die Deletionskartierung der Delta/Serrate-Bindungsdomäne. S2-Zellen in der log-Phase der Vermehrung wurden vorübergehend mit der gezeigten Reihe von Expressionskonstrukten transfiziert; die Zeichnungen repräsentieren die vorhergesagten Proteinprodukte der verschiedenen erzeugten Notch-Deletionsmutanten. Alle Expressionskonstrukte waren von dem Konstrukt Nr. 1 pMtNMg abgeleitet worden. Vorübergehend transfizierte Zellen wurden mit Delta exprimierenden Zellen aus der stabil transformierten Linie L49-6-7 oder mit vorübergehend transfizierten Serrate exprimierenden Zellen gemischt, mit CuSO₄ induziert, unter Aggregationsbedingungen inkubiert und dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit, zu aggregieren, unter Verwendung von spezifischen Antiseren und von Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet. Aggregate wurden als Cluster von vier oder mehr Zellen, welche sowohl Notch als auch Delta/Serrate exprimierende Zellen enthielten, definiert. Die für % Aggregation angegebenen Werte beziehen sich auf den Prozentsatz von allen Notch exprimierenden Zellen, die in solchen Cluster entweder mit Delta (Dl) (linke Spalte) oder mit Serrate (Ser) (rechte Spalte) gefunden werden. Die verschiedenen Notch-Deletionskonstrukte sind diagrammartig mit Spleißlinien, welche die Ligationsverbindungsstellen angeben, dargestellt. Jede EGF-Wiederholung ist als ein mit Punktierung ausgefüllter rechteckiger Rahmen dargestellt und es sind die Anzahlen der EGF-Wiederholungen auf jeder Seite einer Ligationsverbindungsstelle angegeben. An den Ligationsverbindungsstellen sind partielle EGF-Wiederholungen, die durch die verschiedenen Deletionen erzeugt worden sind, durch nicht ausgefüllte Rahmen und geschlossene Klammern (beispielsweise siehe Nr. 23 ΔCla + EGF(10–12)) angegeben. Die Konstrukte Nr. 3–13 repräsentieren die ClaI-Deletionsreihe. Wie diagrammartig dargestellt, zerbrechen vier der ClaI-Stellen in den Wiederholungen 7, 9, 17 und 26 die Wiederholung in der Mitte, unmittelbar nach dem dritten Cystein (bezeichnet durch Wiederholungen mit nicht-ausgefüllten Rahmen; siehe 7 zur weiteren Klärung), während die fünfte und am weitesten 3' gelegene Stelle eine saubere Spaltung zwischen den EGF-Wiederholungen 30 und 31 bewirkt (bezeichnet durch die Wiederholung 31 mit dem ausgefüllten Rahmen; wieder siehe 7). In dem Konstrukt Nr. 15 split ist die EGF-Wiederholung 14, die die split-Punktmutation trägt, als ein gestreift ausgefüllter Rahmen gezeichnet. In dem Konstrukt Nr. 33 ΔCla + XEGF(10–13) sind die von Xenopus-Notch abgeleiteten EGF-Wiederholungen von Drosophila-Wiederholungen durch ein unterschiedliches Muster der Schattierung unterschieden. SP, Signalpeptid; EGF, epidermaler Wachstumsfaktor-Wiederholung; N, Notch/lin-12-Wiederholung; TM, Transmembrandomäne; cdc 10, cdc 10/Ankyrin-Wiederholungen; PA, mutmaßliche Nukleotidbindungs-Consensussequenz; opa, Polyglutamin-Strang, welcher als opa bezeichnet wird; Dl, Delta; Ser, Serrate.
7. Detaillierte Struktur der Notch-Deletionskonstrukte Nr. 19–24; sowohl die EGF-Wiederholung 11 als auch 12 werden für eine Notch-Delta-Aggregation benötigt. Die EGF- Wiederholungen 10–13 sind diagrammartig oben dargestellt, wobei sie die regulären Abstände der sechs Cysteinreste (C) zeigen. PCR-Produkte, die für diese Konstrukte erzeugt worden sind (Namen und Nummern wie in 6 angegeben) werden durch die dicken schwarzen Linien dargestellt und die exakten Endpunkte sind bezogen auf die verschiedenen EGF-Wiederholungen angegeben. Die Fähigkeit, mit Delta zu aggregieren, ist für jedes Konstrukt als (+) oder (–) aufgezeichnet. Die PCR-Fragmente zerbrechen die EGF-Wiederholungen entweder in der Mitte, unmittelbar nach dem dritten Cystein an der gleichen Stelle wie vier von den fünf ClaI-Stellen oder exakt zwischen zwei Wiederholungen an der gleichen Stelle wie die am weitesten C-terminal gelegene ClaI-Stelle.
8. Vergleich der Aminosäuresequenz der EGF-Wiederholungen 11 und 12 aus Drosophila- und Xenopus-Notch. Die Aminosäuresequenz der EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Drosophila-Notch (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567–581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6: 3094–3108) ist in auf Homologie basierender Ausrichtung (Alignment) bezogen auf jene der gleichen zwei EGF-Wiederholungen aus Xenopus-Notch (Coffman et al., 1990, Science 249: 1438–1441) dargestellt. Identische Aminosäuren sind von Rahmen umgeben. Die sechs konservierten Cystein-Reste von jeder EGF-Wiederholung und die Ca⁺⁺-Eindungs-Consensusreste (Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053–2061) sind mit einem Sternchen (*) markiert. Die Leucin→Prolin-Veränderung, die in dem Xenopus-PCR-Klon, welcher keine Aggregation zeigte, gefunden wird, ist darunter angegeben.
9. In dieser Untersuchung eingesetzte Konstrukte. Es sind schematische Diagramme der in Tabelle IV definierten Delta-Varianten gezeigt. Der extrazelluläre aminoproximale Terminus befindet sich in jedem Falle links. S, Signalpeptid; „EGF", EGF-artige Motive; M, Membran-durchspannende Helix; H, Stop-Transfer-Sequenz; durchgezogene Linien, andere Delta-Sequenzen; schraffierte Linien, Neuroglian-Sequenzen. Pfeilköpfe geben Stellen von translatierbaren Linker-Insertionen an. Sca, ScaI; Nae, NaeI; Bam, BamHI; Bgl, BglII; ELR, EGF-artige Wiederholung; Bst, BstEII, Dde, DdeI; Stu, StuI; NG1–NG5, Delta-Neuroglian-Chimäre.
9A. Abhängigkeit der Aggregation von eingesetzten DNA-Mengen. A, Heterotypische Aggregation, die beobachtet wird bei Verwendung von vorübergehend mit jeweils verschiedenen Mengen von pMTD11-DNA (2, 4, 10 oder 20 μg/Platte) transfizierten S2-Zellpopulationen, die nachfolgend unter Aggregationsbedingungen mit S2-Zellpopulationen, die vorübergehend mit einer konstanten Menge von pMtNMg-DNA (20 μg/Platte) transfiziert worden waren, inkubiert wurden. Die aufgeführten Daten sind die Mittelwerte des Bruchteils (%) von Delta-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen ± Standardfehler für jede eingesetzte DNA-Menge (N = 3 Wiederholungen/Replikate mit Ausnahme der 2 μg- und 10 μg- Einsatzmengen, für welche N = 2). Für jedes Replikat wurden minimal 100 Delta exprimierende Zellen gezählt. B, Homotypische Aggregation, welche beobachtet wird bei Verwendung von vorübergehend mit jeweils variierenden Mengen von pMTD11-DNA (2, 4, 10 oder 20 μg/Platte) transfizierten S2-Zellpopulationen, die nachfolgend unter Aggregationsbedingungen inkubiert worden waren. Die aufgeführten Daten sind die Mittelwerte des Bruchteils (%) von Delta-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen ± Standardfehler für jede eingesetzte DNA-Menge (N = 3 Wiederholungen/Replikate). Es wurden für jedes Replikat mindestens 500 Delta exprimierende Zellen gezählt.
10. Aligment der aminoterminalen Sequenzen von Delta und Serrate. Die Reste sind auf der Grundlage einer konzeptionellen Translation von Delta (Dl, obere Sequenz (SEQ ID NO: 3), beginnend an Aminosäure 24, endend an Aminosäure 226) und Serrate (Ser, untere Sequenz (SEQ ID NO: 4); beginnend an Aminosäure 85, endend an Aminosäure 283) kodierenden Sequenzen nummeriert. Vertikale Linien zwischen den beiden Sequenzen zeigen Reste an, die innerhalb der Delta- und Serrate-Sequenzen in diesem Alignment identisch sind. Punkte entsprechen Lücken in dem Alignment. Rahmen umfassen Cysteinreste innerhalb der dem Alignment unterworfenen Regionen. N1, aminoproximale Domäne 1; N2, aminoproximale Domäne 2; N3, aminoproximale Domäne 3. Translatierbare Insertionen, die assoziiert sind mit STU B- [Ersatz der Delta-Aminosäure 132 (A) mit GKIFP] bzw. NAE B- [Insertion von RKIF zwischen die Delta-Aminosäure 197 und Aminosäure 198] Konstrukten sind oben mit der Delta-Wildtyp-Sequenz angegeben.
11. Potentielle Geometrien von Delta-Notch-Wechselwirkungen. A, Potentielles Register von Delta-(links) und Notch-(rechts)-Molekülen, welche zwischen einander gegenüberliegenden Plasmamembranen Wechselwirken. B. Potentielles Register von Delta-(links) und Notch-(rechts)-Molekülen, welche innerhalb derselben Plasmamembranen Wechselwirken. ELR, EGF-artige Wiederholung; nicht-ausgefüllte Rahmen, EGF-artige Wiederholungen; gepunktet ausgefüllte Rahmen, LNR-Wiederholungen; dunkel ausgefüllte Rahmen, Membran-durchspannende Helices. Die aminoterminale Domäne von Delta und die intrazellulären Domänen von Delta und Notch sind durch Ovale dargestellt.
12. Potentielle Geometrien von Delta-Delta-Wechselwirkungen. A und B, Potentielles Register von Delta-Molekülen, die zwischen einander gegenüberliegenden Plasmamembranen Wechselwirken. B, Potentielles Register von Delta-Molekülen, die innerhalb derselben Plasmamembranen Wechselwirken. Nicht-ausgefüllte Rahmen, EGF-artige Wiederholungen; dunkel ausgefüllte Rahmen, Membran-durchspannende Helices. Aminoterminale extrazelluläre und intrazelluläre Domänen von Delta sind durch Ovale dargestellt.
13. Nukleotid-Primärsequenz der Delta-cDNA Dl1 (SEQ ID NO: 5) und Aminosäuresequenz von Delta (SEQ ID NO: 6). Es ist die DNA-Sequenz des 5'-3'-Strangs der Dl1-cDNA gezeigt, die eine Anzahl von Korrekturen im Vergleich zu jener, die in Kopczynski et al. (1988, Genes Dev. 2, 1723–1735) angegeben wird, enthält.
14. Nukleotid-Primärsequenz der Neuroglian-cDNA 1B7A-250 (SEQ ID NO: 7). Dies ist die DNA-Sequenz eines Abschnitts des 5'-3'-Strangs der 1B7A-250-cDNA (A. J. Bieber, pers. Mitteilung; Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697–709). Das Nukleotid 2890 entspricht dem ersten Nukleotid eines Isoleucin-Codons, das die Aminosäure 952 des konzeptionell translatierten Neuroglian-Langform-Proteins kodiert.
15. Nukleinsäuresequenzhomologien zwischen Serrate und Delta. Es ist ein Abschnitt der Drosophila-Serrate-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 8) mit der darunter geschriebenen kodierten Serrate-Proteinsequenz (SEQ ID NO: 9) (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188–2201, auf S. 2193–94) gezeigt. Die vier Regionen, welche hohe Sequenzhomologie mit der Drosophila-Delta-Sequenz zeigen, sind oberhalb der Zeile nummeriert und durch Klammern angegeben. Die gesamte Region von Homologie überspannt die Nukleotide Nummer 627 bis 1290 der Serrate-Nukleotidsequenz (Nummerierung wie in 4 von Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188–2201).
16. Primer, die für eine PCR bei der Klonierung von humanem Notch verwendet worden sind. Es ist die Sequenz von drei Primer, die für die PCR verwendet worden sind, um DNA in einer humanen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek zu amplifizieren, gezeigt. Die drei Primer cdc1 (SEQ ID NO: 10), cdc2 (SEQ ID NO: 11) und cdc3 (SEQ ID NO: 12) wurden gestaltet, um entweder ein 200 bp- oder ein 400 bp-Fragment mittels der Primerpaare cdc1/cdc2 bzw. cdc1/cdc3 zu amplifizieren. I: Inosin.
17. Schematisches Diagramm von humanen Notch-Klonen. Es ist ein schematisches Diagramm von humanem Notch gezeigt. Durchgezogene Fettdruck-Linien unterhalb des Diagramms zeigen jenen Abschnitt der Notch-Sequenz, der in jedem der vier cDNA-Klone enthalten ist. Die Lage der Primer, die in der PCR verwendet worden sind, und ihre Orientierung sind durch Pfeile angegeben.
18. Humane Notch-Sequenzen im Alignment mit der Drosophila-Notch-Sequenz. Mit Nummern versehene vertikale Linien entsprechen Drosophila-Notch-Koordinaten. Horizontale Linien unter jeder Karte zeigen, wo Klone bezogen auf Sequenzabschnitte (dicke horizontale Linien) liegen.
19. Nukleotidsequenzen von humanem Notch, die in dem Plasmid-cDNA-Klon hN2k enthalten sind; 19A: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 13) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend an der EcoRI-Stelle an dem 3'-Ende und in der 3'→5'-Richtung weitergehend. 19B: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 14) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. 19C: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 15) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend 3' von der in 19B gezeigten Sequenz und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. Die gezeigten Sequenzen beruhen auf Mutmaßung und unterliegen einer Bestätigung durch Bestimmung von überlappenden Sequenzen.
20. Nukleotidsequenzen von humanem Notch, die in dem Plasmid-cDNA-Klon hN3k enthalten sind. 20A: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 16) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend an der EcoRI-Stelle an dem 3'-Ende und in der 3'→5'-Richtung weitergehend. 20B: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 17) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. 20C: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 18) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend 3' von der in 20B gezeigten Sequenz und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. 20D: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 19) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend 5' von der in 20A gezeigten Sequenz und in der 3'→5'-Richtung weitergehend. Die gezeigten Sequenzen beruhen auf Mutmaßung und unterliegen einer Bestätigung durch Bestimmung von überlappenden Sequenzen.
21. Nukleotidsequenzen von humanem Notch, die in dem Plasmid-cDNA-Klon hN4k enthalten sind. 21A: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 20) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend an der EcoRI-Stelle an dem 5'-Ende und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. 21B: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 21) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend nahe dem 3'-Ende und in der 3'→5'-Richtung weitergehend. Die gezeigten Sequenzen beruhen auf Mutmaßung und unterliegen einer Bestätigung durch Bestimmung von überlappenden Sequenzen.
22: Nukleotidsequenzen von humanem Notch, die in dem Plasmid-cDNA-Klon hN5k enthalten sind. 22A: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 22) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend an der EcoRI-Stelle an dem 5'-Ende und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. 22B: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 23) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend nahe dem 3'-Ende und in der 3'→5'-Richtung weitergehend. 22C: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 24) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend 3' von der in 22A gezeigten Sequenz und in der 5'→3'-Richtung weitergehend. 22D: Es ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 25) eines Abschnitts des humanen Notch-Inserts gezeigt, beginnend 5' von der in 22B gezeigten Sequenz und in der 3'→5'-Richtung weitergehend. Die gezeigten Sequenzen beruhen auf Mutmaßung und unterliegen einer Bestätigung durch Bestimmung von überlappenden Sequenzen.
23. DNA-(SEQ ID NO: 31) und Aminosäure-(SEQ ID NO: 34)-Sequenzen von humanem Notch, das in dem Plasmid-cDNA-Klon hN3k enthalten ist.
24. DNA-(SEQ ID NO: 33) und Aminosäure-(SEQ ID NO: 34)-Sequenzen von humanem Notch, das in dem Plasmid-cDNA-Klon hN5k enthalten ist.
25. Vergleich von hN5k mit anderen Notch-Homologen. 25A: Schematische Darstellung von Drosophila-Notch. Angegeben sind die Signalsequenz (signal), die 36 EGF-artigen Wiederholungen, die drei Notch/lin-12-Wiederholungen, die Transmembrandomäne (TM), die sechs CDC10-Wiederholungen, die OPA-Wiederholung und die PEST (Prolin, Glutaminsäure, Serin, Threonin)-reiche Region. 25B. Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenz von hN5k mit Sequenzen von anderen Notch-Homologen. Aminosäuren sind auf der linken Seite nummeriert. Die cdc10- und PEST-reichen Regionen sind beide von Rahmen umgeben und individuelle cdc10-Wiederholungen sind markiert. Aminosäuren, die in drei oder mehr Sequenzen identisch sind, sind hervorgehoben. Die Primer, die verwendet wurden, um hN5k zu klonieren, sind unter den Sequenzen, ausgehend von welchen sie gestaltet worden sind, angegeben. Die Kernlokalisierungssequenz (NLS), Caseinkinase II-(CKII) und cdc2-Kinase-(cdc2)-Stellen des mutmaßlichen CcN-Motivs der Vertebraten-Notch-Homologen sind von Rahmen umgeben. Die mögliche zweiteilige (bipartite) nukleare Targeting-Sequenz (BNTS) und proximalen Phosphorylierungsstellen von Drosophila-Notch sind ebenfalls eingerahmt.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen der humanen Notch- und Delta-Gene und Aminosäuresequenzen von den Proteinen, die von diesen kodiert werden. Die Erfindung betrifft ferner Fragmente (welche hier als „adhäsive Fragmente" bezeichnet werden) von den Proteinen, die durch toporhythmische Gene kodiert werden, die homotypische oder heterotypische Bindung an toporhythmische Proteine oder adhäsive Fragmente davon vermitteln. Toporhythmische Gene, wie hier verwendet, sollen die Gene Notch, Delta und Serrate wie auch andere Mitglieder der Delta/Serrate-Familie, die z. B. durch die in dem Abschnitt 5.3 unten beschriebenen Verfahren identifiziert werden könnten, bedeuten.
Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen und Antikörper dagegen der Erfindung können für den Nachweis und die Quantifizierung von mRNA für humanes Notch und Delta und adhäsive Moleküle, um die Expression davon zu untersuchen, um humanes Notch und Delta und adhäsive Sequenzen herzustellen, bei der Untersuchung und Manipulation von Differenzierungsprozessen verwendet werden.
Für Klarheit der Offenbarung und nicht zur Einschränkung wird die detaillierte Beschreibung der Erfindung in die folgenden Unterabschnitte unterteilt:

(i) Identifizierung von und die Sequenzen von toporhythmischen Proteindomänen, die eine Bindung an toporhythmische Proteindomänen vermitteln;
(ii) Die Klonierung und Sequenzierung von humanem Notch und Delta;
(iii) Identifizierung von zusätzlichen Mitgliedern der Delta/Serrate-Familie;
(iv) Die Expression von toporhythmischen Genen;
(v) Identifizierung und Reinigung des exprimierten Genprodukts; und
(vi) Erzeugung von Antikörpern gegen toporhythmische Proteine und adhäsive Sequenzen davon.

5.1. IDENTIFIZIERUNG VON UND DIE SEQUENZEN VON TOPORHYTHMISCHEN PROTEINDOMÄNEN, DIE EINE BINDUNG AN TOPORHYTHMISCHE PROTEINDOMÄNEN VERMITTELN
Die Erfindung offenbart toporhythmische Proteinfragmente und Analoga oder Derivate davon, die eine homotypische oder heterotypische Bindung vermitteln (und dementsprechend hier als „adhäsiv" bezeichnet werden) und Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vorangegangenen in Zusammenhang stehen.
Das adhäsive Fragment von Notch ist jenes, welches den Abschnitt von Notch mit der höchsten Homologie zu ELR11 und 12, d. h. Aminosäurenummern 447 bis 527 (SEQ ID NO: 1) der Drosophila-Notch-Sequenz (siehe 8), umfasst. Das adhäsive Fragment von Delta, welches eine homotypische Bindung vermittelt, ist jenes, welches den Abschnitt von Delta mit der höchsten Homologie zu in etwa den Aminosäurenummern 32–230 der Drosophila-Delta-Sequenz (SEQ ID NO: 6) umfasst. Das adhäsive Fragment von Delta, welches eine Bindung an Notch vermittelt, ist jenes, welches den Abschnitt von Delta mit der höchsten Homologie zu in etwa den Aminosäurenummern 1–230 der Drosophila-Delta-Sequenz (SEQ ID NO: 6) umfasst. In einer speziellen Ausführungsform, welche ein adhäsives Fragment von Serrate betrifft, ist ein solches Fragment jenes, welches den Abschnitt von Serrate mit der höchsten Homologie zu in etwa den Aminosäurenummern 85–283 oder 79–282 der Drosophila-Serrate-Sequenz (siehe 10 (SEQ ID NO: 4) und 15 (SEQ ID NO: 9)) umfasst.
Die Nukleinsäuresequenzen, welche toporhythmische adhäsive Domänen kodieren, können isoliert werden aus Schweine-, Rinder-, Katzen-, Vogel-, Pferd- oder Hund- wie auch Prima ten-Quellen und einer jeglichen anderen Spezies, in welcher Homologe von bekannten toporhythmischen Genen [einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden Gene (mit der Veröffentlichung von Sequenzen in Klammern): Notch (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581), Delta (Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431–3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735; merke die Korrekturen an der Sequenz von Kopczynski et al., die in 13 dieser Anmeldung gefunden werden (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6)) und Serrate (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188–2201)] identifiziert werden können. Solche Sequenzen können durch Substitutionen, Hinzufügungen oder Deletionen, die funktionell äquivalente (adhäsive) Moleküle bereitstellen, verändert werden. Aufgrund der Degeneration von kodierenden Nukleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die adhäsiven Sequenzen kodieren, verwendet werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Nukleotidsequenzen, welche die Gesamtheit oder Abschnitte der Notch-, Delta- oder Serrate-Gene umfassen, die durch die Substitution von verschiedenen Codons, die einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren, wodurch eine stumme Änderung erzeugt wird, verändert sind. In ähnlicher Weise umfassen die adhäsiven Proteinfragmente oder Derivate davon der Erfindung jene, welche als eine primäre Aminosäuresequenz die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenz der adhäsiven Domänen einschließlich veränderter Sequenzen, in denen Reste innerhalb der Sequenz gegen funktionell äquivalente Aminosäurereste ausgetauscht sind, was zu einer stummen Veränderung führt, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispielsweise kann bzw. können eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure einer ähnlichen Polarität, die als ein funktionelles Äquivalent wirkt, ausgetauscht sein, was zu einer stummen Veränderung führt. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Beispielsweise umfassen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Adhäsive Fragmente von togorhythmischen Proteinen und potentielle Derivate, Analoga oder Peptide, welche mit adhäsiven togorhythmischen Proteinsequenzen in Zusammenhang stehen, können auf die gewünschte Bindungsaktivität z. B. durch die in vitro-Aggregationsassays, die in den Beispielen hier beschrieben werden, getestet werden. Adhäsive Derivate oder adhäsive Analoga von adhäsiven Fragmenten von togorhythmischen Proteinen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene Peptide, die zu den adhäsiven Fragmenten im Wesentlichen homolog sind oder deren kodierende Nukleinsäure in der Lage ist, mit der Nukleinsäuresequenz, welche die adhäsiven Fragmente kodiert, zu hybridisieren, und welche Peptide und Peptidanaloga eine positive Bindungsaktivität, z. B. wie in vitro durch einen Aggregationsassay, wie er z. B. in dem Abschnitt mit den Beispielen weiter unten beschrieben wird, getestet wird, aufweisen. Solche Derivate und Analoga werden mit ins Auge gefasst und liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Die mit den adhäsiven Proteinen in Zusammenhang stehenden Derivate, Analoga und Peptide der Erfindung können durch verschiedene Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu deren Herstellung führen, können auf der Gen- oder Proteinebene erfolgen. Beispielsweise kann die klonierte, ein adhäsives Protein kodierende Gensequenz durch eine jegliche von zahlreichen Strategien, die in diesem Fachgebiet bekannt sind (Maniatis, T., 1990. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), modifiziert werden. Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit einer oder mehreren Restriktionsendonuklease(n) gespalten werden, gefolgt von einer weiteren enzymatischen Modifizierung, sofern gewünscht, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, welches ein Derivat, Analog oder Peptid, welches mit einer adhäsiven Domäne in Zusammenhang steht, kodiert, sollte Sorgfalt darauf verwandt werden, sicherzustellen, dass das modifizierte Gen innerhalb desselben translationalen Leserasters wie das adhäsive Protein und von translationalen Stopsignalen in der Genregion, wo die gewünschte adhäsive Aktivität kodiert wird, ununterbrochen bleibt.
Zusätzlich kann die adhäsive Strukturen kodierende Nukleinsäuresequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören oder um Variationen in kodierenden Regionen zu erzeugen und/oder neue Restriktionsendonukleasestellen zu bilden oder um vorexistierende zu zerstören, um eine weitere in vitro-Modifizierung zu vereinfachen. Eine jegliche Technik zur Mutagenese, die in diesem Fachgebiet bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine ortsgerichtete in vitro-Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253, 6551), Verwendung von TAB^®-Linkern (Pharmacia) etc.
Manipulationen der adhäsiven Sequenz können auch auf der Proteinebene vorgenommen werden. Umfasst innerhalb des Umfangs der Erfindung sind toporhythmische Proteinfragmente, Analoga oder Derivate, die während oder nach der Translation, z. B. durch Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem Antikörpermolekül oder anderen zellulären Ligand u. s. w., unterschiedlich modifiziert werden. Eine jegliche von zahlreichen chemischen Modifizierungen kann durch bekannte Techniken ausgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf spezifische chemische Spaltung durch Bromcyan, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH₄; Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion; metabolische Synthese in Gegenwart von Tunicamycin u. s. w.
Zusätzlich können Analoga und Peptide, die mit adhäsiven Fragmenten in Zusammenhang stehen, chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise kann ein Peptid, welches einem Abschnitt eines toporhythmischen Proteins, welcher die gewünschte Aggregationsaktivität in vitro vermittelt, entspricht, durch Verwendung eines Peptidsynthetisiergeräts synthetisiert werden.
Eine spezielle Offenbarung der Erfindung betrifft Fragmente oder Derivate eines Delta-Proteins, die die Fähigkeit haben, an ein zweites Delta-Protein oder Fragment oder Derivat davon zu binden, aber nicht an Notch binden. Ein solches Binden oder Fehlen davon kann in vitro bestimmt werden, wie in Abschnitt 8 beschrieben. Als Beispiel, aber nicht als Einschränkung ist ein solches Delta-Derivat jenes, welches eine Insertion des Tetrapeptids Arg-Lys-Ile-Phe zwischen den Delta-Resten 197 und 198 des Drosophila-Proteins enthält.
5.2. DIE KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON HUMANEM NOTCH UND DELTA
Die Erfindung betrifft ferner die Aminosäuresequenzen von humanem Notch und humanem Delta und Fragmenten und Derivaten davon, die eine antigene Determinante umfassen (d. h. durch einen Antikörper erkannt werden können) oder die funktionell aktiv sind, wie auch Nukleinsäuresequenzen, die die Vorangegangenen kodieren. „Funktionell aktives" Material, wie hier verwendet, bezieht sich auf jenes Material, welches eine oder mehrere bekannte funktionelle Aktivitäten, die mit dem Volllängen-(Wildtyp)-Proteinprodukt assoziiert sind, zeigt, z. B. in dem Falle von Notch Bindung an Delta, Bindung an Serrate, Antigenität (Bindung an einen anti-Notch-Antikörper) u. s. w.
Die Erfindung offenbart Fragmente eines humanen Notch-Proteins, welches aus mindestens 40 Aminosäuren oder aus mindestens 77 Aminosäuren besteht. Die Proteine umfassen oder bestehen im Wesentlichen aus der intrazellulären Domäne, Transmembranregion, extrazellulären Domäne, cdc10-Region, Notch/lin-12-Wiederholungen oder den EGF-homologen Wiederholungen oder einer jeglichen Kombination der Vorangegangenen eines humanen Notch-Proteins. Fragmente oder Proteine, welche Fragmente umfassen, denen ein Teil oder die Gesamtheit der EGF-homologen Wiederholungen von humanem Notch fehlt, werden ebenfalls offenbart.
Die Erfindung betrifft die Nukleotidsequenzen und Untersequenzen von humanem Notch und humanem Delta, bestehend aus wenigstens 25 Nukleotiden, wenigstens 50 Nukleotiden oder wenigstens 121 Nukleotiden. Nukleinsäuren, die die oben beschriebenen Proteine und Proteinfragmente kodieren, werden ebenfalls offenbart wie auch Nukleinsäuren, die zu solchen Nuk leinsäuren komplementär und in der Lage sind, mit diesen zu hybridisieren. Eine solche komplementäre Sequenz kann komplementär sein zu einer humanen Notch-cDNA von wenigstens 25 Nukleotiden oder von wenigstens 121 Nukleotiden. Unter einem bevorzugte Aspekt betrifft die Erfindung cDNA-Sequenzen, welche humanes Notch oder einen Abschnitt davon kodieren. In einer speziellen Offenbarung der Erfindung betrifft die Erfindung die Nukleotidsequenz des humanen Notch-Gens oder cDNA, insbesondere umfassend jene Sequenzen, die in den 19, 20, 21 und/oder 22 (SEQ ID NO: 13 bis NO: 25) gezeigt sind oder in den Plasmiden hN3k, hN4k oder hN5k (siehe Abschnitt 9 unten) enthalten sind, und die kodierten Notch-Proteinsequenzen. Wie leicht ersichtlich ist, soll eine „Nukleinsäure, welche ein Fragment oder einen Abschnitt eines Notch-Proteins kodiert", wie hier verwendet, so aufgefasst werden, dass sie sich auf eine Nukleinsäure bezieht, welche nur das erwähnte Fragment oder den erwähnten Abschnitt des Notch-Proteins und nicht andere Abschnitte des Notch-Proteins kodiert.
Eine humane Notch-DNA-Sequenz kann durch das in Abschnitt 9 unten beschriebene Verfahren kloniert und sequenziert werden.
Es folgt ein bevorzugtes Verfahren zur Klonierung von humanem Delta, welches als ein besonders Beispiel, aber nicht zur Einschränkung aufgeführt wird:
Es wird eine humane Expressionsbibliothek durch Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, konstruiert. Beispielsweise wird humane mRNA isoliert, cDNA hergestellt und in einen Expressionsvektor (z. B. ein Bakteriophagen-Derivat) derart ligiert, dass sie in der Lage ist, durch die Wirtszelle, in welche sie dann eingeführt wird, exprimiert zu werden. Dann können verschiedene Screening-Assays verwendet werden, um eine Selektion auf das exprimierte humane Delta-Produkt vorzunehmen. Eine Selektion kann ausgeführt werden auf der Grundlage einer positiven Bindung an die adhäsive Domäne von humanem Notch (d. h. jenen Abschnitt von humanem Notch, der am stärksten homolog zu Drosophila-ELR11 und 12 (SEQ ID NO: 1) ist. Alternativ können anti-Delta-Antikörper für die Selektion verwendet werden.
Es kann eine PCR verwendet werden, um die gewünschte Sequenz in der Bibliothek vor der Selektion zu amplifizieren. Beispielsweise können Oligonukleotid-Primer, die einen Teil der adhäsiven Domänen, die durch ein Homolog des gewünschten Gens kodiert werden, repräsentieren, als Primer bei einer PCR verwendet werden.
Die obigen Verfahren sind nicht so gedacht, dass sie die folgende allgemeine Beschreibung von Verfahren, durch welche Klone von humanem Notch und Delta erhalten werden können, einschränken.
Eine jegliche humane Zelle kann potentiell als Nukleinsäurequelle für die molekulare Klonierung des Notch- und Delta-Gens dienen. Die DNA kann durch Standardverfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgehend von klonierter DNA (z. B. einer DNA-„Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung von genomischer DNA oder von Fragmenten davon erhalten oder aus der gewünschten humanen Zelle gereinigt werden. (Siehe beispielsweise Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Vereinigtes Königreich, Band I, II). Von genomischer DNA abgeleitete Klone können regulatorische DNA-Regionen und Intron-DNA-Regionen zusätzlich zu kodierenden Regionen enthalten; von cDNA abgeleitete Klone werden nur Exon-Sequenzen enthalten. Was auch immer die Quelle ist, das Gen sollte molekular in einen geeigneten Vektor für eine Propagation des Gens kloniert werden.
Bei der molekularen Klonierung des Gens ausgehend von genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physisch geschert werden, wie beispielsweise durch Beschallen. Die linearen DNA-Fragmente können dann durch Standardtechniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie, nach der Größe aufgetrennt werden.
Sind die DNA-Fragmente einmal erzeugt, kann die Identifizierung des speziellen DNA-Fragments, welches das gewünschte Gen enthält, auf verschiedene Weisen bewerkstelligt werden. Wenn beispielsweise eine Menge eines Abschnitts eines Notch- oder Delta- (von einer jeglichen Spezies)-Gens oder von dessen spezifischer RNA oder eines Fragments davon, z. B. die adhäsive Domäne, zur Verfügung steht und gereinigt und markiert werden kann, können die erzeugten DNA-Fragmente durch Nukleinsäurehybridisierung an die markierte Sonde gescreent werden (Genton, W., und Davis, R., 1977, Science 196, 180; Grunstein, M., und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 3961). Jene DNA-Fragmente mit substantieller Homologie zu der Sonde werden hybridisieren. Es ist auch möglich, das geeignete Fragment zu identifizieren durch Restriktionsenzymverdau(e) und Vergleich von Fragmentgrößen mit jenen, die entsprechend einer bekannten Restriktionskarte, wenn eine solche zur Verfügung steht, erwartet werden. Eine weitere Selektion kann ausgeführt werden auf der Grundlage der Eigenschaften des Gens. Alternativ kann das Vorhandensein des Gens nachgewiesen werden durch Assays, welche auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften von dessen exprimiertem Produkt basieren. Beispielsweise können cDNA-Klone oder DNA-Klone, die die korrekten mRNAs hybrid-selektieren, selektiert werden, die ein Protein produzieren, das z. B. eine ähnliche oder identische elektrophoretische Wanderung, ein ähnliches oder identisches Verhalten bei der isoelektrischen Fokussierung, ähnliche oder identische proteolytische Verdau-Karten, eine ähnliche oder identische in vitro-Aggregationsaktivität („Adhäsivität") oder ähnliche oder identische antigene Eigenschaften, wie sie für Notch oder Delta bekannt sind, aufweist. Wenn ein Antikörper gegen Notch oder Delta zur Verfügung steht, kann das Notch- oder Delta-Protein identifiziert werden durch Binden des markierten Antikörpers an die mutmaßlich Notch oder Delta synthetisierenden Klone in einer ELISA (Enzymimmunassay)-artigen Prozedur.
Das Notch- oder Delta-Gen kann auch durch mRNA-Selektion durch Nukleinsäurehybridisierung, gefolgt von einer in vitro-Translation, identifiziert werden. Bei dieser Vorgehensweise werden Fragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Notch- oder Delta-DNA von einer anderen Spezies (z. B. Drosophila) repräsentieren. Eine Immunpräzipitationsanalyse oder funktionelle Assays (z. B. Aggregationsfähigkeit in vitro; siehe Beispiele weiter unten) der in vitro-Translationsprodukte der isolierten Produkte der isolierten mRNAs identifizieren die mRNA und dementsprechend die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezifische mRNAs durch Adsorption von Polysomen, die aus Zellen isoliert worden sind, an immobilisierte Antikörper, die spezifisch gegen Notch- oder Delta-Protein gerichtet sind, selektiert werden. Eine radioaktiv markierte Notch- oder Delta-cDNA kann unter Verwendung der ausgewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann dann als eine Sonde verwendet werden, um die Notch- oder Delta-DNA-Fragmente unter anderen genomischen DNA-Fragmenten zu identifizieren.
Alternativen zu einem Isolieren der genomischen Notch- oder Delta-DNA umfassen, sind aber nicht beschränkt auf ein chemisches Synthetisieren der Gensequenz selbst ausgehend von einer bekannten Sequenz oder das Herstellen von cDNA gegen die mRNA, die das Notch- oder Delta-Gen kodiert. Beispielsweise kann RNA für eine cDNA-Klonierung des Notch- oder Delta-Gens aus Zellen, die Notch oder Delta exprimieren, isoliert werden. Andere Verfahren sind möglich und liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor inseriert werden. Es kann eine große Anzahl von Vektor-Wirt-Systemen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. Mögliche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Plasmide oder modifizierte Viren, aber das Vektorsystem muss mit der verwendeten Wirtszelle verträglich sein. Solche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Bakteriophagen, wie lambda-Derivate, oder Plasmide, wie pBR322 oder pUC-Plasmid-Derivate. Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise bewerkstelligt werden, indem das DNA-Fragment in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Enden aufweist, ligiert wird. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, die verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, in dem Klonierungsvektor nicht vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann eine jegliche gewünschte Stelle hergestellt werden, indem Nukleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Termini ligiert werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonukleotide, welche Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen kodieren, umfassen. In einem alternativen Verfahren können der gespaltene Vektor und das Notch- oder Delta-Gen durch Homopolymer-Tailing modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation u. s. w. eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
In einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen nach Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor in einem „shot gun"-Ansatz identifiziert und isoliert werden. Eine Anreicherung für das gewünschte Gen, beispielsweise durch Größenfraktionierung, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor vorgenommen werden.
Eine Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte Notch- oder Delta-Gen, -cDNA oder eine entsprechende synthetisierte DNA-Sequenz beinhalten, ermöglicht die Erzeugung einer Mehrzahl von Kopien des Gens. Dementsprechend kann das Gen in großen Mengen erhalten werden, indem Transformanten vermehrt werden, die rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten isoliert werden und, sofern notwendig, das inserierte Gen aus der isolierten rekombinanten DNA zurückgewonnen wird.
Die humanen Notch- und Delta-Sequenzen, die durch die Erfindung offenbart werden, umfassen jene Nukleotidsequenzen, welche im Wesentlichen die gleichen Aminosäuresequenzen kodieren, wie sie in humanem Notch und in humanem Delta gefunden werden, und jene kodierten Aminosäuresequenzen mit funktionell äquivalenten Aminosäuren, alles wie weiter oben in Abschnitt 5.1 für adhäsive Abschnitte von toporhythmischen Proteinen beschrieben.
5.3. IDENTIFIZIERUNG VON ZUSÄTZLICHEN MITGLIEDERN DER DELTA/SERRATE-FAMILIE
Eine rationale Suche nach zusätzlichen Mitgliedern der Delta/Serrate-Genfamilie kann ausgeführt werden, indem ein Ansatz verwendet wird, der einen Vorteil aus der Existenz der konservierten Abschnitte mit starker Homologie zwischen Serrate und Delta zieht (siehe 10, SEQ ID NO: 3 und NO: 4). Beispielsweise können zusätzliche Mitglieder dieser Genfamilie identifiziert werden, indem aus einer Diversität von Nukleinsäuresequenzen jene Sequenzen selektiert werden, die zu sowohl Serrate als auch Delta homolog sind (siehe 13 (SEQ ID NO: 5) und 15 (SEQ ID NO: 8)), und des Weiteren unter den selektierten Sequenzen jene identifiziert werden, die auch Nukleinsäuresequenzen, die zu Serrate und Delta nicht homolog sind, enthalten. Der Begriff „nicht homolog" kann so verstanden werden, dass er eine Region bedeutet, die wenigstens etwa 6 aneinander angrenzende Nukleotide enthält, wobei wenigstens etwa zwei Nukleotide sich von der Serrate- und Delta-Sequenz unterscheiden.
Beispielsweise offenbart die Erfindung das folgende Verfahren. Entsprechend zwei konservierten Segmenten zwischen Delta und Serrate, Delta AS 63–73 und Delta AS 195–206 (siehe 13, SEQ ID NO: 6), können Sätze von degenerierten Oligonukleotidsonden mit etwa 10–20 Nukleotiden synthetisiert werden, die alle der möglichen kodierenden Sequenzen für die Aminosäuren, die entweder in Delta oder Serrate für etwa drei bis sieben einander angrenzende Codons gefunden werden, repräsentieren. Oligonukleotide können entsprechend Abschnitten der vier hochgradig konservierten Regionen zwischen Delta und Serrate, gezeigt in 15 (SEQ ID NO: 8 und NO: 9), d. h. jenen, die durch Serrate AS 124–134, 149–158, 214–219 und 250–259 repräsentiert werden, erhalten werden. Die synthetischen Oligonukleotide können als Primer eingesetzt werden, um PCR-Sequenzen ausgehend von einer Quelle (RNA oder DNA) von potentiellem Interesse zu amplifizieren. (Eine PCR kann beispielsweise durch Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus-Thermocycler-Geräts und von Taq-Polymerase (Gene Amp^TM) ausgeführt werden). Diese könnte mRNA oder cDNA oder genomische DNA aus einer jeglichen eukaryotischen Spezies, die ein Polypeptid, welches mit Serrate und Delta eng verwandt ist, exprimieren könnte, umfassen. Indem die PCR-Reaktionen ausgeführt werden, kann es möglich sein, ein Gen oder Genprodukt nachzuweisen, welches ebenfalls die oben angegebenen Abschnitte von konservierter Sequenz zwischen Serrate und Delta aufweist. Wenn man wählt, mehrere unterschiedliche degenerierte Primer zu synthetisieren, kann es nach wie vor möglich sein, eine komplette Suche mit einer vernünftig kleinen Anzahl von PCR-Reaktionen auszuführen. Es ist auch möglich, die Stringenz von Hybridisierungsbedingungen, die beim Priming der PCR-Reaktionen verwendet werden, zu variieren, um höhere oder geringere Ausmaße von Nukleotidsequenzähnlichkeit zwischen dem unbekannten Gen und Serrate oder Delta zu ermöglichen. Wenn ein Abschnitt eines zuvor unbekannten Mitglieds der Serrate/Delta-Genfamilie erfolgreich amplifiziert wird, kann jener Abschnitt molekular kloniert und sequenziert und als eine Sonde eingesetzt werden, um eine vollständige cDNA oder einen genomischen Klon zu isolieren. Dies wird wiederum die Bestimmung der vollständigen Nukleotidsequenz des unbekannten Gens, die Analyse von dessen Expression und die Produktion von dessen Proteinprodukt für eine funktionelle Analyse erlau ben. Auf diese Weise könnten zusätzliche Gene, welche „adhäsive" Proteine kodieren, identifiziert werden.
Zusätzlich offenbart die Erfindung die Verwendung der Serrate/Delta-Sequenzhomologien bei der Gestaltung von neuen rekombinanten Molekülen, die Mitglieder der Serrate/Delta-Genfamilie sind, die aber möglicherweise in der Natur nicht vorkommen. Beispielsweise und nicht zur Einschränkung kann ein rekombinantes Molekül gemäß der Erfindung konstruiert werden, welches Abschnitte sowohl des Serrate- als auch des Delta-Gens umfasst. Ein solches Molekül könnte Eigenschaften zeigen, die sowohl mit Serrate als auch Delta assoziiert sind, und ein neues Profil von biologischen Aktivitäten, einschließlich Agonisten wie auch Antagonisten, porträtieren. Die Primärsequenz von Serrate und Delta kann auch verwendet werden, um die Tertiärstruktur der Moleküle unter Verwendung einer Computersimulation (Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 3824–3828) vorherzusagen; rekombinante chimäre Serrate/Delta-Gene könnten im Lichte von Korrelationen zwischen Tertiärstruktur und biologischer Funktion entworfen werden. In ähnlicher Weise könnten chimäre Gene, welche Abschnitte eines jeglichen oder von mehreren Mitgliedern der Familie von toporhythmischen Genen (z. B. Notch) umfassen, konstruiert werden.
5.4. DIE EXPRESSION VON TOPORHYTHMISCHEN GENEN
Die Nukleotidsequenz, welche ein adhäsives Fragment eines toporhythmischen Proteins, (vorzugsweise Notch, Serrate oder Delta) oder ein adhäsives Analog oder Derivat davon oder humanes Notch oder Delta oder ein funktionell aktives Fragment oder Derivat davon kodiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert werden, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten Protein kodierenden Sequenz enthält. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auch durch das native toporhythmische Gen und/oder dessen flankierende Regionen bereitgestellt werden. Es können verschiedene Wirt-Vektor-Systeme eingesetzt werden, um die Protein kodierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Säugetierzellsysteme, die mit Viren (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus u. s. w.) infiziert sind; Insektenzellsysteme, die mit Viren (z. B. Baculovirus) infiziert sind; Mikroorganismen, wie Hefe, welche Hefevektoren enthalten, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen, DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Abhängig von dem eingesetzten Wirt-Vektor-System kann ein jegliches einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Es kann der adhäsive Abschnitt des Notch-Gens, z. B. jener, welcher die EGF-artigen Wiederholungen 11 und 12 ko diert, exprimiert werden. Es kann der adhäsive Abschnitt des Delta-Gens, z. B. jener, welcher die Aminosäuren 1–230 kodiert, exprimiert werden. Es kann das humane Notch- oder humane Delta-Gen oder eine Sequenz, welche einen funktionell aktiven Abschnitt von humanem Notch oder Delta kodiert, exprimiert werden. Es kann der adhäsive Abschnitt des Serrate-Gens exprimiert werden.
Ein jegliches der Verfahren, die zuvor für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschrieben worden sind, kann verwendet werden, um Expressionsvektoren, die ein chimäres Gen bestehend aus geeigneten Transkriptions-/Translationskontrollsignalen und den Protein kodierenden Sequenzen enthalten, zu konstruieren. Diese Verfahren können in vitro-DNA-Rekombinations- und Synthesetechniken und in vivo-Rekombinanten (genetische Rekombination) umfassen. Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein toporhythmisches Protein oder Peptidfragment kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das toporhythmische Protein oder Peptid in einem Wirt, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression eines togorhythmischen Proteins durch ein jegliches Promotor/Enhancer-Element, das in diesem Fachgebiet bekannt ist, gesteuert werden. Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression von togorhythmischen Genen zu steuern, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290, 304–310), den Promotor, der in der 3' gelegenen langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkomvirus enthalten ist (Vamamoto et al., 1980, Cell 22, 787–797), den Herpes-Thymidinkinasepromotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296, 39–42); prokaryotische Expressionsvektoren, wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 21–25); siehe auch „Useful Proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242, 74–94; Pflanzenexpressionsvektoren, umfassend die Nopalinsynthetase-Promotorregion (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209–213) oder den Promotor der 35S-RNA des Blumenkohlmosaikvirus (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871) und den Promotor des photosynthetischen Enzyms Ribulosebiphosphatcarboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310, 115–120); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie den Gal 4-Promotor, den ADC (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, den PGK (Phosphoglycerolkinase)-Promotor, den alkalische Phosphatase-Promotor und die folgenden tierischen Transkriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren eingesetzt worden sind: die Elastase I-Gen-Kontrollregion, die in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38, 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7, 425–515); die Insulingen-Kontrollregion, die in pankreatischen Betazellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315, 115–122), die Immunglobulingen-Kontrollregion, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38, 647–658; Adames et al., 1985, Nature 318, 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1436–1444), die Maus-Mammatumorvirus-Kontrollregion, die in testikulären, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45, 485–495), die Albumingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1, 268–276), die alpha-Fetoproteingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235, 53–58); die alpha-1-Antitrypsingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1, 161–171), die Betaglobingen-Kontrollregion, die in Knochenmarkszellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315, 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46, 89–94; die basisches Myelinprotein-Gen-Kontrollregion, die in Oligodendrozytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48, 703–712); die Kontrollregion des Gens der leichten Myosinkette 2, die in Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314, 283–286), und die Kontrollregion des Gonadotropin-releasing-Hormon-Gens, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234, 1372–1378).
Expressionsvektoren, welche toporhythmische Gen-Inserts enthalten, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) Nukleinsäurehybridisierung, (b) Vorhandensein oder Fehlen von „Marker"-genfunktionen und (c) Expression von inserierten Sequenzen. In dem ersten Ansatz kann das Vorhandensein eines fremden Gens, das in einen Expressionsvektor inseriert ist, durch Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden, welche Sequenzen, die zu einem inserierten toporhythmischen Gen homolog sind, umfassen, nachgewiesen werden. In dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirt-System identifiziert und selektiert werden basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten „Marker"-genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus u. s. w.), die durch die Insertion von fremden Genen in den Vektor bewirkt werden. Wenn beispielsweise das toporhythmische Gen innerhalb der Markergensequenz des Vektors inseriert ist, können Rekombinanten, welche das toporhythmische Insert enthalten, identifiziert werden durch das Fehlen der Markergenfunktion. In dem dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden, indem das Produkt des fremden Gens, das durch die Rekombinante exprimiert wird, bestimmt wird. Solche Assays können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des toporhythmischen Gen- Produkts in in vitro-Assaysystemen, z. B. Aggregationsfähigkeit (adhäsive Fähigkeit) (siehe Abschnitte 6–8 unten), basieren.
Ist einmal ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert, können mehrere Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden, um es zu vermehren. Sind einmal ein geeignetes Wirtssystem und Vermehrungsbedingungen etabliert, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in Mengen hergestellt werden. Wie zuvor erläutert, umfassen die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden Vektoren oder deren Derivate: humane oder tierische Viren, wie Vacciniavirus oder Adenovirus; Insektenviren, wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagen-Vektoren (z. B. lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige wenige zu benennen.
Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm ausgewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in der gewünschten speziellen Weise prozessiert. Eine Expression ausgehend von bestimmten Promotoren kann in Gegenwart von bestimmten Induktionsmitteln erhöht sein; dementsprechend kann die Expression des gentechnologisch modifizierten toporhythmischen Proteins kontrolliert werden. Darüber hinaus weisen verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationale Prozessierung und Modifizierung (z. B. Glycosylierung, Spaltung) von Proteinen auf. Es können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die gewünschte Modifizierung und Prozessierung des fremden Proteins, das exprimiert wird, sicherzustellen. Beispielsweise kann eine Expression in einem bakteriellen System verwendet werden, um ein unglycosyliertes Kernproteinprodukt herzustellen. Eine Expression in Hefe wird ein glycosyliertes Produkt produzieren. Eine Expression in Säugetierzellen kann verwendet werden, um eine „native" Glycosylierung eines heterologen toporhythmischen Säugetierproteins sicherzustellen. Darüber hinaus können verschiedene Vektor/Wirt-Expressionssysteme Prozessierungsreaktionen, wie proteolytische Spaltungen, in unterschiedlichen Ausmaßen bewirken.
Das adhäsive toporhythmische Protein, Fragment, Analog oder Derivat kann als eine Fusion oder ein chimäres Proteinprodukt (umfassend das Protein, Fragment, Analog oder Derivat verknüpft mit einer heterologen Proteinsequenz) exprimiert werden. Ein solches chimäres Produkt kann hergestellt werden, indem die geeigneten Nukleinsäuresequenzen, welche die gewünschten Aminosäuresequenzen kodieren, an einander in dem korrekten Leseraster ligiert werden durch Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, und das chimäre Produkt exprimiert wird durch Verfahren, die in diesem Fachgebiet allgemein bekannt sind. Alternativ kann ein sol ches chimäres Produkt durch Proteinsynthesetechniken, z. B. durch Verwendung eines Peptidsynthetisiergeräts, hergestellt werden.
Sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen können kloniert und exprimiert werden.
Eine humane Notch-cDNA-Sequenz kann in die Chromosomen integriert und exprimiert werden. Es können homologe Rekombinationsverfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden.
5.4.1. IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG DES EXPRIMIERTEN GENPRODUKTS
Ist einmal eine Rekombinante, die die toporhythmische Gensequenz exprimiert, identifiziert, kann das Genprodukt analysiert werden. Dies kann erzielt werden durch Assays, die auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Produkts basieren, einschließlich einer radioaktiven Markierung des Produkts, gefolgt von einer Analyse durch Gelelektrophorese.
Ist einmal das toporhythmische Protein identifiziert, kann es isoliert und gereinigt werden durch Standardverfahren, einschließlich Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und auf einer Größenunterscheidung beruhende Säulenchromatographie), Zentrifugation, differenzielle Löslichkeit oder durch eine jegliche andere Standardtechnik für die Reinigung von Proteinen. Die funktionellen Eigenschaften können unter Verwendung eines jeglichen geeigneten Assays, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Aggregationsassays (siehe Abschnitte 6–8), ausgewertet werden.
5.5. ERZEUGUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN TOPORHYTHMISCHE PROTEINE UND ADHÄSIVE SEQUENZEN DAVON
Fragmente von toporhythmischen Proteine oder Analoga oder Derivate davon, die eine homotypische oder heterotypische Bindung vermitteln, oder humane Notch- oder humane Delta-Proteine oder Fragmente davon können als ein Immunogen verwendet werden, um anti-toporhythmisches Protein-Antikörper zu erzeugen. Solche Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Es können Antikörper, die für die EGF-artigen Wiederholungen 11 und 12 von Notch spezifisch sind, hergestellt werden. Es können Antikörper, die mit dem „adhäsiven Abschnitt" von Delta reagieren, erzeugt werden. Ein Beispiel für solche Antikörper kann eine Aggregation in einem in vitro-Assay verhindern. Es können Antikörper, die für humanes Notch spezifisch sind, hergestellt werden.
Verschiedene Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, können für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen ein toporhythmisches Protein oder Peptid verwendet werden. Es können polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen ein Epitop des humanen Notch- Proteins, welches durch eine in 19, 20, 21 oder 22 (SEQ ID NO: 13 bis NO: 25) aufgeführte Sequenz oder eine Untersequenz davon kodiert wird, erhalten werden. Für die Herstellung von Antikörper können verschiedene Wirtstiere durch Injektion des nativen toporhythmischen Proteins oder einer synthetischen Version oder eines Fragments davon immunisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten u. s. w. Es können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken, abhängig von der Wirtsspezies und einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freund-Adjuvans (vollständig oder unvollständig), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronicpolyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und potentiell nützliche humane Adjuvantien, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen eine toporhythmische Proteinsequenz gerichtet sind, kann eine jegliche Technik, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht, verwendet werden. Beispielsweise die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Köhler und Milstein entwickelt worden ist (1975, Nature 256, 495–497), wie auch die Triom-Technik, die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72) und die EBV-Hybridom-Technik, um humane monoklonale Antikörper herzustellen (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96).
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, sind aber nicht beschränkt auf: das F(ab')₂-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfid-Brücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
Bei der Herstellung von Antikörpern kann ein Screening auf den gewünschten Antikörper durch Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, z. B. ELISA (Enzymimmunoassay), bewerkstelligt werden. Um beispielsweise Antikörper, die die adhäsive Domäne eines toporhythmischen Proteins erkennen, zu selektieren, kann man erzeugte Hybridome auf ein Produkt, das an ein Proteinfragment, welches eine solche Domäne enthält, bindet, testen. Für eine Selektion eines für humanes Notch spezifischen Antikörpers kann man eine Selektion auf der Grundlage einer positiven Bindung an humanes Notch und eines Fehlens einer Bindung an Drosophila-Notch vornehmen.
Die vorangegangenen Antikörper können in Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, welche die Lokalisierung und Aktivität der Proteinsequenzen der Erfindung betreffen, verwendet werden. Beispielsweise können verschiedene Immunoassays, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf kompetitive und nicht-kompetitive Assaysysteme unter Verwendung von Techniken, wie Radioimmunoassays, ELISA (Enzymimmunoassay), „Sandwich"-Immunoassays, Präzipitin-(Präzipitations-)reaktionen, Geldiffusionspräzipitationsreaktionen, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays, fluoreszierende Immunoassays, Protein A-Immunoassays und Immunelektrophoreseassays, um nur einige wenige zu benennen.
5.6. ABGABE VON MITTELN IN NOTCH-EXPRIMIERENDE ZELLEN
Die Erfindung offenbart auch Verfahren zur Abgabe von Mitteln in Notch exprimierende Zellen. Wie in Abschnitt 8 weiter unten diskutiert werden wird, scheint Delta-Protein nach einem Binden an ein Notch-Protein an der Oberfläche einer Notch exprimierenden Zellen in die Notch exprimierende Zelle aufgenommen zu werden. Die Erfindung offenbart dementsprechend eine Abgabe von Mitteln in eine Notch exprimierende Zelle durch Konjugation eines Mittels an ein Delta-Protein oder ein adhäsives Fragment oder Derivat davon, welches in der Lage ist, an Notch zu binden, und Exponieren einer Notch exprimierenden Zelle gegenüber dem Konjugat, so dass das Konjugat durch die Zelle aufgenommen wird. Das konjugierte Mittel kann eine Markierung oder ein biologisch aktives Mittel sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Das biologisch aktive Mittel kann ein therapeutisches Mittel, ein Toxin, ein Chemotherapeutikum, ein Wachstumsfaktor, ein Enzym, ein Hormon, ein Arzneimittel, eine Nukleinsäure (z. B. Antisinn-DNA oder -RNA) u. s. w. sein. Die Markierung kann ein Bildgebungsmittel sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schwermetall-Kontrastmittel für eine Röntgenbildgebung, Kernspinresonanztomographie-Bildgebungsmittel und radioaktive Nuklide (d. h. Isotope) für eine auf Radioaktivität beruhende Bildgebung. Unter einem bevorzugten Aspekt wird das Mittel an eine Stelle in der aminoterminalen Hälfte des Delta-Moleküls konjugiert.
Das Delta-Mittel-Konjugat kann an die Notch exprimierende Zelle abgegeben werden, indem die Notch exprimierende Zelle gegenüber Zellen, welche das Delta-Mittel-Konjugat exprimieren, exponiert wird, oder die Notch exprimierende Zelle gegenüber dem Delta-Mittel-Konjugat in einer Lösung, Suspension oder einem anderen Träger exponiert wird. Wenn eine Abgabe in vivo erfolgt, kann das Delta-Mittel-Konjugat in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu umfassen. Der pharmazeutisch annehmbare Träger kann Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Koch salzlösung u. s. w. umfassen. Das Delta-Mittel-Konjugat kann als eine Flüssigkeit, Tablette, Pille, ein Pulver, in einer Form für eine langsame Freisetzung, zu einem Liposom u. s. w. formuliert werden und kann oral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal, um nur einige wenige Routen zu benennen, verabreicht werden, wobei die bevorzugte Wahl leicht basierend auf den Fachkenntnissen des Fachmanns auf diesem Gebiet getroffen wird.
6. MOLEKULARE WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN DEN PROTEINPRODUKTEN DER NEUROGENEN GENORTE NOTCH UND DELTA, ZWEI EGF-HOMOLOGEN GENEN IN DROSOPHILA
Um die Möglichkeit einer intermolekularen Assoziation zwischen den Produkten der Notch- und Delta-Gene zu untersuchen, untersuchten wir die Wirkungen von deren Expression auf eine Aggregation in Drosophila-Schneider 2 (S2)-Zellen (Fehon et al., 1990, Cell 61, 523–534). Wir präsentieren hier einen direkten Beweis für intermolekulare Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta und beschreiben ein Assaysystem, das beim Aufschlüsseln der Komponenten dieser Wechselwirkung verwendet werden wird. Wir zeigen, dass normalerweise nicht-adhäsive kultivierte Drosophila-S2-Zellen, die Notch exprimieren, spezifisch an Zellen, die Delta exprimieren, binden und dass diese Aggregation Calcium-abhängig ist. Obwohl darüber hinaus Zellen, die Notch exprimieren, nicht aneinander binden, binden Zellen, die Delta exprimieren, sehr wohl aneinander, was nahelegt, dass Notch und Delta um eine Bindung an Delta an der Zelloberfläche kompetitieren können. Wir präsentieren auch einen Beweis, der anzeigt, dass Notch und Delta Detergentien-lösliche Komplexe sowohl in kultivierten Zellen als auch embryonalen Zellen bilden, was nahelegt, dass Notch und Delta direkt auf der molekularen Ebene in vitro und in vivo Wechselwirken. Unsere Analysen legen nahe, dass Notch- und Delta-Proteine an der Zelloberfläche über ihre extrazellulären Domänen Wechselwirken.
Einige der nachfolgenden Beispiele offenbaren Gegenstände, die aus dem Umfang der Ansprüche herausfallen, und werden hier als Referenzbeispiele offenbart.
6.1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN
6.1.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE
Für das Notch-Expressionskonstrukt wurde das 6 kb-HpaI-Fragment von dem 5'-Ende der kodierenden Notch-Sequenz in MgIIa (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337–348) in den Metallothioneinpromotor-Vektor pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043–1061) Blunt-End-ligiert, nachdem der Vektor mit EcoRI geschnitten worden war und die Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt worden waren (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)). Es wurde eine einzelne Transformante, die unkorrekt orientiert war, isoliert. DNA aus dieser Transformante wurde dann mit SacI verdaut und ein resultierendes 3 kb-Fragment wurde isoliert, das das 5'-Ende der kodierenden Notch-Sequenz fusioniert an den Polylinker aus pRmHa-3 enthielt. Dieses Fragment wurde dann in die SacI-Stelle von pRmHa-3 in der korrekten Orientierung ligiert. DNA aus diesem Konstrukt wurde mit KpnI und XbaI verdaut, um den größten Teil der Notch-Sequenz und die Gesamtheit des Adh-Polyadenylierungssignals zu entfernen und an ein 11 kb-KpnI-XbaI-Fragment aus MgIIa, welches den Rest der kodierenden Notch-Sequenz und 3'-Sequenzen, die für die Polyadenylierung erforderlich sind, enthielt, ligiert. In dem resultierenden Konstrukt, welches als pMtNMg bezeichnet wurde, ist der Metallothioneinpromotor in pRmHa-3 an Notch-Sequenzen beginnend 20 Nukleotide strangaufwärts von der Translationsstartstelle fusioniert.
Für das extrazelluläre Notch-Konstrukt (ECN1) wurde das CosP479BE-Notch-Cosmid (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337–348), das alle genomischen Notch-Sequenzen, die für eine normale Notch-Funktion in vivo erforderlich sind, enthält, partiell mit AatII verdaut. Fragmentenden wurden unter Verwendung der Exonuklease-Aktivität von T4-DNA-Polymerase (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)) stumpf gemacht und die Fragmente wurden dann erneut komplett mit StuI verdaut. Die resultierenden Fragmente wurden in einem Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur (SeaPlaque, FMC BioProducts) aufgetrennt und das größte Fragment wurde herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann an sich selbst Blunt-End-ligiert. Dies führte zu einer internen Deletion der kodierenden Notch-Sequenzen von Aminosäure 1790 bis 2625 einschließlich (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581) und einer vorhergesagten Rasterverschiebung, die einen neuen 59 Aminosäuren umfassenden Carboxylterminus erzeugt. (Die ligierte Verbindung von diesem Konstrukt ist nicht durch Sequenzieren überprüft worden).
Für das Delta-Expressionskonstrukt wurde die Dl1-cDNA (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735), die die vollständige Kodierungskapazität für Delta umfasst, in die EcoRI-Stelle von pRmHa-3 inseriert. Dieses Konstrukt wurde als pMTDl1 bezeichnet.
6.1.2. ANTIKÖRPERHERSTELLUNG
Die Hybridomzelllinie C17.9C6 wurde erhalten von einer Maus, die mit einem Fusionsprotein basierend auf einem 2,1 kb-SalI-HindIII-Fragment, welches kodierende Sequenzen für den größten Teil der intrazellulären Domäne von Notch (Aminosäuren 1791–2504; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581) umfasst, immunisiert worden war. Das Fragment wurde in pUR289 (Ruther und Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791–1794) subkloniert und dann in den pATH 1-Expressionsvektor (Dieckmann und Tzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1513–1520) als ein BglII-HindIII-Fragment transferiert. Lösliches Fusionsprotein wurde exprimiert, durch 25% (NH₄)₂SO₄ präzipitiert, in 6 M Harnstoff resuspendiert und durch präparative isoelektrische Fokussierung unter Verwendung eines Rotofor (Bio-Rad) (für Einzelheiten siehe Fehon, 1989, Rotofor Review No. 7, Bulletin 1518, Richmond, Kalifornien: Bio-Rad Laboratories) gereinigt.
Polyklonale Mäuse-Antiseren wurden gegen die extrazelluläre Domäne von Notch unter Verwendung von vier BstY1-Fragmenten von 0,8 kb (Aminosäuren 237–501: Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581), 1,1 kb (Aminosäuren 501–868), 0,99 kb (Aminosäuren 868–1200) und 1,4 kb (Aminosäuren 1465–1935) Länge, die sich von der fünften EGF-artigen Wiederholung durch die Transmembrandomäne hindurch erstreckten, welche einzeln im Raster in den geeigneten pGEX-Expressionsvektor (Smith und Johnson, 1988, Gene 67, 31–40) inseriert worden waren, erzeugt. Fusionsproteine wurden an Glutathion-Agarose-Körnchen (SIGMA) gereinigt. Mäuse- und Ratten-Antiseren wurden mit 50% (NH₄)₂SO₄ präzipitiert und in PBS (150 mM NaCl, 14 mM Na₂HPO₄, 6 mM NaH₂PO₄) mit 0,02% NaN₃ resuspendiert.
Die Hybridomzelllinie 201 wurde erhalten von einer Maus, die mit einem Fusionsprotein basierend auf einem 0,54 kb-ClaI-Fragment, welches kodierende Sequenzen aus der extrazellulären Domäne von Delta umfasst (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735), subkloniert in die ClaI-Stelle innerhalb des lacZ-Gens von pUR 288 (Ruther und Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791–1794), immunisiert worden war. Dieses Fragment umfasst Sequenzen, die sich von der vierten bis zu der neunten EGF-artigen Wiederholung in Delta (Aminosäuren 350–529) erstrecken. Fusionsprotein wurde hergestellt durch die Isolierung von Einschlusskörpern (Gilmer et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2152–2156); Einschlusskörper wurden vor einer Verwendung bei der Immunisierung in Harnstoff solubilisiert (Carroll und Laughon, 1987, in DNA Cloning, Band III, D. M. Glover, Hrsg., (Oxford: IRL Press), S. 89–111).
Polyklonale Ratten-Antiseren wurden nach einer Immunisierung mit Antigen, das aus dem gleichen Fusionsproteinkonstrukt abgeleitet worden war, erhalten. In diesem Falle wurde Fusionsprotein hergestellt durch Lyse von IPTG-induzierten Zellen in SDS-Laemmli-Puffer (Carroll und Laughon, 1987, in DNA Cloning, Band III, D. M. Glover, Hrsg., (Oxford: IRL Press), S. 89–111), Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE, Herausschneiden der geeigneten Bande aus dem Gel und Elektroelution von Antigen aus dem Gelscheibchen für eine Verwendung bei der Immunisierung (Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)).
6.1.3. ZELLKULTUR UND TRANSFEKTION
Die S2-Zelllinie (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353–365) wurde in M3-Medium (hergestellt von Hazleton Co.), ergänzt mit 2,5 mg/ml Bacto-Pepton (Difco), 1 mg/ml TC Veastolate (Difco), 11% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone) und 100 E/ml Penicillin-100 μg/ml Streptomycin-0,25 μg/ml Fungizone (Hazleton), kultiviert. Zellen, die sich in der log-Phase mit einer Konzentration von ~ 2 × 10⁶ Zellen/ml vermehrten, wurden mit 20 μg DNA-Calciumphosphat-Copräzipitat in 1 ml pro 5 ml Kultur transfiziert, wie zuvor beschrieben (Wigler et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1373–1376) mit der Ausnahme, dass BES-Puffer (SIGMA) anstelle von HEPES-Puffer verwendet wurde (Chen und Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745–2752). Nach 16–18 h wurden die Zellen in konische Zentrifugenröhrchen transferiert, in einer klinischen Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit 30 s pelletiert, einmal mit ¼ Volumen frischem komplettem Medium gespült, in ihrem ursprünglichen Volumen von komplettem Medium resuspendiert und in den ursprünglichen Kolben zurückgegeben. Dann ließ man transfizierte Zellen sich 24 h vor der Induktion erholen.
6.1.4. AGGREGATIONSASSAYS
Eine Expression von Notch und Delta-Metallothionein-Konstrukten wurde durch die Zugabe von CuSO₄ bis zu einer Konzentration von 0,7 mM induziert. Zellen, die mit dem ECN1-Konstrukt transfiziert worden waren, wurden auf ähnliche Weise behandelt. Es wurden zwei Arten von Aggregationsassays verwendet. In dem ersten Assay wurde eine Gesamtmenge von 3 ml von Zellen (5–10 × 10⁶ Zellen/ml) in einen 25 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit 40–50 Upm auf einem Rundschüttler 24–48 h bei Raumtemperatur rotiert. Für diese Experimente wurden Zellen 1–4 h, nachdem die Induktion begonnen hatte, gemischt und die Induktion wurde während des gesamten Aggregationszeitraums fortgesetzt. In dem zweiten Assay wurden ~ 0,6 ml Zellen in ein 0,6 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß (wobei eine kleine Blase zurückblieb) nach einer Induktion über Nacht (12–16 h) bei Raumtemperatur gegeben und 1–2 h bei 4°C sanft geschwenkt. Die Antikörper-Inhibitions- und Ca²⁺-Abhängigkeitsexperimente wurden unter Verwendung des letztgenannten Assays ausgeführt. Für Ca²⁺-Abhängigkeitsexperimente wurden Zellen zuerst gesammelt und in „balanced saline solution" (BSS) mit 11% FCS (BSS-FCS; FCS wurde gegen 0,9% NaCl, 5 mM Tris [pH 7,5] dialysiert) oder in Ca²⁺-freiem BSS-FCS, enthaltend 10 mM EGTA (Snow et al., 1989, Cell 59, 313–323), gespült und dann in dem gleichen Medium zu dem ursprünglichen Volumen resuspendiert. Für die Antikörper-Inhibitionsexperimente wurden Notch-transfizierte Zellen gesammelt und in M3-Medium gespült und dann vor einer Aggregation in M3-Medium 1 h bei 4°C mit einer 1:250-Verdünnung von Immun- oder Vorimmunseren von jeder der vier Mäuse, die mit Fusionsproteinen, enthaltend Abschnitte aus der extrazellulären Domäne von Notch, immunisiert worden waren (siehe Antikörperherstellung weiter oben), behandelt.
6.1.5. IMMUNFLUORESZENZ
Zellen wurden durch Zentrifugation (3000 Upm für 20 s in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge) gesammelt und in 0,6 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit 0,5 ml frisch hergestelltem 2%-igem Paraformaldehyd in PBS 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Fixieren wurden Zellen durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in PBS gespült und 1 h mittels primärem Antikörper in PBS mit 0,1% Saponin (SIGMA) und 1% normalem Ziegenserum (Pocono Rabbit Farm, Canadensis, PA) angefärbt. Monoklonale Antikörper-Überstände wurden 1:10 verdünnt und Mäuse- oder Rattenseren wurden für diesen Schritt 1:1000 verdünnt. Zellen wurden dann einmal in PBS gespült und 1 h mittels spezifischer sekundärer Antikörper (Doppel-Markierungs-Qualität, Ziege-anti-Maus und Ziege-anti-Ratte, Jackson Immunoresearch) in PBS-Saponin-normalem Ziegenserum angefärbt. Nach dieser Inkubation wurden Zellen zweimal mit PBS gespült und auf Objektträger in 90% Glycerol, 10% 1 M Tris (pH 8,0) und 0,5% n-Propylgallat, aufgebracht. Zellen wurden unter Auflichtfluoreszenz an einem Leitz Orthoplan 2-Mikroskop betrachtet.
Konfokale Mikrophotographien wurden unter Verwendung des Bio-Rad MRC 500-Systems, verbunden mit einem zusammengesetzten Zeiss-Axiovert-Mikroskop, aufgenommen. Bilder wurden unter Verwendung der BHS- und GHS-Filtersätze gesammelt, unter Verwendung des ALIGN-Programms gegeneinander ausgerichtet und unter Verwendung von MERGE gemergt. Durchschlagen von Fluoreszenz von dem grünen in den roten Kanal wurde unter Verwendung des BLEED-Programms reduziert (alle Software bereitgestellt von Bio-Rad). Photographien wurden direkt von dem Computermonitor unter Verwendung eines Kodak Ektar 125-Films erhalten.
6.1.6. ZELLLYSATE, IMMUNPRÄZIPITATIONEN UND WESTERN-BLOTS
Nicht-denaturierende Detergenslysate von Gewebekultur und Wildtyp-Canton-S-Embryos wurden auf Eis in ~ 10 Zell-Volumen von Lysepuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 8,0], 0,5% NP-40, 0,5% Desoxycholat, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂) mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Diisopropylfluorphosphat, 1:2500 verdünnt, als Proteaseinhibitoren hergestellt. Lysate wurden nacheinander unter Verwendung von 18G-, 21G und 25G-Nadeln, angefügt an 1 cm³-Tuberkulin-Spritzen, einer Trituration unterzogen und dann bei voller Ge schwindigkeit in einer Mikrofuge 10 min bei 4°C zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Eine Immunpräzipitation wurde ausgeführt durch Zugeben von ~ 1 μg Antikörper (1–2 μl polyklonales Antiserum) zu 250–500 μl Zelllysat und Inkubieren für 1 h bei 4°C unter Bewegung. Zu dieser Mischung wurden 15 μg Ziege-anti-Maus-Antikörper (Jackson Immunoresearch; diese Antikörper erkennen sowohl Maus- als auch Ratten-IgG) zugegeben und 1 h bei 4°C unter Bewegung inkubieren gelassen. Dem folgte die Zugabe von 100 μl fixierten Staphylococcus aureus (Staph A)-Bakterien (Zysorbin, Zymed; resuspendiert gemäß den Anweisungen des Herstellers), die gesammelt, fünfmal in Lysepuffer gewaschen und eine weitere Stunde inkubiert worden waren. Staph A-Antikörper-Komplexe wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und dreimal in Lysepuffer gewaschen, gefolgt von zwei 15 min-Wäschen in Lysepuffer. Nach Transferieren in ein neues Röhrchen wurde präzipitiertes Material in 50 μl SDS-PAGE-Probenpuffer suspendiert, unverzüglich 10 min gekocht, auf 3%–15%-Gradientengelen aufgetrennt, auf Nitrocellulose geblottet und unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern und HRP-konjugierten sekundären Ziege-anti-Maus-Antikörpern detektiert, wie zuvor beschrieben (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427–2440). Für gesamtes zelluläres Protein-Proben, die auf Western-Blots verwendet wurden (2), wurden Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 Zellvolumen Probenpuffer, der 1 mM PMSF enthielt, lysiert und unverzüglich gekocht.
6.2. ERGEBNISSE
6.2.1. DIE EXPRESSION VON NOTCH UND DELTA IN KULTIVIERTEN ZELLEN
Um Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta nachzuweisen, untersuchten wir das Verhalten von Zellen, welche diese Proteine auf ihren Oberflächen exprimieren, unter Verwendung eines Aggregationsassays. Wir wählten die S2-Zelllinie (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353–365) für diese Untersuchungen aus mehreren Gründen. Erstens sind diese Zellen relativ nichtadhäsiv, vermehren sich in Suspension und sind zuvor in einem ähnlichen Assay verwendet worden, um Fasciclin III-Funktion zu untersuchen (Snow et al., 1989, Cell 59, 313–323). Zweitens sind sie leicht transfizierbar und es steht ein induzierbarer Metallothioneinpromotor-Vektor, der für die Expression von exogenen Genen in kultivierten Drosophila-Zellen entwickelt worden ist, zur Verfügung (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043–1061). Drittens exprimieren S2-Zellen eine aberrante Notch-mRNA und kein detektierbares Notch aufgrund einer Umlagerung des 5'-Endes der kodierenden Notch-Sequenz (siehe unten). Diese Zellen exprimieren auch kein detektierbares Delta (siehe unten).
Schematische Zeichnungen der verwendeten Konstrukte sind in 1 gezeigt (siehe Experimentelle Vorgehensweisen, Abschnitt 6.1, für Einzelheiten). Um Notch in kultivierten Zellen zu exprimieren, wurde das Notch-Minigen MG11a, beschrieben in Ramos et al. (1989, Genetics 123, 337–348) in den Metallothioneinpromotor-Vektor pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043–1061) inseriert. Das Delta-Expressionskonstrukt wurde hergestellt, indem Dl1-cDNA, die die vollständige kodierende Sequenz für Delta aus dem hauptsächlichen embryonalen Delta-Transkript enthält (5.4Z; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735), in den gleichen Vektor inseriert wurde. Ein drittes Konstrukt, welches als ECN1 für „extrazelluläres Notch 1" bezeichnet wurde, enthält die 5'-Notch-Promotorregion und das 3'-Notch-Polyadenylierungssignal zusammen mit kodierenden Sequenzen für die extrazellulären und Transmembranregionen des Notch-Gens aus genomischen Sequenzen, ihm fehlen aber kodierende Sequenzen für 835 Aminosäuren der 4000 Aminosäuren langen intrazellulären Domäne. Zusätzlich sind aufgrund einer vorhergesagten Rasterverschiebung die restlichen 78 carboxyterminalen Aminosäurereste durch einen neuen 59 Aminosäuren langen carboxyterminalen Schwanz ersetzt (siehe Experimentelle Vorgehensweisen).
Für alle der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Experimente wurden Expressionskonstrukte durch Transfektion in S2-Zellen eingeschleust und vorübergehend, anstelle in stabilen Transformanten, exprimiert. Exprimierende Zellen machten typischerweise 1% bis 5% der gesamten Zellpopulation aus, wie anhand von Immunfluoreszenzanfärbung beurteilt wurde (Daten nicht gezeigt). Ein Western-Blot von Proteinen, die nach einer Transfektion exprimiert wurden, ist in 2 gezeigt. Nicht-transfizierte Zellen exprimieren keine nachweisbaren Konzentrationen von Notch oder Delta. Jedoch sind nach einer Transfektion Proteine der vorhergesagten offensichtlichen Molekulargewichte unter Verwendung von monoklonalen Antikörper, die für jedes dieser Proteine jeweils spezifisch sind, leicht nachweisbar. In dem Falle von Notch waren in transfizierten Zellen unterhalb des ~ 300 kD-Volllängenprodukts mehrere Banden erkennbar. Wir wissen noch nicht, ob diese Banden einen Abbau von Notch während der Probenvorbereitung oder vielleicht Synthese- oder Prozessierungszwischenstufen von Notch, die innerhalb von Zellen vorhanden sind, darstellen, aber wir weisen sie konsistent in Proben aus transfizierten Zellen und aus Embryos nach. Zusätzlich führten wir eine Immunfluoreszenzanfärbung von lebenden transfizierten Zellen mit für die extrazellulären Domänen von jedem Protein spezifischen Antikörpern aus, um auf eine Zelloberflächenexpression von diesen Proteinen zu testen. In jedem Falle fanden wir eine Oberflächenanfärbung, wie für ein Oberflächenantigen erwartet. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse klar, dass die Notch- und Delta-Konstrukte eine Expression von Proteinen der erwarteten Größen und subzellulären Lokalisierung unterstützen.
6.2.2. ZELLEN, DIE NOTCH UND DELTA EXPRIMIEREN, AGGREGIEREN
Um die Vorhersage, dass Notch und Delta Wechselwirken, zu testen, entwarfen wir einen einfachen Aggregationsassay, um diese Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die auf der Oberfläche von S2-Zellen exprimiert werden, nachzuweisen. Wir haben uns überlegt, dass, wenn Notch und Delta in der Lage sind, stabile heterotypische Komplexe an der Zelloberfläche zu bilden, dann Zellen, die diese Proteine exprimieren, aneinander binden und unter geeigneten Bedingungen Aggregate bilden könnten. Ein ähnliches Assaysystem ist unlängst für das Fasciclin III-Protein beschrieben worden (Snow et al., 1989, Cell 59, 313–323).
S2-Zellen in der log-Phase der Vermehrung wurden separat mit entweder dem Notch- oder dem Delta-Metallothioneinpromotor-Konstrukt transfiziert. Nach Induktion mit CuSO₄ wurden transfizierte Zellen in gleichen Anzahlen gemischt und man ließ sie über Nacht bei Raumtemperatur aggregieren (für Einzelheiten siehe Experimentelle Vorgehensweisen, Abschnitt 6.1). Alternativ wurden in einigen Experimenten, die dazu gedacht waren, Stoffwechselaktivität zu verringern, Zellen sanft bei 4°C 1–2 h gemischt. Um zu bestimmen, ob sich Aggregate gebildet hatten, wurden Zellen für eine Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Antikörpern, die für jedes Genprodukt spezifisch waren, und von unterschiedlich markierten fluoreszierenden sekundären Antikörpern weiterverarbeitet. Wie zuvor erwähnt, machten exprimierende Zellen üblicherweise weniger als 5% der gesamten Zellpopulation aus, da wir vorübergehende anstelle von stabilen Transformanten verwendeten. Die übrigen Zellen exprimierten ein gegebenes Protein entweder nicht oder exprimierten es in Konzentrationen, die für einen Nachweis durch Immunfluoreszenzmikroskopie zu gering waren. Als Kontrollen führten wir Aggregationen mit nur einer einzelnen Art von transfizierter Zelle aus.
3 zeigt repräsentative Mikrophotographien aus Aggregationsexperimenten und Tabelle I präsentiert die Ergebnisse in numerischer Form. Wie aus 3C und Tabelle I ersichtlich ist, bilden, während Notch exprimierende (Notch⁺) Zellen allein in unserem Assay keine Aggregate bilden, Delta exprimierende (Delta⁺) Zellen diese sehr wohl.
Die Tendenz für Delta⁺-Zellen, zu aggregieren, war sogar in nicht-aggregierten Kontrollproben erkennbar (Tabelle I), wo üblicherweise Zellcluster von 4–8 Zellen auftraten, die wahrscheinlich aufgrund eines Haftens zwischen mitotischen Schwesterzellen entstanden. Jedoch waren Cluster üblicher nach einer Inkubation unter Aggregationsbedingungen (z. B. 19% von Delta⁺-Zellen in Aggregaten vor einer Inkubation gegenüber 37% von Delta⁺-Zellen in Aggregaten nach Inkubation; Experiment 1 in Tabelle I), was anzeigt, dass Delta⁺-Zellen in der Lage sind, in diesem Assay stabile Kontakte mit einander zu bilden. Es ist wichtig, anzumerken, dass, obwohl nicht-anfärbende Zellen über 90% der Zellen in unseren vorübergehenden Transfektionen ausmachten, wir sie niemals innerhalb von Aggregaten fanden. In seltenen Fällen wurden nicht-anfärbende Zellen an der Kante eines Aggregats gefunden. Aufgrund des häufigen Vorkommens von schwach anfärbenden Zellen an den Kanten von Aggregaten ist es wahrscheinlich, dass diese offensichtlich nicht-exprimierenden Zellen transfiziert waren, aber Konzentrationen von Delta exprimierten, die unzureichend waren, um durch Immunfluoreszenz nachgewiesen werden zu können.
In bemerkenswertem Kontrast zu Kontrollexperimenten mit Notch⁺-Zellen allein, führte eine Aggregation von Mischungen von Notch⁺- und Delta⁺-Zellen zu der Bildung von Clustern von bis zu 20 oder mehr Zellen (3D–3H, Tabelle I). Wie Tabelle I zeigt, reichte der Bruchteil von exprimierenden Zellen, der in Cluster von vier oder mehr angefärbten Zellen nach 24 h Aggregation gefunden wird, von 32% bis 54% in Mischungen von Notch⁺- und Delta⁺-Zellen. Dieser Bereich war ähnlich zu jenem, der für Delta⁺-Zellen allein festgestellt wird (37%–40%), unterschied sich aber sehr stark von jenem für Notch⁺-Zellen allein (nur 0%–5%). Obwohl nur einige wenige Cluster, die nur aus Delta⁺-Zellen bestanden, gefunden wurden, wurden Notch⁺-Zellen niemals in Clustern von mehr als vier bis fünf Zellen gefunden, sofern nicht Delta⁺-Zellen ebenfalls anwesend waren. Wieder exprimierten alle Zellen innerhalb von diesen Cluster entweder Notch oder Delta, sogar obwohl transfizierte Zellen nur einen geringen Bruchteil der gesamten Zellpopulation bildeten. Nach 48 h (Tabelle I, Experimente 5 und 6) erschien das Aggregationsausmaß höher (63%–71%), was nahelegt, dass die Aggregation nach 24 h unter diesen Bedingungen noch nicht ein Maximum erreicht hatte. Auch aggregierten Zellen, die mit Notch- und Delta-Konstrukten cotransfiziert worden waren (so dass alle transfizierten Zellen beide Protein exprimieren), unter den gleichen experimentellen Bedingungen in einer ähnlichen Weise.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass die in diesen Experimenten beobachtete Aggregation die Expression von Notch und Delta erfordert und nicht auf die zufällige Expression von einem anderen wechselwirkenden Protein in nicht-transfizierten S2-Zellen zurückzuführen ist. Wir tes teten ferner die Spezifität von dieser Wechselwirkung, indem Notch⁺- und Delta⁺-Zellen 10-fach mit nicht-transfizierten S2-Zellen verdünnt wurden und man diese 24 h bei Raumtemperatur aggregieren ließ. In diesem Experiment wurden 39% der exprimierenden Zellen in Aggregaten mit anderen exprimierenden Zellen gefunden, obwohl sie weniger als 0,1% der gesamten Zellpopulation bildeten. Nicht überraschend waren diese Aggregate jedoch durchschnittlich kleiner als jene, die in Standard-Aggregationsexperimenten gefunden werden. Um zusätzlich eine Kontrolle hinsichtlich der Möglichkeit, dass Notch⁺-Zellen nicht-spezifisch in die Delta⁺-Aggregate rekrutiert werden, da sie eine einzelne Art von Protein auf der Zelloberfläche überexprimieren, auszuführen, mischten wir Delta⁺-Zellen mit Zellen, die Neuroglian, ein Transmembran-Zelloberflächenprotein (Bieber et al., 1989, Cell 59, 447–456), unter der Kontrolle des Metallothioneinpromotors (dieses Metallothionein-Neuroglian-Konstrukt wurde freundlicherweise von A. Bieber und C. Goodman bereitgestellt) exprimierten. Wir beobachteten keine Tendenz für Neuroglian⁺-Zellen, sich an Delta⁺-Aggregate anzuheften, was anzeigt, dass die Notch-Delta-Aggregation nicht allein das Ergebnis von hohen Ausmaßen von Proteinexpression an der Zelloberfläche ist.
Wir testeten auch direkt auf die Beteiligung von Notch an dem Aggregationsprozess, indem die Wirkung einer Mischung von polyklonalen Antiseren, die gegen Fusionsproteine, die nahezu die gesamte extrazelluläre Domäne von Notch umfassten, gerichtet waren, auf die Aggregation untersucht wurde (siehe Experimentelle Vorgehensweisen, Abschnitt 6.1). Um Artefakte, die aufgrund einer Stoffwechselantwort auf das örtlich begrenzte Anfärben bzw. Detektieren („Patching") von Oberflächenantigenen entstehen könnten, zu minimieren, wurden Antikörperbehandlung und der Aggregationsassay in diesen Experimenten bei 4°C ausgeführt. Notch⁺-Zellen wurden mit entweder Vorimmun- oder Immun-Mäuseseren 1 h inkubiert, Delta⁺-Zellen wurden zugegeben und die Aggregation wurde für 1–2 h ausgeführt. Während Notch⁺-Zellen, die mit Vorimmunseren vorbehandelt worden waren, mit Delta⁺-Zellen aggregierten (in einem von drei Experimenten befanden sich 23% der Notch⁺-Zellen in Notch⁺-Delta⁺-Zellaggregaten), taten jene, die mit Immunseren behandelt worden waren, dies nicht (nur 2% der Notch⁺-Zellen befanden sich in Aggregaten). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die extrazelluläre Domäne von Notch für die Notch⁺-Delta⁺-Zellaggregation erforderlich ist, obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass die verringerte Aggregation auf inhibitorische sterische oder Membranstruktur-Effekte, welche aus einer Exposition von Notch⁺-Zellen gegenüber dem Anstiserum resultierten, zurückzuführen war.
Drei andere bemerkenswerte Beobachtungen sind in 3 ersichtlich. Erstens war, obwohl Delta nahezu stets nur an der Zelloberfläche erkennbar war (3B und 3C), die Notch-Anfärbung stets sowohl an der Zelloberfläche als auch intrazellulär, häufig assoziiert mit vesikulären Strukturen, erkennbar (3A). Zweitens stellten wir konsistent einen morphologischen Unterschied zwischen Delta⁺- und Notch⁺-Zellen in gemischten Aggregaten, die über Nacht inkubiert worden waren, fest. Delta⁺-Zellen wiesen oftmals lange Ausdehnungen auf, die angrenzende Notch⁺-Zellen vollständig umgaben, während Notch⁺-Zellen nahezu stets im Erscheinungsbild abgerundet ohne bemerkenswerte zytoplasmatische Ausdehnungen waren (3G). Drittens schienen sich Notch und Delta oftmals innerhalb von Kontaktregionen zwischen Notch⁺- und Delta⁺-Zellen anzusammeln, was eine scharfe Bande von immunfluoreszierender Anfärbung erzeugte (3D–3F). Diese Banden waren in optischen Teilabschnitten, die mittels des konfokalen Mikroskops betracht wurden, leicht sichtbar (3H), was anzeigt, dass sie nicht allein auf einen Gesamtträger („whole mount")-Artefakt zurückzuführen waren. Wir beobachteten auch, dass diese Banden sich schnell (innerhalb von 2 h nach dem Mischen der Zellen) und bei 4°C bildeten, was anzeigt, dass ihre Bildung wahrscheinlich nicht von dem zellulären Stoffwechsel abhing. Diese Beobachtungen würden erwartet werden, wenn innerhalb von Regionen von Zellkontakt Notch und Delta aneinander binden und dementsprechend immobilisiert werden. Dieses Expressionsmuster ist auch konsistent mit jenem, das für andere Proteine, die eine Zellaggregation vermitteln, beobachtet wird (Takeichi, 1988, Development 102, 639–655; Snow et al., 1989, Cell 59, 313–323).
6.2.3. DIE NOTCH-DELTA-VERMITTELTE AGGREGATION IST CALCIUMABHÄNGIG
Frühere Untersuchungen haben nahegelegt, dass EGF-artige Wiederholungen, die eine bestimmte Consensus-Sequenz enthalten, als eine Calcium (Ca²⁺) bindende Domäne dienen könnten (Morita et al.,1984, J. Biol. Chem. 259, 5698–5704; Sugo et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705–5710; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475–480). Für wenigstens zwei von diesen Proteinen, C und C1, ist weiter gezeigt worden, dass eine Ca²⁺-Bindung eine notwendige Komponente für deren Wechselwirkung mit anderen Proteinen ist (Villiers et al., 1980, FEBS Lett. 117, 289–294; Esmon et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 5548–5553; Johnson et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 5554–5560). Viele von diesen EGF-homologen Wiederholungen innerhalb von Notch und die meisten von jenen innerhalb von Delta enthalten die notwendige Consensus-Sequenz für eine Ca²⁺-Bindung (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061; Stenflo et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 368–372; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475–480), obwohl noch nicht bestimmt worden ist, ob diese Proteine tatsächlich Calcium binden oder nicht. Wir testeten dementsprechend die Fähigkeit von exprimierenden Zellen, in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca²⁺-Ionen zu aggregieren, um zu bestimmen, ob es ein Erfordernis für Ca²⁺-Ionen für eine Notch-Delta-Aggregation gibt. Um mögliche nichtspezifische Effekte aufgrund von Stoffwechselreaktionen auf die Entfernung von Ca²⁺ zu minimieren, wurden diese Experimente bei 4°C ausgeführt. Kontrollmischungen von Notch⁺- und Delta⁺-Zellen, die unter Aggregationsbedingungen in Ca²⁺-enthaltendem Medium bei 4°C inkubiert wurden, bildeten leicht Aggregate (ein Durchschnittswert von 34% ± 13%, Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3; Tabelle II). Im Gegensatz dazu bildeten Zellen, die in Medium, dem Ca²⁺-Ionen fehlten und das EGTA enthielt, gemischt wurden, wenig Aggregate (5% ± 5%). Diese Ergebnisse zeigen klar eine Abhängigkeit der Notch-Delta-vermittelten Aggregation von exogenem Ca²⁺ und stehen in ausgeprägtem Kontrast zu jenen, die unlängst für die Drosophila-Fasciclin III- und -Fasciclin I-Proteine in S2-Zellen veröffentlicht wurden (Snow et al., 1989, Cell 59, 313–323; Elkins et al., 1990, J. Cell Biol. 110, 1825–1832), die keine Wirkung einer Entfernung von Ca²⁺-Ionen auf eine durch eines der beiden Proteine vermittelte Aggregation nachwiesen.
6.2.4. NOTCH UND DELTA WECHSELWIRKEN INNERHALB EINER EINZELNEN ZELLE MITEINANDER
Wir stellten die Frage, ob Notch und Delta innerhalb der Membran von einer Zelle, die beide Proteine exprimiert, assoziiert sind, indem die Verteilungen von Notch und Delta in cotransfizierten Zellen untersucht wurden. Wie in den 4A und 4B gezeigt, zeigen diese beiden Proteine oftmals sehr ähnliche Verteilungen an der Oberfläche von cotransfizierten Zellen. Um zu testen, ob die beobachtete Colokalisierung zufällig war oder eine stabile Wechselwirkung zwischen Notch und Delta repräsentierte, behandelten wir lebende Zellen mit einem Überschuss von polyklonalem anti-Notch-Antiserum. Diese Behandlung führte zu einem „Patching" von Notch auf der Oberfläche von exprimierenden Zellen in Form von diskreten Flecken („Patches"), wie durch Immunfluoreszenz nachgewiesen wurde. Es gab eine klare Korrelation zwischen den Verteilungen von Notch und Delta an den Oberflächen von diesen Zellen nach dieser Behandlung (4C und 4D), was anzeigt, dass diese Proteine innerhalb der Membran assoziiert sind. Es ist wichtig, anzumerken, dass diese Experimente nicht die Frage ansprechen, ob diese Assoziation direkt ist oder durch andere Komponenten, wie das Zytoskelett, vermittelt wird. Um eine Kontrolle hinsichtlich der Möglichkeit, dass Delta in diesem Experiment nicht-spezifisch gepatcht wird, auszuführen, cotransfizierten wir Zellen mit Notch und mit dem zuvor erwähnten Neuroglian-Konstrukt (A. Bieber und C. Goodman, unveröffentlichte Daten) und patchten mit anti-Notch-Antiseren. In diesem Falle gab es keine ersichtliche Korrelation zwischen Notch und Neuroglian.
6.2.5. WECHSELWIRKUNGEN MIT DELTA BENÖTIGEN DIE INTRAZELLULÄRE DOMÄNE VON NOTCH NICHT
Zusätzlich zu einer großen extrazellulären Domäne, die EGF-artige Wiederholungen enthält, weist Notch eine ziemlich große intrazelluläre Domäne (IC) von ~ 940 Aminosäuren auf. Die IC-Domäne umfasst eine Phosphorylierungsstelle (Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113–1129), eine mutmaßliche Nukleotidbindungsdomäne, einen Polyglutamin-Abschnitt (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094–3108) und Sequenzen, die zu dem cdc10-Gen aus Hefe, das an der Kontrolle des Zellzyklus in Hefe beteiligt ist (Breeden und Nasmyth, 1987, Nature 329, 651–654), homolog sind. Angesichts der Größe und strukturellen Komplexität von dieser Domäne fragten wir uns, ob diese für Notch-Delta-Wechselwirkungen erforderlich ist. Wir verwendeten dementsprechend ein abgewandeltes Notch-Konstrukt, aus welchem kodierende Sequenzen für ~ 835 Aminosäuren der IC-Domäne einschließlich aller der strukturellen Merkmale, die oben erwähnt worden sind, deletiert worden waren (was 25 Memb ran-proximale Aminosäuren und einen neuen 59 Aminosäuren langen Carboxylterminus zurückließ; siehe Experimentelle Vorgehensweisen und 1 für Einzelheiten). Dieses Konstrukt, das als ECN1 bezeichnet wurde, wurde konstitutiv unter der Kontrolle des normalen Notch-Promotors in transfizierten Zellen in einem Ausmaß geringer als jenes, das für die Metallothioneinpromotor-Konstrukte beobachtet wurde, aber nach wie vor durch Immunfluoreszenz leicht nachweisbar waren, exprimiert.
In Aggregationsassays bildeten Zellen, die das ECN1-Konstrukt exprimierten, konsistent Aggregate mit Delta⁺-Zellen (31% der ECN1-exprimierenden Zellen befanden sich in Aggregaten in einem von drei Experimenten; siehe auch 3I), nicht aber mit sich selbst (nur 4% in Aggregaten), genau so wie wir für Zellen, die intaktes Notch exprimierten, beobachtet hatten. Wir beobachteten auch scharfe Banden von ECN1-Anfärbung innerhalb von Kontaktregionen mit Delta⁺-Zellen, was wiederum auf eine Lokalisierung von ECN1 innerhalb von Kontaktregionen zwischen Zellen hinweist. Um auf Wechselwirkungen innerhalb der Membran zu testen, wiederholten wir die Oberflächenantigen-Co-Patching-Experimente unter Verwendung von Zellen, die mit den ECN1- und Delta-Konstrukten cotransfiziert waren. Wie für intaktes Notch beobachtet worden war, fanden wir heraus, dass, wenn ECN1 unter Verwendung von polyklonalen Antiseren gegen die extrazelluläre Domäne von Notch gepatcht wurde, ECN1 und Delta an der Zelloberfläche colokalisiert waren (4E und 4F). Diese Ergebnisse zeigen, dass die beobachteten Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta innerhalb der Membran den deletierten Abschnitt der IC-Domäne von Notch nicht benötigen und dementsprechend wahrscheinlich durch die extrazelluläre Domäne vermittelt werden. Es ist jedoch möglich, dass die verbliebenen Transmembran- oder IC-Domänensequenzen in ECN1 ausreichend ist, um Wechselwirkungen innerhalb einer einzelnen Zelle zu vermitteln.
6.2.6. NOTCH UND DELTA BILDEN DETERGENTIEN-LÖSLICHE INTERMOLEKULARE KOMPLEXE
Zusammengenommen fassen wir die vorangegangenen Ergebnisse so auf, dass sie angeben, dass molekulare Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta innerhalb von ein und derselben Membran und zwischen diesen Proteinen, wenn sie auf unterschiedlichen Zellen exprimiert werden, vorhanden sind. Als ein weiterer Test auf solche Wechselwirkungen stellten wir die Frage, ob diese Proteine aus nicht-denaturierenden Detergentien-Extrakten von Zellen, die Notch und Delta exprimieren, copräzipitieren würden. Wenn Notch und Delta einen stabilen intermolekularen Komplex entweder zwischen oder innerhalb von Zellen bilden, dann sollte es möglich sein, beide Proteine aus Zellextrakten unter Verwendung von spezifischen Antiseren, die gegen eines dieser Proteine gerichtet sind, zu präzipitieren. Wir führten diese Analyse durch Immunpräzipitieren von Delta mit polyklonalen Antiseren aus NP-40/Desoxycholat-Lysaten (siehe Experimentelle Vorgehensweisen) von Zellen, die mit den Notch- und Delta-Konstrukten cotransfiziert worden waren, die man über Nacht hatte aggregieren lassen, oder von 0–24 h-Wildtyp-Embryos aus. Wir waren nicht in der Lage, die umgekehrten Immunpräzipitate auszuführen, da es nicht möglich war, eine schwache Delta-Bande unzweideutig von Hintergrund-Staph A-Banden zu unterscheiden. Es ist wichtig, anzumerken, dass wir dieses polyklonale anti-Delta-Antiserum auf Kreuzreaktivität gegenüber Notch in Zelllysaten (5A, Bahn 1) und durch Immunfluoreszenz (z. B. vergleiche 3D und 3E) getestet haben und keine gefunden haben. Nach wiederholtem Waschen, um nicht-spezifisch anhaftende Proteine zu entfernen, testeten wir auf Copräzipitation von Notch unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (MAb C17.9C6) gegen Notch auf Western-Blots.
Wie 5 zeigt, wiesen wir tatsächlich eine Copräzipitation von Notch in Delta-Immunpräzipitaten aus cotransfizierten Zellen und Embryos nach. Jedoch schien copräzipitiertes Notch in viel geringeren Mengen als Delta vorhanden zu sein und war dementsprechend schwierig zu detektieren. Diese Ungleichheit ist höchstwahrscheinlich auf die Zerstörung von Notch-Delta-Komplexen während der Lyse- und Waschschritte der Prozedur zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass diese Ungleichheit eine nicht-äquimolare Wechselwirkung zwischen Notch und Delta wiederspiegelt oder stark unterschiedliche Affinitäten der Antiseren, die verwendet wurden, um diese Proteine zu detektieren. Die Tatsache, dass eine Immunpräzipitation von Delta zu der Copräzipitation von Notch führt, bildet einen direkten Beweis, dass diese beiden Proteine stabile intermolekulare Komplexe in transfizierten S2-Zellen und in embryonalen Zellen bilden.
6.3. DISKUSSION
Wir haben Wechselwirkungen zwischen den Proteinprodukten von zwei der neurogenen Genorte, Notch und Delta, untersucht, um ihre zellulären Funktionen besser zu verstehen. Unter Verwendung eines in vitro-Aggregationsassays, der normalerweise nicht-adhäsive S2-Zellen einsetzt, zeigten wir, dass Zellen, die Notch und Delta exprimieren, spezifisch aneinander haften. Die Spezifität von dieser Wechselwirkung ist ersichtlich aus der Beobachtung, dass Notch⁺-Delta⁺-Zellaggregate selten nicht-exprimierende Zellen enthielten, sogar obwohl nicht-exprimierende Zellen die große Mehrheit der gesamten Zellpopulation in diesen Experimenten ausmachten. Wir schlagen vor, dass diese Aggregation durch eine heterotypische Bindung zwischen den extrazellulären Domänen von Notch und Delta, die auf den Oberflächen von exprimie renden Zellen vorhanden sind, vermittelt wird. Konsistent mit diesem Vorschlag stellen wir fest, dass Antiseren, die gegen die extrazelluläre Domäne von Notch gerichtet sind, eine Notch-Delta-vermittelte Aggregation inhibieren und dass die ECN1-Notch-Variante, der nahezu die Gesamtheit der intrazellulären Notch-Domäne fehlt, eine Aggregation mit Zellen, die Delta exprimieren, vermitteln kann. Wir haben auch festgestellt, dass Zellen, die nur Delta exprimieren, miteinander aggregieren, während jene, die nur Notch exprimieren, dies nicht tun. Diese Feststellungen legen nahe, dass Delta an einer homotypischen Wechselwirkung teilnehmen kann, wenn es auf nebeneinanderliegenden Zelloberflächen vorhanden ist, aber dass Notch dies unter unseren Assaybedingungen nicht kann.
Der Vorschlag, dass Notch und Delta an der Zelloberfläche Wechselwirken, wird weiter gestützt durch drei Beweisketten. Erstens finden wir eine intensive Lokalisierung von beiden Proteinen innerhalb von Kontaktregionen mit Notch⁺- und Delta⁺-Zellen, was impliziert, dass Notch und Delta direkt Wechselwirken, sogar wenn sie in unterschiedlichen Zellen exprimiert werden. Zweitens sind Notch und Delta an der Oberfläche von Zellen, die beide Proteine exprimieren, colokalisiert, was nahelegt, dass diese Proteine innerhalb der Zellmembran Wechselwirken können. Drittens können Notch und Delta aus nicht-denaturierenden Detergentien-Extrakten von kultivierten Zellen, die beide Proteine exprimieren, wie auch aus Extrakten von embryonalen Zellen copräzipitiert werden. Zusammen genommen legen diese Ergebnisse die Hypothese, dass Notch und Delta heterotypisch Wechselwirken können, wenn sie auf den Oberflächen von entweder derselben oder unterschiedlicher Zellen exprimiert werden, stark nahe.
Die zugrundliegende Basis für die beobachteten genetischen Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta und zwischen Notch und mam (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464–475) könnte eine Dosis-empfindliche Wechselwirkung zwischen den Proteinen, die durch diese Gene kodiert werden, sein.
Zwei Beweisketten legen nahe, dass die Notch- und Delta-Proteine in vitro und in vivo in ähnlicher Weise ihre Funktion entfalten. Erstens haben die genetischen Analysen angezeigt, dass die Stöchiometrie von Notch und Delta für ihre Funktion im Rahmen der Entwicklung entscheidend ist. Unsere Beobachtungen, dass sowohl Notch-Delta- als auch Delta-Delta-Assoziationen in vitro auftreten können, impliziert, dass Notch und Delta möglicherweise hinsichtlich einer Bindung an Delta kompetitieren. So könnten Dosis-empfindliche genetische Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta das Ergebnis von kompetitiven Bindungswechselwirkungen zwischen deren Proteinprodukten sein. Zweitens waren wir in der Lage, Notch-Delta-Assoziation in Lysaten von kultivierten Zellen und in Lysaten von Drosophila-Embryos unter Verwendung einer Immupräzipitation nachzuweisen. Zusammengenommen, legen diese genetischen und biochemi schen Analysen nahe, dass Notch und Delta tatsächlich in vivo assoziieren in einer Weise ähnlich zu jener, die wir auf der Grundlage von unseren Aggregationsassays vorschlagen.
Genetische und molekulare Analysen von Notch haben auch die Möglichkeit ans Licht gebracht, dass es Wechselwirkungen zwischen individuellen Notch-Proteinen geben könnte (Portin, 1975, Genetics 81, 121–133; Kelley et al., 1987, Cell 51, 539–548; Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95–100). Tatsächlich haben Kidd et al. (1989, Genes Dev. 3, 1113–1129) vorgeschlagen, dass dieses Protein durch Disulfid-Brücken quervernetzte Dimere bildet, obwohl dieser Punkt noch nicht streng bewiesen worden ist. Mit oder ohne Bildung von kovalenten Vernetzungen könnten solche Wechselwirkungen mutmaßlich entweder innerhalb einer einzelnen Zelle oder zwischen Zellen auftreten. Jedoch legt unsere Feststellung, dass Notch⁺-Zellen nicht homotypisch aggregieren, nahe, dass Notch-Notch-Assoziationen wahrscheinlich innerhalb einer einzelnen Zelle und nicht zwischen Zellen auftreten. Alternativ ist es möglich, dass homotypische Notch-Wechselwirkungen Genprodukte benötigen, die in S2-Zellen nicht exprimiert werden.
Die Notch-Delta-Wechselwirkungen, die durch unsere Analyse angezeigt werden, werden wahrscheinlich durch die extrazellulären Domänen von diesen Proteinen vermittelt. Aggregationsexperimente unter Verwendung des ECN1-Konstrukts, aus welchem nahezu die gesamte intrazelluläre Domäne von Notch entfernt oder durch in vitro-Mutagenese verändert worden ist, bestätigten diese Schlussfolgerung. Weitere Experimente, die ECN1-Delta-Assoziationen innerhalb der Membran auf der Grundlage von deren Fähigkeit zum Copatching zeigen, wiesen darauf hin, dass diese Wechselwirkungen auch wahrscheinlich durch die extrazellulären Domänen von Notch und Delta vermittelt werden, obwohl wir in diesem Falle eine mögliche Beteiligung der Transmembrandomäne oder des restlichen Abschnitts der intrazellulären Notch-Domäne nicht ausschließen können. Diese Ergebnisse sind besonders interessant im Lichte der Tatsache, dass sowohl Notch als auch Delta EGF-artige Wiederholungen innerhalb von ihren extrazellulären Domänen aufweisen (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094–3108; Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431–3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735).
Ein zweiter Gegenstand von Interesse hinsichtlich EGF-Domänen ist der Vorschlag, dass sie als Ca²⁺-bindende Domänen dienen können, wenn sie eine Consensus-Sequenz bestehend aus Asp-, Asp/Asn-, Asp/Asn- und Tyr/Phe-Resten an konservierten Positionen innerhalb von EGF-artigen Wiederholungen enthalten (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475–480). Vergleiche mit einer vorgeschlagenen Consensus-Sequenz für Ca²⁺-Bindung haben enthüllt, dass ähnliche Sequenzen innerhalb von vielen der EGF-artigen Wiederholungen von Notch (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061) und innerhalb der meisten der EGF-artigen Wiederholungen von Delta (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735) gefunden werden. Darüber hinaus haben Sequenzanalysen von Notch-Mutationen gezeigt, dass bestimmte Ax-Allele mit Veränderungen von Aminosäuren innerhalb von dieser mutmaßlichen Ca²⁺-bindenden Domäne assoziiert sind (Kelley et al., 1987, Cell 51, 539–548; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407–3417; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061). Beispielsweise scheint die Ax^E2-Mutation, die mit einer His→Tyr-Veränderung in der 29. EGF-artigen Wiederholung korreliert, diese Wiederholung in Richtung der Consensus-Sequenz für eine Ca²⁺-Bindung zu verändern. Im Gegensatz dazu scheint die Ax^9B2-Mutation die 24. EGF-artige Wiederholung als Ergebnis einer Asp→Val-Veränderung von dieser Consensus-Sequenz weg zu verändern. Dementsprechend werfen die genetischen Wechselwirkungen zwischen Ax-Allelen und Delta-Mutationen (Xu et al., 1990, Genes Dev., 4, 464–475) die Frage nach der Möglichkeit, dass Ca²⁺-Ionen eine Rolle bei Notch-Delta-Wechselwirkungen spielen, auf. Unsere Feststellung, dass exogenes Ca²⁺ für eine Notch-Delta-vermittelte Aggregation von transfizierten S2-Zellen erforderlich ist, unterstützt diese Behauptung.
Wie wir auf der Grundlage von früheren molekularen und genetischen Analysen argumentiert haben (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427–2440; Alton et al., 1989, Dev. Genet. 10, 261–272), konnte man nicht mit irgendeiner Sicherheit die zelluläre Funktion von entweder Notch oder Delta über ihre Beteiligung an Zell-Zell-Wechselwirkungen hinaus vorhersagen. Jedoch scheint es jetzt angesichts der hier aufgeführten Ergebnisse vernünftig, zu vermuten, dass Notch und Delta in vivo Funktion entfalten könnten, um adhäsive Wechselwirkungen zwischen Zellen zu vermitteln. Zur gleichen Zeit ist es relativ wahrscheinlich, dass die beobachteten Notch-Delta-Wechselwirkungen möglicherweise nicht eine rein adhäsive Funktion reflektieren könnten und zusätzlich Rezeptor-Ligand-Bindungswechselwirkungen, die in vivo auftreten, reflektieren könnten. Tatsächlich könnte das Vorhandensein einer strukturell komplexen 1000 Aminosäure langen intrazellulären Domäne innerhalb von Notch konsistenter sein mit einer Rolle in der Signaltransduktion als mit rein adhäsiven Wechselwirkungen. Angesichts der Tatsache, dass Notch eine adhäsive Funktion im Zusammenspiel mit Delta haben könnte, könnte eine axonale Expression von Notch irgendeine Rolle bei der Axon-Wegfindung spielen.
7. EGF-WIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND FÜR EINE NOTCH-DELTA-VERMITTELTE AGGREGATION ERFORDERLICH UND AUSREICHEND
In dieser Untersuchung verwenden wir den gleichen Aggregationsassay, wie in Abschnitt 6 beschrieben, zusammen mit Deletionsmutanten von Notch, um Regionen innerhalb der extra zellulären Domäne von Notch, die für Wechselwirkungen mit Delta erforderlich sind, zu identifizieren. Wir präsentieren Hinweise darauf, dass die EGF-Wiederholungen von Notch direkt an dieser Wechselwirkung beteiligt sind und dass nur zwei von den 36 EGF-Wiederholungen sich als notwendig erweisen. Wir zeigen, dass diese beiden EGF-Wiederholungen für ein Binden an Delta ausreichend sind und dass die Calciumabhängigkeit der Notch-Delta-vermittelten Aggregation ebenfalls mit diesen beiden Wiederholungen assoziiert ist. Schließlich vermitteln die beiden entsprechenden EGF-Wiederholungen aus dem Xenopus-Homolog von Notch auch eine Aggregation mit Delta, was impliziert, dass nicht nur die Struktur von Notch im Verlauf der Evolution konserviert geblieben ist, sondern auch seine Funktion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die extrazelluläre Domäne von Notch überraschend modular ist und potentiell verschiedene Proteine zusätzlich zu Delta binden könnte.
7.1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN
7.1.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE
Die beschriebenen Konstrukte sind allesamt Derivate des Volllängen-Notch-Expressionskonstrukts Nr. 1 pMtNMg (siehe Abschnitt 6 oben). Alle Ligationen wurden ausgeführt unter Verwendung von DNA-Fragmenten, die aus Agarosegelen mit niedriger Schmelztemperatur (Sea Plaque, FMC BioProdukts) ausgeschnitten worden waren. Das 6 kb-EcoRI-XhoI-Fragment aus pMtNMg, welches die gesamte extrazelluläre Domäne von Notch enthielt, wurde in die EcoRI-XhoI-Stellen des Bluescript-Vektors (Stratagene) ligiert und als RI/XBS bezeichnet. Alle nachfolgenden Deletionen und Insertionen von EGF-Wiederholungen wurden in diesem Subklon ausgeführt. Die Notch-Sequenz, welche das EcoRI-XhoI-Fragment von diesen RI/XBS-Derivaten enthielt, wurde dann mit dem 5,5 kb-XhoI-XbaI-Fragment aus pMtNMg, enthaltend die intrazelluläre Domäne und 3'-Sequenzen, die für die Polyadenylierung benötigt werden, gemischt und dann in die EcoRI-XbaI-Stelle von pRMHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043–1061) in einer Drei-Elemente-Ligation inseriert. Alle nachfolgenden Nummern beziehen sich auf Nukleotidkoordinaten der Notch-Sequenz gemäß Wharton et al., (1985, Cell 43, 567–581).
Für das Konstrukt Nr. 2 DSph wurde RI/XBS bis zur Vollständigkeit mit SphI verdaut und dann rezirkularisiert, was zu einer im Raster vorliegenden 3,5 kb-Deletion von SphI(996) bis SphI (4545) führte.
Für das Konstrukt Nr. 3 ΔCla wurde RI/XBS bis zur Vollständigkeit mit ClaI verdaut und dann religiert, was eine im Raster vorliegende 2,7 kb-Deletion von ClaI(1668) bis ClaI(4407) erzeugte. Die Ligationsverbindungsstelle wurde durch Doppelstrangsequenzierung (wie von Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464–475, beschrieben) unter Verwendung des Sequenase Kit (U. S. Biochemical Corp., Cleveland) überprüft. Wir haben festgestellt, dass, obwohl die ClaI-Stelle an Position 4566 gemäß der Sequenz existiert, sie unter unseren Bedingungen durch das ClaI-Restriktionsenzym nicht erkannt wurde.
Für die Konstrukte Nr. 4–12 wurde RI/XBS partiell mit ClaI verdaut und dann religiert, um alle möglichen Kombinationen von im Raster vorliegenden Deletionen zu erzeugen: Konstrukt Nr. 4 ΔEGF7–17 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1668) und ClaI(2820); Konstrukt Nr. 5 ΔEGF9–26 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1905) und ClaI(3855); Konstrukt Nr. 6 ΔEGF17–31 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(2820) und ClaI(4407); Konstrukt Nr. 7 ΔEGF7–9 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1668) und ClaI(1905); Konstrukt Nr. 8 ΔEGF9–17 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1905) und ClaI(2820); Konstrukt Nr. 9 ΔEGF17–26 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(2820) und ClaI(3855); Konstrukt Nr. 10 ΔEGF26–30 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(3855) und ClaI(4407); Konstrukt Nr. 11 ΔEGF9–30 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1905) und ClaI(4407); Konstrukt Nr. 12 ΔEGF7–26 entfernte die Sequenz zwischen ClaI(1668) und ClaI(3855).
Für die Konstrukte Nr. 13 ΔCla + EGF9–17 und Nr. 14 ΔCla + EGF17–26 wurden das ~ 0,9 kb-Fragment zwischen ClaI(1905) und ClaI(2820) bzw. das ~ 1,0 kb-Fragment zwischen ClaI(2820) und ClaI(3855) in die einmalig vorkommende ClaI-Stelle des Konstrukts Nr. 3 ΔCla inseriert.
Für Konstrukt Nr. 16 split wurde das 11 kb-KpnI/XbaI-Fragment von pMtNMg durch das entsprechende KpnI/XbaI-Fragment aus einem Notch-Minigen-Konstrukt, welches die split-Mutation in EGF-Wiederholung 14 enthielt, ersetzt.
Für die Konstrukte Nr. 17–25 wurden synthetische Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) gestaltet, um Sequenzabschnitte von EGF-Wiederholungen zu amplifizieren, während die EGF-Wiederholungen an den Enden des amplifizierten Stücks an der gleichen Stelle wie die gemeinsamen ClaI-Stellen unmittelbar nach dem dritten Cystein der Wiederholung gespalten wurden (siehe 7). Die PCR-Produkte wurden mittels Gelen aufgereinigt, wie üblich, und in die ClaI-Stelle des Konstrukts Nr. 3 ΔCla, das durch Auffüllen mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I mit stumpfen Enden versehen worden war (Maniatis et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), ligiert. Die korrekte Orientierung der Inserts wurde durch PCR unter Verwendung eines Sinnstrang-Primers innerhalb des Inserts zusammen mit einem Antisinnstrang-Primer in der EGF-Wiederholung 35 bestimmt. Alle Primer waren 20-mere und wurden mit der Nummer des Nukleotids an ihrem 5'-Ende gemäß den Nukleotidkoordinaten der Notch-Sequenz in Wharton et al. (1985, Cell 43, 567–581) benannt und S bezieht sich auf einen Sinnstrang-Primer, während A sich auf einen Antisinnstrang-Primer bezieht. Konstrukt Nr. 16 ΔCla + EGF(9–13) verwendete die Primer S1917 und A2367. Konstrukt Nr. 17 ΔCla + EGF(11–15) verwendete die Primer S2141 und A2591. Konstrukt Nr. 18 ΔCla + EGF(13–17) verwendete die Primer S2375 und A2819. Konstrukt Nr. 19 ΔCla + EGF(10–13) verwendete die Primer S2018 und A2367. Konstrukt Nr. 20 ΔCla + EGF(11–13) verwendete die Primer S2141 und A2367. Konstrukt Nr. 21 ΔCla + EGF(10–12) verwendete die Primer S2018 und A2015. Konstrukt Nr. 22 ΔCla + EGF(10–11) verwendete die Primer S2018 und A2322. Konstrukt Nr. 23 ΔCla + EGF(10–12) verwendete die Primer S2018 und A2322. Konstrukt Nr. 24 ΔCla + EGF(11–12) verwendete die Primer S2081 und A2322.
Für das Konstrukt Nr. 25 ΔEGF wurde das Konstrukt R1/XBS bis zur Vollständigkeit mit SphI(996) und partiell mit BamHI (5135) verdaut. Die resultierenden inkompatiblen Enden wurden unter Verwendung eines synthetischen Linkers, welcher so gestaltet war, dass er eine einmalig vorkommende ClaI-Stelle erzeugte, miteinander verknüpft. Dies erzeugte eine im Raster vorliegende Deletion, die alle 36 EGF-Wiederholungen mit der Ausnahme der ersten Hälfte von Wiederholung 1 entfernte. Für die Konstrukte Nr. 26–29 wurden die EGF-Fragmente in diese ClaI-Stelle inseriert, wie zuvor für die entsprechenden Konstrukte Nr. 13, 16, 19 und 23 beschrieben.
Für das Konstrukt Nr. 30 ΔECN wurde das Konstrukt R1/XBS bis zur Vollständigkeit mit BglI, EcoRI und XhoI verdaut. Das 0,2 kb-EcoRI-BglI-Fragment (722–948) und das 0,7 kb-BglI-XhoI-Fragment (5873–6627) wurden mit EcoRI-XhoI-geschnittenem Bluescript-Vektor und einem synthetischen Linker, der so gestaltet war, dass er eine einmalig vorkommende ClaI-Stelle erzeugt, ligiert, was zu einer im Raster vorliegenden Deletion von BglI(941) bis BglI(5873), die alle 36 EGF-Wiederholungen mit Ausnahme des ersten Drittels von Wiederholung 1 wie auch die 3 Notch/lin-12-Wiederholungen entfernte, führte. Für die Konstrukte Nr. 31 und 32 wurden die EGF-Fragmente in die einmalig vorkommende ClaI-Stelle inseriert, wie zuvor für die Konstrukte Nr. 19 und 23 beschrieben.
Für die Konstrukte Nr. 33 und 34 wurden die PCR-Primer S1508 und A1859 basierend auf der Xenopus-Notch-Sequenz (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438–1441; Nummern beziehen sich auf Nukleotidkoordinaten, die in dieser Veröffentlichung verwendet worden sind) verwendet, um die EGF-Wiederholungen 11 und 12 aus einer Xenopus-Stage 17-cDNA-Bibliothek (die Bibliothek war von D. Melton hergestellt worden und wurde freundlicherweise von M. Danilchek zur Verfügung gestellt) heraus zu amplifizieren. Das Fragment wurde in das Konstrukt Nr. 3 DCla ligiert und sequenziert.
7.1.2. ZELLKULTUR UND TRANSFEKTION
Die Drosophila-S2-Zelllinie wurde kultiviert und transfiziert, wie in Abschnitt 6 weiter oben beschrieben. Die Delta exprimierende stabil transformierte S2-Zelllinie L-49-6-7 (freundlicherweise etabliert von L. Cherbas) wurde in M3-Medium (hergestellt von Hazleton Co.), ergänzt mit 11% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone), 100 E/ml Penicillin-100 μg/ml Streptomycin-0,25 μg/ml Fungizone (Hazleton), 2 × 10^–7 M Methotrexat, 0,1 mM Hypoxanthin und 0,016 mM Thymidin, kultiviert.
7.1.3. AGGREGATIONSASSAYS UND IMMUNFLUORESZENZ
Aggregationsassays und Ca⁺ ⁺-Abhängigkeitsexperimente waren, wie weiter oben, Abschnitt 6, beschrieben. Zellen wurden mit dem monoklonalen anti-Notch-Antikörper 9C6.C17 und polyklonalen anti-Delta-Ratten-Antiseren (Einzelheiten in Abschnitt 6, oben, beschrieben) angefärbt. Die Oberflächenexpression von Notch-Konstrukten in unpermeabilisierten Zellen wurde unter Verwendung von polyklonalen Ratten-Antiseren, die gegen das 0,8 kb (Aminosäuren 237–501; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581) -BstYI-Fragment aus der extrazellulären Domäne von Notch erzeugt worden waren, bestimmt. Zellen wurden unter Auflichtfluoreszenz mittels eines Leitz-Orthoplan 2-Mikroskops betrachtet.
7.2. ERGEBNISSE
7.2.1. EGF-WIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND FÜR EINE NOTCH-DELTA-VERMITTELTE AGGREGATION ERFORDERLICH
Wir haben eine intensive Deletionsanalyse der extrazellulären Domäne des Notch-Proteins, von der wir gezeigt haben (weiter oben, Abschnitt 6), dass sie an Notch-Delta-Wechselwirkungen beteiligt ist, vorgenommen, um die genaue Domäne von Notch, die diese Wechselwirkungen vermittelt, zu identifizieren. Wir testeten die Fähigkeit von Zellen, die mit den verschiedenen Deletionskonstrukten transfiziert waren, mit Delta zu Wechselwirken, unter Verwendung des in Abschnitt 6 beschriebenen Aggregationsassays. Kurz zusammengefasst, wurden Drosophila-S2-Zellen vorübergehend mit Notch-Deletionskonstrukten transfiziert, es erfolgte eine Induktion mit CuSO₄ und dann eine Aggregation über Nacht bei Raumtemperatur mit einer geringen Menge von Zellen aus der stabil transformierten Delta exprimierenden Zelllinie L49-6-7 (Cherbas), was eine Population ergab, die typischerweise aus ~ 1% Notch exprimierenden Zellen und ~ 5% Delta exprimierenden Zellen bestand, wobei die restlichen Zellen keines der beiden Proteine exprimierten. Um das Ausmaß von Aggregation zu bestimmen, wurden Zel len mit für jedes Genprodukt spezifischen Antiseren angefärbt und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht (siehe Experimentelle Vorgehensweisen für Einzelheiten). Aggregate wurden als Cluster von vier oder mehr Zellen, welche sowohl Notch als auch Delta exprimierende Zellen enthielten, definiert und die in 6 gezeigten Werte repräsentieren den Prozentsatz von allen Notch exprimierenden Zellen, die in solchen Cluster gefunden werden. Alle Zahlen reflektieren das durchschnittliche Ergebnis aus wenigstens zwei separaten Transfektionsexperimenten, in welchen wenigstens 100 Notch-exprimierende Zelleinheiten (entweder einzelne Zellen oder Cluster) bewertet worden sind.
Schematische Zeichnungen der getesteten Konstrukte und die Ergebnisse der Aggregationsexperimente sind in 6 gezeigt (siehe Experimentelle Vorgehensweisen für Einzelheiten). Alle Expressionskonstrukte waren Derivate des Volllängen-Notch-Expressionskonstrukts Nr. 1 pMtNMg (beschrieben in Abschnitt 6, oben).
Die anfänglichen Konstrukte (Nr. 2 DSph und Nr. 3 ΔCla) deletierten große Abschnitte der EGF-Wiederholungen. Ihre Unfähigkeit, eine Notch-Delta-Aggregation zu fördern, legte nahe, dass die EGF-Wiederholungen von Notch an der Wechselwirkung mit Delta beteiligt waren. Wir zogen Vorteil aus einer Reihe von sechs im Raster vorliegenden ClaI-Restriktionsstellen, um die Region zwischen den EGF-Wiederholungen 7 und 30 weiter aufzuschlüsseln. Aufgrund von Sequenzhomologie zwischen den Wiederholungen befinden sich fünf der ClaI-Stellen an der gleichen relativen Stelle innerhalb der EGF-Wiederholung, unmittelbar hinter dem dritten Cystein, während die sechste Stelle unmittelbar vor dem ersten Cystein der EGF-Wiederholung 31 vorkommt (7). So erhielten wir, indem ein partieller ClaI-Verdau ausgeführt und dann religiert wurde, Deletionen, die nicht nur das offene Leseraster des Notch-Proteins bewahrten, sondern zusätzlich häufig die strukturelle Integrität und konservierten Abstände, zumindest theoretisch, der drei Disulfid-Bindungen in den chimären EGF-Wiederholungen, die durch die Religation erzeugt wurden, beibehielten (6, Konstrukte Nr. 4–14). Unglücklicherweise war die am weitesten 3' gelegene ClaI-Stelle gegen einen Verdau resistent, während die am zweitweitesten 3' gelegene ClaI-Stelle einen Bruch zwischen den EGF-Wiederholungen 30 und 31 bewirkte. Wenn dementsprechend verschiedene ClaI-Verdauungsfragmente in das Gerüst des vollständigen ClaI-Verdaus (Konstrukt Nr. 3 ΔCla) reinseriert wurden, wurde die Gesamtstruktur der EGF-Wiederholungen offensichtlich an der 3'-Verbindung unterbrochen.
Bezüglich dieser Reihe von Konstrukten sind mehrere Dinge bemerkenswert. Erstens vernichtete eine Entfernung des ClaI-Restriktionsfragments, welches einen Bruch in den EGF-Wiederholungen 9 und 17 bewirkte (Konstrukt Nr. 8 ΔEGF9–17), die Aggregation mit Delta, während eine Reinsertion dieses Stücks in das Konstrukt Nr. 3 ΔCla, dem die EGF-Wiederholungen 7–30 fehlen, die Aggregation bis auf grob Wildtyp-Niveaus wiederherstellte (Konstrukt Nr. 13 ΔCla + EGF9–17), was nahelegt, dass die EGF-Wiederholungen 9 bis 17 Sequenzen enthalten, die für die Bindung an Delta wichtig sind. Zweitens waren alle Konstrukte in dieser Reihe (Nr. 4–14) konsistent mit der Kartierung der Bindungsstelle auf die EGF-Wiederholungen 9 bis 17. Expressionskonstrukte, die diese Wiederholungen enthielten (Nr. 6, 7, 9, 10, 13) förderten Notch-Delta-Wechselwirkungen, während Konstrukte, denen diese Wiederholungen fehlten (Nr. 4, 5, 8, 11, 12, 14) dies nicht taten. Um zu bestätigen, dass die Unfähigkeit, mit Delta-Zellen zu aggregieren, nicht einfach auf ein Versagen des mutierten Notch-Proteins, die Zelloberfläche zu erreichen, zurückzuführen war, sondern tatsächlich die Deletion der notwendigen Bindungsstelle reflektierte, testeten wir auf eine Zelloberflächenexpression von allen Konstrukten durch immunfluoreszierendes Anfärben von lebenden transfizierten Zellen mit Antikörpern, die für die extrazelluläre Domäne von Notch spezifisch waren. Alle Konstrukte, die versagten, Notch-Delta-Wechselwirkungen zu vermitteln, erzeugten ein Protein, das an der Zelloberfläche normal exprimiert zu werden schien. Drittens aggregierten, obwohl der Aggregationsassay nicht quantitativ ist, zwei Konstrukte, die die EGF-Wiederholungen 9–17 enthielten, Nr. 9 ΔEGF17–26 oder am bemerkenswertesten Nr. 10 ΔEGF26–30 in einem anscheinend niedrigeren Ausmaß. Zellen, die mit den Konstrukten Nr. 9 ΔEGF17–26 und 10 ΔEGF26–30 transfiziert waren, zeigten beträchtlich weniger Oberflächenanfärbung als normal, obwohl fixierte und permeabilisierte Zellen, die mit dem gleichen Antikörper umgesetzt wurden, normal angefärbt wurden, was anzeigt, dass wir nicht einfach die Epitope, die durch die Antiseren erkannt werden, deletiert hatten. Durch Vergleichen des Prozentsatzes von transfizierten Zellen in entweder permeabilisierten oder lebenden Zellpopulationen fanden wir heraus, dass grob 50% der transfizierten Zellen für das Konstrukt Nr. 9 ΔEGF17–26 und 10% für das Konstrukt Nr. 10 ΔEGF26–30 nachweisbares Protein an der Zelloberfläche produzierten. Dementsprechend produzierten diese beiden Konstrukte Proteine, die oftmals versagten, die Zelloberfläche zu erreichen, vielleicht aufgrund einer fehlerhaften Faltung, wodurch die Fähigkeit von transfizierten Zellen, mit Delta exprimierenden Zellen zu aggregieren, verringert, aber nicht vernichtet wurde.
Nachdem wir die Bindungsstelle auf die EGF-Wiederholungen 9 bis 17 kartiert hatten, überprüften wir, ob irgendwelche Notch-Mutationen, deren molekulare Läsion bestimmt worden ist, auf diese Region kartierte. Die einzige derartige Mutation war split, ein halbdominantes Notch-Allel, das mit einer Punktmutation in der EGF-Wiederholung 14 korreliert (Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407–3417; Kelley et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094–3108). Tatsächlich enthüllte ein genetisches Screening auf „second site modifiers" (zweite kompensierende Modifi zierungsstellen) von split mehrere Allele von Delta, was eine spezielle Beziehung zwischen dem split-Allel von Notch und Delta nahelegt (Brand und Campus-Ortega, 1990, Roux's Arch. Dev. Biol. 198(5), 275–285). Um auf mögliche Auswirkungen der split-Mutation auf die Notch-Delta-vermittelte Aggregation zu testen, wurde ein 11 kb-Fragment, welches die mit split assoziierte Fehlsinn-Mutation enthielt, in das Notch-Expressionskonstrukt kloniert (Nr. 15 split). Jedoch blieb die Aggregation mit Delta exprimierenden Zellen in diesem Konstrukt unbeeinflusst, was nahelegt, wie durch nachfolgende Konstrukte bestätigt wurde, dass die EGF-Wiederholung 14 von Notch an den Wechselwirkungen mit Delta, die durch unseren Gewebekulturassay modellartig nachempfunden werden, nicht beteiligt war.
So verwendeten wir, um die Delta bindende Domäne innerhalb der EGF-Wiederholungen 9–17 weitergehend zu kartieren, spezifische Oligonukleotid-Primer und die PCR-Technik, um mehrere Unterfragmente dieser Region zu erzeugen. Um mit den Konstrukten Nr. 4–14, die Proteine produzierten, die in der Lage waren, mit Delta zu Wechselwirken, konsistent zu sein, gestalteten wir die Primer so, dass sie die EGF-Wiederholungen unmittelbar nach dem dritten Cystein an der gleichen Stelle wie die übliche ClaI-Stelle spleißten (7). Die resultierenden PCR-Produkte wurden in die ClaI-Stelle des Konstrukts Nr. 3 ΔCla ligiert. Es wurden drei überlappende Konstrukte, Nr, 16, 17 und 18, produziert; nur eine von diesen, Nr. 16 ΔCla + EGF9–13, erlaubte nach Transfektion von S2-Zellen damit eine Aggregation mit Delta-Zellen. Das Konstrukt Nr. 19, ΔCla + EGF(10–13), dem die EGF-Wiederholung 9 fehlt, definierte weiter die EGF-Wiederholungen 10–13 als die Region, die für Notch-Delta-Wechselwirkungen erforderlich ist.
Die Konstrukte Nr. 20–24 repräsentierten Versuche, diese Domäne unter Verwendung derselben PCR-Strategie sogar noch weiter einzuengen (siehe 7). Wir stellten uns zuerst die Frage, ob beide EGF-Wiederholungen 11 und 12 erforderlich waren, und zweitens, ob die flankierenden Sequenzen von den EGF-Wiederholungen 10 und 13 direkt an der Bindung an Delta beteiligt waren. Die Konstrukte Nr. 20 ΔCla + EGF(11–13), in welchem die EGF-Wiederholung 12 die einzige vollständige hinzugefügte Wiederholung ist, und Nr. 21 ΔCla + EGF(10–12), in welchem die EGF-Wiederholung 11 die einzige vollständige hinzugefügte Wiederholung ist, versagten, eine Aggregation zu vermitteln, was nahelegt, dass das Vorhandensein von entweder EGF-Wiederholung 11 oder 12 allein für Notch-Delta-Wechselwirkungen nicht ausreichend war. Da jedoch die 3'-Ligationsverbindungsstelle von diesen Konstrukten die Gesamtstruktur der EGF-Wiederholungen unterbrach, war es möglich, dass eine kurze „Puffer"zone benötigt wurde, um es der entscheidenden Wiederholung zu ermöglichen, normal zu funktionieren. Dementsprechend könnte beispielsweise in dem Konstrukt Nr. 19 ΔCla – EGF(10–13) die EGF-Wiederholung 12 nicht direkt an einer Bindung an Delta beteiligt sein, könnte aber stattdessen die minimale Menge an Puffersequenz, welche benötigt wird, um die Struktur von EGF-Wiederholung 11 zu schützen, wodurch Wechselwirkungen mit Delta ermöglicht werden, beitragen. Die Konstrukte Nr. 22–24 sprachen dieses Thema an. Wir gestalteten PCR-Primer, die einen Bruch an dem Ende der EGF-Wiederholung bewirkten und dementsprechend weniger wahrscheinlich die EGF-Disulfid-Bildung an der 3'-Ligationsverbindungsstelle zerstörten. Die Konstrukte Nr. 22 ΔCla + EGF(10–11), welches keine Aggregation vermittelte, und Nr. 23 ΔCla + EGF(10–12), welches dies tat, legten wiederum nahe, dass beide Wiederholungen 11 und 12 benötigt werden, während die flankierende Sequenz von Wiederholung 13 dies eindeutig nicht wird. Schließlich zeigte das Konstrukt Nr. 24 ΔCla + EGF(11–12), obwohl jetzt potentiell strukturell an der 5'-Verbindungsstelle unterbrochen, überzeugend, dass die Sequenzen aus der EGF-Wiederholung 10 nicht entscheidend sind. Dementsprechend schlagen wir basierend auf vollständig konsistenten Daten ausgehend von 24 Konstrukten vor, dass die EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch zusammen die kleinste funktionelle Einheit, die aus dieser Analyse erhältlich ist, definieren, die die notwendigen Stellen für eine Bindung an Delta in transfizierten S2-Zellen enthält.
7.2.2. EGF-WIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND FÜR EINE NOTCH-DELTA-VERMITTELTE AGGREGATION AUSREICHEND
Die große ClaI-Deletion, in welche PCR-Fragmente inseriert wurden (Nr. 3 ΔCla), bewahrt grob 1/3 der ursprünglichen 36 EGF-Wiederholungen wie auch die drei Notch/lin-12-Wiederholungen. Während diese eindeutig nicht ausreichend sind, um eine Aggregation zu fördern, ist es möglich, dass sie ein notwendiges Gerüst bilden, innerhalb von welchem spezielle EGF-Wiederholungen mit Delta Wechselwirken können. Um zu testen, ob nur einige wenige EGF-Wiederholungen tatsächlich ausreichend waren, um eine Aggregation zu fördern, gestalteten wir zwei Konstrukte Nr. 25, ΔEGF, in welchem alle 36 Wiederholungen mit Ausnahme der ersten zwei Drittel von Wiederholung 1 deletiert waren, und Nr. 30 ΔECN, in welchem der gesamte extrazelluläre Abschnitt von Notch mit Ausnahme des ersten Drittels von EGF-Wiederholung 1 und ~ 35 Aminosäuren unmittelbar vor der Transmembrandomäne deletiert war. Fragmente, die im Hintergrund von Konstrukt Nr. 3 ΔCla eine Notch-Delta-Aggregation vermittelt hatten, waren bei Insertion in das Konstrukt Nr. 25 ΔEGF wiederum in der Lage, Wechselwirkungen mit Delta zu fördern (Konstrukte Nr. 26–30). Analoge Konstrukte (Nr. 31, 32), in welchen die Notch/lin-12-Wiederholungen ebenfalls fehlten, vermittelten wieder erfolgreich eine Notch-Delta-Aggregation. Dementsprechend scheinen die EGF-Wiederholungen 11 und 12 als unabhängige modulare Einheiten zu funktionieren, die ausreichend sind, um Notch-Delta- Wechselwirkungen in S2-Zellen, sogar in Abwesenheit des größten Teils der extrazellulären Domäne von Notch, zu vermitteln.
7.2.3. EGF-WIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH BEWAHREN DIE CALCIUMABHÄNGIGKEIT EINER NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION

Wie in Abschnitt 6 weiter oben beschrieben (Fehon et al., 1990, Cell 61, 523–534), haben wir gezeigt, dass eine Notch-Delta-vermittelte S2-Zellaggregation calciumabhängig ist. Wir untersuchten dementsprechend die Fähigkeit von Zellen, welche bestimmte Deletionskonstrukte exprimieren, mit Delta exprimierenden Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca⁺⁺-Ionen zu aggregieren. Wir testeten die Konstrukte Nr. 1 pMtNMg als eine Kontrolle und Nr. 13, 16, 19, 23, 24, 26, 27 und 28 und haben festgestellt, dass Zellen, die in Ca⁺⁺ enthaltendem Medium bei 4°C gemischt wurden, leicht Aggregate bildeten, während Zellen, die in Ca⁺ ⁺-freiem Medium, enthaltend EGTA, gemischt wurden, versagten, zu aggregieren (Tabelle III). TABELLE III WIRKUNG VON EXOGENEM Ca⁺⁺ AUF EINE NOTCH-DELTA-AGGREGATION^a

		Ohne Ca⁺⁺-Ionen	Mit Ca⁺⁺-Ionen
1.	pMtNMg	0	37
13.	ΔCla + EGF(9–17)	0	31
16.	ΔCla + EGF(9–13)	0	38
19.	ΔCla + EGF(10–13)	0	42
23.	ΔCla + EGF(10–12)	0	48
29.	ΔEGF + EGF(10–12)	0	44
32.	ΔECN + EGF(10–12)	0	39
33.	ΔCla + XEGF(10–13)	0	34

^aDaten aufgeführt als Prozentsatz von Notch exprimierenden Zellen, die in Aggregaten gefunden werden (wie in 6).

Eindeutig ist die Calciumabhängigkeit der Wechselwirkung sogar in dem kleinsten Konstrukt bewahrt geblieben, was mit der Annahme konsistent ist, dass die minimalen Konstrukte, welche die EGF-Wiederholungen 11 und 12 enthalten, an Delta in einer ähnlichen Weise zu je ner von Volllängen-Notch binden. Dieses Ergebnis ist auch interessant im Lichte von neueren Untersuchungen, welche vermuten, dass EGF-artige Wiederholungen mit einer bestimmten Consensus-Sequenz als Ca⁺ ⁺-bindende Domänen wirken könnten (Morita et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698–5704; Sugo et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705–5710; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475–480). Über die Hälfte der EGF-Wiederholungen in Notch, einschließlich der Wiederholungen 11 und 12, stimmen mit dieser Consensus-Sequenz überein, was das Argument weiter stärkt, dass die EGF-Wiederholungen 11 und 12 für das Fördern von Notch-Delta-Wechselwirkungen verantwortlich sind.
7.2.4. DIE DELTA BINDENDE FUNKTION DER EGF-WIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH IST IN DEM XENOPUS-HOMOLOG VON NOTCH KONSERVIERT
Nachdem die Delta bindende Stelle auf die EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch kartiert worden ist, waren wir daran interessiert, die Frage zu stellen, ob diese Funktion in dem Notch-Homolog, das in Xenopus identifiziert worden ist (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438–1441), konserviert ist. Dieses Protein zeigt eine überraschende Ähnlichkeit zu Drosophila-Notch in der Gesamtstruktur und Organisation. Beispielsweise ist innerhalb der EGF-Wiederholungsregion sowohl die Anzahl als auch die lineare Organisation der Wiederholungen bewahrt geblieben, was ebenfalls eine mögliche funktionelle Konservierung nahe legt. Um dies zu testen, stellten wir PCR-Primer basierend auf der Xenopus-Notch-Sequenz (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438–1441) her und verwendeten diese, um ein ~ 350 bp-Fragment aus einer Xenopus-Stage 17-cDNA-Bibliothek, das die EGF-Wiederholungen 11 und 12 flankiert durch die Hälfte der Wiederholungen 10 und 13 auf jeder Seite umfasst, zu erhalten. Dieses Fragment wurde in das Konstrukt Nr. 3 ΔCla kloniert und drei unabhängige Klone wurde auf eine Fähigkeit mit Delta in dem Zellkultur-Aggregationsassay zu Wechselwirken, getestet. Zwei der Klone, Nr. 33a&b ΔCla + XEGF(10–13) waren bei Transfektion von S2-Zellen damit in der Lage, Notch-Delta-Wechselwirkungen in einem Ausmaß grob äquivalent zu dem analogen Drosophila-Notch-Konstrukt Nr. 19 ΔCla + EGF(10–13) und wieder in einer Calcium-abhängigen Weise zu vermitteln (Tabelle III). Jedoch versagte der dritte Klon, Nr. 33c ΔCla + XEGF(10–13), Notch-Delta-Wechselwirkungen zu vermitteln, obwohl das Protein normal an der Zelloberfläche exprimiert wurde, wie anhand einer Anfärbung von lebenden unpermeabilisierten Zellen beurteilt wurde. Ein Sequenzvergleich des Xenopus-PCR-Produkts in den Konstrukten Nr. 33a und 33c enthüllte eine Fehlsinn-Mutation, welche zu einer Leucin→Prolin-Veränderung (Aminosäure Nr. 453, Coffman et al., 1990, Science 249, 1438–1441) in der EGF-Wiederholung 11 von Konstrukt Nr. 33c führte. Obwohl dieser Rest zwischen Drosophila- und Xenopus-Notch nicht konserviert ist (8), könnte die Einführung eines Prolinrests leicht die Struktur der EGF-Wiederholung stören und sie folglich daran hindern, mit Delta korrekt wechselzuwirken.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Drosophila- und Xenopus-Notch enthüllt ein hohes Ausmaß an Aminosäureidentität, einschließlich der Calcium bindenden Consensus-Sequenz (8, SEQ ID NO: 1 und NO: 2). Jedoch ist das Ausmaß an Homologie nicht überraschend unterschiedlich von jenem, das zwischen den meisten der anderen EGF-Wiederholungen besteht, welche insgesamt etwa 50% Identität auf der Aminosäureebene zeigen. Diese eins-zu-eins-Korrespondenz zwischen individuellen EGF-Wiederholungen legt nahe, dass vielleicht auch sie konservierte funktionelle Einheiten umfassen könnten. Delta-Wechselwirkungen, wieder in einer Calciumionen-abhängigen Weise.
7.3. DISKUSSION
Wir haben unsere Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen den Proteinprodukten der Gene Notch und Delta unter Verwendung des in Abschnitt 6 oben beschriebenen in vitro-S2-Zellaggregationsassays fortgesetzt. Basierend auf einer intensiven Deletionsanalyse der extrazellulären Domäne von Notch zeigen wir, dass die Regionen von Notch, welche die EGF-homologen Wiederholungen 11 und 12 enthalten, beide für eine Notch-Delta-vermittelte Aggregation erforderlich und ausreichend sind und dass dieses Delta-Bindungsvermögen in den gleichen zwei EGF-Wiederholungen von Xenopus-Notch konserviert geblieben ist. Unsere Feststellung, dass die Aggregation auf die EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch kartierte, zeigt, dass die EGF-Wiederholungen von Notch auch als spezifische Proteinbindungsdomänen wirken.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass EGF-Domänen, welche eine spezielle Consensus-Sequenz enthalten, Ca⁺⁺-Ionen binden können (Morita et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5698–5704; Sugo et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 5705–5710; Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053–2061; Handford et al., 1990, EMBO J. 9, 475–480). Tatsächlich stimmt etwa eine Hälfte der EGF-Wiederholungen in Notch, einschließlich der Wiederholungen 11 und 12, mit dieser Consensus-Sequenz überein. Wir haben gezeigt, dass exogenes Ca⁺⁺ für eine Notch-Delta-vermittelte Aggregation von transfizierten S2-Zellen erforderlich war (siehe Abschnitt 6; Fehon et al., 1990, Cell 61, 523–534). Wir testeten eine Untergruppe von unseren Deletionskonstrukten und haben festgestellt, dass die EGF-Wiederholungen 11 und 12 allein (Nr. 32 ΔECN + EGF(11–12)) ausreichend waren, um die Ca⁺⁺-Abhängigkeit von Notch-Delta-Wechselwirkungen aufrechtzuerhalten.
Eine Anzahl von Untersuchungen hat nahegelegt, dass die genetischen Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta eine dosisempfindliche Wechselwirkung zwischen deren Pro teinprodukten reflektieren könnten. Genetische Untersuchungen haben darauf hingewiesen, dass die relativen Gendosen von Notch und Delta für eine normale Entwicklung entscheidend sind. Beispielsweise haben Xu et al. (1990, Genes Dev. 4, 464–475) herausgefunden, dass Nullmutationen bei Delta letale Wechselwirkungen zwischen heterozygoten Kombinationen von Abruptex (Ax)-Allelen, einer Klasse von Notch-Mutationen, die mit Fehlsinn-Mutationen innerhalb der EGF-Wiederholungen korreliert (Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407–3417; Kelley et al., 1987, Mol. Cell Biol. 6, 3094–3108), unterdrücken können. Die in vitro-Wechselwirkungen, die wir beschrieben haben, bei denen wir sowohl Notch-Delta- als auch Delta-Delta-Assoziationen beobachten (siehe Abschnitt 6), implizieren, dass eine kompetitive Wechselwirkung zwischen Notch und Delta bezüglich einer Bindung an Delta die zugrunde liegende Basis für die beobachteten genetischen Wechselwirkungen reflektieren könnte. Darüber hinaus waren wir in der Lage, Notch und Delta aus sowohl Gewebekultur- als auch embryonalen Zellextrakten coimmunzupräzipitieren (siehe Abschnitt 6), was eine mögliche in vivo-Assoziation der beiden Proteine anzeigt. Zusätzlich legen mRNA-in situ-Analysen von Notch- und Delta-Expressionsmustern in dem Embryo nahe, dass die Expression der zwei überlappt, aber nicht identisch ist (Kopczynski und Muskavitch, 1989, Development 107, 623–636; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407–3417). Eine detaillierte Antikörperanalyse der Notch-Proteinexpression während der Entwicklung hat unlängst enthüllt, dass eine Notch-Expression auf der Gewebe- und subzellulären Ebene stärker beschränkt ist, als frühere Untersuchungen angegeben hatten (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427–2440; Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113–1129).
Unsere Feststellung, dass die gleichen zwei EGF-Wiederholungen aus dem Xenopus-Notch-Homolog auch in der Lage sind, Wechselwirkungen mit Delta in Gewebekulturzellen zu vermitteln, spricht stark dafür, dass eine ähnliche Funktion in vivo konserviert geblieben sein wird. Obwohl diese beiden EGF-Wiederholungen in vitro ausreichend sind, ist es selbstverständlich möglich, dass in vivo möglicherweise mehr von dem Notch-Molekül notwendig ist, um Notch-Delta-Wechselwirkungen zu vereinfachen. Tatsächlich waren wir aus zwei Gründen etwas überrascht, festzustellen, dass die Delta bindende Stelle nicht auf EGF-Wiederholungen kartiere, wo mehrere der Ax-Mutationen nachgewiesen worden waren, erstens aufgrund des genetischen Screenings (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464–475), welches Wechselwirkungen zwischen Ax-Allelen und Delta-Mutationen aufgezeigt hat, und zweitens aufgrund von Sequenzanalysen, die gezeigt haben, dass bestimmte Ax-Allele mit einzelnen Aminosäureveränderungen innerhalb der mutmaßlichen Ca⁺⁺ bindenden Consensus-Sequenz der EGF-Wiederholungen assoziiert sind. Beispielsweise verändert die AX^E2-Mutation die EGF-Wiederholung 29 in Richtung der Ca⁺⁺ bindenden Consensus-Sequenz, während die AX^9B2-Mutation die EGF- Wiederholung 24 von der Consensus-Sequenz weg bewegt. Es ist möglich, dass in vivo diese Regionen des Notch-Proteins an Wechselwirkungen, entweder mit Delta und/oder anderen Proteinen, beteiligt sein können, die möglicherweise durch unseren Zellkulturassay nicht akkurat nachempfunden werden.
Unsere in vitro-Kartierung der Delta bindenden Domäne auf die EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch repräsentiert die erste Zuweisung von Funktion zu einer strukturellen Domäne von Notch. Tatsächlich legen die verschiedenen Deletionskonstrukte nahe, dass diese beiden EGF-Wiederholungen als eine modulare Einheit wirken, unabhängig von dem unmittelbaren Kontext, in welchen sie gesetzt werden. So erscheinen weder die restlichen 34 EGF-Wiederholungen noch die drei Notch/lin-12-Wiederholungen notwendig, um ein strukturelles Gerüst zu etablieren, welches für die EGF-Wiederholungen 11 und 12 erforderlich ist, um ihre Funktion zu entfalten. Interessanterweise wurde nahezu die gegenteilige Wirkung beobachtet: obwohl unser Aggregationsassay die Stärke der Wechselwirkung nicht misst, beobachteten wir, als wir die Bindungsstelle auf immer kleinere Fragmente einengten, eine Zunahme der Fähigkeit der transfizierten Zellen, mit Delta exprimierenden Zellen zu aggregieren, was nahelegt, dass die normalen flankierenden EGF-Sequenzen tatsächlich die Assoziation zwischen den Proteinen behindern. Für zwei separate Reihen von Konstrukten, entweder in dem Hintergrund von Konstrukt Nr. 3 ΔCla (vgl. Nr. 9, 16, 19, 23) oder in dem Hintergrund von Konstrukt Nr. 25 ΔEGF (vgl. Nr. 26, 27, 28), beobachteten wir eine Zunahme der Fähigkeit, zu aggregieren, so dass die kleinsten Konstrukte (Nr. 19, 23, 28, 29) konsistent oberhalb von Wildtyp-Niveaus (Nr. 1 pMtNMg) aggregierten. Diese Ergebnisse implizieren, dass die umgebenden EGF-Wiederholungen möglicherweise dazu dienen, die Fähigkeit der EGF-Wiederholungen 11 und 12, sich Delta anzunähern, zu begrenzen, wodurch vielleicht Notch-Delta-Wechselwirkungen in vivo moduliert werden.
Notch kodiert ein strukturell komplexes Transmembranprotein, von dem vorgeschlagen worden ist, dass es eine pleiotrope Rolle während der gesamten Drosophila-Entwicklung spielt. Die Tatsache, dass die EGF-Wiederholungen 11 und 12 als eine unabhängige modulare Einheit zu funktionieren scheinen, die zumindest in der Zellkultur für Wechselwirkungen mit Delta ausreichend ist, wirft unverzüglich die Frage nach der Rolle von den auf. Eine Hypothese ist, dass diese auch modulare Bindungsdomänen für andere Proteine, die mit Notch zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung Wechselwirken, bilden könnten.
Zusätzlich zu Xenopus-Notch kodieren lin-12 und glp-1, zwei Gene, von denen angenommen wird, dass sie ihre Funktion in Zell-Zell-Wechselwirkungen, die an der Spezifizierung von bestimmten Zellschicksalen während der C. elegans-Entwicklung beteiligt sind, entfalten, EGF-homologe Transmembranproteine, die strukturell relativ ähnlich zu Drosophila- und Xenopus-Notch sind. Alle vier Proteine enthalten EGF-homologe Wiederholungen, gefolgt von drei anderen cysteinreichen Wiederholungen (Notch/lin-12-Wiederholungen) in der extrazellulären Domäne, eine einzelne Transmembrandomäne und sechs cdc10/Ankyrin-Wiederholungen in der intrazellulären Region. Anders als Xenopus-Notch, das basierend sowohl auf Sequenzvergleichen als auch den Ergebnissen von unserem Delta-Bindungsassay wahrscheinlich das direkte funktionelle Gegenstück zu Drosophila-Notch kodiert, kodieren lin-12 und glp-1 wahrscheinlich unterschiedliche Mitglieder der gleichen Genfamilie. Ein Vergleich der vorhergesagten Proteinprodukte von lin-12 und glp-1 mit Notch enthüllen spezifische Unterschiede trotz einer insgesamt ähnlichen Organisation von strukturellen Motiven. Der offensichtlichste Unterschied besteht darin, dass lin-12 und glp-1-Proteine nur 13 bzw. 10 EGF-Wiederholungen im Vergleich zu den 36 für sowohl Xenopus- als auch Drosophila-Notch enthalten. Zusätzlich ist in den Nematoden-Genen die Anordnung von EGF-Wiederholungen nach der ersten EGF-Wiederholung durch einen unterschiedlichen Sequenzabschnitt, der in Notch fehlt, unterbrochen. Darüber hinaus haben wir in Bezug auf die Delta bindende Domäne diese als die EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch definiert; es gibt keine zwei aneinander angrenzenden EGF-Wiederholungen in den lin-12- oder glp-1-Proteinen, die die Ca⁺⁺ bindende Consensus-Sequenz zeigen noch irgendwelche zwei aneinander angrenzende Wiederholungen, welche eine hervorstechende Ähnlichkeit zu den EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch zeigen würden, was wiederum nahelegt, dass die lin-12- und glp-1-Genprodukte wahrscheinlich von Notch funktionell verschieden sind.
Unsere Feststellung, dass die EGF-Wiederholungen 11 und 12 von Notch eine diskrete Delta-bindende Einheit bilden, repräsentiert den ersten konkreten Hinweis, welcher die Idee stützt, dass jede EGF-Wiederholung oder kleine Untergruppe von Wiederholungen eine einzigartige Rolle während der Entwicklung, möglicherweise durch direkte Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, spielen könnte. Die Homologien, die zwischen der adhäsiven Domäne von Delta und Serrate festgestellt wurden (siehe Abschnitt 8.3.4. unten), legen nahe, dass der homologe Abschnitt von Serrate „adhäsiv" ist, indem er eine Bindung an andere toporhythmische Proteine vermittelt. Zusätzlich könnte das Gen scabrous, welches ein sekretiertes Protein mit Ähnlichkeit zu Fibrinogen kodiert, mit Notch Wechselwirken.
Zusätzlich zu der EGF-Wiederholung tritt üblicherweise eine Mehrzahl von Kopien von anderen strukturellen Motiven in verschiedenen Proteinen auf. Ein relevantes Beispiel ist das cdc10/Ankyrin-Motiv, von welchem sechs Kopien in der intrazellulären Domäne von Notch gefunden werden. Ankyrin enthält 22 von diesen Wiederholungen. Vielleicht könnten wiederholte Anordnungen von strukturellen Motiven allgemein eine lineare Anordnung einer Reihe von mo dularen Protein bindenden Einheiten repräsentieren. Angesichts dieser Ergebnisse zusammen mit der bekannten strukturellen, genetischen und entwicklungsbezogenen Komplexität von Notch könnte Notch mit einer Anzahl von unterschiedlichen Liganden in einem präzise regulierten zeitlichen und räumlichen Muster im Verlauf der Entwicklung Wechselwirken. Solche Kontextspezifischen Wechselwirkungen mit extrazellulären Proteinen könnten durch die EGF- und Notch/lin-12-Wiederholungen vermittelt werden, während Wechselwirkungen mit zytoskeletalen und zytoplasmatischen Proteinen durch die intrazellulären cdc10/Ankyrin-Motive vermittelt werden könnten.
8. DER AMINOTERMINUS VON DELTA IST EINE EGF-BINDENDE DOMÄNE, DIE MIT NOTCH UND DELTA WECHSELWIRKT
Eine Aggregation von kultivierten Zellen, die so programmiert waren, dass sie Wildtyp- und abgewandelte Delta-Proteine exprimieren, ist eingesetzt worden, um Delta-Sequenzen abzugrenzen, die für eine heterotypische Wechselwirkung mit Notch und homotypische Delta-Wechselwirkung erforderlich sind. Wir haben festgestellt, dass der Aminoterminus der extrazellulären Domäne von Delta für die Teilnahme von Delta an heterotypischen (Delta-Notch) und homotypischen (Delta-Delta)-Wechselwirkungen notwendig und ausreichend ist. Wir schließen daraus, dass der Aminoterminus von Delta eine EGF-Motiv-bindende Domäne (EBD) ist, angesichts dessen, dass EGF-artige Sequenzen von Notch ausreichend sind, um eine heterotypische Wechselwirkung mit Delta zu vermitteln. Die Delta-EBD weist offensichtlich zwei Aktivitäten auf: die Fähigkeit, EGF-verwandte Sequenzen zu binden, und die Fähigkeit zur Selbstassoziierung. Wir stellen auch fest, dass Delta durch kultivierte Zellen, die Notch exprimieren, aufgenommen wird, was eine Reflexion eines Mechanismus, durch welchen diese Proteine in vivo Wechselwirken, sein könnte.
8.1. MATERIALIEN UND METHODEN
8.1.1. ZELLLINIEN
Die S2-Zelllinie von Drosophila (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353–365)), die in diesen Experimenten verwendet wurde, wurde kultiviert, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
8.1.2. IMMUNOLOGISCHE SONDEN
Die Immunhistochemie wurde ausgeführt, wie in Abschnitt 6 oben beschrieben oder manchmal mit geringfügigen Modifizierungen dieser Prozedur. Eingesetzte Antiseren und Anti körper umfassten polyklonale Maus-anti-Delta-Seren, die gegen einen Sequenzabschnitt mit Delta-ELR-Anordnungen, der sich von dem vierten bis zum neunten ELR erstreckt, erzeugt worden waren (siehe Abschnitt 6); polyklonale Ratten-anti-Delta-Seren, die gegen den gleichen Delta-Sequenzabschnitt erzeugt worden waren (siehe Abschnitt 6); polyklonale Ratten-anti-Notch-Seren, die gegen einen Sequenzabschnitt mit Notch-ELR-Anordnungen, der sich von dem fünften bis zu dem dreizehnten ELR erstreckt, erzeugt worden waren; den monoklonalen Maus-Antikörper C17.9C6 (siehe Abschnitt 6), der die intrazelluläre Domäne von Notch erkennt; und den monoklonalen Maus-Antikörper BP-104 (Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697–709), der die lange Form von Drosophila-Neuroglian erkennt.
8.1.3. EXPRESSIONSVEKTOR-KONSTRUKTE
Konstrukte, die eingesetzt wurden, um die Expression von Wildtyp-Delta (pMTDl1) und Wildtyp-Notch (pMTNMg) zu programmieren, werden in Abschnitt 6 oben beschrieben. Konstrukte, die eine Expression von abgewandelten Delta-Proteine dirigieren, wurden unter Verwendung von pMTDl1 erzeugt, die Dl1-cDNA in Bluescript+ (pBSDl1; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723–1735) und pRmHa3-104 (A. J. Bieber, pers. Mitteilung), der aus der Insertion der 1B7A-250-cDNA in den Metallothioneinpromotor-Vektor pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043–1061) besteht und eine induzierbare Expression der langen Form von Drosophila-Neuroglian unterstützt (Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697–709), kloniert.
Kurz zusammengefasst, wurden Konstrukte, wie folgt, hergestellt:
Del(Sca–Nae) – pBSDl1 mit SalI (vollständiger Verdau) und ScaI (partiell) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren. pBSDl1 mit NaeI (partiell) und SalI (vollständig) schneiden, carboxylterminales kodierendes Fragment von Delta isolieren. Fragmente ligieren, transformieren und Klone isolieren. EcoRI-Insert in pRmHa-3 transferieren.
Del(Bam–Bgl) – pBSDl1 mit BglII (vollständig) und BamHI (partiell) schneiden, Enden mit Klenow-DNA-Polymerase auffüllen, ligieren, transformieren und Klone isolieren. EcoRI-Insert in pRmHa-3 transferieren.
Del(ELR1–ELR3) – Die Basenpaare 236–830 der Dl1-cDNA unter Verwendung von 5'-ACTTCAGCAACGATCACGGG-3' (SEQ ID NO: 26) und 5'-TTGGGTATGTGACAGTAATCG-3' (SEQ ID NO: 27) PCR-amplifizieren, mit T4-DNA-Polymerase behandeln, in mit ScaI (partiell) und BglII (vollständig) geschnittenen und hinsichtlich der Enden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllten pBSDl1 ligieren, transformieren und Klone isolieren. Carboxylterminales kodierendes BamHI-SalI-Fragment von Delta in pRmHa-3 transferieren.
Del(ELR4–ELR5) – pBSDl1 wurde bis zur Vollständigkeit mit BglII und partiell mit PstI verdaut. Das Vektor enthaltende 5,6 kb-Fragment wurde isoliert, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des Oligonukleotids 5'-GATCTGCA-3' zirkularisiert, eine Transformation durchgeführt und es wurden Klone isoliert. Das resultierende EcoRI-Insert wurde dann in pRmHa-3 transferiert.
Ter(Dde) – pBSDl1 mit DdeI (partiell) schneiden, die Enden mit Klenow-DNA-Polymerase auffüllen, mit einem 100-fachen molaren Überschuss von 5'-TTAAGTTAACTTAA-3' (SEQ ID NO: 28) ligieren, transformieren und Klone isolieren. EcoRI-Insert in pRmHa-3 transferieren.
Ins(Nae)A – pMTDl1 mit NaeI (partiell) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren, mit 100-fachem molarem Überschuss von 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO: 29) ligieren, transformieren und Klone isolieren.
NAE B – pMTDl1 wurde partiell mit NaeI verdaut und die Population von mutmaßlich linearisierten Kreisen von etwa 5,8 kb Länge wurde isoliert. Die Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des Oligonukleotids 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO: 29) rezirkularisiert und damit eine Transformation ausgeführt und es wurde ein Klon (NAE A), der eine Mehrzahl von Inserts des Linkers enthielt, isoliert. NAE A wurde bis zur Vollständigkeit mit BglII verdaut und die resultierenden 0,4 kb- und 5,4 kb-Fragmente wurden isoliert, ligiert und damit eine Transformation ausgeführt und es wurden Klone isoliert.
Ins(Stu) – pMTDl1 mit StuI (vollständig) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren, mit 100-fachem molarem Überschuss von 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO: 29) ligieren, transformieren und Klone isolieren.
STU B – pMTDl1 wurde vollständig mit StuI verdaut und das resultierende 5,8 kb-Fragment wurde isoliert. Das Fragment wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses des Oligonukleotids 5'-GGAAGATCTTCC-3' (SEQ ID NO: 29) rezirkularisiert und damit eine Transformation ausgeführt und es wurde ein Klon (STU A), der eine Mehrzahl von Inserts des Linkers enthielt, isoliert. STU B wurde bis zur Vollständigkeit mit BglII verdaut und die resultierenden 0,6 kb- und 5,2 kb-Fragmente wurden isoliert, ligiert und es wurde transformiert, und es wurden Klone isoliert.
NG1 – pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren. Ins(Nae)A mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig) schneiden, aminoterminales kodierendes Fragment von Delta isolieren. Fragmente ligieren, eine Transformation ausführen und Klone isolieren.
NG2 – pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren. Del(ELR1–ELR3) mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig) schneiden, aminoterminales kodierendes Fragment von Delta isolieren. Fragmente ligieren, eine Transformation ausführen und Klone isolieren.
NG3 – pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren. pMTDl1 mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig) schneiden, aminoterminales kodierendes Fragment von Delta isolieren. Fragmente ligieren, eine Transformation ausführen und Klone isolieren.
NG4 – pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren. Del(Sca-Nae) mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig) schneiden, aminoterminales kodierendes Fragment von Delta isolieren. Fragmente ligieren, eine Transformation ausführen und Klone isolieren.
NG5 – Del(Sca–Stu), wie folgt, erzeugen: pMTDlI mit ScaI (vollständig) und StuI (vollständig) schneiden, aminoterminales kodierendes ScaI-ScaI-Fragment und carboxyterminales kodierendes StuI-ScaI-Fragment isolieren, ligieren und damit eine Transformation ausführen und Klone isolieren. Del(Sca-Stu) mit EcoRI (vollständig) und BglII (vollständig) schneiden, aminoterminales kodierendes Fragment von Delta isolieren. pRmHa3-104 mit BglII (vollständig) und EcoRI (vollständig) schneiden, Vektor enthaltendes Fragment isolieren. Fragmente ligieren, eine Transformation ausführen und Klone isolieren.

Die Sequenzinhalte der verschiedenen Delta-Varianten sind in Tabelle IV gezeigt. Schematische Diagramme der Delta-Varianten, die in Tabelle IV definiert werden, sind in 9 gezeigt. TABELLE IV SEQUENZINHALTE VON DELTA-VARIANTEN, DIE IN DIESER UNTERSUCHUNG EINGESETZT WURDEN

	Nukleotide	Aminosäuren
Wildtyp	1–2892^A	1–833
Del(Sca–Nae)	1–235/734–2892	1–31/W/199–833
Del(Bam–Bgl)	1–713/1134–2892	1–191/332–833
Del(ELR1–ELR3)	1–830/1134–2892	1–230/332–833
Del(ELR4–ELR5)	1–1137/1405-2892	1–332/422–833
Ter(Dde)	1–2021/TTAAGTTAACTTAA^E/2227–2892	1–626/H
Ins(Nae)A	1–733/(GGAAGATCTTCC)_n ^F/734–2892^B	1–197/(RKIF)_n 198–833
NAE B	1–733/GGAAGATCTTCC^F/734–2892	1–197/RKIF 198–833
Ins(Stu)	1–535/(GGAAGATCTTCC)_n ^F/536–2892^B	1–131/G(KIFR)_n-1 KIFP/133–833
STU B	1–535/GGAAGATCTTCC^F/536–2892	1–131/GKIFP 133–833
NG1	1–733/GGAA/2889–3955(NG)^C	1–198/K/952–1302^D
NG2	1–830/2889–3955(NG)	1–230/952–1302
NG3	1–1133/2889–3955(NG)	1–331/952–1302
NG4	1–235/734–1133/2889–3955(NG)	1–31/199–331/952–1302
NG5	1–235/536–1133/2889–3955(NG)	1–31/S/133–952–1302

A Koordinaten für Delta-Sequenzen entsprechen der Sequenz der Dl1-cDNA (12).
B Die genaue Anzahl von inserierten Linker ist für dieses Konstrukt nicht bestimmt worden.
C Koordinaten für Neuroglian (Bieber et al., 1989, Cell 59, 447–460; Hortsch et al., 1990, Neuron 4, 697–709) -Nukleotidsequenzen, die in Delta-Neuroglian-Chimären vorhanden sind, entsprechen der Sequenz der 1B7A-250-cDNA (13, SEQ ID NO: 5) und sind in Fettdruck angegeben.
D Neuroglian-Aminosäuresequenzen sind abgeleitet von einer konzeptionellen Translation der 1B7A-250-cDNA-Nukleotidsequenz (13, SEQ ID NO: 5) und sind in Fettdruck angegeben.
E SEQ ID NO: 28
F SEQ ID NO: 29

8.1.4. AGGREGATIONSPROTOKOLLE
Zelltransfektion und -aggregation wurden, wie in Abschnitt 6 oben beschrieben, oder mit geringfügigen Modifizierungen davon ausgeführt.
8.2 ERGEBNISSE
8.2.1. AMINOTERMINALE SEQUENZEN INNERHALB DER EXTRAZELLULÄREN DOMÄNE VON DELTA SIND NOTWENDIG UND AUSREICHEND FÜR DIE HETEROTYPISCHE WECHSELWIRKUNG MIT NOTCH
Da wir vorausgesehen hatten, dass einige Delta-Varianten möglicherweise nicht effizient an der Zelloberfläche lokalisiert sind, untersuchten wir die Beziehung zwischen dem Expressionsgrad von Wildtyp-Delta und dem Aggregationsausmaß mit Notch exprimierenden Zellen, indem die Einsatzmenge von Delta-Expressionskonstrukt in unterschiedlichen Transfektionen variiert wurde. Wir haben festgestellt, dass die heterotypische Delta-Notch-Wechselwirkung in diesem Assay nur eine geringfügige Abhängigkeit von der Einsatzmenge von Delta über einen 10×-Bereich zeigt (9A). Angesichts der Robustheit der heterotypischen Wechselwirkung über den getesteten Bereich und unserer Beobachtungen, dass jede der Delta-Varianten, die wir eingesetzt haben, in transfizierten Zellen eine substantielle Anhäufung an der Oberfläche zeigte, schließen wir, dass die Unfähigkeit einer gegebenen Delta-Variante, eine heterotypische Aggregation zu unterstützen, höchstwahrscheinlich ein funktionelles Defizit, das jene Variante zeigt, wiederspiegelt, im Gegensatz zu dem Einfluss von verringerten Ausmaßen von Oberflächenexpression auf die heterotypische Aggregation.
Die Ergebnisse der Experimente zur heterotypischen Aggregation, die durch Delta-Varianten und Wildtyp-Notch vermittelt wird, sind in Tabelle V gezeigt.
Die Delta-Aminosäuren (AS) 1–230 sind das gegenwärtige minimale Sequenzintervall, das so definiert wird, dass es für eine Wechselwirkung mit Notch ausreichend ist. Dies beruht auf dem Erfolg von NG2-Notch-Aggregation. Innerhalb von diesem Intervall sind die Delta-AS 198–230 kritisch, da ihre Deletion in dem NG1-Konstrukt die Notch bindende Aktivität, die für das NG2-Konstrukt beobachtet wird, inaktivierte. Auch innerhalb von diesem Intervall sind die Delta-AS 32–198 kritisch, da ihre Deletion in dem NG4-Konstrukt ebenfalls die Notch-bindende Aktivität, die für das NG3-Konstrukt beobachtet wird, inaktivierte. Die Bedeutung der Delta-AS 192–230 wird auch unterstützt durch die Beobachtung, dass die Del(ELR1–ELR3)-Variante, die alle Delta-Aminosäuren mit Ausnahme der AS 231–331 enthält, Notch bindende Aktivität aufwies, während die Del(Bam–Bgl)-Variante, die alle Delta-Aminosäuren mit Ausnahme der AS 192–331 enthält, offensichtlich hinsichtlich Notch bindender Aktivität inaktiviert war.
Konformation und/oder Primärsequenz in der Nähe der Delta-AS 197/198 ist offensichtlich kritisch, da eine multimere Insertion des Tetrapeptids Arg-Lys-Ile-Phe [im Ein-Buchstaben-Code (siehe z. B. Lehninger et al., 1975, Biochemistry, 2. Auflage, S. 72), RKIF] (SEQ ID NO: 30) – zwischen diese beiden Reste wie in dem Ins(Nae)A-Konstrukt die Notch bindende Aktivität, die bei Wildtyp-Delta beobachtet wird, inaktivierte.
Zusätzlich impliziert die Beobachtung, dass das Del(ELR1–ELR3)-Konstrukt eine Aggregation unterstützte, dass ELR1–ELR3 für eine Delta-Notch-Wechselwirkung nicht erforderlich sind; die Beobachtung, dass das Del(ELR4–ELR5)-Konstrukt eine Aggregation unterstützte, impliziert, dass ELR4 und ELR5 für eine Delta-Notch-Wechselwirkung nicht erforderlich sind, und die Beobachtung, dass das Ter(Dde)-Konstrukt eine Aggregation unterstützte, impliziert, dass die intrazelluläre Delta-Domäne für eine Delta-Notch-Wechselwirkung nicht erforderlich ist.
8.2.2. AMINOTERMINALE SEQUENZEN INNERHALB DER EXTRAZELLULÄREN DOMÄNE VON DELTA SIND FÜR EINE HOMOTYPISCHE WECHSELWIRKUNG NOTWENDIG UND AUSREICHEND

Die Ergebnisse der Experimente zur homotypischen Aggregation, die durch Delta-Varianten vermittelt wird, sind in Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI DURCH DELTA-VARIANTEN VERMITTELTE HOMOTYPISCHE AGGREGATION

Konstrukt	Aggregiert	Unaggregiert	Exp. Nr.
Wild type	38(H)^A	175	1
	48(H)	171	2
	13(H)	95	3
	33(H)	173	4
	134(B)	72	5

Del(Sca-Nae)	0(H)	200	1
	0(H)	200	2
	0(H)	200	3
Del(Bam–Bgl)	0(H)	200	1
	0(H)	200	2
	0(H)	200	3
Del(ELR1–ELR3)	160(B)	62	1
	55(B)	80	2
	0(B)	200	3
	4(B)	203	4
	41(B)	234	5
	4(B)	366	6^B
	23(B)	325 (1:20)
	0(B)	400	7^B
	5(B)	347 (1:5)
	10(B)	228 (1:20)
	0(B)	400	8^B
	16(B)	346 (1:5)
	4(B)	268 (1:20)
	4(B)	500	9^C
	18(B)	500 (1:5)
	12(B)	271 (1:20)
	7(B)	128 (1:50)
	0(B)	500	10^C
	0(B)	500 (1:5)
	0(B)	500 (1:20)
	21(B)	246 (1:50)
	0(B)	500	11^C
	5(B)	500 (1:5)
	8(B)	177 (1:20)
	4(B)	69 (1:50)
Del(ELR4–ELR5)	21(H)	175	1
	29(H)	243	2
	35(H)	179	3
Ter(Dde)	53(H)	164	1
	33(H)	178	2
	36(H)	203	3
Ins(Nae)A	0(B)	200	1
	0(B)	200	2
	0(B)	200	3

A (H) gibt an, dass Zellen in einem 25 ml-Erlenmeyer-Kolben aggregiert wurden; (B) gibt an, dass Zellen in einer Mikrotiterplatte mit 12 Vertiefungen aggregiert wurden (siehe Materialien und Methoden).
B Transfizierte Zellen wurden über Nacht unter Aggregationsbedingungen inkubiert, dann in dem geeigneten Volumen von log-Phase-S2-Zellen in Gegenwart von Induktionsmittel verdünnt und unter Aggregationsbedingungen für weitere vier bis sechs Stunden inkubiert.
C Transfizierte Zellen, zu welchen Induktionsmittel hinzugesetzt worden war, wurden in dem geeigneten Volumen von log-Phase-S2-Zellen, zu welchen Induktionsmittel hinzugesetzt worden war, verdünnt und die Zellmischung wurde über Nacht unter Aggregationsbedingungen inkubiert.

Eine Deletion der Delta-AS 32–198 [Del(Sca–Nae)] oder Delta-AS 192–331 [Del(Bam–Bgl)] aus dem Volllängen-Delta-Protein eliminierte die Delta-Delta-Wechselwirkung. Eine Deletion der Delta-AS 231–331 [Del(ELR1–ELR3)] elimierte die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht. Dem entsprechend sind Sequenzen innerhalb der Delta-AS 32–230 für die Delta-Delta-Wechselwirkung erforderlich.
Konformation und/oder Primärsequenz in der Nähe der Delta-AS 197/198 sind offensichtlich für die Delta-Delta-Wechselwirkung kritisch, da eine multimere Insertion des Tetrapeptids -Arg-Lys-Ile-Phe (SEQ ID NO: 30) zwischen diesen beiden Resten, wie in dem Ins(Nae)A-Konstrukt, die Delta-Delta-Wechselwirkung inaktivierte.
Zusätzlich impliziert die Beobachtung, dass das Del(ELR1–ELR3)-Konstrukt eine Aggregation unterstützen konnte, dass ELR1–ELR3 für die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht benötigt werden; die Beobachtung, dass das Del(ELR–ELR5)-Konstrukt eine Aggregation unterstützte, impliziert, dass ELR4 und ELR5 für die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht benötigt werden, und die Beobachtung, dass das Ter(Dde)-Konstrukt eine Aggregation unterstützte, impliziert, dass die intrazelluläre Domäne von Delta für die Delta-Delta-Wechselwirkung nicht benötigt wird.

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse von Assays auf heterotypische und homotypische Aggregation mit verschiedenen Konstrukten ist in Tabelle VI A gezeigt. TABELLE VIA

DURCH WILDTYP-DELTA-PROTEIN UND DELTA-PROTEIN-VARIANTEN VERMITTELTE AGGREGATION
KONSTRUKT	HETEROTYPISCHE AGGREGATION^a	HOMOTYPISCHE AGGREGATION^b DELTA
KONSTRUKT	DELTA	HOMOTYPISCHE AGGREGATION^b DELTA	NOTCH
Wildtyp	33 ± 12	26 ± 11^c	27 ± 10^c
Del(Sca–Nae)	0	0	0
Del(Bam–Bgl)	0.4 ± 0.4	0.6 ± 0.6	0
Del(ELR1–ELR3)	25 ± 11^d	15 ± 3^d	32 ± 15^d
Del(ELR4–ELR5)	17 ± 2	18 ± 2	13 ± 2
Ter(Dde)	22 ± 1	18 ± 2	18 ± 3
NAE B	25 ± 5	0	27 ± 7
STU B	0	0	0
NG1	0	0	0
NG2	13 ± 1	23 ± 6	4 ± 1^d
NG3	16 ± 1	13 ± 1	27 ± 17
NG4	0	0	0.5 ± 0.3

a: Mittlerer Anteil (%) von Delta- oder Notch-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen (± Standardfehler). N = 3 Replikate, sofern nicht anders angegeben.
b: Mittlerer Anteil (%) von Delta-Zellen in Aggregaten von vier oder mehr Zellen (± Standardfehler). N = 3 Replikate, sofern nicht anders angegeben.
c: N = 5 Replikate.
d: N = 4 Replikate.

8.2.3. AN HETEROTYPISCHEN UND HOMOTYPISCHEN WECHSELWIRKUNGEN BETEILIGTE DELTA-SEQUENZEN SIND QUALITATIV VERSCHIEDEN
Die jeweiligen Merkmale von Delta-Sequenzen, die für heterotypische und homotypische Wechselwirkungen repariert (benötigt) werden, wurden weiter definiert unter Verwendung von Delta-Varianten, bei welchen kurze, im Raster vorliegende, translatierbare Linker-Insertionen in den Aminoterminus von Delta eingeführt worden waren (d. h. NAE B und STU B; 9, Tabelle VIA). Das Ersetzen des Delta-Rests 132 (A) durch das Pentapeptid GKIFP (STU B-Variante) führt zu der Inaktivierung von heterotypischen und homotypischen Wechselwirkungsaktivitäten des Delta-Aminoterminus. Dies legt nahe, dass einige Delta-Sequenzen, die für diese beiden unterschiedlichen Wechselwirkungen benötigt werden, zusammenfallen und in der Nähe von Rest 132 liegen. Andererseits elimiert eine Insertion des Tetrapeptids RKIF zwischen den Delta-Resten 197 und 198 (NAE B-Variante) die Fähigkeit des Delta-Aminoterminus, eine heterotypische Wechselwirkung mit Notch zu vermitteln, hat aber keine offensichtliche Auswirkung auf die Fähigkeit des veränderten Aminoterminus, eine homotypische Wechselwirkung zu vermitteln. Die Feststellung, dass die NAE B-Insertion nur eine der beiden Aktivitäten des Aminoterminus von Delta beeinflusst, impliziert, dass die Delta-Sequenzen, die heterotypische und homotypische Wechselwirkungen vermitteln, auch wenn sie zusammenfallen, qualitativ unterschiedlich sind.
8.2.4. DELTA WIRD DURCH ZELLEN, DIE NOTCH EXPRIMIEREN, AUFGENOMMEN
Im Verlauf von vielen heterotypischen Aggregationsexperimenten haben wir festgestellt, dass Delta-Protein manchmal innerhalb von Zellen gefunden werden kann, die so programmiert worden sind, dass sie Notch, nicht aber Delta exprimieren. Wir führen heterotypische Aggregationsassays aus durch Mischen von anfänglich separaten Populationen von S2-Zellen, die unabhängig mit Expressionskonstrukten, die eine Expression von entweder Delta oder Notch programmieren, transfiziert worden sind. Dennoch detektieren wir oftmals bei Verwendung von Delta-spezifischen Antiseren eine punktförmige Anfärbung von Delta innerhalb von Notch exprimierenden Zellen, die in heterotypischen Aggregaten gefunden wird. Unsere Beobachtungen sind konsistent mit einem direkten Binden von Delta an Notch an der Zelloberfläche und einer nachfolgende Clearance dieses Delta-Notch-Komplexes von der Zelloberfläche über Endozytose.
8.3. DISKUSSION
8.3.1. AMINOTERMINALE SEQUENZEN, DIE MIT EGF NICHT VERWANDT SIND, SIND AN DER WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DELTA UND NOTCH BETEILIGT
Wir haben Zellaggregationsassays eingesetzt, um eine Region innerhalb der aminoproximalen Region der extrazellulären Domäne von Delta zu definieren, die notwendig und ausreichend ist, um die Delta-Notch-Wechselwirkung zu vermitteln. Funktionelle Analysen einer Kombination von Deletionskonstrukten und Konstrukten, die nur (mutmaßlich) eben ausreichende Sequenzabschnitte enthielten („sufficiency constructs"), enthüllten, dass diese Region sich maximal von AS 1 bis AS 230 erstreckt. Es ist überraschend, dass diese Region keine der EGF-artigen Sequenzen, die innerhalb der extrazellulären Domäne von Delta liegen, umfasst. Es ist wahrscheinlich, dass die besonderen Delta-Sequenzen innerhalb des ausreichenden Intervalls, die für eine Wechselwirkung mit Notch benötigt werden, die AS 198–230 umfassen, da eine Deletion dieser Reste Notch bindende Aktivität eliminiert. Die Tatsache, dass eine Deletion von AS 32–198 auch Notch bindende Aktivität inaktiviert, legt nahe, dass Sequenzen, die sich aminoproximal zu AS 198 befinden, auch benötigt werden, obwohl der schädliche Einfluss dieser Deletion aus der Entfernung von zusätzlichen Aminosäuren in der unmittelbaren Nähe von AS 198 resultieren könnte.
Sequenzen innerhalb von Delta, welche für eine Wechselwirkung mit Notch ausreichend sind, können in drei Unterdomänen – N1, N2 und N3 –, welche sich in ihren jeweiligen Gehalten von Cysteinresten unterscheiden (10, SEQ ID NO: 3), eingruppiert werden. Die N1- und N3-Domänen enthalten jeweils sechs Cysteinreste, während die N2-Domäne keinen enthält. Die gerade Anzahl von Cysteinen, die in N1 bzw. N3 vorhanden ist, lässt die Möglichkeit zu, dass die jeweiligen Strukturen von diesen Unterdomänen teilweise durch die Bildung von bestimmten Disulfid-Bindungen bestimmt werden. Das breite organisatorische Muster des Delta-Aminoterminus ist auch allgemein analog zu jenem der extrazellulären Domäne des EGF-Rezeptors der Vertebraten (Lax et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1970–1978), in welcher Sequenzen, von welchen angenommen wird, dass sie mit EGF Wechselwirken, durch zwei Cystein-reiche Unterdomänen begrenzt werden.
8.3.2. FÜR HOMOTYPISCHE UND FÜR HOMOTYPISCHE HETEROTYPISCHE WECHSELWIRKUNGEN BENÖTIGTE DELTA-SEQUENZEN SCHEINEN ZUSAMMENZUFALLEN
Unsere Ergebnisse zeigen auch an, dass Sequenzen, die für eine homotypische Delta-Wechselwirkung essentiell sind, innerhalb des Intervalls AS 32–230 liegen. Eine Deletion von Sequenzen oder eine Insertion von zusätzlichen Aminosäuren innerhalb dieser aminoproximalen Domäne eliminieren die Fähigkeit von solchen Delta-Varianten, allein Zellaggregation zu fördern. Dementsprechend kartieren Sequenzen, die für eine Delta-Delta-Wechselwirkung benötigt werden, innerhalb derselben Domäne des Proteins wie jene, die für eine Delta-Notch-Wechselwirkung benötigt werden.
8.3.3. DER DELTA-AMINOTERMINUS BILDET EIN EGF BINDENDES MOTIV
Die in den Beispielen weiter oben beschriebenen Arbeiten haben enthüllt, dass Notch-Sequenzen, die für eine Delta-Notch-Wechselwirkung in dem Zellaggregationsassay benötigt werden, innerhalb des Bereichs mit der Anordnung von EGF-artigen Wiederholungen der extrazellulären Domäne von Notch kartieren. Diese Feststellung impliziert, dass Delta und Notch aufgrund der Bindung des Delta-Aminoterminus an EGF-artige Sequenzen innerhalb von Notch Wechselwirken, und dementsprechend, dass der Aminoterminus der extrazellulären Domäne von Delta eine EGF bindende Domäne bildet (11).
Diese Ergebnisse werfen auch die Frage nach der Möglichkeit auf, dass eine homotypische Delta-Wechselwirkung die Bindung des Aminoterminus von Delta an EGF-artige Sequenzen innerhalb der extrazellulären Domäne von Delta umfasst (12). Jedoch ist keine der EGF-artigen Wiederholungen innerhalb der extrazellulären Domäne von Delta identisch mit irgendeiner der EGF-artigen Wiederholungen innerhalb der extrazellulären Domäne von Notch (13, SEQ ID NO: 6; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567–581). Angesichts dieser Tatsache weist, wenn homotypische Wechselwirkungen von Delta tatsächlich durch Wechselwirkung zwischen dem Delta-Aminoterminus und EGF-artigen Wiederholungen von Delta vermittelt werden, dann die EGF-bindende Domäne von Delta die Fähigkeit auf, mit wenigstens zwei unterschiedlichen EGF-artigen Sequenzen zu Wechselwirken.
8.3.4. AN DER DELTA-NOTCH-WECHSELWIRKUNG BETEILIGTE DELTA-SEQUENZEN SIND IN DEM SERRATE-PROTEIN KONSERVIERT
Ein Alignment (auf Homologie basierende wechselseitige Ausrichtung) von Aminosäuresequenzen aus den Aminotermini von Delta (13, SEQ ID NO: 6, und 15, SEQ ID NO: 9) und Serrate (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4, 2188–2201; Thomas et al., 1991, Devel. 111, 749–761) enthüllt eine überraschende Konservierung von strukturellem Charakter und Sequenzzusammensetzung. Die allgemeine N1-N2-N3-Unterdomänenstruktur des Aminotermi nus von Delta wird auch innerhalb des Aminoterminus von Serrate beobachtet wie dies das spezifische Vorkommen von sechs Cysteinresten innerhalb der Delta-N1- und Delta-N3-homologen Domänen des Serrate-Proteins wird. Zwei bemerkenswerte Blöcke von Konservierung entsprechen den Delta-AS 63–73 (8/11 Reste identisch) und den Delta-AS 195–206 (10/11 Reste identisch). Der letztgenannte Block ist von besonderem Interesse, da eine Insertion von zusätzlichen Aminosäuren in diesem Intervall die Fähigkeit von Delta, an Notch oder Delta zu binden, eliminieren kann.
8.3.5. AN CIS- UND TRANS-WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN DELTA UND NOTCH KÖNNEN UNTERSCHIEDLICHE SEQUENZEN INNERHALB VON NOTCH BETEILIGT SEIN
Eine Inspektion der Gesamtstrukturen von Delta und Notch legt nahe, dass an einer Delta-Notch-Wechselwirkung Kontakte zwischen der EGF-bindenden Domäne von Delta mit einer von zwei Regionen innerhalb von Notch abhängig davon, ob die Wechselwirkung zwischen Molekülen stattfand, die sich auf einander gegenüberliegenden Membranen oder innerhalb derselben Membran befinden, beteiligt sein könnten (11). Die Zellaggregationsassays, die mutmaßlich die Wechselwirkung von Molekülen in einander gegenüberliegenden Membranen nachweisen, implizieren, dass die EGF-bindende Domäne von Delta mit den EGF-artigen Wiederholungen 11 und 12 von Notch wechselwirkt (siehe Beispiele weiter oben). Wenn Tandem-Anordnungen von EGF-artigen Motiven innerhalb der Delta- und Notch-Proteine tatsächlich stabartige Strukturen bilden (Engel, 1989, FEBS Lett. 251, 1–7), dann würde die geschätzte Verlagerung der EGF-bindenden Domäne von Delta von der Zelloberfläche mutmaßlich ausreichend sein, um die starre Anordnung der EGF-artigen Wiederholungen 1–10 von Notch unterzubringen. Es ist auch interessant, anzumerken, dass die Verlagerung der EGF-bindenden Domäne von Delta von der Zelloberfläche diese Domäne in der Nähe der EGF-artigen Wiederholungen von Notch (25–29), die durch Abruptex-Mutationen betroffen sind, platzieren könnte (Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407–3417; Kelley et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 6, 3094–3108) und eine Wechselwirkung von Delta- und Notch-Proteinen, die innerhalb derselben Membran vorhanden sind, ermöglichen könnte.
8.3.6. WECHSELWIRKUNGEN ANALOG ZU DER DELTA-NOTCH-WECHSELWIRKUNG IN VERTEBRATEN
Angesichts der Wechselwirkung zwischen Delta und Notch in Drosophila ist es relativ wahrscheinlich, dass ein Delta-Homolog (Helta?) in Vertebraten existiert und dass die qualitati ven und molekularen Aspekte der Delta-Notch- und Delta-Delta-Wechselwirkungen, die wir in Drosophila definiert haben, in Vertebraten, einschließlich der Menschen, hochgradig konserviert sein werden. Solche Homologe können kloniert und sequenziert werden, wie weiter oben, Abschnitt 5.2., beschrieben.
9. SEQUENZEN, DIE NOTCH-SERRATE-WECHSELWIRKUNGEN VERMITTELN
Wir berichten über eine neue molekulare Wechselwirkung zwischen Notch und Serrate und zeigen, dass die beiden EGF-Wiederholungen von Notch, die Wechselwirkungen mit Delta vermitteln, nämlich die EGF-Wiederholungen 11 und 12, auch eine Serrate bindende Domäne bilden.
Um zu testen, ob Notch und Serrate direkt Wechselwirken, wurden S2-Zellen mit einem Serrate-Expressionskonstrukt transfiziert und in unserem Aggregationsassay mit Notch exprimierenden Zellen gemischt. Für das Serrate-Expressionskonstrukt wurde ein synthetischer Primer, welcher eine künstliche BamHI-Stelle unmittelbar 5' zu dem Initiator-AUG an Position 442 enthält (alle Sequenznummern sind gemäß Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188–2201) und bis zur Position 464 homolog ist, in Verbindung mit einem zweiten Primer von Position 681–698 verwendet, um ein DNA-Fragment von ~ 260 Basenpaaren zu erzeugen. Dieses Fragment wurde mit BamHI und KpnI (Position 571) geschnitten und in Bluescript KS+ (Stratagene) ligiert. Dieses Konstrukt, BTSer5'PCR, wurde durch Sequenzieren überprüft, dann mit KpnI geschnitten. Das Serrate-KpnI-Fragment (571–2981) wurde inseriert und in der korrekten Orientierung selektiert, um BTSer5'PCR-Kpn zu erzeugen. Das 5'-SacII-Fragment von BTSer5'PCR-Kpn (SacII-Stellen in Bluescript-Polylinker und in Serrate (1199)) wurde isoliert und verwendet, um das 5'-SacII-Fragment der cDNA Cl (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188–2201) zu ersetzen, wodurch die Volllängen-Serrate-cDNA abzüglich der 5'-untranslatierten Regionen regeneriert wurde. Dieses Insert wurde durch einen SalI- und partiellen BamHI-Verdau isoliert und in die BamHI- und SalI-Stellen von pRmHa-3 geshuttelt, um das endgültige Expressionskonstrukt Ser-mtn zu erzeugen.
Wir haben festgestellt, dass Serrate exprimierende Zellen an Notch exprimierende Zellen in einer Calcium-abhängigen Weise anhaften (6 und Tabelle VII). Jedoch scheint Serrate anders als Delta unter den getesteten Versuchsbedingungen nicht homotypisch zu Wechselwirken. Zusätzlich weisen wir keine Wechselwirkungen zwischen Serrate und Delta nach. TABELLE VII Wirkung von exogenem Ca⁺⁺ auf die Notch-Serrate-Aggregation^a

Notch-Serrate

Ohne Ca⁺⁺ Mit Ca⁺⁺

1. pMtNMg 0 15

32. ΔECN + EGF(10–12) 0 13

33. ΔCla + XEGF(10–13) 0 15

^aDaten aufgeführt als Prozentsätze von Notch exprimierenden Zellen, die in Aggregaten gefunden werden (wie in 6). Alle Zahlen stammen aus einzelnen Transfektionsexperimenten (anstelle eines Durchschnitts von Werten aus mehreren separaten Experimenten wie in 6).

Wir haben eine Untergruppe von unseren Notch-Deletionskonstrukten getestet, um die Serrate bindende Domäne zu kartieren, und haben herausgefunden, dass die EGF-Wiederholungen 11 und 12 zusätzlich zu einem Binden an Delta auch Wechselwirkungen mit Serrate vermitteln (6; Konstrukte Nr. 1, 7–10, 13, 16, 17, 19, 28 und 32). Zusätzlich scheint die Serrate bindende Funktion von diesen Wiederholungen auch in den entsprechenden zwei EGF-Wiederholungen von Xenopus-Notch konserviert geblieben zu sein (Nr. 33 ΔCla + XEGF(10–13)). Diese Ergebnisse zeigen unzweideutig, dass Notch mit sowohl Delta als auch Serrate wechselwirkt und dass dieselben zwei EGF-Wiederholungen von Notch beide Wechselwirkungen vermitteln. Wir waren auch in der Lage, die Serrate-Region, die für die Notch/Serrate-Aggregation essentiell ist, zu definieren. Ein Deletieren der Nukleotide 676–1287 (d. h. der Aminosäuren 79–282) (siehe 15) eliminiert die Fähigkeit des Serrate-Proteins, mit Notch zu aggregieren.
Notch und Serrate scheinen weniger effizient zu aggregieren als Notch und Delta, vielleicht da die Notch-Serrate-Wechselwirkung schwacher ist. Wenn beispielsweise Notch-Delta-Aggregate bewertet werden, weisen wir ~ 40% von allen Notch exprimierenden Zellen in Cluster mit Delta exprimierenden Zellen (6, Nr. 1 pMtNMg) und ~ 40% von allen Delta exprimierenden Zellen in Kontakt mit Notch exprimierenden Zellen nach. Für Notch-Serrate finden wir nur ~ 20% von allen Notch exprimierenden Zellen (6; pMtNMg) und ~ 15% von allen Serrate exprimierenden Zellen in Aggregaten. Für die verschiedenen getesteten Notch-Deletionskonstrukte weisen wir konsistent eine Verringerung des Ausmaßes an Aggregation zwischen Notch und Serrate verglichen mit den entsprechenden Notch-Delta-Ausmaßen (6) nach mit der möglichen Ausnahme der Konstrukte Nr. 9 und 10, die stark verringerte Ausmaße von Aggregation sogar mit Delta zeigen. Eine triviale Erklärung für dieses verringerte Ausmaß an Aggregation könnte sein, dass unser Serrate-Konstrukt einfach nicht so viel Protein an der Zelloberfläche wie das Delta-Konstrukt exprimiert, wodurch die Stärke der Wechselwirkung verringert wird. Alternativ könnte der Unterschied bei der Wechselwirkungsstärke auf einen fundamentalen funktionellen Unterschied zwischen Notch-Delta- und Notch-Serrate-Wechselwirkungen, der in vivo signifikant sein könnte, hinweisen.
10. DIE KLONIERUNG, SEQUENZIERUNG UND EXPRESSION VON HUMANEM NOTCH
10.1. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON HUMANEM NOTCH
Klone für die humane Notch-Sequenz waren ursprünglich unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), um DNA aus einer cDNA-Bibliothek aus Hirnmaterial eines 17–18 Wochen alten humanen Fötus zu amplifizieren, in dem Lambda Zap II-Vektor (Stratagene) erhalten worden. Degenerierte Primer zur Verwendung in dieser Reaktion wurden gestaltet, indem die Aminosäuresequenzen des Xenopus-Homologs von Notch mit Drosophila-Notch verglichen wurden. Es wurden drei Primer (cdc1 (SEQ ID NO: 10), cdc2 (SEQ ID NO: 11) und cdc3 (SEQ ID NO: 12); 16) gestaltet, um als Primerpaare cdc1/cdc2 bzw. cdc1/cdc3 entweder ein 200 bp- oder ein 400 bp-Fragment zu amplifizieren.
Das auf diese Weise erhaltene 400 bp-Fragment wurde dann als eine Sonde verwendet, mit welcher die gleiche Bibliothek auf humane Notch-Klone gescreent werden sollte. Das ursprüngliche Screening ergab drei einzigartige Klone, hN3k, hN2K und hN5k, von denen allesamt durch nachfolgende Sequenzanalyse gezeigt wurde, dass sie in dem 3'-Ende von humanem Notch gelegen sind (17). Ein zweites Screening unter Verwendung des 5'-Endes von hN3k als Sonde wurde vorgenommen, um nach Klonen zu suchen, welche das 5'-Ende von humanem Notch umfassten. Aus diesem Screening wurde ein einzigartiger Klon hN4k erhalten und vorläufige Sequenzierungsdaten weisen daraufhin, dass er den größten Teil des 5'-Endes des Gens enthält (17). Zusammen umfassen die Klone hN4k, hN3k und hN5k etwa 10 kb des humanen Notch-Homologs, beginnend frühzeitig in den EGF-Wiederholungen und sich erstreckend in die 3'-untranslatierte Region des Gens. Alle drei Klone sind cDNA-Inserts in die EcoRI-Stelle von pBluescript SK⁺ (Stratagene). Der E. coli-Wirtsstamm ist XL1-Blue (siehe Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S. A12).
Es wurde die Sequenz von verschiedenen Abschnitten von Notch, die in den cDNA-Klonen enthalten waren, bestimmt (durch Verwendung von Sequenase^®, U. S. Biochemical Corp.) und ist in den 19–22 gezeigt (SEQ ID NO: 13 bis NO: 25).
Die vollständigen Nukleotidsequenzen der humanen Notch-cDNA, die in hN3k und hN5k enthalten ist, wurden durch die Didesoxy-Kettenabbruchmethode unter Verwendung des Sequenase^®-Kits (U. S. Biochemical Corp.) bestimmt. Jene Nukleotidsequenzen, die humanes Notch kodierten, wurden leicht in dem geeigneten Leseraster identifiziert, da eine Translation in nur einem der drei möglichen Leseraster eine Sequenz ergibt, die nach Vergleich mit der veröffentlichten abgeleiteten Aminosäuresequenz von Drosophila-Notch eine Sequenz mit einem substantiellen Ausmaß an Homologie zu der Drosophila-Notch-Sequenz ergibt. Da es keine Introns gibt, wurde eine Translation aller drei möglicher Leseraster und ein Vergleich mit Drosophila-Notch leicht bewerkstelligt, was zu der schnellen Identifizierung der kodierenden Region führte. Die DNA- und abgeleiteten Proteinsequenzen der humanen Notch-cDNA in hN3k und hN5k sind in den 23 bzw. 24 aufgeführt. Der Klon hN3k kodiert einen Abschnitt eines Notch-Polypeptids, beginnend bei in etwa der dritten Notch/lin-12-Wiederholung bis zum carboxyterminalen Ende, an dem mehrere Aminosäuren fehlten. Der Klon hN5k kodiert einen Abschnitt eines Notch-Polypeptids beginnend in etwa vor der cdc10-Region bis zu dem Ende des Polypeptids und enthält auch eine 3'-untranslatierte Region.
Ein Vergleich der DNA- und Proteinsequenzen, aufgeführt in 23 (SEQ ID NO: 31 und NO: 32) mit jenen in 24 (SEQ ID NO: 33 und NO: 34) enthüllt signifikante Unterschiede zwischen den Sequenzen, was nahelegt, dass hN3k und hN5k einen Teil von zwei unterschiedlichen Notch-homologen Genen repräsentieren. Unsere Daten legen folglich nahe, dass das humane Genom mehr als ein Notch-homologes Gen beherbergt. Dies ist anders als bei Drosophila, wo Notch ein Einzelkopien-Gen zu sein scheint.
Ein Vergleich der DNA- und Aminosäuresequenzen der humanen Notch-Homologen, die in hN3k und hN5k enthalten sind, mit den entsprechenden Drosophila-Notch-Sequenzen (wie in Wharton et al., 1985, Cell 43: 567–581 veröffentlicht) und mit den entsprechenden Xenopus-Notch-Sequenzen (wie in Coffman et al., 1990, Science 249: 1438–1441 veröffentlicht oder verfügbar aus Genbank^® (Aufnahmenummer M33874)) enthüllte ebenfalls Unterschiede.
Die in 23 gezeigte Aminosäuresequenz (hN3k) wurde mit der vorhergesagten Sequenz des TAN-1-Polypeptids, das in 2 von Ellisen et al., August 1991, Cell 66: 649–661, gezeigt ist, verglichen. Zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden einige Unterschiede gefunden; jedoch ist die hN3k-Notch-Polypeptidsequenz insgesamt zu 99% identisch mit der entsprechenden TAN-1-Region (TAN-1-Aminosäuren 1455 bis 2506). Es wurden vier Unterschiede festgestellt: in der Region zwischen der dritten Notch/lin-12-Wiederholung und dem ersten cdc10-Motiv gibt es ein Arginin (hN3k) anstelle eines X (TAN-1-Aminosäure 1763); (2) es gibt ein Prolin (hN3k) anstelle eines X (TAN-1, Aminosäure 1787); (3) es gibt eine konservative Veränderung eines Asparaginsäurerests (hN3k) anstelle eines Glutaminsäurerests (TAN-1, Aminosäure 2495); und (4) die carboxyterminale Region unterscheidet sich zwischen den TAN-1-Aminosäuren 2507 und 2535 substantiell.
Die in 24 gezeigte Aminosäuresequenz (hN5k) wurde mit der vorhergesagten Sequenz des in 2 von Ellisen et al., August 1991, Cell 66: 649–661, gezeigten TAN-1-Polypeptids verglichen. Es wurden Unterschiede zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen gefunden. Das abgeleitete Notch-Polypeptid von hN5k ist zu 79% identisch mit dem TAN-1-Polypeptid (64% identisch mit Drosophila-Notch) in der cdc10-Region, die sowohl das cc10-Motiv (TAN-1-Aminosäuren 1860 bis 2217) als auch die gut konservierten flankierenden Regionen umfasst (25). Die cdc10-Region umspannt die Aminosäuren 1860 bis 2217 der TAN-1-Sequenz. Zusätzlich ist das durch hN5k kodierte Polypeptid zu 65% identisch mit dem TAN-1-Polypeptid (zu 44% identisch mit Drosophila-Notch) an dem carboxyterminalen Ende des Moleküls, das eine PEST (Prolin, Glutaminsäure, Serin, Threonin)-reiche Region enthält (TAN-1-Aminosäuren 2482 bis 2551) (25B). Der Abschnitt von 215 Aminosäuren, der zwischen den vorerwähnten Regionen liegt, ist unter jeglichen der Notch-homologen Klone, die durch hN3k, hN5k und TAN-1 repräsentiert werden, nicht gut konserviert. Weder das hN5k-Polypeptid noch Drosophila-Notch zeigen signifikante Ausmaße von Aminosäureidentität zu den anderen Proteinen in dieser Region (z. B. hN5k/TAN-1 = 24% Identität; hN5k/Drosophila-Notch = 11% Identität; TAN-1/Drosophila-Notch = 17% Identität). Im Gegensatz dazu weisen Xenopus-Notch (Xotch) (SEQ ID NO: 35), Ratten-Notch (SEQ ID NO: 36) und TAN-1 (SEQ ID NO: 37) weiterhin signifikante Ausmaße an Sequenzidentität miteinander auf (z. B. TAN-1/Ratten-Notch = 75% Identität, TAN-1/Xenopus-Notch = 45% Identität, Ratten-Notch/Xenopus-Notch = 50% Identität).
Schließlich enthüllte eine Untersuchung der Sequenz der intrazellulären Domänen der Vertebraten-Notch-Homologen, gezeigt in 25B, eine unerwartete Feststellung: alle von diesen Proteinen, einschließlich hN5k, enthalten ein mutmaßliches CcN-Motiv, welches mit Kerntargeting-Funktion assoziiert ist, in der konservierten Region, die der letzten der sechs cdc10-Wiederholungen folgt (25B). Obwohl Drosophila-Notch ein solches definiertes Motiv fehlt, enthüllte eine eingehendere Inspektion von dessen Sequenz das Vorhandensein einer möglichen bipartiten Kernlokalisierungssequenz (Robbins et al., 1991, Cell 64: 615–623) wie auch von möglichen CK II- und cdc2-Phosphorylierungsstellen, alle in relativer Nähe zu einander, wodurch möglicherweise ein alternativer Typ von CcN-Motiv definiert wird (25B).
10.2. EXPRESSION VON HUMANEM NOTCH
Es wurden Expressionskonstrukte hergestellt unter Verwendung der humanen Notch-cDNA-Klone, die in Abschnitt 10.1 oben diskutiert wurden. In den Fällen von hN3k und hN2k wurde der vollständige Klon aus seinem Vektor als ein EcoRI-Restriktionsfragment herausgeschnitten und in die EcoRI-Restriktionsstelle von jedem der drei pGEX-Vektoren (Glutathion-S-transferase-Expressionsvektoren; Smith und Johnson, 1988, Gene 7, 31–40) subkloniert. Dies ermöglicht die Expression des Notch-Proteinprodukts ausgehend von dem Subklon im korrekten Leseraster. In dem Falle von hN5k enthält der Klon zwei interne EcoRI-Restriktionsstellen, wodurch 2,6, 1,5 und 0,6 kb-Fragmente erzeugt werden. Sowohl das 2,6 als auch das 1,5 kb-Fragment sind auch in jeden der pGEX-Vektoren subkloniert worden.
Das pGEX-Vektorsystem war verwendet worden, um eine Expression von humanen Notch-Fusionsproteinen (chimären Proteinen) ausgehend von den nachfolgend beschriebenen Konstrukten zu erhalten. Die klonierte Notch-DNA wurde in jedem Falle im Raster in den geeigneten pGEX-Vektor inseriert. Jedes Konstrukt wurde dann mittels Elektroporation in Bakterien (E. coli) eingeführt und wurde als ein Fusionsprotein, welches die Notch-Proteinsequenzen fusioniert an den Carboxylterminus des Glutathion-S-transferase-Proteins enthielt, exprimiert. Eine Expression der Fusionsproteine wurde durch Analyse von bakteriellen Proteinextrakten durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestätigt, wobei ausgehend von Bakterien, die die pGEX-Plasmide mit und ohne die inserierte Notch-DNA enthielten, erhaltene Proteinextrakte verglichen wurden. Die Fusionsproteine waren in wässriger Lösung löslich und wurden aus bakteriellen Lysaten durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-beschichteter Agarose (da der Carboxylterminus von Glutathion-S-transferase an Glutathion bindet) gereinigt. Die exprimierten Fusionsproteine wurden durch einen Antikörper gegen Drosophila-Notch gebunden, wie durch Western-Blotting bestimmt wurde.
Die Konstrukte, die verwendet wurden, um humanes Notch-Glutathion-S-transferase-Fusionsproteine herzustellen, waren, wie folgt:
hNFP#2 – Es wurde PCR verwendet, um ein Fragment beginnend unmittelbar vor den cdc10-Wiederholungen an Nukleotid 192 des hN5k-Inserts bis unmittelbar vor der PEST-reichen Region an Nukleotid 1694 zu erhalten. Die DNA wurde dann mit BamHI und SmaI verdaut und das resultierende Fragment wurde in pGEX-3 ligiert. Nach der Expression wurde das Fusionsprotein durch Binden an Glutathion-Agarose gereinigt. Das gereinigte Polypeptid wurde auf einem 4–15%-Gradienten-Polyacrylamidgel quantifiziert. Das resultierende Fusionsprotein wies ein ungefähres Molekulargewicht von 83 kD auf.
hN3FP#1 – Das gesamte hN3k-DNA-Insert (Nukleotid 1 bis 3235) wurde aus dem Bluescript(SK)-Vektor durch Verdauen mit EcoRI herausgeschnitten. Die DNA wurde in pGEX-3 ligiert.
hN3FP#2 – Ein 3'-Segment von hN3k-DNA (Nukleotid 1847 bis 3235) plus etwas von dem Polylinker wurde aus dem Bluescript (SK)-Vektor durch Verdauen mit XmaI herausgeschnitten. Das Fragment wurde in pGEX-1 ligiert.
Nach Reinigung werden diese Fusionsproteine verwendet, um entweder polyklonale und/oder monoklonale Antikörper gegen humanes Notch herzustellen.
11. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Die folgenden rekombinante Bakterien, welches jeweils ein Plasmid trugen, welches einen Abschnitt von humanem Notch kodierte, wurden am 02. Mai 1991 bei der American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter den Vorschriften des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.

Bakterien tragend Plasmid ATCC-Aufnahmenummer

E. coli XL1-Blue hN4k 68610

E. coli XL1-Blue hN3k 68609

E. coli XL1-Blue hN5k 68611
Die Erfindung soll nicht im Umfang durch die hinterlegten Mikroorganismen oder die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen beschränkt werden. Tatsächlich werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hier beschrieben wurden, den Fachleuten auf diesem Gebiet ausgehend von der vorangegangenen Beschreibung und den begleitenden Figuren ersichtlich werden. Solche Modifizierungen sollen unter den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

Im Wesentlichen aufgereinigtes Fragment eines Serrate-Proteins, welches den Teil des Serrate Proteins mit der größten Homologie zu der in 15 (SEQ ID NO: 9) wiedergegeben, von etwa der Aminosäure 79 bis zu der Aminosäure 282 reichenden Aminosäuresequenz darstellt, wobei das Fragment dadurch gekennzeichnet ist, dass es in vitro über die Fähigkeit verfügt, wenn es auf der Oberfläche einer ersten Zelle exprimiert wird, an ein auf der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiertes Notch-Protein zu binden.
Fragment nach Anspruch 1, wobei das Fragment aus den in 15 (SEC ID NO: 9) wiedergegebenen Aminosäuren 79 bis 282 besteht.
Im Wesentlichen aufgereinigtes Fragment eines Serrate-Proteins, welches den Teil des Serrate Proteins mit der größten Homologie zu der in 15 (SEQ ID NO: 9) wiedergegebenen, von etwa der Aminosäure 85 bis zu der Aminosäure 283 reichenden Aminosäuresequenz darstellt, wobei das Fragment dadurch gekennzeichnet ist, dass es in vitro über die Fähigkeit verfügt, wenn es auf der Oberfläche einer ersten Zelle exprimiert wird, an ein auf der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiertes Notch-Protein zu binden.
Fragment nach Anspruch 3, wobei das Fragment aus den in 15 (SEQ ID NO: 9) wiedergegebenen Aminosäuren 85 bis 283 besteht.
Chimäres Protein, das ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst, welches mit einer heterologen Proteinsequenz verbunden ist.
Derivat eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Derivat die Aminosäuresequenz des Fragments aufweist, in welcher eine oder mehrere Aminosäure(n) innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität ersetzt sind, welche als funktionelles Äquivalent wirkt, und wobei das Derivat in vitro über die Fähigkeit verfügt, wenn es auf der Oberfläche einer ersten Zelle exprimiert wird, an ein auf der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiertes Notch-Protein zu binden.
Chimäres Protein, das ein mit einer heterologen Proteinsequenz verbundenes Derivat nach Anspruch 6 umfasst.
Im Wesentlichen aufgereinigte Nucleinsäure, welche ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein chimäres Protein nach Anspruch 5 oder Anspruch 7 codiert.
Nucleinsäurevektor, der eine Nucleinsäure nach Anspruch 8 umfasst.
Zelle, die mit einem Nucleinsäurevektor nach Anspruch 9 transformiert wurde.
Antikörper, der an ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet.
Antikörper nach Anspruch 11, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zur Herstellung eines Senate-Protein-Fragments umfassend Anziehen einer Zelle nach Anspruch 10, dass das Fragment von der Zelle exprimiert wird, und Isolieren des exprimierten Fragments eines Serrate-Proteins.