DE69936315T2

DE69936315T2 - Fragmente des wachstumsfaktors für bindegewebe (ctgf) und verfahren und anwendungen davon

Info

Publication number: DE69936315T2
Application number: DE69936315T
Authority: DE
Inventors: Gary R. Miami GROTENDORST
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: HK1041005A1; EP1140969A1; HK1041005B; KR100664626B1; PT1140969E; CN1660911A; US6492129B1; ES2288321T3; AU2004205171A1; AU775391B2; WO2000035939A3; JP2002532082A; JP2002532084A; CA2354422A1; WO2000035939A2; WO2000035936A1; KR20010101194A; EP1140969A4; CY1108860T1; AU2004205171B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Wachstumsfaktoren und spezifisch Fragmente des Bindegewebswachstumsfaktor (CTFG) und Verfahren der Verwendung davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Wachstumsfaktoren
Wachstumsfaktoren können allgemein als multifunktionelle, lokal wirkende, intrazelluläre Signalpolypeptide definiert werden, welche sowohl die Ontogenese als auch die Erhaltung der Gewebeform und -funktion kontrollieren. Die Proteinprodukte von vielen Protoonkogenen sind als Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorrezeptoren identifiziert worden.
Wachstumsfaktoren regen im Allgemeinen Zielzellen an zu proliferieren, sich zu differenzieren und sich in entwickelnde Gewebe zu organisieren. Die Wirkung von Wachstumsfaktoren hängt von ihrer Bindung an spezifische Rezeptoren, die ein Signalleitungsereignis innerhalb der Zelle stimulieren, ab. Beispiele für Wachstumsfaktoren schließen den Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), den insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), den transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β), den transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGF-α), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) ein. Von jedem dieser Wachstumsfaktoren ist berichtet worden, dass sie Zellen zur Proliferation anregen.
Bindegewebswachstumsfaktor
CTGF ist ein cysteinreiches, monomeres Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 38 kd. Wie früher berichtet, weist CTGF sowohl mitogene als auch chemotaktische Aktivitäten gegenüber Bindegewebszellen auf. CTGF wird von Zellen sezerniert und es wird angenommen, dass er nach der Interaktion mit einem spezifischen Zellrezeptor aktiv ist.
CTGF ist ein Mitglied einer Familie von Wachstumsregulatoren, zu denen zum Beispiel der Maus (fisp-12)- und menschliche CTGF, Cyr61 (Maus), Cef10 (Huhn) und Nov (Huhn) gehören. Basierend auf Sequenzvergleichen wird angenommen, dass die Mitglieder dieser Familie eine modulare Struktur aufweisen, die üblicherweise aus mindestens einer der folgenden Strukturen bestehen: (1) einer insulinähnlichen Wachstumsfaktordomäne, verantwortlich für das Binden, (2) einer von Willebrand-Faktordomäne, verantwortlich für die Komplexbildung, (3) einer Thrombospondin Typ I-Wiederholung, möglicherweise verantwortlich für das Binden von Matrixmolekülen und (4) einem C-terminalen Modul, das in Matrixproteinen gefunden wird und von dem angenommen wird, dass es für die Rezeptorbindung verantwortlich ist.
Die Sequenz der cDNA für den menschlichen CTGF enthält einen offenen Leserahmen von 1047 Nucleotiden mit einer Startstelle etwa am Nucleotid 130 und einer TGA-Terminationsstelle etwa an Nucleotid 1177 und codiert ein Peptid von 349 Aminosäuren. Die cDNA-Sequenz für den menschlichen CTGF ist früher im US-Patent Nr. 5,408,040 offenbart worden.
Der offene Leserahmen von CTGF codiert ein Polypeptid, das 39 Cysteinreste enthält, was auf ein Protein mit vielfachen intramolekularen Disulfidbrücken hinweist. Der Aminoterminus des Peptids enthält eine hydrophobe Signalsequenz, die auf ein sezerniertes Protein hinweist, und an den Asparaginresten 28 und 225 in der Aminosäuresequenz befinden sich zwei N-verbundene Glycosylierungsstellen.
Von der CTGF-Synthese und -Sekretion wird angenommen, dass sie selektiv durch TGF-β und BMP-2 sowie eventuell durch andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie von Proteinen induziert wird. Obwohl TGF-β das Wachstum von normalen Fibroblasten in Weichagar stimulieren kann, kann, wie auf dem Fachgebiet berichtet, CTGF allein diese Eigenschaft in Fibroblasten nicht induzieren. Allerdings ist gezeigt worden, dass die Synthese und Aktivität von CTGF für TGF-β notwendig sind, um das verankerungsunabhängige Wachstum von Fibroblasten zu stimulieren. Siehe z.B. Kothapalli et al., 1997, Cell Growth & Differentation 8(1):61–68 und Boes et al., 1999, Endocrinology 140(4):1575–1580.
Bezüglich der biologischen Aktivität von CTGF ist berichtet worden, dass es von Natur aus in erster Linie mitogen ist (hat die Fähigkeit Zielzellen zur Proliferation anzuregen). Auch ist von CTGF berichtet worden, eine chemotaktische Aktivität aufzuweisen. Unter pathologischen Gesichtspunkten ist berichtet worden, dass das Volllängen-CTGF-Molekül an Zuständen beteiligt ist, bei denen ein übermäßiges Wachstum von Bindegewebszellen und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulärer Matrix auftreten. Auf dem Fachgebiet ist auch beschrieben worden, dass CTGF in Zusammenhang steht mit Zuständen, die die Wanderung und Proliferation von Gefäßendothelzellen und die Gefäßneubildung betreffen. Zu den Krankheiten und Störungen, die mit diesen Zuständen in Zusammenhang stehen, gehören zum Beispiel Fibrose der Haut und Hauptorgane, Krebs und verwandte Krankheiten und Störungen wie systemische Sklerose, Angiogenese, Atherosklerose, diabetische Nephropathie und renaler Bluthochdruck (siehe z.B. Toshifumi et al., 1999, Journal of Cellular Physiology 18191):153–159: Shimo et al., 1999, Journal of Biochemistry 126(1):137–145; Murphy et al., 1999, Journal of Biological Chemistry 274(9):5830–5834; Wenger et al., 1999, Oncogene 18(4):1073–1080; Frzier et al., 1997, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29(1), 153–161; Oemar et al., 1997, Circulation 95(4):831–839.)
Von CTGF ist auch berichtet worden, dass es nützlich ist in der Wundheilung und Wiederherstellung von Bindegewebe, Knochen und Knorpel. In diesem Aspekt ist CTGF beschrieben worden als Induktor der Knochen-, Gewebe- oder Knorpelbildung bei Krankheiten wie Osteoporose, Osteoarthritis oder Osteochondritis, Arthritis, Skelettstörungen, hypertrophen Narben, Verbrennungen, Gefäßhypertrophie oder Wundheilung (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,837,258 ; Ohnishi et al., 1998, Jounal of Molecular and Cellular Cardiology 30(11):2411–2422; Nakanishi et al., 1997, Biochemical and Biophysical Reserarch Communicatons 234(1):206–210; Pawar et al., 1995, Jounal of Cellular Physiology 165(3):556–565.)
Zusammengefasst ist CTGF in Verbindung gebracht worden mit einer Reihe von fibrotischen und kanzerösen Zuständen und ist beschrieben worden, an der Wundheilung beteiligt zu sein. Demzufolge ist es auf dem Fachgebiet nötig, nützliche Verfahren zur Modulation der Aktivität von CTGF zu identifizieren, um diese verschiedenen Krankheiten und Störungen zu behandeln. Vor der vorliegenden Erfindung lag kein Bericht vor, demzufolge Regionen oder Domänen von CTGF verantwortlich sind für die Signalleitung verschiedener biologischer Aktivitäten. Außerdem lag vor der vorliegenden Erfindung keine Offenbarung zur Behandlung von Krankheiten und Störungen vor, die mit der Zellproliferation und/oder der Überproduktion extrazellulärer Matrix durch die Inhibition der biologischen Aktivität einer spezifischen Region oder Domäne von CTGF zusammenhängen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert neue Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von CTGF-assoziierten Krankheiten, Störungen oder Leiden, welche die Ablagerung der extrazellulären Matrix einbeziehen, einschließlich zum Beispiel die Induktion der Kollagensynthese und Myofibroblastendifferenzierung. Genauer umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung CTGF-Fragmente, welche die N-terminale Region von CTGF enthalten. In einem Aspekt ist das erfindungsgemäße Fragment, umfassend mindestens einen Teil des Exons 2 oder 3, oder das dadurch codierte Polypeptid ist nicht das CTGF-Fragment, das in Brigstock et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(32):20275–82 beschrieben wurde, und besitzt ferner die Fähigkeit die Synthese der extrazellulären Matrix zu induzieren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Fähigkeit Kollagen und die Myofibroblastendifferenzierung zu induzieren. In einem weiteren Aspekt umfasst das erfindungsgemäße Fragment zwischen etwa einem Viertel und einer Hälfte der Länge des Volllängen-CTGF-Proteins.
In einem Aspekt wird ein Fragment des Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF)-Polypeptids, das die vorstehend beschriebenen Aktivitäten aufweist, bereitgestellt. Ein Fragment der Erfindung umfasst CTGF, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens vom Exon 2 codiert wird, wie in 3 dargelegt. Ein Fragment kann auch eine Aminosäuresequenz einschließen, die mindestens von Exon 3 codiert wird, wie in 3 dargelegt. Des weiteren kann ein erfindungsgemäßes CTGF-Fragment eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens von den Exons 2 und 3 codiert wird, wie in 3 dargelegt. Die Erfindung liefert auch die Polynucleotidsequenzen, die solche Fragmente codieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente, um Zusammensetzungen zu identifizieren, die die Aktivität der CTGF-Fragmente modulieren können. Dabei können solche Zusammensetzungen verwendet werden, um die normale Ablagerung der extrazellulären Matrix wie beispielsweise die Kollagenablagerung, wie gewünscht, zu kontrollieren. Genauer können die CTGF-Fragmente verwendet werden, um Zusammensetzungen zu identifizieren, die die normale Ablagerung der Kollagenablagerung und Myofibroblastendifferenzierung kontrollieren, wobei solche Zusammensetzungen verwendete werden können, um die Aktivität der erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente zu hemmen, zu unterdrücken oder zu erhöhen.
Die Zusammensetzungen der beanspruchten Erfindung umfassen des weiteren CTGF-Modulatoren, zum Beispiel Antikörper, Antisensemoleküle, kleine Moleküle und andere Verbindungen, die durch die vorstehenden Verfahren identifiziert wurden und die Aktivität der erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente modulieren können. In einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung CTGF-Modulatoren, die die Aktivität von CTGF oder den CTGF-Fragmenten hemmen oder unterdrücken. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung erhöhen die CTGF-Modulatoren die Aktivität von CTGF oder den CTGF-Fragmenten, zum Beispiel bei Indikationen, bei denen eine Induktion der CTGF-Aktivität erwünscht ist, zum Beispiel bei der Wundheilung, der Gewebereparatur und der Knochenreparatur.
In einem anderen Aspekt der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des CTGF-Fragmentmodulators, allein oder in Kombination mit einer oder mehren Verbindungen, an einen Patienten, der einer Behandlung von Krankheiten, Störungen oder Leiden bedarf, bei denen die Manipulation der Kollagensynthese gewünscht wird. Noch genauer sind die erfindungsgemäßen Verfahren auf die Verwendung von Verbindungen, die in der Lage sind die Aktivität der erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente zu modulieren, ausgerichtet, um die Kollagensynthese zu modulieren und folglich Störungen zu behandeln, die das Übermaß der Kollagensynthese betreffen, einschließlich fibrotischer Krankheiten. Vorzugsweise handelt es sich um Störungen der Haut, dem Hauptorgan, und Störungen, die die Überproduktion von Narbengewebe betreffen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente enthalten. Solche Mittel könne nützlich sein bei der Wundheilung, der Knochen- und Gewebereparatur, bei denen die erhöhte Aktivität von CTGF erwünscht ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt Zellen in einem Myoblasteninduktionstest.
Die 2A und 2B zeigen ein Diagramm, welches darauf hinweist, dass erfindungsgemäße CTGF-Fragmente die Kollagensynthese in NRK-Zellen induzieren.
Die 3A und 3B weisen die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO:1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) des Volllängen-CTGF-Moleküls auf, wobei die Position von jedem Exon des CTGF-Moleküls angegeben wird.
4 weist die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO:3) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:4) der N-terminalen Domäne von CTGF auf, welche Exon 2 und Exon 3 des CTGF-Moleküls enthält.
5 zeigt Daten, die die Hemmung der Kollagensynthese durch anti-CTGF-Antikörper betreffen.
6 zeigt Daten, die die Hemmung der Kollagensynthese durch Antikörper, die gegen die N-terminale Domäne von CTGF gerichtet sind, betreffen.
7 zeigt Daten, die die Stimulation der Kollagensynthese durch CTGF und die N-terminale Domäne con CTGF betreffen.
8 zeigt Daten, die die N-terminale Domäne von CTGF als aktiven Induktor der Kollagensynthese und Myofibroblasteninduktion betreffen.
9 zeigt Daten, die die Wirkung von IGF-2 auf die CTGF-induzierte Kollagensynthese betreffen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die besondere Verfahrensweise und die besonderen Protokolle, Zelllinen, Vektoren und Reagenzien usw., die hierin beschreiben werden, beschränkt ist, da diese variieren können. Auch versteht es sich, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen verwendet wird und nicht beabsichtigt, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken. Es muss angemerkt werden, dass die Singularformen „ein/e/r" und „der/die/das", wie sie hierin und in den anhängenden Ansprüchen verwendet werden, die Bezugnahme auf den Plural einschließen, solange es der Kontext nicht ausdrücklich anders vorschreibt. Daher ist zum Beispiel eine Bezugnahme auf „einen Antikörper" eine Bezugnahme auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter.
Soweit nicht anders festgelegt, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie gewöhnlich von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Erfindung verstanden wird. Bevorzugte Verfahren, Vorrichtungen und Materialien werden hierin beschrieben, obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder gleichgestellt sind, bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
DEFINITIONEN
Der Begriff „CTGF-Fragment", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Fragment, das mindestens einen Teil der N-terminalen Region von CTGF enthält. In einer Ausführungsform enthält das Fragment mindestens einen Teil der Exons 2 oder 3 des Volllängen-CTGF-Proteins und besitzt ferner die Fähigkeit die Synthese extrazellulärer Matrix zu induzieren. In einer anderen Ausführungsform weist das Fragment zwischen etwa einem Viertel und einer Hälfte der Länge des Volllängen-CTGF-Proteins auf. „Die Fähigkeit die Kollagensynthese zu induzieren" soll die Fähigkeit bedeuten, über Kollagensynthese und Myofibroblastendifferenzierung die Erzeugung der extrazellulärer Matrix zu induzieren. Die CTGF-Fragmente können entweder durch Isolation aus natürlichen Quellen, durch synthetische Herstellungsverfahren, rekombinante Gentechnikverfahren oder andere auf dem Fachgebiet verfügbare Verfahren erhalten werden.
Der Begriff „N-terminal", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz, die mindestens einen Teil der Exon 2- und Exon 3-Domänen umfasst, beginnend bei etwa dem Volllängen-CTGF-Molekül, und auf die codierte Aminosäuresequenz wie sie in den 3A und 3B ausgewiesen ist. Der Begriff „Exon 2" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz, der N-terminalen Domäne, beginnend bei etwa dem Volllängen-CTGF-Molekül, und die entsprechende Aminosäuresequenz. Der Begriff „Exon 3" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz der N-terminalen Domäne des Volllängen-CTGF-Moleküls und auf das codierte Polypeptid.
Der Begriff „C-terminal", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz, die mindestens einen Teil der Exon 4- und Exon 5-Domänen des Volllängen-CTGF-Moleküls umfasst, und auf das dadurch codierte Polypeptid, wie in den 3A und 3B ausgewiesen.
Die Begriffe „Störungen" und „Krankheiten", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Zustände, die mit der Expression oder Aktivität von CTGF zusammenhängen. Zu den Krankheiten, Störungen und Zuständen, die mit CTGF in Zusammenhang stehen, gehören, sind aber nicht darauf beschränkt, eine ausgeprägte Narbenbildung, die von akuten oder wiederholten Verletzungen herrührt, einschließlich Operation oder Strahlentherapie, Fibrose von Organen wie Niere, Lungen, Leber, Augen, Herz und Haut, einschließlich Skleroderm, Keloiden und hypertrophe Narbenbildung. Eine abnormale Expression von CTGF ist mit allgemeiner Narbenbildung des Gewebes, tumorähnlichem Wachstum in der Haut und anhaltender Narbenbildung bei Blutgefäßen verbunden und führt zu beeinträchtigter Bluttransportfähigkeit, Bluthochdruck, Hypertrophie usw.. Mit CTGF stehen auch verschiedene Krankheiten in Verbindung, die durch die Proliferation oder Migration der Gefäßendothelzellen verursacht werden, wie beispielsweise Krebs, einschließlich Hauffibromen, Zuständen, die eine abnormale Expression der Endothelzellen betreffen, Mammakarzinomdesmoplasie, Angiolipom und Angioleiomyom. Zu anderen mit CTGF in Beziehungen stehenden Zuständen gehören: Atherosklerose und systemische Sklerose, einschließlich atherosklerotischer Plaques; chronisch-entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn; Angiogenese und andere proliferative Prozesse, die zentrale Rollen bei der Atherosklerose, Arthritis, Krebs und anderen Krankheitszuständen spielen; am Glaukom beteiligte Gefäßneubildung; Entzündung aufgrund von Krankheit oder Verletzung, einschließlich Gelenkentzündung; Tumorwachstum; Metastasen; interstitielle Erkrankung; dermatologische Erkrankungen; Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis; Arteriosklerose; Diabetes, einschließlich diabetischer Nephropathie; Bluthochdruck und andere Nierenerkrankungen und Fibrose aufgrund einer Chemotherapie, Strahlenbehandlung, Dialyse und Fremdtransplantat- und Transplantatabstoßung.
Zu den „fibroproliferativen" Erkrankungen, wie sie hierin bezeichnet werden, gehören, ohne auf eine der vorstehend aufgelisteten Krankheiten oder Störungen beschränkt zu sein, zum Beispiel Nierenfibrose, Skleroderm, Lungenfibrose, Arthritis, hypertrophe Narbenbildung und Atherosklerose. CTGF-assoziierte fibroproliferative Erkrankungen umfassen auch diabetische Nephropathie und Retinopathie Bluthochdruck und andere Nierenstörungen, mit Angiogenese in Zusammenhang stehende Störungen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, mit der Tumorbildung assoziierter Blutgefäße und anderer proliferativer Prozesse, die zentrale Rollen in der Atherosklerose, Arthritis und anderen Krankheitszuständen spielen, zum Beispiel in der Haut-, Herz-, Lungen- und Nierenfibrose. Allgemein sind schwere Fibrosen, welche die Niere, die Leber, die Lunge und das Herz-Kreislauf-System in Mitleidenschaft ziehen, hierin eingeschlossen. Es gibt eine ganze Reihe von Beispielen für Fibrosen, einschließlich der Bildung von Narbengewebe in Folge einer Herzattacke, was die Pumpfähigkeit des Herzens beeinträchtigt. Diabetes verursacht häufig eine/n Schaden/Narbenbildung in den Nieren, was zu einem fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion führt. Auch nach einer Operation kann sich zwischen inneren Organen Narbengewebe bilden, was eine Kontraktur, Schmerz und in einigen Fällen Infertilität verursacht. Hauptorgane wie das Herz, die Niere, die Leber, die Lunge, das Auge und die Haut sind anfällig für chronische Narbenbildung, gewöhnlich in Zusammenhang mit anderen Erkrankungen. Hypertrophe Narben (nicht-maligne Gewebemasse) sind eine gängige Form der Fibrose, verursacht durch Verbrennungen und andere Verletzungen. Zusätzlich gibt es eine Reihe anderer fibroproliferativer Störungen wie beispielsweise Skleroderm, Keloide und Atherosklerose, die dementsprechend mit einer gewöhnlichen Gewebenarbenbildung, tumorähnlichem Wachstum der Haut oder einer anhaltenden Narbenbildung der Blutgefäße, was den Bluttransport beeinträchtigt, in Zusammenhang stehen. Da CTGF bei fibrotischen Störungen überexprimiert wird, stellt er ein sehr spezifisches Ziel für die Entwicklung von anit-fibrotischen Therapeutika dar. CTGF kann durch die Verwendung von kleinen Molekülen und neutralisierenden Antikörpern, zum Beispiel bei der Behandlung von fibroproliferativen Störungen, gehemmt werden. Es versteht sich, dass sich „fibroproliferativ” auf jeden der vorstehenden pathologischen Fälle bezieht, und nicht auf zelluläre Proliferation beschränkt sein sollte.
„Extrazelluläre Matrizen (ECM)" sind Multikomponentenstrukturen, die von verschiedenen Zelltypen, einschließlich zum Beispiel Endothel-, Epithel-, Epidermis- und Muskelzellen, synthetisiert und umgeben werden. Die ECM ist größtenteils aus Kollagen und Heparansulfatproteoglycanen aufgebaut. Die ECM enthält auch _h1Fibronektin, Vitronektin, Chondroitinsulfatproteoglycane und kleinere Proteine. Wachstumsfaktoren werden in diesen Matrizen durch die Assoziation mit dem Glycosaminoglycananteil des Heparansulfatproteoglycans komplexiert. „Heparinähnliche" Regionen mit hohem Irudonsäureanteil und hoher Sulfatierung sind mit der bFGF-bindenden Region von Heparansulfat aus menschlichen Fibroblasten in Verbindung gebracht worden (Turnbull., et al., 1992, J. Biol. Chem. 276(15):10337–10341). Jedoch ist die Zusammensetzung des Heparansulfats in der extrazellulären Matrix nicht vollständig charakterisiert worden.
Die Bezeichnungen „Nucleinsäure" oder „Nucleinsäuresequenz", wie hierin verwendet, beziehen sich auf ein Oligonucleotid, Nucleotid, Polynucleotid oder auf ein Fragment eines jeden davon, auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann und kann einen Sensestrang oder Antisensestrang darstellen kann, auf Peptid-Nucleinsäure (PNA) oder auf jedes DNA-ähnliche oder RNA-ähnliche Material natürlichen oder synthetischen Ursprungs.
Die Bezeichnungen „Aminosäure" oder „Aminosäuresequenz", wie hierin verwendet, beziehen sich auf ein Oligopeptid, Peptid, Polypeptid oder eine Proteinsequenz oder auf ein Fragment, einen Teil oder eine Untereinheit eines jeden davon und auf natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle.
„Hybridisierung" bezieht sich auf einen Vorgang, bei dem ein Nucleinsäurestrang mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbunden wird. Hybridisierungsreaktionen können sensitiv und selektiv sein, so dass eine bestimmte Sequenz von Interesse sogar in Proben, in denen sie in geringer Konzentration vorliegt, identifiziert werden kann. Geeignete stringente Bedingungen können zum Beispiel durch die Salz- oder Formamidkonzentrationen in der Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösung oder durch die Hybridisierungstemperatur festgelegt werden und sind auf dem Fachgebiet bekannt. Insbesondere kann die Stringenz durch die Verminderung der Salzkonzentration, Erhöhung der Formamidkonzentration oder Anheben der Hybridisierungstemperatur erhöht werden.
Zum Beispiel kann die Hybridisierung unter hoch stringenten Bedingungen in etwa 50% Formamid bei etwa 37°C bis 42°C ablaufen. Die Hybridisierung kann unter vermindert stringenten Bedingungen in etwa 35% bis 25% Formamid bei etwa 30°C bis 35°C ablaufen. Insbesondere kann die Hybridisierung unter hoch stringenten Bedingungen bei 42°C in etwa 50% Formamid, 5 × SSPE, 0,3% SDS und 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA ablaufen. Die Hybridisierung kann unter vermindert stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, ablaufen, aber in 35% Formamid bei einer herabgesetzten Temperatur von 35°C. Der Temperaturbereich, der einem bestimmen Stringenzwert entspricht, kann weiter durch die Berechnung des Verhältnisses zwischen Purin und Pyrimidin der Nucleinsäure von Interesse und dem entsprechenden Anpassen der Temperatur eingeengt werden. Abänderungen der vorstehenden Bereiche und Bedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Der Begriff „beträchtliche Aminosäurehomologie" bezieht sich auf Moleküle, die eine Sequenzähnlichkeit von ca. 75% oder mehr, vorzugsweise 85% oder mehr und stärker bevorzugt 90–95% zu einer bestimmten Sequenz aufweisen. Die Bezeichnungen „% Ähnlichkeit" oder „% Identität" beziehen sich auf die prozentuale Sequenzähnlichkeit oder Identität, die in einem Vergleich von zwei oder mehr Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenzen gefunden wird. Die prozentuale Ähnlichkeit kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Die prozentuale Ähnlichkeit zwischen Aminosäuresequenzen kann zum Beispiel durch Verwendung des Clustal-Verfahrens berechnet werden (siehe z.B.: Higgins D.G. und Sharp P.M., 1988, Gene 73:237–244). Der Clustal-Algorithmus gruppiert die Sequenzen durch die Untersuchung des Abstandes zwischen allen Paaren in Cluster ein. Die Cluster werden paarweise, dann in Gruppen ausgerichtet. Die prozentuale Ähnlichkeit zwischen zwei Aminosäuresequenzen, z.B. Sequenz A und Sequenz B, wird berechnet, indem die Länge der Sequenz A minus der Anzahl von Resten der Lücken in Sequenz A minus der Anzahl von Resten der Lücken in Sequenz B, geteilt wird durch die Summe der Reste, die in Sequenz A und Sequenz B übereinstimmen, mal 100. Lücken mit geringer oder keiner Homologie zwischen den zwei Aminosäuresequenzen werden bei der Bestimmung der prozentualen Ähnlichkeit nicht einbezogen. Die prozentuale Ähnlichkeit kann durch andere, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zum Beispiel durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen berechnet werden und kann elektronisch unter Verwendung von Programmen wie das MEGALIGN-Programm (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin) berechnet werden.
Der Begriff „Kollagenuntereinheit" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz einer Polypeptidkette eines Kollagenproteins, codiert von einem einzelnen Gen, genauso wie irgendwelche Derivate der Sequenz, einschließlich Deletionsderivate, konservative Substitutionen usw..
Ein „Fusionsprotein" ist ein Protein, in dem Peptidsequenzen von unterschiedlichen Proteinen kovalent miteinander verbunden sind.
Eine „Antisensesequenz" ist jede Sequenz, die in der Lage ist spezifisch mit einer Zielsequenz zu hybridisieren. Die Antisensesequenz kann DNA, RNA oder jedes Nucleinsäureimitat oder -analog sein. Der Begriff „Antisensetechnologie" bezieht sich auf jede Technologie, die auf der spezifischen Hybridisierung einer Antisensesequenz mit einer Zielsequenz beruht.
Der Begriff „funktionell äquivalent", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein oder ein Nucleinsäuremolekül, das funktionelle oder strukturelle Eigenschaften wie das CTGF-Fragment besitzt. Ein funktionelles Äquivalent zum CTGF-Fragment kann Modifikationen enthalten, abhängig von der Notwendigkeit solcher Modifikationen für die Umsetzung einer bestimmten Funktion. Der Begriff „funktionelles Äquivalent" soll Fragmente, Mutanten, Hybride, Varianten, Analoge oder chemische Derivate eines Moleküls einschließen.
Ein Molekül ist ein „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls, wenn es eine zusätzliche chemische Einheit enthält, die normalerweise kein Teil des Moleküls ist. Solche Einheiten können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit und Ähnliches des Moleküls verbessern. Die Einheiten können alternativ die Toxizität des Moleküls vermindern, jede unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls entfernen oder abschwächen und Ähnliches. Einheiten, die in der Lage sind solche Effekte zu vermitteln, sind zum Beispiel in Gennaro, A.R., Hrsg., 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Co., Esston PA, beschrieben. Verfahren zur Kopplung solcher Einheiten an ein Molekül sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Eine „Variante", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die durch eine oder mehrere Aminosäuren verändert ist. Die Variante kann konservative Änderungen aufweisen, wobei eine ausgetauschte Aminosäure ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften besitzt, z.B. Ersetzen eines Leucins durch einen Isoleucin. Seltener kann eine Variante nicht-konservative Veränderungen aufweisen, z.B. Ersetzen eines Glycins durch ein Tryptophan. Analoge, geringe Veränderungen können auch Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder beides umfassen. Eine Leitlinie zur Bestimmung, welche Aminosäurereste ausgetauscht, inseriert oder deletiert werden können, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Computerprogrammen gefunden werden, zum Beispiel die DNASTAR-Software (DNASTAR Inc., Madison, WI).
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON CTGF-FRAGMENTEN
CTGF-codierende Nucleinsäuresequenzen
Gemäß der Erfindung können Nucleotidsequenzen, die CTGF oder funktionelle Äquivalente davon codieren, wie im US-Patent Nr. 5,408,040 beschrieben, verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle herzustellen, die die Expression des Volllängenproteins oder eines funktionellen Äquivalents davon kontrollieren, oder in einer anderen Ausführungsform Nucleotidsequenzen, die das gewünschte CTGF-Fragment, zum Beispiel in geeigneten Wirtszellen, als Fragment, das aus mindestens einem Teil des Exons 2 oder 3 von CTGF besteht, codieren.
In einer anderen Ausführungsform können Nucleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit Teilen der CTGF-Sequenz hybridisieren, auch in Nucleinsäurehybridisierungsversuchen, Southern- und Northern-Blot-Analysen usw. verwendet werden. In einem noch weiteren Verfahren können DNA-Moleküle, die CTGF codieren, durch Hybridisierungsverfahren, die eine Antikörperdurchmusterung von Expressionsbanken für den Nachweis gemeinsamer struktureller Eigenschaften umfassen, isoliert werden.
Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes, die ihm innewohnt, können andere DNA-Sequenzen, die Proteine mit ausgeprägter Aminosäurehomologie oder einer funktionell äquivalenten Aminosäuresequenz codieren, isoliert und bei der Umsetzung der Erfindung für die Clonierung und Expression von CTGF oder dem CTGF-Fragment verwendet werden. Zu solche DNA-Sequenzen gehören solche, die in der Lage sind unter stringenten Bedingungen mit menschlichen CTGF-Sequenzen zu hybridisieren.
Veränderte DNA-Sequenzen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiednen Nucleotidresten ein. Dies ergibt eine Sequenz, die das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt codiert. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der CTGF-Sequenz enthalten, die stille Änderungen nach sich ziehen und so ein funktionell äquivalentes Protein erzeugen. Solche Aminosäureaustausche können basierend auf ihren Ähnlichkeiten in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der beteiligten Reste hergestellt werden. Zum Beispiel gehören zu den negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure, zu den positiv geladenen Aminosäuren gehören Lysin und Arginin und zu den Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophiliewerten aufweisen, gehören folgende: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylanlanin, Tyrosin.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können hergestellt werden, um für verschiedenste Zwecke die Sequenz des Proteins zu ändern. Dazu gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Änderungen, die die Protessierung und die Expression des Genprodukts modifizieren. Zum Beispiel können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren Mutationen eingeführt werden, z.B. eine ortsgerichtete Mutation, um beispielsweise neue Restriktionsstellen einzuführen. Beispielsweise können in bestimmten Expressionssystemen wie Hefe die Wirtszellen das Genprodukt überglycosylieren. Wenn solche Expressionssysteme verwendet werden, kann es von Vorteil sein CTGF- oder die CTGF-Fragment-codierende Sequenz zu verändern, um eine beliebige N-verbundene Glycosylierungsstelle zu entfernen.
Die CTGF- oder CTGF-Fragmentsequenz kann mit einer heterologen Sequenz verbunden werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Zum Beispiel kann es für die Durchmusterung von Peptidbanken nützlich sein, ein chimäres CTGF-Protein zu codieren, das ein heterologes Epitop exprimiert, welches durch einen im Handel erhältlichen Antikörper erkannt wird. Auch kann ein Fusionsprotein erzeugt werden, das eine Spaltstelle enthält, die zwischen der CTGF- oder der CTGF-Fragmentsequenz und der heterologen Proteinsequenz (z.B. eine Sequenz, die einen Wachstumsfaktor codiert, der mit PDGF verwandt ist) liegt, so dass CTGF oder ein CTGF-Fragment von dem heterologen Teil abgespalten werden kann. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die codierende Sequenz von CTGF oder einem CTGF-Fragment kann auch ganz oder in Teilen unter Verwendung chemischer Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden (siehe z.B. Caruthers, et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7:215–233; Crea und Horn, 1980, Nucleic Acids Res. 9(10):2331; Matteucci und Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719 und Chow und Kempe, 1981, Nucleic Acids Res. 9(12):2807–2817). In einer anderen Ausführungsform kann das Protein unter Verwendung chemischer Verfahren hergestellt werden, um die CTGF-Aminosäuresequenz ganz oder in Teilen herzustellen. Zum Beispiel können Peptide durch Festphasen-Verfahren hergestellt, vom Harz abgespalten und durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie aufgereinigt werden. Siehe z.B. Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman und Co., N.Y. S. 50–60. Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch eine Aminosäureanalyse oder Sequenzierung bestätigt werden. Siehe zum Beispiel für das Edman-Abbauverfahren Creighton, 1983, Proteins, Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman und Co., N.Y. S. 34–49.
Expression von CTGF oder einem CTGF-Fragment
Um ein biologisch aktives CTGF-Fragment zu exprimieren, wird die Nucleotidsequenz, die das Volllängenprotein oder ein vorstehend beschriebenes, funktionelles Äquivalent codiert, verwendet und das CTGF-Fragment in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut, d.h. einen Vektor, der die nötigen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten codierenden Sequenz enthält.
Genauer können dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden, um Expressionsvektoren zu entwickeln, die die CTGF- oder die CTGF-Fragmentsequenz und geeignete Transkriptions-/Translationskontrollsignale enthalten.
Zu diesen Verfahren gehören in vitro-DNA-Rekombinationstechniken, Syntheseverfahren und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination. Siehe z.B. die Verfahren, die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. beschrieben werden.
Eine Vielzahl von Wirtsexpressionsvektorsystemen können verwendet werden, um die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Hefe, einschließlich Pichia pastoris und Hansenula polymorpha, transformiert mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren, die die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten; Insektenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus), die die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten; Pflanzenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid), die die CTGF- oder CTGF-Fragmentcodierende Sequenz enthalten, oder Tierzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Adenovirus, Vacciniavirus, menschlichen Tumorzellen (einschließlich HT-1080)), einschließlich Zelllinien, die so entwickelt wurden, dass sie vielfache Kopien der CTGF-DNA entweder stabil amplifiziert (CHO/dhfr) oder unstabil amplifiziert in Double-Minute-Chromosomen (z.B. murinen Zelllinien) enthalten. Es ist offensichtlich, dass der Begriff „Wirtsexpressionsvektorsysteme" und allgemeiner der Begriff „Wirtszellen", wie hierin verwendet, jeden Nachkommen der Wirtszelle oder des Wirtsexpressionsvektorsystems einschließt. Es ist weiter selbstverständlich, dass, obwohl alle Nachkommen nicht identisch zur Parentalzelle sein können, da sich während der Replikation Mutationen ereignen können, solche Nachkommen im Geltungsbereich der Erfindung liegen.
Die Expressionselemente dieser Systeme variieren in ihrer Stärke und Spezifität. Abhängig vom verwendeten Wirt/Vektorsystem kann jedes einer ganzen Reihe von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, im Expressionsvektor verwendet werden. Zum Beispiel können bei einer Clonierung in Bakteriensystemen induzierbare Promotoren wie pL des Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor) und Ähnliche verwendet werden; bei einer Clonierung in Insektenzellsystemen können Promotoren wie der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor verwendet werden; bei einer Clonierung in Pflanzenzellsystemen können Promotoren verwendet werden, die vom Genom der Pflanzenzellen (z.B. Hitzeschockpromotoren, der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO, der Promotor für das Chlorophyll a/b-Bindeprotein) oder von Pflanzenviren (z.B. der 35S-RNA-Promotor des CaMV, der Hüllproteinpromotor des TMV) stammen; bei einer Clonierung in Säugerzellsystemen können Promotoren verwendet werden, die vom Genom der Sängerzellen (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Sängerviren (z.B. der späte Adenovirus-Promotor, der Vacciniavirus-7.5K-Promotor) stammen; bei der Herstellung von Zelllinien, die vielfache Kopien der CTGF- oder CTGF-Fragment-DNA enthalten, können SV40-, BPV und EBV-basierte Vektoren mit einem geeigneten Selektionsmarker verwendet werden.
In Bakteriensystemen können eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhaft selektiert werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung des exprimierten CTGF oder CTGF-Fragments. Zum Beispiel umfasst ein geeigneter Vektor für die Expression in Bakterien den T7-basierten Vektor, wie in Rosenberg et al., 1987, Gene 56:125 beschrieben. Wenn große Mengen CTGF oder CTGF-Fragment hergestellt werden sollen, um Peptidbanken zu durchmustern, können als weiteres Beispiel Vektoren, die die Expression von großen Mengen von leicht aufzureinigenden Proteinprodukten kontrollieren, wünschenswert sein. Zu solchen Vektoren gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, der E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), in den die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz im richtigen Leserahmen mit der lac Z-codierenden Region in den Vektor ligiert sein kann, so dass ein Hybrid-AS-Lac Z-Protein hergestellt wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503–5509) und Ähnliche. PGEX-Vektoren können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide wie CTGF oder ein CTGF-Fragment mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Gewöhnlich sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht durch Adsorption an Glutathion-Agarosekügelchen, gefolgt von der Elution in Anwesenheit von freiem Glutathion, aus lysierten Zellen aufgereinigt werden. Die pGEX-Vektoren wurden entwickelt, um Thrombin- oder Faktor Xa-Proteasespaltstellen einzufügen, so das die clonierten Polypeptide von Interesse von dem GST-Anteil freigesetzt werden können. Im Allgemeinen können, wenn es sich bei dem Wirt um einen Prokaryonten handelt, kompetente Zellen hergestellt werden, die in der Lage sind DNA aufzunehmen. Die kompetenten Zellen werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren aus Zellen hergestellt, die nach exponentiellem Wachstum geerntet und nachfolgend mit CaCl₂ oder alternativ MgCl₂ oder RbCl behandelt werden.
Wenn es sich bei der Wirtszelle um einen Eukaryonten handelt, können verschiedene Verfahren des DNA-Transfers verwendet werden. Diese umfassen: Transfektion der DNA mittels Calciumphosphat-Präzipitaten; konventionelle mechanische Verfahren, einschließlich Mikroinjektion; Einbringen eines in Liposomen verpackten Plasmids oder die Verwendung von Virusvektoren. Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen, die das erfindungsgemäße Polypeptid codieren, und einem zweiten Fremd-DNA-Molekül, das einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie beispielweise dem Herpes-simplex-Thymidinkinasegen co-transfiziert werden. Ein anderes Verfahren ist die Verwendung eines eukaryontischen viralen Vektors wie beispielsweise des Affenvirus 40 (SV40) oder des Rinder-Papillom-Virus, um die eukaryontischen Zellen transient zu infizieren oder zu transformieren und das Protein zu exprimieren (siehe Eukaryotic Viral Vektors, 1992, Cold Spring Harbor Laborstory, Gluzman, Hrsg.). Zu den eukaryontischen Wirtszellen gehören Hefe, Säugerzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen.
In der Hefe kann eine ganze Reihe von Vektoren verwendet werden, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten. Für einen Überblick siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, 1988, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Kap. 13; Grant et al., 1987, Methods in Enzymology, Wu & Grossman, Hrsg., Acad. Press, N.Y., 153:516–544; Glover, 1986, DNA Cloning, Bd. II, IRL Press, Wash., D.C., Kap. 3; Bitter, 1987, Herterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger & Kimmel, Hrsg., Acad. Press, N.Y., 152:673–684 und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Strathern et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Vol. I und II. Zum Beispiel sind verschiedene Shuttle-Vektoren für die Expression von Fremdgenen in Hefe veröffentlicht worden. Heinemann et al., 1989, Nature 340:205; Rose et al., 1987, Gene 60:237.
In Fällen, in denen Pflanzenexpressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression der CTGF- oder CTGF-Fagment-codierenden Sequenz durch jeden einer ganzen Reihe von Promotoren getrieben werden. Zum Beispiel können virale Promotoren wie die 35S-RNA- oder 19S-RNA-Promotoren des CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511–514) oder der Hüllprotein-Promotor des TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307–311) verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können Pflanzenpromotoren wie die kleine Untereinheit der RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671–1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838–843) oder Hitzeschockpromotoren, z.B. Sojabohnen hsp17.5-E oder hsp17.3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559–565), verwendet werden. Diese Konstrukte können unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation usw. in Pflanzenzellen eingeführt werden. Für einen Überblick solcher Verfahren siehe z.B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, N.Y., Abschnitt VIII, S. 421–463; Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2te Aufl., Blackie, London, Kap. 7–9.
In einem Insektensystem kann ein alternatives Expressionssystem verwendet werden, um CTGF oder eine CTGF-Fragment zu exprimieren. In einem solchen System wird das Baculovirus als Vektor für die Expression fremder Gene verwendet. Das Virus vermehrt sich dann auf Insektenzellen. Die CTGF- oder CTGF-Fragmentcodierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen des Virus (zum Beispiel in das Polyhedrin-Gen) cloniert und unter die Kontrolle eines Baculovirus-Promotors gestellt werden. Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Insektenzellen zu infizieren, in denen das eingefügte Gen exprimiert wird. Siehe z.B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Smith, US-Patent Nr. 4,215,051 .
In Säugerwirtszellen kann eine Reihe von virusbasierten Expressionssystemen verwendet werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions-/Translationskontrollkomplex ligiert werden, z.B. die späte Promotor und dreigeteilte Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann mittels in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Andenovirus-Genom eingeführt werden. Die Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird ein rekombinantes Virus zur Folge haben, das lebensfähig ist und in der Lage ist in infizierten Wirten CTGF oder das CTGF-Fragment zu exprimieren. Siehe z.B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655–3659. Wahlweise kann der Vacciniavirus-7.5K-Promotor verwendet werden. Siehe z.B. Mackett et al., 1982, Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415–7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857–864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927–4931. In einer anderen Ausführungsform wird die CTGF- oder CTGF-Fragmentsequenz in menschlichen Tumorzellen wie beispielsweise HAT-1080 exprimiert, die stabil mittels Calciumphosphat-Präzipitation und mit einem Neomycin-Resistenzgen transfiziert worden sind. In einer noch anderen Ausführungsform wird für die Expression in einer Reihe von Säugerzellen, einschließlich COS-, BHK-, 293- und CHO-Zellen, der pMSXND-Expressionsvektor oder ein Ähnlicher verwendet (Lee und Nathans, 1988, J. Biol. Chem. 263:3521).
Spezifische Startsignale können für eine effiziente Translation der eingefügten CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenzen erforderlich sein. Diese Signale schließen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In den Fällen, in denen das ganze CTGF-Gen, einschließlich seines eigenen Startcodons und benachbarter Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden, muss kein zusätzliches Translationskontrollsignal nötig sein. Wenn jedoch nur ein Teil der CTGF-codierenden Sequenz eingefügt wird, müssen exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Startcodons, bereitgestellt werden. Des weiteren muss das Startcodon im richtigen Leserahmen der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz sein, um die Translation der gesamten Insertion zu gewährleisten. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Startcodons können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlich als auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch das Einführen von geeigneten Transkriptions-Enhancerelementen, Transkriptionsterminatoren usw. verstärkt werden (siehe z.B. Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516–544). Zusätzliche Sequenzen, d.h. Leader-Sequenzen usw., können angefügt werden, um die Sekretion von CTGF oder des CTGF-Fragments entlang verschiedener sekretorischer Wege zu steuern. Dies kann in einer Reihe von Expressionssystemen unter Verwendung verschiedener, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren erreicht werden.
Zusätzlich, kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenz moduliert oder das Genprodukt auf eine bestimmte, gewünschte Art und Weise modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z.B. Glycosylierung) und Prozessierung (z.B. Spalten) eines Proteinprodukt können wichtig sein für die Funktion des Proteins. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und bestimmte Mechanismen für die post-translationale Prozessierung und Modifikation der Proteine. Geeignete Zelllinen oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die richtige Modifikation und Prozessierung der exprimierten Fremdproteine zu gewährleisten. Dazu können eukaryontische Wirtszellen, die die zelluläre Maschinerie, für korrektes Prozessieren des primären Transcripts, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genproduktes besitzen, verwendet werden. Zu solchen Säugerwirtszellen gehören, ohne sie einzuschränken, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, HAT-1080 usw..
Für die Langzeitproduktion von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute wird eine stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die CTGF oder das CTGF-Fragment stabil exprimieren, hergestellt werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit CTGF- oder CTGF-Fragment-DNA, die durch geeignete Expressionskontrollelemente kontrolliert wird (z.B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transcriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einem Selektionsmarker transformiert werden. Nach der Einführung der Fremd-DNA lässt man die veränderten Zellen für 1–2 Tage in angereichertem Medium wachsen und wechselt dann auf ein Selektionsmedium. Der Selektionsmarker im rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt den Zellen das Plasmid stabil in ihre Chromosomen aufzunehmen und zu wachsen, um Foci zu erzeugen, die man wiederum clonieren und zu Zelllinien auswachsen lassen kann.
Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Gene der Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 48:2026) und der Adenin- Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817); diese können in tk^–, hgprt^– beziehungsweise aprt^– Zellen eingesetzt werden.
Ebenso kann eine anti-Metabolitresistenz als Grundlage für die Selektion auf dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:3567; O'Hara et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:1527); gpt, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:2072); neo, das Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) und hygro, das Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30:147), verwendet werden. Kürzlich sind zusätzliche selektierbare Gene beschrieben worden, und zwar trpB, das Zellen erlaubt Indol an Stelle von Tryptophan zu nutzen; hisD, das Zellen erlaubt Histinol an Stelle von Histidin zu nutzen (Hartmann & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:8047) und ODC (Ornithin-Decarboxylase), das Resistenz gegenüber dem Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin (DFMO) verleiht (McConlogue, 1987, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laborstory).
Die Isolierung und Aufreinigung von erfindungsgemäßen wirtszellexprimierten Polypeptiden können durch jegliche konventionelle Mittel wie zum Beispiel präparative chromatographische Trennungen und immunologische Trennungen wie solche, die die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern einschließen, erfolgen.
Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, die CTGF oder ein CTGF-Fragment exprimieren
Die Wirtszellen, die die codierende Sequenz enthalten und das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch mindestens vier übliche Vorgehensweisen identifiziert werden: (a) DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung, (b) die Anwesenheit oder Abwesenheit von „Marker"-Genfunktionen, (c) Beurteilung des Transkriptionsspiegels, gemessen durch die Expression der CTGF- oder CTGF-Fragment-mRNA-Transkripte in der Wirtszelle und (d) Nachweis des Genproduktes, mittels Test oder seiner biologischen Aktivität gemessen.
Bei der ersten Vorgehensweise kann die Anwesenheit der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz, die in den Expressionsvektor eingefügt ist, durch DNA-DNA oder DNA-RNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, wobei Sonden verwendet werden, die Nucleotidsequenzen enthalten, die homolog zu der CTGF-beziehungsweise CTGF-Fragment-codierenden Sequenz sind oder zu Teilen oder Derivaten davon.
Bei der zweiten Vorgehensweise kann das rekombinante Expressionsvektor/Wirtsystem basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten „Marker"-Genfunktionen (z.B. Resistenz gegenüber Antikörpern, Resistenz gegenüber Methotrexat, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung bei Baculovirus usw.) identifiziert und selektiert werden. Zum Beispiel wird in bevorzugten Ausführungsformen die CTGF-codierende Sequenz innerhalb einer Neomycin-Resistenzmarkergensequenz des Vektors eingefügt und Rekombinanten, die die CTGF-codierende Sequenz enthalten, können durch das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Markergen in Tandemanordnung platziert werden, wobei die CTGF-Sequenz unter der Kontrolle des selben oder eines anderen verwendeten Promotors steht, um die Expression der CTGF-codierenden Sequenz zu kontrollieren. Die Expression des Markers in Antwort auf die Induktion oder Selektion weist auf die Expression der CTGF-codierenden Sequenz hin.
Bei der dritten Vorgehensweise kann die transkriptionelle Aktivität für die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Region durch Hybridisierungstests getestet werden. Zum Beispiel kann RNA isoliert und mittels Northern-Blot unter Verwendung einer Sonde, die homolog ist zu der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz oder bestimmten Teilen davon, analysiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die gesamte Nucleinsäure der Wirtszelle extrahiert und hinsichtlich ihrer Hybridisierung mit solchen Sonden getestet werden.
Die vierte Vorgehensweise umfasst den Nachweis der biologischen Aktivität oder immunologischen Reaktivität des CTGF- oder CTGF-Fragment-Genprodukts. Eine Reihe von Test kann verwendet werden, um die CTGF-Aktivität nachzuweisen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, solche Tests, wie sie im US-Patent Nr. 5,408,040 beschrieben wurden.
Spalten des Volllängen-CTGF-Proteins für die Herstellung des CTGF-Fragments
Nach der Expression des Volllängen-CTGF-Proteins kann das Protein durch eine Vielzahl proteolytischer Enzyme, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, gespalten werden, um die erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente zu erzeugen. Unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind, ist zum Beispiel die cysteinfreie Brücke zwischen den N-terminalen und C-terminalen Hälften von CTGF zugänglich für Chymotrypsin.
VERFAHREN ZUR MODULATION UND INHIBITION DER AKTIVITÄT DES CTGF-FRAGMENTS
Wie vorstehend beschrieben, sind die in dieser Erfindung beschriebenen CTGF-Fragmente eine kritische Determinante der Ablagerung der extrazellulären Matrix unter fibrotischen Bedingungen. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Prävention und Behandlung von Komplikationen, die mit der Aktivität der Fragmente in Zusammenhang stehen, durch Regulieren, Modulieren und/oder Inhibieren der Aktivität und/oder Expression solcher Fragmente oder falls erwünscht, Erhöhung der Aktivität solcher Fragmente. Im Besonderen gewährleisten die erfindungsgemäßen Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Agens, das die Aktivität zur Herstellung der extrazellulären Matrix des N-terminalen Fragments von CTGF wie gewünscht reguliert, moduliert und/oder inhibiert, um Krankheiten oder Störungen, die mit der Expression und Aktivität von CTGF in Zusammenhang stehen, zu behandeln, zu verhindern oder zu lindern.
Antikörper
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers, wobei der Antikörper spezifisch mit den erfindungsgemäßen CTGF-Fragmenten reagiert. Antikörper, die spezifisch mit CTGF reagieren, werden im US-Patent 5,783,187 und in der PCT-Veröffentlichung WO 9638172 beschrieben. Die CTGF-Antikörper können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren hergestellt werden. Zu solchen Antikörpern können polyclonale, monoclonale, chimäre, Einzelkettenantikörper genauso wie Fab-Fragmente, einschließlich F(ab')₂- und F_v- Fragmente, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Fragmente können zum Beispiel mittels Fab-Expressionsbank hergestellt werden. Neutralisierende Antikörper, d.h. solche, die eine Dimerbildung hemmen, werden für den therapeutischen Gebrauch besonders bevorzugt.
Ein Zielpolypeptid wie CTGF oder ein Agens, das die Aktivität und/oder die Expression von CTGF moduliert, kann getestet werden, um die Regionen. hoher Immunogenität zu bestimmen. Analyseverfahren und Epitopselektion sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Ausubel et al., Hrsg., 1988, Current Protocols in Molecular Biology. Die Analyse und Selektion können zum Beispiel auch mittels verschiedener Sofwarepakete wie beispielsweise die LASERGENE NAVIGATOR-Software (DNASTAR; Madison WI.) durchgeführt werden. Die Peptide oder Fragmente, die verwendet werden, um die Antikörper hervorzurufen, sollten antigen sein, sind aber nicht notwendigerweise biologisch aktiv. Vorzugsweise ist ein Antigenfragment oder -peptid mindestens 5 Aminosäuren lang, stärker bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren lang und am meisten bevorzugt mindestens 15 Aminosäuren lang. Es ist vorzuziehen, dass das antikörperinduzierende Fragment oder Peptid zu mindestens einem Teil der Aminosäuresequenz des Zielpolypeptids, z.B. CTGF, identisch ist. Ein Peptid oder Fragment, das mindestens einen Teil der Sequenz des natürlich vorkommenden Zielpolypeptids nachahmt, kann auch mit einem anderen Protein, z.B. dem KLH (keyhole limpet hemocyanin), fusioniert werden und gegen das chimäre Molekül können Antiköper erzeugt werden.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Menschen und anderer, durch Injektion mit dem Zielpolypeptid oder irgendeinem immunogenen Fragment oder Peptid davon immunisiert werden. Abhängig von der Wirtsspezies können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken. Ohne darauf beschränkt zu sein, schließen solche Adjuvantien Freundsches Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid und grenzflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH und Dinitrophenol ein. Unter den im Menschen verwendeten Adjuvantien werden BOG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum besonders bevorzugt.
Monoclonale und polyclonale Antikörper können unter Verwendung jeden Verfahrens, das die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur gewährleistet, hergestellt werden. Verfahren für die in vivo- und in vitro-Herstellung sind auf dem Fachgebiet bestens bekannt, siehe z.B. Pound J.D., 1998, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; Harlow E. und Lane D., 1988, Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, New York. Die Herstellung von chimären Antikörpern ist genauso wie die Herstellung von Einzelkettenantikörpern auf dem Fachgebiet gut bekannt, siehe Morrison S.L. et al., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851–6855; Neuberger M.S. et al., 1984, Nature 312:604–608; Takeda S. et al., 1985, Nature 314:452–454. Antikörper mit verwandter Spezifität, aber unterschiedlicher Idiotypzusammensetzung, können zum Beispiel durch Kettenvermischung aus kombinatorischen Zufallsimmunglobulinbanken hergestellt werden. Siehe z.B. Burton D.R., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120–11123.
Antikörper können auch durch Induzieren der in vivo-Produktion in der Lymphocytenpopulation oder durch Durchmustern von Immunglobulinbanken oder Reihen von hochspezifischen Bindungsreagenzien hergestellt werden. Siehe z.B. Orlandi, R. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833–3837; Winter, G. und Milstein C., 1991, Nature 349:293–299). Es können auch Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen für das Zielpolypeptid enthalten, hergestellt werden. Zu solchen Antikörperfragmenten gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antiköpermoleküls hergestellt werden können, und Fab-Fragmente, die durch die Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können. In einer anderen Ausführungsform können Fab-Expressionsbanken erstellt werden, um ein schnelles und leichtes Identifizieren von monoclonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen. Siehe z.B. Huse, W. D. et al., 1989, Science 254:1275–1281.
Antikörper können hinsichtlich ihrer anti-Zielpolypeptidaktivität unter Verwendung einer Reihe von auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren getestet werden. Um Antikörper, die die gewünscht Spezifität aufweisen, zu identifizieren, können verschiedene Verfahren für das Durchmustern verwendet werden, dazu gehören verschiedene Immuntests wie beispielsweise die enzymverbundenen Immunadsorptionstests (ELISAs), einschließlich direkte und Ligandeneinfang- ELISAs, Radioimmuntests (RIAs), Immunblot-Verfahren und fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS). Auf dem Fachgebiet sind eine Reihe von Protokollen für kompetitive Bindungstests oder immunradiometrische Tests unter Verwendung von entweder polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern mit bekannten Spezifitäten gut bekannt. Siehe z.B. Harlow und Lane. Solche Immuntests umfassen gewöhnlich das Messen der Komplexbildung zwischen dem Zielpolypeptid und einem spezifischen Antikörper. Ein zweiseitiger, auf monoclonalem Antikörper basierter Immuntest, bei dem monoclonale Antikörper verwendet werden, die mit zwei nicht-interferierenden Epitope auf dem Zielpolypeptid reaktiv sind, wird bevorzugt, aber andere Test wie kompetitive Bindungstest können auch eingesetzt werden. Siehe z.B. Maddox, D.E. et al., 1983, J. Exp. Med. 158:1211.
Die vorliegende Erfindung zieht auch in Erwägung Antikörper zu verwenden, die spezifisch mit einem CTGF-Polypeptid oder Fragmenten davon reaktiv sind und die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente neutralisieren. Die in dem Verfahren verabreichten Antikörper können der intakte Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon wie Fab-, F(ab')₂- und F_v-Fragmente sein, die in der Lage sind die Epitop-Determinante zu binden. Die Antikörper, die in dem Verfahren verwendet werden, können polyclonale oder stärker bevorzugt monoclonale Antikörper sein. Monoclonale Antikörper mit unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten werden aus antigenhaltigen Fragmenten des Proteins mittels auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren hergestellt. Siehe z.B. Köhler et al., Nature 256:494; Ausubel et al., vorsehend.
In der vorliegenden Erfindung schließen die therapeutische Anwendungen solche Anwendungen ein, die „menschliche" oder „humanisierte" Antikörper, die gegen CTGF oder Fragmente davon gerichtet sind, verwenden. Humanisierte Antikörper sind Antikörper oder Antikörperfragmente, die die gleiche Bindungsspezifität wie ein parentaler Antikörper (d.h. üblicherweise von der Maus stammend) und zunehmend menschliche Eigenschaften aufweisen. Humanisierte Antikörper können zum Beispiel mittels Kettenvermischung oder durch Verwendung des Phagen-Display-Verfahrens erhalten werden. Zum Beispiel wird ein Polypeptid, das eine schwere oder leichten Kette der variablen Domäne eines nicht-menschlichen Antikörpers, spezifisch für CTGF, enthält, mit einem Repertoire an menschlichen, komplementären (schweren oder leichten) Ketten variabler Domänen kombiniert. Hybridpaarungen, die spezifisch für das Antigen von Interesse sind, werden selektiert. Menschliche Ketten der selektierten Paarungen können dann mit einem Repertoir an menschlichen, komplementären, variablen Domänen (schwer oder leicht) kombiniert werden und humanisierte Antikörperpolypeptiddimere können hinsichtlich ihrer Bindungsspezifität gegenüber einem Antigen selektiert werden. Zur Herstellung von humanisierten Antikörpern beschriebene Verfahren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,565,332 ; 5,585,089 ; 5,694,761 und 5,693,762 beschrieben. Des weiteren sind Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern in transgenen Mäusen, zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,545,806 und 5,569,825 , beschrieben.
Antisenseoligonucleotide
Die vorliegende Erfindung liefert einen therapeutischen Ansatz, der direkt in die Translation der CTGF-Boten eingreift, und besonders in die Translation der Boten des Volllängen-CTGF (wobei das Volllängen-Protein dann gespalten wird, um ein erfindungsgemäßes CTGF-Fragment zu erzeugen) oder des Fragments von CTGF (insgesamt „CTGF-mRNA) in ein Protein. Genauer liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem Antisensenucleinsäure oder Ribozyme verwendet werden, um an die CTGF-mRNA zu binden oder sie zu spalten. Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle binden spezifisch an die Boten-RNA eines Zielgens und unterbrechen die Expression des Proteinprodukts des Gens. Die Antisense bindet an die Boten-RNA und erzeugt ein doppelsträngiges Molekül, das nicht von der Zelle translatiert werden kann. Zusätzlich können chemisch reaktive Gruppen wie beispielsweise eisengebundene Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA-Fe) an ein Antisenseoligonucleotid gebunden werden, was die Spaltung der RNA an der Hybridisierungsstelle verursacht. Dies und andere Verwendungen der Antisenseverfahren zur Hemmung der Translation von Genen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Marcu-Sakura, 1988, Anal. Biochem 177:278.
Noch genauer kann in einer Ausführungsform der Erfindung die Sequenz eines Antisensepolynucleotids, das für die Hemmung der Expression der CTGF-mRNA nützlich ist, durch Vergleich der Sequenzen von orthologen Genen (Sequenzen, die zwischen den Spezies konserviert sind) oder den Transkripten von orthologen Gene und Identifizierung hoch konservierter Regionen innerhalb solcher Sequenzen erhalten werden. Ähnlichkeiten in Nucleinsäuresequenzen können mittels Verfahren und Algorithmen, die auf dem Fachgebiet bestens bekannt sind, bestimmt werden. Zu solchen Verfahren und Algorithmen gehören zum Beispiel ein BLAST-Programm (Basic Local Alignment Search Tool am National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiple Aligned Sequences) und AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment).
Bei der Auswahl der bevorzugten Länge für ein gegebenes Polynucleotid sollten, um die günstigen Eigenschaften zu erreichen, verschiedene Faktoren beachtet werden. In einem Aspekt weisen erfindungsgemäße Polynucleotide mindestens eine Länge von 15 Basenpaare (bp) und vorzugsweise eine Länge von etwa 15 bis etwa 100 bp auf. Stärker bevorzugt sind die Polynucleotide etwa 15 bp bis etwa 80 bp lang und noch stärker bevorzugt weisen die erfindungsgemäßen Polynucleotide eine Länge von etwa 15 bis etwa 60 bp auf. Kürzere Polynucleotide wie 10 bis unter 15-mere, obwohl sie eine höhere Zellpenetration verleihen, haben eine geringere Genspezifität. Im Gegensatz dazu verleihen längere Polynucleotide von 20 bis etwa 30 bp eine bessere Spezifität und zeigen verminderte Aufnahmekinetiken in Zellen. Siehe Stein et al., „Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression", Cohen, Hrsg., McMillan Press, London (1988). Die Zugänglichkeit zu Transkript-RNA Zielsequenzen ist ebenso wichtig für schleifenbildenden Regionen und orthologe Sequenzen in Ziel-RNAs, die dadurch vielversprechende Ziele anbieten. In dieser Offenbarung umfasst der Begriff „Polynucleotid" sowohl oligomere Nucleinsäureeinheiten des Typs, wie er auch in der Natur vorkommt, wie die Desoxyribonucleotid- und Ribonucleotidstrukturen von DNA und RNA als auch vom Menschen gemachte Analoge, die in der Lage sind an Nucleinsäure, wie sie in der Natur gefunden wird, zu binden. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können auf Ribonucleotid- oder Desoxyribonucleotidmonomeren, die durch Phosphodiesterbindungen verknüpft sind, oder auf Analogen basieren, die durch Methylphosphonat, Phosphorothionat oder andere Brücken verbunden sind. Sie können auch monomere Anteile enthalten, die veränderte Basenstrukturen oder andere Modifikationen aufweisen, aber die noch die Fähigkeit behalten haben an natürlich vorkommende Transkript-RNA-Strukturen zu binden. Solche Polynucloetide können mittels Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel durch die Verwendung von im Handel erhältlichen Geräten und Reagenzien wie jene, die von Perkin-Elmer/Applied Biosystems (Forster City, KA) bezogen werden können. Zum Beispiel werden Polynucleotide, die spezifisch sind für ein Zieltranskript, gemäß Standardverfahren synthetisiert. Posphorothionatmodifizierte DNA-Polynucleotide werden üblicherweise auf automatisierten DNA-Synthetisegeräten, die bei einer Reihe von Herstellern erhältlich sind, synthetisiert. Diese Instrumente sind in der Lage nanomolare Mengen von Polynucleotiden so lang wie 100 Nucleotide zu synthetisieren. Kürzere Polynucleotide, die von modernen Geräten synthetisiert werden, sind häufig für eine Verwendung ohne weitere Aufreinigung geeignet. Falls notwendig, können Polynucleotide mittels Polyacrylamidgelelektrophorese oder Umkehrphasenchromatographie aufgereinigt werden. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Bd. 2, Kapitel 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Phosphodiesterverknüpfte Polynucleotide sind besonders empfindlich gegenüber der Wirkung von Nucleasen im Serum oder innerhalb der Zellen und daher sind in einer bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäßen Polynucleotide phosphothionat- oder methylphosphonatverknüpfte Analoge, von denen gezeigt worden ist, dass sie nucleaseresistent sind. Der Durchschnittsfachmann kann leicht andere Verknüpfungen für die Verwendung in dieser Erfindung auswählen. Diese Modifikationen können auch gestaltet werden, um die zelluläre Aufnahme und Stabilität des Polynucleotids zu verbessern.
Ein geeigneter Träger für die Verabreichung eines Polynucleotids kann zum Beispiel Vektoren, Antikörper, Arzneimittel, Binde- oder Homing-Proteine oder virale Freisetzungssysteme einschließen, um die Sequenz in einer Zielzelle oder einem Zielgewebe anzureichern. Ein erfindungsgemäßes Polynucleotid kann zum Beispiel an ein Bindeprotein, welches Endothelzellen oder Tumorzellen erkennt, gekoppelt werden. Nach der Verabreichung kann ein erfindungsgemäßes Polynucleotid zu einer Empfängerzelle oder einem Empfängergewebe geleitet werden, so dass eine verstärkte Expression von zum Beispiel Cytokinen, Transkriptionsfaktoren, G-Proteingekoppelten Rezeptoren, Tumorsuppressorproteinen und Apoptose-Initiationsproteinen stattfinden kann.
Die Freisetzung von Antisensemolekülen und ähnlichen kann durch die Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors wie eines chimären Virus oder eines kolloidalen Dispersionssystems erreicht werden. Verschiedene virale Vektoren, die für die Gentherapie, wie hierin erläutert, verwendet werden können, schließen Adenovirus, Herpesvirus, Vaccinia oder vorzugsweise ein RNA-Virus wie beispielweise ein Retrovirus ein. Eine Vielzahl der bekannten Retroviren können ein Gen für einen Selektionsmarker übertragen oder einbauen, so dass die transduzierten Zellen identifiziert und hergestellt werden können. Durch das Einfügen einer Polynucleotidsequenz von Interesse in den viralen Vektor zusammen mit einem anderen Gen, das zum Beispiel den Liganden für einen Rezeptor auf einer bestimmten Zielzelle codiert, ist der Vektor zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können durch Einfügen zum Beispiel eines Polynucleotids, das einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein codiert, zielspezifisch gemacht werden. Ein bevorzugtes Anzielen wird durch die Verwendung eines Antikörpers erreicht, um den retroviralen Vektor anzuzielen. Der Fachmann wird wissen oder kann leicht ohne übermäßiges Experimentieren, spezifische Polynucleotidsequenzen herausfinden, die in das retrovirale Genom eingebaut werden können, um eine zielgerichtete, spezifische Freisetzung des retroviralen Vektors, der das Antisensepolynucleotid enthält, zu ermöglichen.
Da rekombinante Retroviren fehlerhaft sind, benötigen sie Hilfe, um infektiöse Vektorpartikel herzustellen. Die Hilfe kann zum Beispiel durch die Verwendung von Helferzelllinien, die Plasmide enthalten, die alle Strukturgene der Retroviren unter der Kontrolle regulatorischer Sequenzen innerhalb der LTR codieren, geliefert werden. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die den Verpackungsmechanismus zur Erkennung eines RNA-Transkripts für den Einkapselung befähigt. Zu Helferzelllinen, die Deletionen des Verpackungssignals aufweisen, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Ψ2, PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, da kein Genom verpackt wird. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Zellen, in denen das Verpackungssignal intakt ist, aber die Strukturgene durch andere Gene von Interesse ersetzt sind, eingeführt wird, kann der Vektor verpackt und Vektorvirionen können hergestellt werden.
In einer anderen Ausführungsform können NIH 3T3- oder andere Gewebekulturzellen direkt durch herkömmliche Calciumphosphat-Transfektion mit Plasmiden, die die retroviralen Strukturgene gag, pol und env codieren, transfiziert werden. Diese Zellen werden dann mit dem Vektorplasmid, das die Gene von Interesse enthält, transfiziert.
Die so entstandenen Zellen setzen den retroviralen Vektor in das Zellkulturmedium frei.
Ein anderes System zur gezielten Freisetzung für Antisensemoleküle ist ein kolloides Dispersionssystem. Kolloide Dispersionssysteme schließen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und lipidbasierte Systeme ein, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischte Micellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System dieser Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die in vivo und in vitro als Freisetzungssysteme nützlich sind. Es ist gezeigt worden, dass große unilamellare Vesikel (LUV), die in ihrer Größe von 0,2–4,0 μm reichen, einen beträchtlichen Prozentsatz eines wässrigen, Puffers, der großen Makromoleküle enthält, einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können in das wässrige Innere eingekapselt werden und in einer biologisch aktiven Form an Zellen abgegeben werden. Damit ein Liposom ein effektives Gentransfervehikel darstellt, sollten die nachstehenden Eigenschaften vorliegen: (1) Einkapseln der Gene von Interesse mit hoher Effizienz, ohne dabei ihre biologische Aktivität zu gefährden, (2) vorrangiges und starkes Binden an eine Zielzelle im Vergleich zu nicht-Zielzellen, (3) Abgabe des wässrigen Vesikelinhaltes an das Cytoplasma der Zielzelle mit hoher Effizienz und (4) fehlerfreie und effektive Expression der genetischen Information.
Kleine molekulare Inhibitoren
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Identifizierung und Verwendung von kleinen Moleküle, die die Aktivität des erfindungemäßen CTGF-Fragment hemmen.
Die Identifizierung kleiner Moleküle, die die CTGF-Fragmentaktivität hemmen, kann mit Hilfe einer Vielzahl von Durchmusterungsverfahren durchgeführt werden. Für die Durchmusterung der Verbindungen sieht der Test ein nachweisbares Signal vor, das mit dem Binden der Verbindung an ein Protein oder ein zelluläres Ziel in Zusammenhang steht. Abhängig von der Art des Tests kann das nachweisbare Signal Lichtextinktion oder -emission, Plaquebildung oder ein anderes geeignetes Signal sein. Das Ergebnis kann qualitativ oder quantitativ sein. Für die Durchmusterung der Verbindungen hinsichtlich einer spezifischer Bindung können verschiedene Immuntests eingesetzt werden, um an die Zellen gebundene menschliche (oder von Primaten stammende) Antikörper nachzuweisen. Daher kann man markiertes anti-hlg, z.B. anti-hlgM, hlgG oder Kombinationen davon, verwenden, um spezifisch gebundenen, menschlichen Antikörper des Galactosyl-Epitops nachzuweisen. Verschiedene Markierungen wie Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Partikel usw. können verwendet werden. Es gibt eine Reihe von im Handel erhältlicher Kits, die markierte anti-hlg bereitstellen und gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt werden können.
Verschiedene Protokolle können für das Durchmustern einer Bank chemischer Verbindungen verwendet werden. Bis zu einem gewissen Grad wird die Auswahl des geeigneten Protokolls von der Art der Präparation der Verbindungen abhängen. Zum Beispiel können die Verbindungen an einzelne Teilchen, Nadeln, Membranen oder ähnliches gebunden sein, wobei jede der Verbindungen abtrennbar ist. Zusätzlich wird die Menge der verfügbaren Verbindung schwanken, abhängig von dem für die Erstellung der Bank eingesetzten Verfahren. Des weiteren kann man, abhängig von der Art, wie die Verbindung an den Träger gebunden ist, in der Lage sein Aliquots der Verbindung freizusetzen, um eine Serie von Tests durchzuführen. Zusätzlich wird die Art und Weise, in der die Verbindungen getestet werden, beeinflusst durch die Fähigkeit die Verbindung, von der gezeigt worden ist, dass sie eine Aktivität aufweist, zu identifizieren.
Wenn sich die Verbindungen einzeln auf einer Oberfläche in einem Gitter befinden, so dass man auf jeder Seite des Gitters die Zusammensetzung kennt, kann man einen Zellrasen bereitstellen, der ähnlich organisiert ist wie ein Gitter, und kann ihn mit den Verbindungen, die an die feste Oberfläche gebunden sind, in eine Passgenauigkeit bringen. Sobald der Rasen und das feste Substrat sich in Passgenauigkeit befinden, kann man die Verbindungen gemäß der Art und Weise, in der die Verbindungen befestigt sind, von der Oberfläche lösen. Nachdem eine ausreichende Zeit für das Binden der Verbindungen an die Proteine auf der Zelloberfläche verstrichen ist, kann man den Zellrasen waschen, um nicht-spezifisch gebundene Verbindungen zu entfernen. Ein oder mehrere Waschschritte können vonnöten sein, wobei die Waschschritte für unterschiedliche Stringenzstufen sorgen können, abhängig vom gewünschten Grad der Affinität. Nach Beendigung der Waschschritte kann Sängerblut oder -plasma zugegeben und für eine ausreichende Zeit inkubiert werden, um die Cytotoxizität zu gewährleisten. Das Plasma oder Blut kann dann entfernt und die Plaques können beobachtet werden, wobei die Art der Verbindung aufgrund der Position im Gitter bestimmt werden kann. Natürlich sollte das Plasma oder Blut frei von jeglichen Komponenten sein, die die Zellen des Rasen von sich aus abtöten würden.
Da der präparative Vorgang wiederholt werden kann, kann man eine Reihe von festen Substraten herstellen, wobei die gleichen Verbindungen an vergleichbaren Stellen hergestellt werden, so dass die Durchmusterung mit den gleichen oder anderen Zellen wiederholt werden kann, um die Aktivität der einzelnen Verbindungen zu bestimmen.
In einigen Fällen kann die Identität der Verbindung durch eine Nucleinsäuremarkierungssequenz bestimmt werden, wobei die Polymerasekettenreaktion zur Amplifizierung der Markierungssequenz verwendet wird. Siehe zum Beispiel WO93/20242 . In diesem Fall können die aktiven Verbindung bestimmt werden, indem das Lysat genommen wird und zu einem Polymerasekettenreaktionsmedium zugegeben wird, das Primer enthält, die spezifisch sind für die Nucleisäuremarkierungssequenz. Nach der Expansion kann man die Nucleinsäuremarkierungssequenz sequenzieren oder ihre Sequenz durch andere Mittel bestimmen, die das synthetische Verfahren, das zur Herstellung der Verbindung verwendet wurde, anzeigen werden.
In einer anderen Ausführungsform kann man markierte Teilchen haben, bei denen die Markierungen vom Teilchen freisetzbar sind und einen binären Code liefern, der das Syntheseverfahren der an das Teilchen gebundenen Verbindungen beschreibt. Siehe zum Beispiel Ohlmeyer et al., PNAS USA (1993) 90:10922. Diese Markierungen können günstiger Weise eine homologe Reihe von Alkylen Verbindungen sein, die mittels Gaschromatographie-Elektroneneinfang nachgewiesen werden können. Abhängig von der Art der Verbindungsgruppe kann man für eine teilweise Freisetzung von den Teilchen sorgen, so dass die Teilchen vor der Identifizierung der jeweiligen Verbindung 2- oder 3-mal verwendet werden können.
Obwohl zum größten Teil Banken erläutert worden sind, kann jede große Gruppe von Verbindungen auf analoge Weise durchmustert werden, solange das CTGF-Epitop mit jeder der Verbindungen verbunden werden kann. Daher können Verbindungen aus unterschiedlichen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, einschließlich Makrolide, Oligopeptide, Ribonucleinsäuren, Dendrimere usw. auch in einer analogen Weise durchmustert werden.
Die Erzeugung eines Plaques in dem Test zeigt, dass das Binden eines Mitglieds der Bank an die Zelle, gewöhnlicherweise ein Oberflächenprotein, nicht die Bindung des CTGF-Epitops an einen Antikörper stört, dass der Immunkomplex ausreichend stabil ist, um die Komplementkaskade einzuleiten, und dass das Mitglied eine hohe Affinität zur Zielverbindung hat.
Andere Durchmusterungsverfahren, um kleine Moleküle zu erhalten, die die Aktivität von erfindungsgemäßen CTGF-Fragmenten modulieren, werden in der PCT-Veröffentlichung WO 9813353 beschrieben.
ARZNEIMITTEL UND WEGE DER VERABREICHUNG
Um kleine Moleküle oder andere Agenzien, die für die vorliegenden Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Nierenerkrankung nützlich sind, indem die Aktivität und Expression von CTGF moduliert wird, zu identifizieren, können CTGF und biologisch aktive Fragmente davon zur Durchmusterung therapeutischer Verbindungen in jedem einer ganzen Reihe von Durchmusterungsverfahren verwendet werden.
In solchen Durchmusterungsverfahren eingesetzte Fragmente können frei in Lösung, auf einem festen Träger fixiert, auf einer Zelloberfläche getragen oder intrazellulär lokalisiert sein. Das Blockieren oder Reduzieren der biologischen Aktivität oder das Erzeugen von Bindungskomplexen zwischen CTGF und dem zu testenden Agens kann mittels auf dem Fachgebiet erhältlicher Verfahren gemessen werden.
Andere Verfahren für die Arzneistoffdurchmusterung, die eine Hochdurchsatz-Durchmusterung von Verbindungen bereitstellen, die geeignete Bindungsaffinitäten zu CTGF oder einem anderen Zielpolypeptid aufweisen, welches nützlich ist bei der Modulation, Regulation oder Inhibition der Expression und/oder Aktivität von CTGF, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel können Mikroanordnungen, die zu testende Verbindungen tragen, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt, verwendet und analysiert werden. Siehe z.B. Shalon, D. et al., 1995, PCT-Anmeldung Nr.: WO95/35505 ; Baldeschweiler et al., 1995, PCT-Anmeldung Nr.: WO95/251116 ; Brennan, T.M. et al., 1995, US-Patent Nr.: 5,474,796 ; Heller M.J. et al., 1997, US-Patent Nr. 5,605,662 .
Die Identifizierung von kleinen Molekülen, die die CTGF-Aktivität modulieren, kann auch durch verschiedene andere Durchmusterungsverfahren durchgeführt werden, die auch dazu dienen können Antiköper und andere Verbindungen, die mit CTGF interagieren, zu identifizieren und sie können als Arzneistoffe und Therapeutika in den vorliegenden Verfahren verwendet werden. Siehe z.B. Enna, S.J. et al., Hrsg., 1998, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley und Söhne. Die Tests liefern üblicherweise nachweisbare Signale, die mit dem Binden der Verbindung an ein Protein oder ein zelluläres Ziel in Zusammenhang stehen. Das Binden kann zum Beispiel durch Fluorophore, Enzymkonjugate und andere nachweisbare Markierung, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, nachgewiesen werden. Siehe z.B. Enna et al.. Die Ergebnisse können qualitativ oder quantitativ sein.
Für die Durchmusterung der Verbindungen hinsichtlich einer spezifischen Bindung können verschiedene Immuntests für den Nachweis von zum Beispiel menschlichen Antikörpern oder Primatenantikörpern, die an die Zellen gebunden sind, durchgeführt werden. Daher kann man markiertes anti-hlg, z.B. anti-hlgM, hlgG oder Kombinationen davon verwenden, um spezifisch gebundenen menschlichen Antikörper für das Galactosyl-Epitop nachzuweisen. Verschiedene Markierungen können verwendet werden wie Radioisotope, Enzyme, fluoreszenzierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Teilchen usw.. Es gibt eine Reihe im Handel erhältlicher Kits, die markiertes anti-hlg bereitstellen, das gemäß den Herstellerangaben eingesetzt werden kann.
Für die Durchmusterung der Verbindungen hinsichtlich ihrer cytotoxischen Wirkungen kann eine große Auswahl von Protokollen eingesetzt werden, um sicher zu stellen, dass man die gewünschte Aktivität hat. Normalerweise wird man Zellen verwendet, die natürlich vorkommende oder modifizierte Zelllinien oder ähnliches sind. Die Zellen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Wenn man zum Beispiel an einem Pathogen interessiert ist, bei dem es keine Rolle spielt, an welches Epitop die konjugierte Verbindung bindet, kann man die pathogenen Zellen mit irgendeiner der Verbindungen in Anwesenheit eines antiköperabhängigen, cytotoxischen Systems kombinieren, um die cytotoxische Wirkung zu bestimmen. Diesen Test kann man entweder vor oder nach der Bestimmung der Wirkung der verschiedenen Kandidatenverbindungen auf die Zellen des Wirts, an den die Verbindung verabreicht würde, durchführen. Auf diese Weise würde man eine Differenzialanalyse zwischen der Affinität zum pathogenen Ziel und der Affinität zu Wirtszellen, die getroffen werden könnten, basierend auf der Art der Verabreichung erhalten.
In einigen Situationen würde man an einem bestimmten zellulären Zustand wie beispielsweise einem aktivierten Zustand, wie er in T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen, Transplantationen und ähnlichem vorkommen kann, interessiert sein. In dieser Situation würde man zuerst die Verbindungen durchmustern, um solche zu bestimmen, die an die ruhenden Zellen binden, und solche, die nicht an die ruhenden Zellen binden, und die verbleibenden Kandidatenverbindungen hinsichtlich ihrer Cytotoxizität gegenüber den aktivierten Zellen durchmustern. Dann kann man hinsichtlich anderer Zellen, die im Wirt vorkommen und von den Verbindungen getroffen werden können, durchmustern, um ihre cytotoxische Wirkung zu bestimmen. In einer anderen Ausführungsform kann man Krebszellen und normale Zellen einsetzen, um zu bestimmen, ob eine der Verbindungen eine höhere Affinität zu den Krebszellen hat im Vergleich zu normalen Zellen. Wieder könnte man die Bank nach Verbindungen durchmustern, die an normale Zellen binden, und die Wirkung bestimmen. Solche Verbindungen, die nicht cytotoxisch gegenüber normalen Zellen sind, könnten dann hinsichtlich ihrer cytotoxischen Wirkung auf Krebszellen durchmustert werden. Sogar wenn eine gewisse Cytotoxizität gegenüber normalen Zellen vorhanden ist, könnte man im Fall von Krebszellen, falls ein ausreichender Unterschied in der cytotoxischen Aktivität vorliegt, die geringere Cytotoxizität gegenüber normalen Zellen tolerieren, wenn von der Verbindung ansonsten gezeigt wird, dass sie wirksam gegenüber Krebszellen ist.
Anstelle der Verwendung von Zellen, die natürlich erhalten werden, kann man Zellen verwenden, die durch Rekombinationstechniken modifiziert worden sind. Daher kann man Zellen einsetzen, die in Kultur wachsen können und die durch die Hoch- oder Herunterregulation eines bestimmten Gens modifiziert werden können. Auf diese Weise würde man Zellen haben, die sich durch ein einzelnes Protein auf der Oberfläche unterscheiden. Man könnte dann die Bank differentiell hinsichtlich der Wirkung von Bankmitgliedern auf die Zellen, bei denen das bestimmte Protein anwesend ist oder nicht, testen. Auf diese Weise könnte man bestimmen, ob die Verbindung eine spezifische Affinität gegenüber einem bestimmten Oberflächenmembranprotein aufweist, die sich von jedem der Proteine, die sich auf der Oberflächenmembran befinden, unterscheidet.
Durch die Verwendung von Antikörpern, die an ein bestimmtes Membranoberflächenprotein binden, kann man zwischen Zellen unterscheiden, wenn die Antikörper nicht die komplementabhängigen cytotoxische Wirkung einleiten, zum Beispiel durch die Verwendung von unterschiedlichen Spezies, Isotypen oder Kombinationen davon. Durch die Zugabe von Antikörpern, blockierenden Antiseren oder monoclonalen Antikörpern zu einem Teil der Zellen werden solche Zellen das Zielprotein nicht aufweisen, das für das Binden des Bankmitglieds verfügbar ist. Auf diese Weise erzeugt man vergleichende Zellen, die sich in ihrer Antwort, begründet auf der Nicht-Verfügbarkeit einer Gruppe eines einzelnen Proteins, unterscheiden. Während Antikörper gewöhnlich das zweckmäßigste, verwendbare Reagens darstellen, können andere spezifische Bindungseinheiten eingesetzt werden, die die gleiche Funktion liefern.
Für die Verwendung im Test zur Bestimmung der Bindung kann man ein antikörperabhängiges cytotoxisches System verwenden. Man könnte synthetische Gemische der Bestandteile verwenden, wenn nur solche Komponenten, die für die cytotoxische Wirkung nötig sind, vorhanden sind. Dies kann wünschenswert sein, wenn Blut- oder Plasmakomponenten die Ergebnisse des Tests gegenläufig beeinflussen.
Obwohl ein Zellrasen für die Durchmusterung einer großen Anzahl von Kandidaten einen besonders günstigen Weg darstellt, können ebenso andere Verfahren Verwendung finden. Diese Verfahren schließen die Verwendung von Multimuldenplatten und die verschiedenen für die Präparation der kombinatorischen Bank verwendeten Vorrichtungen wie Nadeln, Teebeutel etc., ein. Man kann die Zellen bezüglich der Art der verschiedenen Vorrichtungen getrennt wachsen lassen, wobei die Vorrichtungen dann mit den Zellen in Kontakt gebracht werden können, oder man lässt die Zellen auf den Vorrichtungen wachsen. Die Vorrichtungen kann in einer geeigneten Kultur untergetaucht sein, auf ihr können Zellen ausgesät sein oder sie kann auf andere Weise für den Kontakt zwischen den Zellen und der Kandidatenverbindung bereitgestellt werden. Nach Zugabe des cytotoxischen Agens kann man dann auf verschiedenen Wegen auf Lyse analysieren. Zum Beispiel kann ein FACS verwendet werden, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden, eine sup 51Cr-Freisetzung kann durchgeführt werden, oder der Nachweis einer intrazellulären Verbindung im Überstand kann dazu dienen aktive Verbindungen nachzuweisen.
Zusätzlich kann es wünschenswert sein, zu wissen, ob die Verbindung eine Agonisten- oder Antagonistenaktivität aufweist. Die vorliegenden Testverfahren liefern einen schnellen Weg zur Bestimmung solcher Verbindungen, die in der Bank vorhanden und an das Zielprotein binden. Hat man einmal die Anzahl der Kandidatenverbindung wesentlich eingeengt, kann man differenziertere Test für den Nachweis der Aktivität der Verbindung selbst verwenden. Auf diesem Wege kann man eine schnelle Durchmusterung durchführen, um die Bindungsaffinität und – spezifität zu bestimmen, gefolgt von einer intensiveren Durchmusterung zur Bestimmung der Aktivität. Es gibt verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Aktivität, wobei die Zellen modifiziert sein können, so dass ein Markergen aktiviert wird, das ein nachweisbares Signal liefern wird. Günstigerweise kann das Signal mit der Herstellung eines Farbstoffes, der Herstellung eines Membranoberflächenproteins, das mit markierten Antikörpern nachgewiesen werden kann, oder der Sekretion eines Proteins, das im Überstand durch jedes einer Reihe von Verfahren nachgewiesen werden kann, in Zusammenhang stehen. Zum Beispiel kann das exprimierte Gen Luziferase sein, die modifiziert ist, um eine Leader-Sequenz aufweisen, um sezerniert zu werden, wobei der Überstand hinsichtlich der Lichterzeugung durch ein geeignetes Substrat durchmustert werden kann.
Verschiedene Protokolle können für die Durchmusterung der Bank eingesetzt werden. Bis zu einem gewissen Grad wird dies von der Art der Präparation der Verbindungen abhängen. Zum Beispiel können die Verbindungen an einzelne Teilchen, Nadeln, Membranen oder Ähnliches gebunden sein, wobei jede der Verbindungen abtrennbar ist. Zusätzlich wird die Menge der verfügbaren Verbindung schwanken, abhängig von dem für die Erstellung der Bank eingesetzten Verfahren. Des weiteren kann man, abhängig von der Art, wie die Verbindung an den Träger gebunden ist, in der Lage sein Aliquots der Verbindung freizusetzen, um eine Serie von Tests durchzuführen. Zusätzlich wird die Art und Weise, in der die Verbindungen getestet werden, beeinflusst durch die Fähigkeit die Verbindung, von der gezeigt worden ist, dass sie eine Aktivität aufweist, zu identifizieren.
Wenn sich die Verbindungen einzeln auf einer Oberfläche in einem Gitter befinden, so dass man auf jeder Seite des Gitters die Zusammensetzung kennt, kann man einen Zellrasen bereitstellen, der ähnlich organisiert ist wie ein Gitter, und kann ihn mit den Verbindungen, die an die feste Oberfläche gebunden sind, in eine Passgenauigkeit bringen. Sobald der Rasen und das feste Substrat sich in Passgenauigkeit befinden, kann man die Verbindungen gemäß der Art und Weise, in der die Verbindungen befestigt sind, von der Oberfläche lösen. Nachdem eine ausreichende Zeit für das Binden der Verbindungen an die Proteine auf der Zelloberfläche verstrichen ist, kann man den Zellrasen waschen, um nicht-spezifisch gebundene Verbindungen zu entfernen. Ein oder mehrere Waschschritte können vonnöten sein, wobei die Waschschritte für unterschiedliche Stringenzstufen sorgen können, abhängig vom gewünschten Grad der Affinität. Nach Beendigung der Waschschritte kann Säugerblut oder -plasma zugegeben und für eine ausreichende Zeit inkubiert werden, um die Cytotoxizität zu gewährleisten. Das Plasma oder Blut kann dann entfernt und die Plaques können beobachtet werden, wobei die Art der Verbindung aufgrund der Position im Gitter bestimmt werden kann. Das Plasma oder Blut kann frei sein von jeglichen Komponenten, die natürlicherweise die Zellen des Rasen abtöten würden.
Da der präparative Vorgang wiederholt werden kann, kann man eine Reihe von festen Substraten herstellen, wobei die gleichen Verbindungen an vergleichbaren Stellen hergestellt werden, so dass die Durchmusterung mit den gleichen oder anderen Zellen wiederholt werden kann, um die Aktivität der einzelnen Verbindungen zu bestimmen. In einigen Fällen kann die Identität der Verbindung durch eine Nucleinsäuremarkierungssequenz bestimmt werden, wobei die Polymerasekettenreaktion zur Amplifizierung der Markierungssequenz verwendet wird. Siehe z.B. PCT-Anmeldung Nr. WO93/20242 . In diesem Fall können die aktiven Verbindung bestimmt werden, indem das Lysat genommen wird und zu einem Polymerasekettenreaktionsmedium zugegeben wird, das Primer enthält, die spezifisch sind für die Nucleisäuremarkierungssequenz. Nach der Expansion kann man die Nucleinsäuremarkierungssequenz sequenzieren oder ihre Sequenz durch andere Mittel bestimmen, welche die Auswahl des Verfahrens, das zur Herstellung der Verbindung verwendet wurde, anordnen werden.
In einer anderen Ausführungsform kann man markierte Teilchen haben, bei denen die Markierungen vom Teilchen freisetzbar sind und einen binären Code liefern, der das Syntheseverfahren der an das Teilchen gebundenen Verbindungen beschreibt. Siehe z.B. Ohlmeyer et al., 1993, PNAS, 90:10922. Diese Markierungen können günstigerweise eine homologe Reihe von Alkylen-Verbindungen sein, die mittels Gaschromatographie-Elektroneneinfang nachgewiesen werden können. Abhängig von der Art der Verbindungsgruppe kann man für eine teilweise Freisetzung von den Teilchen sorgen, so dass die Teilchen vor der Identifizierung der jeweiligen Verbindung 2- oder 3-mal verwendet werden können.
Obwohl zum größten Teil Banken erläutert worden sind, kann jede große Gruppe von Verbindungen auf analoge Weise durchmustert werden, solange das CTGF-Epitop mit jeder der Verbindungen verbunden werden kann. Daher können Verbindungen aus unterschiedlichen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, einschließlich Makrolide, Oligopeptide, Ribonucleinsäuren, Dendrimere usw. auch in einer analogen Weise durchmustert werden.
Die Erzeugung eines Plaques in dem Test zeigt, dass das Binden eines Mitglieds der Bank an die Zelle, gewöhnlicherweise ein Oberflächenprotein, nicht die Bindung des CTGF-Epitops an einen Antikörper stört, dass der Immunkomplex ausreichend stabil ist, um die Komplementkaskade einzuleiten, und dass das Mitglied eine hohe Affinität zur Zielverbindung hat.
Die vorliegende Methodik kann in jeder Situation verwendet werden, in der man ein abzutötendes zelluläres Ziel hat, insbesondere solche zellulären Ziele, die wenige oder keine CTGF-Epitope aufweisen. Daher kann das zelluläre Ziel ein pathogener Prokaryont sein. Zu den verschiedenen Organismen gehören zum Beispiel Mikrobakterium, Yersinia, Pseudomonas, Bordetella Pertussis, Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoea, Streptococcus, Hemophilus influenza usw.. Andere Pathogene schließen Eukaryonten, insbesondere Pilze wie Candida, Histoplasma usw., und Protozoen, z.B. Giardia, ein. Zusätzlich können Viren, die in infizierten Zellen Membranoberflächenproteine liefern, das Ziel der vorliegenden Verbindungen sein, wenn die Zellen, die durchmustert werden, vital infiziert worden sind.
Auch Wirtszellen können als Ziele dienen, wenn die Zellen entweder abnormal sind oder in ungünstiger Weise auf den Wirt oder auf Behandlungen des Wirts wirken. Zum Beispiel Krebsgewebe, die man von normalem Gewebe unterscheiden kann, können als Ziel für die vorliegenden Verbindungen dienen. T- oder B-Zellen, die mit Autoimmunerkrankungen oder mit der GVHD oder Transplantatabstoßung in Zusammenhang stehen, können ebenso als Ziele dienen. Abweichende Zellen können ungeachtet ihrer Art ebenfalls als Ziele dienen, solange man sie von normalen Zellen unterscheiden kann. Daher können psoriatische Läsionen, Lymphomzellen, bakterielle, pilzliche, parasitäre und virusinfizierte Zellen Ziele der vorliegenden Produkte sein. Auch wenn man wünscht einen Teil der Zellen abzulösen, ohne alle Zellen zu entfernen, wie beispielsweise Zellen, die einen Differenzierungsmarker exprimieren, wie beispielsweise T-Zelluntergruppen, aktivierte Blutplättchen, Endothelzellen und hormon- oder cytokinrezeptorexprimierende Zellen, können die vorliegenden Verbindungen Anwendung finden.
Andere Durchmusterungsverfahren, um kleine Moleküle zu erhalten, die die Aktivität von CTGF modulieren, können zum Beispiel in der PCT-Anmeldung Nr. WO 9813353 gefunden werden.
Verbindungen/Moleküle
Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen, die mit Nierenfibrose in Zusammenhang stehen, durch Modulieren, Regulieren oder Hemmen der Aktivität von CTGF. Diese Verfahren können die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, die die Bindungsinteraktionen blockiert oder Enzyme blockiert, die in den Signalübertragungsweg von CTGF verwickelt sind, umfassen. Genauer liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Aktivität von CTGF durch die Verabreichung von Verbindungen, die die Induktion von CTGF blockieren.
Verbindungen, die die CTGF-Genexpression und/oder CTGF-Aktivität in dem erfindungsgemäßen Verfahren modulieren, schließen Agenzien, die eine Erhöhung der cyclischen Nucleotide in der Zelle verursachen, ein. Andere Verbindungen, die die Induktion von CTGF gemäß den Verfahren der Erfindung blockieren können, können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Durchmusterungsverfahren identifiziert werden.
In einer Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung oder eines Agens, welche/s die Aktivität, z.B. die Produktion von extrazellulären Matrixproteinen, die Induktion der Myofibroblastendifferenzierung oder die Induktion der Kollagensynthese, eines CTGF-Fragments, z.B. eines Fragments, das von den Exons 2 und 3 codiert wird, wie in 3 dargelegt, moduliert. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen eines Agens von Interesse wie beispielsweise eines Peptids, eines kleinen Moleküls, eines Polypeptids oder eines mimetischen Peptids mit den Zellen (z.B. Fibroblasten) und einem CTGF-Fragment, von dem bekannt ist, dass es die gewünschte Aktivität aufweist, z.B. Herstellung von Kollagen, und das Messen der Fähigkeit der Zellen Kollagen herzustellen durch jedes von einem Fachmann bekannte Mittel (siehe BEISPIELE). Die Fähigkeit der Zellen Kollagen herzustellen wird dann mit der Fähigkeit einer geeigneten Kontrollpopulation von Zellen Kollagen zu produzieren in Abwesenheit des Agens oder der Verbindung verglichen.
Der Begriff „Agens" oder „Verbindung", wie hierin verwendet, beschreibt irgendein Molekül, z.B. ein Protein, ein Polypeptid oder Pharmazeutikum, das die Fähigkeit besitzt eine Aktivität eines CTGF-Fragments, wie hierin beschrieben, zu beeinflussen. Das Agens kann alles sein, von dem man weiß oder erwartet, dass es in der Lage ist auf die Zellen einzuwirken. Das Agens schließt Peptidfragmente des CTGF-Polypeptides ein. Zu den Agenzien gehören synthetische chemische Agenzien, biochemische Agenzien, Zellen, Extrakte, Homogenste und konditioniertes Medium. Das zu testende Agens kann auch eine kombinatorische Bank für die Durchmusterung einer Vielzahl von Verbindungen sein. Verbindungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert werden, können weiter bewertet, nachgewiesen, cloniert, sequenziert und ähnliches werden, entweder in Lösung oder nach Binden an einen festen Träger. Dazu eignet sich jedes Verfahren, das gewöhnlich für den Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz verwendet wird, wie beispielsweise PCR, Oligomerrestriktion (Saiki et al., 1985, Bio/Technology 3:1008–1012), allelspezifische Oligonucleotid (ASO)-Sondenanalyse (Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278), Oligonucleotid-Ligierungstests (OLAs) (Landegren et al., 1988, Science 241:1077) und ähnliche. Molekulare Verfahren für die DNA-Analyse wurden in einem Übersichtsartikel veröffentlicht (Landegren et al., 1988, Science 242:229–237).
Kandidatenagenzien umfassen eine Reihe von chemischen Klassen. Sie können organische Moleküle sein, vorzugsweise kleine, organische Verbindungen mit einem Molekulargeweicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2500 Dalton. Kandidatenagenzien enthalten funktionelle Gruppen, die nötig sind für die strukturelle Interaktion mit Proteinen, insbesondere Wasserstoffbrücken, und umfassen üblicherweise mindestens eine Amino-, eine Carbonyl-, eine Hydroxyl- oder eine Carboxylgruppe, vorzugsweise mindestens zwei funktionelle, chemische Gruppen. Die Kandidatenagenzien enthalten häufig cyclischen Kohlenstoff oder heterocyclische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, substituiert mit einer oder mehreren der vorstehenden funktionellen Gruppen. Kandidatenagenzien werden auch unter Biomolekülen gefunden; ohne darauf beschränkt zu sein, gehören dazu: Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, strukturelle Analoge oder Kombination davon. Kandidatenagenzien können Polypeptide sein oder Polypeptide, die mittels ortsgerichteter Mutagenese oder Zufallsmutagenese einer synthetischen oder natürlich vorkommenden Nucleinsäuresequenz hergestellt werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht das Verfahren die Verabreichung von Molekülen vor, die die post-translationale Modifikation des Volllängen-CTGF stören oder die Aktivierung eines inaktiven Vorläufers von CTGF blockieren. Wie hierin erörtert, hat das Aussetzen von Mesangiumzellen gegenüber TGF-β zufolge, dass eindeutig zusätzliche Banden bei 28-30 kDA erscheinen, die in ihrer Größe den carboxy- und aminoterminalen Hälften des Volllängen-CTGF-Moleküls entsprechen. Wie vorstehend beschrieben, kann die TGF-β-Behandlung zur Herstellung von Proteasen oder anderen Faktoren führen, die in der Lage sind das Volllängen-Molekül zu spalten. Moleküle, die die CTGF-Aktivität hemmen, können durch die Verwendung von hierin bereitgestellten Durchmusterungsverfahren identifiziert werden.
ARZNEIMITTEL UND WEGE DER VERABREICHUNG
Verabreichungswege
Die Zusammensetzungen, die CTGF-Modulatoren enthalten, d.h. die Antikörper, Antisenseoligonucleotide, kleinen Moleküle und anderen Verbindungen, wie sie hierin beschrieben werden, können per se an menschliche Patienten oder in Arzneimitteln verabreicht werden, die falls nötig, geeignete Träger oder Excipienten enthalten. Die vorliegende Erfindung zieht Behandlungsverfahren in Betracht, bei denen Agenzien, die die Expression oder Aktivität von CTGF oder Fragmenten davon modulieren oder regulieren, an einen Patienten, der diese benötigt, verabreicht werden, und zwar in Mengen, die geeignet sind, um die Aktivität oder Expression des CTGF-Fragments zu behandeln oder zu verhindern. Die vorliegenden Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung können die Verabreichung einer wirksamen Menge des Agens an ein Individuum, das vorzugsweise ein Säuger und stärker bevorzugt ein Mensch ist, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind das Säugerindividuum und das verabreichte Agens homologen Ursprungs. Stärker bevorzugt sind das Individuum und das verabreichte Agens menschlichen Ursprungs.
Eine wirksame Menge kann leicht durch Routineversuche bestimmt werden, genauso wie der effizienteste und praktischste Weg der Verabreichung und die geeignetste Formulierung. Verschiedene Systeme zur Freisetzung der Formulierungen und Arzneistoffe sind auf dem Fachgebiet erhältlich. Siehe z.B. Gennaro A.R., Hrsg., 1990, Remingtons's Pharmaceutical Science, 18. Aufl., Mack Publishing Co., Esston PA. Zu den geeigneten Verabreichungswegen können zum Beispiel die orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung oder parenterale Freisetzung, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen genauso wie intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen gehören. Die Zusammensetzung kann besser in einer örtlichen als einer systemischen Art und Weise verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise durch gewöhnliche Mischungs-, Auflösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Zerreibungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschließungs- oder Lyophilisierungsverfahren. Wie vorstehend angemerkt, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger wie beispielsweise Excipienten und Hilfsstoffe einschließlich, die die Verarbeitung der aktiven Moleküle in Präparate für den pharmazeutischen Gebrauch vereinfachen. Die passende Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Für die Injektion kann die Zusammensetzung zum Beispiel in wässrigen Lösungen zubereitet werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie beispielsweise Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung. Für die transmukosale Verabreichung werden je nach Barriere, die durchdrungen werden muss, Durchdringungsstoffe in der Formulierung verwendet. Solche Durchdringungsstoffe sind auf dem Fachgebiet im Allgemeinen bekannt. Für die orale Verabreichung können die Verbindungen leicht durch Kombinieren der aktiven Verbindungen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, formuliert werden. Solche Träger erlauben es die erfindungsgemäßen Verbindungen für die orale Aufnahme durch ein Individuum in Form von Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gelen, Sirupen, Schlämmen, Suspensionen und Ähnliches zu formulieren. Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen wie beispielsweise Zäpfchen oder Retentionseinläufe, die z.B. herkömmliche Suppositoriumsgrundlagen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Arzneimittel für den oralen Gebrauch können als feste Excipienten erhalten werden, wahlweise durch Vermahlen eines resultierendes Gemisches und falls gewünscht nach Zugabe von geeigneten Hilfsmitteln durch Aufbereiten des Granulatgemischs, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Excipienten sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosezubereitungen wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können Zerfallsmittel zugegeben werden, wie beispielsweise das vernetzende Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die wahlweise Gummiarabikum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifizierung oder Charakterisierung verschiedener Kombinationen aktiver Verbindungsdosen zugegeben werden.
Arzneimittel für die orale Verabreichung schließen Push-Fit-Kapseln aus Gelatine genauso wie weiche, versiegelte Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glycerin oder Sorbit ein. Die Push-Fit-Kapseln können die Wirkstoffe in Beimengung mit Füllstoffen wie Lactose, Bindemittel wie Stärke und/oder Gleitmittel wie Talkum oder Magnesiumstearat und wahlweise Stabilisatoren enthalten. Bei weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten wie Fettöle, flüssiges Paraffin oder flüssige Polyethylenglycole gelöst oder suspendiert werden. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen für eine orale Anwendung sollten in Dosierungen sein, die für solch eine Verabreichung geeignet sind.
Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für den Gebrauch gemäß der vorliegenden Erfindung günstigerweise in Form einer Aerosolspraydarreichung aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Zerstäuber unter Verwendung eines geeigneten Treibgases, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder jedes andere geeignete Gas, freigesetzt. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die geeignete Dosierungseinheit festgelegt werden, indem ein Ventil zur Abgabe einer dosierten Menge bereit gestellt wird. Es können Kapseln und Kartuschen, zum Beispiel aus Gelatine, für die Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator zubereitet werden. Diese enthalten normalerweise eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulvergrundlage wie Lactose oder Stärke.
Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion zubereitet werden, können in Form einer Einheitsdosierung, z.B. Ampullen oder in Mehrdosis-Behältern, mit einem zugegebenen Konservierungsmittel dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln einnehmen und können Formulierungsagenzien wie Suspendiermittel, Stabilisatoren und/oder Dispersionsmittel enthalten.
Formulierungen für die parenterale Verabreichung schließen wässrige Lösungen von Agenzien, die eine Wirkung auf die Aktivität von CTGF oder Fragmenten davon haben, in wasserlöslicher Form, ein.
Suspensionen der aktiven Verbindungen können als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle wie Sesamöl und synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Stoffe enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Wahlweise kann die Suspension auch geeignete Stabilitsatoren oder Agenzien enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Zubereitung von hochkonzentrierten Lösungen zu ermöglichen. In einer anderen Ausführungsform kann der Wirkstoff in Pulverform vorliegen, um ihn mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor dem Gebrauch zu rekonstituieren.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch als ein Depotpräparat zubereitet werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Daher können die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als eine Emulsion in einem geeigneten Öl) oder Ionenaustauschharz oder als schwerlösliche Derivate, zum Beispiel als schwerlösliches Salz, formuliert werden.
Pharmazeutische Träger für die hydrophoben Moleküle der Erfindung können Co-Lösungsmittelsysteme einschließen, die zum Beispiel Benzylalkohol, ein nicht-polares grenzflächenaktives Mittel, ein mit Wasser mischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase enthalten. Bei dem Co-Lösungsmittelsystem kann es sich um das VPD-Co-Lösungsmittelsystem handeln. VPD ist eine Lösung mit 3% Gew./Vol. Benzylalkohol, 8% Gew./Vol. des nicht-polaren grenzflächenaktiven Mittels Polysorbat 80 und 65% Gew./Vol. Polyethylenglycol 300, mit absolutem Ethanol zum entsprechendem Volumen aufgefüllt. Das VPD-Co-Lösungsmittelsystem (VPD:5W) besteht aus VPD 1:1 verdünnt mit 5% Dextrose in Wasserlösung. Dieses Co-Lösungsmittelsystem ist wirksam beim Auflösen hydrophober Verbindungen und bewirkt nach systemischer Verabreichung eine geringe Toxizität. Natürlich können die Anteile eines Co-Lösungsmittelsystems beträchtlich verändert werden, ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätseigenschaften zu zerstören. Des weiteren kann die Identität der Co-Lösungsmittelverbindungen variieren. Zum Beispiel können andere, wenig toxische, nicht-polare grenzflächenaktive Mittel anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden, die Größe des Anteils an Polyethylenglycol kann variieren, andere biologisch verträgliche Polymer können Polyethylenglycol ersetzen, z.B. Polyvinyipyrrolidon, und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
In einer anderen Ausführungsform können andere Freisetzungssysteme für hydrophobe Moleküle eingesetzt werden. Lipsomen und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Freisetzungsvehikel oder -träger für hydrophobe Arzneistoffe. Bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid können auch eingesetzt werden, allerdings gewöhnlich auf Kosten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung von Retardfreisetzungssystemen wie semipermeablen Matrizen fester hydrophober Polymere, die die wirksame Menge der zu verabreichenden Zusammensetzung enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Retardfreisetzungsmaterialien sind etabliert und für den Fachmann erhältlich. Retardfreisetzungskapseln können abhängig von ihrer chemischen Eigenschaft die Verbindungen für wenige Wochen bis über 100 Tage freisetzen. Abhängig von der chemischen Eigenschaft und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagens können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
Wirksame Dosierung
Für jede in den vorliegenden Behandlungsverfahren verwendete Zusammensetzung kann anfänglich eine therapeutisch wirksame Dosis unter Verwendung einer Reihe von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren abgeschätzt werden. In einem Zellkulturtest kann zum Beispiel eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erzielen, der den IC₅₀-Wert, wie er in der Zellkultur bestimmt wurde, einschließt. Wenn eine Hemmung der CTGF-Aktivität gewünscht ist, kann zum Beispiel die Konzentration der Testverbindung, die die halbmaximale Hemmung der CTGF-Aktivität erreicht, bestimmt werden. Der für ein menschliches Individuum geeignete Dosierungsbereich kann unter Verwendung von Ergebnissen, die von Zellkulturtests und anderen Tierstudien erhalten wurden, bestimmt werden.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge des Moleküls, die zu einer Besserung der Symptome oder einer Lebensverlängerung bei dem Individuum führt. Toxizität und therapeutische Wirksamkeit solcher Moleküle können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder mit Versuchstieren, z.B. durch Bestimmen der LD₅₀ (Lethaldosis für 50% der Population) und der ED₅₀ (therapeutisch wirksame Dosis bei 50% der Population), bestimmt werden. Das Dosisverhältnis von toxischen zu therapeutische Effekten entspricht dem therapeutische Index, der als Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden kann. Moleküle, die hohe therapeutische Indizes aufweisen, werden bevorzugt.
Die Dosierungen fallen vorzugsweise innerhalb eines Bereichs der zirkulierenden Konzentrationen, die die ED₅₀ einschließen, mit geringer oder keiner Toxizität. Dosierungen können innerhalb dieses Bereichs schwanken, abhängig von der eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung werden mit Blick auf die Besonderheiten des Zustandes eines Individuums gewählt.
Dosierungsmenge und -intervall können individuell angepasst werden, um Plasmaspiegel der aktiven Einheit bereitzustellen, die ausreichend sind, um die CTGF-Aktivität wie gewünscht zu modulieren oder regulieren, d.h. minimal wirksame Konzentration (MEC). Die MEC wird für jede Verbindung schwanken, kann aber zum Beispiel von in vitro-Daten abgeschätzt werden, wie beispielsweise die Konzentration, die nötig ist um 50–90% der CTGF-Aktivität zu erreichen, um das Knochenwachstum, unter Verwendung der hierin beschriebenen Tests, zu induzieren.
Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, werden von individuellen Eigenschaften und dem Verabreichungsweg abhängen. Zusammensetzungen sollten unter einem Behandlungsplan verabreicht werden, die die Plasmaspiegel für etwa 10–90% der Behandlungsdauer, vorzugsweise etwa 30–90% der Behandlungsdauer und am meisten bevorzugt zwischen 50–90%, über der MEC hält. Im Fall einer lokalen Verabreichung oder selektiven Aufnahme mag die wirksame lokale Konzentration des Arzneistoffs nicht den Plasmakonzentrationen entsprechen.
Die Menge der verabreichten Zusammensetzung wird natürlich von einer Reihe von Faktoren abhängen, dazu gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, das besondere Gewicht des Individuums, die Schwere des Leidens, die Art und Weise der Verabreichung und das Urteil das behandelnden Arztes.
Verpackung
Die Zusammensetzungen können, falls gewünscht, in einer Packung oder einer Spendervorrichtung, die eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen, welche den Wirkstoff aufweisen, enthalten können. Die Verpackung kann zum Beispiel Metal- oder Plastikfolie wie beispielsweise eine Blisterpackung enthalten. Der Packung oder Spendervorrichtung kann eine Verabreichungsanweisung beiliegen. Es können auch Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, die in einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert wurde, hergestellt, in einen geeigneten Behälter gebracht und für die Behandlung eines angezeigten Zustandes etikettiert werden. Entsprechende Bedingungen, die auf dem Etikett angegeben werden, schließen die Behandlung von Störungen oder Krankheiten, bei denen Knorpel- oder Knocheninduktion, Wundheilung, Nervenschutz, Nierenfibrose, Diabetes oder Ähnliches gewünscht wird, ein.
BEISPIELE
Die nachstehenden Beispiele werden einzig geliefert, um die beanspruchte Erfindung zu veranschaulichen. Allerdings wird die vorliegende Erfindung in ihrem Umfang durch die beispielhaft aufgeführten Ausführungsformen nicht eingeschränkt, die nur als Veranschaulichungen von einzelnen Aspekten der Erfindung vorgesehen sind, und funktionell gleichwertige Verfahren liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Tatsächlich werden dem Fachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hierin beschriebenen durch die vorstehende Beschreibung und die begleitenden Abbildungen offensichtlich sein. Es ist vorgesehen, dass solche Modifikation in den Geltungsbereich der anhängenden Ansprüchen fallen.
Beispiel 1: CTGF-Fragmente stimulieren die extrazelluläre Matrixsynthese
Für die Herstellung von CTGF-Fragmenten wurde menschliches rekombinantes CTGF (gesamte Länge) durch Chymotrypsin gespalten, um ein CTGF-Fragment zu ergeben. Es wurden auch rekombinante CTGF-Fragmente hergestellt, indem entweder eines von Exon 2 und Exon 3 oder beide Exons von CTGF exprimiert wurden. Eine kontinuierliche Linie von gezüchteten normalen Rattennieren (NRK)-Fibroblasten, als Clon NRK-49F bezeichnet, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen, um Zellkulturen herzustellen. Menschliche Vorhautfibroblasten wurden aus Explantatkulturen etabliert. Zellkulturen wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-medium (DME), das 2,5% fötales Rinderserum und 2,5% Nu-Serum I (Collaborative Biomedical Products, Redford, MA) enthielt, aufrechterhalten und, bevor sie konfluent waren, wurde bei ihnen eine Passage durchgeführt.
Um die Kollagensynthese der Fibroblasten zu untersuchen, wurden wachstumsarretierte Einzelzellschichten von NRK-Fibroblasten und menschliches Vorhautfibroblasten hergestellt, indem 10 000 Zellen/Mulde in Platten mit 48 Mulden ausgesät wurden und die Zellen für die Dauer von 5 bis 7 Tage in DME und 2,5% fötalem Rinderserum/Nu-Serum wachsen konnten bis sie konfluent waren. Man ließ die Fibroblasten-Einzelzellschichten dann in DME, das 25 mM HEPES und ITS-Vormischung (Collaborative Biomedical) enthielt, für die Dauer von 1 bis 8 Tagen an Serum aushungern. Dann wurden Ascorbinsäure (50 mg/ml) und die biologische Agenzien (CTGF-Fragmente) zugegeben. Die Kollagensynthese wurde ermittelt, indem der Einbau von ³H-Prolin in pepsinresistentes, salzpräzipitiertes, mit der Zelloberfläche assoziiertes, extrazelluläres Kollagen gemessen wurde, und zwar unter Verwendung eines quantitativen Tests für die letzten 24 Stunden einer 48-stündigen Behandlung. Wie in 2 dargelegt, stimulierten die CTGF-Fragmente, die die Exons 2 und 3 von CTGF umfassen, die Kollagensynthese in NRK-Fibroblasten mit 1 ng/ml TGF-β. Im Gegensatz dazu stimulierte der carboxyterminale CTGF die Kollagensynthese nicht.
Beispiel 2: CTGF-Fragmente induzieren die Myofibroblastendifferenzierung
Die CTGF-Fragmente und Zellkulturen wurden hergestellt, wie vorstehend beschrieben. Um die Induktion der Myofibroblasten durch die CTGF-Fragmente zu untersuchen, wurden wachstumsarretierte Einzelzellschichtenen von NRK-Fibroblasten oder Vorhautfibroblasten, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und behandelt. Nach den Behandlungen wurden die in Platten mit 48 Mulden wachsenden Einzelzellschichten zweimal mit TBS gewaschen und in Methanol bei – 20 Grad C für die Dauer von 10 Minuten vor der Bearbeitung für den immunhistologischen Nachweis von alpha-glatter Muskulatur fixiert. Der immunhistologische Nachweis wurde durchgeführt. Nach dem Fixieren wurden die einzelligen Schichten zweimal mit TBS gewaschen und für die Dauer von 30 Minuten mit 10% Pferdeserum/2% Milch in TBS blockiert. Die Zellen wurden dann für die Dauer von 1 Stunde mit monoclonalem Maus-IgG gegen alpha-Actin von glatter Muskulatur (Clon 1A4, Sigma Chemical) in einer 1:200-Verdünnung in Pferdeserum/Milch/TBS inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBS wurden die Einzelzellschichten dann für die Dauer von 1 Stunde mit biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG (Vector Labs, Burlingame, KA) in einer 1:200 Verdünnung in Pferdeserum/Milch/TBS inkubiert. Die Einzelzellschichten wurden dann gewaschen und für die Dauer von 30 Minuten mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Streptavidin-Biotin-Komplex (Dako, Glosturp, Dänemark) inkubiert. Nach dem Waschen wurde die alkalische Phosphatase dann mit einem Fast Red-Substrat (Vector Red, Vector Labs) in Anwesenheit von 1 mM Levamisol sichtbar gemacht. Die bearbeiteten Einzelzellschichten wurden dann unter einem Mikroskop auf das Vorkommen von rot gefärbten, für alpha Actin von glatter Muskulatur positiven Myofibroblasten untersucht und die Zahl der Myofibroblasten je Mulde wurde gezählt. Ausgewählte mikroskopische Felder wurden fotografiert.
Wie in 1 gezeigt, spiegelt der Myoblasteninduktionstest die Ergebnisse des Tests auf Fibroblastenkollagensynthese wider. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen CTGF-Fragmente in der Lage die Myoblastendifferenzierung zu induzieren, wie der Vergleich mit carboxyterminalen CTGF-Fragmenten zeigt, die nicht in der Lage waren, solch eine Differenzierung zu induzieren.
Beispiel 3: Neutralisierende anti-CTGF-Antikörper blockieren die TGF-β induzierte DNA-Synthese, Kollegensynthese und Myofibroblasteninduktion
Spezielle anti-CTGF-Antikörper, die gegen biologisch aktives, rekombinantes menschliches CTGF gerichtet sind, wurden in einem Baculovirus-Expressionssystem unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt. Die Antikörper wurden in Ziegen hergestellt und hinsichtlich ihrer neutralisierenden Aktivität gegenüber CTGF direkt oder gegenüber der TGF-induzierten DNA- oder Kollegensynthese in NRK-Fibroblasten getestet. Die Ziegenantikörper zeigten in dem Test hinsichtlich der Neutralisierung der TGF-β-Aktivität eine Wirkung. In diesen Tests waren die Ziege-anti-CTGF-Antikörper in der Lage die DNA-Synthese zu blockieren. Zusätzlich waren, wie in 5 gezeigt, CTGF-Antikörper in der Lage die Kollegensynthese und Myofibroblastenbildung, induziert durch TGF-β, zu blockieren. Es wurde beobachtet, dass die Menge des Antikörpers, die erforderlich war, um die Kollegensynthese zu blockieren, signifikant geringer war als die Menge, die nötig war, um die DNA-Synthese zu blockieren. Sowohl der Westen-Blot-Test als auch die Kompetitions-ELISA-Tests wiesen darauf hin, dass die meisten Antiköper in dieser Herstellung gegen die N-terminale Domäne von CTGF gerichtet waren. Dies führte zu der Annahme, dass die zwei Domänen für die Stimulation der unterschiedlichen biologischen Aktivitäten verantwortlich sein könnten.
Beispiel 4: Anti-CTGF-Antikörper, spezifisch für die N-terminale Domäne von CTGF, blockieren selektiv die Kollegensynthese
Domänen-spezifische anti-CTGF-Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung gereinigter N-terminaler oder C-terminaler CTGF-Domänen hergestellt. Diese Domänen wurden aus intaktem CTGF durch beschränktes Spalten mit Chymotrypsin hergestellt. Die Domänen wurden durch Affinitätschromatographie auf Heparinsepharose voneinander getrennt. Die N-terminale Domäne bindet nicht an Heparin, wohingegen die C-terminale Domäne von CTGF die heparinbindende Aktivität enthält und auf der Heparinsepharose zurückgehalten wird. Basierend auf Western-Blot-Analyse sind diese Domänen rein, und weisen weniger als 0,1% Kontamination mit intaktem CTGF auf. Die einzelnen Domänen wurden in einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml Gel an Affigel 10 gekoppelt. Gesamtes anti-CTGF-IgG (Ziege) wurde dann an die Affinitätssäule absorbiert und spezifisch gebundene Antikörper wurden eluiert. Diese Antikörper wurden dann in Western-Blots getestet, um die Spezifität ihres Reaktionsvermögens zu bestimmen. IgGs, die nur mit der N-terminalen Domäne oder nur mit der C-terminalen Domäne von CTGF reagierten, wurden aus dem Gesamtpool unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert. Die Antikörper wurden dann in Neutralisierungstests unter Verwendung von CTGF getestet. Die Ergebnisse der Studien weisen darauf hin, dass Antikörper, die gegen die N-terminale Domäne von CTGF gerichtet waren, selektiv die Kollagensynthese hemmten, aber nicht die DNA-Synthese, wie in 6 gezeigt. Im Gegensatz dazu hemmten Antikörper, die gegen die C-Domäne von CTGF gerichtet waren, selektiv die DNA-Synthese, aber nicht die Kollagensynthese. Die Daten wiesen darauf hin, dass verschiedene Regionen des CTGF-Moleküls für die Signalgebung bei verschiedenen biologischen Aktivitäten verantwortlich sein können. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und auszuweiten, wurden die biologischen Aktivitäten der isolierten Domänen mit intaktem CTGF und mit TGF-β, wie nachstehend dargelegt, verglichen.
Beispiel 5: Die N-terminale CTGF-Domäne stimuliert die Herstellung von extrazellulärer Matrix
Die N-terminalen und C-terminalen CTGF-Domänen wurden unter Verwendungen von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt. Zuerst wurden, wie vorstehend beschrieben, reine N-terminale und C-terminale Domänen durch proteolytisches Spalten von biologisch aktivem, intaktem CTGF unter Verwendung von Chymotrypsin hergestellt, da es nahezu ausschließlich intakte N-terminale Domänen und C-terminale Domänen ohne kleinere Fragmente erzeugt. Ein zweites Verfahren für die Herstellung reiner C-terminaler und N-terminaler Domänen hatte die Expression von nur eingeschränkten Regionen des offenen Leserahmens von CTGF, die nur die C-terminale Domäne oder nur die N-terminale Domäne codieren, zur Folge. Dies wurde mittels PCR-Amplifizierung von Teilen des offenen Leserahmens erreicht, wobei entweder ein Stopcodon in der cysteinfreien Region eingeführt wurde, um nur die N-terminale Domäne herzustellen, oder der Teil des offenen Leserahmens, der nur die C-terminale Domäne codiert, beginnend mit der Sequenz AYRLED in der cysteinfreien Region, in den Baculovirus-Shuttlevektor GP67 cloniert wurde. Dies erzeugte ein chimäres Protein, das ein Signalpeptid des GP67-Vektorgens enthielt, das die Synthese des gewünschten rekombinanten Proteins (oder Fragments) zum endoplasmatischen Retikulum leitete und dadurch die Sekretion gewährleistete. Nach der Aufreinigung wurden die mittels der verschiedenen Verfahren erzeugten Domänen in einem Biotest mit NRK-Fibroblasten verglichen. Die Ergebnisse dieser Studien bestätigten die vorherigen Beobachtungen mit den domänenspezifischen anti-CTGF-Antikörpern. Die N-terminalen Domänen, die entweder durch proteolytisches Spalten von intaktem CTGF oder durch direkte rekombinante Expression hergestellt wurden, waren als Induktoren der Kollagensynthese und Myofibroblasteninduktion vollständig aktiv, wie in 7 und 8 gezeigt. Umgekehrt waren die C-terminalen Domänen, die mit einem der beiden Verfahren hergestellt wurden, ebenso vollständig im DNA-Synthesetest aktiv. Die Daten zeigten, dass die einzelnen Domänen von CTGF die vollständige biologische Aktivität beibehielten und sie unabhängig voneinander agieren können, um die spezifischen biologischen Effekte bei Zielzellen zu stimulieren. In optimalen Konzentrationen induzierten die einzelnen Domänen eine biologische Antwort, die vergleichbar zum intakten CTGF oder TGF-β ist. Dies wies stark darauf hin, dass die mitogenen (DNA-Synthese) und matrigenen (extrazelluläre Matrixsynthese wie Kollagensynthese) Aktivitäten von TGF-β über CTGF und seine entsprechende Domänen vermittelt werden.
Andere Wachstumsfaktoren können mit den erfindungsgemäßen CTGF-Fragmenten verwendet werden, um die induktive Aktivität von CTGF auf die extrazelluläre Matrixproduktion zu erhöhen. Zum Beispiel wurde der Peptid-Wachstumsfaktor IGF-2 hinsichtlich seiner Wirkung auf Kollagen und myofibroblastenphänotypinduzierbare Aktivität von CTGF getestet. IGF-2-Konzentrationen von 2 ng/ml oder höher hatten in Anwesenheit von CTGF eine große Zunahme der Kollagensynthese und des Myofibroblastenphänotyps, wie in 9 gezeigt, zur Folge. SEQUENZLISTE

Claims

Fragment des Bindegewebswachstumsfaktor(CTGF)-Polypeptids, das in der Lage ist, Synthese der extrazellulären Matrix, Kollagensynthese und/oder Myofibroblastendifferenzierung zu induzieren und aus einer in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Fragment des CTGF-Polypeptids, das in der Lage ist, Synthese der extrazellulären Matrix, Kollagensynthese und/oder Myofibroblastendifferenzierung zu induzieren, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die von Exon 2 codiert wird, wobei die Aminosäuresequenz aus den Resten 24 bis 95 der SEQ ID Nr. 4 besteht.
Fragment des CTGF-Polypeptids, das in der Lage ist, Synthese der extrazellulären Matrix, Kollagensynthese und/oder Myofibroblastendifferenzierung zu induzieren, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die von Exon 3 codiert wird, wobei die Aminosäuresequenz aus den Resten 96 bis 180 der SEQ ID Nr. 4 besteht.
Fragment des CTGF-Polypeptids, das in der Lage ist, Synthese der extrazellulären Matrix, Kollagensynthese und/oder Myofibroblastendifferenzierung zu induzieren, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die von Exons 2 und 3 codiert wird, wobei die Aminosäuresequenz aus den Resten 24 bis 180 der SEQ ID Nr. 4 besteht.
Polynucleotid, das ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Antikörper, der spezifisch an ein in Anspruch 3 definiertes Fragment bindet.
Antisensemolekül, das 15 bis 100 Nucleotide lang ist und an ein Polynucleotid bindet, das aus Exon 2, aus Exon 3 oder aus Exon 2 und Exon 3, wie in 3 dargestellt, besteht.
Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an ein CTGF-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit der Induktion der Synthese der extrazellulären Matrix, der Kollagensynthese und/oder der Myofibroblastendifferenzierung durch CTGF zusammenhängt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Krankheit oder Störung eine fibroproliferative Krankheit/Störung ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Krankheit oder Störung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nierenfibrose, Skleroderm, Lungenfibrose, Leberfibrose, Arthritis, hypertropher Narbenbildung, Atherosklerose, diabetischer Nephropathie und Retinopathie, Bluthochdruck, Nierenerkrankungen, mit der Angiogenese in Zusammenhang stehende Erkrankungen, fibrotische Erkrankungen der Haut und cardiovaskuläre Erkrankungen.
Verwendung eines Antisensemoleküls, das an das Polnucleotid gemäß Anspruch 5 bindet, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit der Induktion der Synthese der extrazellulären Matrix, der Kollagensynthese und/oder der Myofibroblastendifferenzierung durch CTGF zusammenhängt.
In vitro Verfahren zum Identifizieren eines Agens oder einer Verbindung, das/die die Aktivität eines N-terminalen CTGF-Fragments moduliert, umfassend: Inkontaktbringen einer Myofibroblastenzelle mit einem Testagens und mit einem N-terminalen CTGF-Fragment unter Bedingungen, die es den Komponenten erlauben, in Wechselwirkung zu treten; und Vergleichen der Differenzierungsfähigkeit der Zelle in Gegenwart des Agens mit der Differenzierungsfähigkeit einer Zelle in Abwesenheit des Agens, wobei ein Unterschied in der Differenzierungsfähigkeit der Zellen auf ein Agens oder eine Verbindung hinweist, das/die die Differenzierungsaktivität eines CTGF-Fragments moduliert.
In vitro-Verfahren zum Identifizieren eines Agens oder einer Verbindung, das/die die Aktivität eines N-terminalen CTGF-Fragments moduliert, umfassend: Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Testagens und mit einem N-terminalen CTGF-Fragments unter Bedingungen, die es den Komponenten erlauben, in Wechselwirkung zu treten; und Vergleichen der Fähigkeit der Verbindung oder des Agens, die Produktion der extrazellulären Matrix in Gegenwart des Agens zu modulieren mit der Fähigkeit eines Agens oder einer Verbindung, die Produktion der extrazellulären Matrix in Abwesenheit des Agens zu modulieren, wobei ein Unterschied in der Differenzierung in der Produktion der extrazellulären Matrix auf ein Agens oder eine Verbindung hinweist, das/die die Aktivität eines CTGF-Fragments moduliert.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Modulierung Inhibition von Aktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Modulierung Stimulation von Aktivität ist.
Arzneimittel, umfassend die Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einen Antikörper, der spezifisch an das CTGF-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet, und/oder ein Antisensemolekül, das an das Polynucleotid wie in Anspruch 5 beschrieben bindet, für die Verwendung in der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit der Induktion der Synthese der extrazellulären Matrix, der Kollagensynthese und/oder der Myofibroblastendifferenzierung durch CTGF in Zusammenhang steht.