KR100664626B1 - 결합조직 성장인자 단편, 그의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적어도 CTGF의 엑손 2 또는 엑손 3을 포함하며 세포외 매트릭스 합성, 특히 콜라겐 합성과 근섬유아세포 분화 유도능이 있는 CTGF 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 CTGF 단편을 사용하여 상기 CTGF 단편의 활성을 조정하는 조성물을 확인하는 방법, 및 이렇게 확인된 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포외 매트릭스의 과다생성과 관련된 CTGF-관련 장애 및 질병의 치료 방법에 관한 것이다.

결합 조직 성장인자(CTGF), 폴리펩티드 단편, 유사분열 촉진 활성, 조성물

Description

결합 조직 성장인자 단편, 그의 제조 방법 및 그의 용도 {Connective Tissue Growth Factor Fragments and Methods and Uses Thereof}

본 발명은 일반적으로는 성장인자의 분야, 구체적으로는 결합 조직 성장인자 (CTGF)의 단편 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

성장인자

성장인자는 개체발생 및 조직 형태와 기능의 유지 둘다를 조절하는, 국소적으로 작용하는 다기능성 세포내 신호전달 폴리펩티드로서 광범위하게 정의될 수 있다. 다수의 원종양유전자 (proto-oncogene)의 단백질 생성물이 성장인자 및 성장인자 수용체로서 확인되었다.

성장인자는 일반적으로 발생 중인 조직에서 표적 세포의 증식, 분화 및 조직화를 촉진시킨다. 성장인자의 작용은 세포 내에서 신호전달 현상을 촉진하는 특정 수용체에 대한 이들의 결합에 달려 있다. 성장인자의 예로는 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 형질전환 성장인자 베타 (TGF-β), 형질전환 성장인자 알파 (TGF-α), 표피 성장인자 (EGF) 및 결합 조직 성장인자 (CTGF) 등이 있다. 이들 성장인자들은 저마다 세포의 증식을 촉진하는 것으로 보고되어 있다.

결합 조직 성장인자

결합 조직 성장인자 (CTGF)는 분자량이 약 38 kd인 시스테인 풍부 단량체 펩티드이다. 이전에 보고된 바와 같이, CTGF는 결합 조직 세포에 대해 유사분열 촉진 활성 및 화학주화성 활성 둘다를 나타낸다. CTGF는 세포에 의해 분비되고, 특정 세포 수용체와의 상호작용에 의해 활성을 나타내는 것으로 생각된다.

CTGF는 예를 들어, 마우스 (fisp-12) 및 인간 CTGF, Cyr61 (마우스), Cef10 (닭) 및 Nov (닭) 등을 비롯한 성장 조절제족의 한 구성원이다. 서열 비교에 근거할 때 이 족의 구성원은, 전형적으로 (1) 결합에 관여하는 인슐린 유사 성장인자 도메인, (2) 복합체 형성에 관여하는 폰 빌레브란트 인자 도메인, (3) 매트릭스 분자와의 결합에 관여할 가능성이 있는 I형 트롬보스판딘 반복부, 및 (4) 수용체 결합에 관여할 것으로 추측되는, 매트릭스 단백질 내에서 발견되는 C-말단 모듈 중 하나 이상으로 이루어진 모듈 구조를 갖는 것으로 제시된 바 있다.

인간 CGTF의 cDNA 서열은 개시 부위가 약 130번 뉴클레오티드에 있고 TGA 종결 부위가 약 1177번 뉴클레오티드에 있는 1047개의 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 349개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 코딩한다. 인간 CTGF의 cDNA 서열은 이전에 미국 특허 제5,408,040호에 개시된 바 있다.

CTGF 오픈 리딩 프레임은 시스테인 잔기 39개를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는데, 이는 단백질이 분자내 이황화 결합을 다수 갖는다는 것을 지시한다. 상기 펩티드의 아미노 말단은 분비 단백질임을 나타내는 소수성 신호 서열을 포함하고 있고, 두 개의 N-연결 글리코실화 부위가 아미노산 서열의 아스파라긴 잔기 28 및 225에 있다.

CTGF의 합성 및 분비는 TGF-β 및 BMP-2에 의해 선택적으로 유도되며 잠재적으로는 TGF-β단백질 거대족의 다른 구성원에 의해서도 유도되는 것으로 생각된다. 당업계에 보고된 바와 같이, TGF-β는 연질 아가에서 정상 섬유아세포의 증식을 촉진할 수 있지만, CTGF 단독으로는 섬유아세포에서 이러한 성질을 유도할 수 없다. 그러나, CTGF의 합성 및 작용은 TGF-β에 의한 섬유아세포의 부착-비의존성 증식 촉진에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 문헌[Kothapalli et al., 1997, Cell Growth & Differentation 8 (1): 61-68 및 Boes et al., 1999, Endocrinology 140 (4): 1575-1580] 참조.

생물학적 활성 측면에서, CTGF는 천연 상태에서 주로 유사분열 촉진 활성이 있는 것으로 보고되어 있다 (표적 세포가 증식하도록 촉진할 수 있음). CTGF는 또한 화학 주화성 활성도 있는 것으로 보고되어 있다. 병리학적으로는, 전장 CTGF 분자는 결합 조직 세포의 과다증식 및 세포외 매트릭스의 과다침착이 있는 상태에 관여하는 것으로 보고되어 있다. CTGF는 또한 혈관 내피세포 이동 및 증식 및 혈관신생에 관련된 상태와도 연관이 있는 것으로 당업계에 기재되어 있다. 이런 상태와 관련된 질병 및 장애에는 예를 들어, 피부 및 주요 기관의 섬유증, 암, 및 관련 질병 및 장애 예를 들어, 전신 경화증, 혈관형성, 죽상동맥경화증, 당뇨성 신증 및 신장성 고혈압 등이 있다 (예를 들어, 문헌[Toshifumi et al., 1999, Journal of Cellular Physiology 181(1): 153-159; Shimo et al., 1999, Journal of Biochemistry 126(1): 137-145; Murphy et al., 1999, Journal of Biological Chemistry 274(9): 5830-5834; Wenger et al., 1999, Oncogene 18(4): 1073-1080; Frzier et al., 1997, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29(1): 153-161; Oemar et al., 1997, Circulation 95(4): 831-839] 참조).

또한, CTGF는 창상 치유, 결합 조직 복구, 뼈 및 연골 복구에도 유용한 것으로 보고되어 있다. 이러한 측면에서, CTGF는 골다공증, 골관절염 또는 골연골염, 관절염, 골격 장애, 비후성 반흔, 화상, 혈관성 비대증 또는 창상 치유와 같은 장애에서 뼈, 조직 또는 연골 형성의 유도인자로서 기재되어 있다. 문헌[미국 특허 제5,837,258호; Ohnishi et al., 1998, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 30(11): 2411-2422; Nakanishi et al., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 234 (1): 206-210; Pawar et al., 1995, Journal of Cellular Physiology 165 (3): 556-565] 참조.

요약하면, CTGF는 다수의 섬유증 및 암성(癌性) 상태와 연관되어 있고 창상 치유에 기여하는 것으로 기재되어 있다. 결과적으로, 당업계에서는 이런 다양한 질병 및 장애를 치료하기 위해서 CTGF의 활성을 조정하는 유용한 방법을 밝혀낼 필요가 있다. 본 발명 이전에는 CTGF의 영역 또는 도메인이 다양한 생물학적 활성의 신호전달에 관여한다고 보고된 적이 없었다. 또한, 본 발명 이전에는 CTGF의 특정 영역 또는 도메인의 생물학적 활성을 억제함으로써 세포 증식 및(또는) 세포외 매트릭스의 과다생성과 관련된 질병 및 장애를 치료하는 것에 대해 개시된 적이 없었다.

<발명의 요약>

본 발명은 예를 들어 콜라겐 합성 및 근섬유아세포 분화의 유도를 포함하는, 세포외 매트릭스의 침착과 연관되는 CTGF-관련 질병, 장애 또는 병(ailment)의 치료용 신규 조성물 및 치료 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 CTGF의 N-말단 영역을 포함하는 CTGF 단편을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 단편은 적어도 엑손 2 또는 3의 일부, 또는 이에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하며, 이 단편은 문헌[브릭스톡(Brigstock) 등, 1997, J. Biol. Chem. 272(32): 20275-82]에 기재된 CTGF 단편이 아니며, 또한 콜라겐 합성 유도능을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포외 매트릭스 합성 및 근섬유아세포 분화를 유도하는 능력을 갖는다. 또다른 측면에서, 본 발명의 단편은 전장 CTGF 단백질의 약 1/4 내지 1/2을 포함한다.

한 측면에서, 상기한 바와 같은 활성이 있는 결합 조직 성장인자(CTGF) 폴리펩티드의 단편을 제공한다. 본 발명의 단편에는 도 3에 나타낸 바와 같은 적어도 엑손 2에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 CTGF가 포함된다. 또한, 본 발명의 단편에는 도 3에 나타낸 바와 같은 적어도 엑손 3에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 CTGF 단편에는 도 3에 나타낸 바와 같이 적어도 엑손 2 및 엑손 3에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 본 발명은 이러한 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열도 또한 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CTGF 단편의 활성을 조정할 수 있는 조성물을 확인하기 위하여, 본 발명의 CTGF 단편을 사용하는 방법을 포함하며, 이 때 이러한 조성물은 원하는 경우 콜라겐 침착과 같은 세포외 매트릭스의 일반적인 침착을 조절하 기 위해 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, CTGF 단편은 일반적인 콜라겐 침착 및 근섬유아세포 분화를 조절할 수 있는 조성물을 확인하기 위해 사용할 수 있으며, 이 때, 이러한 조성물은 본 발명의 CTGF 단편의 활성을 억제하거나, 억누르거나 또는 증가시키기 위해 사용할 수 있다.

또한, 청구된 본 발명의 그런 조성물은 CTGF 조정제, 예를 들어, 상기 방법에 의해 본 발명의 CTGF 단편의 활성을 조정할 수 있다고 확인된 항체, 안티센스 분자, 소분자, 및 기타의 화합물을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명은 CTGF 또는 CTGF 단편의 활성을 억제하거나 또는 억누르는 CTGF 조정제를 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에서, CTGF 조정제는 예를 들어, CTGF 활성의 유도가 요구되는 징후 (예를 들어 창상 치유, 조직 복구 및 뼈 복구시)에서 CTGF 및 CTGF 단편의 활성을 증가시킨다.

본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 방법은 유효량의 CTGF 단편 조정제를 단독으로, 또는 1종 이상의 화합물과 함께 콜라겐 합성의 조작이 요구되는 질병, 장애 또는 병을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 본 발명의 CTGF 단편의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 사용하여 콜라겐 합성을 조정함으로써 결과적으로 섬유증 장애를 비롯한 과도한 콜라겐 합성과 관련된 장애를 치료하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 장애는 진피, 주요 기관의 것 및 반흔 조직의 과도 생성과 관련된 장애이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 CTGF 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 CTGF의 활성 증가가 요구되는 창상 치유, 뼈 및 조직 복구에 유용 할 수 있다.

도 1은 근모세포 유도 분석시 세포를 보여준다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명의 CTGF 단편이 NRK 세포에서 콜라겐 합성을 유도하는 것을 나타내는 그래프이다.

도 3a 및 도 3b는 전장 CTGF 분자의 핵산 서열 (서열 1) 및 아미노산 서열 (서열 2)을 나타내며, CTGF 분자의 각 엑손의 위치를 나타내고 있다.

도 4는 CTGF 분자의 엑손 2 및 엑손 3을 포함하는 CTGF N-말단 도메인의 핵산 서열 (서열 3) 및 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다.

도 5는 항-CTGF 항체를 사용한 콜라겐 합성 억제에 관한 데이타를 나타낸다.

도 6은 CTGF의 N-말단 도메인에 대해 유도된 항체에 의한 콜라겐 합성의 억제에 관한 데이타를 나타낸다.

도 7은 CTGF 및 CTGF의 N-말단 도메인에 의한 콜라겐 합성의 촉진에 관한 데이타를 나타낸다.

도 8은 콜라겐 합성 및 근섬유아세포 유도의 활성 유도인자로서 CTGF의 N-말단 도메인에 관한 데이타를 나타낸다.

도 9는 CTGF 유도 콜라겐 합성에 대한 IGF-2의 영향에 관한 데이타를 나타낸다.

본원에 기재한 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 및 시약 등은 달라질 수 있기 때문에 본 발명이 이들에 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명할 목적으로만 사용된 것이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본원 및 청구항에 사용한 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 기재되어 있지 않다면 복수 형태를 포함하는 것이다. 따라서, 예를 들어 "항체"라 함은 1종 이상의 항체 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 말하는 것이다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속한 당업계의 통상적인 숙련가들이 공통적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한, 어떤 방법 및 물질이라도 본 발명을 수행하거나 시험하는 데 사용될 수는 있지만, 바람직한 방법, 디바이스 및 물질을 개시한다. 본원에서 인용한 모든 문헌은 그 전체가 본원에 포함되는 것으로 한다.

<정의>

본원에서 사용된 용어 "CTGF 단편"이란 CTGF N-말단 영역의 적어도 일부를 포함하는 단편을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 단편은 전장 CTGF 단백질의 엑손 2 또는 엑손 3의 적어도 일부를 포함하며 또한 세포외 매트릭스의 합성을 유도하는 능력을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 상기 단편의 길이는 전장 CTGF 단백질의 약 1/4 내지 1/2이다. "콜라겐 합성 유도능"은 콜라겐 합성 및 근섬유아세포 분화를 통해 세포외 매트릭스의 형성을 유도하는 능력을 의미한다. CTGF 단편은 천연원으로부터의 단리, 합성 제조 생산, 재조합 유전공학 기술, 또는 당업계에서 이용가능한 다른 기술로 수득할 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "N-말단"이란 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 전장 CTGF 분자에서 시작하는 엑손 2 및 엑손 3 도메인의 적어도 일부를 포함하는 핵산 서열, 및 코딩된 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "엑손 2"란 전장 CTGF 분자에서 시작하는 N-말단 도메인의 핵산 서열과 상응하는 아미노산 서열, 및 상응하는 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "엑손 3"이란 전장 CTGF 분자의 N-말단 도메인의 핵산 서열, 및 코딩된 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "C-말단"이란 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이 전장 CTGF 분자의 엑손 4 및 엑손 5 도메인의 적어도 일부를 포함하는 핵산 서열, 및 그에 의해 코딩된 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "장애" 및 "질병"이란 CTGF의 발현 또는 활성과 관련된 상태를 지칭한다. CTGF와 관련된 질병, 장애 및 상태에는 수술이나 방사선 요법을 비롯한 급성 또는 반복성 외상으로부터 발생한 과도한 반흔 형성, 경피증, 켈로이드 및 비후성 반흔 형성을 포함하는 신장, 폐, 간, 눈, 심장 및 피부와 같은 기관의 섬유증 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. CTGF의 비정상적 발현은 일반적인 조직 반흔 형성, 피부에서의 종양-유사 증식, 및 손상된 혈액 운반 능력, 고혈압, 비대증 등을 초래하는 혈관의 지속적 반흔 형성과 관련되어 있다. 또한, CTGF는 피부섬유증, 비정상적인 내피세포 발현과 관련된 상태, 유방암 데스모스플라시스(desmosplasis), 혈관지방종 및 혈관평활근종을 비롯한 암과 같은 혈관 내피세포 증식 또는 이동으로 인한 다양한 질병과 관련되어 있다. 다른 관련 상태로는 죽상경화증 플라크를 비롯한 죽상동맥경화증 및 전신경화증, 염증성 장 질환, 크론병, 혈관형성, 및 죽상동맥경화증, 관절염, 암 및 다른 질병 상태에서 중추 역할을 하는 기타의 증식 과정, 녹내장에 관여하는 혈관신생, 관절 염증 등을 비롯한 질병 또는 손상으로 인한 염증, 종양 증식 전이, 간질성 질병, 피부과 질병, 만성 류마티스성 관절염을 비롯한 관절염, 동맥경화증, 당뇨성 신증을 비롯한 당뇨병, 고혈압 및 기타 신장 장애, 및 화학요법, 방사선 치료, 투석 및 동종이계이식 거부 및 이식 거부로부터 발생한 섬유증이 있다.

본원에서 지칭된 "섬유증식성" 장애에는 예를 들어 신장 섬유증, 경피증, 폐 섬유증, 관절염, 비후성 반흔 형성 및 죽상동맥경화증과 같은, 상기 기재된 어떤 질병이나 장애도 포함되지만, 이것으로 한정되지는 않는다. CTGF 관련 섬유증식성 장애에는 또한 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 고혈압, 및 기타 신장 장애, 종양 형성과 관련된 혈관을 포함하나 이에 한정되지 않는 혈관형성 관련 장애, 및 죽상동맥경화증, 관절염 및 기타 질환 상태, 예를 들어 피부, 심장, 폐 및 신장 섬유증에서 중추적 역할을 하는 다른 증식 과정도 포함된다. 일반적으로, 신장, 간, 폐 및 심혈관계와 관련된 심각한 섬유증도 여기에 포함된다. 심장의 펌프 능력을 손상시키는 심장 발작에 이어 일어나는 반흔 조직의 형성을 비롯한 섬유증의 예가 많이 있다. 당뇨병은 종종 신장의 손상/반흔 형성을 일으키고, 이 손상/반흔 형성은 진행성 신장 기능 손실을 초래한다. 수술 후에 조차도, 반흔 조직은 내부 기관 사이에 형성되어 수축, 동통 및, 몇몇 경우에는, 불임을 일으킬 수 있다. 심장, 신장, 간, 폐, 눈 및 피부와 같은 주요 기관은 통상적으로 다른 질병과 관련된 만성 반흔이 형성되기 쉽다. 비후성 반흔 (비(非)악성 조직 확장)은 화상 및 다른 외상으로 인한 통상적인 형태의 섬유증이다. 또한, 일반적인 조직 반흔 형성, 피부에서의 종양-유사 증식, 또는 혈액 운반 능력을 손상시키는 혈관의 지속적 반흔 형성과 각각 관련된 경피증, 켈로이드 및 죽상동맥경화증과 같은 다른 섬유증식성 장애도 다수 있다. CTGF는 섬유증 장애에서 과다발현되므로, 이는 항-섬유증 요법의 개발을 위한 매우 특이적 표적임을 의미한다. CTGF는 예를 들어 섬유증식성 장애의 치료시, 소분자 및 중화 항체를 사용하여 억제할 수 있다. "섬유증식성"은 상기 임의의 병리적 상태를 지칭하며 세포 증식에 한정되어서는 안되는 것으로 이해되어야 한다.

"세포외 매트릭스(ECM)"는 예를 들어, 내피세포, 상피세포, 표피세포 및 근육세포를 비롯한 다양한 유형의 세포에 의해 합성되며 이런 세포를 둘러싸는 다성분 구조물이다. ECM은 주로 콜라겐 및 헤파란 술페이트 프로테오글리칸으로 형성된다. 또한, ECM은 h1 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 및 보다 작은 단백질도 포함한다. 성장인자는 헤파란 술페이트 프로테오글리칸의 글리코스아미노글리칸 일부와 결합함으로써 이들 매트릭스에 머물러 있다. 이듀론산이 많고 황산화율이 높은 "헤파린 유사" 영역은 인간 섬유아세포의 헤파란 술페이트의 bFGF 결합 영역과 결합되어 있다 (Turnbull, et al., J. Biol. Chem. 267(15) 10337-10341, 1992). 그러나, 세포외 매트릭스의 헤파란 술페이트 조성은 완전히 특성화되지 않았다.

본원에서 사용된 어구 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드, 뉴클 레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈 또는 합성 유래의 DNA 또는 RNA, 펩티드 핵산 (PNA), 또는 자연 또는 합성 유래의 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 지칭한다.

본원에서 사용된 "아미노산" 또는 "아미노산 서열"이란 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 부분 또는 서브유닛, 및 자연 발생 분자 또는 합성 분자를 지칭한다.

"혼성화"란 핵산 가닥이 염기쌍 형성을 통해 상보적인 가닥과 결합하는 과정을 지칭한다. 혼성화 반응은 특정 관심 서열이 샘플에 낮은 농도로 존재하더라도 확인될 수 있도록 민감하고 선택적일 수 있다. 적절한 엄격 조건은, 예를 들어 예비 혼성화 및 혼성화 용액 중의 염 또는 포름아미드 농도, 또는 혼성화 온도에 의해 정의될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 공지되어 있다. 특히, 엄격도는 염의 농도 감소, 포름아미드 농도 증가, 또는 혼성화 온도 상승에 의해 증가될 수 있다.

예를 들어, 고엄격 조건에서의 혼성화는 약 37 ℃ 내지 42 ℃에서 약 50 %의 포름아미드 중에서 일어날 수 있다. 혼성화는 약 30 ℃ 내지 35 ℃에서 약 35 % 내지 25 %의 포름아미드 중의 감소된 엄격 조건에서 일어날 수 있다. 특히, 혼성화는 42 ℃에서 50 %의 포름아미드, 5X SSPE, 0.3 % SDS 및 200 ㎍/ml 잘린 변성 연어 정자 DNA 중의 고엄격 조건에서 일어날 수 있다. 혼성화는 상기 기재된 바와 같은 감소된 엄격 조건하에서 일어날 수 있지만, 35 ℃의 감소된 온도에서 35 % 포름아미드 중에서 일어날 수 있다. 특정 수준의 엄격도에 상응하는 온도 범위는 관 심 핵산의 푸린 대 피리미딘 비율을 계산하고 그에 따라 온도를 조정함으로써 추가로 좁혀질 수 있다. 상기 범위 및 조건의 변형은 당업계에 잘 공지되어 있다.

용어 "실질적인 아미노산 상동성"이란 특정 서열과 약 75 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 내지 95 %의 서열 유사성을 갖는 분자를 지칭한다. 어구 "유사성 %" 또는 "동일성 %"란 2개 이상의 아미노산 서열 또는 핵산 서열 비교시 나타나는 서열 유사성 또는 서열 동일성의 비율을 지칭한다. 유사성 %는 당업계에 잘 공지된 방법으로 측정될 수 있다.

아미노산 서열 사이의 유사성 %는, 예를 들어 클러스터 방법 (clustal method)을 이용하여 계산할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Higgins, D. G. and P. M. Sharp, 1988, Gene 73:237-244] 참조). 클러스터 알고리즘은 모든 쌍 사이의 거리를 조사하여 서열들을 클러스터로 그룹화시킨다. 클러스터들은 짝짓기 방식 (pairwise)으로 정렬된 후 그룹으로 정렬된다. 두 아미노산 서열 (예를 들어 서열 A와 서열 B) 사이의 유사성 %는 (서열 A의 길이 - 서열 A 중 갭 잔기의 수 - 서열 B 중 갭 잔기의 수)÷(서열 A와 서열 B 사이에 일치되는 잔기의 합)×100에 의해 계산된다. 두 아미노산 서열 사이에 상동성이 낮거나 없는 서열의 갭은 유사성 %를 측정하는 데 포함되지 않는다. 유사성 %는 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 혼성화 조건의 변화에 의해 계산될 수 있으며, MEGALIGN 프로그램 (DNASTAR Inc., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)과 같은 프로그램을 이용하여 전자공학적 방식으로 계산할 수 있다.

용어 "콜라겐 서브유닛"이란 단일 유전자에 의해 코딩되는 콜라겐 단백질의 폴리펩티드 사슬 1개의 아미노산 서열, 및 결실 유도체, 보존적 치환 등을 비롯한 상기 서열의 임의의 유도체를 지칭한다.

"융합 단백질"은 상이한 단백질의 펩티드 서열이 공유결합에 의해 함께 결합된 단백질이다.

"안티센스 서열"은 표적 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있는 임의의 서열이다. 안티센스 서열은 DNA, RNA, 또는 임의의 핵산 모방체 또는 유사체일 수 있다. 용어 "안티센스 기술"은 표적 서열에 대한 안티센스 서열의 특이적 혼성화를 기초로 하는 임의의 기술을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "기능적 등가물"이란 CTGF 단편의 기능적 또는 구조적 특성을 갖는 단백질 또는 핵산 분자를 지칭한다. CTGF 단편의 기능적 등가물은 특이적 기능을 수행하기 위한 필요성에 따른 변형을 포함할 수 있다. 용어 "기능적 등가물"이란 분자의 단편, 돌연변이체, 하이브리드, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함한다.

한 분자가 정상적으로는 분자의 일부가 아닌 부가의 화학적 잔기를 포함할 때, 이 분자를 다른 분자의 "화학적 유도체"라 부른다. 그러한 잔기는 분자의 용해성, 흡착성 및 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 또한, 이들 잔기는 분자의 독성을 감소시키거나, 그 분자의 임의의 바람직하지 못한 부작용을 제거 또는 감쇠시키는 등의 효과를 줄 수 있다. 그러한 효과를 매개할 수 있는 잔기는, 예를 들어 문헌[Gennaro, A.R., ed., 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton PA]에 개시되어 있다. 그러한 잔기를 커플링시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

본원에서 사용된 "변이체"는 1개 이상의 아미노산에 의해 변화된 아미노산 서열을 지칭한다. 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 보존적 변화 (예를 들어, 이소루이신에 의한 루이신의 치환)일 수 있다. 더욱 드물게는, 변이체가 비보존적 변화 (예를 들어, 트립토판에 의한 글리신의 치환)일 수 있다. 또한, 이와 유사한 미미한 변이체는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하기 위한 지침은, 예를 들어 DNASTAR 소프트웨어 (DNASTAR Inc., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)와 같이 당업계에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 찾을 수 있다.

<CTGF 단편의 제조 방법>

CTGF를 코딩하는 핵산 서열

본 발명에 따라, 미국 특허 제5,408,040호에 기재된 바와 같은 CTGF 또는 그의 기능적 등가물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 적절한 숙주세포에서 전장 단백질 또는 그의 기능적 등가물의 발현을 유도하는 재조합 DNA 분자를 생성하거나, 또는 별법으로 원하는 CTGF 단편 (예를 들어, CTGF의 엑손 2 또는 엑손 3의 적어도 일부를 포함하는 단편)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.

별법으로, 엄격한 위치에서 CTGF 서열의 일부에 혼성화되는 뉴클레오티드 서 열은 핵산 혼성화 분석, 서던(Southern) 블럿팅 분석 및 노던(Northern) 블럿팅 분석 등에 사용될 수 있다. 또다른 방법에서, CTGF를 코딩하는 DNA 분자는 발현 라이브러리를 항체 스크리닝하여 공유된 구조적 특징을 검출하는 것을 포함하는 혼성화 방법으로 단리될 수 있다.

유전자 코드의 본래적 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, 실질적인 아미노산 상동성이 있는 단백질 또는 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 코딩하는 기타 DNA 서열을 단리하여 CTGF 또는 CTGF 단편의 클로닝 및 발현을 위한 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 그러한 DNA 서열에는 엄격 조건에서 인간 CTGF 서열에 혼성화될 수 있는 서열이 포함된다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 변화된 DNA 서열에는 동일하거나 또는 기능적으로 등가인 유전자 생성물을 코딩하는 서열을 낳는 결실, 첨가 또는 상이한 뉴클레오티드 잔기의 치환을 포함한다. 유전자 생성물 그 자체가 CTGF 서열내에 침묵 변화(silent change)여서 기능적 등가의 단백질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 포함할 수 있다. 그러한 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및(또는) 양친매성의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하 아미노산에는 아스파라긴산 및 글루탐산이 포함되고, 양전하 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며, 친수성 정도가 유사한 비전하 극성 헤드기가 있는 아미노산에는 루이신과 이소루이신과 발린, 글리신과 알라닌, 아스파라긴과 글루타민, 세린과 트레오닌, 및 페닐알라닌과 티로신이 포함된다.

유전자 생성물의 프로세싱 및 발현을 변형시키는 변화를 비롯한, 그러나 이에 한정되지 않는 여러 가지 목적에 맞게 단백질 서열을 변화시키기 위해 본 발명의 DNA 서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 새로운 제한효소 인식 부위의 삽입을 위해서는 위치-지정 돌연변이 유발법(site-directed mutagenesis)과 같이 당업계에 잘 공지된 기술을 이용하여 돌연변이가 도입될 수 있다. 예를 들어, 효모와 같은 특정 발현 시스템에서는 숙주세포가 유전자 생성물을 과도하게 글리코실화시킬 수 있다. 이러한 발현 시스템을 이용하는 경우에는 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열을 변화시켜 임의의 N-연결 글리코실화 부위를 제거하는 것이 바람직하다.

CTGF 또는 CTGF 단편 서열은 이종 서열에 라이게이션되어 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 시판되는 항체에 의해 인식되는 이종 에피토프를 발현하는 키메라 CTGF 단백질을 코딩하는 것이 유용할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 CTGF 또는 CTGF 단편이 이종 잔기로부터 절단될 수 있도록 CTGF 또는 CTGF 단편 서열과 이종 단백질 서열 (예를 들어, PDGF와 관련된 성장 인자를 코딩하는 서열) 사이에 절단 부위를 포함하도록 조작될 수도 있다. 이런 방법은 당업계에 공지되어 있다.

또한, CTGF 또는 CTGF 단편의 코딩 서열은 당업계에 공지된 화학적인 방법을 이용하여 그 전체 또는 일부를 합성할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Caruthers, et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 1980, Nucleic Acids Res. 9(10):2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; 및 Chow and Kempe, 1981, Nucleic Acids Res. 9(12): 2807-2817] 참조). 별법으로, CTGF 아미노산 서열 전체 또는 일부를 합성하는 화학적인 방법을 이용하여 단백질 그 자체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 펩티드를 고상 기술로 합성하여, 수지로부터 절단한 후, 예비 고성능 액체 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60]을 참조한다. 합성 펩티드의 조성물은 아미노산 분석 또는 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 에드만 분해법은 문헌[Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 34-49]을 참조한다.

CTGF 또는 CTGF 단편의 발현

생물학적 활성을 갖는 CTGF 단편을 발현시키기 위해, 전장 단백질 또는 상기 기재된 바와 같은 기능적 등가물인 CTGF 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적합한 발현 벡터, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함하고 있는 벡터에 삽입한다.

더욱 구체적으로는, 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 CTGF 또는 CTGF 단편 서열 및 적합한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 및 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.]에 기재된 기술을 참조한다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열의 발현에 이용될 수 있다. 이 시스템에는 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균과 같은 미생물; CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)를 비롯한 효모; CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스인 CaMV 및 담배 모자이크 바이러스인 TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 안정하게 증폭 (CHO/dhfr)되거나 더블-마이뉴트(double-minute) 염색체에서 불안정하게 증폭 (쥐과 세포주)되는 CTGF DNA의 카피 다수를 포함하도록 조작된 세포주를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 인간 종양 세포 (HT-1080 포함))로 감염된 동물 세포 시스템등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주-발현 벡터 시스템" 및 더욱 일반적으로 용어 "숙주세포"란 임의의 숙주 세포 또는 숙주-발현 벡터 시스템의 자손을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 복제시 돌연변이가 일어날 수 있기 때문에 모든 자손이 모세포와 동일할 수는 없지만, 이러한 자손도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.

이들 시스템의 발현 요소는 강도 및 특이성에서 차이가 있다. 이용되는 숙 주/벡터 시스템에 따라, 구성적(constitutive) 프로모터 및 유도가능한 프로모터를 비롯한 많은 적합한 전사 및 번역 요소가 어떤 것이라도 발현 벡터에 사용될 수 있다. 예를 들어, 세균 시스템에 클로닝할 때에는 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp 및 ptac (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등과 같은 유도가능한 프로모터를 사용할 수 있고, 곤충 세포 시스템에 클로닝할 때에는 바큘로바이러스 폴리헤드린 (polyhedrin) 프로모터와 같은 프로모터를 사용할 수 있으며, 식물 세포 시스템에 클로닝할 때에는 식물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 열 충격 프로모터, RUBISCO의 작은 서브유닛에 대한 프로모터, 및 엽록소 a/b 결합 단백질에 대한 프로모터) 또는 식물 바이러스의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, CaMV의 35 S RNA 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터)를 사용할 수 있고, 포유동물 세포 시스템에 클로닝할 때에는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터 및 백시니아 바이러스 7.5 K 프로모터)를 사용할 수 있으며, CTGF 또는 CTGF 단편 DNA의 카피를 다수 포함하는 세포주를 만들 때에는 적합한 선택 마커와 함께 SV40-, BPV- 및 EBV-기재의 벡터를 사용할 수 있다.

세균 시스템에서는 발현되는 CTGF 또는 CTGF 단편의 이용 목적에 따라 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 세균에서의 발현에 적합한 벡터에는 문헌[Rosenberg, et al., 1987, Gene 56:125]에 기재된 바와 같이 T7-기재의 벡터가 포함된다. 추가의 예로서, 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 CTGF 또는 CTGF 단편을 다량 생성시켜야 할 경우에는 정제가 용이한 단백질 생성물을 높은 수준으로 발현시키는 벡터가 바람직하다. 그러한 벡터에는, CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열이 벡터에 lac Z 코딩 영역이 있는 프레임에서 라이게이션되어 AS-lac Z의 하이브리드 단백질이 생성되게 하는 대장균 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), 및 pIN 벡터 (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, CTGF 또는 CTGF 단편과 같은 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와 함께 발현시키기 위해 pGEX 벡터를 사용할 수도 있다. 통상적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재하에 용출시킴으로써 용균된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 클로닝된 관심 폴리펩티드가 GST 잔기로부터 방출될 수 있도록 고안되어 있다.

더욱 일반적으로, 숙주가 원핵생물인 경우에는 DNA가 유입될 수 있는 감응성 세포 (competent cell)를 지수 성장기 이후에 수확된 세포로부터 제조한 후, 당업계에 잘 공지된 방법인 CaCl₂, 또는 별법으로 MgCl₂ 또는 RbCl을 처리할 수 있다.

숙주세포가 진핵생물인 경우에는 다양한 DNA 전달 방법이 사용될 수 있다. 이 방법에는 인산칼슘-침전법에 의한 DNA의 형질감염, 미세 주입을 포함하는 통상적인 기계적 절차, 리포좀 내에 포획된 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터의 사용이 포함된다. 또한, 진핵세포는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열과 허피스 심플렉스 티미딘 키나제 유전자와 같은 선택가능한 표현형을 코딩하는 제2 의 외래 DNA 분자로 동시-형질감염될 수 있다. 다른 방법은 원숭이 바이러스 40 (SV40) 또는 소 유두종 바이러스와 같은 진핵생물 바이러스를 이용하여 진핵세포를 일시적으로 감염 또는 형질전환시켜 단백질을 발현시키는 것이다. 문헌 [Eukaryotic Viral Vectors, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, Ed.]을 참조한다. 진핵생물 숙주세포에는 효모, 포유동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등이 있다.

효모의 경우, 구성적 또는 유도가능한 프로모터를 포함하는 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 살펴보기 위해, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, 1988, Ausubel et al., Ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch.13; Grant et al., 1987, Methods in Enzymology, Wu & Grossman, Eds., Acad. Press, N.Y., 153:516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol.II, IRL Press, Wash., D.C., Ch.3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger & Kimmel, Eds., Acad. Press, N.Y., 152:673-684; 및 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Strathern et al., Eds., Cold Spring Harbor Press, Vols. I 및 II]을 참조한다. 예를 들어, 효모에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 다양한 셔틀 벡터가 보고되어 있다 (Heinemann, et al., 1989, Nature 340:205; Rose, et al., 1987, Gene 60:237).

식물 발현 벡터를 사용하는 경우, 여러 프로모터 중 임의의 것으로 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), 또는 TMV의 코트 단백질 프로모터 (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311)와 같은 바이러스 프로모터를 사용할 수 있으며, 별법으로는 RUBISCO의 작은 서브유닛 (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843), 또는 대두 hspl7.5-E 또는 hspl7.3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565)와 같은 열 충격 프로모터등의 식물 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 구조물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세 주입, 일렉트로포레이션 등을 이용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 이러한 기술을 살펴보기 위해, 예를 들어 문헌[Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9]을 참조한다.

곤충 시스템의 경우, 별도의 발현 시스템을 사용하여 CTGF 또는 CTGF 단편을 발현시킬 수 있다. 이러한 시스템에서는 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 바큘로바이러스를 사용한다. 그 다음, 이 바이러스를 곤충 세포에서 증식시킨다. CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자)내로 클로닝되어 바큘로바이러스 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 그 다음, 이러한 재조합 바이러스를 사용하여 곤충세포에 감염시키며, 이 세포에서 삽 입된 유전자를 발현시킨다. 예를 들어, 문헌[Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Smith의 미국 특허 제4,215,051호]을 참조한다.

포유동물 숙주세포의 경우, 다수의 바이러스 기재 발현 시스템이 이용될 수 있다. 발현 벡터로서 아데노바이러스가 사용되는 경우, CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3부분(tripartite) 리더 서열에 라이게이션될 수 있다. 이 키메라 유전자는 이후에 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역 (예를 들어, E1 또는 E3 영역)에의 삽입으로, 감염된 숙주에서 생존가능하며 CTGF 또는 CTGF 단편을 발현하는 재조합체 바이러스가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659]을 참조한다. 별법으로, 백시니아 바이러스의 7.5 K 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931]을 참조한다.

또다른 실시양태에서, CTGF 또는 CTGF 단편 서열은 인산칼슘 침전법으로 안정하게 형질감염되고 네오마이신 내성 유전자가 있는, HT-1080과 같은 인간 종양 세포에서 발현된다. 또다른 실시양태에서, pMSXND 발현 벡터 등은 COS, BHK 293 및 CHO 세포를 비롯한 다양한 포유동물 세포에서의 발현에 사용된다. 문헌[Lee and Nathans, 1988, J. Biol. Chem. 263:3521]을 참조한다.

또한, 삽입된 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이 적 개시 신호가 필요할 수도 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 자기 자신의 개시 코돈 및 인접 서열을 포함하는 전체 CTGF 유전자가 적합한 발현 벡터에 삽입되는 경우에는 어떠한 추가의 번역 조절 신호도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, CTGF 코딩 서열의 일부만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 비롯한 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체가 확실히 번역되도록 하기 위해서 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열의 리딩 프레임과 위상이 같아야 한다. 이들 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 자연 및 합성 모두에서 다양하게 유래할 수 있다. 발현의 효율은 적합한 전사 인핸서 요소, 전사 터미네이터 등을 포함함으로써 강화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544]을 참조한다. 추가의 서열, 즉, 리더 서열 등을 첨가하여 다양한 분비 경로를 따라 CTGF 또는 CTGF 단편의 분비를 지시할 수 있다. 이것은 당업계에 공지된 여러 방법을 이용하여 여러 발현 시스템에서 수행할 수 있다.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 원하는 특이적 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수도 있다. 이러한 단백질 생성물의 변형 (예를 들면, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들면, 절단)이 단백질 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들은 단백질의 번역 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외래 단백질이 확실하게 올바른 변형 및 프로세싱되도록 할 수 있다. 이러기 위해서, 일차 전사체의 적합한 프로세싱, 유전자 생 성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포내 기구를 갖는 진핵생물 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, HT-1080 등이 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

재조합 단백질을 오랫동안, 높은 수율로 생성하기 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, CTGF 또는 CTGF 단편을 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스의 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하기보다, 숙주 세포를 적합한 발현 조절 요소 (예를 들면, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 CTGF 또는 CTGF 단편 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후에, 조작된 세포를 풍부 배지에서 1 내지 2일동안 증식시킬 수 있고, 그 다음에 선택 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드에 있는 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 자신의 염색체내로 안정하게 통합하고 증식하여 후에 클로닝되어 세포주가 될 수 있는 중심을 형성하도록 한다.

이것으로 한정되는 것은 아니지만, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al., 1977, Cell 11:223)), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 48:2026) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자를 포함하는 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있고, 이것들은 각각 tk^-, hgprt^- 또는 aprt ^- 세포에서 사용될 수 있다.

또한, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:1527), 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:2072), 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1), 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30:147) 유전자를 선택하기 위한 기초로서 항대사물 내성을 사용할 수 있다. 최근에는 추가의 선택가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용하도록 하는 trpB, 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:8047), 및 오르니틴 디카르복실라제 억제제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 디카르복실라제) (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory)가 기재된 바 있다.

본 발명의 숙주 세포-발현 폴리펩티드의 단리 및 정제는 임의의 통상적인 방법, 예를 들어 예비 크로마토그래피 분리 및 면역 분리 (예를 들어 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용을 포함하는 것 등)에 의해 수행할 수 있다.

CTGF 또는 CTGF 단편을 발현하는 형질감염체 또는 형질전환체의 확인

코딩 서열을 포함하며 생물학적 활성 유전자 생성물을 발현시키는 숙주 세포를 적어도 다음의 4가지 통상적인 접근법으로 확인할 수 있다. (a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, (c) 숙주 세포 중의 CTGF 또는 CTGF 단편 mRNA 전사체의 발현으로 측정되는 전사 수준의 평가, 및 (d) 분석법 또는 생물학적 활성으로 측정되는 유전자 생성물의 검출.

첫번째 접근법에서, 발현 벡터에 삽입된 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열의 존재는 각각 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 유도체를 포함하는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화로 검출될 수 있다.

두번째 접근법에서, 재조합 발현 벡터/숙주 시스템은 특정 "마커" 유전자 기능 (예를 들면, 항생제에 대한 내성, 메토트렉세이트에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스 중의 폐색체 형성 등)의 존재 또는 부재를 기준으로 확인되고 선택될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, CTGF 코딩 서열을 벡터의 네오마이신-내성 마커 유전자 서열에 삽입하고, CTGF 코딩 서열을 포함하는 재조합체를 마커 유전자 기능의 부재로 확인할 수 있다. 별법으로는 마커 유전자를 CTGF 코딩 서열의 발현에 이용되는 동일 또는 상이한 프로모터의 조절하에 CTGF 서열과 나란히 위치시킬 수 있다. 유도 또는 선택에 대한 마커의 발현은 CTGF 코딩 서열의 발현을 의미한다.

세번째 접근법에서, CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 영역에 대한 전사 활성은 혼성화 분석법으로 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA를 CTGF 또는 CTGF 단편 코딩 서열 또는 그의 특정 일부에 상동성인 프로브를 사용하는 노던 블럿팅으로 단리하고 분석할 수 있다. 별법으로, 이러한 프로브와의 혼성화를 위해 숙주 세포의 전체 핵산을 추출해서 분석할 수 있다.

네번째 접근법은 생물학적으로 활성이거나 면역학적으로 반응성인 CTGF 또는 CTGF 단편 유전자 생성물의 검출을 포함한다. CTGF 활성을 검출하기 위해서, 미국 특허 제 5,408,040호에 기재된 분석법 (이것으로 한정되는 것이 아님)을 비롯한 다수의 분석법을 사용할 수 있다.

CTGF 단편을 생성시키기 위한 전장 CTGF 단백질의 분해

전장 CTGF 단백질의 발현에 이어서, 단백질을 당업자에게 공지된, 임의의 수의 단백질 가수분해 효소로 절단하여 본 발명의 CTGF 단편을 얻을 수 있다. 예를 들어, CTGF의 N-말단쪽 절반과 C-말단쪽 절반 사이에 시스테인 없는 브릿지는 당업계에서 이용가능한 키모트립신 사용 방법에 민감하다.

<CTGF 단편 활성의 조정 및 저해 방법>

상기 기술한 바와 같이, 본 발명에 기술된 CTGF 단편은 섬유증 상태에서 세포외 매트릭스 침착의 중요한 결정인자이다. 본 발명은 이러한 단편의 활성 및(또는) 발현을 조절, 조정 및(또는) 억제하거나, 또는 원하는 경우 이러한 단편의 활성을 증가시킴으로써 상기 단편의 활성과 관련된 합병증을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 방법은 원하는 경우 CTGF의 발현 및 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 개선시키기 위해 CTGF의 N-말단 단편의 세포외 매트릭스 생성 활성을 조절, 조정 및(또는) 억제하는 작용제 치료 유효량을 투여하는 것을 제공한다.

항체

본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 본 발명의 CTGF 단편과 특이적으로 반응 하는 항체를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. CTGF와 특이적으로 반응하는 항체는 미국 특허 제 5,783,187호 및 PCT 공개 WO 9638172에 기재되어 있다. CTGF 항체는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체뿐 아니라, F(ab')₂ 및 F_v 단편을 비롯한 Fab 단편도 포함될 수 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 단편은 예를 들어, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성될 수 있다. 중화 항체, 즉 이량체 형성을 억제하는 항체가 치료 용도로 특히 바람직하다.

표적 폴리펩티드, 예를 들어 CTGF 또는 CTGF의 활성 및(또는) 발현을 조정하는 작용제를 평가하여 고면역원성 영역을 결정할 수 있다. 분석 방법 및 에피토프 선택 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds., 1988, Current Protocols in Molecular Biology]을 참조한다. 또한, 분석 및 선택을 예를 들어 다양한 소프트웨어 패키지, 예를 들어 LASERGENE NAVIGATOR 소프트웨어 (DNASTAR, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 수행할 수도 있다. 항체 유도에 사용되는 펩티드 또는 단편은 항원성이어야 하나, 반드시 생물학적으로 활성인 것은 아니다. 바람직하게는, 항원성 단편 또는 펩티드의 길이는 아미노산 5개 이상, 더욱 바람직하게는 아미노산 10개 이상, 가장 바람직하게는 아미노산 15개 이상이다. 단편 또는 펩티드를 유도하는 항체가 표적 폴리펩티드, 예를 들어 CTGF의 아미노산 서열의 적어도 일부와 동일한 것이 바람직하다. 또한, 자연 발생 표적 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 모방하는 펩티드 또는 단편은 또다른 단백질, 예를 들어 키 홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 융합될 수도 있고, 이러한 키메라 분자에 대한 항체가 생성될 수 있다.

항체 생성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 염소, 토끼, 래트, 마우스, 인간 등의 다양한 숙주는 표적 폴리펩티드 또는 그의 임의의 면역원성 단편 또는 펩티드를 주입하여 면역화될 수 있다. 숙주 종에 따라, 다양한 아쥬반트를 사용하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 아쥬반트로는 프로인트 (Freund's) 아쥬반트, 무기 겔 (예를 들어 수산화 알루미늄), 및 표면 활성 물질 (예를 들어 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 고분자 음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, KLH 및 디니트로페닐) 등이 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 인간에게 사용되는 아쥬반트 중에서는 BCG (bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)이 특히 바람직하다.

모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 배양 중인 연속적 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키는 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 생체내 및 시험관내 생성 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pound, J. D., 1998, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 키메라 항체의 생성 방법 역시 단일-쇄 항체의 생성 방법과 마찬가지로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison, S. L. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda, S. et al., 1985 Nature 314:452-454]을 참조한다. 특이성 은 관련되어 있으나, 이디오타입 조성은 상이한 항체는, 예를 들어 무작위 조합 면역글로빈 라이브러리로부터의 체인 셔플링(chain shuffling)에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Burton D. R., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-11123]을 참조한다.

항체는 또한 림프구 집단에서의 생체내 생성을 유도하거나 또는 면역글로불린 라이브러리 또는 고특이적 결합 시약의 패널을 스크리닝하여 생성될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Orlandi, R. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter, G. and C. Milstein, 1991, Nature 349:293-299]을 참조한다. 또한 표적 폴리펩티드에 대한 특이적 결합 부위를 포함하는 항체 단편이 생성될 수도 있다. 이러한 항체 단편에는 F(ab')₂ 단편 (항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있음), 및 Fab 단편 (F(ab')₂ 단편의 이황화 가교를 환원시켜 생성될 수 있음) 등이 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 별법으로, Fab 발현 라이브러리는 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 확인이 빠르고 쉽도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Huse, W. D. et al., 1989 Science 254:1275-1281]을 참조한다.

항체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 항-표적 폴리펩티드 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) (직접 및 리간드 캡쳐 ELISA 포함), 방사선면역분석법 (RIA), 면역블럿팅 및 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)과 같은 다양한 면역분석법을 비롯한 다양한 기술을, 원하는 특이성을 갖는 항체를 확인하기 위한 스크리닝에 사용할 수 있다. 확립된 특이성을 갖는 폴리 클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 사용하여 경쟁적 결합 분석 또는 면역방사측정 분석을 하기 위한 수많은 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane]을 참조한다. 이러한 면역분석에는 통상적으로 표적 폴리펩티드와 특이적 항체간의 복합체 형성의 측정이 포함된다. 표적 폴리펩티드 상에 있는 두 개의 비간섭 에피토프에 반응성이 있는 모노클로날 항체를 사용하는 2-부위 모노클로날-기재 면역분석법이 바람직하지만, 경쟁적 결합 분석법과 같은 다른 분석법이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Maddox, D.E. et al., 1983, J Exp Med 158:1211]을 참조한다.

본 발명은 본 발명의 CTGF 단편의 생물학적 활성을 중화시키는 CTGF 폴리펩티드 또는 그의 단편에 특이적으로 반응하는 항체의 사용을 고려한다. 본 발명의 방법에서 투여되는 항체는 무손상 항체이거나 또는 에피토프 결정부위에 결합할 수 있는 무손상 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어 Fab, F(ab')₂ 및 F_v 단편)일 수 있다. 본 방법에 사용되는 항체는 폴리클로날 항체, 또는 더욱 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 에피토프 특이성이 상이한 모노클로날 항체들은 당업계에 공지된 방법으로 단백질 단편을 포함하는 항원으로부터 만들어진다. 예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature 256:494; Ausubel et al., 상기 문헌]을 참조한다.

본 발명에서, 치료적 적용은 CTGF 또는 그의 단편에 대해 유도되는 "인간" 또는 "인간화" 항체를 사용하는 적용을 포함한다. 인간화 항체는 모항체 (즉, 통상적으로는 마우스 유래의 항체)와 동일한 결합 특이성을 갖고 인간의 특성을 증가 시킨 항체 또는 항체 단편이다. 인간화 항체는 예를 들어 체인 셔플링에 의해, 또는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, CTGF에 특이적인 비인간 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인간의 상보적 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 레파토리와 결합시킨다. 관심 항원에 특이적인 하이브리드 쌍을 선택한다. 그 다음에 선택된 쌍에서의 인간쇄를 인간의 상보적 가변 도메인 (중쇄 또는 경쇄) 레파토리와 결합시킬 수 있으며, 항원에 대한 결합 특이성으로 인간화 항체 폴리펩티드 이량체를 선택할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 인간화 항체 생성 기술은 예를 들어 미국 특허 제5,565,332호, 동 제5,585,089호, 동 제5,694,761호, 및 동 제5,693,762호에 기재되어 있다. 또한, 형질전환 마우스 중에서 인간 항체 생성 기술은 예를 들어, 미국 특허 제5,545,806호 및 동 제5,569,825호에 기재되어 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드

본 발명은 CTGF 메시지 및 구체적으로는 전장 CTGF (여기서, 이 전장 단백질은 절단되어 본 발명의 CTGF 단편을 형성함) 또는 CTGF 단편의 메시지 (통칭 "CTGF mRNA")의 단백질로의 번역을 직접적으로 방해하는 치료적 접근법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 안티센스 핵산 또는 리보자임을 사용하여 CTGF mRNA에 결합시키거나 또는 CTGF mRNA를 분해시키는 방법을 제공한다. 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 유전자의 단백질 생성물 발현을 방해하면서, 표적 유전자의 RNA 메시지와 특이적으로 결합한다. 안티센스는 메신저 RNA에 결합하여 세포에 의해 번역될 수 없는 이중 가닥 분자를 형성한다. 또한, 철-결합 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA-Fe)과 같은 화학반응성 기는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착되어 혼성화 부위에서 RNA의 절단을 유발할 수 있다. 유전자 번역을 억제하는 안티센스 방법의 이런 용도 및 기타의 용도가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Marcu-Sakura, 1988, Anal. Biochem 177:278]을 참조한다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 한 실시양태에서, CTGF mRNA 발현을 억제하는 데 유용한 안티센스 폴리뉴클레오티드의 서열은 오르토로거스(orthologous) 유전자의 서열 (종들간에 보존된 서열) 또는 오르토로거스 유전자의 전사체를 비교하고, 이러한 서열 중 고도로 보존된 영역을 확인함으로써 수득될 수 있다. 핵산 서열의 유사성은 당업계에 공지된 방법 및 알고리즘으로 결정될 수 있다. 이러한 방법 및 알고리즘에는 예를 들어 BLAST 프로그램 (미국립생물정보센터 (National Center for Biological Information)의 Basic Local Alignment Search Tool), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiple Aligned Sequences) 및 AMPS(Protein Multiple Sequence Alignment) 등이 있다.

주어진 폴리뉴클레오티드의 바람직한 길이를 선택할 때, 다양한 요인들을 고려하여 가장 유리한 특성을 달성해야 한다. 한 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 길이는 15 염기쌍 (bp) 이상이고, 바람직하게는 약 15 내지 약 100 bp이다. 더욱 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 길이가 약 15 bp 내지 약 80 bp이고, 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 길이가 약 15 내지 약 60 bp이다. 더 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 10 내지 15-머 이하의 폴리뉴클레오티드는 세포 침투성은 더 높은 반면, 유전자 특이성은 더 낮다. 반대로, 20 내지 약 30 bp의 더 긴 폴리뉴클레오티드는 특이성은 더 좋으나, 세포로의 흡수 속도가 감소된다. 예를 들어, 문헌[Stein et al., "Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression," Cohen, ed., McMillan Press, London (1988)]을 참조한다. RNA 전사체 표적 서열로의 접근가능성 또한 중요하므로 표적 RNA 중의 루프-형성 영역 및 오르토로거스 서열은 유망한 표적을 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 자연적으로 발견되는 유형의 올리고머 핵산 부분, 예를 들어 DNA 및 RNA의 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 구조 및 자연적으로 발견되는 핵산에 결합할 수 있는 인공 유사체 모두를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체, 또는 메틸 포스포네어, 포스포로티오네이트 또는 기타의 결합으로 연결되는 유사체를 기초로 한 것일 수 있다. 이들은 또한 염기 구조를 바꾼 단량체 부분 또는 다른 변형체를 포함할 수도 있지만, 자연 발생 RNA 전사체 구조와의 결합능은 여전히 보유하고 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 시판되는 기계 및 시약, 예를 들어 퍼킨-엘머/어플라이드 바이오시스템사 (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 구입한 것들을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 표적 전사체에 특이적인 폴리뉴클레오티드를 표준 방법에 따라 합성한다. 통상적으로, 포스포로티오네이트 변형 DNA 폴리뉴클레오티드는 다양한 제조업체가 시판하는 자동화 DNA 합성기 상에서 자동 DNA 합성 방식으로 합성된다. 이들 장치는 뉴클레오티드 100 개 길이의 폴리뉴클레오티드를 나노몰량으로 합성할 수 있다. 현대식 장 치로 합성된 더 짧은 폴리뉴클레오티드는 종종 추가의 정제 없이 사용하는 데 적합하다. 필요하다면, 폴리뉴클레오티드를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 역상 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Chapter 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]을 참조한다.

포스포디에스테르-연결 폴리뉴클레오티드는 혈청 또는 세포내 뉴클레아제의 작용에 특히 민감하므로 바람직한 실시양태에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제에 내성을 보인 포스포티오네이트 또는 메틸 포스포네이트-연결 유사체이다. 당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 다른 연결을 쉽게 선택할 수 있다. 또한 이들 변형들은 세포내 흡수 및 폴리뉴클레오티드의 안정성이 개선되도록 고안될 수도 있다.

폴리뉴클레오티드를 투여하기 위한 적절한 담체로는 예를 들어, 벡터, 항체, 약리 조성물, 결합 단백질 또는 호밍(homing) 단백질, 또는 표적 세포나 표적 조직으로 상기 서열을 보내기 위한 바이러스 운반 시스템 등이 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 내피 세포 또는 종양 세포를 인식하는 결합 단백질에 커플링될 수 있다. 투여 후, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 사이토킨, 전사 인자, G-단백질에 커플링된 수용체, 종양 억제 단백질 및 아폽토시스 개시 단백질의 발현 증가가 일어날 수 있도록 수용 세포 또는 조직으로 표적화될 수 있다.

안티센스 분자 등의 운반은 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산계와 같은 재조합 발현 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 본원에서 설명한 바와 같이, 유전 자 치료법에 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 바람직하게는 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스 등이 있다. 다수의 공지된 레트로바이러스가 선택가능한 마커에 대한 유전자를 이동시키거나 혼입시킬 수 있어서 형질도입된 세포를 확인하고 생성할 수 있다. 특이적 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 코딩하는 또다른 유전자와 함께 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열을 바이러스 벡터에 삽입함으로써, 예를 들어, 벡터가 표적 특이적이 된다. 레트로바이러스 벡터에 예를 들면, 당, 당지질 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 이를 표적 특이적으로 만들 수 있다. 바람직한 표적화는 레트로바이러스 벡터를 표적화하기 위한 항체를 사용함으로써 달성된다. 당업자라면 불필요한 실험 없이도 레트로바이러스 게놈에 삽입시켜 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 표적 특이적으로 운반하도록 하는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 알고 있거나 쉽게 확인할 수 있을 것이다.

재조합 레트로바이러스는 불완전하기 때문에 전염성 벡터 입자를 생성하기 위한 지원이 필요하다. 이러한 지원은, 예를 들면, LTR 내 조절 서열의 제어하에 레트로바이러스의 구조 유전자 모두를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 헬퍼 세포주를 사용함으로써 제공될 수 있다. 이들 플라스미드에는 패키징(packaging) 메카니즘으로 하여금 캡슐화될 RNA 전사체를 인식할 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열이 결여되어 있다. 패키징 신호가 결실된 헬퍼 세포주에는 ψ2, PA317 및 PA12 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 어떠한 게놈도 패키징되지 않으므로, 이들 세포주 는 빈 비리온을 생성하게 된다. 레트로바이러스 벡터가 패키징 신호 무손상 세포에 도입되지만, 구조 유전자가 관심있는 다른 유전자로 대체된 경우에는 벡터가 패키징되어 벡터 비리온이 생성될 수 있다.

별법으로, 통상적인 인산칼슘 형질감염법을 사용하여 NIH 3T3 또는 다른 조직 배양 세포를 레트로바이러스 구조 유전자인 gag, pol 및 env를 코딩하는 플라스미드로 직접 형질감염시킬 수 있다. 그 다음에, 이들 세포를 관심 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염시킨다. 이로써 생성되는 세포는 배양 배지로 레트로바이러스 벡터를 방출한다.

안티센스 분자를 위한 또다른 표적화 운반 시스템은 콜로이드성 분산계이다. 콜로이드성 분산계에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기재 계가 포함된다. 본 발명의 바람직한 콜로이드성 계는 리포솜이다. 리포솜은 생체 내 및 생체 외에서 운반계로서 유용한 인공막 소낭이다. 크기가 0.2 내지 4.0 ㎛ 범위인 커다란 단일라멜라 소낭(LUV)이 커다란 거대분자를 포함하는 완충 수용액의 상당 비율을 캡슐화할 수 있음이 밝혀진 바 있다. RNA, DNA 및 무손상 비리온은 수성 내부에 캡슐화되어 생물학적으로 활성인 형태로 세포에 운반될 수 있다. 리포솜이 효과적인 유전자 이동 운반체가 되기 위해서는 다음의 특징들이 존재해야 한다. (1) 생물학적 활성의 손상 없이, 관심 유전자의 고효율 캡슐화, (2) 비-표적 세포에 비해 표적 세포에 대한 우선적이고 실질적인 결합, (3) 소낭 수성 내용물의 표적 세포 세포질로의 고효율 운반, 및 (4) 유전 정보의 정확하고 효율적인 발현.

소분자 억제제

본 발명은 또한 본 발명의 CTGF 단편의 활성을 억제하는 소분자를 확인하고 이용하는 방법을 추가로 제공한다.

CTGF 단편 활성을 억제하는 소분자의 확인은 다양한 스크리닝 기술로 수행될 수 있다. 화합물의 스크리닝에서, 이런 분석법은 화합물의 단백질 또는 세포 표적으로의 결합과 연관된 검출가능한 신호를 제공할 것이다. 분석법의 성질에 따라, 상기 검출가능한 신호는 광 흡수 또는 방출, 플라크 형성 또는 다른 편리한 신호일 수 있다. 그 결과는 정성적이거나 정량적일 수 있다.

특이적 결합을 하는 화합물을 스크리닝하기 위해서, 다양한 면역분석법을 사용하여 세포와 결합하는 인간 (또는 영장류) 항체를 검출할 수 있다. 즉, 표지된 항-hlg, 예를 들어 항-hlgM, 항-hlgG 또는 이들의 조합물을 써서 갈락토실 에피토프와 특이적으로 결합한 인간 항체를 검출할 수 있다. 방사선동위원소, 효소, 형광체, 화학발광체, 입자 등과 같은 다양한 표지가 사용될 수 있다. 표지된 안티-hIg를 제공하는 시판 키트가 다수 있으며, 이를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용할 수 있다.

다양한 프로토콜을 사용하여 화학 화합물의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 적합한 프로토콜의 선택은 화합물 제제의 성질에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 예를 들어, 화합물 각각이 분리될 수 있는 경우, 화합물들은 개개의 입자, 핀, 막 등에 결합될 수 있다. 또한, 이용가능한 화합물의 양은 라이브러리 생성에 사용된 방법에 따라 달라질 것이다. 또한, 지지체에 대한 화합물의 부착 성질에 따라, 화합물 분취액을 방출하여 일련의 분석을 수행할 수 있다. 또한, 활성이 있는 것으로 나타난 화합물을 확인하는 능력에 의해 화합물 분석 방식이 영향을 받을 것이다.

화합물들이 격자 표면상에 개별적으로 있어서 격자의 부위 각각에서 그 조성을 아는 경우, 세포 론(cellular lawn)을 제공하여 이를 격자와 유사하게 조직되게 하고 고체 표면에 결합된 상기 화합물들에 의해 레지스트리(registry) 형식으로 배치되게 할 수 있다. 일단, 론과 고체 기판이 레지스트리 형식으로 배치된 후에는, 화합물들을 부착된 방식에 따라 표면으로부터 이탈시킬 수 있다. 이들 화합물들이 세포 표면 상의 단백질에 결합하기에 충분한 시간이 지나면, 세포 론을 세척하여 비특이적으로 결합된 화합물을 제거할 수 있다. 1 회 이상의 세척이 필요하며, 이때 세척은 원하는 친화성 정도에 따라 엄격도를 달리할 수 있다. 세척을 마친 후에 포유동물의 혈액 또는 혈장을 첨가하고 세포독성에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 혈장 또는 혈액을 제거한 후, 플라크를 관찰하여 격자에서의 그 위치에 해당하는 화합물의 성질을 결정할 수 있다. 물론 혈장 또는 혈액에는 자연적으로 론의 세포를 사멸시키는 어떠한 성분도 없어야 한다.

예비 방법을 반복할 수 있으므로, 동일 화합물을 비교가능한 부위에 부착시킨 다수의 고체 기판을 제조하여, 동일 또는 상이한 세포로 스크리닝을 반복하여 개별 화합물의 활성을 결정할 수 있다.

일부의 경우, 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 핵산 태그를 증폭시키고, 그 핵산 태그로 화합물의 동일성을 결정할 수 있다. 예를 들어, WO 93/20242를 참조 한다. 이 경우, 용균물을 수거하고, 이것을 핵산 태그에 특이적인 프라이머가 포함된 중합효소 연쇄 반응 배지에 도입시켜 활성인 화합물을 결정할 수 있다. 증폭 후, 그 핵산 태그를 서열분석하거나, 다른 방법으로 그 핵산 태그의 서열을 결정할 수 있으며, 이는 그 화합물의 제조에 사용된 합성 방법을 지시할 것이다.

별법으로는, 입자로부터 방출가능하며 그 입자에 결합한 화합물의 합성 방법을 나타낼 2진부호를 제공할 수 있는 태그가 부착된 입자가 있을 수 있다 (예를 들어, 문헌[Ohlmeyer, et al., PNAS USA (1993) 90:10922] 참조). 이들 태그는 편리하게는 기체 크로마토그래피-전자 포획에 의해 검출될 수 있는 알킬렌 화합물의 동족 계열일 수 있다. 연결기의 성질에 따라서, 특정 화합물을 확인하기 전에 입자를 2회 또는 3회 사용할 수 있도록 입자로부터 부분 방출시킬 수 있다.

대체로 라이브러리가 논의되었지만, CTGF 에피토프를 각각의 화합물에 연결할 수 있는 한, 어떤 큰 군의 화합물들이라도 이와 유사하게 스크리닝할 수 있다. 그러므로 공급원이 상이한 화합물, 즉, 매크롤리드, 올리고펩티드, 리보핵산, 덴드리머 등을 비롯한 천연 및 합성 화합물 모두를 이와 유사한 방식으로 스크리닝할 수 있다.

이 분석법에서 플라크의 형성은 라이브러리 구성원과 세포 (보통은 표면 단백질)와의 결합이 항체와 CTGF 에피토프와의 결합을 방해하지 않고, 면역 복합체가 충분히 안정적이어서 보체 캐스케이드를 개시하며, 그 구성원이 표적에 높은 친화성을 가짐을 증명하는 것이다.

본 발명의 CTGF 단편의 활성을 조정하는 소분자를 수득하기 위한 다른 스크 리닝 방법이 PCT 공개 WO 9813353에 기재되어 있다.

<제약 제제 및 투여 경로>

CTGF의 발현 및 활성을 조정함으로써 신장 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 방법에 유용한 소분자 및 기타의 작용제를 확인하기 위해, CTGF 및 그의 생물학적 활성 단편은 다양한 스크리닝 기술의 어떤 것으로도 치료 화합물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 상기 스크리닝 시험에 사용되는 단편은 용액 중에 자유롭게 존재하고 있거나, 고체 기판에 부착되어 있거나, 세포 표면에 있거나, 또는 세포내에 위치하고 있을 수 있다. CTGF와 시험 작용제 사이의 결합 복합체 형성 또는 생물학적 활성의 차단 또는 감소를 당업계에서 이용가능한 방법으로 측정할 수 있다.

CTGF, 또는 CTGF의 발현 및(또는) 활성을 조정, 조절 또는 억제하는 데 유용한 또다른 표적 폴리펩티드에 대해 적절한 결합 친화성을 갖는 화합물을 고처리량 스크리닝하기 위한 약물 스크리닝의 다른 기술들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 당업계에서 이용가능한 방법으로 시험 화합물을 수반하는 미량배열을 제조하여, 이를 사용해 분석할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Shalon, D. et al., 1995, PCT 출원 WO 95/35505, Baldeschweiler et al., 1995, PCT 출원 WO95/251116호; Brennan, T.M. et al., 1995, 미국특허 제5,474,796호, Heller, M.J. et al., 1997, 미국특허 제5,605,662호] 참조).

CTGF 활성을 조정하는 소분자는 다양한 기타 스크리닝 기술로 확인될 수 있으며, 이것은 CTGF와 상호작용하는 다른 화합물 및 항체의 확인에 사용될 수 있고, 본 발명의 방법에서 약물 또는 치료제로 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Enna, S.J. et al., eds., 1998, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons] 참조). 이런 분석법은 전형적으로 화합물의 단백질 또는 세포 표적으로의 결합과 연관된 검출가능한 신호를 제공할 것이다. 결합은 예를 들면, 형광단, 효소 접합체 및 당업계에 공지된 기타 검출가능한 표지로 검출될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Enna et al.] 참조). 그 결과는 정성적이거나 정량적일 수 있다.

특이적 결합을 하는 화합물을 스크리닝하기 위해서, 다양한 면역분석법을 사용하여 예를 들면, 세포와 결합하는 인간 (또는 영장류) 항체를 검출할 수 있다. 즉, 표지된 항-hlg, 예를 들어 항-hlgM, 항-hlgG 또는 이들의 조합물을 써서 갈락토실 에피토프와 특이적으로 결합한 인간 항체를 검출할 수 있다. 방사선동위원소, 효소, 형광체, 화학발광체, 입자 등과 같은 다양한 표지가 사용될 수 있다. 표지된 안티-hIg를 제공하는 시판 키트가 다수 있으며, 이를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용할 수 있다.

화합물을 세포독성 효과에 대해 스크리닝하기 위해서, 광범위한 프로토콜을 사용하여 원하는 활성을 화합물을 확실하게 찾을 수 있다. 통상적으로, 자연적으로 발생하거나 변형된 세포주 등일 수 있는 세포가 사용될 것이다. 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 예를 들어, 병원체에 관심이 있는 경우, 화합물 접합체가 어떤 에피토프에 결합하는지는 중요하지 않고, 항체 의존성 세포독성 시스템의 존재하에 병원성 세포와 화합물 각각을 조합하여 세포독성 효과를 측정할 수 있다. 이러한 분석법은 다양한 후보 화합물을 숙주 세포에 투여하여 그 효과를 측 정하기 전에 수행될 수도 있고, 그 후에 수행될 수도 있다. 이러한 방법으로, 병원성 표적에 대한 친화성과 접촉할 숙주 세포에 대한 친화성 사이에서 투여 방법에 기초한 차별적 분석결과를 얻게 될 것이다.

일부 상황에서는, 특정 세포 상태, 예를 들어 자가면역 질병, 이식 등 T 세포와 함께 존재할 수 있는 바와 같이 활성화된 상태에 관심이 있을 것이다. 이러한 상황에서는, 먼저 화합물들을 스크리닝하여 어떤 화합물이 정지상태의 세포에 결합하는 지, 그리고 정지상태의 세포에 결합하지 않은 화합물은 어떤 것인지를 결정한 후, 이렇게 남은 후보 화합물들로 활성화된 세포에 대한 세포독성에 대해서 스크리닝할 것이다. 이어서, 그 화합물과 접촉할 숙주에 존재하는 기타 세포에 대해 스크리닝하여 세포독성 효과를 결정할 수 있다. 별법으로, 암 세포 및 정상 세포를 사용하여, 화합물들 중 어떤 것이 정상 세포에 비해 암 세포에 대한 친화성이 더 높은가를 측정할 수 있다. 다시, 정상 세포와의 결합에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 그 효과를 결정할 수 있다. 이어서, 정상 세포에 대해 세포독성이 아닌 화합물들로 암 세포에 대한 세포독성 효과를 스크리닝할 수 있다. 비록 정상 세포에 대해 어떤 세포독성이 있다하더라도, 암 세포의 경우, 세포독성 활성에 충분한 차이가 나서 일부는 정상 세포를 위한 보다 낮은 세포독성을 기꺼이 허용할 것이고, 그렇지 않으면 그 화합물이 암 세포에 효과적인 것으로 나타난다.

천연적으로 수득된 세포를 사용하는 대신, 재조합 기술로 변형된 세포를 사용할 수 있다. 즉, 특정 유전자를 상향 또는 하향조절하여 변형시킬 수 있는, 배양액 중에서 증식시킬 수 있는 세포를 사용할 수 있다. 이러한 방법으로, 표면 상 의 한 단백질이 다른 세포들을 갖게 될 것이다. 그 다음, 상기 라이브러리의 구성원이 특정 단백질의 존재 여부에 따라 세포에 어떤 영향을 주는가를 차별적으로 분석할 수 있다. 이러한 방법으로, 그 화합물이 특정 표면 막 단백질에 대해서 표면 막 상에 존재하는 어떤 단백질과도 구별되는 특이적 친화성을 갖는지 여부를 결정할 수 있다.

보체 의존성 세포독성 효과를 개시하지 않는 특정 표면 막 단백질에 결합하는 항체, 예를 들어, 상이한 종, 이소타입 또는 그의 조합물을 사용하여 세포들을 구분할 수 있다. 항혈청 항체나 모노클로날 항체를 차단하는 항체를 세포의 일부에 첨가함으로써, 이들 세포는 라이브러리 구성원에 결합가능한 표적 단백질을 갖지 않을 것이다. 이러한 방법으로, 한 군의 단일 단백질의 비이용성에 기초한 반응에서 차이가 나는 비교가능한 세포가 생성된다. 통상적으로 항체가 사용하기에 가장 편리한 제제일 것이지만, 동일한 기능을 하는 다른 특이적 결합체가 사용될 수도 있다.

결합 측정 분석에 사용하기 위해, 항체 의존성 세포독성계를 사용할 수 있다. 세포독성 효과에 필요한 성분들만이 존재하는 경우에는, 합성 성분들의 혼합물을 사용할 수 있다. 이는 혈액이나 혈장 성분들이 분석 결과에 역효과를 미칠 수 있는 경우 바람직할 수 있다.

또한, 세포 론은 다수의 후보물질들을 스크리닝하는 매우 편리한 방법이지만, 다른 기술들이 사용될 수도 있다. 이러한 기술로는 다중 웰 플레이트 및 조합 라이브러리의 제조에 사용되는 여러 가지 디바이스, 예를 들어 핀, 티 백 등의 사 용이 포함된다. 디바이스가 세포와 접촉될 수 있는 경우, 다양한 장치의 성질과 관련하여 세포를 분리하여 증식시키거나 디바이스상에서 세포를 증식시킬 수 있다. 디바이스를 적절한 배양액 중에 침지시켜 세포를 접종하거나 그렇지 않으면 이 디바이스를 사용하여 세포와 후보 화합물을 접촉시킨다. 세포독성제를 첨가한 후, 다양한 방법으로 용균물을 분석할 수 있다. 예를 들면, FACS를 사용하여 살아있는 세포와 사멸된 세포를 구별하거나, sup 51 Cr 방출을 이용하거나, 상층액 중의 세포내 화합물 검출로 활성 화합물을 검출할 수 있다.

또한, 화합물이 아고니스트 활성이 있는지 길항 활성이 있는지 알고 싶을 수 있다. 표적 단백질과 결합하는 화합물이 라이브러리 중에 존재하는 지를 결정하기 위한 신속한 방법을 위해 본 발명의 분석 기술이 제공된다. 일단, 실질적으로 후보 화합물의 수를 좁혀, 화합물 그 자체의 활성을 검출하는 더욱 정교한 분석법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로, 결합 친화성 및 특이성을 결정하기 위한 신속한 스크리닝을 수행한 후, 활성을 결정하기 위한 더욱 집중적인 스크리닝을 수행할 수 있다. 세포를 변형시킬 수 있어서 검출가능한 신호를 제공할 마커 유전자가 활성화되는 경우, 활성 결정을 위한 기술이 여러 가지 있다. 편리하게는, 신호가 염료의 생성, 표지된 항체로 검출할 수 있는 표면 막 단백질의 생성, 또는 다양한 임의의 기술로 상층액에서 검출할 수 있는 단백질의 분비와 관련되어 있을 수 있다. 예를 들어, 발현된 유전자가 분비를 위한 리더 서열을 갖도록 변형된 루시퍼라제일 수 있으며, 이로써 적절한 기질을 사용한 광 발생 형성에 대해 상층액을 스크리닝할 수 있게 된다.

다양한 프로토콜을 사용하여 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이는 화합물 제제의 성질에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 예를 들어, 화합물 각각이 분리될 수 있는 경우, 화합물들은 개개의 입자, 핀, 막 등에 결합될 수 있다. 또한, 이용가능한 화합물의 양은 라이브러리 생성에 사용된 방법에 따라 달라질 것이다. 또한, 지지체에 대한 화합물의 부착 성질에 따라, 화합물 분취액을 방출하여 일련의 분석을 수행할 수 있다. 또한, 활성이 있는 것으로 나타난 화합물을 확인하는 능력에 의해 화합물 분석 방식이 영향을 받을 것이다.

화합물들이 격자 표면상에 개별적으로 있어서 격자의 부위 각각에서 그 조성을 아는 경우, 세포 론을 제공하여 이를 격자와 유사하게 조직되게 하고 고체 표면에 결합된 상기 화합물들에 의해 레지스트리 형식으로 배치되게 할 수 있다. 일단, 론과 고체 기판이 레지스트리 형식으로 배치된 후에는, 화합물들을 부착된 방식에 따라 표면으로부터 이탈시킬 수 있다. 이들 화합물들이 세포 표면 상의 단백질에 결합하기에 충분한 시간이 지나면, 세포 론을 세척하여 비특이적으로 결합된 화합물을 제거할 수 있다. 1회 이상의 세척이 필요하며, 이때 세척은 원하는 친화성 정도에 따라 엄격도를 달리할 수 있다. 세척을 마친 후에 포유동물의 혈액 또는 혈장을 첨가하고 세포독성에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 혈장 또는 혈액을 제거한 후, 플라크를 관찰하여 격자에서의 그 위치에 해당하는 화합물의 성질을 결정할 수 있다. 혈장 또는 혈액에는 자연적으로 론의 세포를 사멸시키는 어떠한 성분도 없어야 한다.

예비 방법을 반복할 수 있으므로, 동일 화합물을 비교가능한 부위에 부착시 킨 다수의 고체 기판을 제조하여, 동일 또는 상이한 세포로 스크리닝을 반복하여 개별 화합물의 활성을 결정할 수 있다. 일부의 경우, 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 핵산 태그를 증폭시키고, 그 핵산 태그로 화합물의 동일성을 결정할 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 93/20242를 참조한다. 이 경우, 용균물을 수거하고, 이것을 핵산 태그에 특이적인 프라이머가 포함된 중합효소 연쇄 반응 배지에 도입시켜 활성인 화합물을 결정할 수 있다. 증폭 후, 그 핵산 태그를 서열분석하거나, 다른 방법으로 그 핵산 태그의 서열을 결정할 수 있으며, 이는 그 화합물의 제조에 사용된 방법의 선택을 지시할 것이다.

별법으로는 입자로부터 방출가능하며 그 입자에 결합한 화합물의 합성 방법을 나타낼 2진부호를 제공할 수 있는 태그가 부착된 입자가 있을 수 있다 (예를 들어, 문헌[Ohlmeyer, et al., PNAS USA (1993) 90:10922] 참조). 이들 태그는 편리하게는 기체 크로마토그래피-전자 포획에 의해 검출될 수 있는 알킬렌 화합물의 동족 계열일 수 있다. 연결기의 성질에 따라서, 특정 화합물을 확인하기 전에 입자를 2 회 또는 3 회 사용할 수 있도록 입자로부터 부분 방출시킬 수 있다.

대체로 라이브러리가 논의되었지만, CTGF 에피토프를 각각의 화합물에 연결할 수 있는 한, 어떤 큰 군의 화합물들이라도 이와 유사하게 스크리닝할 수 있다. 그러므로 공급원이 상이한 화합물, 즉, 매크롤리드, 올리고펩티드, 리보핵산, 덴드리머 등을 비롯한 천연 및 합성 화합물 모두를 이와 유사한 방식으로 스크리닝할 수 있다.

이 분석법에서 플라크의 형성은 라이브러리 구성원과 세포 (보통은 표면 단 백질)와의 결합이 항체와 CTGF 에피토프와의 결합을 방해하지 않고, 면역 복합체가 충분히 안정적이어서 보체 캐스케이드를 개시하며, 그 구성원이 표적에 높은 친화성을 가짐을 증명하는 것이다.

본 발명의 방법은 사멸될 세포 표적, 특히 CTGF 에피토프가 소량이거나 아예 없는 세포 표적이 있는 어떠한 상황에서도 사용될 수 있다. 그러므로, 세포 표적은 병원성 원핵생물일 수도 있다. 다양한 유기체로는 예를 들면 마이크로박테륨, 예르시니아(Yersinia), 슈우도모나스, 보데텔라 퍼투시스(백일해균; Bordetella pertussis), 매독균(Treponema pallidum), 임균(Neisseria gonorrhoea), 스트렙토코쿠스, 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus Influenza) 등이 있다. 다른 병원체로는 진핵생물, 특히 칸디다(Candida), 히스토플라스마(Histoplasma) 등과 같은 진균류, 및 편모충(Giardia)과 같은 원생동물 등이 있다. 또한, 스크리닝된 세포가 치명적으로 감염되어 있는 경우, 그 세포에 표면 막 단백질을 제공하는 바이러스도 본 발명의 화합물의 표적이 될 수 있다.

숙주 세포가 비정상적이거나 숙주 또는 숙주의 치료에 불리하게 작용하는 경우, 그 세포도 표적으로 작용할 수 있다. 예를 들면, 정상 조직과 구별이 가능한 암성(癌性) 조직이 본 발명의 화합물의 표적으로 작용할 수 있다. 또한, 자가면역 질병 또는 GVHD나 이식 거부와 관련된 T 세포 또는 B 세포 역시 표적으로 작용할 수 있다. 발육이 이상한 세포 역시 그들의 성질에 관련없이, 정상 세포와 구별이 가능한 한, 표적으로 작용할 수 있다. 따라서, 건선 병변, 림프종 세포, 세균 감염 세포, 진균 감염 세포, 기생물 감염 세포, 바이러스 감염 세포는 본 발명의 생 성물의 표적일 수 있다. 또한, 예를 들면 T 세포 아집단(subset)과 같이 분화 마커를 발현하는 세포, 활성화된 혈소판, 내피 세포, 호르몬 또는 사이토킨 수용체 발현 세포와 같은 세포를 모두 제거하는 것이 아니라 그 일부를 제거하고자 하는 경우에도, 본 발명의 화합물을 적용할 수 있다.

CTGF의 활성을 조정하는 소분자를 얻기 위한 기타의 스크리닝 방법은 문헌[예를 들어 PCT 공개 WO 9813353]에서 찾을 수 있다.

화합물/분자

본 발명은 CTGF의 활성을 조정, 조절 또는 억제함으로써 신장 섬유증 관련 장애를 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법에는 CTGF의 신호 도입 경로에 관련된 효소를 차단하거나 결합 상호작용을 차단하는 화합물의 치료 유효량 투여가 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 CTGF 유도를 차단하는 화합물을 투여하여 CTGF의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서 CTGF 유전자 발현 및(또는) CTGF 활성을 조정하는 화합물로는 세포내 시클릭 뉴클레오티드를 증가시키는 작용제가 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 CTGF 유도를 차단할 수 있는 다른 화합물은 하기의 스크리닝 방법으로 확인될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 CTGF 단편, 예를 들면 도 3에 나타낸 바와 같은 엑손 2 및 엑손 3에 의해 코딩되는 단편의 활성, 예를 들면 세포외 매트릭스 단백질 생산, 근섬유아세포 분화 유도 및 콜라겐 합성 유도 활성을 조정하는 화합물 또는 작용제의 확인 방법을 제공한다. 상기 방법은 펩티드, 소분자, 폴리펩티드, 펩 티드모방체와 같은 관심있는 작용제를, 목적하는 활성, 예를 들면 콜라겐 생성 활성이 있는 것으로 알려진 CTGF 단편 및 세포 (예를 들면, 섬유아세포)와 접촉시키고, 당업자에게 공지되어 있는 임의의 수단으로 세포의 콜라겐 생성능을 측정하는 것을 포함한다 (실시예 참조). 그 다음, 상기 세포의 콜라겐 생성능을 작용제 또는 화합물의 부재하 세포의 적합한 대조군 집단의 콜라겐 생성능과 비교한다.

본원에서 사용된 용어 "작용제" 또는 "화합물"은 본원에서 기재된 바와 같이 CTGF 단편의 활성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 분자, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드 또는 약물을 의미한다. 작용제는 세포에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있거나 그렇게 추측되는 어떠한 것이라도 가능하다. 작용제에는 CTGF 폴리펩티드의 펩티드 단편이 포함된다. 작용제에는 합성 화학 작용제, 생화학 작용제, 세포, 추출물, 균질물 및 조정 배지 등이 있다. 또한, 시험 작용제는 다수의 화합물을 스크리닝하기 위한 조합 라이브러리일 수도 있다. 본 발명의 방법에서 확인되는 화합물은 용액 중에서 또는 고체 기판과의 결합 후에, 특정 DNA 서열의 검출에 통상적으로 사용되는 임의의 방법, 예를 들면 PCR, 올리고머 제한법 (문헌[Saiki et al., Bio/Technology 3:1008-1012, 1985] 참조), 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 프로브 분석법 (문헌[Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278, 1983] 참조), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석법 (OLA) (문헌[Landegren et al., Science 241:1077, 1988] 참조) 등에 의한 추가의 평가, 검출, 클로닝, 서열분석 등이 수행될 수 있다. DNA 분석을 위한 분자 기술은 문헌[Landegren et al., Science 242:229-237, 1988]에 정리되어 있다.

후보 작용제에는 다수의 화학종이 포함된다. 이들은 유기 분자, 바람직하게는 분자량 50 이상 약 2500 달톤 미만의 작은 유기 화합물일 수 있다. 후보 작용제에는 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 관능기가 포함되며, 통상적으로 1개 이상의 아미노기, 카르보닐기, 히드록실기 또는 카르복실기, 바람직하게는 2개 이상의 화학 관능기가 포함된다. 후보 작용제는 종종 1개 이상의 상기 관능기로 치환된 시클릭 탄소 또는 헤테로시클릭 구조 및(또는) 방향족 또는 다중방향족 구조를 포함한다. 또한, 후보 작용제는 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합물을 포함하는 생체분자에서 찾을 수도 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 후보 작용제는 폴리펩티드, 또는 합성 또는 자연 발생 핵산 서열의 위치 지정 돌연변이유발법 또는 무작위 돌연변이유발법에 의해 생성된 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 방법은 전장 CTGF의 번역후 변형을 방해하거나 CTGF의 비활성 전구체의 활성화를 차단하는 분자의 투여 방법을 제공한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 사구체맥관막 세포를 TGF-β에 노출시킴으로써 전장 CTGF 분자의 카르복시-말단쪽 절반 및 아미노 말단쪽 절반의 크기에 상응하는 28 내지 30 kDa 위치에 추가의 두드러진 밴드를 얻게 되었다. 상기에서 논의한 바와 같이, TGF-β의 처치로 전장 분자를 절단할 수 있는 프로테아제 또는 다른 인자가 생성될 수 있다. CTGF 활성을 억제하는 분자는 본원에 제공된 스크리닝 방법을 사용하여 확인할 수 있다.

<제약 조성물 및 투여 경로>

투여 경로

CTGF 조정제, 즉 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 및 본원에 기재된 다른 화합물을 포함하는 조성물은 그 자체가 인간 환자에게 투여되거나, 경우에 따라서는 적절한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물로 투여될 수 있다. 본 발명은 CTGF 또는 그의 단편의 발현 또는 활성을 조정하거나 조절하는 작용제를 CTGF 단편의 활성 또는 발현을 치료하거나 예방하기에 적절한 양으로, 필요로 하는 환자에게 투여하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 치료 방법 및 예방 방법은 유효량의 작용제를 환자, 바람직하게는 포유동물 환자, 가장 바람직하게는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 환자인 포유동물 및 투여된 작용제는 동종 유래일 수 있다. 가장 바람직하게는, 환자 및 투여된 작용제의 기원이 인간이다.

유효량은 통상적인 실험으로 쉽게 결정될 수 있고, 가장 효과적이고 편리한 투여 경로 및 가장 적절한 제형도 마찬가지로 쉽게 결정될 수 있다. 다양한 제형 및 약물 전달 시스템이 당업계에서 사용되고 있다. 예를 들면, 문헌[Gennaro, A.R., ed., 1990, Remington's Pharmaceutical Science, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton PA]을 참조한다. 적합한 투여 경로는, 예를 들면 경구, 직장내, 점막내, 또는 장내 투여 및 근육내, 피하내, 골수내 주사뿐 아니라 경막내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 비내 또는 안내(眼內) 주사를 비롯한 비경구 전달을 포함할 수 있다. 조성물은 전신적 투여 방식보다는 국소적 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법, 예를 들면 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 봉입 (entrapping) 또는 동결건조 방법으로 제조될 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 예를 들면 활성 분자의 제약용 제제로의 가공을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함할 수 있다. 적당한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.

주사제의 경우, 예를 들면 조성물을 수용액, 바람직하게는 생리적으로 적합한 완충액, 예를 들면 행크스(Hanks's) 용액, 링거(Ringer's) 용액, 또는 생리 식염수 완충액 중에서 제형화할 수 있다. 점막내 투여의 경우, 침투해야 하는 장벽에 적합한 침투제(penetrant)를 제형물에 사용한다. 상기 침투제는 통상적으로 당업계에 공지되어 있다. 경구 투여의 경우, 활성 화합물을 당업계에 공지되어 있는 제약상 허용가능한 담체와 조합함으로써 쉽게 제형화할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액제 등으로 환자가 경구 복용하도록 제형화할 수 있다. 또한, 화합물은 좌약 또는 체류 관장액 등, 예를 들면 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌약 기재를 포함하는 직장 조성물로 제형화될 수 있다.

경구용 제약 제제는 고체 부형제로 얻을 수 있고, 경우에 따라서는 생성된 혼합물을 분쇄하고, 필요하다면 적절한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻는다. 적절한 부형제는 특히 당, 예를 들면 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 충전제; 셀룰로스 제제, 예를 들면 옥 수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트고무, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨 및(또는) 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 경우에 따라서는 붕해제, 예를 들면 교차결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그의 염을 첨가할 수 있다.

당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이를 위해, 농축된 당 용액을 사용할 수 있으며, 상기 용액은 경우에 따라 아라비아고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및(또는) 이산화티타늄, 래커 용액 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 활성 화합물 용량이 다른 조합물을 특성화하거나 확인하기 위해, 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가할 수 있다.

경구 투여용 제약 제제에는 젤라틴으로 제조되는 푸시-핏(push-fit) 캡슐 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제와 젤라틴으로 제조되는 연질의 밀봉 캡슐이 포함된다. 푸시-핏 캡슐은 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제 및(또는) 활석 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 및 경우에 따라서는 안정화제와 부가혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐의 경우에는, 활성 화합물을 지방 오일, 액상 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수도 있다. 경구 투여용의 모든 제형물은 경구 투여에 적절한 투여량이어야 한다.

흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적절한 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 임의의 다른 적절한 가스를 사용하여 가압 팩 또는 연무기로부터의 에어로졸 분무 배출 형태로 제공되어 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 적절한 투여량 단위는 계측량을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들면 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다. 이와 같은 것들은 통상적으로 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적절한 분말 기재의 분말 혼합물을 포함한다.

주사, 예를 들면 농축괴 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화된 조성물은 방부제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들면 앰플 또는 다중-투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중의 현탁액제, 용액제 또는 에멀젼제 형태일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및(또는) 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 비경구 투여 제형물에는 수용성 형태일 때 CTGF 또는 그의 단편의 활성에 영향을 주는 작용제의 수용액이 포함된다.

활성 화합물의 현탁액제는 적합한 오일 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 비히클에는 참기름과 같은 지방 오일, 및 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀 등이 있다. 수성 주사 현탁액제는 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질 등이 포함될 수 있다. 경우에 따라서는, 현탁액에 화합물의 용해성을 증가시켜 고농축된 용액을 제조할 수 있게 하는 적절한 안정화제 또는 작용제가 포함될 수도 있다. 별법으로, 활성 성분은 사용되기 전에는 발열 물질 없는 멸균수 등의 비히클에 용해(constitution)시키기 위한 분말 형태로 존재할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 저류물(貯留物) 제제로 제형화될 수 있다. 상기와 같이 장기간 작용하는 제형물은 이식(implantation) (예를 들면, 피하내로 또는 근육내로)으로 투여되거나 근육내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적절한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용가능한 오일 중의 에멀젼) 또는 이온 교환 수지, 난용성 염 등의 난용성 유도체를 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 소수성 분자를 위한 제약 담체에는, 예를 들면 벤질 알콜, 비극성 계면활성제, 수혼화성 유기 중합체 및 수성상을 포함하는 공-용매계가 포함될 수 있다. 공-용매계는 VPD 공-용매계일 수 있다. VPD는 무수 에탄올 중의 3 % w/v 벤질 알콜, 8 % w/v 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80, 및 65 % w/v 폴리에틸렌 글리콜 300으로 이루어진 용액이다. VPD 공-용매계 (VPD:5W)는 수용액 중에서 5 % 덱스트로스를 사용하여 1:1로 희석시킨 VPD로 이루어져 있다. 상기 공-용매계는 소수성 화합물을 용해시키는 데 유효하고 전신 투여 후의 독성이 낮다. 물론, 공-용매계의 비율을 그의 용해성 및 독성 특성의 손상 없이 상당히 변화시킬 수 있다. 또한, 공-용매 성분들을 변화시킬 수도 있다. 예를 들면, 다른 저독성의 비극성 계면활성제를 폴리소르베이트 80 대신 사용할 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜의 분율 크기를 다르게 할 수 있고, 폴리비닐 피롤리돈 등의 다른 생체적합성 중합체로 이 폴리에틸렌 글리콜을 대체할 수 있고, 다른 당 또는 다당류를 덱스트로스 대 신 사용할 수도 있다.

별법으로, 소수성 분자를 위한 다른 전달 시스템이 사용될 수 있다. 소수성 약물을 위한 전달 비히클 또는 담체의 예로는 리포좀 및 에멀젼 등이 공지되어 있다. 디메틸술폭시드와 같은 특정 유기 용매를 사용하면 보통 독성이 증가하게 되지만 이것을 사용할 수도 있다. 또한, 서방형 시스템, 예를 들면 유효량의 투여될 조성물을 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 화합물을 전달할 수 있다. 다양한 서방형 물질들이 수립되어 있고 당업자들에게 이용가능하다. 서방형 캡슐은 그의 화학적 성질에 따라 수 주일에서 100일에 걸쳐 화합물을 방출할 수 있다. 치료제의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가의 전략을 사용할 수 있다.

유효 투여량

본 발명의 치료 방법에 사용되는 모든 조성물에 대해, 치료 유효 투여량은 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술을 사용하여 초기에 예측할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 분석에서, 세포 배양시 결정된 IC₅₀을 포함하는 순환계 농도 범위가 달성되는 투여량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. CTGF 활성을 억제하고자 하는 경우, 예를 들면 CTGF의 활성이 최대 활성의 절반에 도달하게 하는 시험 화합물의 농도를 결정할 수 있다. 인간 환자에 적합한 투여량 범위는 세포 배양 분석 및 다른 동물 연구로부터 얻은 데이타를 사용하여 결정할 수 있다.

치료 유효 투여량은 환자의 증상을 개선시키거나 생존을 연장하는 분자의 양 을 지칭한다. 상기 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차, 예를 들면 LD₅₀ (집단의 50 %를 치사시키는 투여량) 및 ED₅₀ (집단의 50 %에서 치료상 유효한 투여량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 독성 효과 대 치료 효과의 투여량 비율이 치료 지수이며, 이는 LD₅₀/ED₅₀의 비율로 표현될 수 있다. 치료 지수가 높은 분자가 바람직하다.

투여량은 독성이 거의 없거나 아예 없고 ED₅₀을 포함하는 순환계 농도 범위에 속하는 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라서 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형물, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태의 특이성에 따라서 선택될 수 있다.

투여량 및 투여 간격을 각각 조절하여 활성 부분을 CTGF 활성을 원하는 대로 조정하거나 조절하기에 충분한 혈장 농도, 즉 최소 유효 농도 (MEC)로 제공할 수 있다. MEC는 화합물 각각마다 달라질 것이지만, 예를 들어 뼈의 성장을 유도하는 CTGF의 활성이 50 내지 90 % 달성되도록 하는 데 필요한 농도 등을 본원에 기재된 분석법을 사용하여 얻은 시험관내 데이타로부터 예측할 수 있다.

MEC 달성에 필요한 투여량은 개별적 특성 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 조성물은 치료 기간의 약 10 내지 90 %, 바람직하게는 약 30 내지 90 %, 가장 바람직하게는 50 내지 90 % 동안 MEC 보다 높은 혈장 농도를 유지하는 방법으로 투여되어야 한다. 국소 투여 또는 선택적 복용의 경우, 약물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.

물론, 투여된 조성물의 양은 특정 환자의 체중, 통증의 경중도, 투여 방식 및 처방 의사의 판단 등 다수의 요인에 따라 달라질 것이지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

포장

경우에 따라서, 조성물은 활성 성분을 포함하는 1종 이상의 단위 투여 형태가 들어있는 팩 또는 디스펜서 디바이스로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면 블리스터 (blister) 포장과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 디바이스에는 투여 지침서가 첨부되어 있을 수 있다. 또한, 적절한 제약 담체로 제형화된, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하여, 적절한 용기에 담고, 지시된 증상의 치료를 위한 라벨을 부착할 수 있다. 라벨에 지시된 적절한 증상에는 연골 또는 뼈의 유도, 창상 치유, 신경보호, 신장 섬유증, 당뇨병 등이 요구되는 장애 또는 질병의 치료가 포함될 수 있다.

다음의 실시예는 청구하는 발명을 설명하기 위해서만 제공된다. 그러나 본 발명은 예시된 실시양태의 범위에 한정되는 것이 아니라, 오직 본 발명의 단일 측면 및 본 발명의 범위 내에서 기능적으로 동등한 방법을 설명하기 위한 의도이다. 사실, 당업자에게는 이러한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본원에 기재된 것이외의 여러 가지 변형들이 명백할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 것이다.

실시예 1: CTGF 단편에 의한 세포외 매트릭스 합성 촉진

CTGF 단편을 제조하기 위해서, 인간 재조합 CTGF (전장)를 키모트립신으로 분해하여 하나의 CTGF 단편을 생성시켰다. 재조합 CTGF 단편은 또한 CTGF의 엑손 2 및 엑손 3 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현시켜 제조했다. 배양된 정상 래트 신장 (NRK) 섬유아세포 (NRK-49F로 명명됨)의 연속 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)로부터 얻어 세포 배양물을 제조하였다. 인간 포피 섬유아세포를 체외이식 배양물로터 수립하였다. 세포 배양물을 2.5 % 소태아 혈청 및 2.5 % Nu-Serum I (미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 Collaborative Biomedical 제품)을 포함하는 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle media) (DME) 중에 유지시켰고, 전면생장 (confluence) 전에 계대접종시켰다.

섬유아세포에서의 콜라겐 합성을 조사하기 위해서, 48 웰 플레이트에 10,000 세포/웰로 접종하여 NRK 및 인간 포피 섬유아세포의 증식이 정지된 단일층을 제조하였고 이 세포들을 DME 및 2.5 % 소태아 혈청/Nu-Serum 중에서 5 내지 7일 동안 전면생장시켰다. 그 후, 섬유아세포 단일층은 25 mM HEPES 및 ITS 예비혼합물을 포함하는 DME (Collaborative Biomedical 제품) 중에서 1 내지 8일 동안 혈청이 고갈되었다. 그 후, 아스코르브산 (50 mg/ml) 및 생물학적 작용제 (CTGF 단편)를 첨가하였다. 48시간 처리 기간 중 마지막 24시간 동안 정량 분석을 이용하여 펩신 내성 염 침전된 세포외/세포 표면 결합 콜라겐 내로의 ³H-프롤린 혼입량을 측정함으로써 콜라겐 합성을 평가하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, CTGF의 엑손 2 및 엑손 3을 포함하는 CTGF 단편들은 1 ng/㎖의 TGF-β로 처리된 NRK 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진하였다. 반면에, 카르복실 말단 CTGF는 콜라겐 합성을 촉진시키지 않았다.

실시예 2: CTGF 단편에 의한 근섬유아세포의 분화 유도

CTGF 단편 및 세포 배양물을 상기한 바와 같이 제조하였다. CTGF 단편에 의한 근섬유아세포의 유도를 조사하기 위해, 포피 섬유아세포에 대한 NRK의 성장이 정지된 단일층을 상기한 바와 같이 제조하여 처리하였다. 처리후에 알파-평활근의 면역조직학적 검출을 위한 과정 전에 48-웰 평판의 단일층을 TBS로 2회 세척하고 -20 ℃의 메탄올 중에서 10분간 고정시켰다. 면역조직학적 검출을 수행하였다. 고정 후에 세포 단일층을 TBS로 2회 세척하고 30분 동안 TBS 중의 10 % 말혈청/2 % 우유로 차단시켰다. 이어서 세포를 말혈청/우유/TBS의 1:200 희석액에서 모노클론 마우스 항 알파-평활근 액틴 IgG (클론 1A4, 시그마 케미칼)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBS로 3회 세척한 후에, 이어서 세포 단일층을 1시간 동안 말혈청/우유/TBS의 1:200 희석액에서 비오틴화된 말 항-마우스 IgG (벡터 랩; 캘리포니아주 버링게임)와 함께 인큐베이션하였다. 이후에 세포 단일층을 세척하고 30분 동안 알칼리 포스페이트 컨쥬게이션된 스트렙티딘-비오틴 착물 (다코; 덴마크 글로스트럽)과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 후에 1 mM 레바미솔(levamisole)의 존재하에 알칼리 포스파타제를 패스트(fast) 적색 기질 (벡터 레드, 백터 랩스)로 가시화하였다. 이후 처리한 세포 단일층을 현미경으로 적색으로 염색된 알파-평활근 액틴 양성 근섬유아세포에 대해 조사하고 웰당 근섬유아세포의 수를 계수하고 선택된 현미경 영역의 사진을 찍었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포 콜라겐 합성에 대한 분석 결과는 섬유 아세포 유도 분석에 의해 반영된다. 구체적으로, 근모세포 분화를 유도할 수 없는 카르복실 말단 CTGF 단편에 비해, 본 발명의 CTGF 단편은 근모세포 분화를 유도할 수 있었다.

실시예 3: 중화 항-CTGF 항체에 의한, TGF-β유도된 DNA 합성, 콜라겐 합성 및 근섬유아세포 유도의 차단

당업계에 공지된 방법을 사용하여 바큘로바이러스 발현 시스템에서 제조한 생물학적으로 활성인 재조합 인간 CTGF에 대해 특이적인 항-CTGF 항체를 제조하였다. 항체를 염소에서 제조하여, NRK 섬유아세포에서의 TGF-β유도된 DNA 또는 콜라겐 합성에 대해 시험하거나 또는 직접 CTGF의 중화 활성에 대해 시험하였다. TGF-β 작용의 중화에 대한 분석에서 상기 염소 항체는 활성을 나타냈다. 이들 분석법에서 염소 항-CTGF 항체는 DNA 합성을 차단할 수 있었다. 또한, 도 5에서 증명된 바와 같이, CTGF 항체는 TGF-β에 의해 유도된 근섬유아세포 형성과 콜라겐 합성을 차단할 수 있었다. 콜라겐 합성을 차단하기 위해 필요한 항체의 양은 DNA 합성을 차단하기 위해 필요한 양보다 훨씬 적다는 것이 주목되었다. 웨스턴 블럿팅 분석과 경쟁적 ELISA 분석법 둘다에서 상기 제제 중의 항체 대부분이 CTGF의 N-말단 도메인에 대해 유도된 것임을 나타냈다. 이것으로 2개의 도메인이 상이한 생물학적 활성을 촉진시키는 데 관여할 수 있음을 제안되었다.

실시예 4: CTGF의 N-말단 도메인에 특이적인 항-CTGF 항체에 의한, 콜라겐 합성의 선택적 차단

도메인 특이적인 항-CTGF 항체를 정제된 N-말단 또는 C-말단 CTGF 도메인을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 제조하였다. 무손상 CTGF을 키모트립신으로 제한 절단시켜 이들 도메인을 제조하였다. 도메인들은 친화성 크로마토그래피법으로 헤파린 세파로스 상에서 서로 분리시켰다. CTGF의 N-말단 도메인은 헤파린과 결합하지 않는 반면, CTGF의 C-말단은 헤파린 결합 활성을 포함하고 있어서 헤파린 세파로스 상에 남아있게 된다. 웨스턴 블럿팅 분석에 근거할 때 이들 도메인은 순수하며 무손상 CTGF에 의한 오염율이 0.1 % 미만이었다. 그 후, 개별 도메인들을 약 0.5 mg/ml의 겔 농도로 Affigel 10에 커플링시켰다. 항-CTGF IgG (염소) 전체를 친화성 수지에 흡착시키고, 특이적으로 결합된 항체를 용출시켰다. 그 다음에, 상기 항체들을 웨스턴 블럿팅으로 시험하여 반응의 특이성을 측정하였다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 전체 집합으로부터 CTGF의 N-말단 도메인에만 또는 C-말단 도메인에만 반응성인 IgG들을 단리하였다. 그 후에 CTGF를 사용한 중화 분석법으로 항체들을 시험하였다. 이러한 연구 결과, CTGF의 N-말단 도메인에 대한 항체들은 도 6에 나타낸 바와 같이 콜라겐 합성을 선택적으로 억제하지만, DNA 합성에는 그렇지 않음이 밝혀졌다. 반대로 CTGF의 C 도메인에 대한 항체는 DNA 합성을 선택적으로 억제하지만, 콜라겐 합성에는 그렇지 않았다. 이 데이타는 CTGF 분자의 상이한 영역들이 상이한 생물학적 활성을 신호전달하는 데 관여할 수 있음을 의미한다. 이러한 결과를 확인하고 확장하기 위해서 무손상 CTGF 및 TGF-β를 사용한 단리된 도메인들의 생물학적 활성을 하기에 설명한 바와 같이 비교하였다.

실시예 5: CTGF N-말단 도메인에 의한 세포외 매트릭스 생성의 촉진

당업계에 공지된 기술을 사용하여 CTGF N-말단 및 C-말단 도메인을 제조하였 다. 먼저, 상기한 바와 같이, 순수한 N-말단 및 C-말단 도메인을 생물학적으로 활성인 무손상 CTGF를 키모트립신에 의한 단백질 가수분해 절단시켜 제조하였으며, 이는 더 작은 단편이 없는, 거의 오로지 무손상 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인만을 생성하였기 때문이다. 순수한 C-말단 및 N-말단 도메인을 생성하기 위한 두번째 방법에서는, CTGF 오픈 리딩 중 오직 C-말단 도메인 또는 오직 N-말단 도메인만을 코딩하는 제한된 영역만을 발현시키는 것을 포함하였다. 이것은 오픈 리딩 프레임의 부분들을 PCR 증폭시키고, 시스테인이 없는 영역에 정지 코돈을 도입하여 오직 N-말단 도메인만을 생성하게 하거나 또는 오직 C-말단 도메인만을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 부분 (시스테인 없는 영역의 서열 AYRLED에서 시작)을 바큘로바이러스 셔틀 벡터, GP67에 클로닝시켜 수행되었다. 이것은 원하는 재조합 단백질 (또는 단편)의 합성이 소포체에서 일어나도록 하여 확실히 분비되도록 하는, GP67 바이러스 유전자로부터의 신호 펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 생성시켰다. 정제 후에, 여러 가지 방법으로 생성된 도메인을 단리하여 NRK 섬유아세포를 사용하는 생물 분석법으로 비교하였다. 이러한 연구 결과는 도메인 특이적인 항-CTGF 항체를 사용했던 앞서의 관찰을 확인하는 것이었다. 무손상 CTGF의 단백질 분해 소화에 의해 또는 직접적인 재조합 발현에 의해 생성된 N-말단 도메인은 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이 콜라겐 합성 및 근섬유아세포 유도의 유발인자로서 완전한 활성을 나타내었다. 반대로, 각 방법에 의해 생성된 C-말단 도메인은 DNA 합성 분석에서 완전한 활성을 나타내었다. 이런 데이타는 CTGF의 개별 도메인들이 완전한 생물학적 활성을 보유하며 서로 독립적으로 작용하여 표적 세포에 특이적인 생 물학적 효과를 촉진시킬 수 있음을 증명하는 것이다. 최적 농도에서, 개별 도메인들은 무손상 CTGF 또는 TGF-β에 필적하는 생물학적 반응을 유도했다. 이것은 TGF-β의 유사분열 촉진 (DNA 합성) 활성 및 매트릭스 생성 (콜라겐 합성과 같은 세포외 매트릭스의 합성) 활성이 CTGF 및 이의 각각의 도메인을 통해 매개되는 것임을 강하게 시사하는 것이었다.

다른 성장 인자들을 본 발명의 CTGF 단편들과 함께 사용하여 세포외 매트릭스 생성에서 CTGF의 유도 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, CTGF의 콜라겐 및 근섬유아세포 표현형 유도 활성에 대한 펩티드 성장 인자인 IGF-2의 영향에 대해 평가하였다. CTGF 존재하에서 IGF-2는 2 ng/ml 이상의 농도에서 도 9에서 보여진 것과 같이 콜라겐 합성 및 근섬유아세포의 표현형을 크게 증가시켰다.

당업자라면 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않고도 본 발명의 시스템 및 기재된 방법들의 여러 가지 변형법 및 변화가 명백할 것이다. 본 발명은 비록 특별히 바람직한 실시양태와의 관계로 기술되었지만, 본 발명은 청구된 바처럼 그러한 특별한 실시양태에 부당하게 한정되어서는 안됨이 이해되어야 한다. 사실, 분자 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게는 명백한, 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방법의 각종 변형법들은 다음의 청구의 범위내에 포함되는 것이다. 본원에서 인용된 모든 문헌은 그 전체가 본원에 포함되는 것으로 한다.

삭제

<110> Grotendorst, Gary R. <120> CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR FRAGMENTS AND METHODS AND USES THEREOF <130> FIBRO1140KR <140> PCT/US99/29652 <141> 1999-12-14 <150> 60/112,240 <151> 1998-12-14 <150> 60/112,241 <151> 1998-12-14 <160> 4 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 2075 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (130)...(1176) <400> 1 cccggccgac agccccgaga cgacagcccg gcgcgtcccg gtccccacct ccgaccaccg 60 ccagcgctcc aggccccgcg ctccccgctc gccgccaccg cgccctccgc tccgcccgca 120 gtgccaacc atg acc gcc gcc agt atg ggc ccc gtc cgc gtc gcc ttc gtg 171 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val 1 5 10 gtc ctc ctc gcc ctc tgc agc cgg ccg gcc gtc ggc cag aac tgc agc 219 Val Leu Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser 15 20 25 30 ggg ccg tgc cgg tgc ccg gac gag ccg gcg ccg cgc tgc ccg gcg ggc 267 Gly Pro Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly 35 40 45 gtg agc ctc gtg ctg gac ggc tgc ggc tgc tgc cgc gtc tgc gcc aag 315 Val Ser Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys 50 55 60 cag ctg ggc gag ctg tgc acc gag cgc gac ccc tgc gac ccg cac aag 363 Gln Leu Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys 65 70 75 ggc ctc ttc tgt gac ttc ggc tcc ccg gcc aac cgc aag atc ggc gtg 411 Gly Leu Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val 80 85 90 tgc acc gcc aaa gat ggt gct ccc tgc atc ttc ggt ggt acg gtg tac 459 Cys Thr Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr 95 100 105 110 cgc agc gga gag tcc ttc cag agc agc tgc aag tac cag tgc acg tgc 507 Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys 115 120 125 ctg gac ggg gcg gtg ggc tgc atg ccc ctg tgc agc atg gac gtt cgt 555 Leu Asp Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg 130 135 140 ctg ccc agc cct gac tgc ccc ttc ccg agg agg gtc aag ctg ccc ggg 603 Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly 145 150 155 aaa tgc tgc gag gag tgg gtg tgt gac gag ccc aag gac caa acc gtg 651 Lys Cys Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val 160 165 170 gtt ggg cct gcc ctc gcg gct tac cga ctg gaa gac acg ttt ggc cca 699 Val Gly Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro 175 180 185 190 gac cca act atg att aga gcc aac tgc ctg gtc cag acc aca gag tgg 747 Asp Pro Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp 195 200 205 agc gcc tgt tcc aag acc tgt ggg atg ggc atc tcc acc cgg gtt acc 795 Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr 210 215 220 aat gac aac gcc tcc tgc agg cta gag aag cag agc cgc ctg tgc atg 843 Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met 225 230 235 gtc agg cct tgc gaa gct gac ctg gaa gag aac att aag aag ggc aaa 891 Val Arg Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys 240 245 250 aag tgc atc cgt act ccc aaa atc tcc aag cct atc aag ttt gag ctt 939 Lys Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu 255 260 265 270 tct ggc tgc acc agc atg aag aca tac cga gct aaa ttc tgt gga gta 987 Ser Gly Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val 275 280 285 tgt acc gac ggc cga tgc tgc acc ccc cac aga acc acc acc ctg ccg 1035 Cys Thr Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro 290 295 300 gtg gag ttc aag tgc cct gac ggc gag gtc atg aag aag aac atg atg 1083 Val Glu Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met 305 310 315 ttc atc aag acc tgt gcc tgc cat tac aac tgt ccc gga gac aat gac 1131 Phe Ile Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp 320 325 330 atc ttt gaa tcg ctg tac tac agg aag atg tac gga gac atg gca 1176 Ile Phe Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 335 340 345 tgaagccaga gagtgagaga cattaactca ttagactgga acttgaactg attcacatct 1236 catttttccg taaaaatgat ttcagtagca caagttattt aaatctgttt ttctaactgg 1296 gggaaaagat tcccacccaa ttcaaaacat tgtgccatgt caaacaaata gtctatcttc 1356 cccagacact ggtttgaaga atgttaagac ttgacagtgg aactacatta gtacacagca 1416 ccagaatgta tattaaggtg tggctttagg agcagtggga gggtaccggc ccggttagta 1476 tcatcagatc gactcttata cgagtaatat gcctgctatt tgaagtgtaa ttgagaagga 1536 aaattttagc gtgctcactg acctgcctgt agccccagtg acagctagga tgtgcattct 1596 ccagccatca agagactgag tcaagttgtt ccttaagtca gaacagcaga ctcagctctg 1656 acattctgat tcgaatgaca ctgttcagga atcggaatcc tgtcgattag actggacagc 1716 ttgtggcaag tgaatttgcc tgtaacaagc cagatttttt aaaatttata ttgtaaatat 1776 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tatatatata tatatatgta cagttatcta agttaattta 1836 aagttgtttg tgccttttta tttttgtttt taatgctttg atatttcaat gttagcctca 1896 atttctgaac accataggta gaatgtaaag cttgtctgat cgttgaaagc atgaaatgga 1956 tacttatatg gaaattctgc tcagatagaa tgacagtccg tcaaaacaga ttgtttgcaa 2016 aggggaggca tcagtgtctt ggcaggctga tttctaggta ggaaatgtgg tagctcacg 2075 <210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser 100 105 110 Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp 115 120 125 Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro 130 135 140 Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys 145 150 155 160 Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly 165 170 175 Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro 180 185 190 Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala 195 200 205 Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp 210 215 220 Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg 225 230 235 240 Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys 245 250 255 Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly 260 265 270 Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr 275 280 285 Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu 290 295 300 Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile 305 310 315 320 Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe 325 330 335 Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 340 345 <210> 3 <211> 669 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (130)...(669) <223> CTGF N-terminal sequence <400> 3 cccggccgac agccccgaga cgacagcccg gcgcgtcccg gtccccacct ccgaccaccg 60 ccagcgctcc aggccccgcg ctccccgctc gccgccaccg cgccctccgc tccgcccgca 120 gtgccaacc atg acc gcc gcc agt atg ggc ccc gtc cgc gtc gcc ttc gtg 171 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val 1 5 10 gtc ctc ctc gcc ctc tgc agc cgg ccg gcc gtc ggc cag aac tgc agc 219 Val Leu Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser 15 20 25 30 ggg ccg tgc cgg tgc ccg gac gag ccg gcg ccg cgc tgc ccg gcg ggc 267 Gly Pro Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly 35 40 45 gtg agc ctc gtg ctg gac ggc tgc ggc tgc tgc cgc gtc tgc gcc aag 315 Val Ser Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys 50 55 60 cag ctg ggc gag ctg tgc acc gag cgc gac ccc tgc gac ccg cac aag 363 Gln Leu Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys 65 70 75 ggc ctc ttc tgt gac ttc ggc tcc ccg gcc aac cgc aag atc ggc gtg 411 Gly Leu Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val 80 85 90 tgc acc gcc aaa gat ggt gct ccc tgc atc ttc ggt ggt acg gtg tac 459 Cys Thr Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr 95 100 105 110 cgc agc gga gag tcc ttc cag agc agc tgc aag tac cag tgc acg tgc 507 Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys 115 120 125 ctg gac ggg gcg gtg ggc tgc atg ccc ctg tgc agc atg gac gtt cgt 555 Leu Asp Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg 130 135 140 ctg ccc agc cct gac tgc ccc ttc ccg agg agg gtc aag ctg ccc ggg 603 Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly 145 150 155 aaa tgc tgc gag gag tgg gtg tgt gac gag ccc aag gac caa acc gtg 651 Lys Cys Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val 160 165 170 gtt ggg cct gcc ctc gcg 669 Val Gly Pro Ala Leu Ala 175 180 <210> 4 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser 100 105 110 Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp 115 120 125 Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro 130 135 140 Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys 145 150 155 160 Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly 165 170 175 Pro Ala Leu Ala 180

Claims (17)

1. (a) 서열 4에 기재된 잔기 24 내지 잔기 95;

   (b) 서열 4에 기재된 잔기 96 내지 잔기 180; 또는

   (c) 서열 4에 기재된 잔기 24 내지 잔기 180

   의 아미노산 서열을 가지며 세포외 매트릭스 합성, 콜라겐 합성 및(또는) 근섬유아세포 분화 유도능이 있는 결합 조직 성장인자(CTGF) 폴리펩티드 단편.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제1항의 CTGF 단편에 특이적으로 결합하는 항체.
7. 제1항의 CTGF 단편을 코딩하는 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 분자.
8. 제6항의 항체인, CTGF 관련 질병 또는 장애의 치료용 제약 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 섬유증식성 질병/장애인 제약 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 신장 섬유증, 경피증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 관절염, 비후성 반흔 형성, 죽상동맥경화증, 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 고혈압, 신장 장애, 혈관형성 관련 장애, 피부 섬유증 장애 및 심혈관계 장애로 이루어진 군에서 선택된 것인 제약 조성물.
11. 제7항의 안티센스 분자인, CTGF 관련 질병 또는 장애의 치료용 제약 조성물.
12. 근섬유아세포를 시험 작용제 및 N-말단 CTGF 단편과 이들 성분들이 상호작용할 수 있는 조건 하에서 접촉시키고,

    시험 작용제의 존재하 세포의 분화능을 시험 작용제의 부재하 세포의 분화능과 비교하는 것을 포함하며,

    이때 세포의 분화능의 차이는 CTGF 단편의 분화 활성을 조정하는 작용제 또는 화합물임을 지시하는 것인, CTGF N-말단 단편의 활성을 조정하는 작용제 또는 화합물을 확인하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 조정이 활성의 억제인 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 조정이 활성의 촉진인 방법.
15. 세포를 시험 작용제 및 N-말단 CTGF 단편과 이들 성분들이 상호작용할 수 있는 조건 하에서 접촉시키고,

    시험 작용제의 존재하 작용제 또는 화합물의 세포외 매트릭스 생성 조정능을 시험 작용제의 부재하 작용제 또는 화합물의 세포외 매트릭스 생성 조정능과 비교하는 것을 포함하며,

    이때 세포외 매트릭스 생성의 차이는 CTGF 단편의 활성을 조정하는 작용제 또는 화합물임을 지시하는 것인, CTGF N-말단 단편의 활성을 조정하는 작용제 또는 화합물을 확인하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 조정이 활성의 억제인 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 조정이 활성의 촉진인 방법.

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