ES2304811T3 - Fragmentos del factor de crecimiento de tejido conjuntivo. - Google Patents

Abstract

Un fragmento de CTGF que está constituido por la secuencia de aminoácidos del resto 4 al resto 172 de la figura 3. Se refiere generalmente al campo de los factores de crecimiento y específicamente a fragmentos del factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) y a procedimientos de uso de los mismos.

Description

Fragmentos del factor de crecimiento de tejido conjuntivo.

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente al campo de los factores de crecimiento y específicamente a fragmentos del factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) y a procedimientos de uso de los mismos.

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Antecedentes de la invención

Factores de crecimiento. Los factores de crecimiento pueden definirse en líneas generales como polipéptidos de señalización intracelular multifuncional de acción local que controlan tanto la ontogenia como el mantenimiento de la forma y función de tejidos. Los productos de proteína de muchos protooncógenos se han identificado como factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento.

Los factores de crecimiento generalmente estimulan células diana para que proliferen, se diferencien y se organicen en tejidos en desarrollo. La acción de los factores de crecimiento depende de su unión a receptores específicos que estimulan un acontecimiento de señalización dentro de la célula. Ejemplos de factores de crecimiento incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-\alpha), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF). Se ha informado de que cada uno de estos factores de crecimiento estimula células para que proliferen.

Factor de crecimiento de tejido conjuntivo. CTGF es un péptido monomérico rico en cisteína con un peso molecular de aproximadamente 38 kd. Como se informa previamente, CTGF tiene actividad tanto mitogénica como quimiotáctica para las células del tejido conjuntivo. CTGF es secretado por células y se cree que es activo con la interacción con un receptor de células específicas.

CTGF es un miembro de una familia de reguladores del crecimiento que incluyen, por ejemplo, CTGF de ratón (fisp-12) y humano, Cyr61 (ratón), Cef10 (pollo) y Nov (pollo). Basándose en comparaciones de secuencias se ha sugerido que los miembros de esta familia tienen una estructura modular que normalmente está constituida por al menos uno de los siguientes: (1) un dominio del factor de crecimiento similar a la insulina responsable de la unión; (2) un dominio del factor de von Willebrand responsable de la formación de complejos; (3) una repetición tipo I de trombospondina, posiblemente responsable de la unión a moléculas de matriz; y (4) un módulo del extremo C encontrado en proteínas de matriz, que se da por supuesto que es el responsable de la unión a receptores.

La secuencia del ADNc para el CTGF humano contiene un marco de lectura abierto de 1047 nucleótidos, con un sitio de iniciación en aproximadamente el nucleótido 130 y un sitio de terminación de TGA en aproximadamente el nucleótido 1177, y codifica un péptido de 349 aminoácidos. La secuencia de ADNc para CTGF humano se ha descrito previamente en la patente de EE.UU. n° 5.408.040.

El marco de lectura abierto de CTGF codifica un polipéptido que contiene 39 restos de cisteína, lo que indica una proteína con múltiples enlaces disulfuro intramoleculares. El extremo amino del péptido contiene una secuencia de señal hidrófoba indicativa de una proteína secretada y hay dos sitios de glicosilación ligados a N en los restos de asparagina 28 y 225 en la secuencia de aminoácidos.

Se cree que la síntesis y secreción de CTGF están selectivamente inducidos por TGF-\beta y BMP-2, además de potencialmente por otros miembros de la superfamilia TGF-\beta de proteínas. Como se informa en la técnica, aunque TGF-\beta puede estimular el crecimiento de fibroblastos normales en agar blando, CTGF solo no puede inducir esta propiedad en fibroblastos. Sin embargo, se ha mostrado que la síntesis y acción de CTGF son esenciales para que TGF-\beta estimule el anclaje independiente del crecimiento de fibroblastos. (Véase, por ejemplo, Kothapalli y col., 1997, Cell Growth & Differentation 8(1):61-68 y Boes y col., 1999, Endocrinology 140(4):1575-1580).

Con respecto a la actividad biológica, se ha informado de que CTGF es de naturaleza fundamentalmente mitogénica (puede estimular células diana para que proliferen). También se ha informado de que CTGF tiene actividad quimiotáctica. Patológicamente, se ha informado de que la molécula de CTGF de longitud completa participa en afecciones en las que hay un crecimiento excesivo de células del tejido conjuntivo y deposición excesiva de la matriz extracelular. CTGF también se ha descrito en la técnica estando asociado a afecciones relacionadas con la migración y proliferación de células endoteliales vasculares y neovascularización. Las enfermedades y trastornos relacionados con estas afecciones, incluyen, por ejemplo, fibrosis de la piel y órganos importantes, cáncer y enfermedades relacionadas y trastornos tales como esclerosis sistémica, angiogénesis, aterosclerosis, nefropatía diabética e hipertensión renal. (Véase, por ejemplo, Toshifumi y col., 1999, Journal of Cellular Physiology 18191):153-159; Shimo y col., 1999, Journal of Biochemistry 126(1):137-145; Murphy y col., 1999, Journal of Biological Chemistry 274(9):5830-5834; Wenger y col., 1999, Oncogene 18(4):1073-1080; Frzier y col., 1997, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29(1):153-161; Oemar y col., 1997, Circulation 95(4):831-839).

También se ha informado de que CTGF es útil en la cicatrización y reparación de tejido conjuntivo, hueso y cartílago. En este aspecto, CTGF se ha descrito como un inductor de la formación de hueso, tejido o cartílago en trastornos tales como osteoporosis, osteoartritis u osteocondritis, artritis, trastornos esqueléticos, cicatrices hipertróficas, quemaduras, hipertrofia vascular o curación por sonidos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5837258; Ohnishi y col., 1998, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 30(11):2411-2422; Nakanishi y col., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 234(1):206-210; Pawar y col., 1995, Journal of Cellular Physiology 165(3):556-565.

En resumen, CTGF participa en numerosas afecciones fibróticas y cancerosas y se ha descrito que contribuye a la cicatrización. Como resultado, existe necesidad en la técnica de identificar procedimientos útiles para modular la actividad de CTGF para tratar estas diversas enfermedades y afecciones. Antes de la presente invención no había notificación de que las regiones o dominios de CTGF fueran responsables de señalizar diferentes actividades biológicas. Además, antes de la presente invención no había descripción para tratar enfermedades y trastornos asociados con proliferación celular y/o la producción en exceso de la matriz extracelular mediante la inhibición de la actividad biológica de una región o dominio específicos de CTGF.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La memoria descriptiva describe composiciones y procedimientos novedosos para el tratamiento de enfermedades, trastornos o dolencias asociados a CTGF en los que participa la inducción de la proliferación celular, por ejemplo, proliferación de fibroblastos. Más específicamente, las composiciones descritas comprenden fragmentos de CTGF que comprenden la región del extremo C de CTGF.

En un aspecto se proporciona un fragmento de polipéptido del factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) que tiene actividad mitogénica. Un fragmento descrito en este documento incluye CTGF que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por al menos el exón 4 como se expone en la figura 2. Un fragmento también puede incluir una secuencia de aminoácidos codificada por al menos el exón 5 como se expone en la figura 2. Además, un fragmento de CTGF de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos codificada por al menos los exones 4 y 5 como se expone en la figura 2. La invención también proporciona secuencias de polinucleótidos que codifican tales fragmentos.

En un aspecto más particular, el fragmento de CTGF de la presente invención comprende al menos una parte de los exones 4 ó 5 de CTGF, y además posee actividad mitogénica. En otro aspecto, el fragmento de la presente invención comprende entre un cuarto y un medio de la longitud del polipéptido de CTGF completo.

La memoria descriptiva comprende además procedimientos para usar los fragmentos de CTGF de la presente invención para identificar composiciones que pueden modular la actividad mitogénica de dichos fragmentos de CTGF. Más específicamente, los fragmentos de CTGF pueden usarse para identificar composiciones que pueden afectar la actividad de los fragmentos de CTGF, por ejemplo, inhibiendo, suprimiendo o aumentando la actividad mitogénica de los fragmentos de CTGF.

Las composiciones comprenden además moduladores de CTGF, por ejemplo, anticuerpos, moléculas antisentido, moléculas pequeñas y otros compuestos identificados por los procedimientos anteriores que pueden modular la actividad de los fragmentos de CTGF de la presente invención. En un aspecto, la memoria descriptiva proporciona moduladores de CTGF que inhiben o suprimen la actividad mitogénica de CTGF. En otro aspecto, los moduladores de CTGF aumentan la actividad mitogénica de CTGF, por ejemplo, en indicaciones en las que se desea la inducción de la actividad CTGF, por ejemplo, en cicatrización, reparación de tejidos y reparación ósea.

En otro aspecto, los procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz de los moduladores de fragmentos de CTGF, solos o en combinación con uno o más compuestos, a un paciente en necesidad o en riesgo de necesitar tratar enfermedades, trastornos o dolencias en los que se desea la manipulación de la actividad mitogénica. Más particularmente, los procedimientos se refieren a utilizar los compuestos que pueden modular la actividad de los fragmentos de CTGF de esta invención para controlar la actividad mitogénica, y por consiguiente, tratar trastornos relacionados con la abundancia en exceso de proliferación celular, incluyendo trastornos fibróticos y cancerosos.

La memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas que comprenden los fragmentos de CTGF de la presente invención. Tales composiciones pueden ser útiles en cicatrización, reparación ósea y de tejidos, en las que se desea el aumento de actividad de CTGF.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 muestra una gráfica que indica que los fragmentos de CTGF de la presente invención estimulan la mitogénesis en células de NRK;

la fig. 2A y fig. 2B exponen la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID N°:1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID N°:2) de la molécula de CTGF de longitud completa, en las que se identifica la localización de los exones de la molécula de CTGF;

la fig. 3 expone la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID N°:3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID N°:4) del dominio del extremo C de CTGF que comprende el exón 4 y el exón 5 de la molécula de CTGF;

la fig. 4 expone los datos relacionados con la inhibición de la síntesis de ADN en fibroblastos de NRK con anticuerpos anti-CTGF;

la fig. 5 expone los datos relacionados con la estimulación de la síntesis de ADN en fibroblastos de NRK con el dominio del extremo C de CTGF;

la fig. 6 expone los datos relacionados con los efectos de EGF sobre la actividad mitogénica de CTGF;

la fig. 7 muestra la inhibición selectiva de la síntesis de ADN por IgG anti-extremo C de CTGF.

Descripción detallada de la invención

Se entiende que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos, etc., concretos descritos en este documento, ya que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento se usa con el fin de describir solamente las realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Debe observarse que, como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" "una" y "el/la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y equivalentes del mismo para aquellos expertos en la materia, etc.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Se describen procedimientos, dispositivos y materiales preferidos, aunque en la práctica o pruebas de la presente invención puede usarse cualquier procedimiento y material similar o equivalente a aquellos descritos en este documento.

Definiciones

Como se usa en este documento, el término "fragmento de CTGF" se refiere a un fragmento que comprende al menos una parte de la región del extremo C de CTGF. En una realización, el fragmento comprende al menos una parte de los exones 4 ó 5 de la proteína de CTGF de longitud completa, y además posee actividad mitogénica. En otra realización, el fragmento está entre aproximadamente un cuarto y un medio de la longitud de la proteína de CTGF de longitud completa. "Actividad mitogénica" debe significar la capacidad para estimular o inducir proliferación celular, tal como proliferación de fibroblastos. Los fragmentos de CTGF pueden obtenerse o mediante aislamiento de fuentes naturales, producción de productos sintéticos, técnicas de ingeniería genética recombinante u otras técnicas disponibles en la técnica.

Como se usa en este documento, el término "extremo C" se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos parte de los dominios del exón 5, y más preferentemente, al menos parte de los dominios del exón 4 o exón 5, de la molécula de CTGF de longitud completa, y a los polipéptidos codificados por éstos; como se identifica en las figuras 2A y 2B. El término "exón 4" se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos del dominio del extremo C de la molécula de CTGF de longitud completa. El término "exón 5" se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos del dominio del extremo C de la molécula de CTGF de longitud completa, y de la secuencia de aminoácidos codificada.

Como se usa en este documento, el término "extremo N" se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos que comprende los dominios del exón 2 y exón 3 de la molécula de CTGF de longitud completa, y a la secuencia de aminoácidos correspondiente, como se identifica en las figuras 2A y 2B.

Los términos "trastornos" y "enfermedades", como se usan en este documento, se refieren a afecciones asociadas con la expresión o actividad de CTGF ("enfermedades o trastornos asociados a CTGF"). Enfermedades, trastornos y afecciones asociados con CTGF incluyen, pero no se limitan a, cicatrización excesiva resultante de traumatismos agudos o repetitivos, que incluye cirugía o radioterapia, fibrosis de órganos tales como el riñón, pulmones, hígado, ojos, corazón y la piel, incluyendo escleroderma, queloides y cicatrización hipertrófica. La expresión anómala de CTGF se ha asociado con la cicatrización de tejido general, crecimientos en la piel similares a tumores y cicatrización sostenida de vasos sanguíneos, que conduce a una alteración en la capacidad para transportar sangre, hipertensión, hipertrofia, etc. También están asociadas con CTGF diversas enfermedades producidas por proliferación o migración de células endoteliales vasculares, tales como cáncer, que incluye dermatofibromas, afecciones relacionadas con la expresión anómala de células endoteliales, desmoplasia de carcinoma de mama, angiolipoma y angioleiomioma. Otras afecciones relacionadas incluyen aterosclerosis y esclerosis sistémica, que incluye placas ateroscleróticas, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Chrohn, angiogénesis y otros procesos proliferativos que desempeñan funciones centrales en aterosclerosis, artritis, cáncer y otros estados de enfermedad, neovascularización implicada en glaucoma, inflamación debida a enfermedad o lesión, que incluye inflamación de las articulaciones, metástasis del crecimiento tumoral, enfermedad intersticial, enfermedades dermatológicas, artritis, que incluye artritis reumatoide crónica, arteriosclerosis, diabetes, que incluye nefropatía diabética, hipertensión y otros trastornos renales, y fibrosis resultante de quimioterapia, tratamiento con radiación, diálisis y aloinjerto y rechazo de trasplante.

Trastornos "fibroproliferativos" como se hace referencia en este documento incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las enfermedades o trastornos enumerados anteriormente, por ejemplo, fibrosis renal, escleroderma, fibrosis pulmonar, artritis, cicatrización hipertrófica y aterosclerosis. Los trastornos fibroproliferativos asociados a CTGF también incluyen nefropatía diabética y retinopatía, hipertensión y otros trastornos renales, trastornos relacionados con la angiogénesis, que incluyen, pero no se limitan a, vasos sanguíneos asociados con la formación de tumores y otros procesos proliferativos que desempeñan funciones centrales en aterosclerosis, artritis y otros estados de enfermedad, y, por ejemplo, en fibrosis de la piel, cardiaca y pulmonar y renal. En general, las fibrosis graves que implican al riñón, hígado, pulmón y el sistema cardiovascular están incluidas en este documento. Hay numerosos ejemplos de fibrosis, que incluyen la formación de tejido cicatricial tras infarto de miocardio, que altera la capacidad del corazón para bombear. La diabetes frecuentemente produce lesión/cicatrización en los riñones que conduce a una pérdida progresiva de la función renal. Incluso después de cirugía, el tejido cicatricial puede formarse entre órganos internos, produciendo contractura, dolor y, en algunos casos, infertilidad. Los órganos importantes tales como el corazón, riñón, hígado, pulmón, ojo y piel son propensos a cicatrización crónica, comúnmente asociada con otras enfermedades. Las cicatrices hipertróficas (masa de tejido no maligno) son una forma común de fibrosis producida por quemaduras y otro traumatismo. Además, hay varios otros trastornos fibroproliferativos tales como escleroderma, queloides y aterosclerosis que están asociados respectivamente con la cicatrización de tejido general, crecimientos en la piel similares a tumores o una cicatrización sostenida de vasos sanguíneos que altera la capacidad para transportar sangre. Como CTGF se sobreexpresa en trastornos fibróticos, representa una diana muy específica para el desarrollo de fármacos terapéuticos anti-fibróticos. CTGF puede inhibirse mediante el uso de moléculas pequeñas y neutralizar anticuerpos, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos fibroproliferativos. Se entiende que "fibroproliferativo" se refiere a cualquiera de los casos patológicos anteriores y no debería limitarse a proliferación celular.

"Matrices extracelulares (ECM)" son estructuras multicomponente sintetizadas por y que rodean diversos tipos de células que incluyen, por ejemplo, células endoteliales, epiteliales, epidérmicas y musculares. La ECM está formada en gran parte por colágeno y proteoglicanos de heparán-sulfato. La ECM también contiene fibronectina h1, vitronectina, proteoglicanos de sulfato condroitina y proteínas más pequeñas. Los factores de crecimiento se recluyen en estas matrices mediante asociación con la porción de glicosaminoglicano de los proteoglicanos de heparán-sulfato. Regiones "similares a heparina" de alto contenido de ácido idurónico y alta sulfatación se han asociado con la región de unión FGFb de heparán-sulfato de fibroblastos humanos (Turnbull y col., J. Biol. Chem. 267(15) 10337-10341, 1992). Sin embargo, la composición de heparán-sulfato en la matriz extracelular no se ha caracterizado completamente.

Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácidos nucleicos", como se usan en este documento, se refieren a un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido o a un fragmento de cualquiera de estos, a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una hebra sentido o antisentido, a ácido nucleico de péptidos (PNA), o a cualquier material similar a ADN o similar a ARN, de origen natural o sintético.

"Aminoácido" o "secuencia de aminoácidos", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de oligopéptidos, péptidos, polipéptidos o proteínas, o a un fragmento, porción o subunidad de cualquiera de éstas, y a moléculas de procedencia natural o sintética.

"Hibridación" se refiere al procedimiento por el que una hebra de ácido nucleico se une a una hebra complementaria mediante apareamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas, de manera que una secuencia particular de interés puede identificarse incluso en muestras en las que está presente a bajas concentraciones. Condiciones adecuadamente rigurosas pueden definirse, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las disoluciones de prehibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son muy conocidas en la técnica. En particular, la rigurosidad puede aumentarse reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formamida o subiendo la temperatura de hibridación.

Por ejemplo, la hibridación en condiciones de rigurosidad alta podría producirse en aproximadamente el 50% de formamida a aproximadamente de 37°C a 42°C. La hibridación podría producirse en condiciones de rigurosidad reducida en aproximadamente del 35% al 25% de formamida a aproximadamente de 30°C a 35°C. En particular, la hibridación podría producirse bajo condiciones de rigurosidad alta a 42°C en 50% de formamida, 5X SSPE, 0,3% de SDS y 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado. La hibridación podría producirse bajo condiciones de rigurosidad reducida como se describe anteriormente, pero en 35% de formamida a una temperatura reducida de 35°C. El intervalo de temperatura correspondiente a un nivel particular de rigurosidad puede estrecharse más calculando la relación de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura en consecuencia. Las variaciones en los intervalos y condiciones anteriores son muy conocidas en la técnica.

El término "homología sustancial de aminoácidos" se refiere a moléculas que tienen una similitud de secuencias de aproximadamente el 75% o más, preferentemente el 85% o más, y más preferentemente el 90-95% respecto a una secuencia específica. Las frases "similitud en %" o "identidad en %" se refieren al porcentaje de similitud o identidad de secuencias encontrado en una comparación de dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. La similitud en porcentaje puede determinarse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica.

La similitud en porcentaje entre secuencias de aminoácidos puede calcularse, por ejemplo, usando el procedimiento de clústeres. (Véase, por ejemplo, Higgins, D. G. y P. M. Sharp, 1988, Gene 73:237-244). El algoritmo de clústeres agrupa secuencias en clústeres examinando las distancias entre todos los pares. Los clústeres se alinean por parejas y luego en grupos. La similitud en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos, por ejemplo, la secuencia A y la secuencia B, se calcula dividiendo la longitud de la secuencia A, menos el número de restos vacíos en la secuencia A, menos el número de restos vacíos en la secuencia B, entre la suma de apareamientos de restos entre la secuencia A y la secuencia B, por cien. Los vacíos de baja o ninguna homología entre las dos secuencias de aminoácidos no se incluyen en la determinación de la similitud en porcentaje. La similitud en porcentaje puede calcularse mediante otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, variando las condiciones de hibridación, y puede calcularse electrónicamente usando programas tales como el programa MEGALIGN. (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin).

El término "subunidad de colágeno" se refiere a la secuencia de aminoácidos de una cadena de polipéptidos de una proteína de colágeno codificada por un único gen, además de a cualquier derivado de esa secuencia, que incluye derivados de deleción, sustituciones conservativas, etc.

Una "proteína de fusión" es una proteína en la que las secuencias de péptidos de diferentes proteínas están unidas juntas covalentemente.

Una "secuencia antisentido" es cualquier secuencia que puede hibridarse específicamente con una secuencia diana. La secuencia antisentido puede ser ADN, ARN o cualquier imitación o análogo de ácido nucleico. El término "tecnología antisentido" se refiere a cualquier tecnología que se basa en la hibridación específica de una secuencia antisentido con una secuencia diana.

El término "equivalente funcional", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de proteína o de ácido nucleico que posee características funcionales o estructurales respecto al fragmento de CTGF. Un equivalente funcional de un fragmento de CTGF puede contener modificaciones que dependen de la necesidad de tales modificaciones para la realización de una función específica. El término "equivalente funcional" pretende incluir fragmentos, mutantes, híbridos, variantes, análogos o derivados químicos de una molécula.

Se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad de la molécula, absorción, semivida biológica y similares. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseado de la molécula y similares. Los restos que pueden mediar tales efectos se describen, por ejemplo, en Gennaro, A.R., ed., 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton PA. Los procedimientos para acoplar tales restos a una molécula son muy conocidos en la técnica.

Una "variante", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácidos. La variante puede tener cambios conservativos, en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, sustitución de leucina con isoleucina. Más raramente, una variante puede tener cambios no conservativos, por ejemplo, sustitución de una glicina con un triptófano. Variaciones menores análogas también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. La orientación para determinar que restos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse puede encontrarse usando programas informáticos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, WI).

Procedimientos para preparar fragmentos de CTGF

Secuencias de ácidos nucleicos que codifican CTGF. Según la invención, las secuencias de nucleótidos que codifican CTGF o equivalentes funcionales del mismo, como se describe en la patente de EE.UU. n° 5.408.040, pueden usarse para generar moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de la proteína de longitud completa o un equivalente funcional de las mismas, o alternativamente, secuencias de nucleótidos que codifican el fragmento de CTGF deseado, por ejemplo, un fragmento que comprende al menos una parte de los exones 4 ó 5 de CTGF, en células huésped apropiadas.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que se hibridan, bajo rigurosa posición, con porciones de la secuencia de CTGF también pueden usarse en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, análisis de transferencia de Southern y de Northern, etc. En otro procedimiento más, las moléculas de ADN que codifican CTGF pueden aislarse mediante procedimientos de hibridación que comprenden el cribado químico de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar rasgos estructurales compartidos.

Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de ADN que codifican proteínas de homología sustancial de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente pueden aislarse y usarse en la práctica de la invención para clonar y expresar CTGF o el fragmento de CTGF. Tales secuencias de ADN incluyen aquellas que pueden hibridarse con la secuencia de CTGF humano bajo rigurosas condiciones.

Las secuencias de ADN alteradas que pueden usarse según la invención incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes restos de nucleótidos, dando como resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico o un producto génico funcionalmente equivalente. El propio producto génico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos de aminoácidos dentro de la secuencia de CTGF, que dan como resultado un cambio imperceptible, produciéndose así una proteína funcionalmente equivalente. Tales sustituciones de aminoácidos pueden hacerse basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; aminoácidos con grupos cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina; glicina, analina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina.

Las secuencias de ADN de la invención pueden manipularse con el fin de alterar la secuencia de proteína para una variedad de extremos que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones usando técnicas que son muy conocidas en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio para, por ejemplo, insertar nuevos sitios de restricción. Por ejemplo, en ciertos sistemas de expresión tales como levadura, las células huésped pueden glicosilar en exceso el producto génico. Si se usan tales sistemas de expresión puede preferirse alterar CTGF o el fragmento de CTGF que codifica la secuencia para eliminar cualquier sitio de glicosilación ligado a N.

La secuencia de CTGF o del fragmento de CTGF puede ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado químico de bibliotecas de péptidos puede ser útil codificar una proteína de CTGF quimérica que exprese un epítopo heterólogo que es reconocido por un anticuerpo comercialmente disponible. Una proteína de fusión también puede manipularse para que contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia de CTGF o del fragmento de CTGF y la secuencia de la proteína heteróloga (por ejemplo una secuencia que codifica un factor de crecimiento relacionado con PDGF), de manera que CTGF o un fragmento de CTGF pueda escindirse del resto heterólogo. Tales procedimientos son conocidos en la técnica.

La secuencia codificante de CTGF o un fragmento de CTGF también puede sintetizarse en su totalidad o en parte usando procedimientos químicos muy conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Caruthers y col., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea y Horn, 1980, Nucleic Acids Res. 9(10):2331; Matteucci y Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; y Chow y Kempe, 1981, Nucleic Acids Res. 9(12):2807-2817) Alternativamente, la propia proteína podría producirse usando procedimientos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de CTGF en su totalidad o en parte. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse mediante técnicas en fase sólida, escindirse de la resina y purificarse purificarse mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución. Véase, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins, Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman y Co., N.Y. pág. 50-60. La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos. Por ejemplo, para el procedimiento de degradación de Edman véase, Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman y Co., N.Y., pág. 34-49.

Expresión de CTGF o un fragmento de CTGF. Con el fin de expresar un fragmento de CTGF biológicamente activo, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de longitud completa, o un equivalente funcional como se describe anteriormente, el fragmento de CTGF se inserta en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada.

Más específicamente, los procedimientos que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen la secuencia de CTGF o del fragmento de CTGF y señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación in vivo/recombinación genética. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel y col., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.

Puede utilizarse una variedad de sistemas huésped-vector de expresión para expresar la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o vectores de expresión de ADN de cósmido que contienen la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF; levadura, que incluye Pichia pastoris y Hansenula polymorpha, transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante de CTGF y del fragmento de CTGF; o sistemas de células de animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, adenovirus, virus de la variolovacuna, células de tumores humanos (incluyendo HT-1080)) que incluyen líneas celulares manipuladas para contener múltiples copias del ADN de CTGF o establemente amplificadas (CHO/dhfr) o inestablemente amplificadas en cromosomas de doble minuto (por ejemplo, líneas celulares murinas). Como se usa en este documento, se entiende que el término "sistemas huésped-vector de expresión", y más generalmente el término "células huésped", incluye cualquier progenie de la célula huésped o el sistema huésped-vector de expresión. También se entiende que, aunque toda la progenie no pueda ser idéntica a la célula parental, ya que pueden producirse mutaciones durante la replicación, tal progenie está incluida en el alcance de la invención.

Los elementos de expresión de estos sistemas varían en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, en el vector de expresión pueden usarse distintos elementos de transcripción y traducción adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, si se clonan en sistemas bacterianos pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares; si se clonan en sistemas de células de insecto pueden usarse promotores tales como el promotor de polihedrina de baculovirus; si se clonan en sistemas de células de plantas pueden usarse promotores derivados del genoma de células de plantas (por ejemplo, promotores de choque térmico; el promotor para la pequeña subunidad de RUBISCO; el promotor para la proteína de unión a clorofila a/b) o de virus de plantas (por ejemplo, el promotor de ARN 35S de CaMV; el promotor de proteína cubierta TMV); si se clonan en sistemas de células de mamífero pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5K del virus de la variolovacuna); si generan líneas celulares que contienen múltiples copias de los vectores basados en SV40, BPV y EBV de ADN de CTGF o del fragmento de CTGF pueden usarse con un marcador seleccionable apropiado.

En sistemas bacterianos, varios vectores de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso previsto para el CTGF o fragmento de CTGF expresado. Por ejemplo, un vector adecuado para la expresión en bacterias incluye el vector basado en T7 como se describe en Rosenberg y col., 1987, Gene 56:125. Como otro ejemplo, si van a producirse grandes cantidades de CTGF o fragmento de CTGF para el cribado químico de bibliotecas de péptidos, se desean vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther y col., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF puede ligarse al vector en el marco con la región codificante lac Z de manera que se produce un proteína híbrida AS-lac Z; vectores pIN (Inouye y Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509) y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños tales como CTGF o un fragmento de CTGF con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de trombina o de proteasa del factor Xa de manera que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse del resto de GST.

Más generalmente, cuando el huésped es un procariota, las células competentes que pueden captar ADN pueden prepararse a partir de células recogidas después del crecimiento exponencial y posteriormente tratadas por el procedimiento de CaCl_{2}, o alternativamente MgCl_{2} o RbCl, usando procedimientos muy conocidos en la técnica.

Si la célula huésped es una eucariota pueden usarse diversos procedimientos de transferencia de ADN. Estos incluyen la transfección de ADN mediante precipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales, incluyendo microinyección, inserción de un plásmido recubierto de liposomas, o uso de vectores de virus. Las células eucariotas también pueden cotransformarse con secuencias de ADN que codifican el polipéptido de la invención, y una segunda molécula de ADN extraña que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de timidina cinasa de herpes simplex. Otro procedimiento es usar un vector vírico eucariota, tal como virus de simio 40 (SV40) o virus del papiloma bovino, para infectar o transformar predominantemente células eucariotas y expresar proteína. Véase, Eukaryotic Viral Vectors, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, Ed.). Las células huésped eucariotas incluyen levadura, células de mamífero, células de insecto y células de plantas.

En la levadura pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revisión véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, 1988, Ausubel y col., Ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, cap. 13; Grant y col., 1987, Methods in Enzymology, Wu y Grossman, Eds., Acad. Press, N.Y., 153:516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, vol. II, IRL Press, Wash., D.C., cap. 3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger y Kimmel, Eds., Acad. Press, N.Y., 152:673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Strathern y col., Eds., Cold Spring Harbor Press, vol. I y II. Por ejemplo, se ha informado de diversos vectores lanzadera para la expresión de genes extraños en levadura. Heinemann y col., 1989, Nature 340:205; Rose y col., 1987, Gene 60:237.

En los casos en los que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF puede ser accionada por distintos promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores viricos tales como los promotores de ARN 35S y ARN 19S de CaMV (Brisson y col., 1984, Nature 310:511-514), o el promotor de proteína cubierta de TMV (Takamatsu y col., 1987, EMBO J. 6:307-311); alternativamente pueden usarse promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi y col., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie y col., 1984, Science 224:838-843); o promotores de choque térmico, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurley y col., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estos constructos pueden introducirse en células de plantas usando los plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de tales técnicas véase, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, sección VIII, pág. 421-463; Grierson y Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2ª Ed., Blackie, Londres, cap. 7-9.

En un sistema de insecto podría usarse un sistema de expresión alternativo para expresar CTGF o un fragmento de CTGF. En un sistema tal se usa baculovirus como vector para expresar genes extraños. Entonces, el virus crece en las células de insecto. La secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF puede clonarse en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor de baculovirus. Entonces, estos virus recombinantes se usan para infectar células de insecto en las que se expresa el gen insertado. Véase, por ejemplo, Smith y col., 1983, J. Virol. 46:584; Smith, patente de EE.UU. n° 4.215.051.

En células huésped de mamífero pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, al promotor tardío y la secuencia conductora de tres partes. Entonces, este gen quimérico puede insertarse en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y que puede expresar CTGF o un fragmento de CTGF en huéspedes infectados. Véase, por ejemplo, Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad Sci. (EE.UU.) 81:3655-3659. Alternativamente puede usarse el promotor de 7,5K de variolovacuna. Véase, por ejemplo, Mackett y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 79:7415-7419; Mackett y col., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci, 79:4927-4931.

En otra realización, la secuencia de CTGF o del fragmento de CTGF se expresa en células de tumor humano, tales como HT-1080, que se han transfectado establemente con precipitación de fosfato de calcio y un gen de resistencia a neomicina. En todavía otra realización se usa el vector de expresión pMSXND o similares para la expresión en una variedad de células de mamífero, que incluye células COS, BHK 293 y CHO. Lee y Nathans, 1988, J. Biol. Chem. 263:3521.

Las señales de iniciación específicas también pueden requerirse para la traducción eficaz de secuencias codificantes de CTGF o del fragmento de CTGF insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación de ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que todo el gen de CTGF, que incluye su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, se inserte en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta una porción de la secuencia codificante de CTGF, deben proporcionarse las señales de control exógenas de la traducción, que incluyen el codón de iniciación de ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF para garantizar la traducción del inserto completo. Estas señales de control exógenas de la traducción y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. Véase, por ejemplo, Bitter y col., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544. Pueden añadirse secuencias adicionales, es decir, secuencias conductoras, etc., para dirigir la secreción de fragmentos de CTGF a lo largo de diversas rutas secretoras. Esto puede llevarse a cabo en varios sistemas de expresión que usan diversos procedimientos conocidos en la técnica.

Además, puede elegirse una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamientos (por ejemplo, escisión) de productos de proteínas pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Con este fin pueden usarse células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, HT-1080, etc.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden manipularse líneas celulares que expresan establemente CTGF o fragmento de CTGF. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, las células huésped pueden transformarse con ADN de CTGF o de fragmento de CTGF controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN extraño, las células manipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido dentro de sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse dentro de líneas
celulares.

Pueden usarse varios sistemas de selección, que incluyen, pero no se limitan a, la timidina cinasa del virus del herpes simplex (Wigler y col., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad Sci. (EE.UU.) 48:2026), y pueden emplearse genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., 1980, Cell 22:817) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente.

Por tanto, la resistencia a antimetabolitos puede usarse como la base de selección de genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., 1980, Proc. Natl. Acad Sci. (EE.UU.) 77:3567; O'Hare y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin y col., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); y hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., 1984, Gene 30:147). Recientemente se han descrito genes seleccionables adicionales, concretamente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad Sci. (EE.UU.) 85:8047); y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold-Spring Harbor Laboratory).

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El aislamiento y la purificación de polipéptidos expresados en células huésped de la invención puede realziarse por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como aquellas que implican el uso de anticuerpo monoclonal o policlonal.

Identificación de transfectantes o transformantes que expresan CTGF o un fragmento CTGF. Las células huésped que contienen la secuencia codificante y que expresan el producto génico biológicamente activo pueden identificarse mediante al menos cuatro propuestas generales: (a) hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de funciones del gen "marcador"; (c) evaluando el nivel de transcripción como se mide mediante la expresión de transcritos de ARNm de CTGF o del fragmento de CTGF en la célula huésped; y (d) detección del producto génico como se mide mediante un ensayo o mediante su actividad biológica.

En la primera propuesta, la presencia de la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF insertada en el vector de expresión puede detectarse mediante hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN usando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF, respectivamente, o porciones o derivados de la misma.

En la segunda propuesta, el sistema de vector de expresión recombinante/huésped puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, en una realización preferida, la secuencia codificante de CTGF se inserta dentro de una secuencia del gen marcador con resistencia a neomicina del vector, y los recombinantes que contienen la secuencia codificante de CTGF pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede colocarse en tándem con la secuencia de CTGF bajo el control del mismo promotor o diferente usado para controlar la expresión de la secuencia codificante de CTGF. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificante de CTGF.

En la tercera propuesta, la actividad transcripcional para la región codificante de CTGF o del fragmento de CTGF puede evaluarse mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, el ARN puede aislarse y analizarse mediante transferencia de Northern usando una sonda homóloga a la secuencia codificante de CTGF o del fragmento de CTGF o porciones particulares de la misma. Alternativamente, los ácidos nucleicos totales de la célula huésped pueden extraerse y ensayarse para hibridación con tales sondas.

La cuarta propuesta implica la detección del producto génico de CTGF o del fragmento de CTGF biológicamente activo o inmunológicamente reactivo. Pueden usarse varios ensayos para detectar la actividad CTGF, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos ensayos descritos en la patente de EE.UU. n° 5.408.040.

Escisión de la proteína de CTGF de longitud completa para producir fragmento de CTGF. Tras la expresión de la proteína de CTGF de longitud completa, la proteína puede escindirse mediante cualquier número de enzimas proteolíticas conocidas para un experto en la materia para dar como resultado los fragmentos de CTGF de la presente invención. Por ejemplo, el puente sin cisteína entre las mitades del extremo N y el extremo C de CTGF son susceptibles a quimotripsina usando procedimientos disponibles en la técnica.

Procedimientos para modular e inhibir la actividad de fragmentos de CTGF

Como se describe anteriormente, los fragmentos de CTGF descritos en esta invención son un determinante crítico de proliferación celular, más particularmente proliferación de fibroblastos, y por consiguiente, deposición de la matriz extracelular. La presente invención proporciona procedimientos para la prevención y el tratamiento de enfermedades asociadas a CTGF mediante la regulación, modulación y/o inhibición de la actividad mitogénica de los fragmentos de CTGF de la presente invención. Más específicamente, los procedimientos de la presente invención proporcionan la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que regula, modula y/o inhibe la actividad mitogénica o proliferativa celular de los fragmentos del extremo C de CTGF.

Anticuerpos. En una realización, un procedimiento implica la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que reacciona específicamente con los fragmentos de CTGF de la presente invención. Los anticuerpos específicamente reactivos con CTGF se describen en la patente de EE.UU. 5.783.187 y la publicación PCT W09638172. Los anticuerpos de CTGF pueden generarse usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena única, además de fragmentos Fab, incluyendo fragmentos F(ab')_{2} y F_{v}. Los fragmentos pueden producirse, por ejemplo, mediante una biblioteca de expresión de Fab. Para uso terapéutico se prefieren especialmente anticuerpos neutralizantes, es decir, aquellos que inhiben la formación de dímeros.

Puede evaluarse un polipéptido diana, tal como CTGF o un agente que modula la actividad y o expresión de CTGF, para determinar regiones de alta inmunogenicidad. Los procedimientos de análisis y la selección de epítopos son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds., 1988, Current Protocols in Molecular Biology. El análisis y la selección también pueden realizarse, por ejemplo, mediante diversos paquetes informáticos, tales como el software LASERGENE NAVIGATOR. (DNASTAR; Madison WI.) Los péptidos o fragmentos usados para inducir anticuerpos deberían ser antigénicos, pero no son necesariamente biológicamente activos. Preferentemente, un fragmento o péptido antigénico es de al menos 5 aminoácidos de longitud, más preferentemente, al menos 10 aminoácidos de longitud, y lo más preferido, al menos 15 aminoácidos de longitud. Se prefiere que el fragmento o péptido inductor de anticuerpos sea idéntico a al menos una porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido diana, por ejemplo, CTGF. Un péptido o fragmento que imita al menos una porción de la secuencia del polipéptido diana de procedencia natural también puede fusionarse con otra proteína, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), y los anticuerpos puede producirse frente a la molécula quimérica.

Los procedimientos para la producción de anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, diversos huéspedes, que incluyen cabras, conejos, ratas, ratones, seres humanos y otros, pueden inmunizarse mediante inyección con el polipéptido diana o cualquier fragmento o péptido inmunogénico del mismo. Dependiendo de las especies huésped pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, KLH y dinitrofenol. Entre los adyuvantes usados en seres humanos se prefieren especialmente BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción in vivo e in vitro son muy conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Pound, J.D., 1998, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; Harlow, E. y D. Lane, 1988, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. La producción de anticuerpos quiméricos también es muy conocida, ya que es la producción de anticuerpos de una única cadena. Véase, por ejemplo, Morrison, S. L. y col., 1984, Proc. Natl. Acad Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. y col., 1984, Nature 312:604-608; Takeda, S. y col., 1985 Nature 314:452-454. Pueden generarse anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica, por ejemplo, mediante mezclas de cadenas de bibliotecas de inmunoglobinas combinatorias aleatorias. Véase, por ejemplo, Burton D. R., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-11123.

Los anticuerpos también pueden producirse induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante cribado químico de bibliotecas o paneles de inmunoglobulinas de reactivos de unión sumamente específicos. Véase, por ejemplo, Orlandi, R. y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter, G. y C. Milstein, 1991, Nature 349:293-299). También pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para el polipéptido diana. Tales fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos F(ab')_{2}, que puede producirse mediante la digestión en pepsina de la molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab, que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Alternativamente, las bibliotecas de expresión de Fab pueden construirse para permitir la rápida y fácil identificación de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, Huse, W. D. y col., 1989 Science 254:1275-1281.

Los anticuerpos pueden probarse para la actividad de polipéptidos anti-diana usando una variedad de procedimientos muy conocidos en la técnica. Pueden usarse diversas técnicas para el cribado químico para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada, que incluyen diversos inmunoensayos, tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), que incluyen ELISA directos y de captura de ligandos, radioinmunoensayos (RIA), inmunotransferencia y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Numerosos protocolos para ensayos de unión competitiva o inmunorradiométricos, usando o anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas, son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane. Tales inmunoensayos implican normalmente la medición de la formación de complejos entre el polipéptido diana y un anticuerpo específico. Se prefiere un inmunoensayo basado en monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos no interferentes en el polipéptido diana, pero también puede emplearse otros ensayos, tales como un ensayo de unión competitiva. Véase, por ejemplo, Maddox, D. E. y col., 1983, J Exp Med 158:1211.

La memoria descriptiva contempla el uso de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido de CTGF o fragmentos del mismo que neutralizan la actividad biológica de los fragmentos de CTGF de la presente invención. El anticuerpo administrado en el procedimiento puede ser el anticuerpo intacto o fragmentos de unión a antígeno del mismo, tales como fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv, que pueden unir el determinante epitópico. Los anticuerpos usados en el procedimiento pueden ser anticuerpos policlonales o, más preferentemente, monoclonales. Los anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades epitópicas se preparan a partir de fragmentos que contienen antígeno de la proteína mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256:494; Ausubel y col., antes.

En un aspecto, las aplicaciones terapéuticas incluyen aquellas que usan anticuerpos "humanos" o "humanizados" dirigidos a CTGF o fragmentos del mismo. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, que tienen la misma especificidad de unión que un anticuerpo parental, (es decir, normalmente de origen de ratón) y características humanas aumentadas. Los anticuerpos humanizados pueden obtenerse, por ejemplo, mediante mezcla de cadenas o usando tecnología de expresión en fagos. Por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio variable de cadenas pesadas o ligeras de un anticuerpo no humano específico para un CTGF se combina con um repertorio de dominios variables de cadenas complementarias humanas (ligeras o pesadas). Se seleccionan apareamientos de híbridos específicos para el antígeno de interés. Entonces, las cadenas humanas de los apareamientos seleccionados pueden combinarse con un repertorio de dominios variables complementarios humanos (pesados o ligeros) y los dímeros de polipéptidos de anticuerpos humanizados pueden seleccionarse para la especificidad de unión para un antígeno. La técnicas descritas para la generación de anticuerpos humanizados que pueden usarse en el procedimiento de la presente invención se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 5.565.332; 5.585.089; 5.694.761; y 5.693.762. Además, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos humanos en ratones transgénicos se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 5.545.806 y 5.569.825.

Oligonucleótidos antisentido. La memoria descriptiva describe una propuesta terapéutica que directamente interfiere con la traducción de mensajes de CTGF, y específicamente los mensajes de CTGF de longitud completa (en el que la proteína de longitud completa se escinde luego para formar un fragmento de CTGF de la presente invención) o el fragmento de CTGF (conjuntamente "ARNm de CTGF") en la proteína. Más específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento en el que el ácido nucleico antisentido o las ribozimas se usan para unirse a o escindir ARNm de CTGF. Las moléculas de ARN o ADN antisentido se unen específicamente a un mensaje de ARN del gen diana, interrumpiendo la expresión de ese producto de la proteína del gen. El ARN antisentido se une al ARN mensajero formando una molécula bicatenaria que no puede ser traducida por la célula. Además, los grupos químicamente reactivos, tales como ácido etilendiaminotetraacético ligado a hierro (EDTA-Fe) pueden unirse a un oligonucleótido antisentido, produciéndose la escisión del ARN en el sitio de hibridación. Estos y otros usos de procedimientos antisentido para inhibir la traducción de genes son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Marcu-Sakura, 1988, Anal. Biochem 177:278.

Más específicamente, en un aspecto, la secuencia de un polinucleótido antisentido útil para inhibir la expresión del ARNm de CTGF puede obtenerse comparando las secuencias de genes ortólogos (secuencias que se conservan entre especies) o los transcritos de genes ortólogos, e identificando las regiones sumamente conservadas dentro de tales secuencias. La similitud en las secuencias de ácidos nucleicos puede determinarse mediante procedimientos y algoritmos que son muy conocidos en la técnica. Tales procedimientos y algoritmos incluyen, por ejemplo, un programa BLAST (herramienta de búsqueda de alineaciones locales básicas en el Centro Nacional de Información Biológica), ALIGN, AMAS (análisis de múltiples secuencias alineadas) y AMPS (alineación de múltiples secuencias de proteínas).

En la selección de la longitud preferida para un polinucleótido dado deben considerarse diversos factores para lograr las características más favorables. En un aspecto, los polinucleótidos de la presente invención son de al menos de 15 pares de bases (pb) de longitud y preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 pb de longitud. Más preferentemente, los polinucleótidos son de aproximadamente 15 pb a aproximadamente 80 pb de longitud e incluso más preferentemente, los polinucleótidos de la presente invención son de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 pb de longitud. Los polinucleótidos más cortos, tales como de 10 a por debajo de 15-meros, aunque ofrecen una mayor penetración de la células, tienen menos especificidad génica. A diferencia, los polinucleótidos más largos de 20 a aproximadamente 30 pb ofrecen mejor especificidad y muestran una disminución de la cinética de captación en las células. Véase, Stein y col., "Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression", Cohen, ed., McMillan Press, Londres (1988). La accesibilidad a las secuencias diana de ARN transcrito también es de importancia para regiones que forman bucles y secuencias ortólogas en ARN elegidos como diana, ofreciendo así dianas prometedoras. En esta descripción, el término "polinucleótido" engloba tanto restos de ácidos nucleicos oligoméricos del tipo encontrado en la naturaleza, tales como estructuras de desoxirribonucleótido y ribonucleótido de ADN y ARN, como análogos artificiales que pueden unirse al ácido nucleico encontrado en la naturaleza. Los polinucleótidos de la presente invención pueden basarse en monómeros de ribonucleótido o desoxirribonucleótido ligados mediante enlaces fosfodiéster, o mediante análogos ligados mediante fosforano de metilo, fosforotionato u otros enlaces. También pueden comprender restos de monómeros que tienen estructuras de bases alteradas u otras modificaciones, pero que todavía conservan la capacidad para unirse a estructuras de ARN transcrito de procedencia natural. Tales polinucleótidos pueden prepararse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, usando máquinas y reactivos comercialmente disponibles tales como aquellos disponibles de Perkin-Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Por ejemplo, los polinucleótidos específicos para un transcrito elegido como diana se sintetizan según metodología estándar. Los polinucleótidos de ADN modificados con fosforotionato se sintetizan normalmente en ADN automatizado sintetizado en sintetizadores de ADN automatizados disponibles de una variedad de fabricantes. Estos instrumentos pueden sintetizar cantidades de nanomol de polinucleótidos de hasta 100 nucleótidos. Los polinucleótidos más cortos sintetizados mediante instrumentos modernos son frecuentemente adecuados para uso sin más purificación. Si fuera necesario, los polinucleótidos pueden purificarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía en fase inversa. Véase, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vol. 2, capítulo 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Los polinucleótidos ligados por fosfodiéster son particularmente susceptibles a la acción de nucleasas en suero o dentro de células y, por tanto, en una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención son análogos ligados por fosfotionato o fosfonato de metilo, que se han mostrado que son resistentes a nucleasas. Los expertos habituales en la materia pueden seleccionar fácilmente otros enlaces para uso en esta invención. Estas modificaciones también pueden diseñarse para mejorar la captación celular y la estabilidad de los polinucleótidos.

Un vehículo apropiado para la administración de un polinucleótido puede incluir, por ejemplo, vectores, anticuerpos, composiciones farmacológicas, proteínas de unión o recirculación, o sistemas de administración vírica para enriquecer la secuencia en la célula o tejido diana. Un polinucleótido puede acoplarse a, por ejemplo, una proteína de unión que reconoce células endoteliales o células tumorales. Tras la administración, un polinucleótido de la presente invención puede elegirse como diana de una célula o tejido receptor de forma que pueda producirse una expresión potenciada de, por ejemplo, citocinas, factores de transcripción, receptores acoplados a proteínas G, proteínas supresoras de tumores y proteínas de iniciación de apóptosis.

La administración de moléculas antisentido y similares puede lograrse usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Diversos vectores víricos que pueden utilizarse para terapia génica como se enseña en este documento incluyen adenovirus, virus del herpes, variolovacuna o preferentemente un virus de ARN tal como un retrovirus. Varios de los retrovirus conocidos pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas puedan identificarse y generarse. Mediante la inserción de una secuencia de polinucleótidos de interés en el vector vírico, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector es específico para diana. Los vectores retrovíricos pueden hacerse específicos para diana insertando, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un azúcar, un glicolípido o una proteína. La elección de dianas preferidas se lleva a cabo usando un anticuerpo para elegir como diana el vector retrovírico. Aquellos expertos en la materia sabrán de, o podrán determinar fácilmente sin demasiada experimentación, secuencias de polinucleótidos específicas que pueden insertarse en el genoma retrovírico para permitir la administración específica para dianas del vector retrovírico que contiene el polinucleótido antisentido.

Debido a que los retrovirus recombinantes están defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vectores infecciosos. Esta ayuda puede proporcionarse, por ejemplo, usando líneas celulares auxiliares que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales de los retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. Estos plásmidos faltan en una secuencia de nucleótidos, que permiten que el mecanismo de encapsidación reconozca un transcrito de ARN para la encapsidación. Las líneas celulares auxiliares que tienen deleciones de la señal de encapsidación incluyen, pero no se limitan a \psi2, PA317 y PA12. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, ya que no hay genoma encapsidado. Si un vector retrovírico se introduce en tales células en las que la señal de encapsidación está intacta, pero los genes estructurales se han sustituido por otros genes de interés, el vector puede encapsidarse y producirse el virión del vector.

Alternativamente, NIH 3T3 u otras células de cultivo de tejido pueden transfectarse directamente con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovíricos gag, pol y env mediante transfección convencional con fosfato de calcio. Entonces, estas células se transfectan con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retrovírico en el medio de cultivo.

Otro sistema de administración elegido como diana para moléculas antisentido es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, que incluyen emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como sistemas de administración in vivo e in vitro. Se ha mostrado que vesículas unilamelares grandes (LUV), que oscilan en tamaño de 0,2-4,0 um, pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contiene macromoléculas grandes. ARN, ADN y viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso y administrarse a células en una forma biológicamente activa. Con el fin de que un liposoma sea un vehículo de transferencia de genes eficaz, deberían estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes de interés a alta eficiencia mientras que no comprometan su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula diana en comparación con células no diana; (3) administración del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana a alta eficiencia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética.

Inhibidores de moléculas pequeñas. La memoria descriptiva proporciona además un procedimiento en el se identifican y utilizan que las moléculas pequeñas que inhiben la actividad del fragmento de CTGF de la presente invención.

La identificación de moléculas pequeñas que inhiben la actividad del fragmento de CTGF puede realizarse mediante diversas técnicas de cribado químico. Para el cribado químico de los compuestos, el ensayo proporcionará una señal detectable asociada con la unión del compuesto a una proteína o diana celular. Dependiendo de la naturaleza del ensayo, la señal detectable puede ser absorbancia o emisión de luz, formación de placas u otra señal conveniente. El resultado puede ser cualitativo o cuantitativo.

Para el cribado químico de los compuestos para la unión específica pueden emplearse diversos inmunoensayos para detectar anticuerpos humanos (o de primate) unidos a las células. Por tanto, se puede usar anti-hIg marcado, por ejemplo, anti-hIgM, hIgG o combinaciones de los mismos para detectar el anticuerpo humano específicamente unido del epítopo de galactosilo. Pueden usarse diversas marcas tales como radioisótopos, enzimas, agentes que fluorescen, agentes quimioluminiscentes, partículas, etc. Hay numerosos kits comercialmente disponibles que proporcionan anti-hIg marcado que pueden emplearse según el protocolo del fabricante.

Pueden emplearse diversos protocolos para el cribado químico de una biblioteca de compuestos químicos. Hasta cierto punto, la selección del protocolo apropiado dependerá de la naturaleza de la preparación de los compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden unirse a partículas individuales, alfileres, membranas o similares, en los que cada uno de los compuestos puede segregarse. Además, la cantidad de compuesto disponible variará dependiendo del procedimiento empleado para crear la biblioteca. Además, dependiendo de la naturaleza de la unión del compuesto al soporte, pueden liberarse alícuotas de un compuesto, de manera que se realiza una serie de ensayos. Además, el modo en que los compuestos se ensayan estará afectado por la capacidad para identificar el compuesto que se muestra que tiene actividad.

Cuando los compuestos están individualmente sobre una superficie en una rejilla, de manera que a cada lado de la rejilla se sabe cual es la composición, puede proporcionarse un césped celular que está similarmente organizado como una rejilla y puede colocarse alineado con los compuestos unidos a la superficie del sólido. Una vez que el césped y el sustrato sólido están alineados, los compuestos de la superficie pueden liberarse según el modo en el que los compuestos están unidos. Después de un tiempo suficiente para que los compuestos se unan a las proteínas sobre la superficie celular, el césped celular puede lavarse para eliminar los compuestos no específicamente unidos. Pueden participar uno o más lavados, en los que los lavados pueden proporcionar grados variables de rigurosidad, que dependen del grado de afinidad deseado. Después de completarse los lavados, entonces puede añadirse sangre o plasma de mamífero e incubarse durante un tiempo suficiente para la citotoxicidad. Entonces, el plasma o la sangre pueden eliminarse y se observan las placas, en las que la naturaleza del compuesto puede determinarse en virtud de la posición en la rejilla. Por supuesto, el plasma o la sangre deberían estar libres de cualquier componente que destruyera naturalmente las células del césped.

Debido a que el procedimiento preparativo puede repetirse, podría prepararse una pluralidad de sustratos sólidos, en los que los mismos compuestos se preparan en sitios comparables, de manera que el cribado químico podría repetirse con las mismas células o diferentes para determinar la actividad de los compuestos individuales.

En algunos casos, la identidad del compuesto puede determinarse mediante una marca de ácido nucleico usando la reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación de la marca. Véase, por ejemplo, el documento WO93/20242. En este caso, los compuestos que son activos pueden determinarse tomando el lisado e introduciendo el lisado en un medio para la reacción en cadena de la polimerasa que comprende cebadores específicos para la marca de ácido nucleico. Con la expansión, la marca de ácido nucleico puede secuenciarse o su secuencia puede determinarse por otros medios, que indicarán el procedimiento de síntesis usado para preparar el compuesto.

Alternativamente pueden marcarse partículas en las que las marcas pueden eliminarse de la partícula y proporcionar un código binario que describe el procedimiento de síntesis para los compuestos unidos a la partícula. Véase, por ejemplo, Ohlmeyer y col., PNAS USA (1993) 90:10922. Estas marcas pueden ser convenientemente una serie homóloga de compuestos de alquileno que pueden detectarse mediante cromatografía de gases-captura de electrones. Dependiendo de la naturaleza del grupo de enlace puede proporcionarse la liberación parcial de las partículas, de manera que las partículas pueden usarse 2 ó 3 veces antes de identificar el compuesto particular.

Aunque durante la mayor parte se han tratado bibliotecas, análogamente puede cribarse químicamente cualquier grupo grande de compuestos, siempre que el epítopo de CTGF pueda unirse a cada uno de los compuestos. Por tanto, los compuestos de diferentes fuentes, tanto naturales como sintéticas, que incluyen macrólidos, oligopéptidos, ácidos ribonucleicos, dendrímeros, etc., también pueden cribarse químicamente de un modo análogo.

La formación de una placa en el ensayo demuestra que la unión del miembro de la biblioteca a la célula, normalmente una proteína de la superficie, no interfiere con la unión del epítopo de CTGF a un anticuerpo, que el complejo inmunitario es suficientemente estable para iniciar la cascada del complemento y que el miembro tiene una alta afinidad por la diana.

Otros procedimientos de cribado químico para obtener moléculas pequeñas que modulan la actividad de fragmentos de CTGF de la presente invención se describen en la publicación PCT WO9813353.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Con el fin de identificar moléculas pequeñas y otros agentes útiles en los procedimientos presentes para tratar o prevenir un trastorno renal mediante la modulación de la actividad y expresión de CTGF, CTGF y fragmentos biológicamente activos del mismo pueden usarse para el cribado químico de compuestos terapéuticos en cualquiera de una variedad de técnicas de cribado químico. Los fragmentos empleados en tales pruebas de cribado químico pueden estar libres en disolución, fijados a un soporte sólido, soportados sobre una superficie celular o localizados intracelularmente. El bloqueo o la reducción de la actividad biológica o la formación de complejos de unión entre CTGF y el agente que va a probarse pueden medirse mediante procedimientos disponibles en la técnica.

En la técnica se conocen otras técnicas para el cribado químico de fármacos que proporcionan un cribado químico de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de unión adecuada por CTGF o por otro polipéptido diana útil en la modulación, regulación o inhibición de la expresión y/o actividad de CTGF. Por ejemplo, las micromatrices que llevan compuestos de prueba pueden prepararse, usarse y analizarse usando procedimientos disponibles en la técnica. Véase, por ejemplo, Shalon, D. y col., 1995, solicitud PCT n° WO95/35505, Baldeschweiler y col., 1995, solicitud PCT n° WO95/25111 Brennan, T.M. y col., 1995, patente de EE.UU. n° 5.474.796; Heller, M.J. y col., 1997, patente de EE.UU. n° 5.605.662.

La identificación de moléculas pequeñas que modulan la actividad de CTGF también puede realizarse mediante otras diversas técnicas de cribado químico, que también pueden servir para identificar anticuerpos y otros compuestos que interaccionan con CTGF y pueden usarse como fármacos y terapéuticos en los procedimientos presentes. Véase, por ejemplo, Enna, S.J. y col., eds., 1998, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons. Los ensayos proporcionarán normalmente señales detectables asociadas con la unión del compuesto a una proteína o diana celular. La unión puede detectarse mediante, por ejemplo, fluoróforos, conjugados de enzimas y otras marcas detectables muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Enna y col. Los resultados pueden ser cualitativos o cuantitativos.

Para el cribado químico de los compuestos para la unión específica pueden emplearse diversos inmunoensayos para detectar, por ejemplo, anticuerpos humanos o de primate unidos a las células. Por tanto, puede usarse anti-hIg marcado, por ejemplo, anti-hIgm, hIgG o combinaciones de los mismos para detectar anticuerpo humano específicamente unido del epítopo de galactosilo. Pueden usarse diversas marcas tales como radioisótopos, enzimas, agentes que fluorescen, agentes quimioluminiscentes, partículas, etc. Hay numerosos kits comercialmente disponibles que proporcionan anti-hIg marcado, que puede emplearse según el protocolo del fabricante.

Para el barrido químico de los compuestos para efectos citotóxicos puede emplearse una amplia variedad de protocolos para garantizar que uno tiene la actividad deseada. Normalmente se usarán células, que pueden ser líneas celulares de procedencia natural o modificadas, o similares. Las células pueden ser procariotas o eucariotas. Por ejemplo, si se tiene interés en un patógeno, en el que no importa a qué epítopo se une el conjugado del compuesto, las células patogénicas pueden combinarse con cada uno de los compuestos en presencia de un sistema citotóxico dependiente de anticuerpo para determinar el efecto citotóxico. Este ensayo puede realizarse o antes o después de determinarse el efecto de los diversos compuestos candidatos sobre células del huésped al que se administraría el compuesto. De este modo se obtendría un análisis diferencial entre la afinidad por la diana patogénica y la afinidad por células huésped que podrían encontrarse basado en el modo de administración.

En algunas situaciones podría tenerse interés en un estado celular particular, tal como un estado activado, ya que puede estar presente con células T en enfermedades autoinmunitarias, trasplante y similares. En esta situación primero se cribarían químicamente los compuestos para determinar aquellos que se unen a la célula quiescente, y en cuanto a aquellos compuestos que no se unen a las células quiescentes, barrer químicamente el resto de los compuestos candidatos para citotoxicidad para las células activadas. Entonces podría cribarse químicamente para otras células presentes en el huésped que podrían ser encontradas por los compuestos para determinar su efecto citotóxico. Alternativamente podrían emplearse células cancerosas y células normales para determinar si alguno de los compuestos tiene mayor afinidad por las células cancerosas, en comparación con las células normales. De nuevo podría cribarse químicamente la biblioteca de compuestos para la unión a células normales y determinar el efecto. Entonces, aquellos compuestos que no son citotóxicos para células normales podrían cribarse químicamente para su efecto citotóxico para células cancerosas. Aún cuando exista algo de citotoxicidad para células normales, en el caso de células cancerosas, en las que hay una diferenciación suficiente en la actividad citotóxica, se podría estar dispuesto a tolerar la menor citotoxicidad para células normales, en las que si no el compuesto se muestra eficaz con células cancerosas.

En lugar de usar células que se obtienen naturalmente pueden usarse células que se han modificado mediante técnicas recombinantes. Por tanto, pueden emplearse células que pueden hacerse crecer en cultivo, que pueden modificarse mediante regulación por incremento o regulación por disminución de un gen particular. De este modo se tendrían células que se diferencian respecto a una única proteína sobre la superficie. Entonces podría ensayarse diferencialmente la biblioteca respecto al efecto de miembros de la biblioteca en células para las que la proteína particular está presente o ausente. De este modo se podría determinar si el compuesto tiene afinidad específica por una proteína de la membrana superficial particular, a diferencia de cualquiera de las proteínas presentes sobre la membrana superficial.

Podría diferenciarse entre células usando anticuerpos que se unen a una proteína de la membrana superficial particular, en la que los anticuerpos no inician el efecto citotóxico dependiente del complemento, por ejemplo, usando diferentes especies, isotipos o combinaciones de los mismos. Mediante la adición de los anticuerpos, antisueros de bloqueo o anticuerpos monoclonales a una porción de las células, aquellas células no tendrán la proteína diana disponible para unirse al miembro de la biblioteca. De este modo se crean células comparativas que se diferencian en su respuesta basada en la indisponibilidad en un grupo de una única proteína. Aunque los anticuerpos serán normalmente el reactivo más conveniente para usar, pueden emplearse otras entidades de unión específica que proporcionan la misma función.

Para uso en el ensayo para determinar la unión puede usarse un sistema citotóxico dependiente de anticuerpo. Podrían usarse mezclas de síntesis de los componentes en las que sólo están presentes aquellos componentes necesarios para el efecto citotóxico. Esto puede desearse cuando los componentes de sangre o plasma pueden afectar adversamente los resultados del ensayo.

Por tanto, aunque un césped celular es un modo sumamente conveniente para el cribado químico de grandes números de candidatos, también pueden usarse otras técnicas. Estas técnicas incluyen el uso de placas multipocillo y los diversos dispositivos usados para la preparación de la biblioteca combinatoria, tales como alfileres, bolsas de té, etc. Las células pueden hacerse crecer por separado en relación con la naturaleza de los diversos dispositivos, pudiendo entonces ponerse en contacto el dispositivo con las células o hacerse crecer las células en el dispositivo. El dispositivo puede sumergirse en un cultivo apropiado, sembrarse con las células o si no proporcionarse para el contacto entre las células y el compuesto candidato. Entonces, después de añadir el agente citotóxico puede analizarse para lisis en una variedad de formas. Por ejemplo, puede usarse FACS para distinguir entre células vivas y muertas, puede emplearse la liberación de sup 51 Cr o la detección de un compuesto intracelular en el sobrenadante puede servir para detectar compuestos activos.

Además, puede desearse saber si el compuesto tiene actividad agonista o antagonista. Las técnicas de ensayo objeto proporcionan un modo rápido para determinar aquellos compuestos presentes en la biblioteca que se unen a la proteína diana. Una vez que se ha estrechado sustancialmente el número de compuestos candidatos pueden usarse ensayos más sofisticados para detectar la actividad del propio compuesto. De este modo puede realizarse un rápido cribado químico para determinar la afinidad y especificidad de unión, seguido por un cribado químico más intenso para determinar la actividad. Existen diversas técnicas para determinar la actividad, en las que pueden modificarse las células, de manera que se activará un gen marcador que proporcionará una señal detectable. Convenientemente, la señal puede estar asociada con la producción de un colorante, la producción de una proteína de la membrana superficial que puede detectarse con anticuerpos marcados o la secreción de una proteína que puede detectarse en el sobrenadante mediante cualquiera de una variedad de técnicas. Por ejemplo, el gen que se expresa puede modificarse con luciferasa para que tenga una secuencia conductora de manera que se secrete, a través de la cual el sobrenadante puede cribarse entonces químicamente para la formación de la generación de luz usando un sustrato apropiado.

Pueden emplearse diversos protocolos para cribar químicamente la biblioteca. Hasta cierto punto, esto dependerá de la naturaleza de la preparación de los compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden unirse a partículas individuales, alfileres, membranas o similares, en los que cada uno de los compuestos puede segregarse. Además, la cantidad de compuesto disponible variará dependiendo del procedimiento empleado para crear la biblioteca. Además, dependiendo de la naturaleza de la unión del compuesto al soporte, pueden liberarse alícuotas de un compuesto, de manera que se lleva a cabo una serie ensayos. Además, el modo en el que los compuestos se ensayan estará afectado por la capacidad para identificar el compuesto que se muestra que tiene actividad.

Cuando los compuestos están individualmente sobre una superficie en una rejilla, de manera que a cada lado de la rejilla se sabe cual es la composición, puede proporcionarse un césped celular que está similarmente organizado como una rejilla y puede colocarse alineado con los compuestos unidos a la superficie del sólido. Una vez que el césped y el sustrato sólido están alineados, los compuestos de la superficie pueden liberarse según el modo en el que los compuestos están unidos. Después de un tiempo suficiente para que los compuestos se unan a las proteínas sobre la superficie celular, el césped celular puede lavarse para eliminar los compuestos no específicamente unidos. Pueden participar uno o más lavados, en los que lavados pueden proporcionar grados variables de rigurosidad, que dependen del grado de afinidad deseado. Después de completarse los lavados, entonces puede añadirse sangre o plasma de mamífero e incubarse durante un tiempo suficiente para la citotoxicidad. Entonces, el plasma o la sangre pueden eliminarse y se observan las placas, en las que la naturaleza del compuesto puede determinarse en virtud de la posición en la rejilla. El plasma o la sangre pueden estar libres de cualquier componente que destruya naturalmente las células del césped.

Debido a que el procedimiento preparativo puede repetirse, podría prepararse una pluralidad de sustratos sólidos, en los que los mismos compuestos se preparan en sitios comparables, de manera que el cribado químico podría repetirse con las mismas células o diferentes para determinar la actividad de los compuestos individuales. En algunos casos, la identidad del compuesto puede determinarse mediante una marca de ácido nucleico usando la reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación de la marca. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT n° WO93/20242. En este caso, los compuestos que son activos pueden determinarse tomando el lisado e introduciendo el lisado en un medio para la reacción en cadena de la polimerasa que comprende cebadores específicos para la marca de ácido nucleico. Con la expansión, la marca de ácido nucleico puede secuenciarse o su secuencia puede determinarse por otros medios, que dirigirán la selección del procedimiento que se usa para preparar el compuesto.

Alternativamente pueden marcarse partículas en las que las marcas pueden eliminarse de la partícula y proporcionar un código binario que describe el procedimiento de síntesis para los compuestos unidos a la partícula. Véase, por ejemplo, Ohlmeyer y col., 1993, PNAS 90:10922. Estas marcas pueden ser convenientemente una serie homóloga de compuestos de alquilen que pueden detectarse mediante cromatografía de gases-captura de electrones. Dependiendo de la naturaleza del grupo de enlace puede proporcionarse la liberación parcial de las partículas, de manera que las partículas pueden usarse 2 ó 3 veces antes de identificar el compuesto particular.

Aunque durante la mayor parte se han tratado bibliotecas, análogamente puede cribarse químicamente cualquier grupo grande de compuestos, siempre que el epítopo de CTGF pueda unirse a cada uno de los compuestos. Por tanto, los compuestos de diferentes fuentes, tanto naturales como sintéticas, que incluyen macrólidos, oligopéptidos, ácidos ribonucleicos, dendrímeros, etc., también pueden cribarse químicamente de un modo análogo.

La formación de una placa en el ensayo demuestra que la unión del miembro de la biblioteca a la célula, normalmente una proteína de la superficie, no interfiere con la unión del epítopo de CTGF a un anticuerpo, que el complejo complejo inmunitario es suficientemente estable para iniciar la cascada del complemento y que el miembro tiene una alta afinidad por la diana.

La metodología objeto puede usarse en cualquier situación en la que se tiene una diana celular para destruir, particularmente aquellas dianas celulares que tienen baja concentración de epítopo de CTGF o no tienen. Por tanto, la diana celular puede ser una procariota, que es patogénica. Diversos organismos incluyen, por ejemplo, microbacteria, Yersinia, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoea, Streptococcus, Hemophilus influenza, etc. Otros patógenos incluyen eucariotas, particularmente hongos, tales como Candida, Histoplasma, etc., y protozoos, por ejemplo, Giardia. Además, los virus que proporcionan proteínas de la membrana superficial en células infectadas también pueden ser la diana de los compuestos objeto, en los que las células que se criban químicamente se han infectado esencialmente.

Las células huésped también pueden servir de dianas, en las que las células son o anómalas o actúan de un modo adverso hacia el huésped o tratamientos del huésped. Por ejemplo, los tejidos cancerosos que pueden distinguirse de tejido normal pueden servir de diana para los compuestos objeto. Las células T o B asociadas a enfermedades autoinmunitarias o asociadas a GVHD o rechazo de trasplante también pueden servir de dianas. Las células aberrantes, a pesar de su naturaleza, siempre que puedan distinguirse de células normales, también pueden servir de dianas. Por tanto, lesiones psoriáticas, células del linfoma, células bacterianas, fúngicas, parasíticas, infectadas por virus, pueden ser dianas de los productos objeto. Por tanto, los compuestos objeto pueden aplicarse cuando se desee amputar una porción de células, sin eliminar todas las células, tales como células que expresan un marcador de diferenciación tales como subconjuntos de células T, plaquetas activadas, células endoteliales, células que expresan receptores de hormonas o de citocinas.

Otros procedimientos de cribado químico para obtener moléculas pequeñas que modulan la actividad de CTGF pueden encontrarse, por ejemplo, en la solicitud PCT n° WO9813353.

Compuestos/moléculas. La memoria descriptiva proporciona procedimientos para tratar y prevenir enfermedades y trastornos asociados a CTGF mediante la modulación, regulación o inhibición de la actividad de CTGF o fragmentos de CTGF de la presente invención. Estos procedimientos pueden comprender la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que bloquea las interacciones de unión o bloquea las enzimas que participan en la ruta de transducción de señales de CTGF. Más específicamente, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para inhibir la actividad de CTGF mediante la administración de compuestos que bloquean la inducción de CTGF.

Los compuestos que modulan la expresión del gen de CTGF y/o la actividad de CTGF en el procedimiento de la invención incluyen agentes que producen una elevación en los nucleótidos cíclicos en la célula. Otros compuestos que pueden bloquear la inducción de CTGF según los procedimientos descritos en este documento pueden identificarse usando los procedimientos de barrido químico descritos anteriormente.

En una realización, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para identificar un compuesto o un agente que modula la actividad mitogénica de un fragmento de CTGF, por ejemplo, un fragmento codificado por los exones 4 y 5 como se expone en la figura 2. El procedimiento incluye poner en contacto un agente de interés, tal como un péptido, molécula pequeña, polipéptido, peptidomimético, con las células (por ejemplo, fibroblastos) y un fragmento de CTGF conocido por tener actividad mitogénica y medir la capacidad de proliferación de las células mediante medios conocidos para un experto en la materia (véase Ejemplos). Entonces, la capacidad de proliferación de las células se compara con la capacidad de proliferación de una población de control adecuada de células en ausencia del agente o compuesto.

El término "agente" o "compuesto" como se usa en este documento describe cualquier molécula, por ejemplo, una proteína, polipéptido o fármaco, con capacidad para afectar el crecimiento de una célula. El agente puede ser cualquiera conocido o que se sospecha que puede afectar el crecimiento de células. El agente incluye fragmentos de péptidos del polipéptido de CTGF. Los agentes incluyen agentes químicos sintéticos, agentes bioquímicos, células, extractos, homogeneizados y medio acondicionado. El agente de prueba también puede ser una biblioteca combinatoria para cribar químicamente una pluralidad de compuestos. Los compuestos identificados en el procedimiento de la invención pueden evaluarse, detectarse, clonarse, secuenciarse adicionalmente y similares, bien en disolución o después de unirse a un soporte sólido, mediante cualquier procedimiento normalmente aplicado a la detección de una secuencia de ADN específica, tal como PCR, restricción de oligómeros (Saiki y col., Bio/Technology 3:1008-1012, 1985), análisis de sondas de oligonucleótidos específicos para alelos (ASO) (Conner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278, 1983), ensayos de ligamiento de oligonucleótidos (OLA) (Landegren y col., Science 241:1077, 1988) y similares. Se han revisado las técnicas moleculares para el análisis de ADN (Landegren y col., Science 242:229-237, 1988).

Los agentes candidatos engloban numerosas clases químicas. Pueden ser moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular superior a 50 e inferior a aproximadamente 2.500 Daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden frecuentemente estructuras de carbonos cíclicos o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre biomoléculas que incluyen, pero no se limitan a: péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Los agentes candidatos pueden ser polipéptidos o polipéptidos producidos por mutagénesis dirigida a sitios o aleatoria de una secuencia de ácidos nucleicos sintética o de procedencia natural.

En todavía otro aspecto, el procedimiento proporciona la administración de moléculas que interrumpen la modificación postraduccional de CTGF de longitud completa o bloquean la activación de un precursor inactivo de CTGF. Como se trata en este documento, la exposición de células mesangiales a TGF-\beta dio como resultado el aspecto marcado de bandas adicionales a 28-30kDa que se corresponden en tamaño con las mitades del extremo carboxi y amino de la molécula de CTGF de longitud completa. Como se describe anteriormente, el tratamiento con TGF-\beta puede dar como resultado la producción de proteasas u otros factores que pueden escindir la molécula de longitud completa. Las moléculas que inhiben la actividad de CTGF pueden identificarse usando los procedimientos de cribado químico proporcionados en este documento.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Vías de administración. Las composiciones que comprenden moduladores de CTGF, es decir, los anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, moléculas pequeñas y otros compuestos como se describen en este documento pueden administrarse a un paciente humano por sí mismo, o en composiciones farmacéuticas que comprenden, cuando corresponda, vehículos o excipientes adecuados. La memoria descriptiva contempla procedimientos de tratamiento en los que los agentes que modulan o regulan la expresión o actividad de CTGF o fragmentos del mismo se administran a un paciente en necesidad, en cantidades adecuadas para tratar o prevenir la actividad o expresión del fragmento de CTGF. Los presentes procedimientos de tratamiento y prevención pueden comprender la administración de una cantidad eficaz del agente a un sujeto que es preferentemente un sujeto mamífero, y más preferentemente un sujeto humano. En una realización preferida, el mamífero sujeto y el agente administrado son de origen homólogo. Más preferentemente, el sujeto y el agente administrado son de origen humano.

Una cantidad eficaz puede determinarse fácilmente mediante experimento rutinario, como puede ser la vía de administración más eficaz y conveniente y la formulación más apropiada. En la técnica están disponibles diversas formulaciones y sistemas de administración de fármacos. Véase, por ejemplo, Gennaro, A.R., ed, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton PA. Vías adecuadas de administración pueden incluir, por ejemplo, administración por vía oral, rectal, transmucosa o intestinal y administración parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, además de inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. La composición puede administrarse de un modo local en vez de uno sistémico.

Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos muy conocidos en la técnica, tales como mediante procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulado, preparación de comprimidos recubiertos de azúcar, trituración, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Como se observa anteriormente, las composiciones de la presente invención puede incluir uno o más vehículos fisiológicamente aceptables tales como excipientes y adyuvantes que facilitan el procesamiento de moléculas activas en preparaciones para uso farmacéutico. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Para inyección, por ejemplo, la composición puede formularse en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para administración transmucosa, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Para administración por vía oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables muy conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas en suspensión, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto. Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención que contienen, por ejemplo, bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Los preparados farmacéuticos para uso oral pueden obtenerse como excipientes sólidos, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir adyuvantes adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea pueden añadirse agentes de disgregación tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Los núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin pueden usarse disoluciones concentradas de azúcar que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de lacas y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Los preparados farmacéuticos para administración por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, además de cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerina o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los principios activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspensos en líquidos adecuados tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizadores. Todas las formulaciones para administración por vía oral deberían estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.

Para administración por inhalación, los compuestos para uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverizador de aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono o cualquier otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación apropiada puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para uso en un inhalador o insuflador. Éstos contienen normalmente una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Las composiciones formuladas para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua, pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Las formulaciones para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de agentes que afectan la actividad de CTGF o fragmentos del mismo, en forma soluble en agua.

Las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones apropiadas para inyección aceitosa. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo y ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones sumamente concentradas. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado antes de uso, por ejemplo, agua estéril sin pirógeno.

Las composiciones descritas en este documento también pueden formularse como una preparación de liberación lenta. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados ligeramente solubles, por ejemplo, como una sal ligeramente soluble.

Los vehículos farmacéuticos para las moléculas hidrófobas podrían incluir sistemas de codisolventes que comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. El sistema de codisolventes puede ser el sistema de codisolventes VPD. VPD es una disolución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del tensioactivo no polar polisorbato 80 y 65% p/v de polietilenglicol 300, enrasado en etanol absoluto. El sistema de codisolventes VPD (VPD:5W) está constituido por VPD diluido 1:1 con un 5% de dextrosa en disolución acuosa. Este sistema de codisolventes es eficaz en la disolución de compuestos hidrófobos y produce baja toxicidad con la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema de codisolventes pueden variarse considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, puede variarse la identidad de los componentes de los codisolventes. Por ejemplo, pueden usarse otros tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar de polisorbato 80, puede variarse el tamaño de la fracción de polietilenglicol, el polietilenglicol puede reemplazarse por otros polímeros biocompatibles, por ejemplo polivinilpirrolidona, y la dextrosa puede sustituirse por otros azúcares o polisacáridos.

Alternativamente pueden emplearse otros sistemas de administración de moléculas hidrófobas. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos muy conocidos de excipientes o vehículos de administración para fármacos hidrófobos. También pueden emplearse ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente a costa de mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden administrarse usando sistemas de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la cantidad eficaz de la composición que va a administrarse. Están establecidos diversos materiales de liberación sostenida y están disponibles para aquellos expertos en la materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar, dependiendo de su naturaleza química, los compuestos durante algunas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico pueden emplearse estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.

Dosificación eficaz. Para cualquier composición usada en los presentes procedimientos de tratamiento, una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente usando una variedad de técnicas muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, en un ensayo en cultivo celular, una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye la CI_{50}, como se determina en el cultivo celular. Por ejemplo, si se desea la inhibición de la actividad de CTGF, puede determinarse la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición máxima media de la actividad de CTGF. Los intervalos de dosificación apropiados para sujetos humanos pueden determinarse usando datos obtenidos de ensayos en cultivos celulares y otros estudios animales.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de la molécula que da como resultado la mejora de síntomas o una prolongación de la supervivencia en un sujeto. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales moléculas pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis de efectos tóxicos respecto a terapéuticos es el índice terapéutico, que puede expresarse como la relación DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren moléculas que presentan altos índices terapéuticos.

Las dosificaciones entran preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE_{50} con poca o sin toxicidad. Las dosificaciones pueden variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se elegirán en vista de los detalles de una afección del sujeto.

La cantidad e intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles de plasma del resto activo que son suficientes para modular o regular la actividad de CTGF según se desee, es decir, la concentración mínima eficaz (CME). La CME variará para cada compuesto, pero puede estimarse a partir de, por ejemplo, datos in vitro, tales como la concentración necesaria para lograr el 50-90% de actividad de CTGF para inducir el crecimiento óseo usando los ensayos descritos en este documento.

Las dosificaciones necesarias para lograr la CME dependerán de características individuales y la vía de administración. Las composiciones deberían administrarse usando una pauta posológica que mantenga los niveles de plasma por encima de la CME durante aproximadamente el 10-90% de la duración del tratamiento, preferentemente aproximadamente el 30-90% de la duración del tratamiento, y lo más preferido entre el 50-90%. En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede no relacionarse con la concentración de plasma.

Por supuesto, la cantidad de composición administrada dependerá de varios factores que incluyen, pero no se limitan a, peso particular del sujeto, la gravedad de la aflicción, el modo de administración y la opinión del médico prescriptor.

Envase. Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina de metal o de plástico, tal como un envase alveolado. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. También pueden prepararse composiciones que comprenden un compuesto de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible, situadas en un recipiente apropiado y etiquetadas para el tratamiento de una afección indicada. Afecciones adecuadas indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de trastornos o enfermedades en los que se desea la inducción de cartílago u ósea, cicatrización, neuroprotección, fibrosis renal, diabetes o similares.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan exclusivamente para ilustrar la invención reivindicada. Sin embargo, la presente invención no está limitada en el alcance por las realizaciones ilustradas, que sólo se pretenden como ilustraciones de aspectos individuales de la invención, y los procedimientos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, las diversas modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en este documento, serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Tales modificaciones pretenden entrar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Los fragmentos de CTGF estimulan la síntesis de ADN

Para preparar fragmentos de CTGF, CTGF recombinante humano (longitud completa) se digirió mediante quimotripsina para convertirse en un fragmento de CTGF. Los fragmentos de CTGF recombinante también se produjeron mediante expresión de cualquiera o los dos exón 4 y exón 5 de CTGF. Se obtuvo una línea continua de fibroblastos cultivados de riñón de rata normal (NRK), designada el clon NRK-49F, de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) para producir cultivos celulares. Los fibroblastos de prepucio humano se crearon a partir de cultivos de explante. Los cultivos celulares se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) que contenía 2,5% de suero bovino fetal y 2,5% de Nu-Serum I (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) y se efectuaron pases antes de la confluencia.

Para examinar la función de los fragmentos de CTGF en la mitogénesis y síntesis de ADN, las monocapas en las que se detuvo el crecimiento de NRK y fibroblastos de prepucio humano se prepararon sembrando 10.000 células/pocillo en 48 placas de pocillos y permitiendo que las células crecieran hasta confluencia en de 5 a 7 días en DME y 2,5% de suero bovino fetal/Nu-Serum. Entonces, las monocapas de fibroblastos se privaron de suero en DME que contenía HEPES 25 mM y ITS premix (Collaborative Biomedical) durante de 1 a 8 días. Entonces se añadieron ácido ascórbico (50 mg/ml) y agentes biológicos (0,5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico más fragmentos de CTGF). Los cultivos se marcaron con ^{3}H-timidina durante las 24 horas finales del periodo de tratamiento de 48 horas y la síntesis de ADN se evaluó mediante la precipitación con ácido tricloroacético frío. Los resultados se expresaron como cpm/pocillo \pm EEM usando un ensayo cuantitativo.

Como se expone en la figura 1, los fragmentos de CTGF producidos recombinantemente por la expresión del exón 4 y el exón 5 solos y por la escisión de la síntesis de ADN inducida por CTGF de longitud completa en fibroblastos de NRK con 1 ng/ml fueron aproximadamente tan eficaces como 1 ng/ml de CTGF intacto de longitud completa o 5 ng/ml de TGF-\beta. Notablemente, los fragmentos de CTGF del extremo N no estimularon la mitogénesis de fibroblastos de NRK.

Ejemplo 2 La neutralización de anticuerpos anti-CTGF bloquea la síntesis de ADN, síntesis de colágeno e inducción de miofibroblastos inducidas por TGF-\beta

Se fomentaron anticuerpos anti-CTGF específicos frente a CTGF humano recombinante biológicamente activo producido en un sistema de expresión de baculovirus que usa procedimientos conocidos en la técnica. Los anticuerpos se prepararon en cabras y se probaron para la neutralización de la actividad de CTGF directamente o en la síntesis de ADN o colágeno inducida por TGF en fibroblastos de NRK. Los anticuerpos de cabra presentaron actividad en los ensayos para la neutralización de la acción de TGF-\beta. En estos ensayos, los anticuerpos de cabra anti-CTGF pudieron bloquear la síntesis de ADN como se demuestra en la figura 4, la síntesis de colágeno y la formación de miofibroblastos inducida por TGF-\beta. Se observó que la cantidad de anticuerpo requerida para bloquear la síntesis de colágeno era significativamente inferior a la cantidad necesaria para bloquear la síntesis de ADN. Tanto el ensayo de transferencia de Western como los ensayos ELISA de competición indicaron que la mayoría de los anticuerpos en esta preparación se dirigieron contra el dominio del extremo N de CTGF. Esto sugirió que los dos dominios podrían ser responsables de la estimulación de diferentes actividades biológicas.

Ejemplo 3 Los anticuerpos anti-CTGF específicos para el dominio del extremo C de CTGF bloquean selectivamente la síntesis de ADN

Los anticuerpos anti-CTGF específicos para dominio se prepararon mediante cromatografía de afinidad usando dominios de CTGF del extremo C o extremo N purificados. Estos dominios se prepararon a partir de CTGF intacto mediante digestión limitada con quimotripsina. Los dominios se separaron entre sí mediante cromatografía de afinidad en heparina-sefarosa. El dominio del extremo N no se une a heparina, mientras que el dominio del extremo C de CTGF contiene la actividad de unión a heparina y es retenido en la heparina-sefarosa. Estos dominios eran puros, teniendo una contaminación inferior al 0,1% con CTGF intacto basado en análisis de transferencia de Western. Entonces, los dominios individuales se acoplaron a Affigel 10 a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml de gel. Entonces, la IgG anti-CTGF (cabra) total se absorbió en la resina de afinidad y se eluyeron los anticuerpos específicamente unidos. Entonces, estos anticuerpos se probaron en transferencias de Western para determinar la especificidad de su reactividad. La IgG reactiva con sólo el dominio del extremo N o extremo C de CTGF se aisló del conjunto total usando técnicas conocidas en la técnica. Entonces, los anticuerpos se probaron en ensayos de neutralización usando CTGF. Los resultados de estos estudios indicaron que los anticuerpos dirigidos contra el dominio del extremo C de CTGF inhibieron selectivamente la síntesis de ADN, pero no la síntesis de colágeno. A diferencia, el dominio del extremo N de CTGF inhibió selectivamente la síntesis de colágeno, pero no la síntesis de ADN. Estos datos indicaron que las diferentes regiones de la molécula de CTGF pueden ser responsables de la señalización de diferentes actividades biológicas. Para confirmar y ampliar estos resultados, las actividades biológicas de los dominios aislados con CTGF intacto y con TGF-\beta se compararon como se expone a continuación.

Ejemplo 4 El dominio del extremo C de CTGF estimula la síntesis de ADN y la proliferación celular

Los dominios del extremo C y extremo N de CTGF se prepararon usando técnicas conocidas en la técnica. Primero, como se describe anteriormente, los dominios puros del extremo C y extremo N se prepararon mediante digestión proteolítica de CTGF intacto biológicamente activo usando quimotripsina, que produjo dominios del extremo C y extremo N casi exclusivamente intactos sin fragmentos más pequeños. Un segundo procedimiento para generar dominios puros del extremo C y extremo N supuso expresar sólo regiones limitadas de la lectura abierta de CTGF, que sólo codificaron el dominio del extremo C o sólo el dominio del extremo N. Esto se realizó mediante amplificación por PCR de porciones del marco de lectura abierto e introduciendo o un codón de terminación en la región sin cisteína para producir sólo el dominio del extremo N o clonando la porción del marco de lectura abierto que sólo codifica el dominio del extremo C, empezando en la secuencia AYRLED en la región sin cisteína dentro del vector lanzadera de baculovirus, GP67. Esto produjo una proteína quimérica que contenía un péptido de señalización desde el gen del virus GP67, que dirigió la síntesis de la proteína recombinante deseada (o fragmento), hasta el retículo endoplásmico, asegurándose así la secreción. Después de la purificación, los dominios aislados generados por los diversos procedimientos se compararon en un bioensayo con fibroblastos de NRK. Los resultados de estos estudios confirmaron las observaciones previas con los anticuerpos anti-CTGF específicos para dominio. Los dominios del extremo C producidos mediante cualquier procedimiento eran completamente activos en el ensayo de síntesis de ADN como se describe anteriormente y como se muestra en la figura 5. A la inversa, los dominios del extremo N producidos mediante cualquier digestión proteolítica de CTGF intacto o mediante expresión recombinante directa eran completamente activos como inductores de la síntesis de colágeno e inducción de miofibroblastos. Estos datos demostraron que los dominios individuales de CTGF retuvieron la actividad biológica completa y pueden actuar independientemente entre sí para estimular efectos biológicos específicos en células diana. A concentraciones óptimas, los dominios individuales indujeron una respuesta biológica comparable con CTGF intacto o TGF-\beta. Esto indicó claramente que las actividades mitogénicas (síntesis de ADN, proliferación celular) y matrigénicas (síntesis de matriz extracelular, tales como síntesis de colágeno) de TGF-\beta están mediadas por CTGF y sus dominios respectivos.

Pueden usarse otros factores de crecimiento para potenciar la actividad mitogénica de fragmentos de CTGF de la presente invención, que incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF). Como se representa en la figura 6, EGF potencia la actividad mitogénica de CTGF en células de NRK.

<110> Universidad de Miami

\hskip1.07cmFibrogen, Inc.

\hskip1.07cmGrotendorst, Gary

\hskip1.07cmNeff, Thomas

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<120> Fragmentos del factor de crecimiento de tejido conjuntivo y procedimientos y usos de los mismos

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<130> F 1980 EP

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<140> EP 99966224.0

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<141> 13-07-2001

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<150> PCT/US99/29654

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<151> 14-12-1999

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<150> 60/112.240

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<151> 14-12-1998

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<150> 60/112.241

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<151> 14-12-1998

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<160> 4

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 2075

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<212> ADN

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<213> Humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (130)..(1176)

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<400> 1

9

10

11

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<210> 2

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<211> 349

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<212> PRT

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<213> Humano

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<400> 2

12

13

14

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<210> 3

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<211> 1415

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<212> ADN

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<213> Humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(516)

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<400> 3

15

16

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<210> 4

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<211> 172

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<212> PRT

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<213> Humano

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<400> 4

17

18

Claims (2)

1. Un fragmento de CTGF que está constituido por la secuencia de aminoácidos del resto 4 al resto 172 de la figura 3.

2. Un polinucleótido que codifica el fragmento de CTGF de la reivindicación 1.