PT1140969E - Fragmentos do factor de crescimento de tecido conectivo e os seus métodos e utilizações - Google Patents

Description

DO FACTOR DE CRESCIMENTO DE TECIDO CONECTIVO E OS SEUS MÉTODOS E UTILIZAÇÕES"

Esta invenção refere-se geralmente ao campo de factores de crescimento e especificamente a fragmentos do Factor de Crescimento de Tecido Conectivo (CTGF) e aos seus métodos de utilização. m immç&o

Factores de Crescimento. Os factores de crescimento podem ser largamente definidos como polipéptidos de sinalização intracelulares que actuam localmente, multifuncionais, os quais controlam tanto a ontogenia como a manutenção da forma e função do tecido. Os produtos de proteina de muitas proto-oncogenes foram identificados como factores de crescimento e receptores de factor de crescimento.

Os factores de crescimento geralmente estimulam as células alvo para a proliferação, diferenciação e organização em tecidos de desenvolvimento. A acção de factores de crescimento é dependente da sua ligação a receptores específicos que estimulam um evento de sinalização dentro da célula. Os exemplos de factores de crescimento incluem o factor de crescimento derivado da plaqueta (PDGF), o factor de crescimento como a insulina (IGF), o factor de crescimento Seta de transformação (TGF-β), o factor de crescimento alfa de transformação (TGF-or), o factor de crescimento epidérmico (EGF) e o factor de crescimento de tecido conectivo (CTGF). Cada um destes factores de crescimento tem sido relatado para estimular as células para proliferação.

Factor de Crescimento de Tecido Conectivo. 0 CTGF é um péptido monomérico rico em cisteína com um peso molecular de cerca de 38 kd. Como anteriormente relatado, o CTGF tem ambas as actividades mitogénicas e quimiotácticas de células de tecido conectivo. 0 CTGF é segregado por células e é acreditado ser activo na interacção com um receptor de célula especifico. 0 CTGF é um membro de uma família de reguladores de crescimento que incluem, por exemplo, o CTGF do rato (fisp-12) e humano, o Cyr61 (rato), o CeflO (galinha), e Nov (galinha). Baseado em comparações de sequência, foi sugerido que os membros desta família têm uma estrutura modular que consiste tipicamente de pelo menos um dos seguintes: (1) um domínio de factor de crescimento como a insulina responsável pela ligação; (2) um domínio de factor de von Willebrand responsável pela formação complexa; (3) uma trombospondina de tipo I de repetição, possivelmente responsável pela ligação de moléculas matrizes; e (4) um módulo de terminal C encontrado nas proteínas de matriz, postulado para ser responsável pela ligação de receptor. A sequência do ADNc para o CGTF humano contém uma estrutura de leitura aberta de 1047 nucleótidos, com um local de iniciação aproximadamente no nucleótido 130 e um local de terminação de TGA aproximadamente no nucleótido 1177, e coa-~fica um péptido de 349 amino ácidos. A sequência de ADNc para o CTGF humano foi anteriormente divulgada na Patente norte americana N°. 5 408 340. A estrutura de leitura aberta do CTGF codifica um polipéptido que contém 39 resíduos de císteína, indicando uma proteína com múltiplas ligações de disulfito intramoleculares. 0 terminal amino do péptido contém uma sequência de sinal de hidrofóbica indicativa de uma proteína segregada e há dois locais de glicosilação ligados por N aos resíduos 28 e 225 de asparagina na sequência do amino ácido. A síntese e a secreção do CTGF e tida como sendo selectivamente induzida por TGF-β e BMP-2, assim como potencialmente por outros membros da super família de TG&g de proteínas. Como relatado na técnica, embora o TGF-β possa estimular o crescimento de fibroblastos normais em ágar suave, o CTGF sozinho não pode induzir esta propriedade nos fibroblastos. No entanto, foi mostrado que a síntese e a acção de CTGF são essenciais para que o TGF-β estimule a ancoragem do crescimento dos fibroblastos independentes. Ver, por exemplo, Kothapalli et al., 1997, Cell Growth & Differentation 8 (1): 61-68 e Boes et al., 1999, Endocrinology 140 (4): 1575-1580.

No que se refere a actividade biológica, o CTGF tem sido relatado como sendo principalmente mitogénico em natureza (capaz de estimular as células alvo a proliferar) . O CTGF também tem sido relatado como tendo actividade quimiotáctica. Patologicamente, a molécula CTGF de comprimento completo tem sido relatada como estando envolvida em condições em que há um crescimento excessivo das células do tecido conectivo e um excesso de deposição da matriz extracelular. O CTGF também tem sido descrito na técnica com estando associado com condições que se relacionam com a migração e a preliferâção e a neovascularização de células endoteliais vasculares. As doenças e as desordens que se relacionam com estas condições, incluem, por exemplo, a fibrose dos órgãos principais e da pele, cancro, e doenças e desordens relacionadas tais como a esclerose sistémica, a angiogenese, a arteriosclerose, a nefropatia diabética, e a hipertensão renal.(Ver, por exemplo, Toshifumi et al, 1999, Journai of Cellular Physiology 18191) : 153-159; Shimo et ai., 1999, Journal of Biochemistry 126 (1): 137-145; Murphy et al., 1999, Journal of Biological Chemistry 274 (9) : 5830-5834; Wenger et al., 1999, Oncogene 18 (4): 1073-1080; Frazier et al., 1997, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29 (1); 153-161; Oemar et al., 1997, Circulation 95 (4); 831-839). O CTGF também tem sido relatado como sendo útil na cura de feridas e na reparação do tecido conectivo, ossos e cartilagem. Neste aspecto, o CTGF tem sido descrito como um indutor da formação de osso, tecido, ou cartilagem em desordens tais como a osteoporose, a osteoartrite ou osteocondrite, a artrite, as desordens do esqueleto, as escaras hipertróficas, as queimaduras, a hipertrofia vascular ou cura de feridas. (Ver, por exemplo, a Patente norte Americana N°. 5 837 258; Ohnishi et al., 1998, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 30 (11): 2411-2422; Nakanishi et al., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 234 (1) : 206 — 210; Pawar et al., 1995, Journal of Cellular Physiology 165 (3): 556-565).

Em resumo, o CTGF tem sido implicado em numerosas condições fibróticas e cancerosas, e tem sido descrito como contribuindo para a cura de feridas. Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica para identificar métodos úteis para modular a actividade do CTGL para tratar estas e várias doenças e desordens. Antes da presente invenção, não havia nenhum relatório de que as regiões ou os domínios d-s CTGF fossem responsáveis por sinalizar diferentes actividades biológicas. Além disso, antes da presente invenção, não havia nenhuma divulgação do tratamento de doenças e desordens associado com a proliferação de células e/cu a produção em excesso da matriz extracelular por se inibir a actividade biológica de uma região ou domínio específicos de CTGF. A presente invenção fornece novas composições e métodos para o tratamento de doenças, desordens, ou complicações associadas com o CTGF em que a deposição da matriz extracelular está implicada, incluindo, por exemplo, a indução da síntese de colagénio e a diferenciação dos miofibroblastos. Mais especificamente, as composições da presente invenção compreendem fragmentos de CTGF que compreendem a região de terminal N de CTGF. Num aspecto, o fragmento da presente invenção compreende pelo menos uma parte dos exões 2 ou 3, ou o polipéptido por esse meio codificado, não é o fragmento de CTGF descrito em Brigstock et al.r 1997, J. Biol. Chem. 272 (32):20275-82, e possui adicionalmente a capacidade de induzir a síntese da matriz extracelular, incluindo, mas não limitado, a capacidade de induzir a diferenciação de colagénio, e miofibroblastos. Num aspecto adicional, o fragmento da presente invenção compreende entre cerca de um quarto e metade do comprimento da proteína de CTGF de comprimento completo.

Num aspecto, o fragmento do polipéptido do factor de crescimento do tecido conectivo (CTGF) que tem as actividades como descritas em cima e fornecido. Um fragmento da invenção inclui o CTGF que tem uma sequência de aminoácido codificada pelo menos pelo exão 2 como designado na Figura 3. Um fragmento pode também incluir uma sequência de aminoácido codificada pelo menos pelo exão 3 como designado na Figura 3. Adicionalmente, um fragmento de CTGF da invenção pode incluir uma sequência de aminoácido codificada pelo menos pelos exões 2 e 3, como designado na Figura 3. A invenção também fornece sequências de polinucleótidos que codificam tais fragmentos. A presente invenção compreende adicionalmente métodos de utilização dos fragmentos de CTGF da invenção divulgada para identificar composições as quais podem modular a actividade dos referidos fragmentos de CTGF, em que tais composições podem ser usadas para controlar a deposição normal da matriz extracelular, tal como a deposição de colagenio, como desejado. Mais especificamente, os fragmentos de CTGF podem ser usados para identificar composições que podem controlar a deposição normal da deposição de colagénio e a diferenciação dos miofibroblastos, em que tal composição pode ser usada para inibir, suprimir, ou aumentar a actividade dos fragmentos de CTGF da presente invenção.

As composições da invenção reivindicada compreendem adicionalmente, os moduladores de CTGF, por exemplo, anticorpos, moléculas de anti-sentido, moléculas pequenas, e outros compostos identificados pelos métodos acima, os quais podem modular a actividade dos fragmentos de CTGF da presente invenção. Num aspecto, a presente invenção fornece moduladores de CTGF que inibem ou suprimem a actividade de CTGF ou os fragmentos de CTGF. Num outro aspecto da presente invenção, os moduladores de CTGF aumentam a actividade de CTGF ou os fragmentos de CTGF, por exemplo, em indicações em que a indução ca actividade de GTGE é desejável, per exemplo, na cura de feridas, reparação de tecido, e reparação ca osso.

Em outro aspecto da invenção os métodos da presente invenção compreendem a administração de uma quantidade eficaz dos moduladores de fragmentos de LTGF, sozinhos ou em combinação com um ou mais compostos, a um paciente em necessidade para tratar doenças, desordens ou complicações em que a manipulação da síntese de colagénio é desejada. Mais particularmente, os métodos da presente invenção são dirigidos a utilização dos compostos capazes de modular a actividade dos fragmentos de CTGF desta invenção para modular a síntese de colagénio, e consequentemente, tratar desordens relacionadas com o excesso de abundância da síntese de colagénio, incluindo as desordens fibróticas. De um modo preferido, as desordens são da derme, o órgão principal e desordens relacionadas com o excesso de produção de tecido de escaras. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem os fragmentos de CTGF da presente invenção. Tais composições podem ser úteis na cura de feridas, na reparação de ossos e de tecidos, em que a actividade aumentada de CTGF é desejável.

ÔtSCKÇ&O..φβ D1SISIOS A Figura 1 mostra as células num ensaio de indução de mioblastos.

As Figuras 2A e a Figura 2B mostram um gráfico que indica que os fragmentos de LTGF da presente invenção induzem a síntese de colagénio em células de NRK.

As Figuras 3A e a Figura 3B estabelecem a sequência de ácido nucleico (SEQ ID MO. 1) e a sequência de smiso ácido (SEQ ID NC. Ϊ) da molécula de GTGF de comprimento completo, em que a posição de cada exão da molécula de CTGF é identificada. A Figura 4 estabelece a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO. 3) e a sequência de amino ácido (SEQ ID NO. 4) do domínio de terminal N de CTGF que compreende o exão 2 e o exão 3 da molécula de CTGF. A Figura 5 estabelece dados que se referem a inibição da síntese de colagénio com anticorpos de anti-CTGF. A Figura 6 estabelece dados que se relacionam com a inibição da síntese de colagénio por anticorpos dirigidos ao domínio de terminal N de CTGF. A Figura 7 estabelece dados que se relacionam com a estimulação da síntese de colagénio pelo CTGF e o domínio de terminal N de CTGF. A Figura 8 estabelece dados que se relacionam com o domínio de terminal N de CTGF como um indutor activo da síntese de colagénio e da indução de miofibroblastos. A Figura 9 estabelece dados que se relacionam com os efeitos de IGF-2 na síntese de colagénio induzida pelo CTGF.

Bisçsiçio DateMi m E entendido que a presente invenção não é limitada a metodologia, protocolos, linhas de vectores, e reagentes particulares, etc., aqui descrita, uma vez que estes podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é usada para o objectivo de só descrever formas de realização particulares, e não é entendida para limitar o âmbito da presente invenção. Deve ser observado que tal como aqui usadas e nas reivindicações anexas, as formas singulares "a", "um", e "o" incluem referência plural a menos que o contexto ciaramente dite de outra maneira. Assim, por exemplo, uma referência a "um anticorpo" é uma referência a um ou mais anticorpos e os seus equivalentes conhecidos dos especialistas na técnica, e assim por diante. A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como usualmente entendidos por um especialista vulgar na técnica ao qual esta invenção pertence. Os métodos, dispositivos, e materiais preferidos são descritos, embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção.

Definições

Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento de CTGF" refere-se a um fragmento que compreende pelo menos uma parte da região de terminal N de CTGF. Em uma forma de realização, o fragmento compreende pelo menos uma parte dos exões 2 ou 3 da proteína de CTGF de comprimento completo, e além disso possui a capacidade para induzir a síntese da matriz extracelular. Em outra forma de realização, o fragmento está entre cerca de um quarto e metade do comprimento da proteína de CTGF de comprimento completo. "A capacidade para induzir a síntese de colagénio" significará a capacidade para induzir a formação de uma matriz extracelular através da síntese de colagénio e a diferenciação dos miofibroblastos. Os fragmentos de CTGF podem ser obtidos quer pelo isolamento de fontes naturais, produção de fabricação sintética, técnicas de engenharia genéticas recombinantes, ou por outras técnicas disponíveis na técnica.

Tal como aqui utilizado, o termo "terminal N" refere-se a sequência de acido nucleico que compreende pelo menos a parte dos domínios do exão 2 e do exão 3, que começam aproximadamente na molécula de CTGF de comprimento completo, e a sequência de amino acido codificada, como identificada nas Figuras 3A e 3B. 0 termo "exão 2" refere-se a sequência de ácido nucleico e a correspondente sequência de amino acido do domínio de terminal N, que começa aproximadamente na molécula de CTGF de comprimento completo, e a correspondente sequência de amino ácido. 0 termo "exão 3" refere-se a sequência de ácido nucleico do domínio de terminal N da molécula de CTGF de comprimento completo, e ao polipéctido codificado.

Tal como aqui utilizado, o termo "terminal C", refere-se a sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos uma parte dos domínios do exão 4 e do exão 5 da molécula de CTGF de comprimento completo, e ao polipéptido por esse meio codificado, como identificado nas Figuras 3A e 3B.

Os termos " desordens" e "doenças" como aqui utilizados, referem-se a condições associadas com a expressão ou a actividade do CTGF. As doenças, desordens, e condições associadas com o CTGF, incluem, mas não são limitadas, a necroses excessivas que resultam de traumas agudos ou repetitivos, incluindo a cirurgia ou a terapia por radiação, a fibrose de órgãos tais como os rins, pulmões, fígado, olhos, coração, e pele, incluindo as necroses de escleroderma, quelóides, e hipertrófícas. A expressão anormal de CTGF tem sido associada cors a necroçe do tecido geral, crescimentos semelhantes a tumores na pele, e necroseç susteniadas de vasos sanguíneos, levando à capacidade de transportar sangue danificada, hipertensão, hipertrofia, etc. Também açsociaaas com o CTGF estão varias doenças causadas pela ou migração de células endoteliais vasculares, tais como o cancro, incluindo as dermatrofibromas, condições relacionadas com a expressão de células endoteliais anormal, a desmoplasia do carcinoma da mama, o angiolipoma, e angioleiomioma. Outras condições relacionadas incluem a arteriosclerose e a esclerose sistémica, incluindo as placas arterioscleróticas, a doença do intestino inflamatória, a doença de Chron, a angiogenese, e outros processos proliferativos os quais têm papéis centrais na arteriosclerose, artrite, cancro, e outros estados de doença, a neovascularização envolvida no glaucoma, a inflamação devido a doença ou dano, incluindo a inflamação de articulações, as metastases de crescimento do tumor, doença intersticial, doenças dermatológicas, artrites, incluindo as artrites reumatóides crónicas, a arteriosclerose, diabetes, incluindo a nefropatia diabética, a hipertensão, e outras desordens dos rins, e fibroses resultantes da quimioterapia, do tratamento por radiação, da diálise, e da rejeição ao transplante e ao aloenxerto.

As desordens "fibroproliferativas" como aqui referidas incluem mas não são limitadas a qualquer das doenças ou desordens listadas acima, por exemplo, as fibrose dos rins, a escleroderma, a fibrose pulmonar, a artrite, a necrose hipertrópica e a arteriosclerose. As desordens fibropoliferativas associadas com o CTGF também incluem nefropatia diabética e a retinopatia, a hipertensão e outras desordens dos rins, as desordens relacionadas com a angiogénese, incluindo mas não limitadas aos vasos sanguíneos associados com a formação de tumor, e outros processos proliferativos os quais têm papeis centrais na arteriosclerose, e outros estados de doença, e, por exemplo, na fibrose renal, pulmonar e cardíaca, e da pele. Em geral, a fibrose grave que envolve os rins, o fígado, o pulmão, e o sistema cardiovascular estão aqui incluídas. Há numerosos exemplos de fibroses, incluindo a formação de um tecido necroso a seguir a um ataque cardíaco, o qual impede a capacidade do coração de bombear. Os diabetes frequentemente causam dano/necrose nos rins o qual leva a uma perda progressiva da função do rim. Mesmo depois da cirurgia, pode formar-se tecido necroso entre os órgãos internos que causa contractura, dor, e em alguns casos, infertilidade. Os órgãos principais tais como o coração, os rins, o fígado, os pulmões, os olhos, e a pele são propensos a necrose crónica, usualmente associada com outras doenças. As necroses hipertróficas (volume de tecido não maligno) são uma forma comum de fibrose causada por queimaduras e outros traumas. Em adição, há um número de outras desordens fibroproliferativas tais como escleroderma, quelóides, e arteriosclerose as quais são associadas respectivamente com a necrose do tecido geral, crescimentos semelhantes a tumor na pele, ou uma necrose sustentada de vasos sanguíneos os quais impedem a capacidade de transporte do sangue. Uma vez que o CTGF é expresso em excesso nas desordens fibróticas, ele representa um alvo muito específico para o desenvolvimento de terapêuticas antifibróticas. 0 CTGF pode ser inibido através da utilização de moléculas pequenas e de anticorpos de neutralização, por exemplo, no tratamento de desordens fibroproliferativas. É entendido que "fibroproliferativo" refere-se a qualquer dos exemplos patológicos acima e não deve ser limitado a proliferação celular. "Matrizes extracelulares (ECM)", são estruturas de multicomponentes sintetizadas por e à volta de vários tipos de células incluindo, por exemplo, as células endotelíais, epiteliais, epidérmicas e de músculo. A ECM é formada largamente de proteoglicanos de sulfato de heparano e de colagénio. 0 ECM também contém os proteoglicanos de sulfato de condroitina, vitronectina, fibronectina hl, e proteínas pequenas. Os factores de crescimento são sequestrados nestas matrizes por associação com a porção de glicosaminoglicano dos proteoglicanos de sulfato de heparano. As regiões "semelhantes a heparina" de ácido idurónico elevado e de sulfatação elevada têm sido associadas com a região de ligação de bFGF de sulfato de eparano de fibroblastos humanos (Turnbull, et al., J. Biol. Chem. 267 (15) 10337-10341, 1992). No entanto, a composição de sulfato de heparano na matriz extracelular não foi completamente caracterizada.

As frases "ácido nucleico" ou "sequência de acido nucleico" tal como aqui utilizadas referem-se a um oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, ou a um fragmento de qualquer um destes, para o ADN ou ARN de origem genómica ou sintética que pode ser de cordão singular ou de cordão duplo e pode representar um cordão de sentido ou de anti-sentido, para o ácido nucleico do péptido (PNA), ou a qualquer material semelhante a ADN ou semelhante a ARN, natural ou sintético na origem. "Amino acido" ou "sequência de amino ácido" tal como aqui utilizado refere-se a uma sequência de oligopéptido, péptido, polipéptido, ou proteína, ou a um fragmento, porção, ou subunidade de qualquer um destes, e a moléculas sintéticas ou que ocorrem naturalmente. "Hibridização" refere-se a um processo pelo qual um cordão de acido nucleico se junta com um cordão complementar através de uma conjugação de base. As reacções de hibridização podem ser sensíveis e selectivas para que uma sequência particular de interesse possa ser identificada mesmo em amostras nas quais está presente a baixas conventrações. As condições mais rigorosas aaequadas podem ser definidas, por etfttftitg pelas concentrações de sal ou de formamida nas soluções de prk-hibridização e de hibridização, ou pela temperatura de hibridização, e são bem conhecidas na técnica. Em particular, o rigor pode ser aumentado por se reduzir a concentração de sal, aumentando a concentração de formamida ou por se elevar a temperatura de hibridização.

Por exemplo, a hibridização sob elevadas condições de rigor poderia ocorrer de cerca de 50 % de formamida a cerca de 3 7 " C a 42 "C. . a hibridização podia ocorrer sob condições de rigor reduzidas de cerca de 35 % a 25 % de formamida a cerca de 30 °C a 35 "C. em particular, a hibridização poderia ocorrer sob elevadas condições de rigor a 42 °C em 50 % de formamida, 5 x SSPE, 0,3 % de SDS, e 200 pg/mL de ADN de esperma de salmão desnaturado e fraccionado. A hibridização poderia ocorrer sob condições de rigor reduzidas como descrito em cima, mas em 35 % de formamida a uma temperatura reduzida de 35 "C. a variação da temperatura que corresponde a um nivel particular de rigor pode ser adicionalmente reduzida por se calcular a proporção de urina para pirimidina do ácido nucleico de interesse e por se ajustar a temperatura consequentemente. As variações nas proporções e condições em cima são bem conhecidas na tkcnica. O termo "homologia de ácido nucleico substancial" refere-se a moléculas que têm uma semelhança de sequência de aproximadamente 75 % ou mais, de um modo preferido 85 % ou mais e de um modo mais preferido 90-95 % a uma sequência especifica. As frases "% de semelhança" ou "% de identidade" referem-se a percentagem de semelhança ou identidade de sequência verificada numa comparação de duas ou mais sequências de amino ácido ou de ácido nucleico. A percentagem de semelhança pode ser dererminada por métodos bem conhecidos na técnica. A semelhança percentual entre as sequências de amino acido pode ser calculada, por exemplo, usando o método de Clustal. (Ver, por exemplo, Higgins, D. G. e P. M. Sharp, 1988, Gene 73: 237-244). Os grupos de algoritmos de clustal sequenciam-se em grupos por se examinarem as distâncias entre todos os pares. Os grupos são alinhados por pares e depois em grupos. A semelhança de percentagem entre duas sequências de amino acido, por exemplo, a sequência A e a sequência B, é calculada por se dividir o comprimento da sequência A, menos o número de resíduos de espaço na sequência A, menos o número de resíduos de espaço na sequência B, na soma dos equivalentes de resíduo entre a sequência A e a sequência B, vezes cem. Os espaços de baixa ou de nenhuma homologia entre as duas sequências de amino ácido não estão incluídas na determinação da semelhança de percentagem. A semelhança de percentagem pode ser calculada por outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por se fazer variar as condições de hibridização, e pode ser calculada electronicamente usando programas tais como o programa MEGALIGN. (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin). 0 termo "subunidade de colagénio" refere-se a sequência de amino ácido de uma cadeia de polipéptido de uma proteína de colagénio codificada por um único gene, bem como quaisquer derivados que sequenciam, incluindo os derivados de remoção, substituições conservadoras, etc.

Uma "proteína de fusão" é uma proteína na qual as sequências de péptido d® proteínas diferentes covaientemente ligadas em conjunto.

Uma "sequência de anti-sentido" é qualquer sequência capaz de especificamente hibridização a urra sequência alvo. A sequência de anti-sentido pode ser ADN, ARN, ou qualquer mímico ou análogo de ácido nucleico. 0 termo "tecnologia de anti-sentido" refere-se a qualquer tecnologia que conta com a hibridização especifica de uma sequência de anti-sentido a uma sequência alvo. 0 termo "equivalente funcional", tal como aqui usado refere-se a uma proteína ou molécula de ácido nucleico que possui características funcionais ou estruturais para o fragmento de CTGF. Um equivalente funcional de um fragmento de CTGF pode conter modificações dependendo da necessidade de tais modificações para o desempenho de uma função específica. 0 termo "equivalente funcional" é entendido para incluir fragmentos, mutantes, híbridos, variantes, análogos, ou derivados químicos de uma molécula.

Uma molécula é tida como um "derivado químico" de outra molécula quando contém fracções químicas adicionais não normalmente uma parte da molécula. Tais fracções podem melhorar a solubilidade da molécula, a absorção, a meia vida, biológica, e os semelhantes. As fracções podem reduzir alternativamente a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, e os semelhantes. As fracções capazes de mediar tais efeitos são reveladas, por exemplo, em Gennaro, A. R., editores, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 11* edição, Mack Publishing Co, Easton PA. Os procedimentos para ligar tais fracções a uma molécula são bem conhecidos na técnica.

Uma "variante", tal como aqui usada, refere-se a uma sequência de amino ácido que é alterada por um ou mais amino ácidos. A variante pode ser modificações conservadoras, em que um amino ácido substituído tem propriedades químicas ou estruturais semelhantes, per exemplo, a substituição de leucira com isoleucina. Mais raramente, variante pode r não conservadoras, por exemplo, a substituição de uma giicina com um triptofano. As variações menores análogas podem também incluir deleções ou inserções de amino ácido, ou ambas. A orientação em determinar quais os resíduos de amino ácido que podem ser substituídos, inseridos, ou deletados pode ser verificada por se usarem programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, o programa de computador DNASTAR {DNASTAR Inc., Madison, WI).

Métodos Para Fazer Fragmentos de CTGF

Sequência de Ácido Nucleico que Codificam o CTGF. De acordo com a invenção, as sequências de nucleótido que codificam o CTGF ou os seus equivalentes funcionais, como descrito na Patente norte americana N°. 5 408 040, podem ser usadas para gerar moléculas de ADN recombinante que dirigem a expressão da proteína de comprimento completo ou de um seu equivalente funcional, ou alternativamente, as sequências de nucleótido que codificam o fragmento de GTGF desejado, por exemplo, em células hospedeiras apropriadas, compreendendo um fragmento pelo menos uma parte de exões 2 ou 3 do CTGF.

Alternativamente, as sequências de nucleótido as quais hibridizam, sob uma posição rigorosa, a porções da sequência CTGF também podem ser usadas em ensaios de hibridização de ácido nucleico, análises de rnancheamento de Southern e Northern, etc. ainda num outro método, as moléculas de ADN que codificam o CTGF podem ser isoladas por procedimentos de hibridização que compreendem a filtração de anticorpo dos bancos de expressão para detectar características estruturais partilhadas.

Devido à degeneração inerente dc código genético, outras sequências de ADN as quais codificam proteínas de amino ácido substancial ou uma sequência de amino ácido funcionalmente equivalente, podem ser isoladas e usadas na prática da invenção para a clonagem e expressão de CTGF ou do fragmento de CTGF. Tais sequências de ADN incluem aquelas que são capazes de hibridizar para a sequência de CTGF humano sob condições rigorosas.

As sequências de ADN alteradas que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem deleções, adições ou substituições de resíduos de nucleótido diferentes resultando numa sequência que codifica o mesmo ou um produto de gene funcionalmente equivalente. 0 próprio produto de gene pode conter deleções, adições ou substituições de resíduos de amino ácido dentro da sequência de CTGF, a qual resulta numa modificação silenciosa produzindo assim uma proteína funcionalmente equivalente. Tais substituições de amino ácido podem ser feitas com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os amino ácidos negativamente carregados incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico; os amino ácidos positivamente carregados incluem a lisina e a arginina; os amino ácidos com grupos principais polares não carregados que têm valores de hidrofilicidade semelhantes incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina; glicina, analina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalamina, tirosina.

As sequências de ACN da invenção podem ser projectadas com a finalidade de alterar a sequência de proteína para uma variedade de finalidades incluindo mas não limitada a alterações que modificam o processamento e a expressão do produto de gene. Por exemplo, as mutações podem ser introduzidas usando técnicas que são bem conhecidas na técnica, por exemplo, a mutagénese dirigida ao local, por exemplo, para inserir novos locais de restrição. Por exemplo, em certos sistemas de expressão tais como leveduras, as células hospedeiras podem glicosilar em excesso o produto de gene. Quando se utilizam tais sistemas de expressão pode ser preferido alterar a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF para eliminar qualquer local de glicosilação ligado por N. A sequência de CTGF ou do fragmento de CTGF pode ser ligada a uma sequência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, para a filtração dos bancos de péptidos pode ser útil codificar uma proteína de CTGF quimérica que expressa um epítopo heterólogo que é reconhecido por um anticorpo comercialmente disponível. Uma proteína de fusão também pode ser projectada para conter um local de clivagem localizado entre a sequência de CTGF ou de fragmento de CTGF e a sequência de proteína heteróloga (por exemplo uma sequência que codifica o factor de crescimento relacionado com o PDGF), para que o CTGF ou um fragmento de CTGF possa ser clivado longe da fracção heteróloga. Tais métodos são conhecidos na técnica. A sequência que codifica o CTGF ou um fragmento de CTGF também pode ser sintetizada no todo ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na técnica. (Ver, por exemplo, Caruthers et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233/ Crea e Horn, 1980, Nucleic Acids Res. 9(10):2331/ Matteuccí e Caruthers, 1980, Tetrahedron Leters 21:719; e Ghow e Kempe, 1981, Nucleic Acids Res. 2(12): 2807-2817). Alternativamente, a própria proteína pode ser produzida usando métodos químicos para sintetizar a sequência de amino ácido de CTGF no todo ou em parte. Por exemplo, os péptidcs podem ser sintetizados por técnicas ae fase sólida, clivados a partir da resina, e purificados por cromatografia liquida de elevado desempenho preparativo. Ver por exemplo, Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principies, W. H. Freeman and Co, Nova Iorque, páginas 50-60. A composição dos péptidos sintéticos pode ser confirmada pela análise ou a sequenciação do amino ácido. Por exemplo, para o procedimento de degradação de Edman, ver, Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principies, W. H. Freeman and Co, Nova Iorque, páginas 34-49.

Expressão de CTGF Ou um Fragmento de CTGF. Com a finalidade de expressar um fragmento de CTGF biologicamente activo, a sequência de nucleótido que codifica para a proteína de comprimento completo, ou um equivalente funcional como descrito em cima, o fragmento de CTGF é inserido num vector de expressão apropriado, isto é, um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e a translação da sequência de codificação inserida.

Mais especificamente, os métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser usados para construir vectores de expressão que contêm a sequência de CTGF ou do fragmento de CTGF e sinais de controlo transcripcional/translacíonal apropriados. Estes métodos incluem as técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e de recombinação in vivo/recombinação genética. Ver por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque e Ausubel et al., 1989, Current Protocole in Moi&suiâr Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova Iorque.

Uma variedade de sistemas de vector de expressão hospedeira podem ser utilizados para expressar a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF. Estes incluem mas não são limitados a microrganismos tais como as bactérias transformadas com o ADN de bacteriófago recombinante, os vectores de expressão de ADN de plasmideo ou de ADN de cosinídeo que contêm a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF; levedura, incluindo a Pichia pastoris e a Hansenula polymorpha, transformadas com vectores de expressão de levedura recombinante que contêm a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF; sistemas de células de insectos infectados com vectores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, bacculovirus) que contêm a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, o vírus de mosaico da couve-flor, CaMV; o vírus de mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vectores de expressão de plasmídeos recombinantes (por exemplo, o plasmideo Ti) que contém a sequência que codifica o CTGF e o fragmento de CTGF; ou sistemas de células dos animais infectados com vectores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo o adenovírus, o vírus da vacina, as células de tumor humanas (incluindo HT-1080)) incluindo as linhas de células projectadas para conter múltiplas cópias do ADN de CTGF de maneira estável amplificada (CHO/dhfr) ou de maneira não estável amplificada em cromossomas pequenos duplos (por exemplo, as linhas de células de murinos). Como aqui usado, é entendido que o termo "sistemas de vector de expressão hospedeiros" e mais geralmente, o termo "células hospedeiras" inclui qualquer descendência da célula hospedeira ou do sistema de vector de expressão hospedeiro. É além disso entendido que embora toda a descendência possa náo ser idêntica à célula progenitora, uma vez que as mutações podem ocorrer durante a réplica, tais descendências estáo incluídas no âmbito da invenção.

Os elementos de expressão destes sistemas variam na sua resistência e especificidade. Dependendo do sistema de hospedeiro/vector utilizado, alguns de um número de elementos de transcrição e tradução convenientes, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, podem ser usados no vector de expressão. Por exemplo, aquando da clonagem em sistemas bacterianos, os promotores induzíveis tais como o pL do bacteriófago h, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido de ptrp-lac) e os semelhantes podem ser usados; aquando da clonagem em sistemas de células de insectos, os promotores tais como o promotor de poli-hedrina do bacculovirus podem ser usados; aquando da clonagem em sistemas de células de plantas, os promotores derivados do genoma de células de plantas (por exemplo, os promotores de choque de calor; o promotor para a subunidade pequena de RUBISCO; o promotor para a proteína de ligação a/b da clorofila) ou dos vírus de plantas (por exemplo o promotor de ARN 35S de CaMV; o promotor de proteína de revestimento de TMV) podem ser usados; aquando da clonagem em sistemas de células de mamíferos, os promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, o promotor de metalotioneina) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor que atrasa o adenovírus; o promotor 7.5K do vírus da vacina) pode ser usado; quando se geram linhas de células que contêm múltiplas cópias dos vectores a base de sV40, BPV e EBV do ADN de CTGF ou do fragmento de CTGF podem ser usados com um marcador seleccionável apropriado.

Em sistemas bacterianos, um número de vectores de expressão podem ser vantajosamente seleccionados dependendo da utilização entendida para o CTGF expresso ou para o fragmento de GTGF. Por exemplo, um vector conveniente para a expressão em bactérias inclui o vector baseado em T7 como descrito em Rosenberg, et al.r 1987, Gene 56:125. Corno exemplo adicional, quando grandes quantidades de CTGF ou do fragmento de CTGF têm que ser produzidas para filtrar bancos de péptidos, os vectores que dirigem a expressão de elevados níveis de produtos de proteína que são rapidamente purificados podem ser desejáveis. Tais vectores incluem mas não são limitados ao vector de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), no qual a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF pode ser ligada no vector na estrutura com a região de codificação de lac Z para que uma proteína de AS-lac Z híbrida seja produzida; vectores de pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acíds Res. 13: 3101-3109; Van Heeke e Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); e os semelhantes. Os vectores de pGEX também podem ser usados para expressar os polipéptidos exteriores tais como o CTGF ou um fragmento de CTGF com a S-transferase de glutationa (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas pela adsorsão a gotas de glutationa-agarose seguidas por eluição na presença de glutationa livre. Os vectores de pGEX são projectados para incluírem a trombina ou o factor Xa de locais de clivagem da protease para que o polipéptido clonado de interesse possa ser libertado da fracção de GST.

Mais geralmente, onde o hospedeiro é um procariota, as células competentes que são capazes de retenção do ADN podem ser preparadas a partir de células colhidas depois do crescimento exponencial e posteriormente tratadas pelo CaCl2, ou alternativamente MgCl2 ou RbCl, método que usa procedimentos bem conhecidos na técnica.

Onde a célula hospedeira é um eucaricta, vários métodcs de transferência de ADN podem ser usados. Estes incluem a transfecção do ADN por precipitados de fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais, incluindo a micro-injecção, a inserção de um plasmídeo envolvido em lipossomas, ou a utilização de vectores de vírus. As células eucarióticas também podem ser co-transformadas com sequências de ADN que codificam o polipéptido da invenção, e uma segunda molécula de ADN exterior que codifica um fenotipo seleccionável, tal como o gene da quinase de timidina simples de herpes. Um outro método é o de utilizar um vector virai eucariótico, tal como um vírus 40 de símio (SV40) ou um vírus do papiloma bovino, para infectar transitoriamente ou transformar as células eucarióticas e a proteína de expressão. Ver, Eukaryotic Virai Vectors, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, editor). As células hospedeiras eucarióticas incluem levedura, células de mamíferos, células de insectos e células de plantas.

Na levedura, um número de vectores que contêm promotores constitutivos ou induzíveis podem ser usados. Para uma revisão, ver por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ausubel et al., Ed., Greene Publish. Assoe. & Wiley InterScience, capítulo 13; Grant et al., 1987, Methods in Enzymology, Wu & Grossman, Edições, Acad. Press, Nova Iorque, 153: 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C., capítulo 3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger & Kimmel, Edições, Acad. Press, Nova Iorque, 152: 673-684; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Strathern et al., Edições, Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II. Por exemplo, vários vectores de efeito duplo para a expressão de genes exteriores na Levedura foram relatados. Heinemann, et al., 1989, Nature 340: 205; Rose, et al., 1987, Gene 60: 237.

Nos casos em que os vectores de expressão de plantas são usados, a expressão da sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF pode ser dirigida por qualquer de -um número de promotores. Por exemplo, os promotores virais tais como os promotores de ARN 35$ e de ARN 153 de CaMV (Brisson et ai., 1984, Mtfcdrs? 310: 511-514}, ou o promotor da proteína de revestimento de TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307-311) podem ser usados; alternativamente, os promotores de plantas tais como a subunidade pequena de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838-843); ou os promotores de choque ao calor, por exemplo, o hspl7.5-E ou o hspl7.3-B do feijão de soja (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559-565) podem ser usados. Estes constructos podem ser introduzidos nas células de plantas que usam os plasmídeos de Ti, os plasmídeos de Ri, os vectores de vírus de plantas, transformação de ADN directa, a micro-injecção, a electroporação, etc. Para revisão de tais técnicas, ver, por exemplo, Weissbach e Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Nova Iorque, Secção VIII, paginas 421-463; Grierson e Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2* edição, Blackie, Londres, capítulo 7-9.

Num sistema de insectos, um sistema de expressão alternativo pode ser usado para expressar o CTGF ou um fragmento de CTGF. Num tal sistema, o bacculovirus é usado como um vector para expressar os genes exteriores. O vírus depois cresce nas células dos insectos. A sequência que codifica o GTGF ou o fragmento de CTGF pode ser clonada em regiões não essenciais (por exemplo o gene da poli-hedrina) do vírus e colocada sob controlo de um promotor de bacculovirus. Estes vírus recombinantes são depois usados para infectar as células de insectos nas quais o gene inserido é expresso. Ver, por exemplo, Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, Patente norte americana N°. 4 215 051.

Nas células hospedeiras de mamíferos, um número de sistemas de expressão baseados em vírus podem ser utilizados. Em casos em que um adenovírus é usado como um vector de expressão, a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/translação do adenovírus, por exemplo, o último promotor e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode depois ser inserido no genoma do adenovírus através de recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, a região EI ou E3) vai resultar num virus recombinante que é viável e capaz de expressar o GTGF ou um fragmento de CTGF em hospedeiros infectados. Ver por exemplo, Logan e Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 1: 3655-3659. Alternativamente, o promotor 7.5K da vacina pode ser usado. Ver, por exemplo, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. 79: 4927-4931.

Numa outra forma de realização, a sequência de CTGF ou de fragmento de CTGF é expressa em células de tumor humanas, tais como HT-1080, que foram de maneira estável transfectadas com a precipitação de fosfato de cálcio e um gene de resistência a neomicina. Ainda numa outra forma de realização, o vector de expressão pMSXND ou semelhante é usado para a expressão em várias cklulas de mamíferos, incluindo as células COS, BHK 293 e CHO. Lee e Nathans, 1988, J. Biol. Chem. 263: 3521.

Os sinais de iniciação específicos também podem ser necessários para a translação eficiente das sequências que codificam o GTGF ou o fragmento de CTGF inserido. Estes sinais incluem a iniciação do codão de ATG e as sequências adjacentes. Nos casos em que o gene de CTGF inteiro, incluindo o seu próprio codão de iniciação e as sequências adjacentes, é inserido no vector de expressão apropriado, nenhuns sinais de controlo de translação adicionais podem ser necessários, entanto, nos casos em que só uma porção da sequência que codifica o CTGF é inserida, os sinais de controlo de translação exógenos, incluindo o codão de iniciação de ATG, devem ser fornecidos. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com a estrutura de leitura da sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF para assegurar a translação da inserção inteira. Estes sinais de controlo de translação exógenos e os codões de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos de aumento de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. Ver por exemplo, Bitter et al.r 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544. As sequências adicionais, isto é, as sequências líder, etc., podem ser adicionadas para dirigirem a secreção dos fragmentos de CTGF ao longo de vários caminhos secretórios. Isto pode ser acompanhado num número de sistemas de expressão que usam vários métodos conhecidos na técnica.

Além do mais, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida a qual modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto de gene na forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, a glicosilação) e o processamento (por exemplo, a clivagem) de produtos de proteína os podem ser importantes para a função da proteína. As células hospedeiras diferentes têm característicos e mecanismos específicos para o processamento e a modificação pós-translacional de proteínas. As linhas de células apropriadas ou os sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento correctos da proteína exterior expressa. Para esta finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento próprio do transcripto primário, glicosilaçãc, e a fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem mas não são limitadas a CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, HT-1080, etc..

Para a produção a longo prazo, de elevado rendimento das proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, as linhas de células que expressam de maneira estável o CTGF ou o fragmento de CTGF podem ser projectadas. Em vez de se usarem vectores de expressão que contêm origens virais de réplica, as células hospedeiras podem ser transformadas com o ADN do CTGF ou do fragmento de CTGF controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. Depois da introdução do ADN exterior, as células projectadas podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecidos, e depois são trocadas para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmideo recombinante confere resistência a selecção e permite que as células integrem de maneira estável o plasmideo nos seus cromossomas e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas de células.

Um número de sistemas de selecção pode ser usado, incluindo mas não limitado aos genes da quinase da timidina do vírus simples do herpes (Wígler, et ai., 1977, Cell 11: 223), da fosforibosiltransferase de hipoxantina-guanina (Szybalska e ou

Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 48: 2$2$}-4 e da fosforibosiltransferase a adenina í&ovy, et aí., 1980, Cell 22: 817) que pedem ser empregues em células de tk~, respectivamente.

Também, a resistência ao antimetabólito pode ser usada como a base de selecção para o gene de dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler, et al., 1980, Proc. Natl. Acad Sei. (EUA) 77: 3567; 0'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 78: 1527); o gpt, que confere a resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 78: 2072); o neo, que confere a resistência ao aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e o hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147). Recentemente, os genes seleccionaveis adicionais têm sido descritos, a saber o trpB, que permite que as células utilizem o índole em lugar de tritofano; o h.i&Pç que permite que as células utilizem histinol em vez da histidina (Hartman e Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 85: 8047); e o ODC (decarboxilase de ornitina) que confere resistência ao inibidcr de decarboxilase de ornitina, 2- (dífluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory). O isolamento e a purificação de polipéptidos expressos por células hospedeiras da invenção pode ser por qualquer meio convencional tal como, por exemplo, as separações cromatográficas preparativas e as separações imunoiógicas tais como as que envolvem a utilização do anticorpo monocional ou policlonal.

Identificação de Transfectantes Ou Transformantes Que Expressam o CTGF Ou um Fragmento de CTGF. As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação e que expressam o produto de gene biologicamente activo podem ser identificadas pelo menos por quatro abordagens gerais: (a) a hibridização do ADN-ADN ou do ADN-ARN; (b) a presença ou a ausência de funções do gene "marcador(c) a avaliação do nível de transcrição como medido pela expressão dos transcríptos de ARNm de CTGF ou do fragmento de CTGF na célula hospedeira; e (d) a detecção do produto de gene como medido por um ensaio ou pela sua actividade biológica.

Na primeira abordagem, a presença da sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF inserida no vector de expressão pode ser detectada por hibridização de ADN-ADN ou de ADN-ARN usando sondas que compreendem sequências de nucleótido que são homólogas a sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF, respectivamente, ou às suas porções ou derivados.

Na segunda abordagem, o sistema de vector/hospedeiro de expressão recombinante pode ser identificado e seleccionado baseado na presença ou na ausência de certas funções do gene "marcador" (por exemplo, a resistência a antibióticos, a resistência a metotrexato, a transformação do fenótipo, a formação do corpo de oclusão em bacculovirus, etc.). Por exemplo, numa forma de realização preferida, a sequência de codificação do CTGF é inserida dentro de uma sequência do gene marcador de resistência a neomicina do vector, e recombinantes que contêm a sequência de codificação do CTGF podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador, Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado em paralelo com a sequência de CTGF sob o controlo do mesmo promotor ou diferente usado para controlar a expressão da sequência de codificação do CTGF. A expressão do marcador em resposta à indução ou selecção indica a expressão da sequência de codificação do CTGF.

Na terceira abordagem, a actividade transcripcicnal da região que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF pode ser avaliada por ensaios de hibridização. Por exemplo, o ARN pode ser isolado e analisado pelo mancheamanto de Northern que usa uma sonda homóloga à sequência que codifica o CTGF ou o fragmento de CTGF ou as suas porções particuladas. Alternativamente, os ácidos nucleicos totais da célula hospedeira podem ser extraídos e ensaiados para a hibridização a tais sondas. A quarta abordagem envolve a detecção do produto de gene do CTGF ou do fragmento de CTGF biologicamente activo ou imunologicamente reactivo. Um número de ensaios podem ser usados para detectar a actividade de CTGF incluindo, mas não limitado aos ensaios descritos na Patente norte americana N°. 5 408 040.

Clivagem da Proteína de CTGF de Comprimento Completo para Produzir o Fragmento de CTGF. A seguir a expressão da proteína de CTGF de comprimento completo, a proteína pode ser clivada por qualquer número de enzimas proteoliticas conhecidas de um especialista vulgar na técnica para resultar nos fragmentos de CTGF da presente invenção. Por exemplo, a ponte livre de cisteína entre as metades de terminal N e de terminal C de CTGF são susceptíveis a químiotripsina usando métodos disponíveis na técnica.

Métodos para Modular e Inibir a Actividade de Fragmentos de CTGF

Gomo descrito em cima, os fragmentos de CTGF descritos nesta invenção são um determinante crítico da deposição da matriz extracelular em condições fibrótícas. A presente invenção prove métodos para a prevenção e o tratamento de ccmplicações associadas com a actividade dos referidos fragmentos por regular, modular, e/ou inibir a actividade e/ou a expressão de tais fragmentos, ou se desejável aumentar a actividade de tais , Mais especificamente, os métodos da presente invenção proveem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que regula, modula, e/ou inibe a matriz extracelular que produz a actividade dos fragmentos de terminal N do CTGF, como desejado, para tratar, prevenir ou melhorar as doenças, ou desordens associadas com a expressão e a actividade do CTGF.

Anticorpos. Numa forma da realização da presente invenção, um método envolve a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que especificamente reage com os fragmentos de CTGF da presente invenção. Os anticorpos especificamente reactivos com o CTGF são descritos na Patente norte americana N°. 5 783 187 e na publicação de PCT, WO 9638172. Os anticorpos de CTGF podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos de cadeia singular policlonais, monoclonais, quiméricos, bem como os fragmentos de Fab, incluindo os fragmentos F} s e F,. Os fragmentos podem ser produzidos, por exemplo, por um banco de expressão de Fab. Os anticorpos de neutralização, isto é, aqueles que inibem a formação de dimero, são especialmente preferidos para a utilização terapêutica.

Um polipéptido alvo, tal como o CTGF ou um agente que modula a actividade e ou a expressão de CTGF, pode ser avaliado para determinar regiões de elevada imunogenicidade. Os métodos de analise e selecção do epitopo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Ausubel, et aleditores, 1988, Current Prctocols in Molecular Biolcgy. Ά analise e a selecção também podem ser acompanhadas, por exemplo, por vários pacotes de programas de computador, tal como o programa de computador LASERGENE NAVIGATOR. (DNASTAR; Madison WI) . Os péptidos ou os fragmentos usadcs para induzirem anticorpos devem ser antigénicos, mas não são necessariamente biologicamente activos. De um modo preferido, um fragmento ou péptido antigénico é pelo menos de 5 amino ácidos em comprimento, de um modo mais preferido, pelo menos de 10 amino ácidos em comprimento, e de um modo o mais preferido, pelo menos de 15 amino ácidos em comprimento. É preferível que o fragmento que induz o anticorpo ou o péptido seja idêntico pelo menos a uma porção da sequência de amino ácido do polipéptido alvo, por exemplo, o CTGF. Um péptido ou o fragmento que imita pelo menos uma porção da sequência do polipéptido alvo que ocorre naturalmente pode também ser fundido com outra proteína, por exemplo, a hemocianina do orifício da lapa (KLH), e os anticorpos podem ser produzidos contra a molécula quimérica.

Os métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, vários hospedeiros, incluindo cabras, coelhos, ratos, murganhos, seres humanos, e outros, podem ser imunizados por injecção com o polipéptido alvo ou qualquer um seu fragmento ou péptido imunogénico. Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar uma resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas não são limitados ao adjuvante de Freund, géis minerais tais como o hidróxido de alumínio, e substâncias de superfície activa tais como lisolecitina, os polióis plurónicos, os polianiões, os péptidos, as emulsões de óleo, o KLH, e o dinitrofenol. Entre os adjuvantes usados em seres humanos, o BCG (bacilos de Calmette Guerin) e os Corynebacterium parvum são especialmente preferidos.

Os anticorpos monoclonais e policlonaís podem ser preparados por se utilizar qualquer técnica que piwê a produção de moléculas dá anticorpo por linhas de células contínuas em cultura. As técnicas para a produção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Pound, J. D., 1998, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; Harlow, E. e D. Lane, 1988, Antibodies, A Lakoratcrv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque. A produção de anticorpos quiméricos e também bem conhecida, como é a produção de anticorpos de cadeia única. Ver, por exemplo, Morrison, S. L. et «I,,· 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 6851-6855; Neuberger, M. S. et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al., 1985 Nature 314: 452-454. Os anticorpos com especificidade relacionada, mas de composição idiotipica distinta, podem ser gerados, por exemplo, por inversão da cadeia dos bancos de imunoglobina combinatória aleatória. Ver, por exemplo, Burton D. R., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 11120-11123.

Os anticorpos também podem ser produzidos por se induzir a produção in vivo na população de linfócitos ou por se filtrarem bancos ou painéis de imunoglobulina de reagentes de ligação altamente específicos. Ver, por exemplo, Orlandi, R. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 3833-3837; Winter, G. e C. Milstein, 1991, Nature 349: 293-299). Os fragmentos de anticorpo que contêm locais de ligação específicos para o polipéptido alvo também podem ser gerados. Tais fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados aos fragmentos de F(ab')2, os quais podem ser produzidos pela digestão da pepsina da molécula de anticorpo, e os fragmentos de Fab, os quais podem ser gerados por se reduzirem as pontes de dissulfeto dos fragmentos de Ffqb* s;>, Alternativamente, os bancos de expressão de Eab podem ser construídos para permitir uma identificação rápida e fácil dos fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada. Ler, por exemplo, Huse, SL D., et ai., 1989 Science 254: 1275-1281.

Os anticorpcs podem ser testados para a actividade de polipéptido anti-alvo por se utilizar uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Várias técnicas podem ser usadas para a filtração para anticorpos de identificação que tfe a especificidade desejada, incluindo vários imunoensaios, tais como os ensaios imunosorventes ligados por enzimas (ELISAs), incluindo s ELISAs de captura de ligando e directos, os radioimunoensaios (RIAs), imunomancheamento, e classificação da célula activada fluorescente (FACS). Os protocolos numerosos para a ligação competitiva ou os ensaios imunoradiométricos, utilizando quer anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades estabelecidas, são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlowand Lane. Tais imunoensaios envolvem tipicamente a medição da formação complexa entre o polipéptido de alvo e um anticorpo específico. Um imunoensaio de dois locais, de base monoclonal que utiliza anticorpos monoclonais reactivos para dois epitopos de não interferência no polipéptido alvo é preferido, mas outros ensaios, tais como um ensaio de ligação competitivo, também podem ser empregues. Ver, por exemplo, Maddox, D. E., et al, 1983, J Exp Med 158: 1211. A presente invenção contempla a utilização de anticorpos especificamente reactivos com um polipéptido de CTGF ou os seus fragmentos os quais neutralizam a actividade biológica dos fragmentos de CTGF da presente invenção. 0 anticorpo administrado no método pode ser o anticorpo intacto ou os seus fragmentos de ligação de antigénio,· tais como os fragmentos de Fab, e F,, os quais são capazes de ligar o determinante epitópico. Os anticorpcs utilizados no método podem ser anticorpos policlonais ou, de um modo mais preferido, monoclonais. Os anticorpos monoclonais com diferentes especificidades epítópícas são feitos de fragmentos ou to proteínas que contêm o antigénio por métodos fesos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kokler et al., Nature 256: 494; Ausubel, et al.f supra.

Na presente invenção, as aplicações terapêuticas incluem os que usam anticorpos "humanos" ou "humanizados" dirigidos a CTGF ou os seus fragmentos, Os anticorpos humanizados são anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, que têm a mesma especificidade de ligação que um anticorpo progenitor, (isto e, tipicamente de origem do rato) e caracteristicas humanas aumentadas. Os anticorpos humanizados podem ser obtidos, por exemplo, por inverter a cadeia ou por se usar a tecnologia de exposição de fago. Por exemplo, um polipéptido que compreende um domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo específico não humano para um CTGF é combinado com um repertório de domínios variáveis de cadeia (leve ou pesada) complementar humana. As uniões híbridas específicas para o antigénio de interesse são seleccionadas. As cadeias humanas das uniões seleccionadas podem depois ser combinadas com um repertório de domínios variáveis complementares humanos (pesados ou leves) e os dímeros de polipéptido de anticorpo humanizado podem ser seleccionados para a especificidade de ligação para um antigénio. As técnicas descritas para a geração de anticorpos humanizados que podem ser usadas no método da presente invenção são divulgadas, por exemplo, nas Patentes norte americanas Nos 5 565 332; 5 585 089; 5 694 761; e 5 693 762. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos humanos em ratos transgénicos são descritas, por exemplo, nas Patentes norte americanas Nos. 5 545 806 e 5 569 825.

Oligonucleótidos de Anti-sentido. A presente invenção provê uma abordagem terapêutica a qual interfere directamente com a translaçãc de mensagens de CTGF, e especificamente as mensagens do CTGF de comprimento completo (em que a proteína de comprimento completo é depois clivada para formar um fragmento de CTGF da presente invenção) ou o fragmento de CTGF (colectivamente "ARNm de CTGF"), na proteína. Mais especificamente, a presente invenção fornece um método em que o ácido nucleico ou as ribozimas de anti-sentido são usados para se ligarem a ou clivarem o ARNm de CTGF. As moléculas de ADN ou de ARN de anti-sentido ligam-se especificamente com a mensagem de ARN de um gene alvo, interrompendo a expressão do produto de proteína daquele gene. 0 anti-sentido liga-se ao ARN mensageiro que forma uma molécula de cordão duplo que não pode ser traduzida pela célula. Além do mais, os grupos quimicamente reactivos, tais como o ácido etilenodiaminotetra-acético ligado por ferro (EDTA-Fe) podem ser ligados a um oligonucleótido de anti-sentido, causando a clivagem do ARN no local de hibridização. Estas e outras utilizações de métodos de anti-sentido para inibir a tradução de genes são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Marcu-Sakura, 1988, Anal. Biochem 177: 278.

Mais especificamente, numa forma de realização da invenção, a sequência de um polinucleótido de anti-sentido útil para inibir a expressão do ARNm de CTGF pode ser obtida por se compararem as sequências de genes ortólogos (sequências que são conservadas entre espécies), ou os transcriptos de genes ortólogos, e a identificação de regiões altamente conservadas dentro de tais sequências. A semelhança nas sequências de ácido nucleico pode ser determinada por procedimentos e algoritmos que são bem conhecidos na técnica. Tais procedimentos e os algoritmos incluem, por exemplo, um programa de BLAST (Instrumento de Pesquisa de Alinhamento Local Básico no Centro Nacional da Informação Biológica), ALIGN, MSâS (Análise de Múltiplas Sequências Alinhadas), e AMPS (Alinhamento de Sequência Múltipla de Proteína).

Na selecção do comprimento preferido para um dado polinucleótido, deve considerar-se que vários factores alcançam a maior parte das características favoráveis. Em um aspecto, os polinucleótidos da presente invenção são pelo menos de 15 pares de bases (bp) em comprimento e de um modo preferido de cerca de 15 a cerca de 100 bp em comprimento, De um modo mais preferido, os polinucleótidos são de cerca de 15 bp a cerca de 80 bp em comprimento e de um modo mesmo mais preferido, os polinucleótidos da presente invenção são de cerca de 15 a cerca de 60 bp em comprimento. Os polinucleótidos mais curtos, tais como de 10 a menos de 15-mers, enquanto oferece uma penetração na célula mais elevada, têm a especificidade do gene mais baixa. Ao contrário os polinucleótidos mais compridos de 20 a cerca de 30 bp oferecem melhor especificidade, e mostram uma cinética de absorção reduzida nas células. Ver Stein et al., "Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression", Cohen, editor, McMillan Press, Londres (1988). A acessibilidade a sequências alvo de ARN de transcripto também e importância para as regiões de formação de anel e as sequências ortólogas em ARNs alvo oferecem assim alvos prometedores. Nesta divulgação, o termo "polinucleótido" abrange ambas as fracções de ácido nucleico oligoméricas do tipo encontrado na natureza, tais como as estruturas de deoxiribonucleótido e de ribonucleótido de ADN e de ARN, e análogos feitos pelo homem os quais são capazes de se ligarem ao ácido nucleico encontrado na natureza. Os polinucleótidos da presente invenção podem ser baseados em monómeros de ribonucleótido ou de deoxiribonucleótido ligados por ligações de fosfosdiéster, ou per análogos ligados por fosfonaro de metilo, fosforotionato ou outras ligações. Também podem compreender fracções de monómero que alteraram as estruturas de base ou curras modificações, mas que ainda conservam a capacidade de ligação a estruturas de ARN de transcriptos que raturalmente ocorrem. Tais polinucleótidos podem ser preparados por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando maquinas e reagentes comercialmente disponíveis como aqueles disponíveis da firma Perkin-Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA). Por exemplo, os polinucleótidos específicos para um transcripto alvo são sintetizados de acordo com a metodologia padrão. Os polinucleótidos de ADN modificado de fosforotionato tipicamente são sintetizados no ADN automatizado sintetizado em sintetizadores de ADN automatizados disponíveis a partir de vários fabricantes. Estes instrumentos são capazes de sintetizar quantidades de nanomoles de polinucleótidos tão longos quanto 100 nucleótidos. Os polinucleótidos mais curtos sintetizados por instrumentos de modulador são muitas vezes convenientes para utilização sem purificação adicional. Se necessário, os polinucleótidos podem ser purificados por electroforese de gel de poliacrilamida ou por cromatografia de fase inversa. Ver, Sambrook, et al., Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, Vol. 2, capítulo 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989).

Os polinucleótidos ligados por fosfodiéster são especialmente susceptíveis a acção de nucleases no soro ou dentro de células, e por conseguinte, numa forma de realização preferida, os polinucleótidos da presente invenção são análogos de fosfotionato ou ligados por fosfonato de metilo, os quais mostraram ser resistentes à nuclease. Os especialistas usuais na técnica podem facilmente seleccionar outras ligações par utilização nesta invenção. Estas modificações também podem ser projectadas para melhorar a absorção celular e à estabilidade dos polinucleótidos.

Um portador apropriado para a administração de um polinucieótido pode incluir, o exemplo, vectores, anticorpos, composições farmacológicas, proteínas de ligação ou de retorno, ou sistemas de libertação virais para o enriquecimento para a sequência na célula ou tecido alvo. Um polinucleótido da presente invenção pode ser ligado, por exemplo, a uma proteína de ligação a qual reconhece células endoteliais ou células de tumor. A seguir a administração, um polinucleótido da presente invenção pode ser visado a uma célula ou tecido recipiente de tal forma que a expressão aumentada, por exemplo, de citoquinaç, factores de transcrição, receptores ligados a proteína G, proteínas supressoras de tumor, e proteínas de iniciação de apoptose podem ocorrer. A libertação de moléculas de anti-sentido e semelhantes pode ser realizada usando um vector de expressão recombinante tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Vários vectores virais que podem ser utilizados para a terapia de gene como aqui ensinado incluem o adenovírus, o vírus de herpes, a vacina ou de um modo preferido um vírus de ARN tal como um retrovírus. Várias retroviruses conhecidas podem transferir ou incorporar um gene para um marcador seleccionável para que as células transformadas possam ser identificadas e geradas. Por se inserir uma sequência de polinucleótido de interesse no vector virai, juntamente com um outro gene que codifica o ligando de um receptor numa célula alvo específica, por exemplo, o vector é o objectivo específico. Os vectores retrovirais podem ser tornados alvos específicos por se inserir, por exemplo, um polinucleótido que codifica um açúcar, um glicclípido ou uma proteína. Os alvos preferidos são realizados por se utilizar um anticorpo para visar o vector retroviral. Os especialistas usuais na técnica saberão, ou podem apurar rapidamente sem experimentação excessiva, as sequências de polinucleótido específicas as quais podem ser inseridas no genoma retroviral para permitir a libertação específica de alvo do vector retroviral que contem o polinucleótido anti-sentido.

Uma que os retrovírus recombinantes são incorrectos, eles necessitam de ajuda para produzir partículas vectoriais infecciosas. Esta ajuda pode ser fornecida, por exemplo, por se utilizarem linhas de células ajudantes que contêm plasmídeos que codificam todos os genes estruturais do retrovírus sob o controlo de sequências reguladoras dentro do LTR. Estes plasmídeos fazem falta a uma sequência de nucleótido que permite ao mecanismo de embalagem reconhecer um transcripto de ARN para encapidação. As linhas de células ajudantes que têm eliminações do sinal de embalagem incluem mas não são limitadas a Ψ2, PA317 e PA12. Estas linhas de células produzem viriões vazios, uma vez que nenhum genoma é embalado. Se um vector retroviral for introduzido em tais células nas quais o sinal de embalagem é intacto, mas os genes estruturais são substituídos por outros genes de interesse, o vector pode ser embalado e produzido o vector virião.

Alternativamente, o NIH 3T3 ou outras células de cultura de tecido podem ser directamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol, e env, por transfecção do fosfato de cálcio convencional. Estas células são depois transfectadas com o plasmídeo do vector que contém os genes de interesse. As células resultantes libertam o vector retroviral no meio de cultura. base de lípidos,

Um outro sistema de libertação alvo para as moléculas de anti-sentido é um sistema de dispersão coloídal. Os sistemas de dispersão coloidais incluem complexos de nanocápsulas, microesferas, gotas e sistemas incluindo as emulsões de óleo em água, os micelos, os micelos e os lipossomas misturados. 0 sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossoma. Os lipossomas são vesículas de membrana artificial que são úteis como sistemas de libertação in vivo e in vitro. Tem sido mostrado que grandes vesículas unilamelares (LUV) , as quais variam em tamanho de 0,2-4,0 pm podem encapsular uma percentagem substancial de um tampão aquoso que contém grandes macro-moléculas. 0 ARN, o ADN e os virices intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e serem libertados a células de uma forma biologicamente activa. Para que um lipossoma seja um veículo de transferência de gene eficaz, as características seguintes devem estar presentes: (1) a encapsulação dos genes de interesse a elevada eficiência enquanto não comprometem a sua actividade biológica; (2) a ligação preferida e substancial a uma célula alvo em comparação com células não alvo; (3) a libertação dos conteúdos aquosos da vesícula ao citoplasma da célula alvo a elevada eficiência; e (4) a expressão exacta e eficaz de informação genética.

Inibidores de Molécula Pequena. A presente invenção fornece adicionalmente um método no qual as moléculas pequenas que inibem a actividade do fragmento de CTGF da presente invenção são identificados e utilizados. A identificação de moléculas pequenas que inibem a actividade do fragmento de CTGF pode ser conduzida por várias técnicas de filtração. Para filtrar os compostos, o ensaio vai prover um sinal detectável associado com a ligação do composto a uma proteína ou alvo celular. Dependendo da natureza do ensaio, o sinal detectável pode ser de absorvência ou emissão leve, de formação d* placa ou de outro sinal conveniente. 0 resultado pode ser qualitativo cu quantitativo. Para filtrar os compostos para ligação específica, vários imunoensaios podem ser empregues para detectar os anticorpos de seres humanos (ou de primatas) ligados as células. Assim, pode utilizar-se anti-hlg, por exemplo, anti-hlgM, hlgG ou as suas combinações para detectar o anticorpo humano especificamente ligado do epítopo de galactosilo. Vários marcadores podem ser usados tais como radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, partículas, etc. Há numerosos conjuntos comercialmente disponíveis de fornecimento de anti-hlg marcado, que pode ser empregue de acordo com o protocolo do fabricante. Vários protocolos podem ser empregues para filtrar um banco de compostos químicos. A algum grau, a selecção do protocolo apropriado vai depender da natureza da preparação dos compostos. Por exemplo, os compostos podem ser ligados a partículas individuais, pinos, membranas, ou semelhantes, em que cada um dos compostos é segregado. Alem do mais, a quantidade de composto disponível vai variar, dependendo do método empregue para criar o banco. Alem disso, dependendo da natureza da ligação do composto ao suporte, cada um pode ser capaz de libertar alíquotas de um composto, para levar a cabo uma série de ensaios. Além do mais, a maneira pela qual os compostos são ensaiados vai ser afectada pela capacidade de identificar o composto qual mostrou ter actividade. sao

Onde os compostos estão individualmente numa superfície de uma rede, para que em cada local da rede se saiba o que a composição é, pode-se fornecer um tecido celular o qual é organizado de forma semelhante como uma rede e pode ser colocado em registo com os compostos ligados à superfície sólida. Logo que o tecido e o substracto sólido estejam no registo, pode iibertar-se o* compostos da superfície de acordo com a maneira pela qual os compcçlóç ligados. Depois de um período suficiente para os compostos se ligarem às proteínas na superfície celular, pode lavar-se o tecido celular para remover os compostos não especificamente ligados. Uma ou várias lavagens podem estar envoividas, onde as lavagens podem prover para variar os graus de rigor, dependendo do grau desejado da afinidade. Depois das lavagens terem sido concluídas, o sangue ou o plasma de mamíferos pode depois ser adicionado e incubado durante o tempo suficiente para a citotoxicidade. 0 plasma ou o sangue podem depois ser removidos e as placas observadas, onde a natureza do composto pode ser determinada em virtude da posição na rede. Naturalmente, o plasma ou o sangue devem ser livres de quaisquer componentes os quais iriam naturalmente matar as células do tecido.

Uma vez que o processo preparativo pode ser repetido, pode-se preparar uma pluralidade de substratos sólidos, onde os mesmos compostos são preparados em locais comparáveis, para que a filtração possa ser repetida com as mesmas ou diferentes células para determinar a actividade dos compostos individuais.

Em alguns exemplos, a identidade do composto pode ser determinada por um marcador de ácido nucleico, usando a reacção de cadeia de polimerase para a amplificação do marcador. Ver, por exemplo, o documento W093/2Q242. Neste exemplo, os compostos que são activos podem ser determinados por se tomar o lisado e introduzir o lisado num meio de reacção de cadeia de polimerase que compreende iniciadores específicos para o marcador de ácido nucleico. Depois da expansão, pode-se sequenciar o marcador de ácido nucleico ou determinar a sua sequência por outros meios, os quais vão indicar o procedimento sintético usado para preparar o composto. Alternativamente, podem-se ter partículas marcadas onde os marcadores são libertáveis da partícula e fornecem um código binário que descreve o procedimento sintético para os compostos ligados à partícula. Ver, por exemplo, Ohlmeyer, et ai., PNAS EUA (1993) 90: 10922. Estes marcadores podem ser convenientemente uma série homóloga de compostos de alquileno, que podem ser detectados por captura de electrão por cromatografia de gás. Dependendo da natureza do grupo de ligação, pode-se prover uma libertação parcial das partículas, para que as partículas possam ser usadas 2 ou 3 vezes antes da identificação do composto particular.

Enquanto que a maior parte dos bancos tem sido discutida, qualquer grande grupo de compostos pode ser filtrado analogamente, contanto que o epitopo de CTGF possa ser juntado a cada um dos compostos. Assim, os compostos de fontes diferentes, tanto naturais como sintéticas, incluindo os macrólidos, os oligopéptidos, os ácidos ribonucleicos, os dendrímeros, etc., podem também ser filtrados de uma maneira análoga. A formação de uma placa no ensaio demonstra que a ligação do membro do banco a célula, normalmente uma proteína de superfície, não interfere com a ligação do epitopo de CTGF a um anticorpo, que o complexo imune é suficientemente estável para iniciar a cascata de complemento, e que o membro tem uma elevada afinidade para o alvo.

Outros métodos de filtração para se obterem moléculas pequenas que modulam a actividade dos fragmentos de CTGF da presente invenção são divulgados no Pedido de PCT, WO 9813351.

Formulações Farmacêuticas E Vias de Administração

Para identificar moléculas pequenas e outros agentes úteis nos presentes métodos para tratar ou prevenir uma desordem renal por se modular a actividade e a expressão de CTGF, o CTGF e os seus fragmentos bíolcgicamente activos podem ser usados para filtrar compostos terapêuticos em qualquer uma das várias técnicas de filtração. Os fragmentos empregues em tais testes de filtração podem ser livres em solução, afixados a um suporte sólido, iniciado numa superfície de célula, ou localizado intracelularmente. 0 bloqueio ou a redução da actividade biológica ou a formação de complexos de ligação entre o CTGF e o agente a ser testado podem ser medidos por métodos disponíveis na técnica.

Outras técnicas para a filtração de fármacos que fornecem uma elevada filtração de quantidade tratada de compostos que têm afinidade de ligação conveniente ao CTGF, ou a um outro polipéptido alvo útil em modulação, regulamento, ou inibição da expressão e/ou da actividade de CTGF, são conhecidas na técnica. Por exemplo, os compostos de teste que transportam as micro-matrizes podem ser preparados, usados, e analisados utilizando métodos disponíveis na técnica. Ver, por exemplo, Shalon, D. et al., 1995, Pedido de PCT No. W095/355Q5, Baldeschweiler et al., 1995, Pedido de PCT No. W095/251116; Brennan, T. M. et al., 1995, Patente norte americana No. 5 474 796; Heller, M. J. et al., 1997, Patente norte americana No. 5 605 662. A identificação de moléculas pequenas que modulam a actividade de CTGF também pode ser conduzida por várias outras técnicas de filtração, que também podem servir para identificar anticorpos e outros compostos que interagem com o CTGF e podem ser usados como fármacos e terapêuticos nos presentes métodos. Ver, por exemplo, Erma, c .·. J. et al., editores, 1998, Current Protocols in John Wiley and Sons. Os ensaios vão tipicamente fornecer sinais detectáveis associados com a ligação do composto a uma proteína ou alvo celular. A ligação pode ser detectada, por exemplo, por fluorosferas, conjugados de enzima, e outros marcadores detectáveis bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Enna et al. . Os resultados podem ser gualitativos ou guantitativos.

Para filtrar os compostos para ligação específica, vários imunoensaios podem ser empregues para detectar, por exemplo, anticorpos de seres humanos ou de primatas ligados as células. Assim, pode-se utilizar o anti-hlg marcado, por exemplo, o anti-hlgM, o hlgG ou as suas combinações para detectar o anticorpo humano especificamente ligado ao epítopo de galactosilo. Vários marcadores podem ser usados tais como os radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, partículas, etc. Há numerosos conjuntos comercialmente disponíveis que fornecem o anti-hlg marcado, que podem ser empregues de acordo com o protocolo do fabricante.

Para filtrar os compostos de efeitos de citotóxicos, uma larga variedade de protocolos pode ser empregue para assegurar que cada um tem a actividade desejada. Cada um vai usar normalmente células, que podem estar a ocorrer naturalmente ou modificadas, linhas de células, ou semelhantes. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, se se estiver interessado num agente patogéníco, onde não importa a que epítopo o conjugado de composto se liga, podem-se combinar células patogénicas com cada um dos compostos na presença de um sistema cítotóxico dependente de anticorpo para determinar e efeito de cítotóxico. Pode-se executar este ensaio antes de ou subsequente a determinação do efeito dos vários compostos candidatos em células do hospedeiro a quem o composto seria administrado. Deste modo, poder-se-ia obter uma análise diferencial entre a afinidade do alvo patogénico e a afinidade de células hospedeiras que poderiam ser encontradas, baseado no modo da administração.

Em algumas situações, poderia haver interesse numa posição celular particular, tal como um estado activado, como pode estar presente com as células T em doenças auto-imunes, transplantação, e semelhantes. Nesta situação deve-se primeiramente filtrar os compostos para determinar aqueles que se ligam a célula quiescente, e quanto aqueles compostos que não são de ligação as células quiescentes, e filtram os compostos candidatos remanescentes de citotoxicidade as células activadas. Pode-se depois filtrar outras células presentes no hospedeiro que poderiam ser encontradas pelos compostos para determinar o seu efeito citotóxico. Alternativamente, pode-se empregar células de cancro e células normais para determinar se algum dos compostos tem afinidade mais elevada para as células de cancro, comparando com as células normais. Mais uma vez, pode-se filtrar o banco de compostos para ligação a células normais e determinar o efeito. Aqueles compostos que não são citotóxicos para as células normais podem depois ser filtrados para o seu efeito citotóxico a células de cancro. Mesmo onde alguma citotoxicidade existe para as células normais, no caso de células de cancro, onde há uma diferenciação suficiente na actividade citotóxica, poderia estar-se disposto a tolerar a citotoxicidade mais baixa para as células normais, onde o composto é de outra maneira mostrado como sendo eficaz ccoí as células de cancro.

Em vez de se usarem células que são obtidas naturalmente, pode-se usar células que foram modificadas por técnicas recombinantes.

Assim, podem-se empregar células que podem ser cultivadas em cultura, as quais podem ser modificadas por se regular para cima ou regular para baixo um determinado gene. Deste modo, poderia ter-se células que se diferenciam quanto a uma proteina singular na superfície. Poder-se-ia depois ensaiar diferencialmente o banco quanto ao efeito de membros do banco em células para as quais a proteina particular está presente ou ausente. Deste modo, pode-se determinar se o composto tem a afinidade especifica para uma determinada proteina de membrana de superfície em oposição a quaisquer proteínas presentes na membrana de superfície.

Podem-se diferenciar as células por se utilizar a ligação de anticorpos a uma determinada proteína de membrana de superfície, onde os anticorpos não iniciam o efeito citotóxico dependente de complemento, por exemplo, usando espécies diferentes, isotipos, ou as suas combinações. Por se adicionarem os anticorpos, por se bloquearem os antisoros ou os anticorpos monoclonais, a uma porção das células, aquelas células não terão a proteína alvo disponível para ligação ao membro do banco. Deste modo criam-se células comparativas que se diferenciam na sua resposta baseada na indisponibilidade num grupo de uma proteína singular. Enquanto os anticorpos serão normalmente os reagentes mais conveniente de utilizar, outras entidades de ligação específicas podem ser empregues as quais fornecem a mesma função.

Para utilização no ensaio para determinar a ligação, pode-se usar um sistema citotóxico dependente de anticorpo. Podem-se usar misturas sintéticas dos ingredientes, onde só aqueles componentes necessários para o efeito citotóxico Éttiô presentes. Isto pode ser desejável onde os componentes de sangue ou de plasma podem afectar adversamente os resultados do ensaio.

Também, enquanto um tecido celular é uma forma extremamente conveniente de filtrar grandes números de candidatos, outras técnicas também podem encontrar utilização. Estas técnicas incluem a utilização de placas de várias cavidades, e vários dispositivos usados para a preparação do banco combinatório, tal como pinos, bolsas de chá, etc. Podem-se cultivar as células separadamente em relação a natureza dos vários dispositivos, onde o dispositivo pode depois ser contactado com as células ou ter as células cultivadas no dispositivo. 0 dispositivo pode ser imerso em uma cultura apropriada, disseminada com as células, ou de outra maneira fornecida para o contacto entre as células e o composto candidato. Depois de se adicionar o agente citotóxico, pode-se depois analisar para a lise de várias formas. Por exemplo, os FACS podem ser usados para se distinguirem entre células vivas e mortas, pode ser empregue a libertação de sup 51 Cr, ou a detecção de um composto intracelular no sobrenadante, pode servir para detectar os compostos activos.

Além do mais, pode-se desejar saber se o composto tem a actividade de antagonista ou de agonista. As técnicas de ensaio sujeitas fornecem um caminho rápido para determinar aqueles compostos presentes no banco que se ligam a proteína alvo. Logo que se narrou substancialmente o número de compostos candidatos, podem-se usar ensaios mais sofisticados para detectar a actividade do próprio composto. Deste modo, pode-se executar uma filtragem rápida para determinar a afinidade de ligação e a especificidade, seguida por uma filtragem mais intensiva para determinar a actividade. Existem várias técnicas para determinar a actividade, onde as células podem ser modificadas, para que um gene marcador seja activado o qual vai fornecer um sinal detectável. Convenientemente, o sinal pode ser associado com a produção de um corante, a produção de uma proteína de membrana de superfície que pode ser detectada com anticorpos marcados, ou a secreção de uma proteína que pode ser detectada no sobrenadante por qualquer de várias técnicas. Por exemplo, o qene que é expresso pode ser a luciferase modificada para ter uma sequência líder para ser assim segreqada, pelo qual o sobrenadante pode depois ser filtrado para a formação de geração de luz usando um substrato apropriado. Vários protocolos podem ser empregues para filtrar o banco. A algum grau, isto vai depender da natureza da preparação dos compostos. Por exemplo, os compostos podem ser ligados a partículas individuais, pinos, membranas, ou semelhantes, onde cada um dos compostos é segregável. Em adição, a quantidade de composto disponível vai variar, dependendo do método empregue para criar o banco. Além disso, dependendo da natureza da ligação do composto ao suporte, pode-se ser capaz de libertar alíquotas de um composto, para executar uma série de ensaios. Além do mais, a maneira na qual os compostos são ensaiados será afectada pela capacidade para identificar o composto o qual é mostrado como tendo actividade.

Onde os compostos estão individualmente numa superfície numa rede, para que em cada local da rede se saiba o que a composição é, pode-se fornecer um tecido celular o qual é do mesmo modo organizado como uma rede e pode ser colocado em registo com os compostcs ligados à superfície sólida. Logo que o tecido e o substrato sólido estão em registo, podem-se libertar os compostos da superfície de acordo com a maneira na qual os compostos são ligados. Depois de um período suficiente para que os compostos se liguem às proteínas na superfície celular, pode-se lavar o tecido celular para remover os compostos não especificamente ligados. Uma ou mais lavagens podem estar envolvidas, onde as lavagens podem fornecer graus variação de adstringência, dependendo do grau desejado de afinidade. Depois das lavagens terem sido concluídas, o sangue ou o plasma de mamíferos pode depois ser adicionado e incubado durante o tempo suficiente para a citotoxicidade. 0 plasma ou o sangue podem depois ser removidos e as placas observadas, onde a natureza do composto pode ser determinada em virtude da posição na rede. O plasma ou o sangue podem ser livres de quaisquer componentes que vão naturalmente matar as células do tecido.

Uma vez que o processo preparativo pode ser repetido, pode-se preparar uma pluralidade de substratos sólidos, onde os mesmos compostos são preparados nos locais comparáveis, para que a filtração possa ser repetida com as mesmas ou diferentes células para determinar a actividade dos compostos individuais. Em alguns exemplos, a identidade do composto pode ser determinada por um marcador de ácido nucleico, usando a reacção de cadeia de polimerase para a amplificação do marcador. Ver, por exemplo, o Pedido de PCT N°. WO93/20242. Neste exemplo, os compostos que são activos podem ser determinados por se tomar o lisado e por se introduzir o lisado num meio de reacção de cadeia de polimerase que compreende iniciadores específicos para o marcador de ácido nucleico. Depois da expansão, pode-se sequenciar o marcador de ácido nucleico ou determinar a sua sequência por outros meios, os quais vão dirigir a selecção do procedimento que é usado para preparar o composto.

Alternativamente, podem-se ter partículas marcadas onde os marcaacres são libertáveis da partícula e fornecem um código binário que descreve o procedimento sintético para os compostos ligados a partícula. Ver, por exemplo, Ohimeyer, et al., 1993, PNAS 90: 10922. Estes marcadores podem ser convenientemente uma série homóloga de compostos de alquileno, os quais podem ser detectados por captura de electrão por cromatografia de gás. Dependendo da natureza do grupo de ligação, pode-se fornecer uma ligação parcial das partículas, para que as partículas possam ser usadas 2 ou 3 vezes antes de se identificar o composto particular.

Enquanto que a maior parte dos bancos foi discutida, qualquer grande grupo de compostos pode ser filtrado analogamente, desde que o epítopo de CTGF possa ser juntado a cada um dos compostos. Assim, os compostos de fontes diferentes, tanto naturais como sintéticas, incluindo os macrólidos, os oligopéptidos, os ácidos ribonucleicos, os dendrímeros, etc., também podem ser filtrados de uma maneira análoga. A formação de uma placa no ensaio demonstra que a ligação do membro da banco a célula, normalmente uma proteína de superfície, não interfere com a ligação do epítopo de CTGF a um anticorpo, que o complexo imune é suficientemente estável para iniciar a cascata de complemento, e que o membro tem uma elevada afinidade para o alvo. A metodologia objecto pode ser usada em qualquer situação onde se tem um alvo celular a ser morto, particularmente os alvos celulares que têm baixo ou nenhum epítopo de CTGF. Assim, o alvo celular pode ser um procariota, o qual é patogénico. Vários organismos incluem, por exemplo, microbactérias, Yersinia, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Treponema pallídum, Neisseria gonorreia, Streptococcus, Hemophilus influenza, Outros agentes patogénicos incluem eucariotas, em particular fungos, tais como Candida, Histoplasma, etc., e protozoários, por exemplo, Giardia. klêm do mais, os vírus que fornecem proteínas de membrana de superfície em células infectadas, também podem ser o alvo dos compostos objecto, onde as células que são filtradas foram vitalmente infectadas.

As células hospedeiras também podem servir como alvos, onde as células são quer anormais ou actuam de uma forma adversa para o hospedeiro ou os tratamentos do hospedeiro. Por exemplo, os tecidos cancerosos que podem ser distinguidos de tecido normal podem servir como um alvo para os compostos objecto. As células T ou B associadas com doenças autoimunes ou associadas com o GVHD ou a rejeição de transplante também podem servir como alvos. As células aberrantes, apesar da sua natureza, contanto que possam ser distinguidas das células normais, também podem servir como alvo. Assim, as células infectadas com o vírus das lesões psoriáticas, as células de linfoma, bacterianas, fúngicas, parasíticas, podem ser alvos dos produtos objecto. Também, onde se deseja retirar cirurgicamente uma porção de células, sem a remoção de todas as células, tais como as células que expressam um marcador de diferenciação tais como os subconjuntos de célula T, plaquetas activadas, células endoteliais, células de expressão do receptor de citoquina ou de hormona, os compostos objecto podem encontrar aplicação.

Outros métodos de filtração para se obterem moléculas pequenas que modulam a actividade de CTGF podem ser encontrados, por exemplo, no Pedido de PCT N°. WO 9813153.

Compostos/Moléculas. A presente invenção fornece métodos para rratar e prevenir as doenças associadas com as desordens de CTGF e desordens por modularem, regularem, ou inibirem a actividade de CTGF ou dos fragmentos de CTGF da presente invenção. Estes métodos podem compreender a administração de stus quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que bloqueia as interacções de ligação ou bloqueia as enzimas envolvidas no caminho de transdução do sinal de CTGF. Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para inibir a actividade de CTGF por se administrarem compostos que bloqueiam a indução de CTGF.

Os compostos que modulam a expressão do gene de CTGF e/ou a actividade de CTGF no método da invenção incluem agentes que causam uma elevação em nucleótidos cíclicos na célula. Outros compostos que podem bloquear a indução de CTGF de acordo com os métodos da presente invenção, podem ser identificados usando os métodos de filtração descritos em cima.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um método de identificação de um composto ou de um agente que modula a actividade mitogénica de um fragmento de CTGF, por exemplo, um fragmento codificado pelos exões 4 e 5 como estabelecido na Figura 2. 0 método inclui fazer contactar com um agente de interesse, tal como um péptido, molécula pequena, polipéptido, peptidomimético, com as células (por exemplo, os fibroblastos) e um fragmento de CTGF conhecido como tendo actividade mitogénica e a medição da capacidade das células de proliferarem por qualquer meio conhecido de um especialista na técnica(ver os EXEMPLOS). A capacidade das células para proliferarem é depois comparada com a capacidade de uma população de controlo conveniente de células para proliferarem a ausência do agente ou do composto. 0 termo "agente" ou "composto" como aqui usado descreve qualquer molécula, por exemplo, uma proteína, polipéptido, ou farmacêutico, com a capacidade de afectar o crescimento de urra célula. 0 agente pode ser algo conhecido ou suspeito de ser capaz de afectar as células. 0 agente inclui fragmentos de péptido do polipéptido de CTGF. Os agentes incluem os agentes químicos sintéticos, os agentes bioquímicos, as células, os extractos, os homogenados e o meio condicionado. O agente de teste também pode ser um banco combinatório para filtrar uma pluralidade de compostos. Os compostos identificados no método da invenção podem ser além disso avaliados, detectados, clonados, sequenciados, e assim por diante, quer em solução ou depois de ligação a um suporte sólido, por qualquer método normalmente aplicado para a detecção de uma sequência de ADN específica, tal como PCR, restrição de oligómero (Saiki et al., BíolTechnology 3: 1008-1012,1985), analise de teste de oligonucleótido específico de alelos (ASO) (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80:278, 1983), ensaios de ligação de oligonucleótido (OLAs) (Landegren et al., Science 241: 1077, 1988), e os semelhantes. As técnicas moleculares para a análise de ADN foram revistos (Landegren et al., Science 242:229-237, 1988). purinas,

Os agentes candidatos abrangem classes químicas numerosas. Eles podem ser moléculas orgânicas, de um modo preferido pequenos compostos orgânicos que têm um peso molecular de mais de 50 e menos do que cerca de 2 500 Daltons. Os agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para a interaeção estrutural com proteínas, em particular a ligação de hidrogénio, e tipicamente incluem pelo menos um grupo de amino, carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, de um modo preferido pelo menos dois grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos muitas vezes compreendem estruturas de carbono cíclico ou heterociclicas e/ou aromáticas ou estruturas poliaromátícas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais em cima. Os agentes candidatos também são encontrados entre as biomoiéculas incluindo, mas não limitados a: péptidos, sacárídcs, ácidos gordos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou as sua combinações. Os agentes candidatos podem ser polipéptidos, ou polipéptidos produzidos por mutagénese aleatória ou dirigida ao local de uma sequência de ácido nucleico sintética ou que ocorre naturalmente.

Ainda numa forma de realização adicional da presente invenção, o método fornece a administração de moléculas que interrompem a modificação pós translação do CTGF de comprimento completo ou bloqueiam a activação de um precursor inactivo de CTGF. Como aqui discutido, a exposição de células mesangiais ao TGF-β resultou na aparência marcada de bandas adicionais a 28-30 kDa que corresponde em tamanho as fracções de amino e carboxilo da molécula de CTGF de comprimento completo. Como descrito em cima, o tratamento de TGF-β. pode resultar na produção de proteases ou outros factores capazes de clivar a molécula de comprimento completo. As moléculas que inibem a actividade de CTGF podem ser identificadas por se utilizarem os métodos de filtração aqui fornecidos.

Formulações Farmacêuticas e Vias de Administração

Vias de Administração. As composições que compreendem moduladores de CTGF, isto e, os anticorpos, os oligonucleótidos de anti-sentido, as moléculas pequenas e outros compostos como aqui descritos podem ser administrados a um paciente humano por si, ou em composições farmacêuticas que compreendem, onde apropriado, portadores ou excipientes convenientes. A presente invenção contempla ssètodos de tratamento em que os agentes que modulam ou regulam a expressão ou a actividade de CTGF os dos seus fragmentos são administrados a um paciente em necessidade, em quantidades convenientes para tratar ou prevenir a actividade ou a expressão do fragmento de CTGF. Os métodos presenres de tratamento e prevenção podem compreender a administração de uma quantidade eficaz do agente a um sujeito que é de um modo preferido um sujeito mamífero, e de um modo mais preferido um sujeito humano. Numa forna de realização preferida, o sujeito mamífero e o agente administrado são da origem homóloga. De um modo mais preferido, o sujeito e o agente administrados são humanos na origem.

Uma quantidade eficaz pode ser rapidamente determinada por experiência de rotina, como pode ser pela via de administração mais eficaz e conveniente e da formulação mais apropriada. Várias formulações e sistemas de libertação de fármaco estão disponíveis na técnica. Ver, por exemplo, Gennaro, A. R., editor, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1B'A, edição, Mack Publishing Co., Easton PA. As vias de administração convenientes, por exemplo, podem incluem a administração oral, rectal, transmucosal, ou intestinal e a libertação parentérica, incluindo injecções intramusculares, subcutâneas, intramedulares, bem como injecções intratecais, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneais, intranasais, ou intraoculares. A composição pode ser administrada num local em vez de uma maneira sistémica.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica, tal como por processos de mistura convencional, dissolução, granulação, fabricação de drageias, trituração, emulsificação, encapsulação, captura ou liofilização. Como observado em cima, as composições da presente invenção podem incluir um ou mais portadores fisiologicamente aceitáveis tais como excipíentes e auxiliares facilitam o processamento de moléculas activas em preparações para a utilização farmacêutica. A própria formulação depenae da via de administração escolhida.

Para a injecção, por exemplo, a composição pode ser formulada em soluções aquosas, de um modo preferido em tampões fisiologicamente compatíveis tais como a solução de Hanks, a solução de Ringer, ou o tampão salino fisiológico. Para a administração transmucosal, os penetrantes apropriados para a barreira a ser penetrada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica. Para a administração oral, os compostos podem ser formulados rapidamente por se combinarem os compostos activos com os portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais portadores permitem aos compostos da invenção serem formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e semelhantes, para a ingestão oral por um sujeito. Os compostos também podem ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou irrigadores de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais tais como a manteiga de cacau ou outros glicéridos.

As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas como excipientes sólidos, opcionalmente por se moer uma mistura resultante, e por se processar a mistura de grânulos, depois de se adicionarem auxiliares convenientes, se desejado, para se obterem comprimidos ou núcleos de drageias. Os excipientes convenientes são, em particular, enchedores tais como açúcares, incluindo a lactose, a sacarose, o manitol, ou o sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacante, celulose de metilo, celulose de hidroxipropilrnetilo, carbcxímetilcelulose de sódio, e/ou polivinílpirrolídona (PVP). Se desejado, os agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como a pirrolidona de polivinilo de ligação transversal, ágar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como o alginato de sódio.

Os núcleos de drageias são providos com revestimentos convenientes. Para esta finalidade, as soluções de açúcar concentradas podem ser usadas, as quais podem conter opcionalmente goma arábica, talco, pirrolidona de polivinilo, gel de carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos convenientes ou as misturas de solventes. Os corantes ou os pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos dos comprimidos ou das drageias para a identificação ou caracterização de combinações diferentes de doses de composto activo.

As preparações farmacêuticas para a administração oral incluem as cápsulas de impulso feitas de gelatina, bem como as cápsulas suaves, seladas feitas da gelatina e de um plasticizante, tal como o glicerol ou o sorbitol. As cápsulas de impulso podem conter os ingredientes activos em mistura com o enchedor tal como a lactose, ligantes tais como os amidos, e/ou lubrificantes tais como o talco ou o estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas suaves, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos convenientes, tais como os óleos gordos, a parafina líquida, ou os polietileno glicóis líquidos. Além do mais, os estabilizadores podem ser adicionados. Todas as formulações para a administração oral devem estar em dosagens convenientes para tal administração.

Para a administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com a presente invenção são convenientemente libertados na forma de uma apresentação de pulverização de aerossol áé embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com a utilização de um propulsar conveniente, por exemplo, o díclorodífluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, ou qualquer outro gás conveniente. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem apropriada pode ser determinada fornecendo uma válvula para libertar uma quantidade medida. As cápsulas e os cartuchos, por exemplo, de gelatina, para utilização num inalador ou insuflador podem ser formuladas. Estas tipicamente contem uma mistura de pó do composto e uma base de pó conveniente tal como a lactose ou o amido.

As composições formuladas para a administração parentérica por injecção, por exemplo, por injecção de bolus ou infusão continua podem ser apresentadas na forma de unidade de dosagem, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multi-dose, com um conservador adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. As formulações para a administração parentérica incluem as soluções aquosas de agentes que efectuam a actividade de GTGF ou de um seu fragmentos, na forma solúvel em água.

As suspensões dos compostos activos pode ser preparadas como suspensões de injecção oleosa apropriada. Os solventes ou os veículos lipofílicos convenientes incluem óleos gordos tais como o óleo de sésamo e ésteres de ácido gordo sintético, tais como oleato de etilo ou triglicéridos, ou lipossomas. As suspensões de injecção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como celulose de carboximetilo de sódio, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores convenientes ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de pó para a constituição com um veiculo conveniente, por exemplo, a água livre de pirogénio estéril, antes da utilização.

As composições da presente invenção também podem ser formuladas como uma preparação de depósito. Tais formulações de longa actuação podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou P;'-r injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos convenientes (por exemplo como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de troca de iões, ou como derivados solúveis de forma reduzida, por exemplo, como um sal solúvel de forma reduzida.

Os portadores farmacêuticas para as moléculas hidrofóbicas da invenção podem incluir sistemas co-solventes que compreendem, por exemplo, álcool de benzilo, um agente tensioactivo não polar, um polimero orgânico miscivel em água, e uma fase aquosa. 0 sistema co-solvente pode ser o sistema co-solvente VPD. 0 VPD é uma solução de 3 % p/v de álcool de benzilo, 8 % p/v do polisorbato 80 do agente tensioactivo não polar, e 65 % p/v de polietileno glicol 300, feito até ao volume em etanol absoluto. O sistema de co-solvente VPD (VPD: 5W) consiste de VPD diluído 1:1 com 5 % de uma dextrose em solução de água. Este sistema de co-solvente é eficaz na dissolução de compostos hidrofóbicos e produz baixa toxicidade depois da administração sistémica. Naturalmente, as proporções de um sistema de co-solvente podem ser variadas consideravelmente sem se destruir as suas características de solubilidade e de toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes de co-solventes pode ser variada. Por exemplo, outros agentes tensioaclivos não polares de baixa toxicidade podem ser usados em vez do polisorbato 80, o tamanho da fracção do polietileno glicol pode ser variada, outros polímeros biocompatíveis podem substituir o polietileno glicol, por exemplo a pirrolidona de polivinilo, e outros açúcares ou polissacáridos podem substituir a dextrose.

Alternativamente, outros sistemas de libertação de moléculas hidrofóbicas podem ser empregues. Os lipossomas e as emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos ou portadores de libertação de fármacos hidrofóbicos. Certos solventes orgânicos tais como o dimetilsulfóxido também podem ser empregues, embora normalmente a custa de maior toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser libertados usando sistemas de libertação sustentada, tais como matrizes semi-permeáveis dos polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm a quantidade eficaz da composição a ser administrada. Vários materiais de libertação sustentada são estabelecidos e disponíveis para os especialistas na técnica. As cápsulas de libertação sustentada, dependendo da sua natureza química, podem libertar os compostos durante algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, as estratégias adicionais para a estabilização da proteína podem ser empregues.

Dosagem Eficaz. Para qualquer composição usada nos métodos presentes de tratamento, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser prevista inicialmente usando varias técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, em um ensaio de cultura de célula, uma dose pode ser formulada em modelos animais para realizar uma variação de concentração circulante que inclui o ICí como determinado na cuitura de célula. Onde a inibição da actividade de CTGF é desejada, por exemplo, a concentração do composto de teste que realiza uma inibição meio máxima da actividade de CTGF pode ser determinada. As variações de dosagem apropriadas para sujeitos humanos podem ser determinadas usando dados obtidos de ensaios de cultura de célula e outros estudos de animais.

Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a quantidade da molécula que resulta na melhoria de sintomas ou de um prolongamento da sobrevivência num sujeito. A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais moléculas podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, determinando o 1¾¾ (a dose letal para 50 % da população) e o UPÍ:3 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população) . A proporção de dose dos tóxicos para efeitos terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a proporção de As moléculas que apresentam índices terapêutico elevados são preferidas.

As dosagens de um modo preferido estão incluídas numa variação de concentrações circulantes que inclui o com muito pouca ou nenhuma toxicidade. As dosagens podem variar dentro desta variação dependendo da forma de dosagem empregue e da via da administração utilizada. A formulação exacta, a via de administração, e a dosagem vão ser escolhidas com vista à especificação da condição de um sujeito. A quantidade de dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis de plasma da fracção activa que são suficientes para modular ou regular a actividade de CTGF como desejado, isto á a concentração eficaz mínima (MEC). O MEC vai variar para cada composto mas pode ser estimado, por exemplo, a partir de dados in vitro, tais como a concentração necessária para realizar a actividade de 53-90 % de CTGF para induzir o crescimento de osso utilizando os ensaios descritos aqui.

As dosagens necessárias para realizar o MEC vão depender das características individuais e da via da administração. As composições devem ser administradas usando um regime que mantém os níveis de plasma acima do MEC de cerca de 10-90 % da duração do tratamento, de um modo preferido de cerca de 30-90 % da duração do tratamento, e de um modo o mais preferido de entre 50-90 %.Em casos de administração local ou tomada selectiva, a concentração local eficaz do fármaco não pode estar relacionada com a concentração de plasma. A quantidade de composição administrada vai, naturalmente, ser dependente de um número de factores, incluindo, mas não limitada, ao peso do sujeito particular, a gravidade da aflição, a maneira de administração, e ao diagnóstico do médico que prescreve.

Embalagem. As composições, se desejado, podem ser apresentadas numa embalagem ou dispositivo de distribuição que pode conter uma ou varias formas de unidade de dosagem que contêm o ingrediente activo. A embalagem, por exemplo, pode compreender folha de metal ou de plástico, como um pacote com bolhas. A embalagem ou o dispositivo de distribuição podem ser acompanhados por instruções de administração. As composições que compreendem um composto da invenção formuladas num portador farmacêutico compatível também podem ser preparadas, colocadas num recipiente apropriado, e etiquetadas para o tratamento de uma condição indicada. As condições convenientes indicadas na etiqueta podem incluir o tratamento de desordens ou doenças nas quais a indução de osso ou de cartilagem, a cura de feridas, a neuroprotecção, a fibrose do rim, a diabetes, ou dos semelhantes é desejada.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são fornecidos sozinhos para ilustrar a invenção reivindicada. A presente invenção, no entanto, não é limitada no âmbito pelas formas de realização exemplificadas, as quais são entendidas como as ilustrações dos aspectos únicos da invenção só, e os métodos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito da invenção. De facto, varias modificações da invenção em adição aquelas descritas aqui vão tornar-se evidentes aos especialistas na técnica a partir da descrição precedente e dos desenhos que a acompanham. Tais modificações são entendidas para estarem incluídas no âmbito das reivindicações anexas.

Exemplo 1: Fragmentos de CTGF que Estimulam a Síntese da Matriz Extracelular

Para preparar os fragmentos de CTGF, o CTGF recombinante humano (comprimento completo) foi digerido por quimiotripsina para produzir um fragmento de CTGF. Os fragmentos de CTGF recombinantes também foram produzidos por se expressarem quer ou ambos o exão 2 como o exão 3 de CTGF. Uma linha contínua dos fibroblastos do rim de rato normal culturado (NRK), designada como o clone NRK-49F, foi obtida a partir de American Type Culture Collection (ATCC) para produzir culturas de célula. Os fibroblastos de prepúcio humano foram estabelecidos a partir de culturas de transplante. As culturas de células foram mantidas em meio de águia modificado de Dulbecco (DME) que contém 2,5 % de soro de bovino fetal e 2,5 % de soro Nu I (Ccilaboratíve Biomedical Products, Bedford, Mass.) e passados antes de confluência.

Para examinar a síntese de colagénio dos fibroblastos, as monocamadas detidas por crescimento do NRK e dos fibroblastos do prepúcio humano foram preparados por se disseminarem 10 000 células/cavidade em 48 placas de cavidade e deixando as células a crescer para a confluência em 5 a 7 dias em DME e 2,5 % de soro de bovino fetal/soro de Nu. As monocamadas de fibroblastos foram depois secos de soro em DME que contem 25 mM de HEPES e pré-mistura de ITS (Collaborative Biomedical) durante 1 a 8 dias. O ácido ascórbico (50 mg/mL) e os agentes biológicos (fragmentos de CTGF) foram depois adicionados. A síntese de colagénio foi avaliada por se medir a incorporação de il-próliíife em pepsina resistente ao precipitado de sal extracelular/colagénio associado a célula de superfície utilizando um ensaio quantitativo durante 24 horas terminais das 48 horas de tratamento. Como estabelecido na FIG. 2, os fragmentos de CTGF que compreendem os exões 2 e 3 da síntese de colagénio estimulado de CTGF em fibroblastos de NRK com 1 ng/mL de TGF-b. Ao contrário o CTGF terminado por carboxilo não estimulou a síntese de colagénio.

Exemplo 2: Fragmentos de CTGF que Induzem a Diferenciação dos Miofibroblastos

Os fragmentos de CTGF e as culturas de célula foram preparados como descrito em cima. Para examinar a indução de miofibroblastos por fragmentos de CTGF, as moaocamadas detidas por crescimento de NRK para os fibroblastos do prepúcio foram preparadas e tratadas como descrito em cima. Os tratamentos seguintes, monocamadas de placas de 48-cavidades foram lavados duas vezes com TBS e fixados em metanol a -20 graus C durante 10 minutos antes de se processar a detecção ímuno-histológíca do músculo liso de alfa. A detecção imunc-histológíca foi conduzida. A seguir à fixação, as monocamadas de célula foram lavadas duas vezes com TBS e bloqueadas durante 30 minutos com 10 % de soro o de cavalo/2 % de leite em TBS. As células foram depois incubadas durante 1 hora com actina IgG do músculo liso de anti alfa do rato monoclonal (Clone 1A4, Sigma Chemical) numa diluição de 1:200 em soro de cavalo/leite/TBS. A seguir a três lavagens com TBS, as monocamadas de células foram depois incubadas durante 1 hora com o IgG de anti-rato de cavalo biotinilado (Vector Labs, Burlingame, Calif.) numa diluição de 1:200 em soro de cavalo/leite/TBS. As monocamadas de célula foram depois lavadas e incubadas durante 30 minutos com um complexo de estreptvidina-biotina conjugado de um fosfato alcalino (Dako, Glostrup, Dinamarca). A seguir a lavagem, a fosfatase alcalina foi depois visualizada com um substrato vermelho rápido (Vector Red, Vector Labs) na presença de 1 mM de levamisole. As monocamadas de célula processadas foram depois examinadas sob um microscópio para os miofibroblastos positivos da actina do músculo liso de alfa manchado de vermelho e o número de miofibroblastos por cavidade foram contados e os campos microscópicos seleccionados foram fotografados.

Como estabelecido na FIG. 1, os resultados do ensaio para a síntese de colagénio de fibroblastos são reflectidos pelo ensaio de indução do mioblasto. Especificamente, os fragmentos de CTGF da presente invenção foram capazes de induzir a diferenciação do mioblasto, como comparado com os fragmentos de CTGF de terminal de carboxilo, os quais foram incapazes de induzir tal diferenciação.

Exemplo 3: Neutralização da Síntese de ADN Induzida por TGF-β que Bloqueia Anticorpos de Anti-CTGF, Síntese de Colagénio, e Indução do Miofibroblasto

Os anticorpos de anti-CTGF específicos foram levantados contra o CTGF humano recombinante biologicamente activo produzido sistema de expressão de baculovirus que usa métodos conhecidos na técnica. Os anticorpos foram preparados em cabras e testados para a actividade de neutralização de CTGF directamente ou em ADN induzido por TGF ou na síntese de colagénio em fibroblastos de NRK. Os anticorpos de cabra apresentaram a actividade nos ensaios de neutralização da acção de TGF-β. Nestes ensaios, os anticorpos de anti-CTGF de cabra foram capazes de bloquear a síntese d® ADN. do mais, como demonstrado na FIG. 5, os anticorpos de CTGF foram capazes de bloquear a síntese de colagénio e a formação de miofibroblastos induzida por TGF-β. Foi observado que a quantidade de anticorpo necessário para bloquear a síntese de colagénio foi significativamente menor do que a quantidade necessária pii-s bloquear a síntese de ADN. Ambos os ensaios de mancheamento de Western, e os ensaios de ELISA de competição indicaram que a maior parte dos anticorpos nesta preparação foram dirigidos contra o domínio de terminal N de CTGF. Isto sugeriu que os dois domínios poderiam ser responsáveis por estimularem as actividades biológicas diferentes.

Exemplo 4: Anticorpos de Anti-CTGF Específicos para o Domínio de Terminal N da Síntese de Colagénio que Bloqueiam Selectivamente o CTGF

Os anticorpos de anti-CTGF específicos do domínio foram preparados por cromatografia de afinidade utilizando domínios de CTGF de terminal N ou de terminal C purificados. Estes domínios foram preparados a partir de CTGF intacto por digestão limitada com quimiotripsina. Os domínios foram separados um da outro por cromatograf ia de afinidade em sefarose de heparina. 0 Semiámo w terminal N não se liga a heparina ao passo que o domínio de terminal C de CTGF contém a actividade de ligação da heparina e é retido na sefarose de heparina. Estes domínios foram puros, tendo menos de 0,1 % de contaminação com o CTGF intacto baseado na análise de mancheamento de Western. Os domínios individuais foram depois ligados a Affigel 10 a uma concentração de aproximadamente 0,5 mg/mL de gel. O IçG de anti-CTGF total (cabra) foi depois absorvido a resina de afinidade, e os anticorpos especificamente ligados foram eluídos. Estes anticorpos foram depois testados em mancheamentos de Western para determinar a especificidade da sua reactividade. Os IgG-s reactivos somente com o domínio de terminal N ou somente o domínio de terminal C de CTGF foi isolado do conjunto total usando técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos foram depois testados em ensaios de neutralização usando o CTGF. Os resultados destes estudos indicaram que os anticorpos dirigidos contra o domínio de terminal N da síntese de colagénio inibiram selectivamente o CTGF, mas não a síntese de ADN como demonstrado na FIG. 6. Ao contrário os anticorpos dirigidos contra o domínio C da síntese de ADN inibiram selectivamente o CTGF, mas não a síntese de colagénio. Os dados indicaram que as regiões diferentes da molécula de CTGF podem ser responsáveis por transmitirem actividades biológicas diferentes. Confirmar e estender estes resultados, as actividades biológicas dos domínios isolados com o CTGF intacto e com o TGF-β, foram comparados como estabelecido em baixo.

Exemplo 5: O Domínio de terminal N de CTGF que Estimula a Produção da Matriz Extracelular

Os domínios de terminal N e de terminal C de CTGF foram preparados usando técnicas conhecidas na técnica. Primeiro, como descrito em cima, os domínios de terminal N e de terminal C puros foram preparados por digestão proteolítica de CTGF intacto biologicamente activo que usa quimiotripsina, uma vez que produziu quase exclusivamente domínios de terminal N intactos e domínios de terminal C com nenhuns fragmentos mais pequenos. Um segundo método para gerar os domínios de terminal N e de terminal C puro, a expressão implicada só limitou as regiões de leitura aberta do CTGF, que codificou somente o domínio de terminal C ou somente o domínio de terminal N. Isto foi realizado pela amplificação de PCR de porções da estrutura de leitura aberta, e a introdução quer de um codão de paragem na região livre de cisteína para produzir somente o domínio de terminal N ou a clonagem da porção da estrutura de leitura aberta que codifica somente o domínio de terminal C, que começa na sequência AYRLED na região livre de cisteína para o vector GP67 de condução do baculovirus. Isto produziu uma proteína quimérica que contém um péptido de sinal do gene do vírus GP67 que dirigiu a síntese da proteína recombinante desejada (ou fragmento) ao retículo endoplásmico, assegurando assim a secreção. Depois da purificação, os domínios isolados gerados por vários métodos foram comparados num bioensaio com fibroblastos de NRK. Os resultados destes estudos confirmaram as observações prévias com os anticorpos de anti-CTGF específicos do domínio. Os domínios de terminal N produzidos quer por digestão proteolítica de CTGF intacto ou pela expressão recombinante directa foram totalmente activos como indutores da síntese de colagénio e a indução de miofibroblasto como indicado na FIG. 7 e na FIG. 8. De modo inverso, os domínios de terminal C produzidos por qualquer método foram também totalmente activos no ensaio da síntese de ADN. Os dados demonstraram que os domínios individuais de CTGF conservaram a activiaade biológica completa, e podem actuar independentemente um do ourro para estimular os efeitos biológicos específicos em células alvo. Em óptimas concentrações, os domínios individuais induziram uma resposta biológica comparável com o CTGF intacto ou com o TGF-β. Isto indicou fortemente que as actividades mitogénicas (síntese de ADN) e matrigénicas (síntese da matriz extracelular, tal como a síntese de colagénio) de TGF-M são mediadas através do CTGF e dos seus respectivos domínios.

Outros factores de crescimento podem ser usados com os fragmentos de CTGF da presente invenção para aumentar a actividade indutiva de CTGF na produção da matriz extracelular. Por exemplo, o factor de crescimento do péptido, o IGF-2, foi avaliado para o seu efeito na actividade do colagénio e do miofibroblasto de fenotipo indutor de CTGF. As concentrações de 2 ng/mL ou mais elevadas de IGF-2 na presença de CTGF resultaram em um grande aumento na síntese de colagénio e do miofibroblasto de fenotipo como mostrado no FIG. 9.

MS» m SFylMMIAS <110> UNIVERSIDADE DE ΜΪΑΜΙ

<120> FRAGMENTOS DO FACTOR DE CRESCIMENTO DO TECIDO CONECTIVO E OS SEUS MÉTODOS E UTILIZAÇÕES

FIF0> F1M7EC 1? MSsMM < 141 > Μ vm M Mv ltlS»lC~Í4 <1M> \· v / ·> i*, ·'· <iM:> } ·· m <I4 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 2075 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (130) ... (1176) cccggccgac agccccgaga cgacagcccg gcgcgtcccg gtccccacct ccgaccaccg 60 ccagcgctcc aggccccgcg ctccccgctc gccgccaccg cgccctccgc tccgcccgca 120 gtgccaacc atg acc gcc gcc agt atg ggc ccc gtc cgc gtc gcc ttc gtg 171

Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Vai Arg Vai Ala Phe Vai 15 10 gtc ctc ctc gcc ctc tge age cgg ccg gcc gtc ggc cag aac tgc age 219 Vai Leu Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Vai Gly Gin Asn Cys Ser 15 20 25 30 ggg ccg tgc cgg tgc ccg gac gag ccg gcg ccg cgc tgc ccg gcg ggc 267 Gly Pro Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly 35 40 45 gtg age ctc gtg ctg gac ggc tgc ggc tgc tgc cgc gtc tgc gcc aag 315 Vai Ser Leu Vai Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Vai Cys Ala Lys 50 55 60 cag erg ggc gag ctg tgc acc gag cgc gac ccc tgc gac ccg cac aag 363 Gin Leu Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro Hls Lys 65 70 75 ggc ctc ttc tgt gac ttc ggc tcc ccg gcc aac cgc aag ate ggc gtg 411 Gly Leu Phe Cys Asp Phe Giy Ser Pro Ala Asn Arg Lys ile Gly Vai 80 85 90 tgc acc gcc aaa gat ggt gct ccc tgc ate ttc ggt ggt acg gtg tac 459 Cys Thr Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys I le Phe Gly Gly Thr Vai Tyr 95 hs 105 110 cgc age gga gag tcc + j” £1 cag y Ο age tgc aag tac cag tgc acg tgc 50i Ser Gly Glu Ser Phe Gin Ser Ser Cys Lys Tyr Gin Cys Thr Cys 115 120 125 ctg gac ggg gcg gtg ggc tgg a η g CCS ctg tgc age atg gac : gtt cgt 555 Leu Asp Giy Ala Gly Cys Pro Cys Ser Met Asp Vai Arg 130 135 140 ctg ccc age cct gac tgc ecc ttc ccg agg agg gtc aag ctg ccc qcq 6 03 Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pra Arh Arg Vai Lys Leu Pro Glv 145 150 155 aaa tgc tgc gag gag tgg gtg tgt g 3.0 gag ccc aag g a c caa acc qtq 651 Lys Cys Cys Glu Glu Trp Vai Cys Asp Pr 11.1 Pro Ly s Asp Gin Thr Val gtt ggg cct gee etc gcg gct tac cga ctg gaa gac aeg ttt ggc cca Vai Giy Pro á.l* Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr 3he Gly Pro 175 ISO 185 190 gac cca act atg att aga gee aac tgc ctg gtc cag acc CCS. gag tgg Asp Pro Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Vai Gin Thr Thr Glu Trp 195 203 235 age gee tgt tcc aag acc tgt ggg atg ggc :S v.C tcc acc cgg gtt acc Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Giy Met Gly Ile Ser Thr Arg Vai Thr 210 215 220 aat gac aac gee tcc tgc agg cta gag aag Cíi.C age ege ctg tgc atg Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys C-ln Ser Arg Leu Cys Met 225 230 235 gtc agg cct tgc gaa gct gac ctg gaa gag ei et C att aag aag ggc aaa Vai Arg Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys 240 245 250 aag tgc ate cgt act ccc aaa ate tcc aag cct ate aag ttt gag ctt Lys Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu 255 260 265 270 tet ggc tgc acc age atg aag aca tac ega gct aaa ttc tgt gga gta Ser Gly Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Vai 275 280 285 tgt acc gac ggc cga tgc tgc acc ccc cac aga acc acc acc ctg ccg Cys Thr Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro 290 295 300 gtg gag ttc aag tgc cct gac ggc gag g t c atg aag aag aac atg atg Vai Glu Phe Lys Cys Pro Asp Giy Glu Vai Met Lys Lys Asn Met Met 305 310 315 ttc ate aag ei C C tgt: gee tgc cat tac aac tgt ccc gga gac aat gac Phe Ile Lys Thr Cys Ala Cys Bis Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp 320 325 3tC ttt gaa teg ctg tac tac agg aag aeg esc gga gac atg gea Ile Phe Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 335 340 345 atteacatct ttctaactgg gtctatcttc gtacacagca ccggttagta ttgagaagga tgtgcatact ctcagctctg tgaagccaga gagtgagaga cattaactca ttagacegga acttgaactg eatttttccg taaaaatgat ttcagtagca caagttsttu aaatctgttt gggaaaagat cccagacact ccagaatgta . aaattttagc ccagccatca tcccacccaa ttcaaaacat tgtgccatgt caaacaaata $$%.% ·: atgttaagac ttgaeagtgg aactacatta tattaaggag tggctttagg agcagtggga gggtaccggc gactcttata cgagtaatat gcctgctatt tgaagtgtaa gtgctcactg acctgcctgt acagctagga agagacrçag tcaagttgtt ccttaagtca gaacagcaga acattctgat tcgaatgaca ctgttcagga atcggaatcc tgtcgattag aetggacagc 1716 ttgtggcaag tgaatttgcc tgtaacaagc cagatttttt aaaatttaxa ttgtaaatat 1776 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg taxatatata tatatatgta cagttatcta agttaattta 18 36 aagttgtttg tgccttttta cctttgttrt taaugctttg atatttcaat gttagcctca 1896 atttctgaac accataggta gaatgtaaag cttgtctgat cgtrgaaagc atgaaargga 1956 tacttatatg gaaattctgc tçaga-iagaa tgacagtccg tcaaaacaga ttgtttgcaa 2016 aggggaggca tcagtgtctt ggcaqgctga tttctaggta ggaaatgtgg tagctcacg 2075

<210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens 4 <l'v /

Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Vai Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Vai Gly Gin Asn Cys Ser G1 y Pro 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Vai Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gin Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser 100 105 110 Gly Glu Ser Phe Gin S er S er Cys Lys Tyr Gin Cys Thr Cys Leu Asp 115 120 125 Gly Ala Vai Gly Cys Met Pro Leu Cys S er Met Asp Val Arg Leu Pro 130 135 140 Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Võl Lys Leu Pro Gly Lys Cys 145 150 155 160 Cys Glu Glu Trp Vai Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gin Thr Val 7 si Gly 165 170 175 Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Prc 180 185 190 Thr Met 11 e Arg A la Nsn Cys Leu Vai Gin Thr Thr Giu Trp Ser Ala 195 200 205 Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile S er Thr Arg Val Thr Asn Asp 213 215 220 Asn Aia S er Cys Arg Leu Glu Lys Gin Ser Aíií Leu Cys Met Val Nrg 225 230 235 240 Pro Cys Glu hlUí Asp Leu Glu :V> Asn Ile Lys lys Gly Lys Lys Cys 245 25C 255 lie Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys LiXv: Ile Lys Phe Glu Leu S er Gly 260 265 270 Cys Thr S ar Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys TA* Cys Gly Val Cys Thr ; 175 MU "" _ 5 Asp Gly Arg Cys Cys ru r Pro Eis Arg x Thr Thr X X X; Pro Val Glu 29C 293 100

Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Vai Met Lys Lys Asn Met Mec Phe Ile 305 310 315 320

Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe 325 330 335

Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala

<210> 3 <211> 669 <m:-> ADN <213> Homo sapiens <220>

¢32¾ CDS <222> (130) ... (669)

<223> sequência de terminal N de CTGF 60 12 0 171 cccggccgac agccccgaga cgacagcccg gcgcgtcccg gtccccacct ccgaccaccg ccagcgctcc aggccccgcg ctccccgctc gccgccaccg cgccctccgc tccgcccgca gtgccaacc atg acc gcc gcc agt atg ggc ccc gtc cgc gtc gcc ttc gtg Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Vai Arg Vai Ala Phe Vai 15 10 gtc ctc ctc gcc ctc tgc age cgg ccg gcc gtc ggc cag aac tgc age

Vai Leu Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Aia Vai Gly Gin Asn Cys Ser 15 20 25 30 ggg ecg tgc cgg tgc ccg gac gag ccg gcg ccg cgc tgc ccg gcg ggc Glypro Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys 1 Pro Ala ( Gly 35 40 45 gtg age ctc gtg ctg gac ggc tgc ggc tgc tgc cgc gtc tgc gcc aag Va] Ser Leu Vai Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg vai Cys Ala Lys 50 .ss 6 0 cag ctg ggc gag ctg tgc acc gag cgc gac ccc tgc gac ccg cac aag Gin Leu Giy Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys 63 7 0 7 C ggc ctc ttc cgt gac ttc ggc tcc ccg gcc aac cgc aâg ate ggc gtg G.ly Teu Pb p Cys Asp Phe Gly Ser Prc Ala Asn Arg Lys Ile Giy V a i 80 8 5 9C tgc àcc gcc aaa gat ggt gct ccc tgc acc ttc ggt ggt acq çtg tac Cys Thr Ala Lys Asp Gly Pro Cys Ile Phe P' ,T ^-x Gly Thr T y τ 95 1QC 135 110 cgc age gga gag tcc tcc cag age ycç cgc aag tac cag tgc acg tgc Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gin Ser Ser Cys Lys Tyr Gin Cys Thr Cys 115 120 125 erg gac ggg gcg gtg ggc tgc atg CCC erg tgc age atg gac gtt cçt Leu Asp Giy Ala Vai Giy Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Vai Arg 130 135 140 ctg ccc age c c t gac tgc CCC t t C ccg agg agg gtc aag ctg CCC ggg Leu Pro S er Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Vai Lys Leu Pro Giy 145 150 155 aaa tgc tgc gag gag tgg gtg tgt gac gag CCC aag : gac c aa âc c gtg Lys Cys Cys Giu Glu Trp Vai Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gin Thr χ.·Λ 160 165 170 g tt ggg c c t gee etc gcg Vai Giy Pro Ala Leu Ala 175 180

<210> 4 <211> 180 <212> PRT <213> Hemo sapiens

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Lisboa, 20 de Agosto de 2007

Claims (13)

1. Fragmento de polipéptido do factor de crescimento de tecido conectivo (CTGF) que tem a capacidade de induzir a síntese da matriz extracelular, a síntese de colagénio, e/ou a diferenciação de miofibroblastos que consiste de uma sequência de amino ácido como determinado na SEQ ID NO: 4.

2. Fragmento de polipéptido de CTGF que tem a capacidade de induzir a síntese da matriz extracelular, a síntese de colagénio, e/ou a diferenciação de miofibroblastos que consiste de uma sequência de amino ácido codificada pelo exão 2, em que a referida sequência de amino ácido consiste de resíduos 24 a 95 da SEQ ID NO: 4.

3. Fragmento de polipéptido de CTGF que tem a capacidade de induzir a síntese da matriz extracelular, a síntese de colagénio, e/ou a diferenciação de miofibroblastos que consiste de uma sequência de amino ácido codificada pelo exão 3, em que a referida sequência de amino ácido consiste de resíduos 96 a 180 da SEQ ID NO: 4.

4. Fragmento de polipéptido de CTGF que tem a capacidade de induzir a síntese da matriz extracelular, a síntese de colagénio, e/ou a diferenciação de miofibroblastos que consiste de uma sequência de amino ácido codificada pelos exões 2 e 3, em que a referida sequência de amino ácido consiste de resíduos 24 * 180 da SEQ ID NO: 4.

5. Polinucleótido que codifica um fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Anticorpo que se liga especificamente a um fragmento de acordo com a reivindicação 3.

7. Molécula de anti-sentido que é de 15 a 100 nucleótidos em comprimento e se liga a um poiinucieótido que consiste do exão 2, do exão 3, ou do exão 2 e do exão 3 como determinado na Figura 3.

8. Utilização de um anticorpo que se liga especif icamente a um fragmento de CTGF de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença ou desordem associada com a indução da sintese de matriz extracelular, a síntese de colagenio, e/ou a diferenciação de miofibroblastos por CTGF.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a doença ou desordem é uma doença/desordem fibroproliferativa.

10. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a doença ou desordem é seleccionada a partir do grupo que consiste da fibrose dos rins, escleroderma, fibrose pulmonar, fibrose do fígado, artrite, escaras kipertróficas, arteriosclerose, nefropatia diabética e retinopatia, hipertensão, desordens dos rins, desordens relacionadas com a angiogénese, descrdens fibróticas da pele, e desordens cardiovasculares.

11. Utilização de uma molécula de anti-sentido que se liga a polinucleótido de acordo com a reivindicação 5 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença ou desordem associada com a indução da síntese de matriz extracelular, a síntese de colagénio, e/ou a diferenciação de miofibroblastos por CTGF. Método ín vitro para identificar um agente ou composto que modula a actividade de um fragmento de terminal N de CTGF que compreende: contactar uma célula de miofibroblastos com um agente de teste e com um fragmento de CTGF de terminal N em condições que permitem aos componentes interagirem; e comparar a capacidade da célula para se diferenciar na presença do agente para a capacidade de uma célula de se diferenciar e na ausência do agente, em que a diferença na capacidade de diferenciação das células é indicativa de um agente ou composto que modula a actividade de diferenciação de um fragmento de CTGF. Método in vitro para identificar um agente ou composto que modula a actividade de um fragmento de terminal N de CTGF que compreende contactar uma célula com um agente de teste e com um fragmento de CTGF de terminal N em condições que permitem aos componentes interagirem; e comparar a capacidade do composto ou agente para modular a produção da matriz extracelular na presença do agente para a capacidade de um agente ou composto de modularem a produção da matriz extracelular na ausência do agente, em que a diferença na diferenciação na produção da matriz extracelular é indicativa de um agente ou composto que modula a actividade de um fragmento de CTGF.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que a modulação é a inibição da actividade.

15. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que a modulação é a estimulação da actividade. 16. composição farmacêutica que compreende os fragmentos de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, um anticorpo que se liga especificamente ao fragmento de CTGF de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou uma molécula de anti-sentido que se liga ao polinucleótido como determinado na reivindicação 5, para utilização no tratamento de uma doença ou desordem associada com a indução da síntese de matriz extracelular, da síntese de colagénio, e/ou da diferenciação de miofibroblastos por CTGF. Lisboa, 20 de Agosto de 2007