CZ253897A3

CZ253897A3 - Osteoprotegerin

Info

Publication number: CZ253897A3
Application number: CZ972538A
Authority: CZ
Inventors: William J. Boyle; David L. Lacey; Frank J. Calzone; Ming-Shi Chang
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 1999-03-17
Also published as: IL121520A; SI0784093T1; PL187408B1; NZ326579A; AR004400A1; EP2332974A3; FR2742767A1; EP0784093B1; KR19980703599A; BG101813A; BG63347B1; US6369027B1; KR100463584B1; WO1997023614A1; ATE409745T1; EP1990415A1; CZ292587B6; CN1318588C; EP2332974A2; CA2210467C

Description

Osteoprotegerin

Oblast techniky

Vynález se obecně týká polypeptidu podílejících se na regulaci kostního metabolizmu. Vynález se zejména týká nového polypeptidu, označeného jako osteoprotegerin, který je členem receptorové nadrodiny faktoru nekrotizujícího tumor. Tento polypeptid se používá při léčení kostních onemocnění, pro která je charakteristická zvýšená ztráta kostní hmoty, například při léčení osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Polypeptidové růstové faktory a cytokiny jsou sekretované faktory, které signalizují specifickým navázáním na diskrétní povrchové vazebné receptory široké spektrum změn v růstu, v diferenciaci a v metabolizmu buněk. Receptory jako třída proteinů mění svou strukturu a způsob transdukce signálu. Jsou charakteristické tím, že mají extracelulární doménu, která je součástí ligandové vazby a cytoplasmatickou doménu, která přenáší příslušný _ intracelulární signál. Expresní vzory receptorů přesně určují, které buňky budou reagovat na daný ligand, zatímco struktura daného receptoru diktuje buněčnou odpověď indukovanou ligandovou vazbou. Ukázalo se, že receptory přenáší intracelulární signály přes své cytoplasmatické domény aktivací proteinového tyrosinu nebo fosforylací proteinového šeřinu/threoninu (např. receptoru růstového faktoru odvozeného z krevních destiček (PDGFR)) nebo

01-1718-97 Če receptoru-I transformačního růstového faktoru-β, stimulací G-proteinové aktivace (například β-adrenergickým receptorem-I(ΤΘΕβΚ-Ι)) a modulačním spojením s cytoplasmatickými proteiny transdukujicími signál (např. TNFR-1 a Fas/APO) (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995)).

Nadrodinou receptu faktoru nekrotizujícího tumor (TNFR) je skupina transmembránových proteinů typu I, které sdílí konzervovaný motiv bohatý na cystein, který se v intracelulární doméně opakuje třikrát až šestkrát (Smith a kol., Cell 7 6, 953-962 (1994)). Tyto repetice společně tvoří ligandové vazebné domény zmíněných receptoru (Chen a kol., Chemistry 270, 2874-2878 (1995)) . Ligandy pro tyto receptory jsou tvořeny strukturně příbuznou skupinou proteinu, homologická s TNFa. (Goeddel a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597-609 (1986); Nagata a kol., Science 267, 1449-1456 (1995)). TNFa se váže na distinktní, ale blízce příbuzné receptory, TNFR-1 a TNFR-2. TNFa produkuje celou řadu různých biologických odpovědí v buňkách nesoucích receptor včetně proliferace, diferenciace a cytotoxicity a apoptózy (Beutler a kol., Ann. Rev. Biochem. 57, 505-518 (1988)).

Dá se předpokládat, že TNFa zprostředkovává akutní a chronické zánět livé odpovědi.......(Beutler a kol ., Ann. Rev.

Biochem. 57, 505-508 (1988)). Systemická doprava TNFa indukuje toxický šok a rozsáhlou tkáňovou nekrózu. Díky tomu může být TNFa zodpovědný za vážnou morbiditu a mortalitu, které souvisí s celou řadou infekčních chorob včetně sepse. Mutace ve FasL, ligandu pro TNFR-příbuzný receptor Fas/APO (Suda a kol., Cell 75, 1169-1178 (1993)), jsou spojovány s autoimunitou (Fischer a kol., Cell 81,

01-1718-97 Če

935-946 (1995)), zatímco nadprodukce FasL se může podílet na hepatitidě, indukované účinnou látkou. Takže ligandy pro různé proteiny, odvozené z TNFR, často zprostředkovávají vážné důsledky mnoha-chorobných stavů; z čehož vyplývá, že činidla, která neutralizují aktivitu těchto ligandů, mají terapeutickou hodnotu. U rozpustných TNFR-1 receptorů a protilátek, které vážou TNFa, se testovala jejich schopnost neutralizovat systémový TNFa (Loetscher a kol., Cancer Cells 3(6), 221-226 (1991)). Nedávno se klonovala přirozeně se vyskytující forma sekretované TNFR-1 mRNA a u jejího produktu se testovala schopnost neutralizovat TNFa aktivitu in vitro a in vivo (Kohno a kol., PNAS USA 87, 8331-8335 (1990)) . Schopnost tohoto proteinu neutralizovat TNFa svědčí o tom, že rozpustné TNF receptory vážou a čistí TNF a tím blokují cytotoxické vlivy na buňky nesoucí TNFR.

Cílem vynálezu je identifikovat nové členy TNFR nadrodiny. Dá se očekávat, že novými členy rodiny budou transmembránové proteiny nebo jejich rozpustné formy, obsahující extracelulární domény a postrádající transmembrány a cytoplasmové domény. Byl identifikován nový člen TNFR nadrodiny, který kóduje sekretovaný protein, úzce příbuzný s TNFR-2. Analogicky, jako v případě rozpustného TNFR-1, může od TNFR-2 odvozený protein negativně regulovat aktivitu svého ligandu a může být tedy užitečný při léčení určitých lidských chorob.

Podstata vynálezu

Nový člen nadrodiny recetorů tumorového nekrotického faktoru (TNFR) byl identifikován v knihovně intestinálni cDNA, získané z krysího zárodku. Získal se celodélkový cDNA

01-1718-97 Če

klon, který se sekvencoval. Exprese krysí cDNA v transgenické myši vykazovala vyznačené zvýšení, pokud jde o hustotu kostí, zejména u dlouhých kostí, pánevní kosti a obratlů. Polypeptid,' kódovaný cDNA, je označen jako osteoprotegerin (OPG) a hraje důležitou roli při podpoře kostní akumulace.

Vynález poskytuje nukleové kyseliny, kódující polypeptid, mající alespoň jednu z biologických aktivit OPG. Vynález rovněž poskytuje nukleové kyseliny, které se hybridizují na nukleové kyseliny, které kódují myší, krysí nebo humánní OPG, znázorněný na obr. 2B-2C (SEQ ID NO:120) 9A-9B (SEQ ID NO: 122) a 9C-9D (SEQ ID NO: 124). Výhodně je OPG savčí OPG a výhodněji humánní OPG. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají rekombinantní vektory a hostitelské buňky, exprimující OPG, a způsoby produkce rekombinantního OPG. Protilátky nebo jejich fragmenty, které specificky vážou polypeptid, jsou rovněž součástí vynálezu.

Způsoby léčení onemocnění kostí jsou rovněž součástí vynálezu. .Polypeptidy jsou užitečné při prevenci řídnutí kostí a mohou se použít při léčení libovolného stavu, který má za následek ztrátu kostní hmoty, například osteoporózy, hyperkalcemie, Pagetovy choroby kostí a ztráty kostní hmoty v důsledku kloubního revmatismu nebo osteomyelitidy apod. Kostní onemocnění lze rovněž léčit protismyslnou nebo genovou terapií, využívající nukleové kyseliny podle vynálezu. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické kompozice, obsahující OPG nukleové kyseliny a polypeptidy.

01-1718-97 Če

• ♦ ·· ·· · · « • · « ·« ··

Stručný popis obrázků

Obr. 1, FASTA analýza nového EST LORF. Obr. IA ukazuje odvozenou aminokyselinovou sekvenci zařazenou do humánní TNFR-2 sekvence. Obr. IB znázorňuje profilovou analýzu nového EST LORF, přičemž obrázek znázorňuje odvozenou FRI-1 aminokyselinovou sekvenci zařazenou do TNFR-profilu. Obr. IC znázorňuje strukturu TNFR nadrodiny ukazující oblast, která je homogenní s novým FRI-1.

Obr. 2 znázorňuje strukturu a sekvence krysího OPG genu v celé jeho délce, jako nového členu TNFR nadrodiny. Obr. 2A ukazuje mapu pMOB-Bl.l inzertu. Rámeček označuje polohu LORF v cDNA sekvenci (tučná čára), černý obdélník označuje signální peptid a šedé elipsy označují pozici opakujících se sekvencí bohatých na cystein). Obr. 2B a 2C ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a proteinu cDNA krysího OPG, přičemž předpokládaný signální peptid je podtržen a potenciální místa N-navázané glykosylace jsou označena tučným, podtrženým písmem. Obr. D a E znázorňují srovnání odpovídajících sekvencí (Wisconsin GCG Package, verze 8.1) OPG s dalšími členy TNFR nadrodiny, fas (SEQ ID NO: 128); tnfrl (SEQ ID NO: 129); sfu-t2 (SEQ ID NO: 130); tnfr2 (SEQ ID NO: 131); cd40 (SEQ ID NO: 132); osteo (SEQ ID NO: 133) ; ngfr (SEQ ID NO: 134 ) ; ox40 , (SEQ ID. NO: 135) ; - 4-lbb (SEQ ID NO: 136).

Obr. 3 znázorňuje PepPlot analýzu (Winsconsin GCG Package, verze 8.1) předpokládané proteinové sekvence krysího OPG, přičemž obr. 3A schematicky znázorňuje krysí OPG s hydrofobními (nahoře) a hydrofilními (dole) aminokyselinami. Obr. 3B znázorňuje aminokyselinové zbytky, které tvoří β-strukturu (nahoře) a lámou β-strukturu (dole) • »

01-1718-97 Če • · · ·· · · · definované podle Choua a Fasmana (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)). Obr. 3C znázorňuje míru ochoty tvořit a-šroubovici a β-strukturu (Chou a Fasman, tamtéž); křivky ležící nad vodorovnou osou 1,00 ukazují ochotu tvořit a-šroubovici nebo β-strukturu; přičemž struktura může být zakončena v oblastech proteinu, ve kterých křivky klesnou pod hodnotu 1,00. Obr. 3D znázorňuje zbytky, které tvoří a-strukturu (nahoře) nebo které lámou α-strukturu (dole). Obr. 3E znázorňuje části proteinové sekvence, která je podobná sekvencím, které se zpravidla nacházejí na aminovém konci a- a β-struktury (Chou a Fasman, tamtéž). Obr. 3F znázorňuje části proteinové sekvence, která se zpravidla nachází na karboxylovém konci a- a β-struktury (Chou a Fasman, tamtéž). Obr. 3G znázorňuje části proteinové sekvence, která je zpravidla sbalená (Chou a Fasman, tamtéž). Obr. 3H znázorňuje šroubovicový hydrofobní moment (Eisenberg a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984)) v každé pozici v sekvenci. Obr. 31 znázorňuje průměrnou hydropatii Kýta a Doolitla (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)) a Goldmana a kol. (stručný přehled v Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 321-353 (1986)).

Obr. 4 znázorňuje mRNA expresní vzory pro OPG cDNA v lidských tkáních. Northernové bloty s_e sondovaly pomocí krysího cDNA inzertu, značeného pomocí 32P (obr. 4A) nebo pomocí inzertu humánní cDNA (obr. 4B).

Obr. 5 znázorňuje vytvoření transgenické myší exprese OPG cDNA v hepatocytech. Northernová blotová exprese HE-OPG transgenu v myších játrech.

Obr. 6 znázorňuje zahuštění kosti u OPG transgenické myši. Obr. 6A až 6F znázorňují kontrolní myši a obr. 6G až

01-1718-97 Če

6J znázorňují OPG exprimující myši; při pitvě se provedl rentgen všech zvířat a rentgenové snímky se vyvolaly. Obr. 6A až 6F ukazují rentgenové snímky kontrolních zvířat a jednoho transgenického neexpresního zvířete (č. 28). Na těchto snímcích byla jasně odlišitelná kůra a osvětlená středová dutina kostní dřeně. Na rentgenových snímcích 6G až 6J, t j . OPG exprimují cích zvířat, byla kůra špatně definovatelná a v oblasti kostní dřeně byla hustota zvýšena.

Obr. 7 znázorňuje trabekulární kost v OPG transgenické myši. Obr. 7A až 7D reprezentují fotomikrografy kostí kontrolních zvířat. Obr. 7A a 7B ukazují obrázky kosti stehenní při malém zvětšení (4x, lOx) (Massonova trichromová- skvrna). Skvrny pro kyselinovou fosfatázu, rezistentní proti vinanu (TRAP), demonstrují osteoklasty (viz šipky), které resorbují jak chrupavku (obr. 7C) tak trabekulární kost (D). Je třeba zmínit zploštělý vzhled osteoklastů na trabekulární kosti. Obr. 7E až 7H představují fotomikrografy kostí OPG exprimujících zvířat. Obr. 7E a 7F ukazují obrázky kosti stehenní při malém zvětšení (4x, lOx) (Massonova trichromová skvrna), čirá oblast je chrupavka, modře zabarvená oblast představuje kost a červená oblast představuje kůru.

poznamenat,.......že narozdíl „ od kontrolních trabekulární kost neresorbovala, což vedlo obvyklé dřeňové dutiny. Výsledná trabekula má rozmanitý vzhled s modrými a čirými plochami. Čiré plochy zobrazují zbytky ploténkové chrupavky, která se nikdy nepřemodelovala. Na základě TRAP zabarvení se zjistilo, že tito živočichové mají na rostoucí destičce (obr. 7G) osteoklasty (viz šipka), které mohou svůj počet redukovat. Nicméně povrchy trabekuly, orientované směrem od růstové

Je třeba vzorků se k absenci

01-1718-97 Če destičky, jsou ve skutečnosti prosté osteoklastů (obr. 7H) a toto zjištění je v přímém kontrastu s kontrolními živočichy (viz obr. 7D).

Obr. 8. U HE-OPG expresorů nebyl zaznamenán defektni monocyto-makrofágový vývoj. Příčinou osteopetrózy u myší je produkce defektního M-CSF, způsobená místní mutací v M-CSF genu. To způsobuje značný deficit cirkulujících makrofágů a tkáňových makrofágů. Periferní krev OPG expresorů obsahovala monocyty, jak ukázala H1E analýza. K potvrzení přítomnosti tkáňových makrofágů se použila imunohistochemie využívající F480 protilátek, které rozpoznávají antigen buněčného povrchu na myších makrofázích. Obr. 8A a 80 ukazují fotomikrografie (zvětšení 4x) slezin normálních a CR1 přeexpresorů. Je třeba poznamenat, že obě zvířata mají značné množství F480 pozitivních buněk. Monocyto-makrofágy byly rovněž přítomny v dřeni normálních (obr. 8B) a HE-OPG přeexpresorů (obr. 8D) (40x).

Obr. 9 znázorňuje strukturu a sekvenci myších a humánních OPG cDNA klonů (obr. 9A, obr. 9B) . Myší cDNA a proteinovou sekvenci (obr. 9C, obr. 9D) , humánní cDNA a proteinovou sekvenci. Předpokládané signální peptidy jsou podtrženy a možná místa N-navázané glykosylace jsou vyznačena tučným písmem (obr. 9E, obr. 9F). Obrázek rovněž znázorňuje seřazení sekvencí a srovnání krysích, myších a humánních OPG aminokyselinových sekvencí.

Obr. 10 znázorňuje srovnání Zachovalých sekvencí v extracelulární doméně TNFR-1 a humánního OPG. PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, verze 8.1) seřazení sekvencí TNFR1 a OPG je popsáno v příkladu 6. Horní řádek uvádí humánní TNFR1 sekvence, kódující domény 1 až 4. Spodní řádek uvádí

01-1718-97 Ce

• · humánní OPG sekvence, kódující domény 1 až 4. Zachované zbytky jsou zvýrazněny rámečky.

Obr. 11 znázorňuje trojrozměrnou strukturu humánního OPG. Bokorysné zobrazení „Moleskript předpokládané trojrozměrné struktury humánních OPG zbytků 25 až 163 (široká čára) ko-krystalizovaných s humánním TNF3 (tenká čára) . Orientaci (směrem od N-konce k C-konci) označují široké šipky podél OPG polypeptidového hlavního řetězce. Do polypeptidového hlavního řetězce jsou vložena místa jednotlivých postranních řetězců cysteinových zbytků, která pomáhají vymezit samostatné domény bohaté na cystein. TNFP molekula je seřazena způsobem, který popisuje Benner a kol. (1993).

Obr. 12 znázorňuje strukturu OPG cysteinově bohatých domén. Seřazení humánní (horní řádek SEQ ID NO:136) a myší (spodní řádek) OPG aminokyselinové sekvence ukazuje předpokládanou doménovou strukturu OPG. Polypeptid se rozdělil na dvě poloviny; N-konec (obr. 12A) a C-konec (obr. 12B) . Předpokládá se, že N-koncová polovina obsahuje čtyři cysteinově bohaté domény (označené 1 až 4). Předpokládané disulfidové vazby uvnitř řetězce jsou naznačeny tučnými čarami a označeny jako „SSl, „SS2 nebo „SS3. Dále se předpokládá, že tyrosin 28 a histidin 75 (podtržené) tvoří iontovou interakci. Ty aminokyseliny, o který se předpokládá, že vzájemně reagují s OPG ligandem, jsou označeny tečkami nad příslušným zbytkem. Cysteinově zbytky, které se nachází v C-koncové polovině OPG jsou označeny rámečky.

Obr. 13 znázorňuje expresi a sekreci celodélkových a upravených myších OPG-Fc fúzních proteinů. Obr. 13A

• ·

01-1718-97 Če znázorňuje mapu naznačující body fúze na humánní IgGl Fc doménu, které jsou vyznačeny pomocí šipek. Obr. 13B ukazuje stříbrné zabarvení SDS-polyakrylamidového gelu kondiciovaného média, získaného z buněk 'exprimujících expresní vektory Fl.Fc (celodélkový OPG, napojený na Fc na Leucinu 401) nebo CT.Fc (C-koncový upravený OPG napojený na Fc na threoninu 180) fúzního proteinu. První řádek uvádí mateřskou buněčnou linii pCEP4 expresního vektoru; druhý řádek uvádí buněčnou linii Fl.Fc vektoru; třetí řádek uvádí buněčnou linii CT.Fc vektoru. Obr. 13C ukazuje westernový blot kondiciovaného média, získaného z Fl.Fc a CT.Fc fúzních proteinových expresních vektorů sondovaných Fc doménou anti-humánního IgGl (Pierce). První řádek uvádí výsledky pro buněčnou linii mateřského pCEP4 expresního vektoru; druhý řádek uvádí výsledky pro buněčnou linii Fl.Fc vektoru; a třetí řádek uvádí výsledky pro buněčnou linii CT.Fc vektoru.

Obr. 14 znázorňuje expresi humánního OPG v E. coli. Obr. 14A znázorňuje konstrukci bakteriálního expresního vektoru. LORF humánního OPG genu se amplifikoval PCR a následně napojil na oligonukleotidový spojovníkový fragment (horní řetězec je SEQ ID NO:137; spodní řetězec je SEQ ID NO:127) a ligoval do pAMG21 vektorové DNA. Výsledný vektor η e schooen exorimovat OPG zbvtkv 32-4 01 navázané na

N-koncový methioninový zbytek. Obr. 14B znázorňuje SDS-PAGE analýzu neindukovaného a prostředí, příznivého pro indukovaného pAMG21 -humánní plasmid. První řádek uvádí MW standardy;

bakteriálního

OPG 32-401 druhý řádek označuje neindukovanou bakterii; třetí řádek označuje indukci při 30°C; čtvrtý řádek označuje indukci při 37°C; pátý řádek označuje celobuněčný lyzát při 37°C; šestý řádek označuje rozpustnou frakci celobuněčného lyzátu; sedmý ·· ·♦ ··

01-1718-97 Če

řádek označuje nerozpustnou frakci celobuněčného lyzátu; a osmý řádek označuje purifikovaná inkluzní těla, získaná z celobuněčného lyzátu.

Obr. 15 znázorňuje analýzu rekombinantního myšího OPG, produkovaného v CHO buňkách pomocí SDS-PAGE a westernového blotu. V obou případech se použilo stejné množství CHO kondiciovaného média, při jehož přípravě se použil redukující vzorkový pufr (levý sloupec) nebo neredukující vzorkový pufr (pravý sloupec). Po elektroforéze se rozpuštěné proteiny transfektovaly na nylonovou membránu a následně sondovaly anti-OPG protilátkami. Relativní polohy 55 kd monomerní a 100 kd dimerní formy OPG jsou označeny šipkami.

Obr. 16 znázorňuje „pulse-chase analýzu rekombinantního myšího OPG produkovaného v CHO buňkách. CHO buňky se označily pulzováním s ³⁵S-methionin/cysteinem, a následně se vyhledávaly po předem stanovenou dobu. Metabolicky značené kultury se rozdělily jak do kondiciovaného média tak do buněk, které se čistily a následně imunologicky srážely pomocí anti-OPG protilátek, a z obou se připravily extrakty detergentů. Imunologicky získané sraženiny se rozpustily pomocí SDS-PAGE a exponovaly na film. Horní levý a pravý obdélník ukazuje výsledky, získané” při analýze ” vzorků ”za ne redukčních” podmínek. Spodní levý a pravý obdélník ukazuje výsledky, získané při analýze vzorků za redukčních podmínek; přičemž levé obdélníky poskytují výsledky pro buněčné extrakty, zatímco pravé obdélníky poskytují výsledky pro extrakty kondiciovaného média. Relativní mobilita 55 kd monomerní a 100 kd dimerní formy OPG jsou označeny pomocí šipek.

• »

01-1718-97 Če • · « ·· ··

Obr. 17 znázorňuje expresi OPG v CTLL-2 buněčné linii. Z CTLL-2 buněk a CHO-mu OPG [1-401] transfektovaných buněk se připravilo séra prosté kondiciované médium, které se následně zahustilo = a analyzovalo neredukčni SDS-PAGE a westernovým přenosem. Levý pruh označuje CTLL-2 kondiciované médium. Pravý pruh označuje CHO-muOPG kondiciované médium. Relativní mobilita 55 kd monomerní a 100 kd dimerní formy OPG jsou označeny pomocí šipek.

Obr. 18 znázorňuje detekci OPG exprese ve vzorcích séra a jaterních extraktech, získaných z kontrolních a OPG transgenických myší. Vzorky transgenické myši se připravily způsobem popsaným v příkladu 4. OPG exprese se vizualizovala po SDS-PAGE a následně westernovým přenosem za použití anti-OPG protilátek.

Obr. 19 znázorňuje účinky huOPG [22-401]-Fc fúzního proteinu in vitro na tvorbu osteoklastů. Test tvorby osteoklastů se provádí způsobem popsaným v příkladu 11A za nepřítomnosti (kontrolní) nebo za přítomnosti naznačených množství huOPG [22-401]-Fc fúze. Tvorba osteoklastů se vizualizovala histochemickým zabarvením vinanově rezistentní kyselinofosfatázy (TRAP). Obr. 19A znázorňuje OPG přidaný do 100 ng/ml. Obr. 19D znázorňuje OPG přidaný do 0,1 ng/ml. Obr. 19E znázorňuje OPG přidaný do 0,01 ng/ml. Obr. 19F znázorňuj e OPG přidaný’do 0, 001 ng/ml. Obr. 19G znázorňuje kontrolní vzorek bez přidání OPG.

Obr. 20 znázorňuje snížení TRAP aktivity osteoklastové kultury, k němuž dochází spolu se zvyšujícím se množstvím OPG. Při testu tvorby osteoklastů se použily naznačené koncentrace huOPG [22-401]-Fc fúzního proteinu a TRAP aktivita se kvantifikovala způsobem popsaným v příkladu 11A.

01-1718-97 Če • ··*· ·· ·· > · · « » · ·· ·· · · 4 • · « »· ··

Obr. 21 znázorňuje vliv OPG na konečné stadium diferenciace osteoklastů. HuOPG [22-401]-Fc fúze se přidala při provádění testu tvorby osteoklastů v průběhu středního stadia zrání osteoklastů (pátý až šestý den) nebo během konečného stadia zrání osteoklastů (sedmý až patnáctý den; CTL-OPG). TRAP aktivita se kvantifikovala a porovnala s aktivitou, pozorovanou za absence OPG (CTL-CTL) v přítomnosti OPG v celém testu (OPG-OPG).

Obr. 22 znázorňuje účinky IL-Ιβ, IL-Ια a OPG na krví ionizovaný vápník v těle myší. Hladiny krví ionizovaného vápníku se monitorovaly po aplikaci injekce samotného IL-Ιβ, samotného IL-la, IL-Ιβ plus muOPG [22-401]-Fc, IL-la plus MuOPG [22-401]-Fc a samotného muOPG [22-401]-Fc. Kontrolní myši přijaly pouze injekce fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS). IL-Ιβ experiment je znázorněný na obr. 22A. Experiment Il-la je znázorněn na obr. 22B.

Obr. 23 osteoklasty Histologické znázorňuje účinky OPG na kalvariální u kontrolních a ILl-ošetřených myší.

metody pro analýzu myších kalvariálních kostních vzorků jsou popsány v příkladu 11B. Šipky ukazují osteoklasty, obsažené ve vzorku myší po dvoudenním ošetřování. Obr. 23A znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně čtyři injekce PBS. Obr. 23B znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně jedna injekce IL-1 a tři injekce PBS. Obr. 23C znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně jedna injekce PBS a tři injekce OPG a obr. 23D znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně jedna injekce IL-1 a tři injekce OPG.

• ·

01-1718-97 Če

Obr. 24 znázorňuje radiografickou analýzu kostní akumulace v dřeňové dutině normálních myší. Myši se injektovaly subkutánně fyziologickým roztokem (obr. 24A) nebo muOPG [22-401]-Fc fúzí (5 mg/kg/den) po dobu čtrnácti dní (obr. 24B) a hustota kosti se určila způsobem popsaným v příkladu 11C.

Obr. 25 znázorňuje histomorfometrickou analýzu kostní akumulace v dřeňové dutině normálních myší. Injektáž a histologické testy se prováděly způsobem popsaným v příkladu 11C.

Obr. 26 znázorňuje histologickou analýzu kostní akumulace v dřeňové dutině normálních myší. Injektáž a histologické testy se prováděly způsobem popsaným v příkladu 11C. Obr. 2 6A znázorňuje injektáž fyziologickým roztokem a obr. 26B znázorňuje injektáž muOPG [22-401]-Fc fúzí.

Obr. 27 znázorňuje aktivitu OPG podaného krysám, kterým byly odňaty vaječníky. Tento jednotýdenní experiment ukázal, že OPG má tendenci blokovat řídnutí kosti a rovněž ukázal další anti-resorpční terapie. DEXA měření se provedla v okamžiku ovariektomie a jeden a dva týdny po ošetření. Výsledky se vyjádřily jako % změna počáteční ^.kostní^-hustoty—.(průměrná-hodnota—*./— SEM)-, - =

Obr. 28 znázorňuje kostní hustotu ve femorální metafýze, měřenou histomorfometrickými metodami, která, jak se zjistilo, je u krys zbavených vaječníků (OVX) nižší než u zvířat, u kterých byla tato operace pouze předstírána (SHAM) 17 dní po ovarioektomii. Tento vliv byl blokován OPG-Fc, přičemž OPG-Fc ošetřené krysy zbavené vaječníků (OVX+OPG) mají podstatně vyšší hustotu kosti než krysy • ·

01-1718-97 Če zbavené vaječníků a ošetřené vehikulem (OVX) (střední hodnota +/- SEM).

Nový člen nadrodiny receptorů faktoru nekrotizujícího tumor (TNFR) byl identifikován jako exprimované sekvenční zakončení (EST), izolované z intestinální cDNA knihovny zárodku krysy. Struktury celodélkových krysích cDNA klonů a odpovídajících myších a humánních cDNA klonů byly určeny a popsány v příkladech 1 a 6. Krysí, myší a humánní geny jsou znázorněny na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO:124). Všechny tři sekvence vykazovaly vysokou podobnost s extracelulárními doménami členů TNFR rodiny. Žádný z izolovaných celodélkových cDNA klonů nekódoval transmembránové a cytoplasmatické domény, jak by se u membránu vážících receptorů očekávalo, z čehož vyplývá, že tyto cDNA kódují spíše rozpustné sekretované proteiny než buněčné povrchové receptory. Část nukleotidů 1200-1353 tvořících humánní gen, znázorněných na obr. 9D, byla uložena do databáze Genové banky 22. listopadu 1995 pod přírůstkovým číslem 17188769.

Příklad 2 popisuje zjištěnou tkáňovou distribuci krysí a humánní mRNA. mRNA exprese u krys byla detekována v .,n o +

J VA VΊ a /-«on exprese byla zjištěna v ledvinách. Rovněž byla zjištěna exprese v kosterním svalu a slinivce, detekována exprese ve stejných tkáních

U lidí byla a rovněž v lymfatických uzlinách, brzlíku, slezině a slepém střevě.

Krysí cDNA se exprimovala v transgenických myších (příklad 3) za použití ApoE promotorového expresivního systému, specifického pro játra. Analýza expresorů ukázala • ·

01-1718-97 Če podstatné zvýšení hustoty kosti, zejména u dlouhých kostí (stehenních kostí), obratlů a plochých kostí (pánve). Histologická analýza zabarvených částí kosti ukazovala na závažnou osteopetrózu (viz příklad 4) naznačující značnou ^Jnerovnováhu mezi tvorbou kostní hmoty a resorpcí, která vedla k značné akumulaci kosti a chrupavky. Snížení počtu trabekulárních osteoklastů v kostech OPG expresorových zvířat naznačuje, že podstatnou část aktivity TNFRpříbuzného proteinu může představovat ochrana před kostní resorpcí, která je procesem zprostředkovávaným osteoklasty.

Z pohledu aktivity v transgenových expresorech jsou zde popsány TNFR-příbuzné proteiny, označené jako OPG.

Za použití krysí cDNA sekvence se izoloval myší a humánní cDNA klon (příklad 5) . Exprese myšího OPG v 2 93 buňkách a humánního OPG v bakterii E. coli je popsána v příkladech 7 a 8. Myší OPG se produkoval jako Fc fúze, která se čistila afinitní chromatografií (protein A). Příklad 7 rovněž popisuje expresi celodélkového a seříznutého humánního a myšího OPG polypeptidů v CHO a 293 buňkách buď jako expresi fúzních polypeptidů na Fc oblast humánního IgGl nebo jako expresi nekondenzovaných polypeptidů. Exprese celodélkového a seříznutého humánního a myšího OPG v E. coli buď jako Fc fúzních polypeptidů nebo jako nekondenzovaných polypeptidů je popsána v_ příkladu 8 . Purifikace rekombinantně produkovaného savčího a bakteriálního OPG je popsána v příkladu 10.

Biologická aktivita OPG se určila za použití in vitro testu osteoklastového zrání, in vivo modelu interleukinu-1 (IL-1) indukovaného hyperkalcemií a injekčních studií hustoty kosti u normálních myší (viz příklad 11). Následující OPG rekombinantní proteiny produkované v CHO • ·

01-1718-97 Če • · · • Φ

nebo 293 buňkách demonstrovaly v testu osteoklastového zrání aktivitu v E. coli: muOPG [22-185]-Fc, muOPG [22194]-Fc, muOPG [22-401]-Fc, muOPG [22-401], huOPG [22-201]Fc, huOPG [22-401]-Fc. muOPG [22-180]-Fc produkovaný v GHO buňkách a huOPG met[32-401] produkovaný v E. coli nedemonstrovaly aktivitu v in vitro testu.

OPG, získaný z několika zdrojů, se produkoval jako dimer a do určité míry jako vyšší multimer. Krysí OPG [22401] produkovaný v transgenických myších, muOPG [22-401] a huOPG [22-401] produkovaný jako rekombinantní polypeptid v CHO buňkách a OPG exprimovaný jako přirozeně se vyskytující produkt cytotoxické T buněčné linie tvořily převážně dimery a trimery, jak ukázala analýza na neredukčních SDS gelech (viz příklad 9). Seříznuté OPG polypeptidy mající delece v oblasti aminokyselin 186-401 (např. OPG [1-185] a OPG [1-194]) byly převážně monomerní z čehož vyplývá, že oblast 186-401 může být součástí samospojování OPG polypeptidů. Nicméně huOPG met[32-401], produkovaný v E. coli, byl z velké části monomerní.

OPG může být důležitý při regulaci kostní resorpce. Zdá se, že protein působí jako rozpustný receptor TNF rodiny a může bránit interakci mezi receptorem a ligandem, který se podílí na osteolytické dráze. Zdá se, že jedním aspektem regulace je redukce počtu osteokiastů.......

Nukleové kyseliny

Vynález poskytuje izolovanou nukleovou kyselinu, kódující polypeptid, který má alespoň jednu biologickou aktivitu OPG. Jak je zde uvedeno, biologické aktivity OPG

01-1718-97 Če

zahrnují neomezujícím způsobem veškeré aktivity zahrnující kostní metabolizmus a zejména zahuštění kostí. Nukleové kyseliny podle vynálezu se zvolí z následujícího výčtu kyselin:

a) sekvence nukleových kyselin, které jsou znázorněny na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO:120), obr. 9A až 9B (SEQ ID NO:122), resp. obr. 9C až 9D (SEQ ID NO:124) nebo jejich komplementární řetězce;

b) nukleové kyseliny, které hybridizují za přísných podmínek s polypeptid-kódující oblastí, znázorněnou na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO:120), obr. 9A až 9B (SEQ ID NO:122), resp. obr. 9C až 9D (SEQ ID NO:124);

c) nukleové kyseliny, které	hybridizuj í	za přísných
podmínek s nukleotidy 148 až	337 včetně	těch,	které
znázorňuje obr. IA; a
d) sekvence nukleových	kyselin,	které	tvoří
degenerované formy sekvencí (a) a	(b) .
Vynález poskytuje nukleové	kyseliny,	které	kóduj í

krysí, myší a humánní OPG stejně jako nukleové sekvence hybridizující na sekvence, které kódují polypeptid mající alespoň jednu biologickou aktivitu OPG. Vynález rovněž poskytuje nukleové kyseliny, které hybridizují na krysí OPG EST zahrnující nukleotidy 148-337, jak ukazuje obr. IA. Podmínkami pro hybridizaci jsou zpravidla vysoká přísnost, například 5xSSC, 50% formamid a 42°C, což jsou podmínky popsané v příkladu 1. Ekvivalentní přísnost s těmito podmínkami lze snadno získat nastavením koncentrací soli a organického rozpouštědla a nastavením teploty. Nukleové kyseliny v (b) zahrnují sekvence, kódující OPG-odvozené polypeptidy, které nepodléhají detekovatelné hybridizaci s dalšími známými členy TNF receptorové nadrodiny. U výhodného provedení jsou nukleovými kyselinami kyseliny,

01-1718-97 Če

znázorněné na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO:124).

Délka hybridizujících nukleových kyselin podle vynálezu může být různá, protože hybridizace může probíhat v části polypeptid-kódujících oblastí nebo ve všech polypeptid-kódujících oblastech, které jsou znázorněny na obr. 2B až 2C (SEQ ID N0:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO: 124) a může rovněž probíhat v sousedících nekódujících oblastech. Hybridizující nukleové kyseliny mohou tedy představovat seříznutí nebo rozšíření sekvencí znázorněných na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122) resp. 9C až 9D (SEQ ID NO:124). Sestřižené nebo rozšířené nukleové kyseliny jsou součástí vynálezu, pokud si zachovávají jednu nebo několik biologických vlastností OPG. Hybridizující nukleové kyseliny mohou rovněž zahrnovat sousední nekódující oblasti, které jsou 5' a/nebo 3' vzhledem k OPG kódující oblasti. Nekódující oblasti zahrnují regulační oblasti, které se podílí na OPG expresi, například promotory, zesílení, translační iniciační místa, transkripční terminační místa apod.

Hybridizační podmínky pro nukleové kyseliny popsal Sambrook a kol. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

DNA, kódující krysí OPG byla poskytnuta v plasmidu pMO-Bl.l, který byl uložen American Type Culture Collection, Rockville, MD, 27. prosince 1995, pod ATCC přírůstkovým číslem 69970. Myší OPG-kódující DNA byla poskytnuta ve formě plasmid pRcCMV-myší OPG, uloženého v American Type Culture Collection, Rockville, MD,

01-1718-97 Če

27. prosince 1995, pod přírůstkovým číslem 69971. Humánní OPG-kódující DNA byla poskytnuta ve formě plasmidového pRcCMV-humánního OPG a uložena v American Type Culture Collection, Rockville, MD, 27. prosince 1995, pod přírůstkovým číslem 69969. Nukleové kyseliny podle vynálezu budou hybridizovat za přísných podmínek na DNA inzerty, uložené pod ATCC přírůstkovými čísly 69969, 69970 a 69971, a mají alespoň jednu biologickou aktivitu OPG.

Vynález rovněž poskytuje deriváty sekvencí nukleových kyselin, které jsou znázorněny na obr. 2B, 9A a 9B. Jak je zde uvedeno, deriváty zahrnují sekvence nukleových kyselin mají adice, substituce, inzerty nebo delece jednoho nebo více zbytků, takže výsledné sekvence kódují polypeptidy mající jednu nebo více aminokyselinových zbytků, které byly přidány, vynechány, vloženy nebo substituovány a výsledný polypeptid má aktivitu OPG. Deriváty nukleových kyselin mohou tvořit přirozeně se vyskytující kyseliny, například variantu vzniklou sestřihem, nebo polymorfismus, nebo mohou být zkonstruovány pomocí technik místně směrované mutageneze, které jsou odborníkům v daném oboru dostupné. Příkladem přirozeně se vyskytující varianty OPG je nukleová kyselina, kódující změnu lys na asn na 3. zbytku vedoucí sekvence (viz příklad 5). Dá se předpokládat, že deriváty nukleových kyselin budou kódovat aminokyselinové změny v oblastech molekuly, ve kterých je nejméně pravděpodobné, že by došlo k narušení biologické aktivity. Další deriváty zahrnují nukleovou kyselinu, kódující formu OPG vážící membránu, která má extracelulární doménu, jak ukazují obr. 2B až 2C (SEQ ID N0:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO:124) spolu s transmembránovou a cytoplasmovou doménou.

• * · • ·

01-1718-97 Če

U jednoho provedení zahrnují deriváty OPG nukleové kyseliny, kódující seříznuté formy OPG z jejichž karboxylového konce byla odstraněna jedna nebo více aminokyselin. Nukleové kyseliny, kódující OPG, mohou postrádat na karboxylovém konci 1 až 216 aminokyselin. Oblast protilátky Fc může případně vybíhat z nového karboxylového konce a poskytovat tak biologicky aktivní OPG-Fc fúzní polypeptid (viz příklad 11) . U výhodných provedení nukleové kyseliny kódují OPG, který má aminokyselinovou sekvenci, totožnou se zbytky 22 až 185, 22 až 189, 22 až 194 nebo 22 až 201 (při použití číslování znázorněného na obrázcích 9E až 9F) a případně kódující Fc oblast humánního IgG.

Součástí jsou rovněž nukleové kyseliny, kódující seříznuté formy OPG, který postrádá jednu nebo více aminokyselin na N-konci. Seříznuté formy zahrnují formy postrádající část z 21 aminokyselin nebo všech 21 aminokyselin, obsahujících vedoucí sekvenci. Kromě toho vynález poskytuje nukleové kyseliny kódující OPG, který postrádá 1 až 10 aminokyselin na zralém N-konci (na

22. zbytku) a který postrádá případně 1 až 216 aminokyselin na C-konci (na 401. zbytku). Nukleové kyseliny mohou případně kódovat methioninový zbytek na N-konci. Příklady takových OPG seříznutých polypeptidů jsou popsány v příkladu 8.

Příklady nukleových kyselin podle vynálezu zahrnují cDNA, genomovou DNA, syntetickou DNA a RNA. cDNA se získala z knihoven připravených z mRNA, izolované z různých tkání exprimuj ících OPG. U lidí jsou tkáňovými zdroji OPG ledviny, játra, placenta a srdce. Genomová DNA, kódující » ♦ » · »· · ·♦

01-1718-97 Če

OPG se získala z genomových knihoven, které jsou komerčně dostupné pro celou řadu druhů. Syntetická DNA se získala chemickou syntézou vzájemně se překrývajících oligonukleotidových fragmentů, po které následovalo sestaveni fragmentů do rekonstituované části kódovací oblasti nebo do celé kódovací oblasti a lemovacích sekvencí (viz patent US 4,695,623, který popisuje chemickou syntézu interferonových genů). RNA se nejsnáze získala pomocí prokaryotických expresivních vektorů, které řídí vysokoúrovňovou syntézu mRNA, například pomocí vektorů používajících T7 promotory a RNA polymerázu.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu se používají pro deleci OPG sekvencí v biologických vzorcích při určování buněk a tkání, které exprimují OPG mRNA. Sekvence mohou být rovněž použity k prohledávání sekvencí příbuzných s OPG v cDNA a v genomových knihovnách. Takové prohledávání patří mezi metody, které jsou odborníci v oblasti, zabývající se deleci homologických sekvencí za vhodných hybridizačních podmínek, schopni běžně provádět. Nukleové kyseliny jsou rovněž užitečné při modulaci exprese OPG hladin protismyslnou terapií nebo genovou terapií. Nukleové kyseliny se rovněž používají při vývoji transgenických zvířat, která lze použít při produkci polypeptidů a při studii biologické aktivity (viz příklad 3). ~ ... . ______

Vektory a hostitelské buňky

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají expresní vektory, obsahující sekvence nukleových kyselin kódující OPG, hostitelské buňky, transformované uvedenými vektory, a způsoby přípravy OPG. Přehled exprese rekombinantních

01-1718-97 Če

proteinů lze nalézt v Methods of Enzymology sv. 185, Goeddel, D.V. ed. Academie Press (1990) .

Hostitelské buňky pro přípravu OPG zahrnují prokaryotické hostitelské buňky, například E. coli, kvasinkové, rostlinné, hmyzí a savčí hostitelské buňky. Pro expresi jsou vhodné například bakteriální kmeny E. coli HB101 nebo JM101. Výhodné savčí hostitelské buňky zahrnují COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, buňky ledvin nedospělého křečka (BHK) a další. Savčí hostitelské buňky jsou výhodné, pokud jsou pro OPG aktivitu důležité post-translační modifikace, například glykosylace a zpracování polypeptidu. Savčí exprese umožňuje produkci sekretovaných polypeptidu, které lze z růstového média izolovat.

Vektory pro expresi OPG obsahují minimální počet sekvencí potřebných pro propagaci vektoru a pro expresi klonovaného inzertu. Tyto sekvence zahrnují počátek replikace, selekční markér, promotor, ribozomové vazebné místo, sekvence zesilovače, místa RNA sestřihu a místa transkripční terminace. Vektory vhodné pro expresi v již zmíněných hostitelských buňkách jsou snadno dostupné. Nukleové kyseliny podle vynálezu se zavedou do vektorů pomocí standardních rekombinantních DNA technik. Součástí jsou rovněž vektory pro tkáňově specifickou expresi OPG.

Tyto vektory zahrnují promotory, které fungují při produkci v myších, specificky v játrech, ledvinách anebo dalších orgánech, a virové vektory pro expresi OPG v cílových lidských buňkách.

Při použití vhodného systému hostitel-vektor, se OPG produkuje rekombinantní kultivací hostitelské buňky, transformované expresním vektorem, obsahujícím sekvence

01-1718-97 Če

nukleových kyselin, které kódují OPG za podmínek, za kterých se produkuje OPG, a izolací produktu exprese. OPG se produkuje v supernatantu transfektovaných savčích buněk nebo v inkluzních tělech transformovaných bakteriálních hostitelských buněk. Takto vyprodukované OPG může být purifikováno postupy známými odborníkům v daném oboru, které budou popsány níže. Exprese OPG v savčích a bakteriálních hostitelských systémech je popsána v příkladech 7 a 8. Příkladem expresních vektorů pro savčí hostitele jsou plasmidy, například pDSRa, popsaný v PCT přihlášce č. 90/14363. Příkladem expresních vektorů pro bakteriální hostitelské buňky jsou plasmidy pAMG21 a pAMG22-His, popsané v příkladu 8. Plasmid pAMG21 byl uložen American Type Culture Collection, Rockville, MD, 24. července 1996 pod přírůstkovým číslem 98113. Plasmid pAMG22-His byl uložen American Type Culture Collection, Rockville, MD, 24. července 1996 pod přírůstkovým číslem 98112. Je zřejmé, že zde popsané specifické plasmidy a hostitelské buňky jsou pouze ilustrativními příklady a pro expresi polypeptidů mohou být použity další dostupné plasmidy a hostitelské buňky.

Vynález rovněž poskytuje expresi OPG z endogenních nukleových kyselin filtrací in vivo nebo ex vivo rekombinacemi,-.™ které umožňuj i modulaci-OPG=z- hostitelského chromozomu. Součástí je rovněž exprese OPG, jejíž podstatou je zavedení exogenních regulačních sekvencí (např. promotorů nebo zesilovačů), které jsou schopny řídit produkci OPG z míst, kódujících endogenní OPG. Vynález rovněž zahrnuje stimulaci endogenních regulačních sekvencí, schopných řídit produkci OPG (např. vystavením transkripčním zesilovacím faktorům).

01-1718-97 Če

Polypeptidy

Vynález poskytuje OPG, nový člen TNF receptorové nadrodiny, který vykazuje aktivitu souvisící s kostním metabolizmem. OPG je aktivní zejména při inhibici kostní resorpce, kdy zvyšuje hustotu kostní hmoty. OPG označuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci myšího, krysího nebo humánního OPG nebo jeho derivátu, které mají alespoň jednu z biologických aktivit OPG. Aminokyselinové sekvence krysího, myšího a humánního OPG jsou znázorněny na obrázcích 2B až 2C (SEQ ID N0:121), 9A až 9B (SEQ ID NO:123), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO:125). Derivát OPG označuje polypeptid obsahující adici, deleci, inzerci nebo substituci jedné nebo více aminokyselin, takže výsledný polypeptid má alespoň jednu z biologických aktivit OPG. Biologické aktivity OPG zahrnují neomezujícím způsobem aktivity, jejichž součástí je kostní metabolizmus. Tyto polypeptidy budou mít výhodně v N-koncové vedoucí sekvenci vynecháno 21 aminokyselin.

OPG polypeptidy, které spadají do rozsahu vynálezu, zahrnují krysí [1-401], krysí [22-180], krysí [22-401], krysí [22-401]-Fc fúzi, krysí [1-180]-Fc fúzi, myší [1401], myší [1-180], myší [22-401], humánní [1-401] , myší [22-180], humánní [22-401], humánní [22-180], humánní [1-180],'humánní [22-Í8Ó]-Fc fúzi a humánní met-32-401. Číslování aminokyselin je znázorněno v SEQ ID NO:121 (krysí), SEQ ID NO:123 (myší) a SEQ ID NO:125 (humánní). Součástí jsou rovněž polypeptidové deriváty, které mají delece nebo seříznuté C-konce, takže postrádají část aminokyselinových zbytků 180-401 OPG nebo všechny tyto zbytky; jednu nebo více aminokyselinových změn ve zbytcích 180 až 401; deleci části nebo celé domény OPG bohaté na

• · « • ·· (C-koncové) domény bohaté amínokvselinovvch změn v

01-1718-97 Če cystein, zejména deleci vzdálené na cystein; a jednu nebo více doméně bohaté na cystein, zejména ve vzdálené (C-koncové) doméně bohaté na cystein. U jednoho provedení má 'OPG ve zralém N-konci vynechánu 1 až přibližně 10 aminokyselin (přičemž zralým N-koncem je 22. zbytek) a případně 1 až přibližně 216 aminokyselin v C-konci.

Další OPG polypeptidy, které spadají do rozsahu vynálezu zahrnují: humánní [22-180]-Fc fúzi, humánní [22-201]-Fc fúzi, humánní [22-401]-Fc fúzi, myší [22-185]-Fc fúzi, myší [22-194]-Fc fúzi. Tyto polypeptidy se produkují v savčích hostitelských buňkách, například v CHO nebo v 293 buňkách. Dalšími OPG polypeptidy, které jsou součástí vynálezu, jsou následující polypeptidy, které se exprimují v prokaryotických hostitelských buňkách: humánní met[22-401], Fc-humánní met[22-401] fúze (Fc oblast je navázána na N-konec celodélkové OPG kódující sekvence, jak uvádí příklad 8), humánní met[22-401]-Fc fúze (Fc oblast se váže na celodélkovou OPG sekvenci),

Fc-myší met[22-401] fúze, myší met[22-401]-Fc fúze, humánní met[27-401], humánní met[22-185], humánní met[22-189], humánní met[22-194], humánní met[22-194] (P25A), humánní met[22-194] (P26A), humánní met[27-185], humánní met[27-189], humánní met[27-194], humánní met-agr-gly-ser(his)e [22-401], humánní met-lys [22-401], humánní met(lys)₃-[22-401], humánní met[22-401]-Fc (P25A), humánní met[22-401] (P25A), humánní met[22-401] (P26A), humánní met[22-401] (P26D), myší met[22-401], myší met[27-401], myší met[32-401], myší met[27-180], myší met[22-189], myší met[22-194], myší met[27-189], myší met[27-194], myší metlys [22-401], myší HEK[22-401] (A45T), myší met-lys• ·

01-1718-97 Če

(his)7[22-401], myší met-lys[27-401]-(his)₇ a myší met[27401] (P33E, G36S, A45P). Je zřejmé, že výše uvedené OPG polypeptidy, produkované v prokaryotických hostitelských buňkách, mají N-koncový methioninový zbytek, pokud není tento zbytek přímo označen. U konkrétních příkladů se při produkci OPG-Fc fúze použila oblast, tvořená 227 aminokyselinami humánního IgGl-γΙ, která měla sekvenci uvedenou Ellisonem a kol. v (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1998)). Nicméně rovněž mohou být použity další varianty Fc oblasti humánního IgG.

Analýza biologické aktivity C-koncových OPG sestřihů, kondenzovaných s humánní IgGl Fc oblastí, označuje část OPG tvořenou přibližně 164 aminokyselinami, které jsou potřebné pro danou aktivitu. Tato oblast zahrnuje aminokyseliny 22-185, výhodně aminokyseliny znázorněné na obrázcích 9C až 9D (SEQ ID NO:125), a obsahuje čtyři domény, bohaté na cystein, které jsou charakteristické pro domény bohaté na cystein TNFR extracelulárních domén.

Při použití homologie mezi OPG a extracelulárními doménami vážícími ligandy členů rodiny TNF receptoru, se na základě známé krystalické struktury extracelulární domény TNFR-I vyrobil trojrozměrný model OPG (viz příklad 6) . Tento model se použil při identifikaci těch zbytků v OPG, které by mohly být důležité pro biologickou aktivitu. Byly identifikovány cysteinové zbytky, které se podílejí na udržení struktury čtyř domén bohatých na cystein. V modelu se identifikovaly následující disulfidové vazby: doména 1: cys41 na cys54, cys44 na cys62, tyr23 a his66 mohou stabilizovat strukturu této domény; doména 2: cys65 na cys80, cys83 na cys98, cys87 na cysl05; doména 3: cysl07 na cysll8, cys!24 na cysl42; doména 4: cysl45 na cysl60, • ·

01-1718-97 Če

·· ·· • · · 1 • · ·· ·· · · • · « ·· ·· cysl66 na cysl85. Jak ukazují obrázky 11 a 12A až 12B, rovněž se identifikovaly zbytky, které ležely v těsné blízkosti TNFP. U tohoto modelu se dá předpokládat, že se OPG váže na odpovídající ligand; TNFP se použije jako modelový ligand pro simulaci interakce OPG s jeho ligandem. Na tomto modelu se ukázalo, že pro navázanost ligandů jsou důležité následující zbytky v OPG: glu34, lys43, pro66 až gln91 (zejména pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glu90 a gln91), glul53 a serl55.

Změny v těchto aminokyselinových zbytcích, buď samostatně nebo v kombinaci, mohou ovlivnit biologickou aktivitu OPG. Například změny specifických cysteinových zbytků mohou změnit strukturu jednotlivých domén bohatých na cystein, zatímco změny zbytků, které jsou důležité pro vaznost ligandů, mohou ovlivnit fyzikální interakce OPG s ligandy. Strukturní modely mohou pomoci při identifikaci analogů, které mají žádanější vlastnosti, například zvýšenou biologickou aktivitu, vyšší stabilitu nebo snažší způsob formulace.

Vynález rovněž poskytuje OPG multimer, který obsahuje OPG monomery. Zdá se, že OPG je aktivní jako multimer (například dimer, trimer, multimer obsahující vyšší počet monomerů). Výhodně jsou OPG multimery dimery nebo trimery. OPG multimery mohou obsahovat monomery, které mají aminokyselinovou sekvenci OPG, dostačující pro podporu multimerní formace, nebo mohou obsahovat monomery, které mají heterologické sekvence, například oblast protilátky Fc. Z analýzy C-koncových delecí OPG vyplývá, že alespoň část oblasti 186-401 je ve spojení s OPG polypeptidy. Substituce části oblasti OPG aminokyselin 186-401 nebo celé

9 • « » · 9

9

01-1718-97 Če této oblasti aminokyselinovou sekvenci, která je schopna samospojeni, spadá rovněž do rozsahu vynálezu. Alternativně mohou být OPG polypeptidy nebo jejich deriváty modifikovány za vzniku dimerů nebo multimerů místně cílenou mutagenezi, která vede k vytvoření nezpárovaných cysteinových zbytků pro rotaci meziřetězcové disulfidové vazby, fotochemickým zesíťováním, například vystavením UV světlu, nebo chemickým zesíťováním dvoufunkčními spojovacími molekulami, například dvoufunkčním polyethylenglykolem apod.

Součástí vynálezu jsou i modifikace OPG polypeptidů, přičemž tyto modifikace zahrnují post-translační modifikace (např. N-navázaný nebo O-navázaný uhlohydrátový řetězec, zpracování N-konce nebo C-konce), přichycení chemických zbytků na aminokyselinový hlavní řetězec, chemické modifikace N-navázaného nebo O-navázaného uhlohydrátového řetězce a přidání N-koncového methioninového zbytku v důsledku exprese prokaryotické hostitelské buňky. Polypetidy mohou být rovněž modifikovány tak, aby je bylo možné detekovat, například enzymaticky, pomocí fluorescenční látky, pomocí isotopu nebo afinitním značením, které umožní detekovat a izolovat protein.

Další modifikace OPG zahrnují chimérické proteiny, ve kterých je OPG kondenzován na heterologickou amiňokysěiinóvdu sekvenci. Heterologickou sekvencí může být libovolná sekvence, která umožní výslednému fúznímu proteinu ponechat si aktivitu OPG. Heterologové sekvence zahrnují například imunoglobulinové fúze, například Fc fúze, které mohou pomoci při purifikací tohoto proteinu. Výhodná je heterologická sekvence, která podporuje spojení OPG monomerů do formy dimerů, trimerů a dalších vyšších multimerních forem.

01-1718-97 Če

Polypeptidy podle vynálezu se izolují a purifikují od dalších polypeptidů přítomných ve tkáních, buněčných liniích a transformovaných hostitelských buňkách exprimuj ících - OPG, nebo j sou purifikovány od složek buněčných struktur obsahujících sekretovaný protein. U jednoho provedení je polypeptid uvolněn ze spojení s dalšími humánními proteiny jako expresní produkt bakteriální hostitelské buňky.

Vynález rovněž poskytuje chemicky modifikované deriváty OPG, které mohou poskytovat další výhody, například zvýšení stability a cirkulační doby polypeptidů, nebo snížení imunogenicity (viz patent US 4,179,337). Chemické zbytky pro derivaci lze zvolit z vodou rozpustných polymerů, například polyethylenglykolu, kopolymeru ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulózy, dextranu, polyvinylalkoholu apod. Polypeptidy mohou být modifikovány v nahodilých polohách molekuly nebo v předem stanovených polohách molekuly a mohou zahrnovat jeden, dva, tři nebo více navázaných chemických zbytků.

Polymerem může být polymer s libovolnou molekulovou hmotností a může být větvený nebo přímý. Pro polyethylenglykol je z důvodu snadné manipulace a výroby výhodnou molekulovou hmotností přibližně 1 kDa až 100 kDa (výraz přibližně označuje, že v přípravcích polyethylenglykolu budou některé molekuly těžší a některé lehčí než stanovená molekulová hmotnost). Je zřejmé, že lze použít polymery s jinou molekulovou hmotností, přičemž jejich velikost bude závislá na požadovaném terapeutickém profilu (například na požadované době trvání dlouhodobého uvolňování, účincích, biologické aktivitě, obtížnosti manipulace, stupni nebo nedostatku antigenicity a dalších

01-1718-97 Če • · ·· • * • · • · ···· ··· ·· · ·· «

·* ·· • · · • · ·· ··· · • · ··· ··*· známých vlivech polyethylenglykolu na terapeutický protein nebo jeho analog).

Při navázání molekul polyethylenglykolu (nebo dalších chemických zbytků) na protein by se měly zvážit všechny možné vlivy na funkční nebo antigenní domény proteinu. Odborníci v daném oboru mají k dispozici celou řadu možných způsobů navázání, například způsob popsaný v dokumentu EP 0 401 384 (navázání PEG na G-CSF) , viz rovněž Malik a kol., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (popisující pegylaci GM-CSF pomocí tresylchloridu). Polyethylenglykol lze například kovalentně navázat pomocí aminokyselinových zbytků přes reakční skupinu, například přes volnou aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu. Reakčními skupinami jsou ty skupiny, na které lze navázat molekuly aktivovaného polyethylenglykolu. Aminokyselinové zbytky, které mají volnou aminoskupinu, mohou zahrnovat lysinové zbytky a N-koncové aminokyselinové zbytky; a ty, které mají volnou karboxylovou skupinu mohou zahrnovat zbytky tvořené kyselinou asparágovou, zbytky tvořené kyselinou glutamovou a C-koncový aminokyselinový zbytek. Jako reakční skupinu pro navázání molekuly (molekul) polyethylenglykolu lze rovněž použít merkaptoskupiny. Pro terapeutické účely je výhodné navázání na aminoskupinu, například navázání na N-konec nebo lysinovou skupinu. __ __ ₌

Někdy může být žádoucí konkrétní N-terminačně chemicky modifikovaný protein. Při použití polyethylenglykolu jako ilustrativního příkladu kompozic podle vynálezu lze polyethylenglykol zvolit z celé řady polyethylenglykolových molekul (s různou molekulovou hmotností, různým větvením, atd.). Rovněž lze zvolit různé poměry polyethylenglykolových molekul ku molekulám proteinu • ·

Ρ

01-1718-97 Če

(nebo peptidu) v reakční směsi, typy pegylačních reakcí, které se mají provést a způsoby získání zvoleného N-terminačně pegylovaného proteinu. Způsobem získání N-terminačně pegylátovaného přípravku (tj. separování tohoto zbytku od dalších monopegylátovaných zbytků v případě potřeby) itiůže být purifikace N-terminačně pegylovaného materiálu z populace pegylovaných proteinových molekul. Selektivní N-terminační chemickou modifikaci lze provádět redukční alkylací, která využívá různou reaktivitu různých typů primárních aminoskupin (lysin versus Nzakončení) dostupných pro derivatizaci v konkrétním proteinu. Za. vhodných reakčních podmínek je možné pomocí polymeru, obsahujícího karbonylovou skupinu, dosáhnout v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci.

Syntetické OPG dimery mohou být připraveny celou řadou různých způsobů chemického síťování. OPG monomery mohou být chemicky spojeny libovolným způsobem, který zachová nebo zvýší biologickou aktivitu OPG. Pro tyto účely lze použít široké spektrum chemických síťovacích činidel, přičemž tato činidla se zvolí v závislosti na požadovaném proteinovém dimeru. Síťovací činidla mohou být například krátká a relativně tuhá nebo delší a pružnější, mohou být biologicky reverzibilní a mohou poskytovat sníženou imunogenicitu nebo delší farmakokinetický poločas života. _ __ _

U jednoho příkladu se OPG molekuly naváží přes N-konec dvoustupňovou syntézou (viz příklad 12). V prvním stupni se OPG chemicky modifikuje na N-konci tak, že se na tento konec zavede chráněná thiolová skupina, která se po purifikaci zbaví ochranné skupiny a použije jako místo navázání při místně specifické konjugaci, při které se druhá OPG molekula může navázat přes celou řadu různých

01-1718-97 Če síťovacích činidel. N-koncové příčné vazby zahrnují neomezujícím způsobem disulfidovou vazbu, thioetherové vazby využívající bis-funkční alifatická síťovací činidla s krátkým řetězcem -a thioetherové vazby na dvoufunkční polyethylenglykolová síťovací činidla s různými délkami (PEG „dumbbells) . Součástí PEG „dumbbells syntézy OPG dimerů je rovněž vedlejší produkt této syntézy, který se označuje jako „monobell. OPG „monobell je tvořen monomerem, navázaným na lineární dvoufunkční PEG přes volný polymerní konec. Alternativně lze OPG zesíťovat přímo přes celou řadu pro amin specifických homobifunkčních síťovacích technik, které zahrnují použití reakčních činidel, jakými jsou například: dianhydrid kyseliny diethylentriaminpentaoctové (DTPA), p-benzochinon (pBQ) nebo bis(sulfosukcinimidyl)suberát (BS³) a rovněž dalších v daném oboru známých činidel. Je rovněž možné navázat reakční činidla, jakým je například iminothiolan, v přítomnosti různých dvoufunkčních, pro thiol specifických, síťovacích činidel, například bismaleinimidu, na thiolát OPG a dosáhnout tak dimerace a/nebo vytvoření „dumbbells v jediném provozním kroku.

Součástí vynálezu je rovněž způsob purifikace OPG z přírodních zdrojů a z transfektovaných hostitelských buněk. Purifikační proces_ lze provádět v jednom__nebo ^íce standardních proteinových purifikačních krocích, prováděných v pořadí vhodném pro získání purifikovaného proteinu. Chromatografické kroky mohou obsahovat výměnu iontů, gelovou filtraci, hydrofobní interakci, reverzní fázi, chromatografické zaměření, afinitní chromatografií používající anti-OPG protilátku nebo biotin-streptavidinový afinitní komplex apod.

• · • · e «

01-1718-97 Če • · · ·

Protilátky

Součástí vynálezu jsou rovněž protilátky, specificky se vážící na OPG. Antigeny pro generování protilátek mohou být celodélkové peptidy nebo peptidy tvořené částí OPG sekvence. Imunologické postupy pro generování polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, reagujících s OPG, jsou odborníkům v daném oboru známy (viz například Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y.(1988)). Takto vyráběné protilátky jsou charakteristické vazebnou specifičností a jsou epitopově rozlišitelné pomocí standardních imunosorpčních testů, využívajících navázání enzymu. Protilátky rovněž zahrnují chimérické protilátky, které mají variabilní doménové oblasti a konstantní doménové oblasti, odvozené z různých druhů. U jednoho provedení jsou chimérickými protilátkami humanizované protilátky, které mají myší variabilní domény a humánní konstantní doménu. Součástí vynálezu jsou rovněž komplementární určovací oblasti, naroubované na humánní síť (tak zvané CDR-roubované protilátky). Chimérické a CDRroubované protilátky jsou vyrobeny rekombinantními způsoby, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Součástí jsou rovněž lidské protilátky vyprodukované v myších.

.....Anti-OPG protilátky podle vynálezu mohou být použity jako afinitní reakční činidlo při purifikaci OPG z biologických vzorků (viz příklad 10). U jednoho způsobu se protilátka imobilizuje na CnBr-aktivované Sepharose a sloupec konjugátu protilátka-Sepharosa se použije při odstraňování OPG z kapalných vzorků. Protilátky se rovněž používají jako diagnostická reakční činidla pro detekci a

01-1718-97 Če kvantifikaci OPG v biologických vzorcích v případě, že se detekce a kvantifikace provádí níže popsaným způsobem.

Farmaceutické kompozice

Vynález rovněž poskytuje farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidů podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem, rozpouštědlem, emulgátorem, konzervační látkou a/nebo adjuvansem.

Výraz „terapeuticky účinné množství znamená množství, které poskytuje terapeutický účinek pro specifikovaný stav a způsob podání. Kompozice může být v kapalné nebo lyofilizované formě a obsahuje ředidlo (Tris, acetát nebo fosfátové pufry), které má různé pH hodnoty a iontové síly, rozpouštědlo, například Tween nebo Polysorbát, nosiče, například albumin lidského séra nebo želatinu, konzervační látky, například kyselinu askorbovou nebo pyrosiřičitan sodný. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají kompozice, obsahující OPG modifikovaný vodou rozpustnými polymery, které zvyšují jejich rozpustnost nebo stabilitu. Kompozice mohou rovněž obsahovat zabudování OPG do liposomů, mikroemulzí, micel nebo vehikul, které umožní dlouhodobou kontrolovanou dopravu účinné látky. OPG kompozice mohou konkrétně obsahovat zabudování do polymerních matric, například hydrogelů, silikonů, polyethylenů, kopolymerů ethylenu a vinylacetátu nebo biologicky degradovatelných polymerů. Použitelnými hydrogely jsou například polyhydroxyalkylmethakryláty (p-HEMA.), polyakrylamid, polymethakrylamid, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol a různé polyelektrolytové komplexy. Příkladem biologicky

01-1718-97 Če degradovatelných polymerů jsou například kyselina póly(2hydroxypropanová) (PLA), kyselina polyglykolová (PGA), kopolymery PLA a PGA, polyamidy a kopolymery polyamidů a polyesterů. - Další kontrolované se uvolňující formulace zahrnují mikrokapsle, mikrokuličky, makromolekulami komplexy a polymerní perličky, které lze podávat formou inj ekcí.

Volba příslušné kompozice bude záviset na množství faktorů včetně stavu, který je léčen, způsobu podání a požadovaných farmakokinetických parametrech. Rozsáhlejší přehled složek vhodných pro farmaceutické kompozice lze nalézt v Remington⁷ s Pharmaceutical Sciences, 18. vydání A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980).

Kompozice podle vynálezu lze podávat formou injekce, buď subkutánní, intravenózní nebo intramuskulární, nebo orální, nazální, pulmonární nebo rektální cestou. Volba způsobu podání může eventuálně záviset na řadě faktorů a pro odborníka v daném oboru by neměl být problém zvolit v konkrétních případech nejvhodnější způsob aplikace.

Vynález rovněž poskytuje farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství nukleových kyselin podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným adjuvansem. Kompozice nukleových kyselin budou vhodné pro dopravu části oblasti kódující OPG nebo ceíé této oblasti do buněk a tkání jako část protismyslného nebo genového terapeutického režimu.

• o

01-1718-97 Če

Způsob léčení

Kostní tkáň tvoří oporu těla a je tvořena minerálem (z velké části vápníkem a fosforem), matricí tvořenou kolagenovými a nekolagenovými proteiny, a buňkami. V kosti se nachází tři typy buněk, t j. osteocyty, osteoblasty a osteoklasty, které se podílí na dynamickém procesu, pomocí kterého se kost kontinuálně tvoří a resorbuje. Osteoblasty podporují tvorbu kostní tkáně, zatímco osteoklasty jsou spojovány s resorpcí. Resorpce, neboli rozpouštění kostní matrice a minerálu, je rychlý a efektivní proces ve srovnání s tvorbou kosti a může z kosti uvolňovat velké množství minerálů. Osteoklasty se podílí na regulaci normálního přetváření kosterní tkáně a resorpci, indukované hormony. Resorpce je například stimulována sekrecí parathyroidového hormonu v odpovědi na zvýšení koncentrace vápníkových iontů v extracelulárních tekutinách. Na druhé straně, inhibice resorpce je základní funkcí kalcitoninu. Kromě toho metabolity vitaminu D ovlivňují citlivost kosti na parathyroidový hormon a kalcitonin.

Po dozrání skeletu množství kosti v kostře odráží rovnováhu (nebo nerovnováhu) tvorby kosti a resorpce kosti. Maxima kostní dřeň dosahuje po dozrání kostry, před čtvrtou dekádou. Mezi čtvrtou a pátou dekádou se rovnováha posouvá a dominuje' kostní resorpce. Nevyhnutelné snížení kostní hmoty, k němuž dochází s rostoucím věkem, se projevuje dříve u žen než u mužů a u některých žen dochází k jejímu podstatnému zrychlení po menopauze (zejména u Evropanek a Asiatek).

Osteopenie je chorobným stavem obecně se týkajícím jakéhokoliv snížení kostní hmoty pod normální úroveň. Tento

01-1718-97 Če

chorobný stav může vznikat v důsledku zpomalení syntézy kosti nebo urychlení destrukce kosti, nebo obojího. Nejběžnější formou osteopenie je primární osteoporóza, která je rovněž označována jako postmenopauzální a senilní osteoporóza. Tato forma osteoporózy je stav projevující se celkovou ztrátou kostní hmoty, ke které dochází s rostoucím věkem a vzniká zpravidla v důsledku zvýšení resorpce kostní hmoty při normální rychlosti tvorby kostní hmoty. Přibližně u 25 až 30 % všech bělošek ve Spojených státech amerických se vyvinula symptomatická osteoporóza. Rovněž byl zjištěn přímý vztah mezi osteoporózou a výskytem fraktury kyčelní kosti, stehenní kosti, fraktury krčku a intertrochanterické fraktury u žen, starších 45 let. U mužů se symptomatická osteoporóza vyvíjí mezi 50. až 70. rokem věku, nicméně bylo zjištěno, že tato choroba postihuje převážně ženy.

Příčina postmenopauzální a senilní osteoporózy není známa. Bylo identifikováno několik faktorů, které se podílí na vývoji tohoto chorobného stavu. Mezi těmito faktory lze například zmínit změnu hladiny hormonů, která doprovází stárnutí a neadekvátní spotřebu vápníku, která se podílí na snížení intestinální absorpce vápníku a dalších minerálů. Léčení zpravidla zahrnuje hormonální terapii nebo podávání dietetických doplňků, které mají zpomalit tento proces. Nicméně do současné doby nebyl nalezen efektivní způsob léčení řídnutí kosti.

Vynález poskytuje způsob léčení kostních onemocnění, jehož podstata spočívá v podání terapeuticky účinného množství OPG. Kostním onemocněním může být libovolné onemocnění charakteristické celkovou ztrátou kostní hmoty (osteopenie nebo osteolýza). Léčení pomocí OPG se zpravidla

01-1718-97 Če

nasadí v případě, kdy je třeba potlačit resorpci kosti. Léčením lze tedy redukovat resorpci kosti, pokud tato resorpce převyšuje normální stav, nebo lze tímto způsobem -léčení, snížit resorbci- pod normální -hodnotu a kompenzovat tak nižší úroveň tvorby kostní hmoty.

Chorobné stavy, které lze léčit pomocí OPG jsou následuj ící:

osteoporóza, například primární osteoporóza, endokrinní osteoporóza (hyperthyroidismus, hyperparathryoidismus, Cushingova nemoc a akromegalie), dědičné a vrozené formy osteoporózy (vrozená lomivost kostí, homocystinurie, Menkesův syndrom a Riley-Dayův syndrom) a osteoporóza, způsobená imobilizací končetin;

Pagetovo onemocnění kosti (deformující zánět kostí) u dospělých a adolescentů;

osteomyelitida nebo infekční léze v kosti, vedoucí ke ztrátě kostní hmoty;

hyperkalcemie, která je výsledkem pevných nádorů (prsu, plic a ledvin) a hematologická zhoubná bujení (mnohotný myelom, lymfom a leukemie), idiopatická hyperkalcemie a hyperkalcemie spojovaná s hyperthryoidismem a onemocnění renálních funkcí;

pooperační osteopenie indukovaná podáním steroidů a spojovaná s chorobami tenkého a tlustého střeva a chronickými hepatickými a renálními chorobami;

osteonekróza, neboli smrt kostních buněk, spojovaná s traumatickým úrazem nebo netraumatickou nekrózou, souvisící s Gaucherovou chorobou, srpkovitost, systemický lupus erythematosus a další chorobné stavy;

··

01-1718-97 Če ztráta kostní hmoty způsobená kloubním revmatismem;

periodontální ztráta kostní hmoty;

osteolytická metastáze.

Je zřejmé, že OPG lze použít samotný nebo ve spojení s dalšími faktory při léčení kostních onemocnění. U jednoho provedení se použije osteoprotegerin ve spojení s terapeuticky účinným množstvím faktoru, který stimuluje tvorbu kostní hmoty. Tyto faktory zahrnují neomezujícím způsobem kostní morfogenní faktory označené BMP-1 až BMP12, transformační růstový faktor-β (TGF-β) a členy TGF-β rodiny, interleukinové-1 inhibitory, TNFa inhibitory, parathyroidový hormon a jeho analogy, protein odvozený od parathyroidu a jeho analogy, E série prostaglandinů, bisfosfonáty (například alendronát a další) a kostobohacující minerály, například fluorid a vápník.

01-1718-97 Če

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace a izolace krysí OPG cDNA

Materiály a způsoby klonování a analýzy cDNA jsou popsány v Maniatis a kol., tamtéž. Polymerázové řetězové reakce (PCR) se prováděly za použití termocykleru PerkinElmer 9600 a PCR reakční směsi (Boehringer-Mannheim) a koncentracích primeru specifikovaných výrobcem. Zpravidla se 25 až 50 μΐ reakční směsi denaturovalo při 94 °C, načež následovalo 20 až 4 0 cyklů, při kterých se směs ohřála na pět sekund na 94°C, posléze ochladila na 5 sekund na 50 až 60°C a opět ohřála na 3 až 5 minut na 72°C. Po skončení zmíněných cyklů se směs ohřála na 3 až 5 minut na teplotu 72’C. Potom se reakční směs analyzovala gelovou elektroforézou, jak popisuje Maniatis a kol., tamtéž.

Pro potřeby EST analýzy (Adams a kol., Science 252, 1651-1656 (1991)) se za použití mRNA izolované z zárodečného d20 střeva zkonstruovala cDNA knihovna. Zárodkům krys se při pitvě odebralo celé tenké a tlusté střevo a promylo se v PBS. Celá buněčná RNA se purifikovala kyselinovou guanidinium thiokyanát-fenol-chloroformovou extrakcí^-” (Chomczynski a Sacchi, Anal. Biochem. 162, Ϊ56159, (1987)). Póly (A+) mRNA frakce se získala z celkového RNA preparátu adsorpcí na Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) a elucí z Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) za použití výrobcem doporučených postupů. cDNA knihovna nahodilých primérů se připravila za použití systému „Superscript Plasmid System (Gibco BLR, Gaithersburg, Md). Nahodilý cDNA primer obsahující vnitřní restríkční místo, • ·

01-1718-97 Če

který se použil pro iniciaci syntézy prvního řetězce, měl následující sekvenci:

5' -AAAGGAAGGAAAAAAGCGGCCGCTACANNNNNNNNT-3' (SEQ ID NO: 1) Not I

Pro syntézu prvního řetězce samostatné reakční směsi, které póly (A) RNA a 120 ng, 360 ng nebo 1,080 ng nahodilého primeru. Po syntéze druhého řetězce se reakční produkty samostatně extrahovaly směsí fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu (poměr 25:24:1), načež se vysrážel ethanol. Dvouřetězcové (ds) cDNA produkty tří reakčních směsí se sloučily a ligovaly na následující ds oligonukleotidový adaptér:

se připravily tři obsahovaly 2,5 μς

5'-TCGACCCACGCGTCCG-3' (SEQ ID NO: 2)

3'-GGGTGCGCAGGCp-5' (SEQ ID NO: 3)

Po ligaci se cDNA kompletně digerovala pomocí Not I, extrahovala směsí fenolu, chloroformu a isoamylu (poměr 25:24:1) za vysrážení alkoholu a ethanolu. Resuspendovaná cDNA se následně frakcionalizovala podle velikosti gelovou filtrací za použití předem připravených sloupců opatřených Předepsaným plasmidovým systémem (Superscript Plasmid System) (Gibco BLR, Gaithersburg, Md) způsobem doporučeným výrobcem.

Byly odebrány dvě frakce obsahující největší cDNA produkty, a po vysrážení ethanolu se přímo ligovaly do Not I a Sal I digerovaných pMOB vektorem DNA (Strathmann a kol., 1991). Ligovaná cDNA se elektroporací zavedla do kompetentní ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BLR, Gaithersburg, MD) . Pro účely automatické sekvenční analýzy ♦ φ φ ·φ φ · φφφ φ · • φφφ

01-1718-97 Če se přibližně 10 000 transformantů umístilo do 20 cm x 20 cm agarových ploten obsahujících ampicilinem obohacené LB živné médium. Vzrostlé kolonie se sklidily a uspořádaly na 96jamkové mikrotitrové plotny obsahující 200 ml ¹L-živné půdy, 7,5% glycerol a 50 gg/ml ampicilinu. Kultury, které vzrostly přes noc při 37°C a duplikační sada mikrotitrových ploten, které se připravily použitím sterilního 96kolíkového replikačního nástroje, se pro účely další analýzy uložily při -80°C. Při klonování celodélkové cDNA se na 96 bakteriálních ampicilínových ploten, z nichž každá obsahovala přibližně 10 000 klonů, umístil přibližně jeden milion transformantů. Plasmidová DNA z každé jamky se

samostatně izolovala za	použití	sady	Qiagen Plasmid Maxi
Kit (Qiagen Corp.,	Germany)	a	rozmístila	se do
96mikrotitrových ploten	pro účely	PCR	analýzy.
Pro sekvencování	nahodilých	fetálních	krysích

intestinálních cDNA klonů se glycerolové sady roztály a malé alikvotní podíly se naředily destilovanou vodou v poměru 1:25. Přibližně 3,0 μΐ naředěných bakteriálních kultur se přidaly do PCR reakční směsi (BoehringerMannheim), která obsahovala následující oligonukleotidy:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO: 4)

5'CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO: 5)

Reakční směsi se inkubovaly v termocykleru (PerkinElmer 9600) za následujících cyklických podmínek: 94°C po dobu 2 minut; 30 cyklů zahrnujících 5 sekund při 94°C, 5 sekund při 50°C a 3 minuty při 72°C; a na závěr 4 minuty při 72°C. Po inkubaci v termocykleru se reakční směsi naředily 2,0 ml vody. Amplifikované DNA fragmenty se dále purifikovaly za použití sloupců Centricon (Princeton

01-1718-97 Če

Separations) a postupů doporučených výrobcem. PCR reakční produkty se sekvencovaly na automatizovaném DNA sekvenceru Applied Biosystems 373A za použití reakcí T3 primeru (oligonukleotid 353-23; 5'-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3') (SEQ ID NO: 6) Taq barvivo-terminátoru (Applied Biosystems) prováděných podle doporučení výrobce.

Výsledná 5' nukleotidová sekvence, získaná z nahodile sebraných cDNA klonů, se translatovala a následně porovnávala s existující databází známých proteinových sekvencí za použití modifikované verze programu FASTA (Pearson a kol., Meth. Enzymol. 183, (1990)). Translatované sekvence se rovněž analyzovaly z hlediska přítomnosti specifického, na cystein bohatého, proteinového motivu, nalezeného ve všech známých členech nadrodiny tumor nekrotizujícího faktorového receptoru (TNFR) (Smith a kol., Cell 76, 959-962 (1994)) za použití sekvenční profilové metody Gribskova a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)), modifikované Luethem a kol. (Protein Science 3, 139-146 (1994)).

Za použití dat získaných analýzou FASTA a Profilové analýzy se jako možný nový člen TNFR nadrodiny identifikoval EST, FRI-1 (fetální krysí intestin-1). FRI-1 obsahoval přibližně 600bp inzert s LORF přibližně 150 aminokyselin. Nejblíže odpovídajícím TNFR byl v databázi humánní typ II TNFR (TNFR-2). Porovnávaná oblast v rozsahu této přibližně 150 ak LORF vykazovala přibližně 43% homologii mezi TNFR-2 a FRI-1. Profilová analýza, využívající první a druhou cysteinem obohacenou repetici TNFR nadrodiny, poskytla Z skoré přibližně 8, což naznačuje, že FRI-1 gen možná kóduje nový člen rodiny. Za účelem zjištění dedukce struktury FRI-1 produktu se fetální

01-1718-97 Če

krysí intestinální cDNA knihovna prohledávala s cílem určit celodélkové klony. Následující oligonukleotidy se odvodily z původní FRI-1 sekvence:

5' -GCATTATGACCCAGAAACCGGAC-3' 5' -AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3' (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8)

Tyto primery se použily v PCR reakcích při prohledávání 96 jamek plasmidové DNA, přičemž každá jamka obsahovala plasmidovou DNA z 10 000 nezávislých cDNA klonů. Přibližně 1 gg plasmidové jamkové DNA se amplifikoval v PCR reakční směsi (Boehringer-Mannheim) za použití PerkinElmerova 96jamkového termocykleru za následujících cyklických podmínek: 2 minuty při 94 °C, jeden cyklus; 15 sekund při 94 °C, následně 45 sekund při 65°C, 30 cyklů; 7 minut při 65°C, 1 cyklus. PCR reakční produkty se analyzovaly gelovou elektroforézou. 13 z 96 plasmidových DNA jamek dalo vzniknout amplifikovaným DNA produktům s očekávanou relativní molekulovou hmotností.

DNA z jedné pozitivní jamky se použila pro transformaci kompetentní ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , která byla popsána výše. Přibližně se umístilo na sterilní (BA-85, Schleicher a Schuell) a

000 transformantů nitrocelulózová vlákna ___o σ 1 qXo-c

- iau O -u Cuííc za^- použiji ³²p-dCTP značené verze PCR produktu, získaného výše. Filtry se předhybridizovaly 2 až 4 hodiny při 42°C v 5X SSC, 50% deionizovaném formamidu, 5X Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 100 gg/ml denaturované lososí semenné DNA. Filtry se následně hybridizovaly přibližně 18 hodin při 42°C v 5X SSC, 50% deionizovaném formamidu, 2X Denhardtově roztoku, 0,1% SDS, 100 gg/ml denaturované lososí semenné

01-1718-97 Če

I * fr 9

9

DNA a přibližně 5 ng/ml značené sondy. Potom se filtry promývaly 10 minut při pokojové teplotě ve 2X SSC, 10 minut při 55°C v IX SSC a konečně 10 až 15 minut při 55°C v 0,5X SSC. Hybridizační klony se detekovaly následující' autoradiografií a následně se přemístily na nitrocelulózové filtry pro účely druhého prohledávání. Po druhém prohledávání se izoloval plasmidový klon (pBl.l), který se následně amplifikoval v L-růstovém médiu obsahujícím 100 gg/ml ampicilinu za vzniku plasmidové DNA. Sekvencovaly se oba řetězce 2,4 kb pBl.l inzertu.

Pro detekci libovolné existující sekvence, která by odpovídala a/nebo vykazovala určitý stupeň podobnosti se použila FASTA analýza veřejné databáze, ke které se použila pBl.l inzerční sekvence. Zjistilo se, že žádná sekvence neodpovídá žádnému známému genu nebo EST, nicméně se ukázala přibližně 45% podobnost s humánním a myším TNFR-2 genem. Methioninový výchozí kodon se nacházel na bp 124 nukleotidové sekvence, za ním následoval LORF kódující 401 ak zbytky, která končí na bp 1327. Dá se předpokládat, že 401 ak zbytkový produkt má hydrofobní signálový peptid, tvořený přibližně 31 zbytky na svém N-konci a 4 potenciální místa N-vázané glykosylace. Pomocí programu PepPlot nebyla identifikována žádná hydrofobní sekvence, která by překrývala ₌transmembránu._ (Wi-sconsin --GCG- -package, verze 8.1). Předpokládaná 401 ak sekvence se následně použila pro průzkum proteinové databáze. Opět nebyly zjištěny žádné existující odpovídající sekvence, i když se ukázalo, že je zde silná podobnost s mnoha členy TNFR nadrodiny, nejznatelnější s humánním a myším TNFR-2. Sekvenční vyrovnání tohoto nového proteinu se známými členy TNFR nadrodiny se připravilo za použití programu Pileup a

01-1718-97 Če • · « • ·· následně se modifikovalo pomocí programu PrettyPlot (Wisconsin GCG package, verze 8.1). Toto vyrovnání ukazuje čistou homologii mezi dlouhým FRI-1 genovým produktem a všemi dalšíml· členy TNFR rodiny. Homologická oblast' mapuje extracelulární doménu členů TNFR rodiny a odpovídá třem nebo čtyřem repeticím bohatým na cystein, které se nachází v ligandu vážícím doménu těchto proteinů. Z toho vyplývá, že FRI-1 gen kóduje nový člen TNFR rodiny. Protože nebyla zjištěna žádná transmembránová oblast, předpokládá se, že se může jednat o sekretovaný receptor podobný rozpustným receptorům odvozeným od TNFR-1 (Kohno a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335 (1990)). Díky zřejmé biologické aktivitě FRI-1 genu (viz výše) byl produkt označen jako osteoprotegerin (OPG).

Příklad 2

Expresní vzory OPG mRNA ve tkáních

Za účelem určení velikosti humánního transkriptu a vzorů exprese se mnohočetné northernové bloty lidské tkáně (Clonetech) sondovaly pomocí ³²p-dCTP značeného FRI-1 PCR produktu. Northernové bloty se 2 až 4 hodiny předhybridizovaly při teplotě 42°C v 5X SSPE, 50% formamidu, 5X Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 100 gg/ml denaturované lososí semenné DNA. Bloty se následně hybridizovaly 18 až 24 hodin při teplotě 42°C v 5X SSPE, 50% formamidu, 2X Denhardtově roztoku, 0,1% SDS a 100 μg/ml denaturované lososí semenné DNA a 5 ng/ml značené sondy. Bloty se potom deset minut promývaly při pokojové teplotě v 2X SSC, deset minut při 50°C IX SSC a následně 10 až 15 minut v 0,5X SSC.

·· ·· ·· • · · · ·

01-1718-97 Če

Použitím sondy odvozené z krysího genu se v několika tkáních detekovaly převládající mRNA druhy s relativní molekulovou hmotností 2,4 kb. Těmito tkáněmi byly ledviny, játra, placenta'asrdce. Nejvyšší hladiny byly detekovány v ledvinách. Velké mRNA druhy 4,5 a 7,5 kb byly detekovány v kosterním svalu a slinivce. Bylo zjištěno, že v lidské fetální tkáni, ledvinách, dochází k exprimaci relativně vysokých hladin 2,4 kb mRNA. Pomocí humánní sondy (viz níže) byl zjištěn ve stejných tkáních pouze 2,4 kb transkript. Relativně vysoké hladiny 2,4 kb transkriptu bylo zjištěno rovněž v lymfatických uzlinách, brzlíku, slezině a slepém střevě. Velikost transkriptu, určená jak pomocí krysího, tak pomocí humánního osteosprótegerinového genu, je většinou identická s délkou krysího pBl.1 FRI-1 inzertu, z čehož vyplývá, že představuje celodélkový cDNA klon.

Příklad 3

Systemická doprava OPG v transgenické myši

Krysí OPG klon pBl. 1 se použil jako matrice pro PCR amplifikaci kódovací oblasti pro subklonování do ApoEjaterního specifického expresního vektoru (Simonet a kol.,

J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) a PCT přihláška

č. US94/11675 a US č. 08/221,767). Následující 5' a 3' oligonukleotidové primery se použily pro PCR amplifikaci:

5'-GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTG-3' (SEQ ID NO: 9)

5' -ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGAAACAGCCCAGTGACCATTC-3' (SEQ ID NO: 10)

01-1718-97 Če • · ·· ··

4 · 4 · · • 4 4 ··

4 4444 · <44

4444 44 4 4

PCR reakční směs (Boehringer-Mannheim) se ošetřila následujícím způsobem: 1 minutu při 94 °C, 1 cyklus;

sekund při 94 °C, 30 sekund při 62°C a 1 minutu při 74 °C, -25 cyklů. Po amplifikaci se vzorky čistily na Qiagen PCR sloupcích a digerovaly přes noc pomocí Spěl a Notl restrikčních enzymů. Digerované produkty se extrahovaly, vysrážely a subklonovaly do ApoE promotorového expresního vektoru. Před mikroinjektáží výsledného klonu, HE-OPG, se tento klon sekvencoval, čímž se zajistila absence mutací.

HE-OPG plasmid se purifikoval dvěma cykly CsCl hustotně gradientního odstřeďování. Purifikovaná plasmidová DNA se digerovala pomocí Xhol a Ase I, a 3, 6 kb transgenní inzert se purifikoval gelovou elektroforézou. Purifikovaný fragment se naředil, čímž se vytvořil zásobní injekční roztok 1 gg/ml v 5 mM Tris, pH 7,4, 0,2 mM EDTA. Jednobuněčná embrya z BDF1 x BDFl-vypěstovaných myší se injektovaly v podstatě způsobem, který popsal Brinster a kol. v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)) s tou výjimkou, že injekční jehly se před použitím seřízly a silikonizovaly. Embrya se pěstovala přes noc v CO₂inkubátoru a 15 až 20 dvoubuněčných embryí se přeneslo do vejcovodů pseudogravidních CDl myších samiček.

Po určení těhotenství bylo z implantace mikroinjektovaných embryí získáno 49 potomků. Potomci se prohledávali PCR amplifikaci integrovaného transgenu v genomových DNA vzorcích. Cílenou oblast pro amplifikaci tvořila 369 bp oblast humánního Apo E intronu, která je součástí expresního vektoru. Oligomerními proteiny použitými pro PCR amplifikaci byly:

5'-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3' (SEQ ID NO: 11) ··

01-1718-97 Ce «· ·· • 9 9 9

5'-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3' (SEQ ID NO: 12)

Pro PCR se použily následující podmínky: dvě minuty při 94°C, 1 cyklus; jednu minutu při 94°C, .20 sekund při 63°C a 30 sekund při 72°C, 30 cyklů. Z původních 49 potomků bylo jako PCR pozitivně transgenických identifikováno 9.

Pět transgenických osmi- až desetidenních jedinců (2, 11, 16, 17 a 28) a pět kontrolních jedinců (1, 12, 15, 18 a 30) se usmrtilo a provedla se jejich pitva a patologická analýza. Ze zbývajících čtyř transgenických jedinců se játra izolovala parciální hepatektomií. Při parciální hepatektomií se myši znecitlivěly a jaterní lalok se vyjmul chirurgickým způsobem. Z jater všech transgenických mláďat a pěti negativních kontrolních mláďat se izolovala celková celulární RNA způsobem, který popsal McDonald a kol. v Meth. Enzymol. 152, 219 (1987). Na těchto vzorcích se provedla analýza northernových blotů, která se zaměřovala na určení hladiny transgenní exprese. Přibližně 10 gg celkové RNA z jater každého zvířete, které se rozpustily pomocí elektroforézových denaturačních gelů (Ogden a kol., Meth. Enzymol 152, 61 (1987)), se následně přenesly na HYBOND-N nylonovou membránu (Amersham) a sondovaly pomocí ³²p dCTP-značené pBl.1 inzerční DNA. Hybridizace se prováděla přes noc při 42°C v 50% formamidu, 5 x SSPE, 0,5% SDS, 5 x Denhardtově roztoku, 100 gg/ml denaturované lososí semenné DNA a 2-4 x 10⁶ cpm značené sondy/ml hybridizačního pufru. Po ukončení hybridizace se bloty promývaly dvakrát pět minut při pokojové teplotě v 2 x SSC a následně stejnou dobu v 0,1% SDS a potom dvakrát 5 až 10 minut při 55°C v 0,1 x SSC a 0,1% SDS. Exprese transgenu v testovaných a kontrolních mláďatech se stanovila následující autoradiografií.

01-1718-97	Če	51	• · · · • · · · · • · · ·	• · · · • · · · · · • · · • · · ·
Data	northernového	blotu	naznačují, že	7 z
transgenických jedinců	exprimuj e	detekovatelné	hladiny
transgenní	mRNA (zvíře č	. 2, 11,	16, 17, 22, 33	a 45) .
Negativní	kontrolní myši	a j edna	z transgenických ~ myší

(č. 28) neexprimovaly žádnou s transgenem příbuznou mRNA. Vzhledem k tomu, že se dá předpokládat, že OPG je sekretovaný protein, přeexprimování transgenní mRNA by mělo zastupovat hladinu systemicky dopraveného genového produktu. Myši 2, 17 a 22, které byly pozitivní na PCR a northernový blot exprimovaly vysoké hladiny transgenní mRNA a mohly větší měrou biologicky ovlivňovat hostitelské buňky a tkáně.

Příklad 4

Biologická aktivita OPG

Pět z transgenických myší (zvířata 2, 11, 16, 17 a 28) a 5 kontrolních mláďat (zvířata 1, 12, 15, 18 a 30) bylo utraceno pro účely pitvy a patologické analýzy. Před provedením eutanázie se ověřila správnost identifikačních čísel všech zvířat, zvířata se zvážila, znecitlivěla a odebrala se jim krev. Krev se uložila jak ve formě krevního séra, tak ve formě kompletní krve pro kompletní chemické a hematologické vyšetření. Bezprostředně po ukončení anestezie letální C0₂ inhalací a ještě před oddělením velkých celků se provedla radiografie. Potom se odstranily tkáně a fixovaly v 10% pufrovaném Zn-formalinu pro účely histologického výzkumu. Shromážděné tkáně zahrnovaly játra, slezinu, slinivku, žaludek, dvanácterník, kyčelník, střevo, slezinu, reprodukční orgány, kůži a prsní žlázy, kost, mozek, srdce, plíce, brzlík, průdušnici, štítnou žlázu,

01-1718-97 Če lačník, konečník, nadledviny, močový měchýř a kosterní sval. Před fixací se stanovila hmotnost jater, žaludku, ledvin, nadledvin, sleziny a brzlíku. Po fixaci se tkáně zpracovaly do parafinových bloků a získaly se 3 gm řezy. Kostní tkáň se dekalcifikovala pomocí roztoku kyseliny mravenčí a všechny řezy se obarvily hematoxylinem a eosinem. U některých tkání se rovněž provedlo zabarvení Gomoriho retikulinem a Massonovým trichromem. Pro stanovení exprese vinanově rezistentní kyselinové fosfatázy (TRAP), tj. enzymu vysoce exprimovaného mnohojadernými buňkami monocyto-makrofágového původu, které resorbují kostní hmotu, tak zvanými osteoklasty, se použila enzymatická histochemie. Pro detekci replikujících buněk, resp. buněk monocyto-makrofágového původu se rovněž použila imunohis to chemie monocyto-makrofágového povrchu BrdU a F480 antigenu. Pro detekci exprese F480 povrchového antigenu se formalinem fixované, parafinem zapouzdřené 4 μπι řezy deparafinovaly a hydratovaly deionizovanou vodou. Řezy se ochladily 3% peroxidem vodíku, blokovaly pomocí produktu Protein Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA) a inkubovaly v krysí monoklonální anti-myší F480 protilátce (Harlan, Indianopolis, IN) . Tato protilátka se detekovala pomocí biotinyiem značených králičích anti-krysích imunoglobulinů, peroxidázou konjugovaného strepavidinu (BioGenex San Ramon,

CA) s DAB jako chromagenem (BioTek, Santa Barbara, CA) Řezy se obarvily kontrastní barvou, hematoxylinem.

Oddělení velkých celků a ohledání viscerálních tkání, neobjevilo u transgenických expresorů nebo kontrolních mláďat žádné abnormality. Analýza hmotnosti orgánů naznačila, že u transgenických myší došlo přibližně k 38% zvětšení sleziny v porovnání s kontrolními jedinci. U • ·

01-1718-97 Če transgenických expresorů došlo rovněž k mírnému zvětšení velikosti krevních destiček a cirkulujících nezbarvených buněk. U transgenických receptorů bylo dále zjištěno podstatné snížení hladin krevních destiček. Kromě toho byla’ u transgenických receptorů zjištěna tendence snižovat hladinu kyseliny močové v séru, hladinu dusíku v moči a hladinu alkalinfosfatázy. Zjistilo se, že kostry expresorů včetně dlouhých kostí (kostí stehenních), obratlů a plochých kostí (pánevní kosti) vykazují zvýšenou radiohustotu. Relativní velikost stehenních kostí u expresorů se nelišila od velikosti kontrolních myší.

Histologická analýza zabarvených řezů kosti OPG expresorů ukázala vážnou osteopetrózu s přítomností chrupavkových zbytků primární spongiozy patrné v kostní trabekule, ve střední části stehenní kosti. Jasně vymezená kůra nebyla v řezech stehenní kosti identifikovatelná. U normálních zvířat je středová část kosti vyplněna kostní dření. Řezy obratle rovněž ukazují osteopetrotické změny, z čehož vyplývá, že kosterní změny indukované OPG byly systemické. Zbývající kostní dřeň vykazovala převážně myeloidní prvky. Přítomny byly rovněž megakaryocyty, Retikulinové skvrny neukazovaly na ukládání retikulinu. Imunohistochemie pro F4 80 buněčný povrchový antigen, exprimovaný buňkami monocyto-makrofágové derivace u „myši, ukazovala na přítomnost F480 pozitivních buněk v dřeňových prostorách. Přímo vedle trámčitých kostních povrchů je možné vidět zploštěné F480 pozitivní buňky.

Mesenchymální buňky, vážící stehenní kost, byly zploštěné a jevily se jako inaktivní. Z rozmístění H&E a TRAP skvrn se zjistilo, že u OPG expresorů se osteoklasty nachází na površích stehenní kosti pouze zřídka.

01-1718-97 Če

Osteoklasty a/nebo chondroklasty se nacházely spíše v oblasti chrupavky resorbující růstové ploténky, ale jejich počty mohou být v porovnání s kontrolními jedinci nižší. Osteoklasty byly rovněž přítomny na kortikálním povrchu metafýz.y, kde je zpravidla značná stavební aktivita. Hlavní rozdíl mezi expresory a kontrolními'jedinci představovalo podstatné snížení trámčitých osteoklastů jak v obratlech, tak ve stehenních kostech. Rozsah kostní akumulace byl přímo úměrný hladině OPG transgenní mRNA, detekované northernovým přenosem celkové jaterní RNA.

U sleziny OPG expresorů bylo zjištěno zvýšené množství červené dřeně. Tato expanze je způsobena zvýšenou krvetvorbou. Zastoupeny jsou všechny krvetvorné linie. F480 pozitivní buňky byly přítomny v červené dřeni jak kontrolních jedinců, tak OPG expresorů. Dva z expresorů (2 a 17) měly ložiska extramedulární krvetvorby v játrech, což je pravděpodobně důsledek osteopetrotické dřeně.

Pokud jde o brzlík, lymfatické uzliny, gastrointestinální trakt, pankreatohepatobiliární trakt, dýchací trakt, reprodukční systém, močopohlavní systém, kůži, nervový systém, srdce a aortu, prsa, kosterní sval a tuk, nebyly pozorovány žádné abnormality.

Příklad 5

Izolace myší a humánní OPG cDNA

Z myší ledvinové cDNA knihovny (Clonetech) se PCR amplifikací izoloval cDNA klon odpovídající 5' konci myší OPG mRNA. Z krysí OPG cDNA sekvence se odvodily následující oligonukleotidy:

01-1718-97 Če

5'-ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3' 5'-GTTGCACTCCTGTTTCACGGTCTG-3'

5'-CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3' ’ -TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3'

	•	··· ·	•
(SEQ	ID	NO:	13)
(SEQ	ID	NO:	14)
(seq	ID	NO:	15)
(SEQ	ID	NO:	16)

5'-AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3' (SEQ ID NO: 17)

5'-AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGACCATTCC-3' (SEQ ID NO: 18)

Parciální a celodélkové cDNA produkty získané tímto postupem se sekvencovaly. Celodélkový produkt byl digerován Not I a Xba I a následně směrované nakloňován do plasmidového vektoru pRcCMV (Invitrogen). Výsledný plasmid byl označen jako pRcCMV-Mu-OPG. Nukleotidová sekvence klonovaného produktu se porovnala s krysí OPG cDNA sekvencí. V rozsahu 1300 bp úseku překrývajícího OPG LORF byly krysí a myší DNA sekvence přibližně z 88% identické. Myší cDNA sekvence obsahovala 401 ak LORF, což je srovnatelné se sekvencí krysího OPG proteinu, a ukázalo se, že je přibližně z 94% identická bez mezer. To ukazuje, že izolovaná myší cDNA sekvence kóduje myší OPG protein a že sekvence a struktura je po celou dobu evoluce do značné míry zachována. Myší OPG proteinová sekvence obsahuje na svém N-konci identický pravděpodobný signální peptid a všechna čtyři potenciální místa N-navázané glykosylace jsou zachován?... —' ..... . ------- - Parciální humánní OPG cDNA se klonovala z humánní ledvinové cDNA knihovny za použití následujících, pro krysu specifických, oligonukleotidů:

5'-GTG AAG CTG TGC AAG AAC CTG ATG-3' (SEQ ID NO: 19)

5'-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3' (SEQ ID NO: 20) • ·

01-1718-97 Če

Tento PCR produkt se sekvencoval a použil pro sestavení primerů pro amplifikaci 3' konce humánní cDNA využívající humánní OPG genomový klon v lambdě jako matrici: ... - — -

5'-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3' (SEQ ID NO: 29)

5'-CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3' (SEQ ID NO: 21)

Amplifikovaný PCR produkt se sekvencoval a společně se sekvencí 5' konce se použil pro navržení 5' a 3' humánněspecifických, primerů použitelných při amplifikaci celých humánních OPG cDNA kódovacích sekvencí:

5'-AGCGCGGCCGCGGGGACCACAATGAACAAGTTG-3' (SEQ ID NO: 22)

5'-AGCTCTAGAATTGTGAGGAAACAGCTCAATGGC-3' (SEQ ID NO: 23)

Celodélkový humánní PCR produkt se sekvencoval, potom přímo klonoval na plasmidový vektor pRcCMV (Invitrogen) pomocí Not I a Xba I. Výsledný plasmid byl označen jako pRcCMV-humánní OPG. Nukleotidová sekvence klonovaného produktu se porovnala s krysí a myší OPG cDNA sekvencí. V rozsahu 1300 bp úseku překrývajícím OPG LORF byly krysí a myší sekvence DNA přibližně ze 78 až 88 % identické s humánní OPG cDNA. Humánní OPG cDNA sekvence rovněž obsahovala 401 ak LORF, což bylo srovnatelné s krysí a myší proteinovou sekvencí. Předpokládaný humánní OPG protein byl přibližně z 85 %, resp. přibližně z 90 %, identický s krysím a myším proteinem. Seřazení sekvencí krysího, myšího a humánního proteinu ukázalo, že u nich během vývoje nedošlo k podstatnějším změnám. Předpokládá se, že humánní protein má N-koncový signální peptid a 5 potenciálních míst N-navázané glykosylace, z nichž 4 zůstaly mezi krysím a myším OPG proteinem zachovány.

··

01-1718-97 Če

DNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence myšího OPG jsou znázorněny na obrázcích 9A a 9B (SEQ ID NO: 122). DNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence humánního OPG jsou znázorněny na obrázcích 9C a 9D (SEQ ID NO: 124). Porovnání krysí, myší a humánní OPG aminokyselinové sekvence je znázorněno na obrázcích 9E a 9F.

Izolace dalších humánních OPG cDNA klonů odhalila přítomnost záměny báze C za G v poloze 103 DNA sekvence, znázorněné na obrázku 9C. Tato nukleotidová změna má za následek substituci lysinu asparáginem v poloze 3 aminokyselinové sekvence, znázorněné ne obrázku 9C. Zbytek sekvence v klonech obsahujících tuto změnu byl identický s odpovídajícími úseky, znázorněnými na obrázcích 9C a 9D.

Příklad 6

Modelování OPG trojrozměrné struktury

N-koncová část OPG má homologii s extracelulární částí všech známých členů TNFR nadrodiny (obrázek ÍC) . Nejvýznamnější motiv v tomto úseku TNFR-odvozených genů je přibližně 40aminokyselinová na cystein bohatá repetiční sekvence, která se balí do distinktních struktur (Banner a kol..., C e 11 _7 3. 4 31-445 ^(1993), )„= Tento mo t iv= s e —- zp r a vidi a zobrazil ve čtyřech (rozmezí 3 až 6) tandemových repeticích (viz obrázek 1C) a je známo, že je součástí ligandové vazby (Beutler a van Huffel Science 264, 667-663 (1994)). Každá repetice zpravidla obsahuje šest vzájemně odsazených cysteinových zbytků, které se podílí na tvorbě tří intradoménových disulfidových vazeb, označených jako SS1, SS2 a SS3 (Banner a kol., tamtéž). V některých receptorech, • ·

01-1718-97 Če

například TNFR2, CD30 a CD4 0, některé z repetičních domén obsahují pouze dvě intrařetězcové disulfidové vazby (SSl a SS3) .

Humánní OPG proteinová sekvence se seřadila s profilem TNFR1 extracelulární domény za použití metod, které popsal Luethy a kol., tamtéž, a výsledky se graficky znázornily pomocí programu PrettyPlot z Wisconsin Package, verze 8.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI) (obrázek 10). Toto seřazení sekvencí se následně použilo pro sestrojení trojrozměrného (3—D) modelu humánní OPG N-koncové domény. Pro sestrojení se jako matrice použila známá 3-D struktura extracelulární domény p55 TNFR1 (Banner a kol., tamtéž). Atomové koordináty peptidového hlavního řetězce a postranních řetězců identických zbytků se zkopírovaly z krystalických strukturních koordinát TNFR1. Potom se zbývající koordináty pro inzerce a různé postranní řetězce generovaly za použití programu LOOK (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA) . 3-D model se následně čistil minimalizováním své konformační energie pomocí programu LOOK.

Dá se předpokládat, že OPG se bude analogicky s dalšími členy TNFR rodiny vázat na ligand. Pro účely modelování interakce OPG se svým ligandem se ke stimulaci

3-D modelu.....„OPG ligaňdupoužila krystalická struktura

TNF-β. Tento údaj byl graficky znázorněn (viz obrázek 11) pomocí Molscriptu (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24, 946-950, 1991). Byl zkonstruován model pro OPG komplex OPG/ligand s 3 ΤΝΓβ a 3 OPG molekulami, ve kterém byly relativní polohy OPG identické s TNFR1 v krystalické struktuře. Tento model se následně použil pro nalezení zbytků OPG, které by mohly vzájemně reagovat se svým ligandem. Pro průzkum se zvolil

01-1718-97 Če následující přístup. Vypočetla se oblast všech zbytků v komplexu, která je přístupná rozpouštědlu a jeden OPG model. Zbytky, které měly jinou přístupnost v komplexu než v monomeru budou pravděpodobně reagovat s ligandem. -- ‘ Humánní a myší OPG aminokyselinové sekvence se přeuspořádaly za použití této informace do nejvýznamnějších sekvencí, z nichž každá obsahovala domény 1-4 bohaté na cystein (obr. 12A a 12B). Každá doména měla jedinečné strukturní vlastnosti, které lze předpokládat.

Doména 1

Obsahuje 4 cysteinové zbytky obsažené v SS2 (C41 až C54) a SS3 (C44 až C62) disulfidové vazby). Ačkoliv z disulfidových můstků není zřejmá žádná SS1 vazba, tyrosin zachovaný v poloze 28 je homologický s Y20 v TNFR1, o němž se ví, že se podílí na interakci s H66 a napomáhá tak formování domény. OPG má v poloze 75 homologový histidin, z čehož vyplývá, že se OPG Y28 a H75 hromadí společně v nativním proteinu stejně jako to dělají homologické zbytky v TNFR1. Oba tyto zbytky mohou být tedy ve skutečnosti důležité pro biologickou aktivitu, a N-koncové OPG úpravy až k Y28 a za Y28 mohou aktivitu měnit. Na základě studie výše popsaného trojrozměrného modelu se dá předpokládat, že zbytky E34 a K43 vzájemně reagují s vazebným ligandem.

Doména 2

Obsahuje šest cysteinových zbytků a dá se předpokládat, že obsahuje SSl (C65 až C80), SS2 (C83 až • ·

01-1718-97 Če

C98) a SS3 (C87 až C105) disulfidové vazby. Tento úsek OPG rovněž obsahuje úsek P66-Q91, který je seřazen s částí TNFR1 domény 2, která tvoří těsné kontakty s TNFP (viz výše) a může vzájemně reagovat's^: OPG ligandem. Na základě získaných strukturních dat se předpokládá, že s vazebným ligandem vzájemně reagují zejména následující zbytky P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90 a Q91.

Doména 3

Obsahuje 4 cysteinové zbytky, které jsou součástí SS1 (C107 až C118) a SS3 (C124 až C142) disulf idových vazeb, ale nikoliv vazby SS2. Na základě získaných strukturních dat lze předpokládat, že zbytky E115, L118 a K119 vzájemně reagují s OPG ligandem.

Doména 4

Obsahuje 4 cysteinové zbytky, které jsou součástí SS1 (C145 až C160) a SS3 (C166 až C185) disulfidových vazeb ale nikoliv vazby SS2. Na základě získaných strukturních dat lze předpokládat, že zbytky E153 a S155 vzájemně reaguje š OPG ligandem.

Předpokládaný strukturní model OPG tedy identifikoval celou řadu vysoce Zachovalých zbytků, které jsou pravděpodobně důležité pro jeho biologickou aktivitu.

01-1718-97 Če ·· r * ·« ·9 • · · · · · ··· · · • · · · · · · ···· ··· ··· ·*·· ··

Příklad 7

Produkt rekombinantního sekretovaného OPG proteinu v savčích buňkách

Aby se určilo, zdali je OPG skutečně sekretovaným proteinem, fúzovala se myší OPG cDNA na humánní IgGl Fc doménu tvořící značení (Capon a kol., Nátuře 337, 525-531 (1998)) a exprimovala se v humánních 293 fibroblastech. Fc fúze se prováděly za použití vektoru pFc-A3. Vektor pFc-A3 obsahuje úsek kódující Fc oblast humánního imunoglobulinového IgG-γΙ těžkého řetězce (Ellison a kol., tamtéž) z první aminokyseliny pantové domény (Glu-99) na karboxylový konec a je lemován 5'-Notl fúzním místem a 3'-SalI a Xbal místy. Plasmid se konstruoval PCR amplifikací humánní slezinové cDNA knihovny (Clontech). PCR reakce se prováděly v konečném objemu 100 μΐ a využily 2 jednotky Vent DNA polymerázy (New England Biolabs) ve 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KC1, 10 μΜ (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄,

0,1% Triton X-100 se 400 μΜ jednotlivých dNTP a 1 ng cDNA knihovny, která se měla amplifikovat společně s 1 μΜ každého primeru. Reakce se iniciovaly dvouminutovou denaturací při 95°C, načež následovalo 30 cyklů, zahrnujících 30 sekund při 95°C, třicet sekund při 55°C a dvě minuty při 73°C. 5' primer

5' ATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC 3' (SEQ ID NO:24) zabudoval Notl místo bezprostředně za 5' na první zbytek (Glu-99) pantové domény IgG-yl. 3' primer

5' -TCTAGAGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT-3' (SEQ ID NO:25)

01-1718-97 Če

zabudoval Sall a Xbal místa. 717-bp PCR produkt se digeroval Notl a Sall, izoloval elektroforézou přes 1% agarózu (FMC Corp.), purifikoval postupem Geneclean (BIO 101 lne.) a-klonoval na Notl, Sall-digerovaný pBluescript' II KS vektor (Stratagene). Inzert ve výsledném plasmidu, pFcA3, se sekvencoval s cílem potvrdit přesnost PCR reakce.

Klonovaná myší cDNA v plasmidu pRcCMV-MuOPG se amplifikovala za použití následujících dvou sad příměrových párů:

Pár 1

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQ ID NO:26)

5'-CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTG-3' (SEQ ID NO:27)

Pár 2

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQ ID NO:28)

5'-CCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTG-3' (SEQ ID NO:30)

První pár amplifikoval celou OPG LORF a vytvářel Notl restrikční místo, které bylo slučitelné s Not I místem v Fc fúzním vektoru pFcA3. Vektor pFcA3 se připravil vytvořením Not I restrikčního místa 5^z ^na zbytku kyseliny asparágové 216 humánní IgGl Fc cDNA. Tento konstrukt zavádí spojovník, který kóduje dvě irelevantní aminokyseliny, které překrývají spoj mezi OPG proteinem a IgG Fc úsekem. Tento produkt, pokud je navázán na Fc části, by mohl přímo kódovat všech 401 OPG zbytků a následně všech 227 aminokyselinových zbytků humánní IgGl Fc oblasti (Fl.Fc). Druhý primerový pár amplifikuje DNA sekvence,

01-1718-97 Če

kódující prvních 180 aminokyselinových zbytků OPG, které zahrnují svou pravděpodobnou ligandovou vazebnou doménu. Jak již bylo · uvedeno výše, 3’ primer tvoří umělé Not I restrikčni místo,.....které váže C-koncový upravený OPG LORF v poloze threoninu 180 přímo na IgGl Fc doménu (CT.fc).

Spoj aminokyselinové sekvence vážící OPG zbytek 401 a zbytek aseptické kyseliny 221 humánní Fc oblasti může být modifikován následujícím způsobem: DNA, kódující zbytky 216-220 humánní Fc oblasti, lze výše popsaným způsobem deletovat, nebo lze cysteinový zbytek odpovídající C220 humánní Fc oblasti mutovat buď na serin nebo na alanin. OPG-Fc fúzní protein, kódovaný těmito modifikovanými vektory, může být transfektován do humánních 293 buněk nebo CHO buněk a rekombinantní OPG-Fc fúzní protein purifikován níže uvedeným způsobem.

Oba produkty se přímo klonovaly do plasmidového vektoru pCEP4 (Invitrogen). Vektor pCEP4 obsahuje zdroj replikace, kterým je virus Epsteina a Bárrové, a je schopen episomální replikace ve 293-EBNA-l buňkách. Rodičovské pCEP4, pCEP4-Fl.Fc a pCEP4-CT.Fc vektory byly lipofektovány do 293-EBNA-l buněk za použití metod doporučovaných výrobcem. Transfektované buňky se následně vybraly ve 100 gg/ml hygromycinu za účelem vybrání vektorové exprese a výsledné,— vůči účinné látce rezistentní, hmotové kultury rostly až do okamžiku, kdy vytvořily celek. Buňky se následně pěstovaly 72 hodin v médiu prostém séra, načež se kondiciované médium odstranilo a analyzovalo SDS-PAGE. Stříbrné zabarvení polyakrylamidového gelu detekovalo hlavní proteiny kondiciovaného média produkovaného pro účinnou látku rezistentními 293 kulturami. V pCEP4-Fl.Fc a pCEP4-CT.Fc kondiciovaného média byly vydatně sekretovány • ·

01-1718-97 Če jedinečné pásy předpokládaných velikostí (viz obrázky 13B a 13C) . Celodélkový Fc fúzní protein se hromadil do vysoké koncentrace, z čehož vyplývá, že může být stabilní. Oba Fc fúzní proteiny.....byly detekovány ant i-humánní mi IgGl Ťc protilátkami (Pierce) na westernových blotech, což naznačuje, že tvořily rekombinantní OPG produkty.

Celodélkový OPG-Fc fúzní protein se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografií za použití postupů doporučených výrobcem. Protein se vystavil analýze N-terminační sekvence, k níž se použila automatizovaná Edmannova degradace, kterou v podstatě popsal Matsudaira a kol. (J. Biol. Chem. 2 62, 10-35 (1987)) . Po 19 cyklech byla odečtena následující aminokyselinová sekvence:

NH2-E TLPPKYLHYDPETGHQL L-O2H (SEQ ID NO:31)

Tato sekvence je identická s předpokládanou myší OPG aminokyselinovou sekvencí počínaje aminokyselinovým zbytkem 22, z čehož vyplývá, že u savců se hlavní místo přirozeného štěpení nachází mezi aminokyselinovými zbytky Q21-E22 a nikoliv mezi Y31-D32, jak se původně předpokládalo. Expresní experimenty prováděné v 293-EBNA buňkách pomocí pCEP4-Fl.Fc a pCEP4-CT.Fc ukazují, že OPG je .^sekretovány^protein^a může působit systemicky,. pokud jde o navázání na svůj ligand.

Postupy, podobné postupům použitým při konstrukci a expresi muOPG[22-180]-Fc a muOPG[22-401]-Fc fúzí se použily i pro další myší a humánní OPG-Fc fúzní proteiny.

Myší OPG cDNA, kódující aminokyseliny 1-185 navázané na Fc úsek humánní IgGl [muOPG Ct(185).Fc], se konstruovala

01-1718-97 Če následujícím způsobem. Myší OPG cDNA z plasmidu pRcCMV Mu osteoprotegerinu (popsaná v příkladu 5) se amplifikovala výše popsaným způsobem za použití následujícího příměrového páru v polymerázové řetězové reakci: ”

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:32) 1333-80:

5'-CCT CTG CGG CCG CAC ACA CGT TGT CAT GTG TTG 0-3' (SEQ ID NO:33)

Tento primerový pár amplifikuje myší OPG cDNA oblast, kódující aminokyselinové zbytky 63-185 (odpovídající bp 278-645) OPG čtecímu rámci, jak ukazuje obr. 9A. 3' primer obsahuje Not I restrikční místo, které je kompatibilní s ohraničeným Not I místem Fc fúzního vektoru pFcA3. Produkt rovněž překrývá jedinečné EcoRI restrikční místo, lokalizované na bp 436. Amplifikovaný PCR produkt se purifikoval, rozštěpil Notl a EcoRI a výsledný EcoRI-Notl restrikční fragment se purifikoval. Vektor pCEPP4, který měl myší 1-401 OPG-Fc fúzní inzert, se rozštěpil pomocí EcoRI a Notl, purifikoval a sekvenčně se seřadil s výše generovaným PCR produktem. Výsledný expresní vektor na bázi pCEP4 přímo kóduje OPG zbytky 1-185 a následně 227 aminokyselinových zbytků humánního IgGl Fc úseku. Myší OPG 1-185. Fc fúzní vektor se transfektoval do 293 buněk, zvolila se účinná látka a výše popsaným způsobem se připravilo kondiciované médium. Výsledný sekretovaný myší OPG 1-185.Fc fúzní produkt se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučených výrobci.

01-1718-97 Če

Myší OPG DNA, kódující aminokyselinové zbytky 1-194, nakloňovaná do Fc úseku humánní IgGl (muOPG Ct(194).Fc), se konstruovala následujícím způsobem. Myší OPG cDNA z plasmidu pRcCMV Mu-osteoprotegerinu se amplifikovala za použití následujících příměrových párů:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:34)

1333-81:

5'-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3' (SEQ ID NO:35)

Tento primerový pár amplifikuje myší OPG cDNA úsek, kódující aminokyselinové zbytky 70-194 (odpovídající bp 298-672) OPG čtecího rámce. 3' primer obsahuje Not I restrikční místo, které je kompatibilní s ohraničeným Not I místem Fc fúzního vektoru pFcA3. Produkt rovněž přesahuje jedinečné EcoRI restrikční místo, lokalizované na bp 436. Amplifikovaný PCR produkt se klonoval do výše popsaného myšího OPG[1-401] Fc fúzního vektoru. Výsledný expresní vektor na bázi pCEP4 přímo kóduje OPG zbytky 1 až 194 a následně 227 aminokyselinových zbytků humánního IgGl Fc úseku. Myší OPG 1-194.Fc fúzní vektor se transfektoval do 293 buněk, zvolila se účinná látka a výše popsaným způsobem se připravilo, kondiciované médium. Výsledný sekretovaný. fúzní produkt se purifikoval Protein-A sloupcovou

chromatografií výrobci.	(Pierce)	za použití	postupů doporučených
Humánní	OPG DNA,	kóduj ící	aminokyseliny 1-401,
nakloňovaný do	Fc úseku	humánního	IgGl se zkonstruovala

následujícím způsobem. Humánní OPG DNA v plasmidu pRcCMV-hu

01-1718-97 Če • · · • ·· · · osteoprotegerinu (popsaná v příkladu 5) se amplifikovala za použití následujících oligonukleotidových primerů:

1254-90:

5'-CCT CTG AGC (SEQ ID NO:36)	TCA AGC	TTG GTT	TCC GGG GAC CAC AAT G-3'
1254-95:
5'-CCT CTG CGG	CCG CTA	AGC AGC	TTA TTT TTA CTG AAT GG-3'
(SEQ ID NO:37)
Výsledný	PCR produkt kóduje celodélkový humánní OPG

protein a tvoří NoT I restrikční místo, které je slučitelné s ohraničeným Not I místem Fc fúzního vektoru FcA3. PCR produkt se přímo klonoval do výše popsaného plasmidového vektoru pCEP4. Výsledný expresní vektor přímo kóduje humánní OPG zbytky 1-401 a následně 227 aminokyselinové zbytky humánního IgGl Fc úseku. Z transfektovaných a pro účinnou látku vybraných buněk se připravilo kondiciované médium a huOPG Fl.Fc fúzní produkt se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučovaných výrobci.

Humánní OPG DNA, kódující aminokyselinové zbytky 1 až 201, nakódovaná do Fc úseku humánní IgGl [huOPG Ct(201).Fc] se zkonstruovala následujícím způsobem. Humánní OPG cDNA, nakloňovaná z plasmidového pRcCMV-hu osteoprotegerinu, se amplifikovala PCR za použití následujícího oligonukleotidového příměrového páru:

1254-90:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NO:38) • ·

01-1718-97 Če

1254-92:

5'-CCT CTG CGG CCG CCA GGG TAA CAT CTA TTC CAC-3' (SEQ ID NO:39)

Tento primerový pár amplifikuje humánní OPG cDNA úsek, kódující aminokyselinové zbytky 1-201 OPG čtecího rámce, a vytváří Not I restrikční místo na 3' konci, které je kompatibilní s ohraničeným Not I místem Fc fúzního vektoru FcA3. Tento produkt, pokud se naváže na Fc úsek, přímo kóduje OPG zbytky 1-201 a následně všech 221 aminokyselinových zbytků humánního IgGl Fc úseku. PCR produkt se výše popsaným způsobem směrově nakloňoval do plasmidového vektoru pCEP4. Z transfektovaných a pro účinnou látku zvolených buněk se připravilo kondiciované médium a hu OPG Ct(201).Fc fúzní produkty se purifikovaly Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučených výrobci.

Pro konstrukci a expresi nekondenzovaného myšího a humánního OPG se použily následující postupy.

Plasmid pro savčí expresi celodélkového myšího OPG (zbytky 1 až 401) se generoval PCR amplifikací myšího OPG cDNA inzertu z pRcCMV Mu-osteoprotegerinu a subklonoval do expresního vektoru pDSRa (DeClerck a kol., J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)). Pro tyto účely se použily následující oligonukleotidové primery:

1295-26:

5'-CCG AAG CTT CCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GC-3' (SEQ ID N0:40)

1295-27:

01-1718-97 Če

5'-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G-3' (SEQ ID NO:41)

Myší OPG celodélkový čtecí rámec se amplifikoval výše popsanou PCR. PCR produkt se purifikoval a digeroval restrikční endonukleázou Hind III a Xba I (BoehringerMannheim, Indianapolis, IN) za výrobcem doporučených podmínek a potom se ligoval pomocí Hind III a Xba I na digerovaný pDSRa. Rekombinantní klony se detekovaly digerací restrikční endonukleázou a následně sekvencovaly, což mělo vyloučit vznik mutací během PCR amplifikačních kroků.

Jednotlivé exprese

Výsledný plasmid, pDSRa-muOPG, se zavedl do (CHO) buněk vaječníků čínského křečka transfekcí mediovanou vápníkem (Wigler a kol., Cell 11, 233 (1977)) kolonie se zvolily na základě dihydrofolátreduktázového (DHFR) genu v plasmidovém vektoru a několik klonů se izolovalo. Exprese myšího OPG rekombinantního proteinu se monitorovala westernovým přenosem kondiciovaného média CHO buněk. Vybraly se vysoce exprimující buňky a OPG exprese se dále amplifikovala methotrexátem způsobem, který popsal DeClerck a kol., tamtéž. Kondiciované médium z CHO buněčných linií se další purifikaci připravilo pro rekombinantního sekretovaného myšího OPG proteinu.

Plasmid pro savčí expresi celodélkového humánního OPG (aminokyseliny 1 až 401) se generoval subklonováním cDNA inzertu v pRcCMV-hu osteoprotegerinu přímo do vektoru pDSRa (DeClerck a kol., tamtéž). Plasmid pRcCMV-OPG se zcela digeroval Not I, s konci zarovnanými pomocí Klenowa a potom se zcela digeroval pomocí Xba I. Vektor DNA se

01-1718-97 Če digeroval pomocí Hind III, s konci zarovnanými pomocí Klenowa, potom se digeroval pomocí Xba I a následně se ligoval na OPG inzert. Rekombinantní plasmidy se potom sekvencovaly, aby se potvrdila správná orientace humánní OPG cDNA.

Výsledný plasmid pDSRa-huOPG se, jak již bylo uvedeno, zavedl do vaječníkových (CHO) buněk křečka. Jednotlivé kolonie se zvolily na základě exprese dihydrofolátreduktázového (DHFR) genu v plasmidovém vektoru a několik klonů se izolovalo. Exprese humánního OPG rekombinantního proteinu se monitorovala westernovým přenosem kondiciovaného média CHO buněk. Vybraly se vysoce exprimující klony a OPG exprese se dále amplifikovala methotrexátem. Pro proteinovou purifikaci se připravilokondiciované médium z CHO buněčných linií, exprimujících humánní OPG.

Expresní vektory pro myší OPG, kódující zbytky 1 až 185, se konstruovaly následujícím způsobem. Myší OPG cDNA z pRcCMV-Mu OPG se amplifikovala pomocí následujících oiigonukleotidových primerů:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:42)

1356-12:

5'-CCT CTG TCG ACT TAA CAC ACG TTG TCA TGT GTT GC-3' (SEQ ID NO:43)

Tento primerový pár amplifikuje myší OPG cDNA úsek kódující aminokyseliny 63 až 185 OPG čtecího rámce (bp 278645) a obsahuje umělý koncový kodon přímo za cysteinovým kodonem (C 185), za kterým následuje umělé Sal I restrikční

01-1718-97 Če

endonukleázové místo. Předpokládaný produkt obsahuje vnitřní Eco RI restrikční místo použitelné při subklonování do již existujícího vektoru. Po PCR amplifikaci se výsledný purifikovaný produkt rozštěpil pomocí Eco RI a Sal I restrikční endonukleázy a velký fragment se gelově purifikoval. Purifikovaný produkt se následně subklonuje do velkého restrikčního fragmentu Eco RI a Sal I výše popsaného digestu pBluescript-muOPG Fl.Fc. Výsledný plasmid se digeroval pomocí Hind III a Xho I a malý fragment se gelově purifikoval. Tento fragment, který obsahuje otevřený čtecí rámec, kódující zbytky 1 až 185, se následně subklonoval do Hind III a Xho I digestu expresního vektoru pCEP4. Výsledný vektor, pmuOPG [1 až 185], kóduje upravený OPG polypeptid, který terminuje na cysteinovém zbytku, lokalizovaném v poloze 185. Jak již bylo uvedeno, připravilo se kondiciované médium z transfektovaných a pro účinnou látku zvolených buněk.

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:44)

1356-13:

5'-CCT CTG TCG ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3' (SEQ ID NO:45)

Tento primerový pár amplifikuje myší OPG cDNA úsek kódující aminokyseliny 70 až 194 OPG čtecího rámce (bp 298-672) a obsahuje umělý koncový kodon přímo za lysinovým kodonem (K194), za kterým následuje umělé místo Sal I restrikční endonukleázy. Předpokládaný produkt obsahuje Eco RI restrikční místo, použitelné při subklonování do již existujícího vektoru. Po PCR amplifikaci se výsledný purifikovaný produkt rozštěpil • ··

01-1718-97 Če pomocí Eco RI a Sal I restrikční endonukleázy a velký fragment se gelově purifikoval. Purifikovaný produkt se následně subklonuje do velkého restrikčního fragmentu Eco RI a Sal I výše popsaného-digestu pBluescript-muOPG Fl.Fc. Výsledný plasmid se digeroval pomocí Hind III a Xho I a malý fragment se gelově purifikoval. Tento fragment, který obsahuje otevřený čtecí rámec, kódující zbytky 1 až 185, se následně subklonoval do Hind III a Xho I digestu expresního vektoru pCEP4. Výsledný vektor, pmuOPG [1 až 185], kóduje upravený OPG polypeptid, který terminuje na cysteinovém zbytku, lokalizovaném v poloze 185. Jak již bylo uvedeno, připravilo se kondiciované médium z transfektovaných a pro účinnou látku zvolených buněk.

Několik mutací se generovalo na 5' konci huOPG [22-401]-Fc genu, který zavádí buď aminokyselinové substituce nebo delece OPG mezi zbytky 22 až 32. Všechny mutace se generovaly pomocí sady „QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA) za použití výrobcem doporučených podmínek. Stručně řečeno, reakční směs, obsahující huOPG [22-401]-Fc, plasmidová DNA matrice a mutagenové primery se ošetřily Pfu polymerázou v přítomnosti deoxynukleotidů a potom amplifikovaly výše popsaným způsobem v termocykleru. Alikvotní podíl reakční směsi se následně tepelným šokem transfektoval do kompetentní E. coli XLl-modři a následně se provedlo ověření mutací. Plasmidová DNA z transformantů se následně sekvencovala na různé mutace.

Následující primerové páry se použily pro deleci zbytků 22 až 26 humánního OPG genu, která měla za následek vznik huOPG [27-401]-Fc fúzního proteinu:

··

01-1718-97 Če

1436-11:

5'-TGG ACC ACC CAG AAG TAC CTT CAT TAT GAC-3' (SEQ ID NO:140)

1436-12:

5'-GTC ATA ATG AAG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-3' (SEQ ID NO:141)

Následující příměrové páry se použily pro deleci zbytků 22 až 28 humánního OPG genu, která měla za následek vznik huOPG [29-401]-Fc fúzního proteinu:

1436-17:

5'-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA-3' (SEQ ID NO:142)

1436-18:

5'-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3' (SEQ ID NO:143)

Následující primerové páry se použily pro deleci zbytků 22 až 31 humánního OPG genu, která měla za následek vznik huOPG [32-401]-Fc fúzního proteinu:

1436-27:

5'-GTG GAC CAC CCA GGA CGA AGA AAC CTC TC-3' (SEQ ID NO:144) _

1436-28:

5'-GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG GGT TCC-3' (SEQ ID NO:145)

Následující primerové páry se použily pro změnu kodonu pro tyrosinový zbytek 28 na fenylalaninu humánního OPG

01-1718-97 Če • Φ · · ·· ·· ·· • · · · · · · · · · · • · · · · · ·· • ·· · ······ · genu, což mělo za následek produkci huOPG [22-401]-Fc Y28F fúzního proteinu:

1436-27:

5'-CGT TTC CTC CAA AGT TCC TTC ATT ATG AC-3' (SEQ ID NO:146)

1436-30:

5'-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TGG AGG AAA CG-3' (SEQ ID NO:147)

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro tyrosinový zbytek 26 na alaninu humánního OPG genu, což mělo za následek produkci huOPG [22-401]-Fc P26A fúzního proteinu:

1429-83:

5'-GGA ACC GTT TCC TGC AAA GTA CCT TCA TTA TG-3 (SEQ ID NO:148)

1429-84:

5'-CAT AAT GAA GGT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC -3' (SEQ ID NO:149)

Každý výsledný muOPG [22-401]-Fc plasmid, obsahující příslušnou mutaci, se následně transfektoval do humánních 293 buněk a mutantní OPG-Fc fúzní protein se purifikoval z výše zmíněného kondiciovaného média. Biologická aktivita každého proteinu se testovala in vitro testem tvorby osteoklastů, který je popsán v příkladu 11.

01-1718-97 Če

Příklad 8

Exprese OPG v E. coli

A. Bakteriální expresní vektory pAMG21

Expresní plasmidový pAMG21 může být odvozen z Amgenova expresního vektorového systému pCFM1656 (ATCC #69576), který může být zase odvozen z Amgenova expresního vektorového systému, popsaného v patentu US 4,710,473. Plasmid pCFM1656 může být odvozen z popsaného pCFM36 plasmidu (patent US 4,710,473): (a) zničením dvou endogenových Ndel restrikčních míst koncovým plněním T4 polymerázovým enzymem a následným upravením konce ligaci; (b) replikací DNA sekvence mezi jedinečnými AatlI a Clal restrikčními místy obsahujícími syntetický P_L promotor s podobným fragmentem získaným z pCFM636 (patent US 4,710,473) obsahujícího PL promotor

AatlI

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT3 · TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCAGTAŤTTAATAGAGACGGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (SEQ ID NO: 53)

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (SEQ ID NO: 54)

Clal a následně (c) substitucí malé DNA sekvence mezi výjimečnými Clal a KpnI restrikčními místy následujícími oligonukleotidy:

01-1718-97 Če

•	9	·· ··		··	•
*	•	• ·	•	• ·
• ·	•	• · · ·	•	•	Λ
•	•	•	•	•	•
9 ··				• ·

5' (SEQ

3' (SEQ

CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' ID NO:48)

TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5'

ID NO:49)

Clal

- KpnI

Expresní plasmid může být následně odvozen z pCFM1656 připravením série místně směrovaných bazických změn PCR, vzájemným překryvem oligomutageneze a DNA sekvenčních substitucí. Počínaje BglII místem (plasmid bp # 180) bezprostředně za 5' k plasmidovému replikačnímu promotoru PcopB směrem k plasmidovým replikačním genům došlo k následujícím změnám bazických párů:

	pAMG21 bp #	bp v pCFM1656	bp v pAMG21	změněný na
#	204	T/A	C/G
#	428	A/T	G/C
#	509	G/C	A/T
#	617	- -	dva inzerty	G/C bp
#	679	G/C	T/A
#	980	T/A	C/G
#	994	G/C	A/T
#	1004	A/T	C/G
#	1007	C/G	T/A
#	1028	A/T	T/A
#	1047 “·” ^!==i	C/G ^s '	T/A = ⁵ —‘
#	1178	G/C	T/A
#	1466	G/C	T/A
#	2028	G/C	bp delece
#	2187	C/G	T/A
#	2480	A/T	T/A

* ·· ·· ·· ·· · · · · · · • · · · ·· • · · ··· · ·

01-1718-97 Če	77	« • ···· bp v	• · · · ·'·*«· · • · · · · · pAMG21 změněný na
	pAMG21 bp #	bp v	PCFM1656
#	2499-2502	AGTG . TCAC	- -........	- GTCA CAGT	•
# # #	2642 3435 3446 3643	TCCGAGC AGGCTCG G/C G/C A/T		7 bp A/T A/T T/A	delece
DNA sekvence	mezi unikátními	AatlI	(pozice #4364 v

pCFM1656) a SacII (pozice # 4585 v pCFM1656) restrikčních místech je substituována následující DNA sekvencí:

[AatlI kohezní konec] ₅, GCGTAACGTATGCATGGTCTCC(pozice #4358 v pAMG21) 5’ TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG—

-CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT-GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA-GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC-CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG-CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG-CATAAaCTGCCAGGCATCáAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAatlI

-TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC-AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG-TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC-AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG-GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC-CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG• ·

-1718-97 Če

-TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC-ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG-ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTCTAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG-GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA•CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT•AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT-TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATATAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAAatcgtcatacttatccctttgatttgggtcactattctggactactaaagcgaagaaattTTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTGAATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC•AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCATTTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTAAATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAGTTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATCAATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG•TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTCATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGTTATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACAAAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTCTTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAGGCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAACGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATTATTGGATTTTTGTCAGACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTGTAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGACTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATTATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAACTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTSacII

GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAÁCGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTGAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATACTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGTGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC01-1718-97 Če

-AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3' -TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5' [SacII kohezní konec] (SEQ ID NO:50) (pozice #5904 v pAMG21)(SEQ ID NO:46)

Během ligace kohezního konce této substituované DNA sekvence jsou zničeny vnější AatlI a SacII místa. V substituované DNA existují jedinečná AatlI a SacII místa.

pAMG22-His

Expresní plasmid pAMG22-His lze odvodit z Amgenova expresního vektoru pAMG22 substitucí malé DNA sekvence mezi jedinečnými Ndel (#4795) a EcoRI (#4818) restrikčními místy následujícím oligonukleotidovým duplexem:

Ndel -NtlSl . EcoRI

5' TATGAAACATCATCACCATCACCATCATGCTAGCGTTAACGCGTTGG 3' (SEQ ID N0:51) ' ACTTTGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACGATCGCAATTGCGCAACCTTAA 5 ’ (SEQ ID NO:52)

MetLysHisHisHisHisHisHisHisAlaSerValAsnAlaLeuGlu (SEQ ID NO:168) pAMG22

Expresní plasmid pAMG22 lze odvodit z Amgenova expresního vektoru pCFM1656 (ATCC #69576), který může být zase odvozen z Amgenova expresního vektorového systému popsaného v patentu US 4,710,473, uděleném

1. prosince 1987. Plasmid pCFM1656 může být odvozen z

01-1718-97 Če popsaného plasmidu pCFM836 (patent US 4,710,473): (a) zničením dvou endogenových Ndel restrikčních míst koncovým plněním T4 polymerázovým enzymem a následným ztupením konce ligací; (b) replikací DNA sekvence mezi jedinečnými AatlI a Clal restrikčními místy obsahujícími syntetický P_L promotor s podobným fragmentem získaným z pCFM636 (patent US 4,710,473), který obsahuje PL promotor

Aatix

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT3' TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (SEQ ID NO: 53) -ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (SEQ ID NO: 54)

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3' (SEQ ID NO:55)

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (SEQ ID NO:56) ==----Clal KpnI

Expresní plasmid pAMG22 může být následně odvozen z pCFM1656 připravením série místně směrovaných bazických změn PCR vzájemným překryvem oligomutageneze a DNA sekvenčních substitucí. Počínaje BglII místem (plasmid

01-1718-97 Če • · bp # 180) bezprostředně za 5' k plasmidovému replikačnímu promotoru PcopB směrem k plasmidovým replikačním genům, přičemž.....došlo k následujícím změnám bazických párů:

pAMG22 bp #	bp v pCFM1656	bp v pAMG22	změněný na
# 204	T/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T
# 617	- -	dva inzerty	G/C bp
# 679	G/C	T/A
# 980	T/A	C/G
# 994	G/C	A/T
# 1004	A/T	C/G
# 1007	C/G	T/A
# 1028	A/T	T/A
# 1047	C/G	T/A
# 1178	G/C	T/A
# 1466	G/C	T/A
# 2028	G/C	bp delece
# 2187	C/G	T/A
# 2480	A/T	T/A
	... acmc	.... ctcs. . . . ..
	TCAC	CAGT
# 2642	TCCGAGC AGGCTCG	7 bp delece
# 3435	G/C	A/T
# 3446	G/C	A/T
# 3643	A/T	T/A

• ·

01-1718-97 Če

DNA sekvence mezi unikátními AatlI (pozice #4364 v PCFM1656) a SacII (pozice # 4585 v pCFM1656) restrikčních místech je substituována následující DNA sekvencí:

[AatlI kohezní konec](pozice #4358 v pAMG22) ’ GCGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT-ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG-TATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC-AACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG-TTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC-CCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG-GGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-GCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTAAatlI

-ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC-TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAG-TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGTTT-AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA-TAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGTGT-ATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCACASacII

-CGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAA-GCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTCTT-CTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGG-CCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCA-GGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGT-CGCTCTTCACGC 3' (SEQ ID NO: 58)

-GCGAGAAGTG 5' (SEQ ID NO: 57) (SacII kohezní konec](pozice #5024 v pAMG22)

01-1718-97 Če

B. Humánní OPG Met [32-401]

V příkladu byl použitým expresním vektorem vektor pAMG21, derivát pCFM1656 (ATCC přírůstkové číslo 69576), který obsahoval vhodná restrikční místa pro inzerci genů za lux PR promotorem (popis lux expresního systému lze nalézt v patentu US 5,169,318). Použitou hostitelskou buňkou byla GM120 (ATCC přírůstkové číslo 55764). Tento hostitel má lacIQ promotor a láci gen integrovaný ve druhém místě hostitelského chromozomu prototrofického E. coli K12 hostitele. Pro expresi jsou vhodné i další běžně používané E. coli expresní vektory a hostitelské buňky.

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 32-401 humánního OPG polypeptidu, se zavedla pod kontrolou luxPR promotoru do plasmidového expresního vektoru následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1257-20 a #1257-19 jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pRcCMV-Hu OPG DNA, obsahuj ící^=i=á“humánní'ⁱ’”⁼ OPG ~ cDNA, ’ “a^^—třiceticyklové termocyklizace tvořené třiceti cykly: přičemž každý cyklus zahrnoval 20 sekund při 94°C, 30 sekund při 37°C a nakonec 30 sekund při 72°C. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se analyzoval, purifikoval a podrobil restrikci KpnI a BamHI restrikční endonukleázou a purifikoval. Syntetické oligonukleotidy #1257-21 a #1257-22 se jednotlivě fosforylovaly pomocí T4 polynukleotidové

01-1718-97 Če kinázy a ATP a následně se smísily, zahřály na 94 °C a nechaly ochladit na pokojovou teplotu za vzniku oligonukleotidového spojovníkového duplexu, který obsahoval Ndel ' a KpnI kohezní konce. Fosforylovaný spojovníkový duplex, tvořený mezi oligonukleotidy #1257-21 a #1257-22, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce (viz obr. 14A) a KpnI a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt, generovaný za použití oligo-primerů #1257-20 a #1257-19 (viz výše) se přímo vřadila mezi dvě místa plasmidového vektoru pAMG21, konkrétně Ndel místo a BamHI místo, pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie (viz obr. 14A a níže uvedené sekvence). Syntetický spojovník použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin.

Zvolily se dva klony, izolovala se plasmidová DNA a humánní OPG inzert se následně potvrdil DNA sekvencí. Výsledný pAMG21 plasmid, obsahující aminokyseliny 32-401 humánního OPG polypeptidů v rámci bezprostředně následující za methioninem, byl označen jako pAMG21-huOPG met[32-401] nebo pAMG21-huOPG met[32-401]

Oligo#1257-19

5' -TACGCACTGGATCCTTATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGAC-3 ' (SEQ ID NO:59)

Oligo#1257-20 —-~·— = — , 5'-GTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAAC-3' (SEQ ID NO:60)

Oligo#1257-21

5' -TATGGATGAAGAAACTTCTCATCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCC

GCCGGGTAC -3' (SEQ ID NO:61)

Oligo#1257-22 ’ -CCGGCGGACATTTATCACACAGCAGCTGATGAGAAGTTTCTTCATCCA-3' (SEQ ID NO:47)

01-1718-97 Če

Kultury pAMG21-huOPG met[32-401] v E. coli GM120 v 2XYT médiu, obsahujícím 20 gg/ml kanamycinu, se před vřazením inkubovaly při 30°C. Přidáním .syntetického autoinduceru N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserinlaktonu do média kultury do konečné koncentrace 30 ng/ml se dosáhlo indukce huOPG met[32-401] genové produkční exprese z luxPR promotoru a kultury se inkubovaly buď při 30°C nebo 37°C po dalších 6 hodin. Po šesti hodinách se bakteriální kultury zkoumaly mikroskopicky, přičemž cílem tohoto mikroskopického průzkumu bylo zjistit přítomnost inkluzních těl, a následně peletovaly odstřeďováním. Přítomnost lámavých inkluzních těl v indukovaných kulturách naznačovala, že část rekombinantního huOPG met[32-401] genového produktu se produkovala nerozpustně v E. coli. Některé bakteriální pelety se resuspendovaly v lOmM TrisHCl/pH8, lmM EDTA a lyžovaly přímo přidáním 2X Laemlli vzorkového pufru na IX konečnou koncentraci a β-merkaptoethanolu do 5% konečné koncentrace a analyzovaly pomocí SDS-PAGE. Na SDS-PAGE gelu, obsahujícím celkové buněčné lyzáty kultur indukovaných při 30°C a 37°C, bylo možné pozorovat podstatně intenzivněji zabarvený pás (coomassie), přibližně 42 kDa, ve srovnání s linií 2, kterou je celkový buněčný lyzát kultury inkubované při 30°C (obr. 14E).-Délka očekávaného genového produktu by měla být 370 aminokyselin a očekávaná molekulová hmotnost přibližně 42,2 kDa. Po šestihodinové inkubaci při 37°C se peletovala další kultura, která se inkluzních těl (viz níže) dále zpracovala buď izolací nebo mikrofluidizací. Peleta, zpracovaná mikrofluidizací, se resuspendovala v 25mM TrisHCl/pH8, 0,5M NaCl pufru mikrofuidizerem Model 1108 a dvacetkrát protáhla (Microfluidics Corp.) a • · e e

01-1718-97 Če • « • ·· shromáždila. Z nashromážděného vzorku (mikrofluidizovaného celkového lyzátu) se odstranil alikvotní podíl a zbytek se peletoval dvacet minut při 20 000 x g. Vzniklý supernatant se odstranil· (mikrofluidizovaná rozpustná frakce) a¹ peleta se resuspendovala ve 25mM Tris-HCl/pH8, 0,5M NaCl, 6M roztoku močoviny (mikrofluidizovaná nerozpustná frakce). Do alikvotního podílu celkové rozpustné nebo nerozpustné frakce se přidal Laemalliho vzorkový pufr do dvojnásobné konečné koncentrace a β-merkaptoethanol do 5% konečné koncentrace. Vzorky se následně analyzovaly pomocí SDSPAGE. Zdá se, že se v nerozpustné frakci nachází podstatné množství rekombinantního huOPG met[32-401] genového produktu. Rekombinantní proteinová inkluzní těla se purifikovala následujícím způsobem. Bakteriální buňky se separovaly z média izopyknickou centrifugací v Beckmannově J-6B odstředivce opatřené JS-4.2 rotorem, která se prováděla patnáct minut při 4 900 x g a při 4°C. Bakteriální peleta se resuspendovala v 5 ml vody a následně se vodou naředila na konečný objem 10 ml. Tato suspenze se přemístila do kalíšku z nerezavějící oceli, chlazeného v ledu, a podrobila sonifikačnímu rozrušení pomocí Bransonova sonifikátoru opatřeného standardním koncem (power setting=5, duty cycle=95%, 80 bursts). Sonifikovaná buněčná suspenze se odstřeďovala pět až deset minut v supercentrifuze ' Beckman Optima TLX, ““ vybavené TLA 100.3 ’ rotorem při 195 000 x g při 23°C. Supernatant se odstranil a peleta se propláchla proudem vody ze střičky. Pelety se shromáždily seškrábnutím pomocí mikrošpachtle a transfektovaly do skleněného homogenizeru (15 ml kapacita). Pět ml roztoku Percoll (75% kapalného Percollu, 0,15 M chloridu sodného) se přidalo do homogenizeru a obsahy se homogenizovaly dokud se nedosáhlo rovnoměrné suspenze.

01-1718-97 Če • ·

Objem se zvýšil přidáním roztoku Percoll na 19,5 ml, smísil a distribuoval do 3 Beckman Quick-Seal zkumavek (13 χ 32 mm). Zkumavky se uzavřely podle instrukcí výrobce. Zkumavky - se 30 minut ·- odstřeďovaly ' v rotoru Beckman TLA 100.3 při 23°C a 20 000 ot./min (21 600 x g) . Zkumavky se analyzovaly z hlediska příslušného pásmového vzoru. Ke zjištění křehkých těl se izolovaly gradientní frakce a naředily vodou. Inkluzní těla se peletovala centrifugací a proteinová koncentrace se stanovila pomocí SDS-PAGE.

Alikvotní podíl inkluzních těl, izolovaný níže popsaným způsobem, se rozpustil v IX Laemlliově vzorkovém pufru s 5% β-merkaptoethanolem a rozpustil na SDS-PAGE gelu a izolovaná inkluzní těla poskytla vysoce purifikovaný rekombinantní huOPG[32-401] genový produkt. Hlavní ~42 kDa pás, pozorovaný po rozpuštění inkluzních těl na SDSpolyakrylamidovém gelu se excidoval ze separačního gelu a zjistilo se, že N-koncová aminokyselinová sekvence je v podstatě totožná se sekvencí, kterou popsal Matsudaira a kol., J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Následující sekvence byla určena po 19 cyklech:

NH₂ -MDEETSHQLLCDKCPPGTY-COOH (SEQ ID NO:62)

7.T -Ϊ <= + Ί 1 že tato sekvence je identická S’ prvními kódovanými pAMG21 Huvektorem produkovaným devatenácti aminokyselinami,

OPG met[32-401] expresním methioninovým zbytkem, který poskytl bakteriální expresní vektor.

01-1718-97 Če • · ·«

C. Humánní OPG met[22-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 humánního OPG, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Izolovaná plasmidová DNA pAMG21-huOPG met [32-401] (viz část B) se rozštěpila pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy a výsledné fragmenty se rozpustily na agarózovém gelu. B fragment (~1O64 bp fragment) se izoloval z gelu za použití standardní metodologie. Syntetické oligonukleotidy #1267-06 a #1267-07 se jednotlivě fosforylovaly a nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex, který obsahoval Ndel a KpnI kohezní konce, za použití postupů v části B. Syntetický spojovník použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex obsahující Ndel a KpnI kohezní konce, a izolovaný ~1064 bp fragment pAMG21-huOP met[32-401], digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli elektroporací postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[22-401]genu.

Oligo #1267-06

5»-TAT GGA AAC TTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TTC TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TCC GCC GGG TAC-3* (SEQ ID NO:63) • ·

01-1718-97 Če

Oligo #1267-07

5*-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAG AAG TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG GAA AAG TTT CCA-3* (SEQ ID NO:64)

Kultury pAMG21-huOPG-met[22-401] v E. coli hostiteli 393 se umístily do 2XYT média obsahujícího 20 gg/ml kanamycinu a před indukcí se inkubovaly při 30°C. Indukce exprese rekombinantního genového produktu z luxPR promotoru vektoru pAMG21 se dosáhlo přidáním syntetického autoinduceru, N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserinlaktonu, do kulturního média do konečné koncentrace 30 ng/ml a další šestihodinovou inkubací buď při 30°C nebo 37°C. Po šesti hodinách se bakteriální kultury peletovaly centrifugací (=30°C, 1+6 nebo 37°C 1+6). Bakteriální kultury se rovněž peletovaly buď bezprostředně před indukcí (=30°C, Přel) nebo se alternativně do separační kultury žádný inducer nepřidal a tato kultura se nechala inkubovat při 30°C po dobu dalších šesti hodin a poskytla tak neindukovanou (UI) kulturu (=30°C UI). Bakteriální pelety buď 30°C Pre I, 30°C UI, 30°C 1+6 nebo 37°C 1+6 kultur se resuspendovaly, lyžovaly a analyzovaly SDS-polyakrylamidogelovou eiektroforézou (PAGE) ' ža podmínek, popsaných v části B. Polyakrylamidové gely se buď obarvily modří coomasie a/nebo westernovým přenosem převedly na nitrocelulózu a imunosondovaly králičí anti-mu OPG-Fc polyklonální protilátkou způsobem, popsaným v příkladu 10. Hladina genového produktu, vzniklého následkem indukce, se porovnala s neindukovaným (30°C UI) nebo předem indukovaným (30°C Přel) vzorkem.

01-1718-97 Če

D. Myší OPG met[22-401]

N-koncový methionin a (mu) OPG polypeptidu, se

DNA sekvence, kódující aminokyseliny 22 až 401 myšího vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1257-16 a #1257-15 jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pRcCMV-Mu OPG DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR produkt se štěpil pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy způsobem popsaným v části B. Syntetické oligonukleotidy #1260-61 a #1260-82 se jednotlivě fosforylovaly a nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex, který obsahoval Ndel a KpnI kohezní konce za použití postupů v části B. Syntetický spojovník použil E. coli kodony a poskytl methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex, oligonukleotidy #1260-61 a #1260-82, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce a digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy a purifikovaný PCR produkt generovaný za použití oligonukleotidových primerů #1257-16 a #1257-15 se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských.™393= .buněk . E. colipostupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-met[22-401] genu.

N-koncový vytvořený

Exprese rekombinantního muOPG met [22-401] polypeptidu z kultur 393 buněk, které obsahovaly plasmid pAMG21-MuOPG met [22-401], která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

• · · · • · ··

01-1718-97 Če ·· ··

Oligo #1257-15

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA AC-3’ (SEQ ID NO:65)

Oligo #1257-16 .......

’ -GTG CTC CTG GTA CCT ACC TAA AAC AGC ACT GCA CAG TG-3’ (SEQ ID NO:66)

Oligo #1260-61

5’-TAT GGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TÁC-3’ (SEQ ID NO:67)

Oligo #1260-82

5¹-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CCA3’ (SEQ ID NO:68)

E. Myší OPG met[32-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 32 až 401 myšího OPG polypeptidů, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy #1267-08 a #1267-09 se jednotlivě fosforylovaly a za použití postupů popsaných v “ části’ ”B nechaly “vytvořit “ oligonukleotidový ‘“spojovníkový duplex. Syntetický spojovníkový duplex použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex, vytvořený mezi oligonukleotidy #126708 a #1267-09, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce a digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy, a purifikovaný PCR produkt, popsaný již dříve (část D), se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo

01-1718-97 Če ····

» ·· • · « • ·· »· · « • · ι vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-met[32-401]genu.

Exprese rekombinantního muOPG met [32-401] polypeptidů z kultur 393 buněk, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21 v důsledku indukce, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1267-08

5' -TAT GGA CCC AGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO:69)

Oligo #1267-09

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CTG GGT CCA-3' (SEQ ID NO:70)

F. myší OPG met-lys[22-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin následovaný lysinovým zbytkem a aminokyseliny 22 až 401 myšího OPG, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy #1282-95 a #1282-96 se jednotlivě fosforylovaly a za použití postupů popsaných v části B nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex. Syntetický spojovníkový duplex použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex, vytvořený mezi oligonukleotidy #128201-1718-97 Če ·· • · · • · ··

999 · • 9

99 a #1282-96, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce a digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy, a purifikovaný PCR produkt, popsaný již dříve (část D) , se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 3 93 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-Met-Lys[22-401]genu.

Exprese rekombinantního muOPG Met-Lys[32-401] polypeptidů z kultur 393 buněk, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1282-95

5'-TAT GAA AGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO:71)

Oligo #1282-96

5' -CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TCA-3' (SEQ ID NO:72)

G. Myší OPG met-lys-(his)7[22-401]

DNA sekvence, kódující N-koncové zbytky Met-Lys-HisHis-His-His-His-His-His (=MKH) následované aminokyselinami 22 až 401 myšího OPG, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního ··

01-1718-97 Če ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · ·* ·· vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1300-50 a #1257-15 jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pAMG21-muOPGmet[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných' v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se excisoval, purifikoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikčni endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt, generovaný za použití oligonukleotidových primerů #1300-50 a #1257-15, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-MKH[22-4 01] genu.

Exprese rekombinantního muOPG MKH[22-401] polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1300-50

5'-GTT CTC CTC ATA TGA AAC ATC ATC ACC ATC ACC ATC ATG AAA CTC TGC CTC CÁA AAT ACC TGC ATT ACG ÁT-3' (SEQ ID NO:73)

Oligo #1257-15 (viz sekce D) • ·

01-1718-97 Ce

H. Myší OPG met-lys[22-401](his)₇

DNA sekvence, kódující N-koncový met-lys, aminokyseliny 22 až 401 myšího OPG a sedm histaminových zbytků následujících aminokyselinu 401 (=muOPG MK[22-401]H₇) , se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1300-49 a #1257-51 jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se purifikoval, štěpil pomocí endonukleázy a purifikoval. a purifikovaný PCR produkt, použití oligonukleotidových primerů #1300-50 a #1257-15, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-MK[22-401]-H₇ genu.

Ndel a BamHI

Ndel a BamHI generovaný za excisoval, restrikční digerovaný _____________F.vprpRň- . rakomblnantního = muOPG = ΜΚΓ22-401] -H₇ polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

01-1718-97 Če

Oligo #1300-49

5’-GTT CTC CTC ATA TGA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC A-3' (SEQ ID NO:74)

Oligo #1300-51

5’-TAC GCA CTG GAT CCT TAA TGA TGG TGA TGG TGA TGA TGT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA ACC TGA TTC CCT A-3’ (SEQ ID NO:75)

I. Myší OPG met[27-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 27 až 401 myšího OPG, se umístila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-74 a #1257-15 jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se izoloval, purifikoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie

-přímo-.vřadil., mezi Ndel m.ísto, .a, .BamHI, „místo plasmidového „ , vektoru pAMG21. Ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[27-401] genu.

Exprese rekombinantního muOPG-met[27-401] polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly

01-1718-97 Če

rekombinantní plasmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo#1309-74

5'-GTT CTC CTC ATA TGA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC AT-3’ (SEQ ID NO:76)

Oligo#1257-15 (viz Sekce D)

J. Humánní OPG met[27—401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 27 až 401 humánního OPG, se umístila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-75 a #1309-76 jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pAMG21-huOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se izoloval, purifikoval, štěpil pomocí Asel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Asel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[27-401] genu.

01-1718-97 Če

Exprese rekombinantního huOPG-met[27-401] polypeptidu z transformovaných 393 buněk, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21, která následoval po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1309-75

5'-GTT CTC CTA TTA ATG AAA TAT CTT CAT TAT GAT GAA GAA ACT T-3’ (SEQ ID NO:77)

Oligo #1309-76

5*-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTT ACT GAT T-3' (SEQ ID NO:78)

K. Myší OPG met[22-180]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 180 myšího OPG, se uvedla pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-72 a #1309-73 jako primery, se prováděla za použiti matricového plasmidu pAMG21-muOPGmet [22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR .produkt „~se„-izoloval, «purifikoval, „«štěpil- pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligace se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se

01-1718-97 Če • · • · ···· • Φ > ♦ i » « · · ·· • ·

II • · • · « * sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[22-180] genu.

Exprese rekombinantního muOPG-met[22-180] polypeptidů z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21, která následoval po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1309-72

5'-GTT CTC CTC ATA TGG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC A-3' (SEQ ID NO:79)

Oligo #1309-73

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT GTT GCA TTT CCT TTC TGA ATT AGC A-3' (SEQ ID NO:80)

L. Myší OPG met[27-180]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 27 až 180 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plasmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-74 (viz část I) a #1309-73 (viz část K) jako primery, se prováděla za použití matricového plasmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se vyjmul, purifikoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Výše uvedený Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plasmidového vektoru pAMG21. Ligace se

393 buněk E. coli vybraly, izolovala ·· • ·

01-1718-97 Če .:.,

100 elektroporací převedla do hostitelských postupem doporučeným výrobcem. Klony se se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[27-180]'genu.

Exprese rekombinantního muOPG met[27-180] polypeptidů z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plasmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

M. Myší OPG met[22-189] a met[22-194]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 22 až 189 nebo 22 až 194 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Pár syntetických oligonukleotidů #1337-92 a #1337-93 (=muOPG-189 spojovník) nebo #1333-57 a #1333-58 (=muOPG-194 spojovník), se individuálně fosforyloval a nechal vytvořit oligospojníkový duplexový pár za použití metod popsaných v sekci B. Purifikovaná plasmidová DNA pAMG21-muOPG-met[22-401] se štěpila pomocí KpnI a BspEI restrikčních endonukleáz a výsledné DNA fragmenty se rozpustily na agarózovém gelu. Přibližně 413 bp B fragment se izoloval pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie. Fosforylované oligospojovníkové duplexy se vytvořily buď mezi oligonukleotidy #1337-92 a #13337-93 (muOPG-189 spojovník) nebo mezi oligonukleotidy #1333-57 a #1333-58 (muOPG-194 spojovník) obsahující BspEI a BamHI kohezní konce, a výše zmíněný izolovaný ~413 bp B fragment plasmidového pAMG21-muOPGmet[22-401], digerovaný pomocí KpnI a BspEI restrikčních τ dr

01-1718-97 Če

101 endonukleáz, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi KpnI místo a BamHI místo pAMG21-muOPG met[22-401]. Každá ligační směs -se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E.· coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[22-189] genu nebo muOPG-met[22-194] genu.

Exprese rekombinantních muOPG-met[22-189] a muOPGmet [22-194] pólypeptidu z rekombinantních pAMG21 plasmidů transformovaných do 393 buněk se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1337-92

5’-CCG GAA ACA GAT AAT GAG-3' (SEQ ID NO:81)

Oligo #1337-93

5'-GAT CCT CAT TAT CTG TTT-3' (SEQ ID NO:82)

Oligo #1333-57

5'-CCG GAA ACA GAG AAG CCA CGC AAA AGT AAG-3' (SEQ ID NO:83)

Oligo #1333-58

5'-GAT CCT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TTT-3' (SEO ID NO: 84) . ..

N. Myší met[27-189] a met[27-194]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 27 až 189 nebo 27 až 194 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Fosforylované oligonukleotidové spojovníky, „muOPG-189 spojovník nebo „muOPG-194 spojovník (viz část M) obsahující BspEI a BamHI e 9

01-1718-97 Če

102 kohezní konce a izolovaný -413 bp B fragment plasmidového pAMG21-muOPG-met[22-4 01] , digerovaný pomocí KpnI a BspEI restrikčních endonukleáz, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi KpnI místo a BamHI místo pAMG21—muOPG met [27-401] . Každá ligačníz směs se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[27-189] genu nebo muOPG-met[27-194] genu.

Exprese rekombinantního muOPG-met[27-189] a muOPGmet [27-194] polypeptidú z rekombinantních pAMG21 plasmidů transformovaných do 393 buněk se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

0. Humánní OPG met[22-185], met[22-189], met[22-194]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 22 až 185, 22 až 189 nebo 22 až 194 humánního OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Pár syntetických oligonukleotidů, #1331-87 a #1331-88 (=huOPG-185 spojovník), #1331-89 a #1331-90 (=huOPG-189 spojovník) nebo #1331-91 a #1331-92 (=huOPG-194 spojovník), se individuálně fosforylovaly a jednotlivě nechaly vytvořit oligo-spojovníkový duplexový pár za použití metod popsaných v sekci B. Purifikovaná plasmidová DNA pAMG21-huOPG-met [27-401] se štěpila pomocí KpnI a Ndel restrikčních endonukleáz a výsledné DNA fragmenty se rozpustily na agarózovém gelu. Přibližně 407 bp B fragment se izoloval pomocí standardní rekombinantní DNA standardní

01-1718-97 Če

«· ··

103 #1331-90 (=huOPG-189 (huOPG-194 spojovník) metodologie. Fosforylované oligo-spojovníkové duplexy, vytvořené buď mezi oligonukleotidy #1331-87 a #1331-88 (=huOPG-185 spojovník), #1331-89 a spojovník) nebo #1331-91 a #1331-92 [každý spojovník obsahuje Ndel a BamHI kohezní konce], a výše zmíněný izolovaný ~407 bp B fragment plasmidového pAMG21-huOPG-met [27-401], digerovaný pomocí KpnI a Ndel restrikčních endonukleáz, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi KpnI místo a BamHI místo plasmidu pAMG21-huOPG met[22-401] . Každá ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E· coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[22-185] genu, huOPG-met [22-189] genu nebo huOPG-met [22-194] genu.

Exprese rekombinantního huOPG-met[22-185], huOPGmet [22-189] nebo huOPG-met[22-194] v transformovaných 393 buňkách obsahujících rekombinantní pAMG21 plasmidy se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1331-87

5’-TAT GTT AAT GAG-3' (SEQ ID NO:85)

Oligo #1331-88

5’-GAT CCT CAT TAA CA-3' (SEQ ID NO:86)

Oligo #1331-89

5'-TAT GTT CCG GAA ACA GTT AAG-3' (SEQ ID NO: 87)

Oligo #1331-90

5'-GAT CCT TAA CTG TTT CCG GAA CA-3' (SEQ ID NO: 88)

01-1718-97 Če

CAA CTC AAA AAT

TCA CTG TTT CCG GAA^:

104

Oligo #1331-91

5'-TAT GTT CCG GAA ACA GTG AAT AAG-3’ (SEQ ID NO:89)

Oligo #1331-92

5'-GAT CCT TAT TTT TGA GTT GAT CA-3’ (SEQ ID NO:90)

P. Humánní OPG met[27-185], met[27-189], met[27-194]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 27 až 185, 27 až 189 nebo 27 až 194 humánního OPG polypeptidů, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Fosforylované oligonukleotidové spojovníky „huOPG-185 spojovník, „huOPG-189 spojovník nebo „huOPG194 spojovník (viz část O) obsahující Ndel a BamHI kohezní konce a izolovaný ~407 bp B fragment plasmidového pAMG21huOPG-met[27-401], digerovaný pomocí KpnI a Ndel restrikčních endonukleáz (viz část O), se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi KpnI místo a BamHI místo plasmidu pAMG21-huOPG met [27-401] (viz část J) . Každá ligační směs se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E, colí postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se jsekvencování DNA,₌ jehož cílem bylo ověřit _DNA sekvenci huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] nebo huOPGmet[27-194] genu.

Exprese rekombinantního huOPG-met[27-185], huOPGmet [27-189] a huOPG-met[27-194 ] polypeptidů z rekombinantních pAMG21 plasmidů transformovaných do 393 kultur se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

• »

01-1718-97 Če

105

Q. Myší OPG met[27-401] (P33E, G36S, A45P)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 27 až 48 humánního a následně aminokyselinové zbytky 4 9 až 4 01 myšího OPG, se dala pod kontrolou. íuxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Purifikovaný plasmid pAMG21-huOPGmet [27-401] (viz část J) se štěpil pomocí AatlI a KpnI restrikčních endonukleáz a ~1075 bp B fragment izolovaný z agarózového gelu se za použití standardní rekombinantní DNA metodologie izoloval z agarózového gelu. Kromě toho se plasmidová pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA (viz část D) digerovala pomocí KpnI a BamHI restrikčních endonukleáz a výše popsaného izolovaného -1064 bp B fragmentu. Izolovaný ~1075 bp pAMG21-huOPG-met[27-401] restrikční fragment obsahující AatlI & KpnI kohezní konce (viz výše), -1064 bp pAMG21-muOPG-met[22-401] restrikční fragment obsahující KpnI a BamHI kohezní konce a -5043 bp restrikční fragment obsahující AatlI a BamHI kohezní konce a odpovídající nukleokyselinová sekvence pAMG21 mezi AatlI & BamHI se ligovaly za použití standardní rekombinantní DNA metodologie. Ligace se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly a přítomnost rekombinantního inzertu v plasmidu se ověřila pomocí standardní DNA metodologie. Změny aminokyselin v muOPG z prolinu-33 na kyselinu glutamovou-33, z glycinu-36 na serin-36 a z alaninu-45 na prolin-45 jsou výsledkem náhrady muOPG zbytků 27 až 48 huOPG zbytky 27 až 48.

Exprese rekombinantního muOPG-met[27-401] (P33E, G36S,

A45P) z transformovaných 393 buněk obsahujících

01-1718-97 Ce « <► · » ··· · · • · 9 9 9

999 9999 99 99

106 rekombinantní pAMG21 plasmid se určila způsoby popsanými v části C.

R. Myší OPG met-lys (his) 2-ala-ser-(asp) 4-lys [22-401] (A45T)

DNA sekvence, kódující N-koncový His a enterokinázu rozpoznávající sekvenci, kterou je (od NH₂ k COOH konci) Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-Asp-Asp-AspAsp-Lys (=HEK), a za touto sekvencí následují aminokyseliny 22 až 401 myšího OPG polypeptidů, se dala následujícím způsobem pod kontrolu lac represoru regulovaného Ps4 promotorem. pAMG22-His (viz část A) se digerovala pomocí Nhel a BamHI restrikčních endonukleáz a velký fragment (fragment A) se izoloval z agarózového gelu za použití standardní rekombinantní DNA metodologie. Oligonukleotidy #1282-91 a #1282-92 se individuálně fosforylovaly a pomocí již popsaných metod nechaly vytvořit oligo-vazebníkový duplex (viz část B) . Fosforylovaný vazebný duplex, vytvořený mezi oligonukleotidy #1282-91 a #1282-92, obsahující Nhel a KpnI kohezní konce, popsaný KpnI a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt (viz část D) a A fragment vektoru pAMG22-His digerovaného pomocí Nhel a BamHI se ligovaly za použití standardní rekombinantní DNA metodologie. Ligacs se ^pomocí, elektroporace, prováděné způsobem doporučeným výrobcem, transformovala do E. coli hostitele GM120. Klony se zvolily, izolovala se plasmidová DNA a provedlo se DNA sekvencování s cílem ověřit DNA sekvenci muOPG-HEK[22-401] genu. DNA sekvencování odhalilo v přirozené muOPG sekvenci nepůvodní mutaci, která vznikla v důsledku změny jediné aminokyseliny alaninu-45 muOPG polypeptidů na threonin.

·· ··

01-1718-97 Če • 9 ···· ·

107

Exprese rekombinantní muOPG-HEK[22-401] (A45T) z GM120 buněk obsahujících rekombinantní pAMG21 plasmid se určila za použití metod v podstatě shodných s metodami popsanými v části C s tou výjimkou, že se namísto přidání syntetického autoinduktoru pro dosažení indukce přidává IPTG do konečné koncentrace 0,4 mM.

Oligo #1282-91

5*-CTA GCG ACG ACG ACG ACA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC ATC AGC TGC TGT GTG ATA AAT GTG CTC CGG GTA C-3’ (SEQ ID NO: 91)

Oligo #1282-92 ’-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TGT CGT CGT CGT CG-3' (SEQ ID NO:92) :S. Humánní OPG met-arg-gly-ser- (his) ₆[22-401]

Pro přípravu fragmentu se 175 bázemi pro vzájemné překrytí dvouřetězcové DNA bylo navrženo osm oligonukleotidů (1338-09 až 1338-16, uvedených níže). Tyto oligonukleotidy se temperovaly, ligovaly a 5' a 3' oligonukleotidy se použily jako PCR primery pro přípravu -větších ~⁼mnoŽ8tví“f ragmentu tvořeného “175 ““bázemi. Konéčné PCR genové produkty se digerovaly restrikčními endonukleázami Clal a KpnI, čímž se získal fragment, který nahradil 28 N-koncových kodonů humánního OPG. Clal a KpnI digerovaný PCR produkt se vřadil do pAMG21-huOPG [27-401], který byl rovněž štěpen Clal a KpnI. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli 393. Klony se prohledávaly s cílem určit, zda jsou schopny • 4

01-1718-97 Ce • · 9 9 · • · · ♦· « « ··· · 9

108 produkovat rekombinantní proteinový produkt a zda obsahují genovou fúzi mající správnou nukleotidovou sekvenci. Úrovně proteinové exprese se určily na základě studií prováděných v- 50 ml protřepávačce. U celého buněčného lyzátu a sonifikované pelety se analyzovala exprese konstruktu pomocí barvivém Coomassie zabarvených PAGE gelů a pomocí westernové analýzy za použití myší anti-OPG protilátky. Exprese huOPG Met-Arg-Gly-Ser-(His)_s [22-401], jejímž výsledkem je tvorba velkých inkluzních těl a proteinu, se lokalizovala do nerozpustné (peletové) frakce.

1338-09

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GA (SEQ ID NO: 93)

1338-10

TTT GTT TTA ACT AAT TAA AGG AGG AAT AAA ATA TGA GAG GAT CGC ATC AC (SEQ ID NO:94)

1338-11

CAT CAC CAT CAC GAA ACC TTC CCG CCG AAA TAC CTG CAC TAC GAC GAA GA (SEQ ID NO: 95)

1338-12

AAC CTC CCA CCA GCT GCT GTG CGA CAA ATG CCC GCC GGG TAC CCA AAC A (SEQ ID NO:96)

1338-13

TGT TTG GGT ACC CGG CGG GCA TTT GT (SEQ ID NO: 97)

1338-14

CGC ACA GCA GCT GGT GGG AGG TTT CTT CGT CGT AGT GCA GGT ATT TCG GC (SEQ ID NO:98)

1338-15

GGG AAG GTT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGC GAT CCT CTC ATA TTT TAT T (SEQ ID NO:99)

1338-16

CCT CCT TTA ATT. AGT TAA AAC AAA TCT AGT -ATC AAA TCG ATT GTG TTT GT----------(SEQ ID NO:100) « · • ·

01-1718-97 Če «

• · β · ·· · · ft • c «»

109

T. Humánní OPG met-lys[22-401] a met(lys)₃[22-401]

Za účelem konstrukce met-lys a met-(lys)₃ verzí humánního OPG[22-401] byly pro přidání příslušného počtu lysinových zbytků navrženy vzájemně se překrývající oligonukleotidy. Pro každý konstrukt byly navrženy dva oligonukleotidy tak, aby překryv umožnil dva cykly PCR pro výrobu konečného produktu. Matricí pro první PCR reakci byl plasmidový DNA přípravek obsahující humánní 22-401 gen. První PCR přidala lysinový zbytek (zbytky). Druhá PCR použila produkt prvního cyklu a přidala sekvenci zpět na první restrikční místo, Clal.

Konečné PCR genové produkty se digerovaly restrikčními endonukleázami Clal a KpnI, které nahradily N-koncových 28 kodonů hu OPG a následně se ligovaly do plasmidového pAMG21-hu OPG [27-401], který se rovněž digeroval zmíněnými dvěmi restrikčními endonukleázami. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli kmene 393. Prohledáváním klonů se zjišťovala jejich schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a to, zda vykazují genovou fúzi se správnou nukleotidovou sekvencí. Úrovně proteinové exprese se stanovily ze studií 50 ml protřepávačky. Celý buněčný lyzát a sonifikovaná peleta se analyzovaly s cílem stanovit expresi konstruktu_ za použití coomassiem zabarvených PAGE gelů a westernové analýzy s myší anti-OPG protilátkou. U žádného konstruktu nebyla zjištěna detekovatelná úroveň proteinové exprese ani nebyla pozorována inkluzní těla. DNA sekvence byly potvrzeny DNA sekvencováním.

Pro přípravu Met-Lys huOPG[22-401] se použily následující oligonukleotidové primery:

01-1718-97 Če

TTT TAA CTA ATT

C (SEQ ID

110

1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG AAA GGA GGA ΑΤΑ AAA TG (SEQ ID NO: 101)

1338-18

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAG AAA AAT ATC (SEQ ID NO:102)

1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA NO:103)

Oligonucleotide primers to prepare Met-(Lys)3-huOPG[22401] :

1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO:104)

1338-19

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAA AAA AAG AAA CTT TTC CTC CAA AAT ATC (SEQ ID NO:105)

1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ID NO:106)

CTT TTC CTC CAA

U. Fúze humánního a myšího OPG [22-4011/Fc

Zkonstruovaly se čtyři OPG-Fc fúze, ve kterých se Fc úsek humánního IgGl navázal na N-konec humánních nebo myších osteoprotegerinových aminokyselin 22 až 401 (označený jako Fc/OPG [22-401]) nebo C-konec (označený jako OPG[22-401]/Fc). Fc fúze se konstruovaly za použití fúzního vektoru pFc-A3 popsaného v příkladu 7.

01-1718-97 Če • •5

111

Všechny fúzní geny se konstruovaly za použití standardní PCR technologie. Matricí pro PCR reakce byly plasinidové přípravky obsahující cílové geny. Překrývající oligonukleotidy byly navrženy tak, ¹ aby kombinovaly C-koncový úsek genu s N-koncovým úsekem jiného genu. Tento způsob umožňuje po provedení příslušných PCR reakcí vzájemné fúzování dvou genů ve správném čtecím rámci. Nejprve se do PCR reakce zavedl pomocí univerzálního primerů pro vektor, nesoucí cílový gen, pro každý gen jeden „fúzní oligonukleotid. Potom se pomocí univerzálního primerů zavedl do PCR reakce druhý komplementární „fúzní oligonukleotid, čímž se získal druhý gen. Na konci první PCR reakce se získaly dva samostatné produkty, přičemž v každém jednotlivém genu bylo přítomno fúzní místo, tvořící dostatečný překryv pro provádění druhého cyklu PCR a vytvoření požadované fúze. V druhém cyklu PCR se první dva PCR produkty zkombinovaly s univerzálními primery a prostřednictvím vzájemně se překrývajících úseků se připravila celodélková fúzní DNA sekvence.

Konečné PCR genové produkty se digerovaly restrikčními endonukleázami Xbal a BamHI a následně ligovaly do vektoru pAMG21, který byl rovněž digerován těmito dvěmi endonukleázami. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli bakteriálního kmene 393. Prohledáváním klonů se zjišťovala jejich schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a to, zda vykazují genovou fúzi se správnou nukleotidovou sekvencí. Úrovně proteinové exprese se stanovily ze studií 50 mi protřepávačky. Celý buněčný lyzát a sonifikovaná peleta se analyzovaly s cílem stanovit expresi konstruktu

01-1718-97 Če • · · * · · · 9 99 9 9 9

9 9 · 9

9 999 9 9D 9 9

112 za použití coomassiem zabarvených PAGE gelů a westernové analýzy s myší anti-OPG protilátkou.

Fc/huOPG [22-401]

Exprese Fc/hu OPG [22-401] fúzního peptidu se detekovala na coomassiem zabarveném PAGE gelu a na westernovém blotu. Buňky měly velmi velká inkluzní těla a velká část produktu se nacházela v nerozpustné (peletové) frakci. Pro konstrukci této OPG-Fc fúze se použily následující primery:

1318-48

CAG CCC GGG TAA AAT GGA AAC GTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TT (SEQ ID NO:107)

1318-49

CGT TTC CAT TTT ACC CGG GCT GAG CGA GAG GCT CTT CTG CGT GT (SEQ ID NO:108)

Fc/muOPG [22-401]

Exprese fúzního peptidú se detekovala na coomassiem zabarveném PAGE gelu a na westernovém blotu. Buňky měly velmi velká inkluzní těla a velká část produktu se nacházela v nerozpustné (peletové) frakci. Pro konstrukci této OPG-Fc fúze se použily následující primery:

01-1718-97 Če

113

1318-50

CGC TCA GCC CGG GTA AAA TGG AAA CGT TGC CTC CAA AAT ACC TGC (SEQ ID NO:109)

1318-51

CCA TTT TAC CCG GGC TGA GCG AGA GGC TCT TCT GCG TGT (SEQ ID NO:110) muOPG [22-401]/Fc

Exprese fúzního peptidu se detekovala na coomassiem zabarveném PAGE gelu a na westernovém blotu. Množství rekombinantního produktu bylo menší než OPG fúzních proteinů, které mají Fc úsek v N-koncové poloze. Zřejmá inkluzní těla nebyla detekována. Zdálo se, že většina produktu se nachází v nerozpustné (peletové) formě. Pro konstrukci této OPG-Fc fúze se použily následující primery:

1318-54

GAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SEQ ID NO:111)

1318-55

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G (SEQ ID NO:112)

01-1718-97 Če • t ·ΐ ·· · · · · · · ·· · · · · · · • · · · · * · ···· ··* ··· ···· ··* ··

114 huOPG [22-401]/Fc

Exprese fúzního peptidu nebyla na coomassiem zabarveném gelu zjištěna, ačkoliv na westernovém blotu byl patrný slabý pozitivní signál. Zřejmá inkluzní těla nebyla detekována. Pro přípravu této OPG-Fc fúze se použily následující primery:

1318-52

AAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SEQ ID N0:113)

1318-53

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG ATT GG (SEQ ID NO:114)

V. Fúze humánního OPG met[22-401]-Fc (P25A)

Tento konstrukt kombinuje aminokyselinovou změnu prolinu na alanin v poloze 25 (P25A) s huOPG met[22-401]-Fc fúzí. Plasmid se digeroval restrikčními endonukleázami Clal a KpnI, které odstranily 28 N-koncových kodonů genu a výsledný malý (kratší než 200 bazických párů) fragment se rral _nnri ί Vrxtra 1 ... Toni-n frarrmpnť . ·, kťprú Ί η ΑΓΠΊ sťn

W --------------------, -------_u -------------- ---------prolinu alanin, se následně ligoval do plasmidové pAMG21huOPG [22-401]-Fc fúze, která se digerovala zmíněnými dvěmi restrikčními endonukleázami. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli bakteriálního kmene 393. Prohledáváním klonů se zjišťovala jejich schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a to, zda vykazují genovou fúzi se správnou nukleotidovou

01-1718-97 Če

115 sekvencí. Úrovně proteinové exprese se stanovily ze studií ml protřepávačky. Celý buněčný lyzát a sonifikovaná peleta se analyzovaly s cílem stanovit expresi konstruktu za použití coomassiem zabarvených PAGE gelů a westernové analýzy s myší anti-OPG protilátkou. Expresní úroveň fúzního peptidu byla detekována na coomasiem zabarveném gelu a westernovém blotu. Protein se nacházel v nerozpustné (peletové) frakci. Buňky měly velká inkluzní těla.

W. Humánní OPG met[22-401] (P25A)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 humánního OPG s prolinem v poloze .25 substituovaným alaninem se pod kontrolou lux P_Rpromotoru v prokaryotickém expresním vektoru pAMG21, se konstruovala následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy # 1289-84 a 1289-85 se temperovaly za vzniku oligonukleotidového vazebníkového duplexu s Xbal a KpnI kohezními konci. Syntetický vazebníkový duplex použil optimální kodony E. coli a kódoval N-koncový methionin. Vazebník rovněž obsahoval Spěl restrikční místo, které nebylo obsaženo v původní sekvenci. Vazebníkový duplex se za použití standardních metod směrově vřadil mezi Xbal a KpnI místo v pAMG21-huOPG-22-401. Ligační ₌směs se pomocí transformace zavedla do E. coli hostitele GM221. Klony se nejprve prohledávaly z hlediska produkce rekombinantního proteinu. Z pozitivních klonů se izolovala plasmidová DNA, u které se provedlo DNA sekvencování s cílem ověřit DNA sekvenci HuOPG-Met[22-401](P25A) genu. Pro generování vazebníku Xbal - KpnI se použily následující oligonukleotidy:

01-1718-97 Če

116

Oligo #1289-84

5' -CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TGC TCC

AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TAG TCA TCA GCT GCT

GTG TGA TAA ATG-TCC GCC GGG TAC -3* (SEQ ID N0:115)

Oligo #1289-85

5'- CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC TAG TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG CAA AAG TTT CCA TAT GTT ATT CCT CCT T-3' (SEQ ID NO:116)

X. Humánní OPG met[22-401] (P26A) a (P26D)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 humánního OPG s prolinem v poloze 26 substituovaným alaninem pod kontrolou lux P_R promotoru v prokaryotickém expresním vektoru pAMG21, se konstruovala následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy # 1289-86 .a 1289-87 se temperovaly za vzniku oligonukleotidového vazebníkového duplexu s Xbal a Spěl kohezními konci. Syntetický vazebníkový duplex použil optimální kodony E. coli a kódoval N-koncový methionin. Vazebníkový duplex se za použití standardních metod směrově vřadil mezi Xbal a Spěl místo v pAMG21-huOPG[22-401] (P25A). Ligační směs se pomocí transformace zavedla do E. coli hostitele GM221. Klony se nejprve prohledávaly z hlediska produkce rekombinantního proteinu. Z pozitivních klonů se izolovala plasmidová DNA, u které se provedlo DNA sekvencování s cílem ověřit DNA sekvenci huOPG-Met[22-401] (P26A) genu. Ukázalo se, že jeden ze sekvencovaných klonů má prolin v poloze 26 substituovaný spíše kyselinou asparágovou než alaninem a tento klon byl označen jako huOPG-met [22··

I 4 ·· ·'·

01-1718-97 Če ►

··· « * · ·· ·♦

117

401](P26D). Pro generování Xbal - Spěl vazebníku se použily následující oligonukleotidy:

Oligo #1289-86

5’ - CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TCC TGC TAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AA - 3' (SEQ ID NO:117)

Oligo #1289-87

5' - CTA GTT TCT TCA TCA TAA TGA AGA TAT TTA GCA GGA AAA GTT TCC ATA TGT TAT TCC TCC TT - 3' (SEQ ID NO:118)

Y. Humánní OPG met[22-194] (P25A)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokysleiny 22 až 194 humánního OPG s prolinem v poloze 25 substituovaným alaninem pod kontrolou lux P_R promotoru v prokaryotickém expresním vektoru pAMG21, se konstruovala následujícím způsobem. Jak plasmid pAMG21-huOPG[27-194] tak pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) se digeroval KpnI a BamHI endonukleázou. 450 bp fragment se izoloval z pAMG21huOPG [27-194 ^a____6. 1 ,kbp fragment,. se., izoloval z pAMG21huOPG[22-401](P25A). Tyto fragmenty se pomocí transformace vzájemně ligovaly a zavedly do E. coli hostitele GM221. Klony se nejprve prohledávaly z hlediska produkce rekombinantního proteinu. Z pozitivních klonů se izolovala plasmidová DNA, u které se DNA sekvencováním ověřila DNA sekvence huOPG-Met [22-194] (P25A) genu.

01-1718-97 Če

«« 9· • · · 9 • <· ·· *·· 9 · • 9 9

9· 9 9

118

Příklad 9

Spojení OPG monomerů

CHO buňky, uměle připravené pro přeexprimování muOPG [22-401], se použily pro generování kondiciovaného média pro účely analýzy sekretovaného rekombinantního OPG prováděné za použití králičích polyklonálních anti-OPG protilátek. Alikvotní podíl kondiciovaného média se dvacetkrát zahustil a následně analyzoval pomocí redukční a neredukční SDS-PAGE (obr. 15). Za redukčních podmínek protein migroval jako Mr 50-55 kd polypeptid.. Toto chování by se dalo předpokládat, pokud by se zralý produkt glykosyloval v jednom nebo několika svých konvenčních N-navázaných glykosylačních místech. Překvapivé zjištění bylo učiněno v případě, kdy se vzorek analyzoval pomocí neredukující SDS-PAGE. V tomto případě protein migroval jako přibližně 100 kd polypeptid, což je dvojnásobek velikosti redukovaného proteinu. Kromě toho zde bylo malé množství Mr 50-55 kd polypeptidů. Tento migrační vzor SDS-PAGE odpovídal teorii, podle které OPG produkt tvořil dimery, které se vytvořily v důsledku oxidací volné sulfhydrylové skupiny (skupin).

Předpokládaný zralý OPG polypeptid obsahuje 23 cysteinových zbytků, ž nichž” 18, jak se předpokládá, se podílí na. tvorbě disulfidových můstků uvnitř řetězce, které obsahují čtyři domény obohacené cysteinem (obr. 12A) . Pět zbývajících C-koncových cysteinových zbytků není součástí sekundární struktury, jak lze předpokládat na základě homologie s dalšími členy TNFR rodiny. Předpokládaný zralý OPG polypeptid tedy obsahuje celkově lichý počet cysteinový zbytků a je teoreticky možné, že alespoň jeden z těchto

01-1718-97 Če ► ··· »««

119 zbytků je volný pro tvorbu intermolekulární disulfidové vazby mezi dvěma OPG monomery.

Objasněni vzorů OPG kineze a spojení monomerů napomohly studie „pulse-chase značení. CHO buňky, exprimující muOPG [22-401], se metabolicky značily 30 minut výše popsaným způsobem v médiu prostém séru a obsahujícím ³⁵S methionin a cystein. Po uplynutí této časové periody se médium odstranilo a nahradilo kompletním médiem obsahujícím neoznačený methionin a cystein v koncentracích přibližně 2 OOOkrát vyšší než byla původní koncentrace radioaktivních aminokyselin. 30 minut, 1 hodinu, 2 hodiny, 4 hodiny, 6 hodin a 12 hodin po přidání se kultury sklidily odstraněním kondiciovaného média a připravily se lyzáty kondiciovaného média a přilnavé monovrstvy. Kultivační médium a buněčné lyzáty se vyčistily výše popsaným způsobem a následně imunologicky vysrážely za použití anti-OPG protilátek. Pro promytí imunologických sraženin se uvolnily varem v neredukčním SDS-PAGE pufru a následně rozdělily na dvě poloviny. K jedné polovině se přidalo redukční činidlo, β-merkaptoethanol do konečné pětiprocentní (obj./obj.) koncentrace, zatímco druhá polovina se udržovala v neredukujících podmínkách. Obě sady imunologických sraženin se analyzovaly SDS-PAGE výše popsaným způsobem a následně se zpracovaly pro účely autoradiografie a exponovaly na film. Výsledky zachycuje obr. 16. Vzorky analyzované redukční SDS-PAGE jsou znázorněny ve spodní části obrázku. Po provedení syntézy se OPG peptid rychle zpracoval na o něco větší polypeptid, který pravděpodobně reprezentuje modifikaci N-navázané glykosylace. Přibližně po 1 až 2 hodinách se hladina OPG v buňce prudce snížila a současně se objevila v supernatantu kultury. Toto je, jak se zdá,

01-1718-97 Če

··		9	·· '99
•	9		9 9 /·
9	9 9	•	• 9 99· 9
9	9		9 · ·
9999	999

120 způsobeno vektorovým transportem OPG z buňky do média, k němuž v průběhu času došlo, což odpovídá teorii, že OPG je přirozeně sekretovaný protein. Analýza stejných , imunologických sraženin za - neredukčních podmínek odhaluje vzájemný vztah mezi tvorbou OPG dimerů a sekrecí do kondiciovaného média (obr. 1.6, horní část) . Během prvních 30 až 60 minut se OPG monomery zpracovaly v buňce přímou glykosylací, po které následovala tvorba dimerů. Postupně se objem OPG monomeru rozdělil do dvou dimerů, které následně z buňky zmizely. Přibližně 60 minut po realizování syntézy se OPG dimery objevily v kondiciovaném médiu, kde se hromadily po celou dobu trvání experimentu. Po uplynutí této časové periody se vytvořily OPG dimery, které se následně sekretovaly do kultivačního média. OPG monomery setrvávaly během experimentu v nízké koncentraci uvnitř buňky a malé množství těchto monomerů se rovněž objevilo v médiu. Nezdá se, že by k tomu docházelo v důsledku zlomu kovalentních OPG dimerů, ale spíše v důsledku produkce substechiometrického množství monomerů v buňce a jejich následné sekrece.

Zdá se, že OPG rekombinantně generovaný z transfektovaných CHO buněk má převážně formu dimerů. Za účelem stanovení, zda dimerace je přirozeným procesem probíhajícím v rámci OPG syntézy se zjišťovalo, zda se v kondiciovaném médiu buněčné linie nachází přirozeně exprimovaný OPG. Prohledáváním RNA tkáně a buněčné linie se zjistilo, že CTLL-2 buněčná linie, myší cytotoxická T lymfocytová buněčná linie (ATCC přírůstkové číslo TIB-214) exprimuje OPG mRNA. Ukázalo se, že OPG transkript odpovídá klonované a sekvencované 2,5 až 3,0 kb RNA, identifikované ·· » <· · '· • ·« · ·

01-1718-97 Ce ·« ·· « · · « • (· ··

121 v ledvině, a že kóduje sekretovanou molekulu. Westernová analýza kondiciovaného média, získaného z CTLL-2 buněk, ukázala, že většina sekretovaného OPG proteinu, pokud ne všechen, má formu dimeru (obr. 17) . Z tohoto zjištění vyplývá, že OPG dimerace a sekrece není výsledkem přeexprimování v buněčné linii, ale že dimerní forma je pravděpodobně hlavní formou produktu, který je generován expresními buňkami.

Tkáně a sérum normálních a transgenických myší se analyzovaly s cílem stanovit povahu OPG molekuly exprimované v OPG transgenické myši. Vzhledem k tomu, že se krysí OPG cDNA exprimovala pod kontrolou hepatocytového kontrolního prvku, se pro analýzu použily extrakty, připravené z parenchymu kontrolní a transgenické myši za neredukčních podmínek (obr. 18) . V extraktu, získaném z transgenických myší, ale nikoliv v extraktu z kontrolních myší, se snadno určily OPG dimery spolu se substechiometrickým množstvím monomerů. OPG dimery a monomery se zdají být identické s rekombinantním myším proteinem, exprimovaným v geneticky uměle připravených CHO buňkách. Z těchto zjištění vyplývá, že OPG dimery jsou ve skutečnosti přirozenou formou genového produktu a že jsou pravděpodobně klíčovými aktivními složkami. Vzorky séra, získané“ z kontrolních a ' transgenických myšV se rovněž analyzovaly westernovou analýzou. U kontrolních myší většina OPG proteinu migrovala jako dimer a rovněž se analyzovalo malé množství monomeru. Kromě toho bylo detekováno podstatnější množství proteinu, odvozeného od většího OPG, který migroval s relativní molekulovou hmotností, odpovídající předpokládané velikosti kovalentně navázaného trimeru. Rekombinantní OPG je tedy exprimován v

01-1718-97 Če ♦ ft ft »

»ft · ft ftft >· · I • · «

122

OPG transgenických myších převážně jako dimerový protein a tato dimerová forma může být základem pro osteopetrotický fenotyp u OPG myší. OPG rekombinantní protein může rovněž existovat ve vyšší molekulární „trimerní formě.- — i

Pro účely stanovení toho, zda hraje uvedených pět C-koncových cysteinových zbytků OPG nějakou roli při homodimerizaci, se myší OPG kodony pro cysteinové zbytky 195 (C195), C202, C277, C319 a C400 změnily výše popsaným způsobem na serin za použití sady QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA) . MuOPG gen se subklonoval mezi Not I a Xba I místa pcDNA 3.1 ( + ) vektoru (Invitrogen, San Diego, CA) . Výsledný plasmid pcDNA3.1-muOPG a mutagenní primery se ošetřily v přítomnosti deoxynukleotidů Pfu polymerázou a následně se výše popsaným způsobem amplifikovaly v termocykleru. Alikvotní podíl reakční směsi se potom tepelným šokem transfektoval do kompetentní E. coli XLl-Blue a nakonec umístil na plotny. Plasmidová DNA z transformantů se následně sekvencovala za účelem ověření mutací.

Následující primerové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 195 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C195S proteinu:

1389-19:

5' -CAC GCA AAA GTC GGG AAT AGA TGT CAC-3' (SEQ ID NO:150)

1406-38:

5' -GTG ACA TCT ATT CCC GAC TTT TGC GTG-3' (SEQ ID NO:151)

01-1718-97 Če • · · · · · ·· • · · ·♦·♦··· • · · · · · • ·«· ··* ···· ·· ··

123

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 202 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C202S proteinu:

1389-21:

5' -CAC CCT GTC GGA AGA GGC CTT CTT C-3' (SEQ ID NO:152)

1389-22:

5' -GAA GAA GGC CTC TTC CGA CAG GGT G-3' (1389-22) (SEQ ID NO:153)

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 277 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C277S proteinu:

1389-23:

5' -TGA CCT CTC GGA AAG CAG CGT GCA-3' (SEQ ID NO:154)

1389-24:

5' -TGC ACG CTG CTT TCC GAG AGG TCA-3' (SEQ ID NO:155)

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 319 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C319S proteinu:

1389-17:

5' -CCT CGA AAT CGA GCG AGC AGC TCC-3' (SEQ ID NO: 156)

1389-18:

5' -CGA TTT CGA GGT CTT TCT CGT TCT C-3' (SEQ ID NO:157)

01-1718-97 Če · · ·· ·* ·· • · · · · · · · · ·· 9 · 9 9 9 9 9 • 9 9 · 9 9 999 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9999 999 999 9999 99 ·♦

124

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 400 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C400S proteinu:

1406-72: /

5' -CCG TGA AAA TAA GCT CGT TAT AAC TAG GAA TGG-3' (SEQ ID NO:158)

1406-75:

5' -CCA TTC CTA GTT ATA ACG AGC TTA TTT TCA CGG-3' (SEQ ID NO:159)

Každý výsledný muOPG [22-401] plasmid obsahující příslušnou mutaci se následně transfekoval do humánních 293 buněk, a mutantní OPG-Fc fúzní protein se purifikoval z kondiciovaného média výše popsaným způsobem. Biologická aktivita každého proteinu se stanovila pomocí testu in vitro tvorby osteoklastů, který bude popsán v příkladu

11. Kondiciované médium z každého transfektantu se analyzovalo neredukční SDS-PAGE a westernovým přenosem anti-OPG protilátkami.

Mutace libovolného z pěti C-koncových cysteinových zbytků způsobuje produkci převážně (>90%) monomerních 55 kd OPG molekul. Z těchto výsledků vyplývá, že koncové cysteinové zbytky zastávají určitou roli při OPG homodimerizaci.

C-koncové OPG deleční mutace se konstruovaly do mapy úseku (úseků) OPG C-koncové domény, které jsou důležité pro OPG homodimeraci. Ke konstrukci těchto OPG mutantů se použila PCR amplifikace využívající primérů, které zavedly nezralé terminační signály pro ukončení translace do

01-1718-97 Če • · · · · · «··« ««· ··· ···< ·· ··

125

C-koncového úseku myšího OPG. Na iniciačním kodonu MuOPG (obsahujícím HindlII restrikční místo) se vyznačil 5' oligonukleotid a 3' oligonukleotid (obsahující terminační kodon a Xhol místo)- za účelem úpravy C-koncového úseku muOPG zakončení buď na threoninovém zbytku 200 (CT200), prolinu 212 (CT212), kyselině glutamové 293 (CT-293) nebo na šeřinu 355 (CT-355).

Následující primery se použily pro konstrukt muOPG [22200] :

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NO:160)

1391-91:

5' -CCT CTC TCG AGT CAG GTG ACA TCT ATT CCA CAC TTT TGC GTG GC-3' (1391-91) (SEQ ID N0:161)

The following primers were ušed to construct muOPG [22-212] :

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NO:162)

1391-90:

5' -CCT CTC TCG AGT CAA GGA ACA GCA AAC CTG AAG AAG GC -3' (SEQ ID NO:163)

Následující primery se použily pro konstrukt muOPG [22-293] :

01-1718-97 Če • · · · · · ·· • · · · · · ··· · · • · · · «· · ···· ··· ··· ···· ·· ··

126

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NO:164)

1391-89:

t

5'- CCT CTC TCG AGT CAC TCT GTG GTG AGG TTC GAG TGG·

CC-3' (SEQ ID NO:165)

The following primers were ušed to construct muOPG [22-355] :

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NO:166)

1391-88:

5' CCT CTC TCG AGT CAG GAT GTT TTC AAG TGC TTG AGG GC-3' (SEQ ID NO:167)

Každý výsledný muOPG-CT plasmid obsahující příslušnou úpravu se následně transfektoval do humánních 293 buněk mutantního OPG-Fc fúzního proteinu, purifikovaného z výše popsaného kondiciovaného média. Biologická aktivita každého proteinu se zjišťovala in vitro pomocí testu tvorby osteoklastů, který bude popsán v příkladu 11. Kondiciovaná média se rovněž analyzovala pomocí neredukční SDS-PAGE a westernového přenosu pomocí anti-OPG protilátek.

Úprava C-koncového úseku OPG ovlivňuje schopnost OPG tvořit homodimery. CT 355 je převážně monomerní, ačkoliv rovněž dochází k tvorbě určitého množství monomerů. CT 293 tvoří, jak se zdá, stejné molární množství monomeru a dimeru a rovněž tvoří agregáty s vysokou molekulovou hmotností. Nicméně CT 212 a CT 200 jsou monomerní.

• ·

01-1718-97 Če

127

Příklad 10

Purifikace OPG

A. Purifikace savčích OPG-Fc fúzních proteinů ¹ ·--'·

Pět litrů kondiciovaného média z 293 buněk exprimujících OPG-Fc fúzní protein se připravilo následujícím způsobem. Zmrazený vzorek buněk se nechal roztát v 10 ml 293S média (DMEM-vysoká glukóza, lx L-glutamin, 10% tepelně inaktivované fetální bovinní sérum (FBS) a 100 gg/ml hygromycinu) a následující den se tomuto vzorku poskytlo čerstvé médium. Po třech dnech se buňky rozdělily při naředění 1:10 a 1:20 do dvou T175 baněk. Provedla se dvě další 1:10 dělení a rozdělila se do 200 baněk T175. Buňky se v tomto okamžiku, t j. pět dní po roztátí buněk, nechaly růst až do okamžiku, kdy dosáhly téměř souvislé vrstvy (přibližně tři dny), odsáním se zbavily se séra, a po promytí 25 ml PBS na baňku se do každé baňky přidalo 25 ml SF média (DMEM-vysoká glukóza, lx L-glutamin). Buňky se udržovaly tři dny na 5% CO2, potom se sklidily, odstředily a přefiltrovaly přes 0,45m filtry na bázi nitrátu celulózy (Corning).

OPG-Fc fúzní proteiny se purifikovaly za použití sloupce Protein G Sephsarose (Pharmacia) uvedeného do rovnovážného stavu v PBS. Velikost sloupce se lišila v závislosti na objemu výchozího média. Kondiciované médium, připravené výše popsaným způsobem, se zavedlo do sloupce, který se promyl PBS, a k eluování čistého proteinu se použil lOOmM glycin pH 2,7. Frakce se sebraly do zkumavek obsahujících 1M Tris pH 9,2 s cílem co nej rychleji tyto frakce neutralizovat. Frakce obsahující protein se sloučily, zahustily buď v Amicon Centricon 10 nebo

01-1718-97 Če

• ·	•	•	• · ··		• ·	•
•	•	•	• ·	•	• ·
•	• ·	•	• · · ·	•		♦
♦	•	•	•	•	•	•
• O · ·	• · ·				• ·

128

Centriprep 10 a diafiltrovaly do PBS. Čistý protein se uskladnil při -80°C.

Tímto postupem se purifikovaly myší [22-401]-Fc, myší [22-180]-Fc, myší [22-194]-Fc, humánní [22-401]-Fc a humánní [22-201]Fc a rovněž myší [22-185]-Fc.

B. Příprava anti-OPG protilátek

Třem novozélandským bílým králíkům (počáteční váha 2 268 g až 3 629 g) se subkutánně injektoval muOPG[22-401]Fc fúzní protein. Každý králík se imunizoval první den 50 μg antigenu emulgovaného ve stejném objemu Freundsova kompletního adjuvansu. Další posilovači dávky se aplikovaly stejným způsobem 14. a 28. den, přičemž kompletní adjuvans byl v případě těchto posilujících dávek nahrazen Freunsdovým nekompletním adjuvansem. Titry protilátky se monitorovaly pomocí EIA. Po aplikaci druhé posilující dávky poskytla antiséra titry s vysokou hladinou protilátky a každému zvířeti bylo odebráno 25 ml krve. Sérum se nejprve vedlo přes afinitní sloupec, ve kterém byl imobilizován OPG-Fc. Anti-OPG protilátky se eluovaly pufrem, Pierce Gentle Elution Buffer, obsahujícím 1% ledovou kyselinu octovou. Eluovaný protein se následně dialyzoval do PBS a vedl přes Fc kolonu za účelem odstranění protilátek specifických pro Fc část OPG fúzního proteinu. Běh přes frakce obsahující anti-OPG specifické protilátky se dialyzoval do PBS.

• · • ·

01-1718-97 Če • Φ « 3 · · • · 4 · · · · · · · • φ φ ····· • φ φ ······· φ φ · φ φφφ φφφφ φφφ φ · φ φ φ φ φ · · · ·

129

C. Purifikace myšího OPG[22-401]

Chromatografická afinita protilátek

Afinitní purifikované anti-OPG protilátky se diafiltrovaly do vazebného pufru (O,1M uhličitan sodný, pH 8,3, 0,5M NaCl) a mísily dvě hodiny při pokojové teplotě s CNBr-aktivovanými sepharózovými kuličkami (Pharmacia). Pryskyřice se před dvouhodinovou blokací neobsazených míst 1M ethanolaminem (pH 8,0), při pokojové teplotě, promyla větším množstvím vazebného pufru. Pryskyřice se následně promyla roztokem s nízkým pH (O,1M octanu sodného pH 4,0, 0,5M NaCl) a následně promývacím roztokem s vysokou hodnotou pH (O,1M Tris-HCl pH 8,0, 0,5M NaCl). Poslední průplachy se třikrát zopakovaly. Pryskyřice se nakonec, před tím než se naplnila do kolony, uvedla do rovnovážného stavu pomocí PBS. Slepá eluce se provedla za použití 0,lM glycin-HCl, pH 2,5, a kolona se následně opět uvedla do rovnovážného stavu pomocí PBS.

Do sloupce se následně při nízké zaváděcí rychlosti aplikovalo kondenzované kondiciované médium z CHO buněk, exprimujících muOPG[22-401]. Kolona se promývala PBS, dokud se měřená UV absorbance při 280 nm nevrátila na výchozí úroveň. Protein se z kolony eluoval nejprve 0,lM glycinemHČ1 (pH 2,5), potom se uvedl do rovnovážného stavu pomocí PBS a eluoval druhým pufrem (0,lM CAPS, pH 10,5), 1M NaCl). Uvedené dva eluční odběry se samostatně diafiltrovaly do PBS a před zmrazením na -20°C sterilně filtrovaly.

• · • ·

01-1718-97 Če ···· • · · · · · ··· ······· 9 9 9 9

130

Konvenční chromatografie

Kondiciované médium CHO buněk se 23krát zahustilo ve spirálově vinuté patroně Amicon (S10Y10) a diafiltrovalo do 20mM Tris pH 8,0. Diafiltrované médium se následně aplikovalo na Q-sepharosový HP (Pharmacia) sloupec, který se uvedl do rovnovážného stavu 20mM Tris pH 8,0. Sloupec se následně promýval, dokud absorbance při 280 nm nedosáhla opět základní linie. Protein se eluoval dvaceti objemy sloupce eiuční soustavy tvořené gradientem 0 až 300mM NaCl v Tris pH 8,0. OPG protein se detekoval pomocí westernového přenosu frakcí eluovaných ze sloupce.

Frakce obsahující OPG se sloučily a doplnily do konečné koncentrace 300mM NaCl, 0,2mM DTT. NiNTA superosový (Qiagen) sloupec se uvedl do rovnovážného stavu 20mM Tris pH 8,0, 300mM NaCl, 0,2mM DTT a následně se do sloupce zavedly sloučené frakce. Sloupec se promýval vyrovnávacím pufrem dokud se opět nedosáhlo základní absorbance. Proteiny se ze sloupce eluovaly 0 až 30mM imidazolovým elučním gradientem ve vyrovnávacím pufru. Zbývající proteiny se ze sloupce vymyly ÍM imidazolem. Pro detekci frakcí obsahujících OPG se opět použil westernový přenos.

Sloučené frakce z NiNTA sloupce se dialyzovaly do lOmm fosforečnanu draselného pH 7,0 a 0,2mM DTT. Dialyzovaná frakce se následně zavedla do keramického hydroxyapatitového sloupce (Bio-Rad), který se následně uvedl do rovnovážného stavu pomocí lOmM fosfátového pufru. Po promytí sloupce se protein eluoval objemem 10 až lOOmM elučním gradientem fosforečnanu draselného, který představoval dvacetinásobek objemu sloupce. Potom

01-1718-97 Ce

131 následovala eluce stejným množstvím elučního 100 až 400 mM gradientu fosforečnanu.

OPG se detekoval zabarvením SDS-polyakrylamidových gelů modří coomassie a westernovým přenosem. Frakce se po sloučení diafiltrovaly do PBS a zmrazily na -80°C. Purifikovaný protein měl formu monomeru a v této formě zůstal i po diafiltraci do PBS. Tento monomer je stabilní, pokud se skladuje ve zmrazeném stavu nebo při pH 5 při 4°C. Nicméně pokud se skladuje při 4°C v PBS, po jednom týdnu, jak se zdá, vytvoří dimery, trimery a tetramery.

D. Purifikace humánního OPG met[22-401] z E. coli

Bakteriální buněčná pasta se za použití nízkostřižného homogenizeru při 5°C suspendovala do 10 mM EDTA, do koncentrace 15% (hm./obj.). Buňky se následně rozrušily dvojitou homogenizací při 5°C a 103,35 MPa. Výsledný homogenizovaný vzorek se odstřeďoval jednu hodinu při 5°C a při 5 000 x g. Odstředěné pelety se vymyly nízkostřižnou homogenizací do vody při původním homogenizačním objemu a následně odstřeďovaly jako v předchozím případě. Promyté pelety se následně solubilizovaly 30 minut při pokojové teplotě do 15% (hm./obj.) roztokem (konečná koncentrace) 6 M guanidinn HC1, 10 mM dithiothreitolu, 10 mM TrisHCl, pH 8,5. Tento roztok se 30krát naředil 2 M močovinou, obsahující 50 mM CAPS, pH 10,5, 1 mM redukovaného glutathionu a následně 72 hodin míchal při 5°C. OPG se purifikoval z tohoto roztoku, při 25°C, nejprve nastavením pH hodnoty pomocí kyseliny octové a následně chromatografií přes sloupec SP-HP Sepharosy, který se uvedl do rovnovážného stavu pomocí 25 mM octanu sodného, pH 4,5.

01-1718-97 Če » · · » · <

• · » · • · • · 4

132

Sloupcová eluce se prováděla dvaceti objemy sloupce 50 mM až 550 mM lineárním gradientem chloridu sodného ve stejném pufru, při rychlosti proudění 0,1 objemu sloupce/minutu. Horní frakce, obsahující pouze požadovanou OPG formu, se odebraly a skladovaly při 5°C nebo se pomocí pufru převedly do fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku, zahustily ultrafiltrací a následně skladovaly při 5°C. Tento materiál se analyzoval HPLC s reverzní fází, SDS-PAGE, limulus amebocytlyzátovým testem pro ověření přítomnosti endotoxinu a sekvencování N-konce. Kromě toho lze pro určení sbalené povahy proteinu použít i další techniky, například hmotovou spektrometrii, test pH/teplotní stability, fluorescenční test, cirkulární dichroismus, diferenciální rastrovací kalorimetrii a testy na bázi profilace proteázy.

Příklad 11

Biologická účinnost rekombinantního OPG

Z histologických a histomorfometrických výsledků vyplývá, že hepatické přeexprimování OPG v transgenických myších značně snížilo počet osteoklastů, což způsobilo podstatné zvýšení kostní tkáně (viz například 4). Pro lepší pochopení potenciálního mechanizmu (mechanizmů) tohoto in vivo účinku se analyzovaly různé formy rekombinantního OPG na in vitro kultivačním modelu tvorby osteoklastů (test tvorby osteoklastů). Tento kultivační systém, který původně navrhl Udagawa (Udagawa a kol. Endocrinology 125, 1805-1813 (1989), Proč. Nati. Acad, Sci. USA 87, 7260-7264 (1990)), využívá kombinaci buněk kostní dřeně a buněk z buněčných linií podpůrné vazivové tkáně kostní dřeně. Popis modifikace tohoto kultivačního systému, použitého v rámci • ·

01-1718-97 Če

133 těchto studií, byl již veřejně publikován (Lacey a kol. Endocrinology 136, 2367-2376 (1995)). Při provádění tohoto způsobu se buňky kostní dřeně, které se získaly výplachem ze stehenní a holenní kosti myší, kultivovaly přes noc v kultivačním médiu (alfa MEM s 10% tepelně inaktivdvaným fetálním bovinním sérem) obohaceném 500 U/ml CSF-1 (kolonii stimulujícím faktorem 1, rovněž označovaným jako M-CSF)> tj. hematopoietickým růstovým faktorem specifickým pro buňky monocytově-makrofágové rodinné linie. Po ukončení inkubace se odebraly buňky, které nepřilnuly, a podrobily se gradienční purifikaci a následně opět kultivovaly spolu s buňkami z buněčné linie ST2 kostní dřeně (1 x 10^eneadherentních buněk : 1 x 10⁵ ST2 buněk/ml média). Toto médium je obohaceno dexamethasonem (100 nM) a biologicky aktivním metabolitem vitaminu D3, známým jako 1,25 dihydroxyvitamin D3 (1,25 (OH)2 D3, 10 nM) . Pro zlepšení osteoklastového zobrazení se do některých kultur přidal prostaglandin E2 (250 nM). Ko-kultivační perioda se zpravidla pohybuje v rozmezí od 8 do 10 dní a každé 3 až 4 dny se přidávalo čerstvé médium se všemi dodatkovými přísadami. V různých intervalech se kultury použily pro ověření přítomnosti vinan rezistentní kyselinové fosfatázy (TRAP) buď za použití histochemického barviva (Sigma Kit # 387A, Sigma, St. Louis, MO) nebo pomocí testu TRAP roztoku. TRAP histochemická metoda umožňuje fenotypickou identifikaci osteokiastů, což jsou vícejaderné (> 3 jádra) buňky, které jsou rovněž TRAP+. Podstatou testu roztoku je štěpení kultur, obsahujících osteoklasty, v citrátovém pufru (100 mM, pH 5,0), který obsahuje 0,1% Triton X-100. Aktivita vinanově rezistentní kyselinové fosfatázy se následně stanovila na základě konverze p-nitrofenylfosfátu (20 nM) na p-nitrofenol v přítomnosti 80 mM vinanu sodného,

01-1718-97 Če t

• · * • · e ¢. • · • · · · · · · • ·· ·· ··» • · · · · 9 9 » 9 9 · ·

II 99

134 který se objevil během tří- až pětiminutové inkubace, při pokojové teplotě. Reakce se ukončila přidáním NaOH do konečné koncentrace 0,5 M. Změřila se optická hustota při 405 nm a výsledky se vynesly do grafu. ......,......

Předcházející studie (Udagawa a kol., tamtéž) prováděné za použití testu tvorby osteoklastů ukázaly, že buňky exprimuj i receptory pro ¹²⁵I-kalcitonin (autoradiografie) a vytváří důlky v povrchu kostí, a pokud se zkombinují s TRAP pozitivitou potvrzují, že vícejaderné buňky mají osteoklastový fenotyp. Dalším důkazem podpory osteoklastového fenotypu vícejaderných buněk, který se získal při in vitro testu tvorby osteoklastů je to, že buňky exprimuj i αν a β3 integriny imunocytochemií a kalcitoninový receptor a TRAP mRNA hybridizací in šitu (ISH).

HuOPG [22-401]-Fc fúze se purifikovala z CHO buněk kondiciovaného média a následně použila při testu tvorby osteoklastů. Při 100 ng/ml huOPG [22-401]-Fc byla tvorba osteoklastů inhibována v podstatě stoprocentně (obr. 19A) . Hladiny TRAP, měřené v lyžovaných kulturách v jamkách mikrotitrační plotny, byly rovněž inhibovány v přítomnosti OPG s ID₅₀ přibližně 3 ng/ml (o.br. 20) . Zdálo se, že hladina TRAP aktivity v lyzátech koreluje s relativním počtem osteoklastů, zjištěných pomocí TRAP cytochemie (porovnání obr. 19A až 19G a 20) . Purifikované humánní IgGl a TNFbp se rovněž ananlyzovaly na tomto modelu a zjistilo se, že nemají inhibiční ani stimulační účinky, z čehož vyplývá, že inhibiční účinky huOPG [22-401]-Fc jsou účinky způsobené OPG částí fúzního proteinu. Stejným způsobem se analyzovaly i další formy humánních a myších molekul a získané kumulativní výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.

01-1718-97 Če

135

Tabulka 1

Účinky různých OPG forem na in vitro tvorbu osteoklastů

OPG konstrukt Relativní bioaktivita in vitro

muOPG	[22-401]-Fc	+++
muOPG	[22-194]-Fc	+++
muOPG	[22-185]-Fc	++
muOPG	[22—180]-Fc	-
muOPG	[22-401]	+++
muOPG	[22-401] C195	+++
muOPG	[22-401] C202	+
muOPG	[22-401] C277	-
muOPG	[22-401] C319	+
muOPG	[22-401] C400	+
muOPG	[22-185]	-
muOPG	[22-194]	++
muOPG	[22-200]	++
muOPG	[22-212]	-
muOPG	[22-293]	+++
muOPG	[22-355]	+++
huOPG	[22-401]-Fc	+++
huOPG	[22-201]-Fc	+++
huOPG	[22-4011-Fc P26A	+++
- huOPG	[22-401]-Fc Y28F	+++’
huOPG	[22-401]	+++
huOPG	[27-401]-Fc	++
huOPG	[29-401]-Fc	++
huOPG	[32-401]-Fc	+/-

+++,	ED₅₀ = 0.4-2 ng/ml
++,	ED_S0 = 2-10 ng/ml
+/	ED_S0 = 10-100 ng/ml
	ED_5o > 100 ng/ml

01-1718-97 Če • ·

136

Z výše uvedených souhrnných dat vyplývá, že myší a humánní OPG aminokyselinové sekvence 22-401 jsou plně aktivní in vitro jak ve formě nakondenzované na Fc doménu, tak v nenakondenzované formě. Inhibuji dávkově dependentním způsobem a při dávkách 2 až 10 ng/ml vykazují poloviční až maximální aktivitu. Úprava myšího C-konce na threoninovém zbytku 180 inaktivuje molekulu, zatímco úpravy na cysteinu 185 a dále zachovávají plnou aktivitu. Cysteinový zbytek v poloze 185 je předurčen pro tvorbu SS3 vazby v doménovém 4. úseku OPG. Odstranění tohoto zbytku v dalších TNFRpříbuzných proteinech již dříve ukázalo inhibici biologické aktivity (Yan a kol., J. Biol. Chem. 226, 12099-12104 (1994)). Naše zjištění, že muOPG[22-180]-Fc je inaktivní zatímco muOPG[22-185]-Fc je aktivní, odpovídá dřívějším zjištěním. Z toho vyplývá, že aminokyselinové zbytky 22-185 definují oblast OPG aktivity.

Výsledky testů tvorby osteoklastů rovněž ukazují, že stejně jako transgenicky exprimovaný OPG rovněž rekombinantní OPG protein potlačuje tvorbu osteoklastů. Experimenty analyzující objevení TRAP+ buněk, β3+ buněk, F480+ buněk v kulturách kontinuálně vystavených OPG ukázaly, že OPG blokuje objevení TRAP+ a β3+ buněk ale nikoliv F480+ buněk. Na druhou stranu, TRAP+ a β3+ buňky se začaly objevovat čtyři dny potom, co se kultura objevila v kontrolních kulturách. V kulturách ošetřených OPG lze nalézt pouze F480+ buňky a zdá se, že jsou přítomny v kvantitativně stejném počtu jako v kontrolních kulturách. Zdá se tedy, že mechanizmus OPG, působící in vitro, se podílí na blokaci diferenciace osteoklastů v kroku zahrnujícím vznik mohocyto-makrofágů, ale před vznikem

01-1718-97 Če

137 buněk exprimujících buď TRAP nebo β3 integriny. Tato zjištění souhrnně ukazují na to, že OPG nenarušuje obecný růst a diferenciaci monocyto-makrofágových prekurzorů kostní dřeně, ais spíše vede k závěru, že OPG -specificky blokuje selektivní diferenciaci osteoklastů z monocytomakrofágových prekurzorů.

K přesnější časové specifikaci okamžiku, ve kterém se OPG v průběhu diferenciace osteoklastů projevuje jako inhibitor, se použila variace in vitro kultivační metody. Tato variace, kterou popsal Lacey a kol., viz níže, využívá jako osteoklastové prekurzory makrofágy kostní dřeně. Osteoklastové prekurzory se získají odebráním neadherentních buněk kostní dřeně po celonoční inkubaci v CSF-l/M-CSF, a kultivací těchto buněk po dobu dalších čtyř dní 1 000 až 2 000 U/ml CSF-1. Po čtyřech dnech kultivace, tj . růstové fáze, se odstranily neadherentní buňky. Adherentní buňky, kterými jsou makrofágy kostní dřeně, mohou být následně vystaveny maximálně na dva dny různým ošetřením v přítomnosti 1 000 až 2 000 U/ml CSF-1. Tato dvoudenní perioda se označuje jako střední diferenciační perioda. Potom se buněčné vrstvy opět nechají růst a na alespoň osm dní se následně přidají ST-2 buňky (1 x 10⁵buněk/ml), dexamethason (100 nM) a 1,25 (OH)2 D3 (10 nM) . Tato časová perioda se označuje jako konečná diferenciační perioda. Analytická činidla se mohou podávat rovněž během této konečné diferenciační periody. Během konečné diferenciační periody se rovněž získají fenotypové markéry osteoklastové diferenciace (Lacey a kol., tamtéž).

Vliv huOPG [22-401]-Fc (100 ng/ml) na tvorbu osteoklastů se na tomto modelu analyzoval přidáním tohoto fúzního peptidu buď během střední nebo konečné

01-1718-97 Če

138 diferenciační periody nebo alternativně v průběhu obou těchto period. Provedly se oba testy, jak TRAP cytochemický tak TRAP roztokový test. Výsledky TRAP roztokového testu jsou znázorněny na obr. 21. HuOPG [22—401]-Fc · inhibuje vznik TRAP aktivity, pokud se přidají jak do střední tak do konečné diferenciační fáze nebo do obou těchto fází. Pokud se přidal do střední fáze a následně z kultur odstranil vypláchnutím, potom huOPG [22-401]-Fc vznik TRAP aktivity v lyzátech kultury neblokoval. Cytochemické výsledky byly paralelou údajů získaných roztokovým testem. Z výsledků všech těchto testů vyplývá, že pro uplatnění všech supresivních účinků huOPG [22-401]-Fc na tvorbu osteoklastů je důležitá jeho přítomnost během konečné diferenciační periody.

B. In vivo ILl-α a ILl-β imunologické experimenty

IL1 zvyšuje kostní resorpci, jak systemicky tak místně, pokud se injektuje subkutánně přes myší kalvu (Boyce a kol., Endocrinology 125, 1142-1150 (1989)).

Systemické účinky lze odvodit ze stupně hyperkalcemie a lokální účinky lze stanovit histologicky, zjišťováním relativní hodnoty osteoklasty mediované odpovědi. Cílem těchto experimentů, bylo určit . zda může rekombinantní muOPG [22-401]-Fc modifikovat lokální a/nebo systemické účinky IL1, pokud se injektuje subkutánně, přes oblast kalvy, jako v případě TLI.

01-1718-97 Ce

139

ILl-β experiment

Samečci myší (ICR Swiss white), staří čtyři týdny, se pro účely ’ ošetření rozdělili do následujících skupin -(pět myší na skupinu). Kontrolní skupina: IL1 ošetřená zvířata (myším se aplikovala jedna^- injekce 2,5 gg ILl-β denně); skupina zvířat ošetřených nízkou dávkou muOPG [22-401]-Fc (myším se aplikovaly tři injekce 1 gg muOPG [22-401]-Fc denně); skupina myší ošetřená nízkou dávkou muOPG [22-401]Fc a ILl-β; skupina zvířat ošetřených vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc (myším se aplikovaly tři injekce 10 gg muOPG [22-401]-Fc denně); a skupina myší ošetřená vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ILl-β. Všechny myši přijaly stejný celkový počet injekcí buď aktivního faktoru nebo vehikula (0,1% albumin bovinního séra ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku). Zvířata ze všech skupin se následující den po poslední injekci utratila. Hmotnost a hladina ionizovaného vápníku v krvi se stanovila před aplikací první injekce, čtyři hodiny po aplikaci druhé injekce a 24 hodin po třetí IL1 injekci, a poslední měření se provedlo bezprostředně před utracením zvířat. Po utracení zvířat se zvířatům odebrala kalva, která se dále zpracovala pro účely parafinového dělení.

ILl-α experiment

Samečci myší (ICR Swiss white), staří čtyři týdny, se pro účely ošetření rozdělili do následujících skupin (pět myší na skupinu). Kontrolní skupina: ILl-alfa ošetřená zvířata (myším se aplikovala jedna injekce 5 gg ILl-a

01-1718-97 Če

140 denně); skupina zvířat ošetřených nízkou dávkou muOPG [22— 401]-Fc (myším se aplikovala jedna injekce 10 gg muOPG [22401]-Fc denně); skupina myší ošetřená nízkou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ILl-d (dávkování viz výše); skupina zvířat ošetřených vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc (myším se aplikovaly tři injekce 10 gg muOPG [22-401]-Fc denně); a skupina myší ošetřená vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ILl-α. Všechny myši přijaly stejný celkový počet injekcí buď aktivního faktoru nebo vehikula. Zvířata ze všech skupin se následující den po poslední injekci utratila. Hladina ionizovaného vápníku v krvi se stanovila před aplikací první injekce, čtyři hodiny po aplikaci druhé injekce a 24 hodin po třetí IL1 injekci a poslední měření se provedlo bezprostředně před utracením zvířat. Hmotnost zvířat se stanovila před aplikací první injekce, čtyři hodiny po aplikaci druhé injekce a 24 hodin po třetí IL1 injekci, a poslední měření se provedlo bezprostředně před utracením zvířat. Po utracení zvířat se zvířatům odebrala kalva, která se dále zpracovala pro účely parafinového dělení.

Histologické metody

......... Kalvariální kostní vzorky se fixovaly formalinem zinku, dekalcifikovaly v kyselině mravenčí, dehydratovaly ethanolem a tvářely v parafínu. Řezy (5 μιη silné) se vedly kalvou vedle lambdového švu a zabarvily buď hematoxylinem a eosinem nebo se zreagovaly pro účely vinan rezistentní kyselinofosfatázové aktivity (Sigma Kit# 387A) a zabarvily protilátkou hematoxylinem. Kostní resorpce se hodnotila u ILl-α ošetřených myší histomorfometrickými metodami za

01-1718-97

141 použití osteohodnoty (Osteimetrics, Atlanta, GA) sledováním histologických znaků na desce digitizátoru za použití mikroskopu, k jehož okulárové části je pomocí příslušného nástavce přimontována kamera. V hlavních dřeňových prostorech kalvariální kosti se určil počet osteoklastů, povrchy potažené osteoklasty a erodované povrchy. Injektované a neinjektované strany kalvy se měřily samostatně.

Výsledky

ILl-α a ILl-β produkoval při použitých dávkách hyperkalcemii, zejména druhý den, pravděpodobně v důsledku systemické indukce zvýšené kostní resorpce. Hyperkalcemická odezva byla u ILl-beta ošetřených myší blokována muOPG [22401]-Fc a u ILl-alfa ošetřených myší byla značně zmírněna. Tento účinek se projevil nejzřetelněji druhý den (obrázek 22A až 22B).

Histologická analýza kalvy myší ošetřených ILl-α a ILl-β ukazuje, že ošetření samotným IL1 produkuje podstatné zvýšení indikace kostní resorpce zahrnující: počet osteoklastů, osteoklasty vystlaný povrch a erodovaný povrch (povrchy, které jsou vroubkované v důsledku působení osteoklastů (obr. 23B, tabulka 2). V odezvě na ILl-α nebo ILl-β bylo zvýšení kostní resorbce na injektované a neinjektované straně kalvy v podstatě stejné. Muopg [22— 401]-Fc injekce redukují kostní resorpci jak u myší ošetřených ILl-α a ILl-β tak u myší přijímajících samotné vehikulum, nicméně tuto redukci bylo možné pozorovat pouze na stranách kalvy injektovaných muopg [22-401]-Fc.

01-1718-97 ···· ·

142

Nejpravděpodobnějším vysvětlením pro tato pozorování je to, že muOPG [22-401]-Fc inhiboval kostní resorpci. Tento závěr se opírá o zjištěnou redukci celkového počtu osteoklastů a procento kostního povrchu, na němž může probíhat kostní resorpce v oblasti kalvy sousedící s muOPG [22-401]-Fc injekčními místy. Zdá se, že působení muOPG [22-401]-Fc je spíše lokální, jak ukázala histologie, ale ze skutečnosti, že muOPG [22-401]-Fc rovněž tlumí IL1indukovanou hyperkalcemii, vyplývá, že muOPG [22-401]-Fc má mnohem mírnější vliv na systemické pojetí kostní resorpce.

·· »·

Ρ * · « > ♦ ·· η

ρ—1

Ή >ra >1 '>ι β

(Ο >

Ο +J

Φ

-ΓΊ

Ρ

-Η

I ι-Ί

Η

Ρ φ

υ ίΧ β

ο

Μ φ

ι-ι

Ή β

-Ρ

Φ ο

'Φ β

β >Φ s

ο ρ

a φ

Λ

Ο β|

Ο >

Ή ι—I >

01-1718-97

CM (0 44 ρ—I β Λ Φ Η

# Rozdíl proti neinjektóvané straně p < 0,05 (t test dvojic) «· <1

01-1718-97 Če

99 ·	•	99 ··
• ·	9	'9 · ·
• · ·	9	« · ··♦ ·
• ·	9	• 9 e
···· ··»

144

C. Systemické účinky muOPG [22-401]-Fc u rostoucích myší

Tří- až čtyřtýdenní samečci myši BDF1 s hmotností 9,2 až 15,7 g se rozdělili do skupin po deseti myších. Potom se myši injektovaly subkutánně fyziologickým roztokem· nebo muOPG [22-401]-Fc 2,5mg/kg bíd po dobu čtrnácti dní (5 mg/kg/den). Myši se radiografovaly před ošetřením a sedmý a čtrnáctý den po ošetření. 24 hodin po poslední injekci se myši utratily. Odňala se jim pravá stehenní kost, fixovala ve formalinu zinku, dekalciovala v kyselině mravenčí a zapouzdřila v parafínu. Řezy se vedly střední oblastí distální femorální metafýzy a střední částí stehenní kosti. Hustota kosti se určila histomorfometricky v šesti sousedících oblastech, počínaje metafyzálním hraničním plátem růstové destičky přes primární a sekundární spongiózu až po femorální diafýzu (střední část kosti). Všechny oblasti měly rozměr 0,5 x 0,5 mm².

Radiografické změny

Po sedmidenním ošetřování se ve spongióze spojené s růstovými destičkami myší ošetřených OPG objevila zóna se zvýšenou hustotou kosti, v porovnání s kostní hustotou, která byla pozorována v této oblasti u kontrolních myši.. Účinky se projevily zejména v distální femorální a proximální tibiální metafázi (obr. 24A až 24B). Nicméně pásy zvýšené hustoty se rovněž objevily ve vertebrálních tělech, na iliakální hraně a distálním tibiu. Po čtrnácti dnech se oblasti neprůhlednosti rozšířily dále do střední části femorální a tibiální kosti, avšak pokud jde o intenzitu radio-neprůhlednosti, ta se snížila. Po ukončení

01-1718-97 Če *··· · * · · ·· ♦ · ···· ·

145 experimentu nebyly navíc zjištěny žádné rozdíly v délce středních částí femorálních a tibiálních kostí nebo změny v délce těchto kostí, ke kterým by došlo v průběhu experimentu, z čehož vyplývá, že OPG neovlivňuje růst kostí. .

Histologické změny

Distální femorální metafýza vykazuje zvýšenou hustotu kosti v oblastech 1,1 až 2,65 mm vzdálených .od růstové destičky (obr. 25 a 26A až 26B). To je oblast v těle myší, ze které je kost rychle odstraňována osteoklastymediovanou kostní resorpci. U těchto rychle rostoucích mladých myší zvýšení hustoty kosti v této oblasti, pozorované při OPG ošetření, odpovídá inhibici kostní resorpce.

D. Účinky osteoprotegerinu na ztrátu kostní hmoty indukovanou ovariektomií u krys

Dvanáctitýdenní samičky krysy Fisher se podrobily ovariektomií (OVX) nebo stejnému operačnímu zákroku bez vyjmutí vaječníků a provedla se u nich dvě měření absorpční fotometrie rentgenového záření (DEXA), jejichž úkolem bylo určit hustotu kostní hmoty v distální femorální metafýze. Po třídenní rekonvalescenci se zvířatům denně aplikovaly po dobu čtrnácti dní injekce podle následujících schémat: deset stínově operovaných zvířat dostalo vehikulum (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok); deseti OVX zvířatům se podalo vehikulum (fosfátem pufrované vehikulum); šesti zvířatům se podal OPG-Fc 5 mg/kg SC;

··

01-1718-97 Če • · · ··

146 šesti OVX zvířatům se podal pamidronát (PAM) 5 mg/kg SC; šesti OVX zvířatům se podal estrogen (ESTR) 40 μς/kg SC. Po sedmi až čtrnáctidenním ošetřování zvířat se změřila pomocí DEXA hustota kostní⁷ hmoty. Dva dny po poslední injekci se* zvířata usmrtila a odebrala se jim pravá tibiální a femurální kost pro účely histologického hodnocení.

DEXA měření hustoty kostní hmoty ukázala na tendenci řídnutí kostní hmoty v důsledku ovariektomie, které bylo blokováno OPG-Fc. Tyto vlivy jsou v podstatě shodné s vlivy známých antiresorpčních činidel, estrogenu a pamidronátu (obr. 27). Histomorfometrická analýza potvrdila pozorování, že při OPG-Fc léčení byla produkce kostní hmoty podstatně větší u OVX krys než produkce kostní hmoty, kterou bylo možné sledovat u neošetřených OVX krys (obr. 28). Tyto výsledky potvrzují aktivitu OPG při ztrátě kostní hmoty, která souvisí s nedostatkem endogenního estrogenu po ovariektomii.

Souhrn in vivo

Účinky rekombinantního OPG in vivo jsou paralelou změn, sledovaných u OPG transgenických myší. Redukce počtu osteoklastů, pozorovaná u OPG transgenických myší, se reprodukuje injektováním rekombinantního OPG lokálně přes kalvu jak normálních myší tak myší ošetřených ILl-α nebo ILl-β. OPG transgenické myši vyvinuly osteopetrotický fenotyp s progresivním plněním dřeňové dutiny kostní hmotou a s nepřemodelovanou chrupavkou, vybíhající z růstových plotýnek od prvního dne po narození. U normálních třítýdenních (rostoucích) myší rovněž vedla OPG ošetření k ·· « ·

01-1718-97 Če

147 retenci kosti a nepřemodelované chrupavky v oblastech tvorby endochondrální kosti. Tento účinek se sledoval radiograficky a byl potvrzen histologicky. Rekombinantní OPG tedy u normálníchzvířat vyvolává fenotypové změny podobné změnám, které lze pozorovat u transgenických zvířat a tyto změny odpovídají OPG-indukované inhibici kostní resorpce. Na základě výsledků in vitro testů, sledujících tvorbu osteoklastů, se zjistilo, že k podstatné části inhibice dochází v důsledku narušení tvorby osteoklastů. V souladu s touto hypotézou OPG blokuje ovariektomiíindukovanou osteoporózu u krys. Je známo, že ztráta kostní hmoty u tohoto modelu je mediovaná aktivovanými osteoklasty, z čehož vyplývá role, kterou má OPG při ošetření primární osteoporózy.

Příklad 12

Pegylace derivátů OPG

Příprava N-koncových PEG-OPG konjugátů redukční alkylací

HuOPG met [22-194] P25A tvořil pufr, který se přemístil do 25 až 50 mM NaOAc, pH 4,5 až 4,8 a zahustil na 2 až 5 mg/ml. Tento roztok se použil pro provádění OPG redukční alkylace s^s monofunkčními PEG aldehydy při 5 až 7°C. PEG monofunkční aldehydy, lineární nebo větvené, ΜΗ = 1 až 57 kDa (dostupný od společnosti Shearwater Polymers), se přidaly do OPG roztoku jako pevné látky v množstvích 2 až 4 moly PEG aldehydu na mol OPG. Po rozpuštění polymeru v proteinovém roztoku se přidal kyanoborohydrid sodný v množství, které poskytlo konečnou koncentraci 15 až 20 mM v reakční směsi z 1 až 1,6 M

01-1718-97 Če

148 čerstvě připraveného zásobního roztoku ve studené DI vodě. Vývoj reakce a rozsah OPG pegylace se monitoroval velikostně vylučovací HPLC na G3000SW_XL koloně (Toso Haas) eluované 100 mM NaP0₄, 0,5 M NaCl, 10% ethanolem, pH-6,9. Reakce se zpravidla nechala probíhat 16 až 18 hodin, ,načež se 6 až 8krát naředila a pH se snížila na 3,5 až 4. Reakční směs se frakcionalizovala iontoměničovou chromatografií (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia), při které se eluovala 20 mM NaOAc pH 4 s lineárním gradientem do 0,75M NaCl během 25 objemů kolony a při rychlosti proudění 30 cm/hod. Frakce mono-, di- nebo poly-pegylátovaného OPG se sebraly a charakterizovaly pomocí SEC HPLC a SDS-PAGE. N-koncovým sekvencováním se zjistilo, že monoPEG-OPG konjugátem, ve většině případů hlavním reakčním produktem, byl 98% Nkoncovš PEG-modifikovaný OPG.

Tento postup se zpravidla použil pro přípravu následujících N-koncových PEG-OPG konjugátů (ve kterých tvoří OPG HuOPG met [22-194] P25A: 5 kD monoPEG, 10 kD monovětvený PEG, 12 kD monoPEG, 20 kD monoPEG, 20 kD monovětvený PEG, 25 kD monoPEG, 31 kD monoPEG, 57 kD monoPEG, 12 kD diPEG, 25 kD diPEG, 31 kD diPEG, 57 kD diPEG, 25 kD triPEG.

Příprava PEG-OPG konjugátů acylací

HuOPG met [22-194] P25A tvořil pufr, který se přemístil do 50 mM pufru BICINE, pH 8 a zahustil se na 2 až 3 mg/ml. Tento roztok se použil pro provádění OPG redukční acylace s monofunkčními PEG N-hydroxysukcinimidylestery, prováděné při pokojové teplotě. PEG N-hydroxysukcinimidylestery, lineární nebo větvené, ΜΗ = 1 až 57 kDa (dostupný

01-1718-97 Če ··· ·

149 od společnosti Shearwater Polymers) se přidaly do OPG roztoku jako pevné látky v množstvích 4 až 8 molů PEG Nhydroxysukcinimidylesteru na mol OPG. Vývoj reakce a rozsah OPG pegylace se monitoroval velikostně vylučovací HPLC na G3000SW_xl koloně (Toso Haas) eluované 100 mM NaP0₄, 0,5 M NaCl, 10% ethanolem, pH 6,9. Reakce se zpravidla nechala probíhat 1 hodinu, načež se reakční směs 6 až 8krát naředila a pH se snížila na 3,5 až 4. Reakční směs se frakcionalizovala iontoměničovou chromatografií (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia), při které se eluovala 20 mM NaOAc pH 4 s lineárním gradientem do 0,75M NaCl během 25 objemů kolony při rychlosti proudění 30 cm/hod. Frakce mono-, di- nebo poly-pegylátovaného OPG se sebraly a charakterizovaly pomocí SEC HPLC a SDS-PAGE.

Tento postup se zpravidla použil pro přípravu následujících PEG-OPG konjugátů: 5 kD polyPEG, 20 kD polyPEG, 40 kD póly větveného PEG, 50 kD polyPEG.

Příprava dimerního PEG-OPG

HuOPG met [22-194] P25A se připravil thiolací při 1 až 3 mg/ml ve fosfátovém pufru při téměř neutrálním pH. Do S-acetyl anhydridu kyseliny merkaptosukcinové (AMSA) se za stálého míchání přidal, při 4°C, v průběhu dvou hodin do 3 až 7násobného molárního přebytku, zatímco pH hodnota se udržovala na 7,0. Monomethilátovaný OPG se separoval z nemodifikovaného a polythiolátovaného OPG iontoměničovou chromatografií a chráněný thiol se zbavil ochranné skupiny ošetřením hydroxylaminem. Po odstranění ochranné skupiny se hydroxylamin odstranil gelovou filtrací a výsledný monothiolátovaný OPG se podrobil celé řadě thiolově

01-1718-97 Če

• ·· ·· · · 9 · • · · ·· · ··· · · • · 9

99 99

150 specifických síťovacích chemických reakcí. Za účelem vytvoření disulfidem vázaného dimeru se thiolátovaný OPG při >lmg/ml nechal podlehnout vzduchové oxidaci dialýzou v mírně bazickém fosfátovém pufru. Kovalentní thioetherový OPG dimer se připravil uvedením bismaleinimidového síťovacího činidla, N, N-bis(3-maleimido propianyl)-2-hydroxy 1,3-propanu, s thiolátovaným OPG při >lmg/ml při 0,6násobném molárním poměru síťovacího činidla proti OPG ve fosfátovém pufru při pH 6,5. Podobně se získávají PEG typu „dumbbells, a to reakcí substechiometrických množství bis-maleimidových PEG síťovacích činidel s thiolátovaným OPG při 1 mg/ml ve fosfátovém pufru při 6,5. Libovolný z výše uvedených dimerních konjugátů mohl být dále čištěn buď pomocí iontoměničové nebo velikostně vylučovací chromatografie.

Dimerní PEG-OPG kunjugáty (ve kterých OPG znamená HuOPG met [22-194] P25A) , připravené za použití výše popsaných postupů, zahrnují disulfidově-vázaný OPG dimer, kovalentní thioetherový OPG dimer s alifatickým síťovacím činidlem aminového typu, 3,4 kD a 8 kD typu „dumbbells a „monobells.

U PEG-OPG konjugátů se testovala aktivita in vitro za použití testu zrání osteoklastů, popsaných v příkladu 11A a aktivita ‘ in vivo měřením zvýšení kostní hustoty' po injektování do těla myší, prováděné způsobem popsaným v příkladu 11C. In vivo aktivita je shrnuta v níže uvedené tabulce 3.

·· ·· ··

01-1718-97 Če

151

Tabulka 3

In vivo biologická účinnost pegylátovaného OPG

OPG konstrukt

P25A
P25A	5k PEG
P25A	20k	PEG
P25A	31k	PEG
P25A	57k	PEG
P25A	12k	PEG
P25A	20k	větvený

muOPG	met	[22-194]
muOPG	met	[22-194]
muOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]
huOPG	met	[22-194]

5k PEG 20k PEG

P25A 8k PEG dimér P25A disulfidová příčná vazba

Zvýšení hustoty tibiální kosti +

+ +

+ * * *

V závěru je třeba upozornit, že výše uvedené příklady provedení vynálezu je třeba považovat za výhodná provedení, která mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

01-1718-97 Če • ·

152

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) údaje k SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

AAAGGAAGGA AAAAAGCGGC CGCTACANNN NNNNNT (1) údaje k SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

TCGACCCACG CGTCCG (1) údaje k SEQ ID NO:3: — =..........

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

01-1718-97 Ce • ·

153

GGGTGCGCAG GC (1) údaje k SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (1) údaje k SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

CAGGAAACAG CTATGACC 18 (1) údaje k SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bazických párů (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

01-1718-97 Če »···

154 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

CAATTAACCC TCACTAAAGG 20

údaje k SEQ ID NO:7:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 23 bazických párů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GCATTATGAC CCAGAAACCG GAC 23 (1) údaje k SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

AGGTAGCGCC CTTCCTCACA TTC____ 23 (1) údaje k SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

01-1718-97 Ce

155 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

GACTAGTCCC ACAATGAACA AGTGGCTGTG 30 (1) údaje k SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

ATTAGAATGC GGCCGCTAAA CTATGAAACA GCCCAGTGAC CATTC 45 (1) údaje k SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

GCCTCTAGAA AGAGCTGGGA C ' ..... , . . ..... -- ₂₁ (1) údaje k SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Če

156 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

CGCCGTGTTC CATTTATGAG C —— . · 21 · (1) údaje k SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 24 (1) údaje k SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

GTTGCACTCC TGTTTCACGG TCTG 24 (1) údaje k SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Če • · (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

157 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

CAAGACACCT TGAAGGGCCT GATG (1) údaje k SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

TAACTTTTAC AGAAGAGCAT CAGC 24 (1) údaje k SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

AGCGCGGCCG CATGAACAAG TGGCTGTGCT GCG 33 (1) údaje k SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • ··

01-1718-97 Če

158 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

AGCTCTAGAG AAACAGCCCA GTGACCATTC C = .......

(1) údaje k SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

GTGAAGCTGT GCAAGAACCT GATG 24 (1) údaje k SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:20:

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG (1) údaje k SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

01-1718-97 Če

159 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

CAGATCCTGA AGCTGCTCAG TTTG “ - * - 24 (1) údaje k SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

AGCGCGGCCG CGGGGACCAC AATGAACAAG TTG 33 (1) údaje k SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

AGCTCTAGAA TTGTGAGGAA ACAGCTCAAT GGC 33 (1) údaje k SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Če • ft ft· ftft · · · ft* • ··· · · · · • · · · • · · · · • · · · • ftftft ··· ftftft ftft ftft

160 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

ATAGCGGCCG CTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCAC - 39 (I) údaje k SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

TCTAGAGTCG ACTTATCATT TACCCGGAGA CAGGGAGAGG CTCTT 45 (1) údaje k SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

	44 « · «4 ·* ·« «··· 44 4 4 · 4 4 · • · · · · · ·
01-1718-97 Če	e 4 4 4 <4 4 444 4 4 4 · · · 4 4·

161

(ii)	DRUH MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:
CCTCTGCGGC	CGCTAAGCAG CTTATTTTCA CGGATTGAAC CTG	- 43
(1) údaj e	k SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GACC 24 (1) údaje k SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Ce

162 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

CCTCTGCGGC CGCTGTTGCA TTTCCTTTCT G - - ·· - ......- 3.1 (1) údaje k SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:

Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His 1 5 10 15

Gin Leu Leu (1) údaje k SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:32:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (1) údaje k SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 bazických párů

01-1718-97 Če

163 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA .........

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:33:

CCTCTGCGGC CGCACACACG TTGTCATGTG TTGC 34 (1) údaje k SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (1) údaje k SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý _ ______(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:35:

CCTCTGCGGC CGCCTTTTGC GTGGCTTCTC TGTT 34 (1) údaj e k SEQ ID NO:3 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

01-1718-97 Če

164 (A) DÉLKA: 37 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:36:

CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37 (1) údaje k SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:37:

CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTTTA CTGAATGG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina .__________(C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý _ _ __ _ _ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:38:

CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37 (1) údaje k SEQ ID NO:39:

01-1718-97 Če

165 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:39:

CCTCTGCGGC CGCCAGGGTA ACATCTATTC CAC 33 (1) údaje k SEQ ID NO:40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:40:

CCGAAGCTTC CACCATGAAC AAGTGGCTGT GCTGC 35 (1) údaje k SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 40 bazických párů
		TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: j ednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:41:

CCTCTGTCGA CTATTATAAG CAGCTTATTT TCACGGATTG 40 (1) údaje k SEQ ID NO:42:

01-1718-97 Ce

		166
(i)	CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 21 bazických párů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:42:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (1) údaje k SEQ ID NO:43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:43:

CCTCTGTCGA CTTAACACAC GTTGTCATGT GTTGC 35 (1) údaje k SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:44:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (1) údaje k SEQ ID NO:45:

01-1718-97 Ce

167 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:45:

CCTCTGTCGA CTTACTTTTG CGTGGCTTCT CTGTT (1) údaje k SEQ ID NO:46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1537 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:46:

GTGAAGAGCG	TGÁAGAGCGG	TTCCTCCTTT	CAGCAAAAAA	CCCCTCAAGA	CCCGTTTAGA	60
GGCCCCAAGG	GGTTATGCTA	GTTATTGCTC	AGCGGTGGCA	GCAGCCAACT	CAGCTTCCTT	120
TCGGGCTTTC	TTCTTCTTCT	TCTTCTTTCC	GCGGATCCTC	GAGTAAGCTT	CCATGGTACC	180
CTGCAGGTCG	ACACTAGTGA	GCTCGAATTC	CAACGCGTTA	ACCATATGTT	ATTCCTCCTT	240
TAATTAGTTA	AAACAAATCT	AGAATCAAAT	CGATTAATCG	ACTATAACAA	ÁCCAŤTTTCT	300
TGCGTAAACC	TGTACGATCC	TACAGGTACT	TATGTTAAAC	AATTGTATTT	CAAGCGATAT	360
AATAGTGTGA	CAAAAATCCA	ATTTATTAGA	ATCAAATGTC	AATCTATTAC	CGTTTTAATG	420
ATATATAACA	CGCAAAACTT	GCGACAAACA	ATAGGTAAGG	ATAAAGAGAT	GGGTATGAAA	480

01-1718-97 Če

168

GACATAAATG CCGACGACAC TTACAGAATA ATTAATAAAA TTAAAGCCTG	TAGAAGCAAT	540
AATGATATTA ATCAATGCTT ATCTGATATG ACTAAAATGG TACATTGTGA	ATATTATTTA	600
CTCGCGATCA TTTATCCTCA TTCTATGGTT AAATCTGATA TTTCAATTCT	GGATAATTAC	660
CCTAAAAAAT GGAGGCAATA TTATGATGAC GCTAATTTAA TAAAATATGA	TCCTATAGTA	720.
GATTATTCTA ACTCCAATCA TTCACCGATT AATTGGAATA TATTTGAAAA	CAATGCTGTA	780
AATAAAAAAT CTCCAAATGT AATTAAAGAA GCGAAATCAT CAGGTCTTAT	CACTGGGTTT	840
AGTTTCCCTA TTCATACTGC TAATAATGGC TTCGGAATGC TTAGTTTTGC	ACATTCAGAG	900
AAAGACAACT ATATAGATAG TTTATTTTTA CATGCGTGTA TGAACATACC	ATTAATTGTT	960
CCTTCTCTAG TTGATAATTA TCGAAAAATA AATATAGCAA ATAATAAATC	AAACAACGAT	1020
TTAACCAAAA GAGAAAAAGA ATGTTTAGCG TGGGCATGCG AAGGAAAAAG	CTCTTGGGAT	1080
ATTTCAAAAA TATTAGGCTG TAGTAAGCGC ACGGTCACTT TCCATTTAAC	CAATGCGCAA	1140
ATGAAACTCA ATACAACAAA CCGCTGCCAA AGTATTTCTA AAGCAATTTT	AACAGGAGCA	1200
ATTGATTGCC CATACTTTAA AAGTTAAGTA CGACGTCCAT ATTTGAATGT	ATTTAGAAAA	1260
ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCCATCCG TCAGGATGGC	CTTCTGCTTA	1320
ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC ACCCTCCGGG	CCGTTGCTTC	1380
GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA GGAGAGCGTT	CACCGACAAA	1440
CAACAGATAA AACGAAAGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT TTCGTTTTAT	TTGATGCCTG	1500
GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA TGCATAC		1537
(1) údaje k SEQ ID NO:47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:47:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA

01-1718-97 Če

169 (1, údaje k SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 bazických párů ^J (B) TYP: nukleová kyselina - . , , (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:48:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (1) údaje k SEQ ID NO:49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:49:

I

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49 (1) údaje k SEQ ID NO:50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1546 bazických!párů' * ' (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:50:

GCGTAACGTA TGCATGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA

01-1718-97 Če

170

CGAAAGGCTC	AGTCGAAAGA	CTGGGCCTTT	CGTTTTATCT	GTTGTTTGTC	GGTGAACGCT	120
CTCCTGAGTA	GGACAAATCC	GCCGGGAGCG	GATTTGAACG	TTGCGAAGCA	ACGGCCCGGA	180
GGGTGGCGGG	CAGGACGCCC	GCCATAAACT	GCCAGGCATC	AAATTAAGCA	GAAGGCCATC	240
CTGACGGATG	GCCTTTTTGC	GTTTCTACAA	ACTCTTTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	300
AAATATGGAC	GTCGTACTTA	ACTTTTAAAG	TATGGGCAAT	CAATTGCTCC	TGTTAAAATT	360
GCTTTAGAAA	TACTTTGGCA	GCGGTTTGTT	GTATTGAGTT	TCATTTGCGC	ATTGGTTAAA	420
TGGAAAGTGA	CCGTGCGCTT	ACTACAGCCT	aatatttttg	AAATATCCCA	AGAGCTTTTT	480
CCTTCGCATG	CCCACGCTAA	ACATTCTTTT	TCTCTTTTGG	TTAAATCGTT	GTTTGATTTA	540
TTATTTGCTA	TATTTATTTT	TCGATAATTA	TCAACTAGAG	AAGGAACAAT	TAATGGTATG	600
TTCATACACG	CATGTAAAAA	TAAACTATCT	ATATAGTTGT	CTTTCTCTGA	ATGTGCAAAA	660
CTAAGCATTC	CGAAGCCATT	ATTAGCAGTA	TGAATAGGGA	AACTAAACCC	AGTGATAAGA	720
CCTGATGATT	TCGCTTCTTT	AATTACATTT	GGAGATTTTT	TATTTACAGC	ATTGTTTTCA	780
AATATATTCC	AATTAATCGG	TGAATGATTG	GAGTTAGAAT	AATCTACTAT	AGGATCATAT	840
TTTATTAAAT	TAGCGTCATC	ATAATATTGC	CTCCATTTTT	TAGGGTAATT	ATCCAGAATT	900
GAAATATCAG	ATTTAACCAT	AGAATGAGGA	TAAATGATCG	CGAGTAAATA	ATATTCACAA	960
TGTACCATTT	TAGTCATATC	AGATAAGCAT	TGATTAATAT	CATTATTGCT	TCTACAGGCT	1020
TTAATTTTAT	TAATTATTCT	GTAAGTGTCG	TCGGCATTTA	TGTCTTTCAT	ACCCATCTCT	1080
TTATCCTTAC	CTATTGTTTG	TCGCAAGTTT	TGCGTGTTAT	ATATCATTAA	AACGGTAATA	1140
GATTGACATT	TGATTCTAAT	AAATTGGATT	TTTGTCACAC	TATTATATCG	CTTGAAATAC	1200
AATTGTTTAA	CATAAGTACC	TGTAGGATCG	TACAGGTTTA	CGCAAGAAAA	TGGTTTGTTA	1260
TAGTCGATTA	ATCGATTTGA	TTCTAGATTT	GTTTTAACTA	ATTAAAGGAG	GAATAACATA	1320
TGGTTAACGC	GTTGGAATTC	GAGCTCACTA	GTGTCGACCT	GCAGGGTACC	ATGGAAGCTT	1380
ACTCGAGGAT	CCGCGGAAAG	AAGAAGAAGA	AGAAGAAAGC	CCGAAAGGAA	GCTGAGTTGG	1440
CTGCTGCCAC	CGCTGAGCAA	TAACTAGCAT	AACCCCTTGG	GGCCTCTAAA	CGGGTCTTGA	1500
GGGGTTTTTT	GCTGAAAGGA	GGAACCGCTC	TTCACGCTCT	TCACGC		1546

(1) údaje k SEQ ID NO:51:

• ·

01-1718-97 Ce

171 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 47 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:51:

TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGC TAGCGTTAAC GCGTTGG 47 (1) údaje k SEQ ID NO:52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:52:

AATTCCAACG CGTTAACGCT AGCATGATGG TGATGGTGAT GATGTTTCA 49 (1) údaje k SEQ ID NO:53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 141 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:53:

CTAATTCCGC TCTCACCTAC CAAACAATGC CCCCCTGCAA AAAATAAATT CATATAAAAA

01-1718-97 Če

172

ACATACAGAT AACCATCTGC GGTGATAAAT TATCTCTGGC GGTGTTGACA TAAATACCAC 120

TGGCGGTGAT ACTGAGCACA T ¹⁴¹ (1) údaje k SEQ ID NO:54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 147 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:54:

CGATGTGCTC

ACCGCAGATG

TTGGTAGGTG

AGTATCACCG

GTTATCTGTA

AGAGCGGAAT

CCAGTGGTAT

TGTTTTTTAT

TAGACGT

TTATGTCAAC ACCGCCAGAG ATAATTTATC

ATGAATTTAT TTTTTGCAGG GGGGCATTGT

120

147

údaje	k SEQ	ID NO:55:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 55 bazických párů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: j ednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:55:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (1) údaje k SEQ ID NO:56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů

01-1718-97 Ce • · · ·

173 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:56:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49 (1) údaje k SEQ ID NO:57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 668 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:57:

GTGAAGAGCG	TGAAGAGCGG	TTCCTCCTTT	CAGCAAAAAA	CCCCTCAAGA	CCCGTTTAGA	60
GGCCCCAAGG	GGTTATGCTA	GTTATTGCTC	AGCGGTGGCA	GCAGCCAACT	CAGCTTCCTT	120
TCGGGCTTTC	TTČTTCTTCT	TCTTCTTTCC	GCGGATCCTC	GAGTAAGCTT	CCATGGTACC	180
CTGCAGGTCG	ACACTAGTGA	GCTCGAATTC	CAACGCGTTA	ACCATATGTT	ATTCCTCCTT	240
TAATTAGTTA	ACTCAAATCT	AGAATCAAAT	CGATAAATTG	TGAGCGCTCA	CAATTGAGAA	300
TATTAATCAA	GAATTTTAGC	ATTTGTCAAA	TGAATTTTTT	AAAAATTATG	AGACGTCCAT	360
ATTTGAATGT	ATTTAGAAAA	ATAAACAAAA	GAGTTTGTAG	AAACGCAAAA	AGGCCATCCG _s	420
TCAGGATGGC	CTTCTGCTTA	ATTTGATGCC	TGGCAGTTTA	TGGCGGGCGT	CCTGCCCGCC	480
ACCCTCCGGG	CCGTTGCTTC	GCAACGTTCA	aatccgctcc	CGGCGGATTT	GTCCTACTCA	540
GGAGAGCGTT	CACCGACAAA	CAACAGATAA	AACGAAAGGC	CCAGTCTTTC	GACTGAGCCT	600
TTCGTTTTAT	TTGATGCCTG	GCAGTTCCCT	ACTCTCGCAT	GGGGAGACCA	TGCATACGTT	660

ACGCACGT

668

01-1718-97 Ce

174 (1) údaje k SEQ ID NO:58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 726 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:58:

GCGTAACGTA	TGCATGGTCT	CCCCATGCGA	GAGTAGGGAA	CTGCCAGGCA	TCAAATAAAA	60
CGAAAGGCTC	AGTCGAAAGA	CTGGGCCTTT	CGTTTTATCT	GTTGTTTGTC	GGTGAACGCT	120
CTCCTGAGTA	GGACAAATCC	GCCGGGAGCG	GATTTGAACG	TTGCGAAGCA	ACGGCCCGGA	180
GGGTGGCGGG	CAGGACGCCC	GCCATAAACT	GCCAGGCATC	AAATTAAGCA	GAAGGGGCCT	240
CCCACCGCCC	GTCCTGCGGG	CGGTATTTGA	CGGTCCGTAG	TTTAATTCGT	CTTCGCCATC	300
CTGACGGATG	GCCTTTTTGC	GTTTCTACAA	ACTCTTTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	360
AAATATGGAC	GTCTCATAAT	TTTTAAAAAA	TTCATTTGAC	AAATGCTAAA	ATTCTTGATT	420
AATATTCTCA	ATTGTGAGCG	CTCACAATTT	ATCGATTTGA	TTCTAGATTT	GTTTTAACTA	480
ATTAAAGGAG	GAÁTAACATA	TGGTTAACGC	GTTGGAATTC	GAGCTCACTA	GTGTCGACCT	540
GCAGGGTACC	ATGGAAGCTT	ACTCGAGGAT	CCGCGGAAAG	AAGAAGAAGA	AGAAGAAAGC	600
CCGAAAGGAA	GCTGAGTTGG	CTGCTGCCAC	CGCTGAGCAA	TAACTAGCAT	AACCCCTTGG	660
GGCCTCTAAA	CGGGTCTTGA	GGGGTTTTTT	GCTGAAAGGA	GGAACCGCTC	TTCACGCTCT	720
TČAČGC						726
! i (1) údaj e	k SEQ ID NO	:59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ·· · ♦ ·· ·· ·· • · ·· ·· 9 · 9 9 9

9 999·9

99 9 999999

01-1718-97 Ce

175 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:59:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT' GGAC ' 44 (1) údaje k SEQ ID NO:60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:60:

GTCCTCCTGG TACCTACCTA AAACÁAC 27 (1) údaje k SEQ ID NO:61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 102 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:61:

TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTACCCGGCG 60

GACATTTATC ACACAGCAGC TGATGAGAAG TTTCTTCATC CA 102 (1) údaje k SEQ ID NO:62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

01-1718-97 Ce ·· ·· • · · · • · · ·

176 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:62:

Met Asp Glu Glu Thr Ser His Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro 1 5 10 15

Gly Thr Tyr (1) údaje k SEQ ID NO:63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 84 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:63:

TATGGAAACT TTCCTCCTCCAA AATATCTTCA TTATGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT

GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC (1) údaje k SEQ ID NO:64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 bazických párů (Β) ΤΫΡ: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:64:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60

TTGGAGGAAA AGTTTCCA ·· ··

01-1718-97 Če ·« • · • ftftft • ftft • ftft · • · © ft • · ·»· ftftftft • c ft · • ft ftft © β β © 9 • · · ·· ©ft

177 (1) údaje k SEQ ID NO:65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:65:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTCACGGATT GAAC (1) údaje k SEQ ID NO:66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:66:

GTGCTCCTGG TACCTACCTA AAACAGCACT GCACAGTG (1) údaje k SEQ ID NO:67:

' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:' (A) DÉLKA: 84 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:67:

01-1718-97 Če

178

TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA TTACGATCCG GAAACTGGTC ATCAGCTGCT 60

GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 84 (1) údaje k SEQ ID NO:68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:68:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GYCCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60

TTGGAGGCAG AGTTTCCA 78 (1) údaje k SEQ ID NO:69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:69:

TATGGACCCA GAAACTGGTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA .TGTGCTCCGG_^GTAC___ 54 _ (1) údaje k SEQ ID NO:70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

01-1718-97 če _· : * * .· · ··:: :

·!·· ··· ··· ···· ·· ··

179 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:70:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC TGGGTCCA 48 (1) údaje k SEQ ID NO:71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 87 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:71:

TATGAAAGA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCATTACGAT CCGGAAACTG GTCATCAGCT 60

GCTGTGTGAT AAATGTGCTC CGGGTAC 87 (1) údaje k SEQ ID NO:72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 81 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:72:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60

TTGGAGGCAG AGTTTCTTTC A 81 (1) údaje k SEQ ID NO:73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 71 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Ce o · • ·· · · · ·

180 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:73:

GTTCTCCTCA TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCAIGA AACTCTGCCT CCAAAAIACC TGCATTACGA T (1) údaj e k SEQ ID NO:7 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:74:

GTTCTCCTCA TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCA (1) údaje k SEQ ID NO:75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 76 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:75:

TACGCACTGG ATCCTTAATG ATGGTGATGGTGATGATGTA AGCAGCTTAT TTTCACGGAI

TGAACCTGAT TCCCTA (1) údaje k SEQ ID NO:76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 47 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina

01-1718-97 Če ·· · ♦ · ·· .1 ί

181 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:76:

GTTCTCCTCA TATGAAATAC CTGCATTACG ATCCGGAAAC TGGTCAT (1) údaje k SEQ ID NO:77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:77:

GTTCTCCTAT TAATGAAATA TCTTCATTAT GATGAAGAAA CTT 43 (1) údaje k SEQ ID NO:78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární _ (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA ^r (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:78:

TACGCACTGG

ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT (1) údaje k SEQ ID NO:79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 bazických párů

01-1718-97 Ce

182 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý

TOPOLOGIE: lineární _ (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA · · ..........

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:79:

GTTCTCCTCA TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA (1) údaje k SEQ ID NO:80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:80:

TACGCACTGG ATCCTTATGT TGCATTTCCT TTCTGAATTA GCA (1) údaje k SEQ ID NO:81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:81:

CCGGAAACAG ATAATGAG (1) údaje k SEQ ID NO:82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

01-1718-97 Ce

183 (A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:82:

GATCCTCATT ATCTGTTT 18 (1) údaje k SEQ ID NO:83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:83:

CCGGAAACAG AGAAGCCACG CAAAAGTAAG 30 (1) údaje k SEQ ID NO:84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:84:

GATCCTTACT TTTGCGTGGC TTCTCTGTTT 30 (1) údaje k SEQ ID NO:85:

• · 9

01-1718-97 Ce

184 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární - J i

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:85:

TATGTTAATG AG 12 (1) údaje k SEQ ID NO:86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:86:

GATCCTCATT AACA 14 (1) údaje k SEQ ID NO:87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina

.......... (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:87:

TATGTTCCGG AAACAGTTAA G 21 (1) údaje k SEQ ID NO:88:

01-1718-97 Ce

185 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární i

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:88:

GATCCTTAAC TGTTTCCGGA ACA 23 (1) údaje k SEQ ID NO:89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:89:

TATGTTCCGG AAACAGTGAA TCAACTCAAA AATAAG 3 6 (1) údaje k SEQ ID NO:90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:90:

GATCCTTATT TTTGAGTTGA TTCACTGTTT CCGGAACA 38 (1) údaje k SEQ ID NO:91:

01-1718-97 Ce

186 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:91:

CTAGCGACGA CGACGACAAA GAAACTCTGC CTCCAAAATA CCTGCATTAC

CTGGTCATCA GCTGCTGTGT GATAAATGTG CTCCGGGTAC

GATCCGGAAA

100 (1) údaje k SEQ ID NO:92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 92 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:92:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA

TTGGAGGCAG AGTTTCTTTG TCGTCGTCGT CG

TGCAGGTATT (1) údaje k SEQ ID NO:93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:93:

ACAAACACAA TGCATTTGAT ACTAGA

01-1718-97 Ce *·

187 (1) údaje k SEQ ID NO:94:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

- - (A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:94:

TTTGTTTTAA CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATATGAGAGG ATCGCATCAC 50 (1) údaje k SEQ ID NO:95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:95:

CATCACCATC ACGAAACCTT CCCGCCGAAA TACCTGCACT ACGACGAAGA 50 (1) údaje k SEQ ID NO:96:

-..... (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: “ . (A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:96:

01-1718-97 Ce

188

AACCTCCCAC CAGCTGCTGT GCGACAAATG CCCGCCGGGT ACCCAAACA 49 (1) údaje k SEQ ID NO:97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: .........

(A) DÉLKA: 26 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:97:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGGC ATTTGT 26 (1) údaje k SEQ ID NO:98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:98:

CGCACAGCAG CTGGTGGGAG GTTTCTTCGT CGTAGTGCAG GTATTTCGGC 50 (1) údaje k SEQ ID NO:99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:99:

··

01-1718-97 Če

189

GGGAAGGTTT CGTGATGGTG ATGGTGATGC GATCCTCTCA TATTTTATT 49 (1) údaje k SEQ ID N0:100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:100:

CCTCCTTTAA TTAGTTAAAA CAAATCTAGT ATCAAATCGA TTGTGTTTGT 50 (1) údaje k SEQ ID NO:101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:101:

ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59 (1) údaje k SEQ ID NO:102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA ··

01-1718-97 Ce

190 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:102:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAGAAA CTTTTCCTCC AAAATATC 48 (1) údaje k SEQ ID NO:103:

/ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:103:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 (1) údaje k SEQ ID NO:104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:104:

ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59 (1) údaje k SEQ ID NO:105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

01-1718-97 Ce ··· ·· 99 · · 4 » · ·Φ ··· · « • · I ·· 9·

191 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:105:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAAAAA AAGAAACTTT TCCTCCAAAA TATC 54 (1) údaje k SEQ ID NO:106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:106:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31

údaje k SEQ ID NO:107:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 44 bazických párů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:107:

CAGCCCGGGT AAAATGGAAA CGTTTCCTCC AAAATATCTT CATT 44 (1) údaje k SEQ ID NO:108:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

01-1718-97 Če ·· ·· » · · a • ·· ·· ·· « • · « • · · ·

192 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:108:

CGTTTCCATT TTACCCGGGC TGAGCGAGAG GCTCTTCTGC GTGT

údaje	k SEQ	ID NO:109:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 45 bazických párů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:109:

CGCTCAGCCC GGGTAAAATG GAAACGTTGC CTCCAAAATA CCTGC (1) údaje k SEQ ID NO:110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:110:

CCATTTTAČC CGGGCTGAGČ GAGAGGCTCT TCTGCGŤGT ⁼ ” (1) údaje k SEQ ID NO:111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Če

193

ft··· • ft ftft ft · · • · ·· · · (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:111

GAAAATAAGC-TGCTTÁGCTG GAGCTGAACC AAAATC = 36 (1) údaje k SEQ ID NO:112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:112:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTCACGG ATTG 34 (1) údaje k SEQ ID NO:113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:113:

AAAAATAAGC TGCTTÁGCTG CAGCTGAACC AAAATC 36 (1) údaje k SEQ ID NO:114:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ·· ·· 99 • · · · · • · · ·· « 99 9 9 9 · 9 · ··· ·· ·· ··

01-1718-97 Če β

··· 9

194 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:114:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTTACTG ATTGG - 35 (1) údaje k SEQ ID NO:115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 102 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:115:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TGCTCCAAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60

AACTAGTCAT CAGCTGCTGT GTGATAAATG TCCGCCGGGT AC 102 (1) údaje k SEQ ID NO:116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 94 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA ” (xi) POPIS SEKVENCE: SEQID NO:116: - — ™ ’

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACTAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60

TTGGAGCAAA AGTTTCCATA TGTTATTCCT CCTT (1) údaje k SEQ ID NO:117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 62 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina ··

01-1718-97 Če «··· ♦·· ·· -. 9·9 9 9 9

9 99 ·· · e · • · · ·· ··

195 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:117: - /

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TCCTGCTAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60

AA 62 (1) údaje k SEQ ID NO:118:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 62 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:118:

CTAGTTTCTT CATCATAATG AAGATATTTA GCAGGAAAAG TTTCCATATG TTATTCCTCC 60

TT 62 (1) údaje k SEQ ID NO:119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:119:

·» • ·

01-1718-97 Če «· ce • · ··

Tyr 1	His	Tyr	Tyr	Asp 5	Gin	Asn	Gly	Arg
Cys	Gin	Pro	Gly 20	His	Phe	Leu	Val	Lys 25
Asp	Thr	Val	Cys	His	Lys	Pro	Cys	Glu

40

196

Met 10	Cys	Glu	Glu	Cys	His 15	Met
His	Cys	Lys	Gin	Pro 30	Lys	Arg
Pro	Gly	Val	Thr 45	Tyr	Thr	Asp	t

Asp Trp His 50

údaje k SEQ ID NO:120:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 2432 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: cDNA
(ix)	ZNAK: (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 124..1326

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:120:

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTGTTGCCC AGACCTTATA

GGCAGCAGAG AAGCACCTAG CACTGGCCCA GCGGCTGCCG

ACA ATG AAC AAG TGG CTG TGC TGT GCA CTC CTG

Met Asn Lys Trp Leu Čys Cys Ala Leu Leu

10

ATT GAA ŤGG ACA ACC CAG GAA ACC TTT CCT CCA

Ile Glu Trp Thr Thr Gin Glu Thr Phe Pro Pro

25

TAAAACGTCA TGTTCGCCTG

CCTGAGGTTT CCAGAGGACC

GTG	TTC	TTG	GAC	.ATC
Val	Phe	Leu	Asp	Ile 15
AAA	TAC	TTG	CAT	TAT
Lys	Tyr	Leu	His 30	Tyr

120

168.

216 ··

01-1718-9/ Če β β β β • •β · * • · · • · · ·

197

GAC CCA

GAA Glu

ACC GGA Thr Gly 35

CGT CAG CTC TTG TGT GAC AAA TGT GCT CCT GGC

264

Asp

Pro

Arg Gin

Leu

Leu Cys 40

Asp Lys Cys

Ala 45

Pro

Gly

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTC

AGG,

AGG

AAG

ACA

CTG

TGT

GTC ,

312

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

50

55

60

l

CCT

TGC

CCT

GAC

TAC

TCT

TAT

ACA

GAC

AGC

TGG

CAC

ACG

AGT

GAT

GAA

360

Pro

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

65

70

75

TGC

GTG

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

AAG

GAA

CTG

CAG

ACC

GTG

AAA

CAG

408

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

Val

Lys

Gin

80

85

90

95

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

TGC

GAA

TGT

GAG

GAA

GGG

CGC

456

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

100

105

110

TAC

CTG

GAG

CTC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCA

GGC

504

Tyr

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Ly3

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

115

120

125

TTG

GGT

GTG

CTG

CAG

GCT

GGG

ACC

CCA

GAG

CGA

AAC

ACG

GTT

TGC

AAA

552

Leu

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

130

135

140

AGA

TGT

CCG

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

GAG

ACG

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

600

Arg

Cy3

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

145

150

155

TGT

AGG

AAA

CAC

ACC

AAC

TGC

AGC

TCA

CTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

648

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

160

165

170

175

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAT

GTA

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCA

696

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

180

185

190

ACT

CAA’

AAT

TGT

GGA

ΆΤΑ”

GAT

GTC

ACC

CTG

TGC’

GAA GAG

GCA

TTC“

ttc -

744

Thr

Gin

Asn

Cys

Gly

ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

195

200

205

AGG

TTT

GCT

GTG

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

CCG

AAT

TGG

CTG

AGT

GTT

CTG

792

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

210

215

220

GTG

GAC

AGT

TTG

CCT

GGG

ACC

AAA

GTG

AAT

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

840

Val

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

225

230

235

• ·

01-1718-97 Če '·· • ·· ·· · · • β

198

ATA AAA CGG AGA CAC AGC TCG

CAA Gin

GAG CAA ACT TTC CAG CTA CTT AAG

888

Ile Lys 240

Arg

Arg His

Ser 245

Ser

Glu

Gin Thr 250

Phe

Gin

Leu

Lys 255

CTG

TGG

AAG

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

936

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

260

265

270

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

AGT

GTG

CAA

CGG

CAT

ATC

GGC

CAC

984

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

275

280

285

GCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTC

CGC

ATC

TTG

ATG

GAG

AGC

TTG

CCT

1032

Ala

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

290

295

300

GGG

AAG

ATC

AGC

CCA

GAC

GAG

ATT

GAG

AGA

ACG

AGA

AAG

ACC

TGC

1080

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

Asp

Glu

ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

305

310

315

AAA

CCC

AGC

GAG

CAG

CTC

CTG

AAG

CTA

CTG

AGC

TTG

TGG

AGG

ATC

AAA

1128

Lys

Pro

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

320

325

330

335

AAT

GGA

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

GGC

CTG

ATG

TAC

GCA

CTC

AAG

CAC

1176

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

340

345

350

TTG

AAA

GCA

TAC

CAC

TTT

CCC

AAA

ACC

GTC

ACC

CAC

AGT

CTG

AGG

AAG

1224

Leu

Lys

Ala

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

355

360

365

ACC

ATC

AGG

TTC

TTG

CAC

AGC

TTC

ACC

ATG

TAC

CGA

TTG

TAT

CAG

AAA

1272

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

370

-

375

380

CTC

TTT

CTA

GAA

ATG

ATA

GGG

AAT

CAG

GTT

CAA

TCA

GTG

AAG

ATA

AGC

1320

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

385

390

395

TGC TTA TAGTTAGGAA TGGTCACTGG GCTGTTTCTT CAGGATGGGC CAACACTGAT 1376

Cys Leu 400 ' !

GGAGCAGATG GCTGCTTCTC CGGCTCTTGA AATGGCAGTT GATTCCTTTC TCATCAGTTG 1436

GTGGGAATGA AGATCCTCCA GCCCAACACA CACACTGGGG AGTCTGAGTC AGGAGAGTGA 1496

GGCAGGCTAT TTGATAATTG TGCAAAGCTG CCAGGTGTAC ACCTAGAAAG TCAAGCACCC

1556 ·· ·· > · · « » β ee «♦· β <

• · « ·· ·4

01-1718-97 Če

β··

199

TGAGAAAGAG	GATATTTTTA	TAACCTCAAA	CATAGGCCCT	TTCCTTCCTC	TCCTTATGGA	1616
TGAGTACTCA	GAAGGCTTCT	ACTATCTTCT	GTGTCATCCC	TAGATGAAGG	CCTCTTTTAT	1676
TTATTTTTTT	ATTCTTTTTT	TCGGAGCTGG	GGACCGAACC	CAGGGCCTTG	CGCTTGCGAG	’ 1736
GCAAGTGCTC	TACCACTGAG	CTAAATCTCC	AACCCCTGAA	GGCCTCTTTC	TTTCTGCCTC	1796
TGATAGTCTA	TGACATTCTT	TTTTCTACAA	TTCGTATCAG	GTGCACGAGC	CTTATCCCAT	1856
TTGTAGGTTT	CTAGGCAAGT	TGACCGTTAG	CTATTTTTCC	CTCTGAAGAT	TTGATTCGAG	1916
TTGCAGACTT	GGCTAGACAA	GCAGGGGTAG	GTTATGGTAG	TTTATTTAAC	AGACTGCCAC	1976
CAGGAGTCCA	GTGTTTCTTG	TTCCTCTGTA	GTTGTACCTA	AGCTGACTCC	AAGTACATTT	2036
AGTATGAAAA	ATAATCAACA	AATTTTATTC	CTTCTATCAA	CATTGGCTAG	CTTTGTTTCA	2096
GGGCACTAAA	AGAAACTACT	ATATGGAGAA	AGAATTGATA	TTGCCCCCAA	CGTTCAACAA	2156
CCCAATAGTT	TATCCAGCTG	TCATGCCTGG	TTCAGTGTCT	ACTGACTATG	CGCCCTCTTA	2216
TTACTGCATG	CAGTAATTCA	ACTGGAAATA	GTAATAATAA	TAATAGAAÁT	AAAATCTAGA	2276
CTCCATTGGA	TCTCTCTGAA	TATGGGAATA	TCTAACTTAA	GAAGCTTTGA	GATTTCAGTT	2336
GTGTTAAAGG	CTTTTATTAA	AAAGCTGATG	CTCTTCTGTA	AAAGTTACTA	ATATATCTGT	2396
AAGACTATTA	CAGTATTGCT	ATTTATATCC	ATCCAG			2432

(1) údaje k SEQ ID NO-.121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 401 aminokyselin ,.-... (B) TYP: aminokyselina - “ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein /

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:121:

Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile Ile ¹ 5 10 15

Glu Trp Thr Thr Gin Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 20 25 30 ·· ·· • ·

01-1718-97 Če ·· • · ···· ·· • · ··· • ·· ·· · · e e • · • · ··· ···* * ·

9 ·· · ··

200

Pro Glu

Thr Gly Arg Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

Val

Lys

Gin

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Leu

115

120

125

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180

185

190

Gin

Asn

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

210

-

215

220

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

tys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

275 280 285

Asn Leu Thr Thr Glu Gin Leu Arg Ile Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly 290 295 300 » »

01-1718-97 Ce

201 ·· · * » β ββ «4 • · f • · · Α • · ·

Lys 305

Lys

Ile

Ser

Pro

Asp 310

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr 315

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys 320

Pro

Ser

Glu

Gin

Leu 325

Leu

Lys

Leu

Ser 330

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys 335

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp 340

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu 345

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys 350

His

Leu

Lys

Ala

Tyr 355

His

Phe

Pro

Lys

Thr 360

Val

Thr

His

Ser

Leu 365

Arg

Lys

Thr

Ile

Arg 370

Phe

Leu

His

Ser

Phe 375

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu 380

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe 385

Leu

Glu

Met

Ile

Gly 390

Asn

Gin

Val

Gin

Ser 395

Val

Lys

Ile

Ser

Cys 400

Leu (1) údaje k SEQ ID NO:122:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1324 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 90..1292 — - (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:122:

CCTTATATAA ACGTCATGAT TGCCTGGGCT GCAGAGACGC ACCTAGCACT GACCCAGCGG 60

CTGCCTCCTG AGGTTTCCCG AGGACCACA ATG AAC AAG TGG CTG TGC TGC GCA 113

Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala

5

CTC CTG GTG CTC CTG GAC ATC ATT GAA TGG ACA ACC CAG GAA ACC CTT Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile Ile Glu Trp Thr Thr Gin Glu Thr Leu 10 15 20

161

I e e

01-1718-97 Ce

202

CCT CCA Pro Pro 25

AAG Ly3

TAC Tyr

TTG Leu

CAT His

TAT GAC CCA GAA ACT GGT

CAT His

CAG Gin

CTC Leu

CTG Leu 40

209

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr 35

Gly

TGT

GAC

AAA

TGT

GCT

CCT

GGC

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTG

' 257

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

45

50

55

AGG

AAG

ACA

TTG

TGT

GTC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TCT

TAT

ACG

GAC

305

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

60

65

70

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAT

GAG

TGT

GTG

TAT

TGC

AGC

CCA

GTG

TGC

AAG

353

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

75

80

85

GAA

CTG

CAG

TCC

GTG

AAG

CAG

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

401

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

90

95

100

TGT

GAG

TGT

GAG

GAA

GGG

CGT

TAC

CTG

GAG

ATC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

449

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

105

110

115

120

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCG

GGC

TCC

GGC

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

CCA

497

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

125

130

135

GAG

CGA

AAC

ACA

GTT

TGC

AAA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

545

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

140

145

150

GAG.

ACT

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

TGT

ATA

AAA

CAC

ACG

AAC

TGC

AGC

ACA

593

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

155

160

165

TTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAC

GTG

641

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

= -r. ~ ·:· -i

-170-

175

18 Ó

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCC

ACG

CAA

AAG

TGT

GGA

ATA

GAT

GTC

ACC

689

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

185

190

195

200

CTG

TGT

GAA

GAG

GCC

TTC

AGG

TTT

GCT

GTT

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

737

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

205

210

215

203

CCA AAT TGG CTG AGT GTT TTG GTG GAC AGT TTG CCT GGG ACC AAA GTG

785

Pro

Asn Trp Leu 220

Ser Val

Leu Val

Asp 225

Ser

Leu

Pro Gly

Thr 230

Lys Val

AAT

GCC

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

ATA

AAA

CGG

AGA

CAC

AGC

TCA

CAA

GAG

833

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

235

240

245

CAA

ACC

TTC

CAG

CTG

AAG

CTG

TGG

AAA

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

881

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

250

255

260

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

929

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

265

270

275

280

GTG

CAG

CGG

CAT

CTC

GGC

CAC

TCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTT

977

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

285

290

295

GCC

TTG

ATG

GAG

AGC

CTG

CCT

GGG

AAG

ATC

AGC

CCA

GAA

GAG

ATT

1025

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

Glu

Ile

300

305

310

GAG

AGA

ACG

AGA

AAG

ACC

TGC

AAA

TCG

AGC

GAG

CAG

CTC

CTG

AAG

CTA

1073

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

315

320

325

CTC

AGT

TTA

TGG

AGG

ATC

AAA

AAT

GGT

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

GGC

1121

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

330

335

340

CTG

ATG

TAT

GCC

CTC

AAG

CAC

TTG

AAA

ACA

TCC

CAC

TTT

CCC

AAA

ACT

1169

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

345

350

355

360

GTC

ACC

CAC

AGT

CTG

AGG

AAG

ACC

ATG

AGG

TTC

CTG

CAC

AGC

TTC

ACA

1217

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

-

.365

370

- · ··

=.·

375

ATG

TAC

AGA

CTG

TAT

CAG

AAG

CTC

TTT

TTA

GAA

ATG

ATA

GGG

AAT

CAG

1265

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile Gly

Asn

Gin

!

380

385

390

GTT

CAA

TCC

GTG

AAA

ATA

AGC

TGC

TTA

TAACTAGGAA TGGTCACTGG

1312

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

395

400

GCTGTTTCTT CA

1324 ··>

204 (1) údaje k SEQ ID NO:123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA: 401 aminokyselin
(B) (D)	TYP: aminokyselina TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:123

Met 1

Asn

Lys Trp

Leu Cys Cys Ala Leu Leu

Val Leu

Leu

Asp

Ile 15

Ile

5

10

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Leu

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

20

25

30

Pro

Glu

Thr

Gly

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lye

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

115

-

120

125

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

130

135

140

...... .

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Ile

/ Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

165

170

175

Gly Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180 185 190

Gin Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg 195 200 205

205

Phe Ala Val

Pro

Thr Lys

Ile 215

Ile Pro Asn Trp Leu 220

Ser

.Val

Leu

Val

210

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lys

Lye

Ile

Ser

Pro

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

305

310

315

320

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

340

345

350

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

355

360

365

Met

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Ly3

Leu

370

375

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

385

-

390

395

400

Leu (1) údaje k SEQ ID NO:124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1355 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý ft ··· »

206 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(_A) NÁZEV/KLÍČ: CDS “ ' (B) POZICE: 94..1296 ' (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:124:

GTATATATAA CGTGATGAGC GTACGGGTGC GGAGACGCAC CGGAGCGCTC GCCCAGCCGC 60

CGCTCCAAGC CCCTGAGGTT TCCGGGGACC ACA ATG AAC AAG TTG CTG TGC TGC 114

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys

GCG CTC GTG TTT CTG

GAC ATC

1 TCC ATT AAG TGG ACC

5 ACC CAG GAA ACG

162

Ala

Leu

Val 10

Phe

Leu

Asp

Ile

Ser 15

Ile

Lys

Trp

Thr

Thr 20

Gin

Glu

Thr

TTT

CCT

CCA

AAG

TAC

CTT

CAT

TAT

GAC

GAA

ACC

TCT

CAT

CAG

CTG

210

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Glu

Thr

Ser

His

Gin

Leu

25

30

35

TTG

TGT

GAC

AAA

TGT

CCT

GGT

ACC

TAC

CTA

AAA

CAA

CAC

TGT

ACA

258

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

40

45

50

55

GCA

AAG

TGG

AAG

ACC

GTG

TGC

GCC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TAC

ACA

306

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

60

65

70

GAC

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAC

GAG

TGT

CTA

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

354

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

75

80

85

AAG

GAG

CTG

CAG

TAC

GTC

AAG

CAG

GAG

TGC

AAT

CGC

ACC

CAC

AAC

CGC

402

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

90

95

100

Í=L---------=

===^-=:

· «

=

•i—· ^:=

“ —

-

-----

GTG

TGC

GAA

TGC

AAG

GAA

GGG

CGC

TAC

CTT

GAG

ATA

GAG

TTC

TGC

TTG

450

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

105

110

115

AAA

ČAT

AGG

AGC

TGC

CCT

GGA

TTT

GGA

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

498

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

120

125

130

135

CCA

GAG

CGA

AAT

ACA

GTT

TGC

AAA

AGA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

546

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

140

145

150

e e ···

207

01-1718-9/ Če ► ···

AAT Asn

GAG ACG TCA TCT

AAA Lys

GCA CCC TGT AGA AAA CAC

ACA AAT TGC AGT

594

Glu Thr Ser 155

Ser

Ala

Pro

Cys Arg Lys 160 -

His

Thr

Asn 165

Cys

Ser

GTC

TTT

GGT

CTC

CTG

CTA

ACT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAC

GAC

AAC

642

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

170

175

180

ATA TGT TCC GGA AAC AGT GAA TCA ACT CAA AAA TGT GGA ATA GAT GTT

690

Ile Cys

Ser

Gly Asn Ser

Glu 190

Ser

Thr

Gin

Lys

Cys 195

Gly

Ile

Asp

Val

185

ACC

CTG

TGT

GAG

GCA

TTC

AGG

TTT

GCT

GTT

CCT

ACA

AAG

TTT

738

Thr

Leu

Cy3

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

200

205

210

215

ACG

CCT

AAC

TGG

CTT

AGT

GTC

TTG

GTA

GAC

AAT

TTG

CCT

GGC

ACC

AAA

786

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

220

225

230

GTA

AAC

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

ATA

AAA

CGG

CAA

CAC

AGC

TCA

CAA

834

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

235

240

245

GAA

CAG

ACT

TTC

CAG

CTG

AAG

TTA

TGG

AAA

CAT

CAA

AAC

AAA

GCC

882

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Ala

250

255

260

CAA

GAT

ATA

GTC

AAG

ATC

CAA

GAT

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AAC

930

Gin

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Asn

265

270

275

AGC

GTG

CAG

CGG

CAC

ATT

GGA

CAT

GCT

AAC

CTC

ACC

TTC

GAG

CAG

CTT

978

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Leu

280

285

290

295

CGT

agc

TTG

_ ATG

GAA

AGC

TTA

CCG

GGA

AAG

'AAA

GTG

GGA

GCA

GAA

GAC

1026

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

300

305

310

ATT

GAA

AAA

ACA

ATA

AAG

GCA

TGC

AAA

CCC

AGT

GAC

CAG

ATC

CTG

AAG

1074

Ile

Glu

Lys

Thr

ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

Leu

Lys

315

320

325

CTG

CTC

AGT

TTG

TGG

CGA

ATA

AAA

AAT

GGC

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

1122

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

330 335 340 ·· · · ·· ·· ·· e · · e β e 9 9 « s 9

01-1718-97 Če • · · · · · · ···· ··· ··· ···· «· < ·

208

GGC CTA Gly Leu

ATG CAC

GCA Ala

CTA Leu

AAG CAC

TCA Ser

AAG ACG TAC CAC TTT CCC AAA

1170

Met

His

Lys 350

His

Ly3

Thr

Tyr 355

His

Phe

Pro

Lys

345

ACT

GTC

ACT

CAG

AGT

CTA

AAG

ACC

ATC

AGG

TTC

CTT

CAC

AGC

TTC

1218

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

i

360

365

370

375

'·

ACA

ATG

TAC

AAA

TTG

TAT

CAG

AAG

TTA

TTT

TTA

GAA

ATG

ATA

GGT

AAC

1266

Thr

Met

Tyr

Ly3

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

380

385

390

CAG

GTC

CAA

TCA

GTA

AAA

ATA

AGC

TGC

TTA

TAACTGGAAA TGGCCATTGA

1316

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

395 400

GCTGTTTCCT CACAATTGGC GAGATCCCAT GGATGATAA 1355 (1) údaje k SEQ ID NO:125:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 401 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:125:

Met 1	Asn	Lys	Leu	Leu 5	Cys	Cys	Ala
Lys	Trp	Thr	Thr 20	Gin	Glu	Thr	Phe
Glu	Glu	Thr 35	Ser	His	Gin	Leu	Leu 40
Tyr	Leu 50	Lys	Gin	His	Cys	Thr 55	Ala
Cys 65	Pro	Asp	His	Tyr	Tyr 70	Thr	Asp
Leu	Tyr	Cys	Ser	Pro 85	Val	Cys	Lys
Cys	Asn	Arg	Thr	His	Asn	Arg	Val

100

Leu	Val 10	Phe	Leu	Asp	Ile	Ser 15	Ile
Pro	Pro	Lys	Tyr	Leu	His	Tyr	Asp
25					30
Cys	Asp	Lys	Cys	Pro 45	Pro	Gly	Thr
Lys	Trp	Lys	Thr 60	Val	Cys	Ala	Pro
Ser	Trp	His 75	Thr	Ser	Asp	Glu	Cys 80
Glu	Leu 90	Gin	Tyr	Val	Lys	Gin 95	Glu
Cys	Glu	Cys	Lys	Glu	Gly	Arg	Tyr

105 110

01-1718-97 Če

209

Leu Glu Ile Glu

Phe Cys

Leu Lys 120

His

Arg Ser Cys

Pro 125

Pro

Gly

Phe

115

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

180

185

190

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

210

215

220

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Aen

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

305

310

315

320

Pro

Ser

Asp

Gin.

Ile_

_rLeu.

Lys_

Leu

Leu.

Ser

Leu

-Trp

Arg

Ile-

Lys ’

'Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

i

340

345

350

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

355

360

365

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

370 375 380

01-1718-97 Če ·« • φ

210

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gin Val Gin Ser Val Lys Ile Ser Cys ³⁸⁵ 390 395 ₄₀₀Leu (1) údaje k SEQ ID NO:126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 139 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:126:

Cys 1

Pro

Gin

Gly

Lys 5

Tyr

Ile

His

Pro

Gin 10

Asn

Ser

Ile

Cys 15

Cys

Thr

Lys

Cys

His 20

Lys

Gly

Thr

Tyr

Leu 25

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro 30

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp 35

Thr

Asp

Cys

Arg

Glu 40

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser 45

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu 50

Asn

His

Leu

Arg

His 55

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser 60

Lys

Cys

Arg

Lys

Glu 65

Met

Gly

Gin

Val

Glu 70

Ile

Ser

Cys

Thr 75

Val

Asp

Arg

Asp

Thr 80

Val

-Cys-

Gly Cys

Arg- Lys85

Asn

Gin

'TyrArg 90

His

Tyr'

Trp“

Ser'

Glu 95

Asn

Leu

Phe

Gin

Cys 100

Phe

Asn

Cys

Ser

Leu 105

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr 110

Val

His

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

115 120 125

Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys 130 135

01-1718-97 Ce ♦ · ···· ··· · • · · · · · ··

211

údaje	k SEQ	ID NO:127:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 48 bazických párů
	(B).	TYP: nukleová kyselina-
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: j ednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:127:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA (1) údaje k SEQ ID NO:128:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 219 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:128:

Met 1

Leu

Gly

Ile

Trp 5

Thr

Leu

Pro

Leu 10

Val

Leu

Thr

Ser

Val 15

Ala

Arg

Leu

Ser

Lys

Ser

Val

Asn

Ala

Gin

Val

Thr

Asp

Ile

Asn

Ser

20

25

30

Lys

Gly /

Leu 35

Glu

Leu

Arg

Lys

Thr 40

Val

Thr

Val

Glu 45

Thr

Gin

Asn

Leu

Glu 50

Gly

Leu

His

Asp 55

Gly

Gin

Phe

Cys

His 60

Lys

Pro

Cys

Pro

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro 65 70 75 80 ř\ ί «,π^λ λ ·* X.

υ±-ι/±o-y/ Ce « ·

212

Asp

Cys

Val

Pro

Cye

Gin

Glu

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Ala

His

85

90

95

Phe

Ser

Lys

Cy3

Arg

Cys

Arg

Leu

Cy3

Asp

Glu

Gly

His

Gly

100

105

110

Leu

Glu

Val

Glu

Ile

Asn

Cys

Thr

Arg

Thr

Gin

Asn

Thr

Lys

Cys

Arg

115

120

125

Cys

Lys

Pro

Aen

Phe

Cys

A3n

Ser

Thr

Val

Cys

Glu

HÍ3

Cys

Asp

130

135

140

Pro

Cys

Thr

Lys

Cys

Glu

His

Gly

Ile

Lys

Glu

Cys

Thr

Leu

Thr

145

150

155

160

Ser

Asn

Thr

Lys

Cys

Lys

Glu

Gly

Ser

Arg

Ser

Asn

Leu

Gly

Trp

165

170

175

Leu

Cys

Leu

Pro

Ile

Pro

Leu

Ile

Val

Trp

Val

Lys

Arg

180

185

190

Lys

Glu

Val

Gin

Lys

Thr

Cys

Arg

Lys

His

Arg

Lys

Glu

Asn

Gin

Gly

195

200

205

Ser

His

Glu

Ser

Pro

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Thr

210 215 (1) údaje k SEQ ID NO:129:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 280 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

	(ii	) DRUH MOLEKULY:	protein
	(xi	)“POPIS^SEKVENCE	: SEQ ID NO:129: ' ' '
Met Gly 1	Leu	Ser Thr Val Pro 5	Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 10 15
Glu Leu	Leu	Val Gly Ile Tyr 20	Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 25 30
His Leu	Gly 35	Asp Arg Glu Lys	Arg Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys 40 45

01-1718-97 Če

213

Tyr

Ile His Pro Gin Asn Asn

Ser

Ile

Cys Cys Thr Lys Cys 60

His

Lys

50

55

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

65

70

75

80

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu

Asn

His

Leu

85

90

95

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

Glu

Met

Glv

Gin

Val

100

105

110

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

115

120

125

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Asn

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

130

135

140

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

His

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

145

150

155

160

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

Phe

Leu

Arg

Glu

165

170

175

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

Ser

Asn

Cys

Lys

Ser

Leu

Glu

Cys

Thr

180

185

190

Lys

Leu

Cys

Leu

Pro

Gin

Ile

Glu

Asn

Val

Lys

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

195

200

205

Gly

Thr

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ile

Phe

Gly

Leu

Cys

Leu

210

215

220

Leu

Ser

Leu

Phe

Ile

Gly

Leu

Met

Tyr

Arg

Tyr

Gin

Arg

Trp

Lys

225

-

230

235

240

Ser

Lys

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Glu

: =

_s-=, .

.. ....

245

=

.. ..

250

- , „

255

,, -

Gly Glu

Leu

Glu

Gly Thr

Thr

Lys

Pro

Leu

Ala

Pro

Asn

Pro

Sér

/

260

265

270

Phe

Ser

Pro

Thr

Pro

Gly

Phe

Thr

275 280 ·' · · · ♦···♦· <

• · · · 9 9 9 ···· ··· 999 9999 99 99

01-1718-97 Ce

214 (1) údaje k SEQ ID NO:130:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 207 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:130:

Met 1

Leu

Arg Leu

Ile 5

Ala

Leu Leu Val Cys Val Val Tyr Val Tyr

Gly

10

15

Asp

Val

Pro

Tyr

Ser

Asn

Gin

Gly

Lys

Cys

Gly

His

Asp

20

25

30

Tyr

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Ala

Ser

Cys

His

Pro

Gly

Phe

Tyr

35

40

45

Ala

Ser

Arg

Leu

Cys

Gly

Pro

Gly

Ser

Asn

Thr

Val

Cys

Ser

Pro

Cys

50

55

60

Glu

Asp

Gly

Thr

Phe

Thr

Ala

Ser

Thr

Asn

His

Ala

Pro

Ala

Cys

Val

65

70

75

80

Ser

Cys

Arg Gly

Pro

Cys

Thr

Gly

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Gin

Pro

Cy3

85

90

95

Asp

Arg

Thr

His

Asp

Arg

Val

Cys

Asn

Cys

Ser

Thr

Gly

Asn

Tyr

Cys

100

105

110

Leu

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Cys

Arg

Ile

Cys

Ala

Pro

Gin

Thr

Lys

115

120

125

Cys

Pro

Ala

Gly

Tyr

Gly

Val

Ser

Gly

His

Thr

Arg

Ala

Gly

Asp

Thr

130

135

140

Leu

Cys

Glu

Lys

Cys

Pro

His

Thr

Tyr

Ser

Asp

Ser

Leu

Ser

Pro

145

150

155

160

Thr

Glu

Arg

Cys

Gly

Thr

Ser

Phe

Asn

Tyr

Ile

Ser

Val

Gly

Phe

Asn

165 170 175

Leu Tyr Pro Val Asn Glu Thr Ser Cys Thr Thr Thr Ala Gly His Asn 180 185 190 ·« ··

01

-1718-97 Če

215

·' • ····

©· • '9 99 9

• « •

Glu

Val

Ile Lys 195

Thr

Lys

Glu

Phe 200

Thr

Val

Thr

Leu

Asn 205

Tyr

Thr

(1) údaje k SEQ ID NO:131: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 227 aminokyselin. (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:131:

Met 1

Ala

Pro Val

Ala 5

Val

Trp

Ala

Leu 10

Ala

Val

Gly

Leu

Glu 15

Leu

Trp

Ala

Ala Ala 20

His

Ala

Leu

Pro

Ala 25

Gin

Val

Ala

Phe

Thr 30

Pro

Tyr

Ala

Pro

Glu Pro 35

Gly

Ser

Thr

Cys 40

Arg

Leu

Arg

Glu

Tyr 45

Tyr

Asp

Gin

Thr

Ala 50

Gin Met

Cys

Ser 55

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly 60

Gin

His

Ala

Lys

Val 65

Phe

Cys Thr

Lys

Thr 70

Ser

Asp

Thr

Val

Cys 75

Asp

Ser

Cys

Glu

Asp 80

Ser

Thr

Tyr Thr

Gin 85

Leu

Trp

Asn

Trp

Val 90

Pro

Glu

Cys

Leu

Ser 95

Cys

Gly

Ser

Arg Cys

Ser

Asp

Gin

Val

Glu

Thr

Gin

Ala

Cy3

Thr

Arg

..,

100

• s—-

- = =·-

- = · ·

-105=

, , -

--· - · —

- -

110

·=--:= ·- ··

-·

Glu

Gin

Asn Arg 115

Ile

Cys

Thr

Cys 120

Arg

Pro

Gly

Trp

Tyr 125

Cys

Ala

Leu

Ser

Lys 130

Gin Glu

Gly

Cys

Arg 135

Leu

Cys

Ala

Pro

Leu 140

Arg

Lys

Cys

Arg

Pro 145

Gly

Phe Gly

Val

Ala 150

Arg

Pro

Gly

Thr

Glu 155

Thr

Ser

Asp

Val

Val 160

Cys

Lys

Pro Cys

Ala 165

Pro

Gly

Thr

Phe

Ser 170

Asn

Thr

Ser

Ser 175

Thr

01-1718-97 Če

216

4©«

Asp

Ile

Cys

Arg

Pro

His

Gin

Ile

Cy3

Asn

Val

Ala

Ile

Pro

Gly

180

185

190

Asn

Ala

Ser

Arg

Asp

Ala

Val

Cys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Thr

Arg

Ser

195

i.:

·. ·_ϊ.ϊ: .

200

205

Met

Ala

Pro

Gly

Ala

Val

His

Leu

Pro

Gin

Pro

Val

Ser

Thr

Arg

Ser

210

215

220

Gin

His

Thr

225

(1)	údaj e k	SEQ	ID NO:132:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA: 197 aminokyselin
		(B)	TYP: aminokyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
		(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii) DRUH	MOLEKULY: protein
	(xi) )	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:132
Met	Val Ser	Leu	Pro Arg Leu Cys Ala	Leu	Trp	Gly	Cys	Leu	Leu	Thr
1			5	10					15
Ala	Val His	Leu	Gly Gin Cys Val Thr	Cys	Ser	Asp	Lye	Gin	Tyr	Leu
		20	25					30
His	Asp Gly	Gin	Cys Cys Asp Leu Cys	Gin	Pro	Gly	Ser	Arg	Leu	Thr
	35		40				45
Ser	.His Cys	Thr	,Ala₌Leu„Glu,Ly3, Thr,	Gin	Cys	.-His ’·	Pro	Cys	Asp	-Ser

	50		55			60
Gly	Glu Phe	Ser	Ala Gin Trp Asn Arg	Glu	Ile	Arg	Cys	His	Gin	His
65			70		75					80
Arg	His Cys	Glu	Pro Asn Gin Gly Leu	Arg	Val	Lys	Lys	Glu	Gly	Thr
			85	90					95
Ala	Glu Ser	Asp	Thr Val Cys Thr Cys	Lys	Glu	Gly	Gin	His	Cys	Thr
		100	105					110
Ser	Lys Asp	Cys	Glu Ala Cys Ala Gin	His	Thr	Pro	Cys	Ile	Pro	Gly
	115		120				125

9· ·· ·♦ « 9 9 9 9 9

01-1718-97 Če

217 • •β · 9

9 9

9 ··

Phe

Gly Val Met 130

Glu

Met

Ala Thr Glu Thr 135

Thr Asp Thr 140

Val

Cys His

Pro

Cys

Pro

Val

Gly

Phe

Ser

Asn

Gin

Ser

Leu

Phe

Glu

Lys

145

150

155

160

Cys

Tyr

Pro

Trp

Thr

Ser

Cys

Glu

Asp

Lys

Asn

Leu

Glu

Val

Leu

Gin

165

170

175

Lys

Gly

Thr

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

Ile

Cys

Gly

Leu

Lys

Ser

Arg

Met

180

185

190

Arg

Ala

Leu

Val

195 (1) údaje k SEQ ID NO:133:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 208 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:133:

Met Asn Lys

Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile

Ile Asp

1 Glu

Trp Thr

5 Thr Gin 20

Glu

Thr

10

Leu

His 30

15 Tyr

Phe

Pro 25

Pro Lys

Tyr

Pro

Glu

Thr 35

Gly

ArgGin

‘ Leu

Leu 40

Cys

Asp Lys

Cys

Ala 45

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu 50

Lys

Gin

His

Cys

Thr 55

Val

Arg

Lys

Thr 60

Leu

Cys

Val

Pro

Cys 65

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr 70

Thr

Asp

Ser

Trp

His 75

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys 80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro 85

Val

Cys

Lys

Glu

Leu 90

Gin

Thr

Val

Lys

Gin 95

Glu

01-1718-97 če

218

Cys

Asn

Arg

Thr 100

His

Asn

Arg

Val

Cys 105

Glu

Cys

Glu

Gly 110

Arg

Tyr

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cye

Pro

Gly

Leu

115

12 0

125

Gly

Val 130

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr 135

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr 140

Val

Cys

Lys

Arg

Cys 145

Pro

Asp

Gly

Phe

Phe 150

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser 155

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys 160

Arg

Lys

His

Thr

Asn 165

Cys

Ser

Leu

Gly 170

Leu

Ile

Gin 175

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr 180

HÍ3

Asp

Asn

Val

Cys 185

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu 190

Ala

Thr

Gin

Asn

Cys 195

Gly

Ile

Asp

Val

Thr 200

Leu

Cys

Glu

Ala 205

Phe

Arg

údaje k SEQ ID NO:134:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 224 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:134:

Met

Gly Ala

Gly

Ala

Thr

Gly

Arg

Ala

Met

Ašp

Gly

Pro

Arg

Lěu

Leů

1

5

10

15

Leu

Leu Leu

Leu

Gly

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Lys

Glu

Ala

Cys

20

25

30

Pro

Thr Gly

Leu

Tyr

Thr

His

Ser

Gly

Glu

Cys

Lys

Ala

Cys

Asn

35

40

45

Leu

Gly Glu

Gly

Val

Ala

Gin

Pro

Cys

Gly

Ala

Asn

Gin

Thr

Val

Cys

50

55

60

··

01-1718-97 Če

219 • β* 9 4

9 « ·· 99

Glu 65

Pro

Cys

Leu

Asp

Ser 70

Val

Thr

Phe

Ser

Asp 75

Val

Ser

Ala

Thr 80

Glu

Pro

Cys

Lys

Pro 85

Cys

Thr

Glu

Cys

Val 90

Gly

Leu

Gin

Ser

Met 95

Ser

Ala

Pro

Cys

Val 100

Glu

Ala

Asp

Ala 105

Val

Cys

Arg

Cys

Ala 110

Tyr

Gly

Tyr

Gin 115

Asp

Glu

Thr

Gly 120

Arg

Cys

Glu

Ala

Cys 125

Arg

Val

Cys

Glu

Ala 130

Gly

Ser

Gly

Leu

Val 135

Phe

Ser

Cys

Gin

Asp 140

Lys

Gin

Asn

Thr

Val 145

Cys

Glu

Cys

Pro 150

Asp

Gly

Thr

Tyr

Ser 155

Asp

Glu

Ala

Asn

His 160

Val

Asp

Pro

Cys

Leu 165

Pro

Cys

Thr

Val

Cys 170

Glu

Asp

Thr

Glu

Arg 175

Gin

Leu

Arg

Glu

Cys 180

Thr

Arg

Trp

Ala

Asp 185

Ala

Glu

Cys

Glu

Glu 190

Ile

Pro

Gly

Arg

Trp 195

Ile

Thr

Arg

Ser

Thr 200

Pro

Glu

Gly

Ser 205

Asp

Ser

Thr

Ala

Pro 210

Ser

Thr

Gin

Glu

Pro 215

Glu

Ala

Pro

Glu 220

Gin

Asp

Leu

Ile

(1) údaje k SEQ ID NO:135:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 205 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý

—.....(D) TOPOLOGIE: lineární “ (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:135:

Met Tyr Val Trp Val Gin Gin Pro Thr Ala Phe Leu Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15

Ser Leu Gly Val Thr Val Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Thr Tyr Pro 20 25 30 • ·· ·♦ ·♦ ses a β V e ' · a a a a • · · ·· · a • · · a a* ···· ·· ··

01-1718-97 Če ····

220

Ser

Gly

His 35

Lys

Cys

Arg

Glu 40

Cys

Gin

Pro

Gly

His 45

Gly

Met

Val

Ser

Arg 50

Cys

Asp

His

Thr

Arg 55

Asp

Thr

Val

Cys

His 60

Pro

Cys

Glu

Pro

Gly 65

Phe

Tyr

Asn

Glu

Ala 70

Val

Asn

Tyr

Asp

Thr 75

Cys

Lys

Gin

Cys

Thr 80

Gin

Cys

Asn

His

Arg

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Gin

Asn

Cys

Thr

Pro

85

90

95

Thr

Glu

Asp

Thr

Val

Cye

Gin

Cys

Arg

Pro

Gly

Thr

Gin

Pro

Arg

Gin

100

105

110

Asp

Ser

Ser 115

His

Lys

Leu

Gly

Val 120

Asp

Cys

Val

Pro

Cys 125

Pro

Gly

His

Phe 130

Ser

Pro

Gly

Ser

Asn 135

Gin

Ala

Cys

Lys

Pro 140

Trp

Thr

Asn

Cys

Thr 145

Leu

Ser

Gly

Lys

Gin 150

Ile

Arg

His

Pro

Ala 155

Ser

Asn

Ser

Leu

Asp 160

Thr

Val

Cys

Glu

Asp

Arg

Ser

Leu

Ala

Thr

Leu

Trp

Glu

Thr

165

170

175

Gin

Arg

Thr

Phe

Arg

Pro

Thr

Val

Pro

Ser

Thr

Val

Trp

180

185

190

Pro

Arg

Thr

Ser

Gin

Leu

Pro

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

195 200 205

Met (1) údaje k SEQ ID NO:136:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 191 aminokyselin ' ⁼ (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:136:

Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val 5 10 15 ·«

01-1718-97 Če

221

Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gin Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gin 20 25 30

Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lye Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro 35..... 40 ...... · ’ - 45

Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gin Pro Asn Cys Asn Ile Cys 50 55 60

Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr

70 75 80

His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro

90 95

Gin Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gin Glu Leu Thr 100 105 110

Lys Gin Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gin Asn 115 120 125

Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg 130 135 140

Ser Val Leu Ly3 Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu

165 170 175

Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gin Val Leu Thr Leu Phe Leu 180 185 190 (1) údaje k SEQ ID NO:137:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C, DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:137:

TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC

01-1718-97 Če

222 (1) údaje k SEQ ID NO:138:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 380 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:138:

Glu 1

Thr

Leu

Pro

Pro 5

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr 10

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly 15

His

Gin

Leu

Cys 20

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro 25

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys 30

Gin

His

Cys

Thr

Val 35

Arg

Lys

Thr

Leu 40

Cys

Val

Pro

Cys

Pro 45

Asp

His

Ser

Tyr

Thr 50

Asp

Ser

Trp

His

Thr 55

Ser

Asp

Glu

Cys

Val 60

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val 65

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin 70

Ser

Val

Lys

Gin

Glu 75

Cys

Asn

Arg

Thr

His 80

Asn

Arg

Val

Cys

Glu 85

Cys

Glu

Gly

Arg 90

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu 95

Phe

Cys

Leu

Lys

His 100

Arg

Ser

Cys

Pro

Pro 105

Gly

Ser

Gly

Val

Val 110

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro 115

Glu

Arg

Asn

Thr

Val 120

Cys

Lys

Cys

Pro 125

Asp

Gly

Phe

_Phe

Ser 130

Gly

Glu~

: Thr

Ser

Ser 135

Lys

Ala

Pro=Cys

Ile’ 140

Lys

“His

Thr

Ášn

Cys 145

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu 150

Leu

Ile

Gin

Lys 155

Gly

Asn

Ala

Thr

His 160

Asp

Asn

Val

Cys

Ser 165

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala 170

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly 175

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

180 185 190

01-1718-97 Čé

223

Lys

Ile

Ile Pro Asn 195

Trp

Leu Ser Val Leu Val Asp Ser Leu Pro

Gly

200

205

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

HÍ3

Ser

210

215

220

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

225

230

235

240

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

Aep

Ile

Asp

Leu

Cys

245

250

255

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

Asn

Leu

Thr

Glu

260

265

270

Gin

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

275

280

285

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

Ser

Glu

Gin

Leu

290

295

300

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

305

310

315

320

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Phe

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Phe

Leu

His

340

345

350

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

355

360

365

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

370

375

380

(1) údaje k SEQID NO:139:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 380 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

01-1718-97 Čě

224 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:139:

Glu Thr Phe 1

Pro

Pro Lys 5

Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu _..........10 ......

Thr

Ser 15

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

Hlá

20

25

30

i

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

35

40

45

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

50

55

60

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

65

70

75

80

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

85

90

95

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cy3

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gin

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

115

120

125

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

130

135

140

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

145

150

155

160

Asp

Asn

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

165

170

175

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

180

185

190

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

195

200=

_______

...

• ·

205

—-

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gin

His

Ser

210

215

220

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

225 230 235 240

Lys Ala Gin Asp ile Val Lys Lys Ile Ile Gin Asp Ile Asp Leu Cys 245 250 255 ·· • · ς

• · ···· «·

01-1718-97 Če ♦ ··

225 ·· * A ···· ·· ·· • · · ··· · · • · · ·· ♦ ·

Glu Asn

Ser

Val 260

Gin

Arg His

Ile

Gly His Ala Asn Leu Thr

Phe Glu

265

270

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

275

280

²⁸⁵

Glu

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

290

295

300

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

305

310

315

320

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

340

345

350

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

355

360

365

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

370

375

380

(1)

údaj

e k

SEQ

ID NO:140:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:140:

TGGACCACCC AGAAGTACCT TCATTATGAC 30 (1) údaje k SEQ ID NO:141:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ·· o ·

01-1718-97 Če

226

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:141:

GTCATAATGA AGGTACTTCT GGGTGGTCCA ' ' 30 (1) údaje k SEQ ID NO:142:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineárni (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:142:

GGACCACCCA GCTTCATTAT GACGAAGAAA C 31 (1) údaje k SEQ ID NO:143:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineárni (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:143:

GTTTCTTCGT CATAATGAAG CTGGGTGGTC C 31 (1) údaje k SEQ ID NO:144:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineárni s

• ·

I *

01-1718-97 Če

227 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:144:

GTGGACCACC CAGGACGAAG AAACCTCTC .....29 ‘

Z (1) údaje k SEQ ID NO:145:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:145:

GAGAGGTTTC TTCGTCCTGG GTGGTCCAC 29 (1) údaje k SEQ ID NO:146:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:146:

CGTTTCCTCC AAAGTTCCTT CATTATGAC 29 (1) údaje k SEQ ID NO:147:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Če

228

• ·

6· ·· (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:147:

GTCATAATGA AGGAACTTTG GAGGAAACG.....-- - ₂9 (1) údaje k SEQ ID NO:148:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:148:

GGAAACGTTT CCTGCAAAGT ACCTTCATTA TG 32 (1) údaje k SEQ ID NO:149:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:149:

CATAATGAAG GTACTTTGCA GGAAACGTTT CC 32 (1) údaje k SEQ ID NO:150:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • ·

01-1718-97 Če

229 • · · · « • · « • « ·* (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:150:

CACGCAAAAG TCGGGAATAG ATGTCAC ~ ¹ 27 (1) údaje k SEQ ID NO:151:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:151:

GTGACATCTA TTCCCGACTT TTGCGTG 27

údaje k SEQ ID NO:152:
(i)	CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 25 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:152

CACCCTGTCG GAAGAGGCCT TCTTC 25 (1) údaje k SEQ ID NO:153:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

01-1718-97 Če

230 • · ·· (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:153:

' GAAGAAGGCC TCTTCCGACA GGGTG '' - ----- - - - ' - - -' - - - - - - ₂5 /

(1) údaje k SEQ ID NO:154:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:154:

TGACCTCTCG GAAAGCAGCG TGCA 24 (1) údaje k SEQ ID NO:155:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:155:

TGCACGCTGC TTTCCGAGAG GTCA 24 (1) údaje k SEQ ID NO:156:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

01-1718-97 Če

231 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:156:

CCTCGAAATC GAGCGAGCAG CTCC “ 24 (1) údaje k SEQ ID NO:157:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:157:

CGATTTCGAG GTCTTTCTCG TTCTC 25

(1) údaj e	k SEQ ID NO:158:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: cDNA
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:158
CCGTGAAAAI	' AAGCTCGTTA TAACTAGGAA
(1) údaj e	k SEQ ID NO:159:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

• · ·

• « e

« ·

01-1718-97 Če ····

232 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:159:

CCATTCCTAG TTATAACGAG CTTATTTTCA CGG ’’ ~ ------- ’ 33 (1) údaje k SEQ ID NO:160:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:160:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:161:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:161:

CCTCTCTCGAGTCAGGTGAC ATCTATTCCA CACTTTTGCG TGGC 44 (1) údaje k SEQ ID NO:162:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ·· • · • · ·

* ···

233 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

01-1718-97 Čě • ·· · (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:162:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (1) údaje k SEQ ID NO:163:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:163:

CCTCTCTCGA GTCAAGGAAC AGCAAACCTG AAGAAGGC 38 (1) údaje k SEQ ID NO:164:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:164:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO.-165:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

234

01-1718-97 Če • · * · ···· ··· (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:165:

CCTCTCTCGA GTCACTCTGT GGTGAGGTTC GAGTGGCC “ 38.......!

(1) údaje k SEQ ID NO:166:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:166:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:167:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:167:

CCTCTCTCGA

GTCAGGATGT TTTCAAGTGC TTGAGGGC (1) údaje k SEQ ID NO:168:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ··

01-1718-97 Če ·· • · · * • · 9 9 ' 99 9 9 β • · 9

99

235 (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:168:

Met Lys His His His His His His His 'Ala Ser Val Asn Ala Leu Glu

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid, obsahující alespoň jednu z biologických aktivit OPG, vyznačená tím, že se zvolí ze skupiny tvořené:

a) nukleovými kyselinami znázorněnými na obrázcích 2B až 2C (SEQ ID NO:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122) a 9C až 9D (SEQ ID NO:124) nebo jejich komplementárními řetězci;

b) nukleovými kyselinami, které za přísných podmínek hybridizují s polypeptidem kódujícím oblasti znázorněné na obrázcích 2B až 2C (SEQ ID N0:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122) a 9C až 9D (SEQ ID NO:124);

c) nukleovými kyselinami, které za přísných podmínek hybridizují s nukleotidy 148 až 337 včetně, znázorněními ne obrázku IA; a

d) nukleovými kyselinami, které jsou degeneráty nukleových kyselin (a), (b) a (c).
2. Nukleová kyselina podle nároku 1, vyznačená tím, že znamená cDNA, genomovou DNA, syntetickou DNA nebo RNA. ..... — ' ’ .....
3. Polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle nároku 1.

• ·

01-1718-97 Če

237

4 . Nukleová kyselina podle nároku 1, v y z n a. č e - n á tím, že zahrnuje j eden : nebo několik kodonů, výhodně pro expresi Escherichia coli. • 5. Nukleová kyselina podle nároku 1, v y z n a č e -

n á tím, že má na sobě navázáno detekovatelné značení.
6. Nukleová kyselina podle nároku 1, vyznačená tím, že zahrnuje polypeptid-kódující úsek z obrázků 2B až 2C (SEQ ID N0:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122) a 9C až 9D (SEQ ID NO:124).
7. Nukleová kyselina podle nároku 6, vyznačená tím, že má sekvenci, znázorněnou na obrázcích 9C až 9D, (SEQ ID NO;124) z nukleotidů 158 až 1297.
8. Expresní vektor zahrnující nukleovou kyselinu podle nároku 1.
9. Expresní vektor podle nároku 8, vyznačený tím, že nukleová kyselina obsahuje polypeptid-kódující úsek, znázorněný na obrázcích 9C až 9D, (SEQ ID NO:124).

··

01-1718-97 Če

238
10. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná expresním vektorem podle nároku 8.
11. Hostitelská buňka podle nároku 10, vyznačená tim, že znamená eukaryotickou buňku.
12. Hostitelská buňka podle nároku 11, vyznačená tim, že se zvol! ze skupiny zahrnujíc! CHO, COS, 293, 3T3, CV-1 a BHK buňky.
13. Hostitelská buňka podle nároku 10, vyznačená tim, že znamená prokaryotickou buňku.
14. Hostitelská buňka podle nároku 13, vyznačená tim, že znamená Escherichia coli.
15. Transgenický savec obsahující expresní vektor podle nároku 8. _
16. Transgenický savec podle nároku 15, čený tim, že tímto savcem je hlodavec.

vyzná .· ft ftft ftftft · · ftftft · ft » » * ft* _v ···'· ft ft ft ft ftftft · ·

01-1718-97 ce / ftftftft ftftft ftftft

239
17. Transgenický savec podle nároku 16, vyznačený tím, že tímto savcem je myš.

i
18. Způsob výroby OPG, vyznačený tím, že zahrnuje: růst hostitelských buněk transformovaných nebo transfektovaných nukleovou kyselinou podle nároku 1 za vhodných živných podmínek; a izolaci polypeptidových produktů exprese nukleových kyselin.

OPG.

Purifikovaný a izolovaný polypeptid obsahuj ící tím,

Polypeptid podle nároku 19, že znamená savčí OPG.

vyznač tím,

Polypeptid podle nároku 20, že znamená humánní OPG.

vyznač

22. Polypeptid tím, že je proteinů.

podle nároku v podstatě
19, v prostý yznačený dalších humánních tím
23. Polypeptid podle nároku 21, vyznačený že má aminokyselinovou sekvenci, znázorněnou na obrázku 9A až (SEQ ID NO:125) značený znázorněnou na

01-1718-97 Če

240 obrázku 2B až 2C (SEQ IDNO:121),

9B (SEQ ID NO: 123) nebo obrázku 9C až 9D nebo její deriváty.
24. Polypeptid podle nároku 23, v y tím, že má aminokyselinovou sekvenci, obrázku 9C až 9D, (SEQ ID NO:125) tvořenou zbytky 22 až 401 včetně.
25. Polypeptid podle nároku 23, vyznačený tím, že má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO:125) tvořenou zbytky 32 až 401 včetně.
26. Polypeptid podle nároku 19, vyznačený t i'm , že je produktem exprese exogenní DNA sekvence.
27. Polypeptid podle nároku 26, vyznačený tím, že DNA znamená cDNA, genomovou DNA nebo syntetickou DNA.-· - ....... ----- - ...... .. ....._......,
28. Polypeptid podle nároku 19, vyznačený tím, že je modifikován vodou rozpustným polymerem.

01-1718-97 Če

241
29. Polypeptid podle nároku 28, vyznačený tím, že vodou rozpustným polymerem je polyethylenglykol .
30. Polypeptid obsahující: aminokyselinovou sekvenci přibližně alespoň 164 aminokyselin, zahrnujících čtyři cysteinově bohaté domény charakteristické cysteinově bohatými doménami extracelulárních úseků receptorů nádor nekrotizujícího faktoru; a aktivitu zvýšení hustoty kosti.
31. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 2B až 2C (SEQ ID NO:121), obrázku 9A až 9B (SEQ ID NO: 123) nebo obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO:125), která má na zbytku 22 N-konec a ve které jsou kyseliny 1 až 216 vynechány z karboxylového konce.
32. Polypeptid podle nároku 31, vyznačený tím, že zahrnuje aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 22 až 185, 22 až 189, 22 až 194 nebo 22 až 201 včetně.
33. Polypeptid podle nároku 32, vyznačený tím, že dále zahrnuje Fc oblast humánního IgGl vybíhající z karboxylového konce.
34. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 2B až 2C (SEQ ID NO:121), obrázku 9A ··

01-1718-97 Če · j*.

242 až 9B (SEQ ID NO: 123) nebo obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO:125), která má na zbytku 22 N-konec a ve které je na N-konci vynechána 1 až 10 aminokyselin a případně na karboxylovém konci 1 až 216 kyselin.
35. P.olypeptid podle nároku 34, vyznačený tím, že zahrnuje aminokyselinovou sekvenci ze zbytků 27 až 185, 27 až 189, 27 až 401 nebo 32 až 401 včetně.
36. Polypeptid podle nároku 35, vyznačený tím, že dále zahrnuje Fc oblast humánního IgGl vybíhající z karboxylového konce.

37. Polypeptid zvolený ze skupiny tvořené: huOPG [22-201]-Fc

huOPG [22-401]-Fc huOPG [22- •180] -Fc huOPG met [22-401]-Fc huOPG Fc-met [22-401] huOPG met [22-185] huOPG met [22-189] _ huOPG met [22-194] huOPG met [27-185] huOPG met [27-189] huOPG met [27-194] huOPG met [32-401] huOPG met- lys [22-401] huOPG met [22-401] huOPG met [22-401]-Fc (P25A)

• ·

·· * . · ·· ·· · 01-1718-97 Če ..... — - huOPG met [22-401] 243 (P25A) huOPG met [22-401] (P2 6A) huOPG met [22-401] (P26D) huOPG’ met [22-194] (P25A) huOPG met [22-194] (P26A) huOPG met met-(lys) ₃ [22-401] huOPG met met-arg-gly-ser-(his)₆ [22-401].

38. Nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároku 37.
39. Protilátka nebo její fragment, který se specificky váže na OPG.
40. Protilátka podle nároku 39, vyznačená tím, že je monoklonální protilátkou.
41. Způsob detekce přítomnosti OPG v biologickém vzorku, vyznačený tím, že zahrnuje:

......inkubaci vzorku protilátkou podle nároku 39 za .

podmínek, které umožňují navázání protilátky na OPG; a detekci navázané protilátky.
42. Způsob hodnocení schopnosti kandidátové látky navázat se na OPG, vyznačený tím, že zahrnuje:

01-1718-97 Če • ···* ··*· ·· ·· • · 9

Λ β * * Φ * · W

9 9 ·

99 9·

244 inkubaci OPG kandidátovou látkou za podmínek, které umožňují její navázání; a měření navázané látky.
43. Způsob regulace hladin OPG v těle živočicha, vyznačený tím, že zahrnuje modifikace živočicha nukleovou kyselinou, kódující OPG.
44. Způsob podle nároku 43, vyznačený tím, že nukleová kyselina podporuje zvýšení hladiny OPG ve tkáni.
45. Způsob podle nároku 44, vyznačený tím, že živočichem je člověk.
46. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství OPG ve farmaceuticky přijatelném nosiči, adjuvans, solubilizační činidlo, stabilizační činidlo a/nebo antioxidant.
47.

tím

Kompozice podle nároku 46, že OPG je humánní OPG.

vyznačená \X

01-1718-97 Ce ,J. J. *

245
48. Kompozice podle nároku 47, vyznačená tím, že OPG má aminokyselinovou sekvenci, znázorněnou na obrázku 9B. . . . . . , ...

/
49. Způsob léčení nemoci kostí, vyznačený tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 19.
50. Způsob podle nároku 49, vyznačený tím, že polypeptidem je humánní OPG.
51. Způsob podle nároku 49, vyznačený tím, že nemocí kostí je excesivní ztráta kosti.
52. Způsob podle nároku 51, vyznačený tím, že nemoc kostí se zvolí ze skupiny zahrnující osteoporózu, Pagetovu kostní chorobu, hyperkalcemii, hyperparatyreoidismus, steroidem indukovanou osteopenii, ztrátu kostní hmoty v důsledku kloubního revmatismu, ztrátu kostní hmoty v důsledku osteomyelitidy, osteolytickou metastázu a periodontální ztrátu kostní hmoty.
53. Způsob podle nároku 49, vyznačený tím, že dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství látek zvolených ze skupiny zahrnující kostní morfogenní proteiny BMP-1 až BMP-12, členy rodiny TGF-β, a a • a aa e e e • a a·· ····

01-1718-97 Če '· a a a · aa aa

246

IL-1 inhibitory, TNFa inhibitory, protein odvozený z hormonu paratyreoidu a jeho analogy, E řadu prostaglandinů, bisfosfonáty a kost-obohacující minerály.
54. Osteoprotegerinový multimer tvořený osteoprotegerinovými monomery.

55. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, v y značený tim, že znamená dimer. 56. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, v y značený tim, že je tvořen vnitřním řetězcem

disulfidových vazeb.

57. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, vyznačený tím, že je tvořen spojením Fc úseků odvozených z humánního IgGl. 58. Osteoprotegerinový multimer” podle nároku 54,

vyznačený tim, žejev podstatě prostý osteoprotegerinových monomerů a inaktivnich multimerů.
59. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, vyznačený tim, že monomery obsahuji aminokyselinovou sekvenci, znázorněnou na obrázku 9C až 9D,

9 —

01-1718-97 Če »··· ··· • 9 » · i

9 6 · 9 • « • ·

247 (SEQ ID NO: 125) tvořenou zbytky 22 až 401, nebo její derivát.
60. Osteoprotegerinový multimer podle nároku' 54, vyznačený tím, že monomery obsahují aminokyselinovou sekvenci, znázorněnou na obrázku 9C až 9D, (SEQ ID NO: 125) tvořenou zbytky 22 až 194, nebo její derivát.