TW201333034A - 新穎抗人類ｃｔｇｆ抗體 - Google Patents

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Shoji Iwasaki
Ryuichi Moriya
Masayasu Yoshino
Koji Takakura
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Abstract

本發明之課題係提供與傳統之抗人類CTGF抗體比較，結合活性及/或中和活性佳之抗人類CTGF抗體，以及使用該抗人類CTGF抗體之包含慢性腎臟病或糖尿病性腎病等之腎臟疾病之人類CTGF參與病態形成之各種疾病之預防或治療方法。本發明之解決手段係含序列號碼10所示之胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列號碼4所示之胺基酸序列而成之輕鏈可變區之抗人類CTGF抗體。

Description

新穎抗人類CTGF抗體
本發明係關於新穎抗人類CTGF抗體。詳細而言，本發明之新穎抗人類CTGF抗體與傳統的抗人類CTGF抗體比較，係結合活性及/或中和活性佳之抗人類CTGF抗體。
CTGF(結締組織生長因子)係屬於CCN家族之分子量約為36~38kDa之富含半胱胺酸殘基之分泌蛋白質(非專利文獻1)，傳統上，已知係被認為於纖維化中最重要的增殖因子之TGF-β所誘發(非專利文獻2)。因此，推測TGF-β誘發CTGF，所誘發之CTGF促進臟器或組織之纖維化，認為CTGF係於纖維化、細胞增殖、細胞外基質之代謝、血管形成、動脈硬化等，扮演重要角色(非專利文獻3)。
CTGF存在許多區域(domain)，與其他的因子互相作用。其中，藉由von Willebrand Factor type C domain，CTGF與TGF-β或BMP4直接結合，顯示發生促進TGF-β訊號或抑制BMP訊號(非專利文獻4)。
揭示CTGF係於各種腎臟疾病(例如慢性腎臟病、糖尿病性腎病、絲球體硬化症、IgA腎臟病、巢狀分節性絲球體硬化症、ANCA相關腎炎、急速進行性腎絲球體腎炎、慢性移植腎病、腎病症候群(Nephrotic syndrome)、狼瘡腎炎(lupus nephritis)、膜狀增生性 腎絲球體腎炎)中表現亢進(非專利文獻5)、纖維化密切相關(非專利文獻6)。
另外，報告揭示CTGF係與各種纖維症(硬皮症(scleroderma)、間質性肺病、特發性肺纖維化病等之肺纖維症、由慢性B型或C型肝炎所發生之纖維症、放射線誘發性纖維症、由創傷治癒所產生之纖維症、及心臟肥大及纖維症)或血管增殖性疾病、糖尿病性網膜症、癌等有關，認為成為新的治療目標(非專利文獻7、8)。
因此，若能開發特異地結合於CTGF，具有抑制CTGF所引起之各種作用之活性之單株抗體，可期待適用於診斷、預防或治療CTGF參與病態形成之各種疾病。
研究進行直至現在，作為對人類CTGF顯示抑制功能作用之抗體，揭示有人類單株抗體之M84及M320(專利文獻1)、CLN1(專利文獻2)或小鼠單株抗體之CTGF-m2-1(專利文獻3)等。其中，CLN1係被檢討的最詳細，於間質性肺纖維症模式或單側尿管結紮而腎間質纖維化模式中，顯示該效果。CLN1現在係以FG-3019於臨床試驗(第二期)階段。
然而，傳統的抗體對CTGF的結合活性稱不上充份，就治療有效性之觀點，對CTGF之中和活性稱不上很強。
一般，作為規定抗體醫藥之有效投與量之主要因素，可列舉抗體具有對抗原之結合活性或中和活性、或體內存在的抗原量，但使結合活性或中和活性提升係與投與量減低有關，作為結果可說是亦對減低患者經濟上的負擔或醫 療成本極為有效的改良。
由此可知，取得比傳統的抗體之結合活性或中和活性強之抗人類CTGF抗體，用以利用於預防或治療CTGF參與病態形成之各種疾病是不可或缺的。
先前技術文獻 專利文獻
〔專利文獻1〕特開2000-232884
〔專利文獻2〕WO2004/108764
〔專利文獻3〕WO2007/066823
非專利文獻
〔非專利文獻1〕D.M. Bradham et al, J. Cell Biol. 114:1285-1294 (1991)
〔非專利文獻2〕A. Igarashi et al, Mol. Biol. Cell 4:637-645 (1993)
〔非專利文獻3〕Blom IE et al, Matrix Biol. 21 (6):473-82 (2002)
〔非專利文獻4〕Abreu, et al. Nat. Cell. Biol. 4, 599-604 (2002)
〔非專利文獻5〕Ito Y et al.: Kidney Int. 53 (4) 853-61, (1998)
〔非專利文獻6〕Phanish MK et al, Nephron Exp Nephrol. 114 (3) e83-92; (2010)
〔非專利文獻7〕Shi-Wen X et al, Cytokine Growth Factor Rev. 19 (2):133-44. (2008)
〔非專利文獻8〕Jun JI et al, Nat Rev Drug Discov. 10 (12):945-63 (2011)
本發明之課題係提供與傳統之抗人類CTGF抗體比較，結合活性及/或中和活性佳之抗人類CTGF抗體。
本發明係包含適用於醫學上或產業上之物質、方法之後述發明者。
〔1〕含序列號碼10所示之胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列號碼4所示之胺基酸序列而成之輕鏈可變區之抗人類CTGF抗體。
〔2〕前述抗體之重鏈恆定區為人Igγ 1恆定區之〔1〕之抗人類CTGF抗體。
〔3〕前述抗體之輕鏈恆定區為人Igκ恆定區之〔1〕之抗人類CTGF抗體。
〔4〕前述抗體之重鏈恆定區為人Igγ 1恆定區，前述抗體之輕鏈恆定區為人Igκ恆定區之〔1〕之抗人類CTGF抗體。
〔5〕含序列號碼12所示之胺基酸序列而成之重鏈、及序列號碼8所示之胺基酸序列而成之輕鏈之〔1〕之抗人類CTGF抗體。
〔6〕含編碼〔1〕~〔5〕中任一種抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸。
〔7〕含編碼〔1〕~〔5〕中任一種抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸。
〔8〕含〔6〕及/或〔7〕之聚核苷酸之表現載體。
〔9〕以〔8〕之表現載體所轉型之宿主細胞。
〔10〕選自後述(a)及(b)所成群之〔9〕之宿主細胞。
(a)以含有含編碼〔1〕~〔5〕中任一種抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸與含編碼該抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞；及(b)以含有含編碼〔1〕~〔5〕中任一種抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體與含有含編碼該抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞。
〔11〕包含培養〔9〕或〔10〕之宿主細胞，使抗人類CTGF抗體表現之步驟之生產〔1〕~〔5〕中任一種生產抗人類CTGF抗體之方法。
〔12〕含〔1〕~〔5〕中任一種抗體之人類CTGF參與病態形成之各種疾病之治療藥。
〔13〕前述疾病係腎病之〔12〕之治療藥。
〔14〕前述腎病係慢性腎臟病或糖尿病性腎病之〔13〕之治療藥。
〔15〕包含投與〔1〕~〔5〕中任一種抗體之步驟之 用以預防或處理人類CTGF參與病態形成之疾病之方法。
〔16〕前述疾病係腎病之〔15〕之方法。
〔17〕前述腎病係慢性腎臟病或糖尿病性腎病之〔16〕之方法。
〔18〕用以使用於用以預防或處理人類CTGF參與病態形成之疾病之〔1〕~〔5〕中任一種抗體。
〔19〕前述疾病係腎病之〔18〕之抗體。
〔20〕前述腎病係慢性腎臟病或糖尿病性腎病之〔19〕之抗體。
依據本發明，提供與傳統之抗人類CTGF抗體比較，結合活性及/或中和活性佳之抗人類CTGF抗體。本發明之抗人類CTGF抗體係藉由抑制人類CTGF機能，具有強力的抗纖維化作用者，有效地預防或治療人類CTGF參與病態形成之各種疾病。因此，如此的本發明之抗人類CTGF抗體係對投與量減低、擴大投與間隔、改善投與方法(例如皮下注射劑)等之臨床適用，帶來良好的改善，寄予大幅改善治療有效性及患者之遵從性。
用以實施發明之最佳型態
後述詳細地說明本發明。
本發明者等係於製作抗人類CTGF抗體，重複相當的創意檢討之結果，與傳統的抗人類CTGF抗體比較，改善 結合活性，成功地製作中和活性佳之抗人類CTGF抗體。
抗體分子之基本結構係各類共通地由分子量5萬~7萬之重鏈與2~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常係由約含440個胺基酸之聚胜肽鏈而成，各類具有特徵的結構，對應IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，稱為γ、μ、α、δ、ε鏈。進而，IgG存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分別稱為γ 1、γ 2、γ 3、γ 4。輕鏈通常係由約含220個胺基酸之聚胜肽鏈而成，已知有L型及K型2種，分別稱為λ、κ鏈。抗體分子之基本結構之胜肽結構係分別相同的2股重鏈及2股輕鏈，由雙硫鏈(S-S鍵)及非共價鏈所鍵結，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈係可與任何重鏈成對。各個抗體分子經常由2股相同的輕鏈與2股相同的重鏈而成。
鏈內S-S鍵係重鏈有四個(μ、ε鏈有五個)，輕鏈有二個，每胺基酸為100~110個之殘基形成一個圈，此立體結構係各圈間相似，稱為結構單位或區域。重鏈、輕鏈皆位於N端之區域係即使來自同種動物之同一類(副類)之標準品，其胺基酸序列並不一定，稱為可變區，各區域係分別稱為重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。據此C端側之胺基酸序列係各個分類或副類大致一定，稱為恆定區(各區域係分別表示為CH1、CH2、CH3或CL)。
抗體的抗原決定部份係藉由VH及VL所構成，結合之特異性係依據此部份之胺基酸序列。另一方面，所謂的與 補體或各種細胞之結合之生物學活性係反映於各類Ig之恆定區之結構差異。已知輕鏈及重鏈之可變區之可變性係大致局限於任一種鏈皆存在之3個小的超可變區，稱此等區域為互補性決定區(CDR；自N端側分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區剩餘的部份係稱為骨架區(FR)，係比較恆定的。
本發明者等成功地製作本發明之抗人類CTGF抗體係具有後述特徵之抗人類CTGF抗體。
含序列號碼10所示之胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列號碼4所示之胺基酸序列而成之輕鏈可變區之抗人類CTGF抗體。
具體上，本發明者等係使用人類單株抗體開發技術「VelocImmune」(VelocImmune antibody technology；Regeneron社(美國專利6596541號))小鼠，製作抗體，藉由使用各種生物學的活性試驗及物性試驗之抗體篩選，成功地鑑定本發明之抗人類CTGF抗體。VelocImmune技術係將內因性之免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區為對應之人類可變區所取代之基因重組小鼠，以目的抗原(例如人類CTGF)進行免疫後，取得表現抗體之小鼠之淋巴系細胞，藉由與小鼠之骨髓瘤細胞進行細胞融合，製作融合瘤。接著，將此融合瘤細胞，對於是否產生特異性地結合於目的抗原之抗體，進行篩選。在此所產生的抗體係具有人類抗體之可變區與小鼠抗體之恆定區之抗體(亦稱為複合抗體)。接著，鑑定特異性地結合於目的 抗原之抗體時，自其融合瘤細胞單離編碼抗體之重鏈及輕鏈之可變區之DNA，將該DNA連結於編碼所需類別之人類抗體重鏈及輕鏈之恆定區之DNA。使如此所得之編碼重鏈及輕鏈之基因於細胞內(例如CHO細胞)表現，產生抗體分子。依該方法所製作之抗體之重鏈及輕鏈係來自人類免疫球蛋白基因之「完全人類型」抗體之重鏈及輕鏈。
本發明之抗人類CTGF抗體係基於本申請說明書所揭示之其重鏈可變區及輕鏈可變區之序列訊息，使用該領域已知方法，藉由該業者而可容易製作。適宜的是本發明之抗人類CTGF抗體係將其重鏈可變區及輕鏈可變區，分別連結於人類抗體之重鏈恆定區及輕鏈恆定區，可製作完全人類型抗體。具體上，製作具有編碼本發明之抗體之重鏈可變區胺基酸(序列號碼10)之鹽基序列之重鏈可變區基因片段、及具有編碼本發明之抗體之輕鏈可變區胺基酸(序列號碼4)之鹽基序列之輕鏈可變區基因片段。接著，使此可變區基因與人類抗體之適當類之恆定區基因連結，製作完全人類型抗體基因。接著，連結此抗體基因於適當之表現載體，導入培養細胞中。最後，培養此培養細胞，自培養上澄液，可得到單株抗體。
編碼本發明之抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸之基因片段係例如基於依據該重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列所設計之鹽基序列，利用該領域已知之基因合成方法而可合成。作為如此基因合成方法，可使用WO90/07861記載之抗體基因之合成方法等之該基者已知 之各種方法。
接著，使前述之可變區基因片段及人類抗體之恆定區基因連結，製作完全人類型抗體基因。所使用之人類抗體之恆定區，雖亦可選擇任何之副類恆定區(例如作為重鏈之γ 1、γ 2、γ 3或γ 4，作為輕鏈之λ或κ鏈之恆定區)，但可使用作為重鏈恆定區之人Igγ 1，以及作為輕鏈恆定區之人Igκ為宜。
製作此完全人類型抗體基因後，接著關於導入抗體基因於表現載體、導入表現載體於培養細胞、培養培養細胞、精製抗體等，可使用該領域已知之各種方法進行。
作為如前述所得之與抗體基因所連結之表現載體，可舉例如GS載體pEE6.4或pEE12.4(Lonza Biologics社)，但只要可表現抗體基因者即可，並無特別限制。另外，亦可使用AG-γ 1或AG-κ(例如參考WO94/20632)等之預先具有人Ig恆定區基因者。
前述之表現載體係藉由例如磷酸鈣法、電穿孔法等，導入於培養細胞中。
作為導入表現載體之培養細胞，例如可使用CHO-K1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等之培養細胞，將其藉由常法培養即可。
前述培養後，培養上澄液中所累積之抗體係可藉由各種管柱層析法，例如使用蛋白質A或蛋白質G管柱之各種層析法精製。
本發明之抗人類CTGF抗體係結合於人類CTGF的抗 體。作為測定所得之抗人類CTGF抗體對人類CTGF之結合活性之方法，有ELISA或表面電漿共振(SPR)分析等之方法。例如，使用ELISA時，固定人類CTGF(序列號碼14)於ELISA盤，對此添加抗人類CTGF抗體，使反應後，使以辣根過氧化酶(HRP)等之酵素標記之抗IgG抗體等之二次抗體反應，洗淨後，加入發色基質(例如HRP標記時，TMB發色試劑)，測定吸光度。另外，使用SPR分析，可更詳細地測定對人類CTGF之結合活性。進行SPR分析時，例如藉由使用Biacore系統，測定抗人類CTGF抗體與人類CTGF之結合速度常數(ka)及解離速度常數(kd)，由2個常數的比，可算出解離常數(KD)。本發明之抗人類CTGF抗體亦包含結合於來自其他動物之CTGF(例如小鼠CTGF)的抗體，亦可測定對此等蛋白質之結合活性。
另外，本發明之抗人類CTGF抗體係具有對人類CTGF之中和活性。本說明書中使用時，所謂抗體之「中和活性」係指抑制因對CTGF之結合而介在CTGF所帶來之任意的生物活性之活性，可評估CTGF之1種或多數生物活性為指標。作為如此中和活性，可舉例如來自腎臟之纖維母細胞之抑制膠原蛋白合成(抑制纖維化)作用，可藉由使用如後述實施例所記載之方法而評估。
為更詳細地評估本發明之抗人類CTGF抗體之效果，亦可使用抗體之in vivo之藥效試驗。例如藉由如後述實施例所記載之使用小鼠慢性腎臟病模式或大鼠慢性腎炎模 式之腎機能評估，可評估抗體於in vivo之藥效。
其他，作為評估本發明之抗人類CTGF抗體之各種安定性(例如熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性)之方法，可舉例如利用示差掃描熱量測定或保存中凝聚體形成之測定之方法。
適宜的是本發明之抗人類CTGF抗體係使用該領域已知之方法，合成含編碼序列號碼10所示之重鏈可變區之胺基酸序列之鹽基序列之DNA、及合成含編碼序列號碼4所示之輕鏈可變區之胺基酸序列之鹽基序列之DNA，將此等與適當類別之人類抗體恆定區基因，適宜的是對於重鏈係人Igγ 1恆定區基因，對於輕鏈係人Igκ恆定區基因連結，建構完全人類型抗體基因，使用該領域已知之各種方法，藉由導入該完全人類型抗體基因於表現載體，導入該表現載體於培養細胞，培養該培養細胞，自所得之培養物精製抗體，可容易取得。含編碼序列號碼10所示之重鏈可變區胺基酸序列之鹽基序列之DNA係包含序列號碼9所示之鹽基序列為宜。含編碼序列號碼4所示之輕鏈可變區胺基酸序列之鹽基序列之DNA係包含序列號碼3所示之鹽基序列為宜。
含序列號碼10所示之重鏈可變區及人Igγ 1恆定區之本發明適合的抗人類CTGF抗體重鏈係由序列號碼12所示之胺基酸序列而成之重鏈。含序列號碼4所示之輕鏈可變區及人Igκ恆定區之本發明適合的抗人類CTGF抗體輕鏈係由序列號碼8所示之胺基酸序列而成之輕鏈。含編 碼由序列號碼12所示之胺基酸序列而成之抗人類CTGF抗體重鏈之鹽基序列之DNA係包含序列號碼11所示之鹽基序列為宜。含編碼由序列號碼8所示之胺基酸序列而成之抗人類CTGF抗體輕鏈之鹽基序列之DNA係包含序列號碼7所示之鹽基序列為宜。作為含由序列號碼12所示之胺基酸序列而成之重鏈與由序列號碼8所示之胺基酸序列而成之輕鏈之本發明之抗人類CTGF抗體，可列舉後述實施例所記載之完全人類型37-45-MH1。
本發明亦包含含有含由序列號碼10之第31~35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列號碼10之第50~66之胺基酸序列而成之CDR2、由序列號碼10之第99~108之胺基酸序列而成之CDR3之重鏈可變區，以及含由序列號碼4之第24~35之胺基酸序列而成之CDR1、由序列號碼4之第51~57之胺基酸序列而成之CDR2、由序列號碼4之第90~98之胺基酸序列而成之CDR3之輕鏈可變區之抗人類CTGF抗體。如此之抗人類CTGF抗體亦又依據如前述之步驟，該業者可容易製作。
本發明亦包含含本發明之抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區，保持活性之單股可變區片段(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2等之抗人類CTGF抗體片段。另外，若為該業者，基於本發明，亦可製作該抗人類CTGF抗體或抗體片段與其他胜肽或蛋白質之融合抗體、或製作使結合修飾劑之修飾抗體。融合所使用之其他胜肽或蛋白質係只要不使抗體之結合活性降低者，並無特別限定，可舉例如人類白 清白蛋白、各種tag胜肽、人工螺旋模體胜肽、結合麥芽糖之蛋白質、穀胱甘肽硫轉移酶、各種毒素、其他可促進多量體化之胜肽或蛋白質等。修飾所使用之修飾劑係只要不使抗體之結合活性降低者，並無特別限定，可舉例如聚乙二醇、糖類、磷脂質、微脂粒、低分子化合物等。
如此所得之本發明之抗人類CTGF抗體係因應需要，更進一步精製後，依據常法所製劑化，可使用於預防、治療慢性腎臟病、糖尿病性腎病等之腎病、血管增殖性疾病、心肌症、肝臟纖維增殖病、肺纖維病、皮膚纖維化疾病、糖尿病性網膜症、癌等之CTGF參與病態形成之各種疾病。
本發明之抗人類CTGF抗體係可作為腎病治療劑為宜，以慢性腎臟病或糖尿病性腎病之治療劑尤佳。作為此等治療劑等之劑型例，可為注射劑、點滴用劑等之非經口劑，以藉由靜脈內投與、皮下投與等投與為宜。另外，關於製劑化，於藥學上所容許之範圍，可使用因應此等劑型之載體或添加劑。
關於前述製劑化之本發明之抗人類CTGF抗體之添加量雖依患者症狀之程度或年齡、使用製劑之劑型、或抗體之結合力價而異，但使用例如0.001mg/kg至100mg/kg程度為宜。
本發明又提供含編碼本發明之抗人類CTGF抗體之序列之聚核苷酸及含其之表現載體。本發明又提供含編碼本發明之抗人類CTGF抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷 酸、及含編碼本發明之抗CTGF抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸、以及含此等中任一種或二者之表現載體。本發明之表現載體係於原核細胞及/或真核細胞之各種宿主細胞中，表現編碼本發明之抗體或其重鏈可變區及/或輕鏈可變區之基因，只要可產生此等多胜肽者即可，並無特別限定。可舉例如質體載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒)等。適宜的是本發明之表現載體係含有含編碼前述之本發明之抗體之重鏈或輕鏈之序列之聚核苷酸，或含有含編碼本發明之抗體之重鏈之序列之聚核苷酸與含編碼本發明之抗體之輕鏈之序列之聚核苷酸二者。
本發明之表現載體可含有對編碼本發明之抗人類CTGF抗體或其重鏈可變區及/或輕鏈可變區之基因，可機能性連結之啟動子。作為細菌中使編碼本發明之抗體或其重鏈可變區及/或輕鏈可變區之基因表現用之啟動子，宿主為大腸桿菌屬菌時，可舉例如Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λ PL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為酵母中之表現用啟動子，可舉例如PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子，作為芽孢桿菌屬菌之表現用啟動子，可舉例如SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。另外，宿主為哺乳動物細胞等之真核細胞時，可舉例如來自SV40之啟動子、反轉錄病毒之啟動子、熱休克蛋白啟動子等。
使用細菌，尤其大腸菌作為宿主細胞時，本發明之表現載體進一步可含開始密碼、終止密碼、終止子 (terminator)區及可複製單位。另一方面，使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞作為宿主時，本發明之表現載體係可含開始密碼、終止密碼。另外，此時可含有增強子序列、編碼本發明之抗體或其重鏈可變區或輕鏈可變區之基因之5'端及3'端之非轉譯區域、分泌訊號序列、剪接位、多聚腺苷酸化點、或可複製單位等。另外，因應目的，亦可含通常所使用之篩選標記(例如四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、卡納黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因)。
本發明又提供導入編碼本發明之抗體或其重鏈可變區及/或輕鏈可變區之基因之轉型株。如此之轉型株係可藉由例如以本發明之表現載體將宿主細胞轉型而製作。作為製作轉型株所使用之宿主細胞，只要適合前述之表現載體，可被轉型者即可，並無特別限定，例如本發明之技術領域中通常所使用之天然細胞或人工所建立的細胞等之各種細胞(例如細菌(大腸桿菌屬菌、芽孢桿菌屬菌)、酵母(酵母菌屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如Sf9等)。轉型係可藉由本身已知之方法進行。
適宜的是本發明之轉型株係以含有含編碼本發明之抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸與含編碼本發明之抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞，或以含有含編碼本發明之抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體與含有含編碼本發明之抗體之輕鏈 可變區之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞。更適宜的是本發明之轉型株係以前述之含有含編碼本發明之抗體之重鏈之序列之聚核苷酸與含編碼本發明之抗體之輕鏈之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞，或以前述之含有含編碼本發明之抗體之重鏈之序列之聚核苷酸之表現載體與含有含編碼本發明之抗體之輕鏈之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞。
本發明又提供包含使編碼本發明之抗體或其重鏈可變區及/或輕鏈可變區之基因於宿主細胞表現，亦即使用如此之轉型株之本發明之抗人類CTGF抗體之生產方法。適宜的是於該方法所使用之宿主細胞係前述之以本發明之表現載體所轉型之宿主細胞，該表現載體係可分別或同時含有含編碼本發明之抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸與含編碼本發明之抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸。
本發明之抗人類CTGF抗體之生產中，轉型株係可於營養培養基中所培養。營養培養基係以含有轉型株生長發育所需之碳源、無機氮源或有機氮源為宜。作為碳源，例如葡萄糖、糊精、可溶性澱粉、蔗糖等，作為無機氮源或有機氮源，可舉例如銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸漬液(Corn steep liquor)、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。另外，依據所需，可含有其他營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生物(例如四環黴素、新黴素、安比西林、卡納黴素等)等)。
轉型株之培養係藉由本身已知之方法所進行。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間係可適當選擇。例如宿主為動物細胞時，作為培養基，可使用含約5~20%之胎兒牛血清之MEM培養基(Science,Vol.122,p.501,1952)、DMEM培養基(Virology,Vol.8,p.396,1959)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199培養基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.,Vol.73,p.1,1950)等。培養基之pH係以約6~8為宜，培養通常係於約30~40℃，進行約15~72小時，因應需要，亦可進行通氣或攪拌。宿主係昆蟲細胞時，可舉例如含胎兒牛血清之Grace's培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.8404,1985)等，其pH係以約5~8為宜。培養通常係於約20~40℃，進行約15~100小時，因應需要，亦可進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放射線菌、酵母、絲狀菌時，例如含有前述營養源之液體培養基係適當的。適合的是pH5~8之培養基。宿主為E.coli時，作為適合的培養基，可列舉LB培養基、M9培養基(Miller等，Exp.Mol.Genet,Cold Spring Harbor Laboratory,p.431,1972)等。操作時，培養係因應需要，於通氣、攪拌下，通常14~43℃，可進行約3~24小時。宿主為芽孢桿菌屬菌時，因應需要，於通氣、攪拌下，通常30~40℃，可進行約16~96小時。宿主為酵母時，作為培養基，可舉例如Burkholder最小培養基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77,p.4505,1980)，pH 係以5~8為宜。培養通常係於約20~35℃，進行約14~144小時，因應需要，亦可進行通氣或攪拌。
本發明之抗人類CTGF抗體係培養如前述之轉型株，可自該轉型株回收，以單離、精製為宜。作為單離、精製方法，可舉例如鹽析、溶劑沈澱法等之利用溶解度之方法、透析、超濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳等之利用分子量差異之方法、離子交換層析或氫氧基磷灰石層析等之利用電荷之方法、親和層析等之利用特異的親和性之方法、逆相高效液相層析法等之利用疏水性差異之方法、等電點電泳等之利用等電點差異之方法等。
整體地記載關於本發明，進一步為取得理解，在此提供參考之特定實施例，但此等為舉例的目的，本發明並非受限定者。
實施例
關於使用市售的試劑組或試藥等之部份，除非特例，皆依添附的協定進行實驗。
(實施例1：取得各種來源之CTGF蛋白質)
本發明者等，取得人類CTGF蛋白質作為用以製作抗人類CTGF抗體之抗原。將人類CTGF之全長基因(序列號碼13)嵌入表現載體(pcDNA3.1；Invitrogen社)，將 製作的載體，使用基因導入試劑之FreeStyle MAX Reagent(Invitrogen社)，導入基因於FreeStyle 293細胞(Invitrogen社)。將此細胞，以使用FreeStyle 293 Expression Medium(Invitrogen社)之無血清培養系培養後，取得含人類CTGF蛋白質之培養上澄液。自取得之培養上澄液，使用HiTrap肝素管柱及CM管柱(GE Healthcare Japan社)精製蛋白質，使用於下述實驗。關於小鼠、大鼠及猴子CTGF蛋白質，亦使用相同方法取得。
(實施例2：對VelocImmune小鼠之免疫)
藉由對VelocImmune小鼠之免疫而取得對人類CTGF之抗體。本發明者等為提高所得抗體之多樣化，檢討複數的免疫方法、投與途徑、佐劑、免疫期間等。作為免疫原係使用精製之人類CTGF，與佐劑混合後，進行免疫。作為投與途徑，檢討腳趾投與與腹腔投與。作為佐劑，檢討TiterMax Gold(CytRx Corporation)、佛朗氏完全佐劑(Sigma社)及佛朗氏不完全佐劑(Sigma社)。進而，作為添加之免疫賦活劑，檢討CpG寡核苷酸及Aluminum Phosphate Gel(BRENNTAG社)。作為免疫期間，檢討3週~14週。數次免疫後，由小鼠尾靜脈進行採血，偵測力價，進行產生結合於人類CTGF之抗體之VelocImmune小鼠選擇。
力價測定係使用後述標準的ELISA方法進行測定。於 Maxisorp384盤(Nunc社)，添加20μl之人類CTGF磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)(1μg/ml)，於4℃培養一晚而固體化。隔天，將盤以100μl之洗淨液(TBST：含有0.05% Tween-20之Tris-buffer)洗淨一次後，添加100μl之阻斷劑(含有1% BSA之PBS)，於室溫靜置1小時。以100μl之TBST洗淨液洗淨一次後，製作採血之血漿之稀釋系列而添加。於室溫培養1小時後，以100μl之TBST洗淨液洗淨三次，添加20μl之以含有0.1% BSA之TBST洗淨液稀釋成5000倍之辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG抗體(HRP-goat anti-mouse IgG antibody；Zymed社)。於室溫下培養1小時後，以100μl之TBST洗淨液洗淨三次。加入40μl之TMB發色試劑(住友bakelite社)，於室溫下靜置10分鐘後，加入40μl之停止液(2mol/l硫酸)，使反應停止，測定450nm之吸光度。
(實施例3：製作產生抗人類CTGF抗體之融合瘤)
對確認抗體上升而選擇之小鼠，進行最終免疫(抗原之靜脈內投與或腹腔內投與)。依據規定方法，取出經免疫之小鼠脾臟或淋巴節等，收集淋巴球，將此與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，製作融合瘤。將融合瘤極限稀釋，形成單一選殖體，並自上澄液，使用蛋白質A或蛋白質G管柱(GE Healthcare Japan社)精製抗體。
(實施例4：ELISA分析)
本發明者等係使用ELISA方法，評估抗體對CTGF之結合特異性。於Maxisorp384盤(Nunc社)，添加20μl之人類CTGF之PBS溶液(1μg/ml)，於4℃培養一晚而固體化。隔天，將盤以100μl之洗淨液(TPBS：含有0.05% Tween-20之PBS)洗淨一次後，添加100μl之阻斷劑(含有1% BSA之PBS)，於室溫靜置1小時。以100μl之TBST洗淨液洗淨一次後，將精製抗體樣品，製作適當的稀釋系列而添加。於室溫培養1小時後，以100μl之TBST洗淨液洗淨三次，添加20μl之以含有0.1% BSA之TBST洗淨液稀釋成5000倍之辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG抗體(HRP-goat anti-mouse IgG antibody；Zymed社)。於室溫下培養1個小時後，以100μl之TBST洗淨液洗淨三次。加入40μl之TMB發色試劑(住友bakelite社)，於室溫下靜置10分鐘後，加入40μl之停止液(2mol/l硫酸)，使反應停止，測定450nm之吸光度。對各抗體以複製(duplicate)進行試驗，藉由符合曲線分析EC50。
此結果係確認命名為37-45之抗體，具有高結合活性(EC50：1.6ng/ml)。
(實施例5：抗體之序列決定)
對於所鑑定之抗體37-45，本發明者等自融合瘤選殖編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因。自融合瘤萃取RNA，使用cDNA增幅試劑組(SMARTer RACE cDNA Amplification kit；Clontech社)，製作cDNA。接著，使用PCR，延長及增幅重鏈及輕鏈之可變區。將PCR產物，對pCR3.1-TOPO(Invitrogen社)等之PCR產物次選殖(Subcloning)用載體進行重組後，使用定序儀(ABI PRISM 3100；Applied Biosystems社)，決定基因序列。
分別表示，所決定之37-45之重鏈可變區之鹽基序列為序列號碼1，胺基酸序列為序列號碼2，37-45之輕鏈可變區之鹽基序列為序列號碼3，胺基酸序列為序列號碼4。
(實施例6：製作完全人類型抗體)
前述抗體係可變區來自人類，恆定區來自小鼠的抗體。因此，本發明者等係將來自小鼠的恆定區，取代成來自人類之恆定區，製作完全人類型抗體(完全人類型37-45)。具體上，分別於抗體之重鏈可變區基因之5'端，連接訊號序列，接著3'端連接人Igγ 1之恆定區基因(Man Sung Co等，(1992)J Immunol.Vol.148(4)：1149-1154)，插入此重鏈基因於GS載體(Lonza Biologics社)pEE6.4。插入時，將基因中之限制酵素BbvCI識別位點，改變成不對抗體胺基酸序列造成影響之DNA序列。另外，分別於抗體之輕鏈可變區基因之5'端，連接訊號序列，接著3'端連接人κ鏈之恆定區基因(Man Sung Co等，前出)，插入此輕鏈基因於GS載體pEE12.4。
分別表示製作之完全人類型37-45之重鏈之鹽基序列 為序列號碼5，胺基酸序列為序列號碼6，該抗體之輕鏈之鹽基序列為序列號碼7，胺基酸序列為序列號碼8。
(實施例7：製作可變區之糖鏈修飾部位之突變株)
前述之完全人類型37-45之重鏈可變區胺基酸係包含於N-X-(T/S)之N型糖鏈修飾模體(motif)序列。具體上，序列號碼2所示之重鏈可變區中，依據Kabat編號，第58個Asn符合糖鏈修飾部位。已知糖鏈修飾部位存在時，細胞培養間發生糖鏈附加於抗體，但糖鏈附加係依賴培養條件或使表現之宿主。亦即，即使建立相同的抗體產生細胞，仍有依培養條件(培養基、細胞密度等)而糖鏈附加程度改變之可能性，有難以取得均勻品質之抗體醫藥品之可能性。因此，本發明者等係製作於完全人類型37-45之重鏈可變區，導入突變之完全人類型抗體(完全人類型37-45-MH1)。
分別表示製作之完全人類型37-45-MH1之重鏈可變區之鹽基序列為序列號碼9，胺基酸序列為序列號碼10。分別表示製作之完全人類型37-45-MH1之重鏈之鹽基序列為序列號碼11，胺基酸序列為序列號碼12。完全人類型37-45-MH1之輕鏈係與完全人類型37-45之輕鏈相同。
完全人類型37-45-MH1抗體之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3係分別依據Kabat編號之重鏈可變區之第31~35、第50~65及第95~102區域，分別由序列號碼10之第31~35、第50~66及第99~108胺基酸序列而 成。完全人類型37-45-MH1抗體之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3係分別依據Kabat編號之輕鏈可變區之第24~34、第50~56及第89~97區域，分別由序列號碼4之第24~35、第51~57及第90~98胺基酸序列而成。
(實施例8：完全人類型抗體之發現及精製)
將分別插入前述各抗體(完全人類型37-45及完全人類型37-45-MH1)之重鏈與輕鏈之基因之前述GS載體，於Not I及Pvu I，以限制酵素切斷，使用Ligation-Convenience Kit(NIPPONGENE社)或Ligation-high(TOYOBO社)，進行接合(ligation)，建構插入重鏈與輕鏈之兩基因之GS載體。此載體係編碼全長之重鏈及輕鏈與麩胺酸合成酵素(Glutamine synthetase)，藉由轉殖(Transfection)於CHO-K1SV細胞，使抗體表現。將培養上澄液，以蛋白質A或蛋白質G管柱(GE Healthcare Japan社)精製，得到各完全人類型抗體之精製抗體。
(實施例9：完全人類型抗體之ELISA分析)
本發明者等係使用ELISA方法，評估前述實施例製作之完全人類型37-45及完全人類型37-45-MH1之對人、小鼠、大鼠及猴子CTGF之結合特異性。在此，雖使用與實施例4記載之方法相同的方法，但作為二次抗體係使用以含有0.1% BSA之TBST洗淨液稀釋成5000倍之辣根過氧 化酶標記兔子抗人IgG抗體(HRP-rabbit anti-human IgG antibody；DAKO社)。對各抗體以複製(duplicate)進行試驗，藉由符合曲線分析EC50。
其結果，可知任一種完全人類型抗體，對人、小鼠、大鼠及猴子CTGF具有相同程度之結合能力。
(實施例10：藉由SPR分析，評估結合活性)
本發明者等為更詳細地測定完全人類型37-45-MH1之抗原特異之結合活性，進行表面電漿共振(SPR)分析。本實施例係使用抗人類CTGF抗體CLN1(專利文獻2)作為比較抗體。
於SPR分析中，使用Biacore2000(GE Healthcare Japan社)，進行分析。於Sensor Chip CM5之表面，使用Human Antibody Capture Kit及Amine Coupling Kit(GE Healthcare Japan社)，將抗CTGF抗體固體化。將實施例1取得之人類CTGF，以HBS-EP溶液(GE Healthcare Japan社)梯度稀釋，以流速50μl/分，添加100μl於流動通路。藉由此測定系統，使用數據分析軟體 (BIA Evaluation)，計算人類CTGF蛋白質與抗CTGF抗體之結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及解離常數(KD)。
此結果係確認完全人類型37-45-MH1與抗體CLN1之活性比較，具有約12倍高之對人類CTGF之結合活性。
(實施例11：來自大鼠腎細胞中膠原蛋白合成之抑制作用)
本發明者等為測定完全人類型37-45-MH1之抗原特異之中和活性，檢討對大鼠纖維母細胞NRK-49F中TGFβ誘發性之膠原蛋白合成之抑制效果。本實施例係使用CLN1作為比較抗體。
NRK-49F細胞(自ATCC取得)係藉由添加TGFβ而產生CTGF。將NRK-49F細胞，接種於含有10%FCS之DMEM培養基之24孔培養盤(5×104細胞)，24小時後，改變成含有0.01%FCS之DMEM(500μl)。進一步於24小時後，加入TGFβ(R&D Systems；1ng/ml)於培養基。於添加TGFβ 1小時前，添加抗人類CTGF抗體(完全人類型37-45-MH1或CLN1)(1μg/ml、3μg/ml、 10μg/ml之3組)。72小時後，回收上澄液，進行SDS-PAGE，使用Anti-Collagen I antibody(Abcam社)，依據常法，進行西方墨點法(Western blotting)分析。其結果係確認完全人類型37-45-MH1為濃度依賴的，與CLN1比較，具有強的膠原蛋白合成抑制能力。
(實施例12：小鼠殘存腎臟模式之腎機能評估試驗)
腎絲球體硬化或尿細管變性係於引起慢性腎臟病之各種腎障礙共同呈現所見。此慢性腎臟病係可以呈現持續惡化性腎障礙之小鼠殘存腎臟模式進行檢討。此模式係藉由取出2/3個單側腎與全部取出另一側腎(取出5/6個腎)，對腎施以負擔，誘發明顯的蛋白質尿及腎機能降低，病理組織學上顯示腎絲球體硬化或尿細管變性，顯示輕度間質纖維化(參考例如Kidney International,64,350-355,2003)。
取出5/6腎係參考Zhang等之方法(Kidney International,56,549-558,1999)而進行。9週齡之雄性小鼠ICR(日本SLC，靜岡縣濱松市)，腹腔內投與戊巴比妥(50mg/kg)，進行麻醉，切除左腎頭側1/3個及尾側1/3個。自最初的手術1週後，腹腔內投與戊巴比妥(50mg/kg)，進行麻醉，完全取出右側腎臟，完成取出5/6個腎。
取出5/6個腎後，於1週後進行取尿及抽血，測定尿中蛋白質排泄率及腎機能參數(血中肌酸酐濃度及肌酸酐清除率)。蛋白質濃度測定係以Bradford法進行(Bio- Rad Laboratories)。肌酸酐濃度係使用CRE-EN KAINOS(KAINOS社)測定。尿中蛋白質排泄率係以尿中肌酸酐濃度(mg/dl)修正尿中蛋白質濃度(mg/ml)而算出。以此等尿中蛋白質排泄率、血中肌酸酐濃度及肌酸酐清除率為指標，分組成溶劑處理組(投與pH7.4之磷酸緩衝溶液)或抗體投與組(1組15例)。投與抗體用量係設定0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg三組，開始試驗。磷酸緩衝溶液或完全人類型37-45-MH1係每週1次，於背部進行皮下注射(合計投與6次)。試驗開始時、自試驗開始第4週及第6週，採取尿樣品及血液樣品，測定尿中蛋白質排泄率、血中肌酸酐濃度及肌酸酐清除率。
關於尿中蛋白質排泄率，於試驗開始之時間點，溶劑處理組與正常組比較，尿中蛋白質排泄率增加(正常組為5.1±0.4；溶劑處理組為9.7±0.7(P<0.01))。自試驗開始第4週及第6週，溶劑處理組與正常組比較，尿中蛋白質排泄率增加。相對於此，抗體投與組(1mg/kg組及2mg/kg組)，統計學上無有意義差，但與溶劑處理組比較，依賴投與量地尿中蛋白質排泄率減少。
關於血中肌酸酐濃度，於試驗開始之時間點，溶劑處理組與正常組比較，血中肌酸酐濃度上升(正常組為0.36±0.013mg/dl；溶劑處理組為0.53±0.016mg/dl(P<0.01))。之後，於第4週、第6週，溶劑處理組與正常組比較，血中肌酸酐濃度上升(第4週：正常組為0.42±0.025mg/dl；溶劑處理組為0.66±0.037mg/dl(P< 0.01)，第6週：正常組為0.31±0.016mg/dl；溶劑處理組為0.81±0.126mg/dl(P<0.05))。關於抗體投與組，0.5mg/kg組雖無有意差，但與溶劑處理組比較，於第4週、第6週，血中肌酸酐濃度降低。另外，1mg/kg組及2mg/kg組與溶劑處理組比較，有意義地抑制血中肌酸酐濃度上升(第4週：1mg/kg組為0.51±0.022mg/dl(P<0.05)；2mg/kg組為0.51±0.015mg/dl(P<0.05)，第6週：1mg/kg組為0.55±0.043mg/dl(P<0.05)；2mg/kg組為0.49±0.024mg/dl(P<0.01)。
關於肌酸酐清除率(尿中肌酸酐濃度×24小時的尿量/血中肌酸酐濃度)，於試驗開始之時間點，溶劑處理組與正常組比較，認為肌酸酐清除率減少(正常組為1.8±0.18；溶劑處理組為1.3±0.08(P<0.01))。之後，於第4週、第6週，溶劑處理組與正常組比較，肌酸酐清除率降低(第4週：正常組為2.1±0.16；溶劑處理組為1.6±0.16，第6週：正常組為2.8±0.29；溶劑處理組為1.4±0.17(P<0.001))。關於抗體投與組，0.5mg/kg組與溶劑處理組比較，認為未抑制肌酸酐清除率降低。相對於此，1mg/kg組於第4週、第6週，與溶劑處理組比較，有意義地抑肌酸酐清除率降低(第4週：溶劑處理組為1.6±0.16；1mg/kg組為2.1±0.11(P<0.05)，第6週：溶劑處理組為1.4±0.17；1mg/kg組為2.0±0.18(P<0.05))。另外，2mg/kg組，於第6週與溶劑處理組比較，有意義地抑制肌酸酐清除率降低(第6週：溶劑處理 組為14±0.17；2mg/kg組為1.9±0.14(P<0.05)。
由此等結果，可確認完全人類型37-45-MH1於慢性腎臟病模式中，抑制腎機能降低。
(實施例13：大鼠腎臟模式之藥理評估試驗)
大鼠抗Thy1.1模式係藉由注入對腎絲球體之腎膈細胞表面之Thy抗原之抗體而使發病之經確立之腎膈細胞增殖性腎絲球體腎炎模式(例如參考Yamamoto及Wilson,1987 Kidney Int.32：514-25,Morita等，1998 Am J Kidney Dis 31：559-73)。本模式係融解腎膈細胞後，腎膈細胞增殖及細胞外基質增加，尿蛋白質上升(例如參考Floege等，1991 Kidney Int.40：477-88,Ito等，2001 J Am Soc Nephrol.12：472-84)。抗Thy1.1模式係與人類之IgA腎病或過敏性紫斑症(Henoch-Schönlein purpura)類似，使用本模式，以蛋白尿為指標，可預測病態的發展(例如參考Kasuga等，2001 Kidney Int.60：1745-55,Liu等，2007 Nephron Exp Nephrol.105：e65-74)。
將抗Thy1.1抗體(Anti-Rat CD90(Thy1.1)monoclonal antibody-ascites；CEDARLANE社)，以生理食鹽水調製成0.1g/ml，對大鼠藉由靜脈內投與(每100g體重為200μl)而使腎炎發病。投與抗Thy1.1抗體4小時後，靜脈內投與完全人類型37-45-MH1(0.5mg/kg、1mg/kg或2mg/kg)或溶劑(PBS)。自誘發病態3至4天後，進行24小時採尿，測定尿中蛋白質之24小時排泄量 (UP)及尿中蛋白質排泄率(UP/uCr：以尿中肌酸酐濃度(mg/dl)修正尿中蛋白質濃度(mg/ml))。其結果如表3(UP)及表4(UP/uCr)表示。
其結果係完全人類型37-45-MH1為用量依賴地抑制蛋白尿，對2mg/kg組對溶劑投與組之抑制率，以UP為指標時為27.2%，UP/uCr為46.0%。
接著，於確認與CLN1作用強度之差異為目的，進行相同模式評估。評估步驟係與前述相同。評估係參考前述有效用量。以完全人類型37-45-MH1之2mg/kg為陽性對照，使用CLN1之2mg/kg及10倍用量之20mg/kg。另外，調查因異種抗體處理之非特異的免疫反應之相關為目的，以人類型IgG1抗體(抗KLH(鑰孔蟲戚血藍蛋白)抗體：以KLH對VelocImmune小鼠進行免疫，取得抗體。之後，與完全人類型37-45-MH1同樣地製作完全人類型IgG1抗體)之2mg/kg及20mg/kg為對照組。該結果如表5(UP)及表6(UP/uCr)所示。
其結果，病態係與前次大約相同的發病程度。接著，完全人類型37-45-MH1之2mg/kg係表示與前次評估大約相同之抑制率，以溶劑投與組為對照時之抑制率係以UP為指標時，2mg/kg為29.1%，UP/uCr為39.2%。
另一方面，CLN1與完全人類型37-45-MH1相比較，蛋白尿抑制作用弱(2mg/kg時，UP及UP/uCr為指標時之對溶劑投與組之抑制率，分別為12.6%及21.5%；20mg/kg時，UP及UP/uCr為指標時之對溶劑投與組之抑制率，分別為3.5%及9.5%)。另外，人類型IgG1抗體對蛋白尿幾乎沒有影響。
由此可確認完全人類型37-45-MH1與CLN1比較，具有強力的蛋白尿抑制作用。
產業上利用性
本發明之抗人類CTGF抗體係有效地預防或治療以慢性腎臟病或糖尿病性腎病等之腎臟病為首之CTGF參與病態形成之各種疾病。
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Claims (11)

  1. 一種抗人類CTGF抗體，其特徵係含序列號碼10所示之胺基酸序列而成之重鏈可變區、及序列號碼4所示之胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗人類CTGF抗體，其中前述抗體之重鏈恆定區為人Igγ 1恆定區。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗人類CTGF抗體，其中前述抗體之輕鏈恆定區為人Igκ恆定區。
  4. 如申請專利範圍第1項之抗人類CTGF抗體，其中前述抗體之重鏈恆定區為人Igγ 1恆定區，前述抗體之輕鏈恆定區為人Igκ恆定區。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗人類CTGF抗體，其含序列號碼12所示之胺基酸序列而成之重鏈、及序列號碼8所示之胺基酸序列而成之輕鏈。
  6. 一種聚核苷酸，其特徵係含編碼如申請專利範圍第1項之抗體之重鏈可變區之序列。
  7. 一種聚核苷酸，其特徵係含編碼如申請專利範圍第1項之抗體之輕鏈可變區之序列。
  8. 一種表現載體，其特徵係含如申請專利範圍第6項及/或第7項之聚核苷酸。
  9. 一種宿主細胞，其特徵係以如申請專利範圍第8項之表現載體所轉型。
  10. 如申請專利範圍第9項之宿主細胞，其係選自後述(a)及(b)所成群， (a)以含有含編碼如申請專利範圍第1項之抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸與含編碼該抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞；及(b)以含有含編碼如申請專利範圍第1項之抗體之重鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體與含有含編碼該抗體之輕鏈可變區之序列之聚核苷酸之表現載體所轉型之宿主細胞。
  11. 一種生產如申請專利範圍第1項之抗人類CTGF抗體之方法，其特徵係包含培養如申請專利範圍第9項或第10項之宿主細胞，使抗人類CTGF抗體表現之步驟。
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