KR20120075457A - 톨-유사 수용체 2에 대한 인간화 항체 및 이의 용도 - Google Patents
톨-유사 수용체 2에 대한 인간화 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하는 완전 인간화 항체는 전체적으로 인간 기원의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 경쇄의 가변 영역은 서열 번호: 1의 서열과 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄 도메인의 가변 영역은 서열 번호: 4의 서열과 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 이러한 항체를 엔코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 특히 톨-유사 수용체 2 활성화 및 신호전달에 의해 매개된 염증성 및 자가면역 질환의 치료를 위한 약제에서의 본 항체의 용도가 제공된다.
Description
본 발명은 완전 인간화 항체 및 이의 단편, 및 특히, 톨-유사 수용체 2 (TLR2, TLR-2)에 대한 결합 특이성을 갖는 완전 인간화 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 톨-유사 수용체 2 활성화 및 신호전달에 의해 매개된 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료 및 예방을 위한 상기 완전 인간화 항체의 용도에 관한 것이다.
톨-유사 수용체 (Toll-like Receptor; TLR)는 선천적 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하는 패턴 인식 수용체의 패밀리(family)를 형성하는 것으로서, 이러한 것들은 또한 조직 손상, 조직 통합성(tissue integrity)의 유지 및 종양 형성에 관여된다. 최근에 인간에게서 11개의 톨-유사 수용체가 확인되었다. 톨-유사 수용체 패밀리의 일원들은 고도로 보존되는데, 대부분의 포유류 종은 10개 내지 15개의 톨-유사 수용체를 가지고 있다. 각 톨-유사 수용체는 특정 병원체-관련 분자 지표를 인식한다. 톨-유사 수용체 2 (TLR2, CD282, TLR-2)는 펩티도글리칸, 지질 단백질, 지질 타이콘산 및 내인성 리간드에 의해 활성화될 수 있다.
톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 모노클로날 항체가 공지되어 있다. WO 01/36488호에는 TL2.1로서 지칭되는 항체가 기재되어 있는데, 이러한 항체는 수탁번호 99102832로 유럽미생물보존센타(ECACC)에 부타페스트 조약에 따라 기탁된 융합 세포주로부터 유래된 것이다. 이러한 항체는 인간 세포 상에서 발현된 톨-유사 수용체 2의 활성화를 길항시킨다.
WO 2005/028509호에는 T2.5로 지칭되는 뮤린 모노클로날 항체(murine monoclonal antibody)가 기재되어 있는데, 이러한 항체는 포유류 TLR2의 활성화를 특이적으로 억제한다. T2.5 모노클로날 항체는 인간형 및 뮤린형의 TLR2 둘 모두에 대해 교차 반응적인 것으로 보인다. 상기 문헌은 WO 01/36488호에 기재된 바와 같은 뮤린 TL2.1 항-TLR2 모노클로날 항체가 상기 특허출원의 상세한 설명에 기술된 바와 같이, 인간형 및 뮤린형의 TLR2 둘 모두에 대해 교차 반응적이지 않다는 것을 제시하는 실험 데이타를 추가로 포함한다. 반대로, WO 2005/028509호에서는 TL2.1 항체는 단지 인간 톨-유사 수용체 2에 결합할 뿐 뮤리 톨-유사 수용체 2에는 결합하지 않는 것으로서 나타내고 있다. WO 2005/028509호의 T2.5 모노클로날 항체는 TLR2의 세포외 도메인에 대비하여 상승되고, 이에 따라 톨-유사 수용체 2의 영역의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다.
WO 2005/019431호에는 TLR2에 대한 결합 특이성을 갖는, 11 G7이라고 명시된 항체가 기재되어 있다. 이러한 뮤린 항체는 명칭 PTA-5014로 미국미생물보존센타 (ATCC)에 수탁된 융합 세포주 11 G7로부터 유래될 수 있다. 11 G7 모노클로날 항체는 TLR2의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하여, 톨-유사 수용체 1(TLR1)과 TLR2 간에 형성된 헤테로다이머(heterodimer)를 활성화시키는 효능제로 자극되는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 의한 시토카인 생산의 유도를 차단시킬 수 있다. 11 G7 항체는 톨-유사 수용체 6(TLR6)과 TLR2 간에 형성된 헤테로다이머를 통해 신호전달을 유발시키는 효능제로 자극된 PBMC에 의한 시토카인 생산을 억제하지 못한다.
생체내 치료학적 적용을 위한 설치류 모노클로날 항체, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체의 사용은 항체가 투여된 피검체에 의해 발생되는 요망되지 않은 면역 반응의 발생과 관련되는 것으로 보인다. 이러한 면역 반응은 치료학적 항체의 효과(effectiveness)를 효과적으로 중화시키는 항체의 생산을 야기시킬 수 있다. 이러한 면역 반응은 통상적으로 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응으로서 칭하여진다. HAMA 반응은 항체의 치료학적 효과를 떨어뜨리는 치료용 항체가 이의 결합 타겟에 도달하는 능력을 손상시킴을 포함하는 여러 가지 방식으로 투여된 항체의 치료학적 효과를 떨어뜨린다.
개체에 투여되는 치료용 항체에 비해 상승되는 원치않는 HAMA 반응의 문제를 다루기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었다. 통상적으로, 이러한 방법들은 마우스 항체의 특정 구성요소를 인간 항체로부터 유래된 동등한 부분으로 대체시키는 기술들을 포함한다. 이러한 방법들은, 예를 들어 인간-유래 불변 영역에 연결된 뮤린 가변 영역을 포함하는 키메라 항체를 생성시킬 수 있다. 대안적으로, "CDR 이식"으로서 공지된 기술이 사용될 수 있는데, 여기서 뮤린 항체로부터의 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 영역들에 의해 제공된 프레임워크(framework)에 이식된다. 이는 뮤린 항체의 결합 특이성을 유지하지만 단지 비-인간 구성요소들이 이식된 뮤린 CDR 영역인 항체를 생성시킨다.
그러나, 이러한 두 가지 방법 모두에서, 얻어진 인간화 항체의 치료학적 효과가 손상될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체의 뮤린 가변 영역 구성요소는 또한 이러한 항체에 대비하여 상승되는 HAMA 반응에 대한 토대를 여전히 제공할 수 있다. 또한, CDR 이식된 인간화 항체가 생산되는 경우에, CDR 영역의 단순 이식이 흔히 항체의 결합 친화성의 감소로 인하여 항체의 치료학적 효능을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
이에 따라, 본 발명자는 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지고 TLR2 기능을 길항시키지만 인간에서 필수적으로 비-면역원성인 완전 인간화 모노클로날 항체를 생성시킬 필요성을 인지하였다. 광범위한 실험 이후에, 본 발명자는 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지고 톨-유사 수용체 2가 톨-유사 수용체 1 또는 톨-유사 수용체 6과 헤테로다이머를 형성시키는 지와는 무관하게 TLR2 기능을 길항시키는 완전 인간화 모노클로날 항체를 생성시켰다. 이러한 TLR2 길항성 항체는 종래에 공지된 키메라 또는 CDR-이식 기술로부터 생성되지 않고, 이에 따라 어떠한 뮤린 아미노산 잔기를 함유하지 않는다. 또한, 이러한 항체는 다른 공지된 톨-유사 수용체 2 길항성 항체의 기능적 요건인 CD32 세포 표면 항원에 결합시킬 필요 없이 TLR2 중화를 매개하는 것으로 보인다. 또한, 본 발명의 완전 인간화 항체는 당해 분야에 공지된 제 1의 완전 인간 TLR2 중화 항체이다. 이러한 항체는 임의의 T 세포 에피토프를 나타내지 않으며, 이에 따라 중화 항체는 피검체에 투여될 때 이에 비해 상승되지 않는다. 항-TLR2 길항성 항체는 광범위한 포유류 세포들에 의해 발현되는 바와 같이 톨-유사 수용체 2에 대한 넓은 수준의 교차-반응성을 추가로 나타내며, 완전 인간화 항체의 결합은 놀랍게도 인간, 마우스, 및 원숭이 세포 상에서 발현되는 톨-유사 수용체 2에 결합하는 것으로 관찰된다.
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 톨-유사 수용체 2(TLR2, CD282, TLR-2)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이 제공되는데, 여기서 항체 또는 항원 결합 부분은 경쇄 및 중쇄를 포함하거나, 이러한 것들로 구성되거나 이러한 것들을 필수적으로 포함하며, 상기 경쇄의 가변 영역(VL)은 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 이러한 서열과 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄의 가변 영역(VH)은 서열번호 4의 아미노산 서열과 동일하거나 이러한 서열과 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 이러한 서열을 필수적으로 포함한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 용어 중화 항체(nutralising antibody)는 톨-유사 수용체 2의 생물학적 활성화 및 신호전달을 중화시킬 수 있는 항체를 기술한 것이다. 길항성 항체 또는 차단 항체로서 또한 칭하여질 수 있는 중화 항체는 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 및 바람직하게 선택적으로 결합하고, 톨-유사 수용체 2의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제시킨다. 예를 들어, 중화 항체는 톨-유사 수용체 2 리간드 결합 부위에 대한 리간드 또는 기질, 예를 들어 톨-유사 수용체 2 리간드의 결합을 억제시킬 수 있다. 대안적으로, 중화 항체는 예를 들어 리간드 효능제 결합을 손상시킴으로써 리간드 효능제에 의해 이전에 결합된 톨-유사 수용체 2의 활성화를 방해할 수 있다. 통상적으로, 중화 항체는 톨-유사 수용체 2를 선택적으로 결합시키고, 이에 따라 생리학적 또는 치료학적 조건 하에서 다른 톨-유사 수용체 패밀리 일원(예를 들어, 톨-유사 수용체 4)을 실질적으로 결합시키지 못한다.
특정 구체예에서, 톨-유사 수용체 2 중화 항체는 CD32 (Fc 감마 수용체 II (FcγRII, FcgRII), 특히 CD32a 및/또는 CD32b에 결합시키기 위해, 항-톨-유사 수용체 2 항체 또는 결합 단편의 요건과는 독립적으로, 톨-유사 수용체 2 기능적 활성의 길항작용을 매개한다. 이에 따라, 톨-유사 수용체 2의 중화는 CD32에 대한 항체, 및 특히 항체의 Fc 부분 또는 항체 단편의 결합을 요구하지 않는다.
통상적으로, 본 발명의 항-톨-유사 수용체 2 항체는, 이러한 항체가 피검체, 특히 인간에 투여될 때, 이러한 항체들이 이에 대한 면역 반응을 매개시킬 수 있는 임의의 결합 에피토프를 함유하지 않음을 특징으로 한다. 이러한 특징은 항체가 투여되는 피검체에서 본 발명의 항체 대한 중화 항체의 생성을 방해한다는 점에서 중요한데, 왜냐하면 면역 반응이 일어나는 경우에 항체의 치료학적 효능이 심각하게 손상될 수 있기 때문이다.
통상적으로, 중화 항-톨-유사 수용체 2 항체는 완전 인간화 항체이다. 즉, 항체를 포함하는 아미노산 잔기의 모든 조합은 전부 인간 기원이고, 이에 따라, 예를 들어 인간 및 비-인간 영역을 함유하지 않는다. 특히, 본 발명의 항체는 단지 인간 가변 영역 서열을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 항체는 예를 들어, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에서 마우스 및 인간 둘 모두로부터 유래된 아미노산 잔기로 이루어진 키메라 모노클로날 항체, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)이 뮤린 항체로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하고 항체의 연관된 프레임워크 영역(FR) 및 불변 영역(CR)이 인간 항체로부터 유래된 CDR-이식된 "인간화" 항체와는 상이하다. 이에 따라, 본 발명의 완전 인간화 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역을 가지며, 이는 모두 인간 기원이거나 인긴 기원의 서열과 실질적으로 일치하지만, 반드시 동일한 항체는 아니다. 본 발명의 완전 인간화 항체는 "인간화" 항체로서 또는 인간 서열로부터 전부 유래된 항체로서 또한 칭하여질 수 있다.
본 발명의 항체의 경쇄의 가변 영역(VL)의 아미노산 서열은 하기 서열 번호: 1로서 나타낸다:
서열 번호: 1에서, 도 1에 도시된 바와 같이, 밑줄 친 잔기는 상보성 결정 영역의 위치와 관련이 있으며, 여기서 잔기 24 내지 34는 CDR1과 관련이 있으며, 잔기 50 내지 56은 CDR2와 관련이 있으며, 잔기 89 내지 97은 CDR3와 관련이 있다. 도 1b는 가변 경쇄 누클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 이러한 도면에서, 경쇄 도메인의 잔기는 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 통상적으로 번호가 매겨진다[Kabat EA et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services].
이러한 CDR 잔기의 동정은 카바트 넘버링 시스템을 이용하여 CDR 영역에 대해 할당된 잔기와 일치한다는 것이 주지되어야 하는데, 여기서 VLCDR1 (즉, 경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역 1)은 잔기 24 내지 34를 포함하며, VLCDR2 (경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역 1)는 잔기 50 내지 56을 포함하며, VLCDR3 (경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역 1)은 잔기 89 내지 97을 포함한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 상동인 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 20, 50 또는 100개의 아미노산의 길이, 또는 서열 전장에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 일치성(identity), 더욱 바람직하게 95% 서열 일치성, 및 가장 바람직하게 적어도 98% 아미노산 일치성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 통상적으로, 이러한 동종 아미노산 서열(homologus amino acid sequence)은 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가질 것이고, 톨-유사 수용체 2에 결합될 때, 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시킬 것이다.
통상적으로, 경쇄의 가변 영역(VL)은 경쇄를 제공하기 위하여 인간 면역글로불린 카파 불변 도메인(CL)에 연결되는데, 상기 경쇄는 인간화 항체의 경쇄이다.
이에 따라, 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 구성원(binding member)이 완전 경쇄를 포함하는 경우에, 경쇄는 하기 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다:
특정의 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 바람직하게 98% 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이를 필수적으로 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 결합 구성원에 관한 것이다. 통상적으로, 서열 번호: 2와 적어도 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체는 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합할 것이고, 여기에 결합될 때, 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시키기 위해 제공될 것이다.
특정 구체예에서, 서열 번호: 2에서 규정되고 도 3에 도시된 바와 같은 경쇄의 아미노산 서열은 도 4에 도시된 바와 같은 서열 번호: 3의 누클레오티드 서열로부터 엔코딩된다. 도 4에 도시된 서열 번호: 3의 서열에서, 밑줄 친 핵산은 경쇄 가변 영역의 아미노산을 엔코딩한다.
일 구체예에서, 중쇄의 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 하기 서열 번호: 4로 나타낸다:
도 2에 도시된 바와 같은 서열 번호: 4에서, 밑줄 친 잔기는 3개의 상보성 결정 영역의 아미노산 잔기와 관련이 있으며, 여기서 잔기 31 내지 35는 CDR1 (VHCDR1 (중쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역 1))과 관련이 있으며, 잔기 50 내지 65는 CDR2 (VHCDR2)와 관련이 있으며, 잔기 95 내지 103은 CDR3 (VHCDR3)과 관련이 있다. 이러한 CDR 잔기의 위치결정(positioning)은 카바트 넘버링 시스템을 이용하여 CDR 영역에 통상적으로 기술된 위치결정과 약간 상이하다는 것이 주지되어야 하며, 여기서 CDR1은 잔기 31 내지 35에 존재하며, CDR2는 잔기 50 내지 66에 존재하며, CDR3은 잔기 95 내지 103에 존재한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 서열 번호: 4의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 아미노산 서열은 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 적어도 20, 50 또는 100개의 아미노산의 길이에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 일치성, 더욱 바람직하게 95% 서열 일치성 및 가장 바람직하게 적어도 98% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 특정의 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 바람직하게 98% 서열 일치성의 아미노산 서열 상동성을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인을 포함한 항체 또는 결합 구성원에 관한 것이다.
통상적으로, 중쇄의 가변 영역(VH)은 적어도 하나의 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 추가 아미노산 서열에 동시 연결된다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 불변 도메인은 본 발명의 인간화 항체의 완전한 중쇄를 형성시키기 위해 서브클래스 IgG (면역글로불린 G)의 항체로부터 유래된다. 이에 따라, 상기 불변 도메인은 CH1, CH2 및 CH3를, 상기 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치된 적합한 링커와 함께 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 불변 도메인은 IgG 동형의 면역글로불린, 통상적으로 면역글로불린 G, 동형 4 (IgG4)로부터 유래된다. IgG4 항체는 중쇄 및 부착된 경쇄 (하프-분자)를 다른 분자로부터의 중-경쇄 쌍과 스와핑(swapping)시킴으로써 Fab 암(arm)을 교체시키는 역동성의 분자(dynamic molecule)로서, 이러한 교체는 이중-특이적 항체를 형성시킨다. 이에 따라, 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 Fab 암 교체의 발생을 방해하기 위해 IgG4 면역글로불린의 불변 도메인들 중 적어도 하나의 아미노산 서열에 대해 이루어진다. 이에 따라, 본 발명의 특정 구체예에서, 항체 또는 항체 단편이 IgG4로부터 유래된 불변 도메인을 포함하는 경우에, 경첩 영역(hinge region)에 위치된, 중쇄의 아미노산 잔기 241의 돌열변이는, 세린 잔기가 프롤린 잔기 (S241P)로 치환되도록 수행될 것이다[문헌(Angal S. et al. Molecular Immunology. 1993. Vol. 30. No.1. p105-108)에 교시됨).
이에 따라, 특정 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 잔기를 제공하기 위해 사용되는 아미노산 잔기는 동형 IgG4의 면역글로불린으로부터 유래된다. 특정의 다른 구체예에서, 면역글로불린은 서브클래스 IgG 및 동형 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 면역글로불린으로부터 유래된다. 특정의 다른 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 제공하기 위해 사용되는 아미노산 잔기는 서브형 IgA의 면역글로불린으로부터 유래된다.
여러 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입은 항체의 기능성 성질을 변형시키기 위해 항체의 불변 도메인의 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 삽입, 결실 및/또는 치환은 항체의 이펙터 기능(effector function), 효능(potency) 또는 반감기 성질들로부터 선택된 (그러나, 이에 제한되지 않는) 적어도 하나의 성질을 변형시키기 위해 불변 도메인의 아미노산 잔기에 대해 이루어질 수 있다.
특정 구체예에서, 도메인 VH-CH1-CH2-CH3을 포함하고 경첩 영역을 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 5로서 제공된다:
특정의 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 바람직하게 98%의 아미노산 서열 일치성을 갖는 상동의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 결합 구성원에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 서열 번호: 5로 규정되고 도 5에 도시된 바와 같은 중쇄의 아미노산 서열은 도 6에 도시된 바와 같이 서열 번호: 6의 누클레오티드 서열로부터 엔코딩된다. 도 5에 도시된 바와 같은 서열 번호: 5의 서열에서, 진하게 표시된 잔기는 경첩 영역이며, 이탤릭체의 잔기는 CH1 불변 도메인의 잔기이며, 밑줄 친 잔기는 CH2 불변 도메인의 잔기이며, 밑줄 친 잔기 이후에 기술된 잔기는 CH3 불변 도메인의 잔기이다. 특정 구체예에서, CH1, CH2 및/또는 CH3 불변 도메인은 IgG1, IgG2, IgA, 또는 IgM과 같은 (그러나 이로 제한되지 않는) 임의의 적합한 면역글로불린 서브형으로부터 유래된 CH1, CH2 또는 CH3 도메인으로 전부 또는 일부 치환될 수 있다. 특정 구체예에서, 불변 도메인들 중 임의 영역에 존재하는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환이 또한 제공될 수 있다. 통상적으로, 상기 결실, 삽입 또는 치환은 항체 또는 항체 단편의 Fc 부분의 결합 성질에서의 얻어진 기능적 변화, 및 특히 Fc 수용체에 결합하고 이펙터 기능을 매개하는 항체의 Fc 영역의 능력의 조정을 야기시킨다.
특정의 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 1의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체, 또는 이에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 일치성을 갖는 변형체, 및 서별 번호: 4의 중쇄 가변 도메인 또는 이에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 상동 일치성(homology identity)을 갖는 변형체를 포함하는 단리된 항체에 관한 것이다.
특정의 다른 구체예에서, 서열 번호: 2의 아미노 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 서열 일치성을 갖는 변형체, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 또는 이에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 일치성을 갖는 변형체를 포함하는 경쇄로 형성된 항체가 제공된다.
본 발명의 항체 및 항체 단편을 생산하는데 사용하기 위한 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 도메인 및 불변 도메인은 이러한 도메인들의 변형체를 포함할 수 있는 것으로 인식될 것인데, 예를 들어, 상기 가변 도메인 및 불변 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 이러한 도메인의 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이를 포함할 수 있다. 변형체 불변 도메인이 본원에 기술된 불변 도메인 보다 길거나 짧을 수 있는 것으로 인식될 것이다. 특정 구체예에서, 변형체 가변 또는 불변 도메인은 야생형 항체 불변 도메인에 대해 적어도 90% 일치성 또는 유사성의 서열 상동성을 가질 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이 "서열 상동성(sequence homology)"은 또한 서열 일치성 또는 서열 유사성으로서 칭하여질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "일치성(identity)" 또는 "서열 일치성(sequence identity)"은 정렬된 서열에서의 임의의 특징 위치에서, 아미노산 잔기가 정렬된 서열들 간에 동일하다는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "유사성(similarity)" 또는 "서열 유사성(sequence similarity)"은, 정렬된 서열에서의 임의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 간에 유사한 타입이라는 것을 명시하는 것이다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기에 대해 치환될 수 있다. 이는 보존적 치환으로서 칭하여질 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 아미노산 서열이 이에 함유된 임의의 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해 개질될 때, 이러한 변화는 비개질된 항체와 비교할 때, 얻어진 항체의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 (천연) 폴리펩티드 및 이의 작용성 유도체에 관한 서열 상동성, 또는 서열 일치성은 서열들을 정렬시키고 필요한 경우에 갭(gap)을 도입하여 최대 백분율 상동성을 달성하고 서열 일치성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후에, 상응하는 천연 폴리펩티드의 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율에 관한 것이다. N- 또는 C-말단 연장도 삽입도 서열 일치성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지 않을 것이다. 두 개 이상의 아미노산 서열의 정렬을 수행하고 이들의 서열 일치성 또는 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 2개의 아미노산 서열의 일치성 또는 유사성의 백분율은 알고리즘, 예를 들어 BLAST (Altschul et al. 1990), FASTA (Pearson & Lipman 1988), 또는 Smith-Waterman 알고리즘 (Smith & Waterman 1981)을 이용하여 용이하게 계산될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 뮤린 모노클로날 항체 T2.5에 의해 인식되는 톨-유사 수용체 2 상에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 완전 인간화 항체를 제공하는 것으로서, 여기서 상기 인간 항체는 하기를 포함한다:
- 가변 영역이 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 가변성의 경쇄,
- 가변 도메인이 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 중쇄.
특정 구체예에서, 항체는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자에 콘주게이팅될 수 있다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 OPN-305으로 명시된, 완전 인간화 모노클로날 항체에 관한 것으로서, 이러한 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. OPN-305 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 중쇄를 갖는 것으로서 추가로 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "필수적으로 포함하다(consists essentially of)" 또는 "필수적으로 포함한(consisting essentially of)"은 폴리펩티드가 기술된 것 이외에 추가적인 특징 또는 엘리먼트(element)를 가질 수 있는 것을 의미하는 것으로서, 단 이러한 추가 특징 또는 엘리먼트가 톨-유사 수용체 2에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편의 능력에 크기 영향을 미치지 않는 것이다. 즉, 폴리펩티드를 포함한 항체 또는 항체 단편은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 아미노산 서열에 도입된 개질과 같은, 톨-유사 수용체 2에 결합하고 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시키는 항체 또는 항체 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 추가적인 특징 또는 엘리먼트를 가질 수 있다. 예를 들어, 특정 서열을 필수적으로 포함하는 폴리펩티드는 서열의 한 단부 또는 양 단부에 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 추가 아미노산을 함유할 수 있으며, 단, 이러한 추가 아미노산은 항체 또는 항체 단편에 폴리펩티드의 역할을 억제하거나, 차단하거나, 중단시키는 것을 방해하지 않는다. 유사하게, 본 발명의 톨-유사 수용체 2 길항성 항체에 기여하는 폴리펩티드 분자는 하나 이상의 작용기로 화학적으로 개질될 수 있으며, 단 이러한 작용기는 톨-유사 수용체 2에 결합하고 이의 기능을 길항시키는 항체 또는 항체 단편의 능력을 방해하지 않는다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된, 완전 인간화 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본원에서 정의된 바와 같이, "완전 인간화" 항체는 프레임워크 영역(FR), 불변 영역(CR) 및 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 생식세포 면역글로불린 서열들로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 칭하는 것이다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 이러한 불변 영역은 또한 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 완전 인간화 항체는 랜덤 또는 생체내 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 도입된 돌연변이와 같이, 인간 면역글로불린 서열에 의해 엔코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 완전 인간화 항체는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것이 의도되지 않는다. 완전 인간화 모노클로날 항체는 단일 결합 특이성을 나타내고 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체이다. 이는 예를 들어, 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열은 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 인간화 모노클로날 항체와는 상이하다.
단지 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL) 서열의 아미노산 서열이 제공된 구체예에서, 본 발명은 문헌 [Portolano et al. (Portolano et al. The Journal of Immunology (1993). 150:880-887) and Clarkson et al. (Clarkson et al. Nature (1991) 352:624-628)]의 교시에 따라 상보성 가변 도메인 서열의 라이브러리(library)에 대비하여 상기 가변 도메인 서열을 스크리닝함으로써, 톨-유사 수용체 2, 특히 포유류 톨-유사 수용체 2, 통상적으로 인간 톨-유사 수용체 2의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 항체는 톨-유사 수용체 2 기능을 길항시키도록 기능한다.
특정의 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하는데, 상기 항체는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호: 1을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 단리된 항체는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 실질적으로 순수한 단리된 항체이다. 특정의 다른 구체예에서, 항체는 재조합 항체, 즉 재조합 방법에 의해 제조된 항체이다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명에는 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되는데, 이러한 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하며, 이러한 항체는 인간, 뮤린 및 원숭이 세포 상에서 발현되는 톨-유사 수용체 2에 대해 교차 반응성이다(즉, 이에 대한 결합 특이성을 갖는다). 통상적으로, 이러한 항체는 항체에 의해 결합될 때, 톨-유사 수용체 2의 리간드 결합 부위에 대한 리간드 효능제 결합에 의해 톨-유사 수용체 2의 활성화를 방해하는 리간드 결합 부위에서 톨-유사 수용체 2에 결합한다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 이전 양태들에서 정의된 바와 같은 항체들 중 2, 3, 또는 4개 이상을 포함하는 다가 단일특이적 항원 결합 단백질, 또는 이의 단편들에 관한 것으로서, 여기서 상기 항체는 연결 구조에 의해 서로 결합된다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 이전 양태들의 완전 인간화 항체로부터 유래된 결합 구성원(binding member) 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 항원 결합 단편은 항원, 통상적으로 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 칭하는 것이다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 달성될 수 있는 것으로 나타난다. 특정 구체예에서, 결합 구성원 또는 항원 결합 단편은 단리된 결합 구성원일 수 있다. 본 발명의 결합 구성원 또는 항원 결합 단편은 본 발명의 항체의 단편, 예를 들어 완전 인간화된 분자의 단편, 예를 들어 단지 중쇄 또는 경쇄, 또는 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 결합 구성원은 통상적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 결합 구성원의 VH 도메인은 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. VH 및 VL 도메인 각각 내에는 4개의 관련된 프레임워크 영역("FR")과 함께 3개의 상보성 결정 영역 ("CDR")이 존재한다. VH 도메인은 통상적으로 3개의 HCDR (중쇄 상보성 결정 영역)을 포함하며, VL 도메인은 통상적으로 3개의 LCDR (경쇄 상보성 영역)을 포함한다. 이에 따라, 결합 구성원은 복수의 관련된 프레임워크 영역과 함께, 순서대로 VH CDR1 (또는 HCDR1), CDR2 (HCDR2) 및 CDR3 (HCDR3) 영역들을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 결합 구성원은 관련된 프레임워크 영역과 함께 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 VL 도메인을 추가적으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다. VH 또는 VL 도메인은 통상적으로 하기 배열에서 3개의 상보성 결정 영역들 사이에 산재된 4개의 프레임워크 영역인, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
경쇄의 가변 영역(VL)은 항체 또는 결합 단편의 결합 특이성을 부여함에 있어 역할을 하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 이러한 상보성 결정 영역은 또한 과가변 영역으로서 공지될 수 있다. 3개의 상보성 결정 영역은 하기 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 및 서열 번호: 9로서 나타내며, 이러한 서열들은 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3과 관련된다.
도 1a는 서열 번호: 1에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 1b는 가변 경쇄 누클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한 것이다. VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 영역의 위치는 도 1a에서 각 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 적절한 아미노산 잔기의 밑줄 친 부분에 의해 나타낸다.
도 1b에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기는 카바트 등(Kabat et al.)에 의해 발명된 넘버링 시스템(numbering system)에 따라 통상적으로 번호가 매겨진다 [Kabat,E.A., Wu,TT., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242]. 카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서 잔기를 칭할 때 사용된다(대략적으로 경쇄의 잔기 1 내지 107, 및 중쇄의 잔기 1-113). 이러한 넘버링 시스템은 달리 명시되는 경우를 제외하고 본 명세서에서 사용된다. 카바트 잔기 명칭은 항상 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 잔기의 리니어 넘버링(linear numbering)과 직접적으로 대응하는 것은 아니다. 실제 리니어(linear) 아미노산 서열은 프레임워크 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)에 따라, 중쇄 또는 경쇄의 기본 가변 도메인 구조의 구조적 구성요소의 단축 또는 이에 대한 삽입에 상응하여 엄격한 카바트 넘버링에서 보다 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 카바트 넘버링이 적용된 표준 서열을 갖는 항체의 서열에서 잔기의 정렬에 의해 임의의 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.
VLCDR1 (또한 VL-CRD1 , 경쇄 가변 도메인 상보성 결정 영역 1, 또는 CDR-L1으로 알려짐)은 도 1a에 도시된 바와 같이 경쇄 가변 도메인 서열의 잔기 24 내지 38에 존재하는 15개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 이러한 잔기는 도 1b에서 잔기 24 내지 34로 나타내며, 여기서 잔기 27, 27a, 27b, 27c 및 27d가 적절히 고려된다. 이에 따라, VLCDR1의 경우에서, 15개의 잔기는 카바트에 따라 정의된 CDRL1과 동일한 것으로 받아들여진다.
도 1a에 도시된 VLCDR2 (또한 VL-CRD2, 경쇄 가변 도메인 상보성 결정 영역 2, 또는 CDR-L2로 알려짐)는 7개의 아미노산 잔기로 이루어지고 도 1b에 도시된 바와 같이 가변 영역 서열의 잔기 50 내지 56에 위치된다. 이러한 잔기는 카바트에 따라 정의된 CDRL2 영역과 동일한 것으로 채택된 바와 같이 잔기 50 내지 56과 정확하게 관련이 있다.
도 1a에 도시된 VLCDR3 (또한 VL-CRD3, 경쇄 가변 영역 상보성 결정 영역 3, 또는 CDR-L3로 알려짐)은 9개의 아미노산 잔기로 이루어지고 도 1b에 도시된 바와 같이 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 경우에 잔기 89 내지 97로 위치된다. 이러한 잔기는 카바트에 따라 정의된 CDRL3 영역과 동일한 것으로 받아들여지는 바 잔기 89 내지 97과 정확하게 관련이 있다.
중쇄의 가변 영역(VH)은 또한 항체 또는 항체 단편의 결합 특이성을 부여하는데 역할을 하는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 상기 3개의 상보성 결정 영역은 하기 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 , 및 서열 번호: 12로 나타내며, 이러한 서열은 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3과 관련이 있다.
도 2a는 서열 번호: 2에 도시된 바와 같은 VH 도메인의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 2b는 가변 중쇄 누클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 2b에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기는 카바트에 의해 발명된 시스템에 따라 통상적으로 번호가 매겨진다. VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 영역의 위치는 도 2a에서 적절한 아미노산 잔기의 밑줄 친 부분에 의해 나타낸다.
VHCDR1 (또한 VH-CRD1 , 중쇄 가변 도메인 상보성 결정 영역 1, 또는 CDR-H1로서 알려짐)은 가변 영역 서열의 잔기 31 내지 35에 존재하는 5개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 이러한 잔기는 카바트에 따라 정의된 CDRH 1 영역과 동일한 것을 받아들여지는 바 잔기 31 내지 35와 정확하게 관련이 있다.
VHCDR2 (또한 VH-CRD2, 중쇄 가변 도메인 상보성 결정 영역 2, 또는 CDRH2로서 알려짐)는 17개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 가변 도메인 서열의 잔기 50 내지 65에 위치된다. 이러한 잔기는 카바트에 따라 정의된 CDRH2 영역과 동일한 것으로 받아들여지는 바 잔기 50 내지 65와 정확하게 관련이 있다.
VHCDR3 (또한 VH-CRD3, 중쇄 가변 도메인 상보성 결정 영역 3, 또는 CDRH3)는 9개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 서열의 잔기 95 내지 103에 위치된다. 도 2b에 예시된 바와 같이 카바트 유래 CDRH3 영역의 CDRH3 영역의 잔기 100에 맞춰 정렬하는 것으로 여겨지는 위치 100 및 100a에서의 2개의 잔기의 존재로 인하여, 이러한 9개의 잔기는 카바트에 따라 정의된 CDRH2 영역의 8개의 잔기(잔기 95 내지 102)와 정확하게 관련이 있다.
경쇄의 CDR은, 예를 들어 두 개의 CDR 세트 모두가 존재하는 경우에, 항체 또는 항체 결합 단편의 결합 특이성을 부여하기 위해 중쇄의 CDR과 결합한다. 결합 에너지론(energetics of binding)에 대한 경쇄 가변 영역에 의해 이루어진 기여가 결합된 중쇄 가변 영역에 비해 적은 것으로 알져져 있다. 이에 따라, 순서대로 3개의 상보성 결정 영역 (VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3)을 포함하는 단리된 중쇄 영역은 항원 결합 능력을 갖는 것으로 알려져 있고 일반적으로 단일 도메인 항체로서 칭하여진다. 이러한 항체 단편은 서열 번호: 1에 정의된 바와 같이, 본 발명의 중쇄 가변 영역의 규정을 기준으로, 본 발명에 의해 제공된다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 톨-유사 수용체 2 (TLR2, TLR-2, CD282)에 대한 결합 특이성을 가지고 서열 번호: 7 내지 서열 번호: 12를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 완전 인간화 항체 또는 관련된 결합 구성원에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 결합 구성원은 서열 번호: 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 구체예에서, 순서대로 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하거나, 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 결합 구성원이 제공된다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11 및 서열 번호: 12 각각은 순서대로 제공되며, 이들 사이에 프레임워크 영역이 산재되어 있다.
특정 구체예에서, VH 또는 VL 도메인의 아미노산 서열은 적어도 하나의 역 돌연변이(back mutation)를 포함할 수 있으며, 상기 역 돌연변이는 TKR2에 대한, 인간화 항체 또는 이의 단편의 결합 특이성을 개선시키고/거나 TLRS 길항제로서 인간화 항체의 치료학적 효능을 향상시키기 위해 서열의 특정 위치에서 아미노산 잔기를 대체하는 것이다. 통상적으로, 이러한 개질은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내의 프레임워크 잔기에서 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 다른 공학 기술은 예를 들어 혈청내 반감기, 보체 결합, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존적 세포 독성을 변경시킬 수 있는 Fc 영역의 개질을 포함함으로써 본 발명의 항체를 개질시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 특정 구체예에서, 개조된 글리코실화 패턴을 갖는 항체 또는 항체 단편이 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체가 글리코실화되는 범위를 증가 또는 감소시킴으로써 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 통상적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 부분의 부착을 칭하는 것이다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 효소적 부착을 위한 인식 서열(recognition sequence)이다. 이에 따라, 폴리펩티드에서의 이러한 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 가능한 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈, 또는 자일로즈 중 하나의 부착을 칭하는 것이지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
특정의 다른 구체예에서, 항체는 항체를 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체와 반응시킴으로써 페그화(PEGylate)될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 탈푸코실화되고, 이에 따라 푸코즈 잔기가 부족하다.
특정 구체예에서, 항체의 생물학적 성질에서의 개질은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태와 같은 치환 구역에서의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 타겟 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 아미노산은 이들의 측쇄의 성질에서의 유사성에 따라 그룹핑될 수 있다 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))]: (1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H). 대안적으로, 천연 발생 잔기는 공통 측쇄 성질들을 기준으로 하여 하기 그룹들로 나누어질 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, VaI, Leu, He; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 일원의 다른 클래스로의 교환을 일으킬 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위에 또는 나머지 (예를 들어, 비-보전적) 부위에 도입될 수 있다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항체 또는 이의 단편의 형성에서 서열 번호: 1의 VL 도메인, 및/또는 서열 번호: 4의 VH 도메인의 용도에 관한 것으로서, 여기서 상기 항체 또는 단편은 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지며, 상기 항체 또는 단편은 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시키도록 기능한다.
특정의 다른 구체예에서, 본 발명은 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지고 TLR2 길항제로서 기능하는, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 결합 구성원, 또는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95% 및 가장 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 서열에 관한 것이다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 하기 실시예에서 특징분석되는 OPN-305로 명시된 완전 인간화 모노클로날 항체에 관한 것이다. OPN-305의 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열은 서열 번호: 1로 나타내며, OPN-305의 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열은 서열 번호: 4로 나타낸다. 또한, OPN-305의 중쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 5로 나타내며, OPN-305의 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호: 2로 나타낸다.
항체는 세포 배양과 같은 재조합 수단에 의해 생성될 수 있거나, 대안적으로 항체는 단리된 항체일 수 있다. 특정 구체예에서, 다른 개질은 중쇄의 Fc 부분, 및 특히 항체의 CH2 및 CH3 불변 도메인에서 이루어질 수 있다. 이러한 구체예에서, 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 결합 단편은 OPN-305 완전 인간화 항체, 예를 들어, Fab 단편, F'ab 단편 또는 sc-Fv로부터 유래될 수 있다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 파트너 분자(partner molecule)에 연결된 이의 항원 결합 부분을 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 이러한 항체-파트너 분자 접합체는 화학적 링커, 예를 들어 펩티딜 링커, 히드라진 링커, 또는 디설피드 링커에 의해 콘주게이팅된다. 특정 구체예에서, 커플링 파트너는 이펙터 분자, 라벨, 약물, 또는 캐리어 분자이다. 펩티딜 및 비-펩티딜 커플링 파트너 둘 모두에 대한 본 발명의 항체를 커플링시키기 위한 적합한 기술은 당해 분야의 기술자에게 공지된 것일 것이다. 적합한 라벨의 예에는 검출 가능한 라벨, 예를 들어 방사성 라벨, 또는 효소 라벨, 예를 들어 호오스 래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase), 또는 바이오틴(biotin)과 같은 화학적 부분을 포함한다. 대안적으로, 라벨은 작용성 라벨, 예를 들어 리신, 또는 항체 결합의 부위에서 전구약물을 활성 약물로 전환시킬 수 있는 전구약물일 수 있다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 비해 상이한 결합 특이성을 갖는 제 2 작용성 부분에 연결된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이성 분자에 관한 것이다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 모노클로날 항체 OPN-305에 의해 결합된 것과 동일한 톨-유사 수용체 2의 세포외 도메인 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 올리고누클레오티드, 펩티도미메틱 또는 유기 화합물로부터 유래된 모노클로날 항체 또는 결합 단편에 관한 것으로서, 여기서 모노클로날 항체는 상업적으로 입수가능한 T2.5로 명시된 항체가 아니다. 통상적으로, 화합물에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프는 서열 번호: 13 및/또는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 화합물들은 동일한 에피토프에서 톨-유사 수용체 2에 결합시키기 위해 본원에 기술된 항체와 상호 경쟁적인 능력을 갖는다. 이러한 화합물들은 상호-경쟁 결합 연구에 의해 동정될 수 있는데, 이는 OPN-305와 같은 본 발명의 항체에 대해 수행될 수 있다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 톨-유사 수용체 2 활성화 및/또는 세포내 신호전달에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 매개된 질환 또는 증상의 예방 및/또는 치료에서의 본 발명에 따른 완전 인간화 항체, 완전 인간화 모노클로날 항체 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도에 관한 것이다.
특정 구체예에서, TLR2-매개된 질환 또는 증상은 염증성 증상이다.
특정 구체예에서, 결합 구성원은 Fab 단편, Fab' 단편, scFv (단쇄 가변 단편), 펩티도미메틱, 디아바디(diabody), 또는 관련된 다가 유도체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다.
Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편의 재조합 생산을 위해 사용되는 기술들은 당해 분야의 기술자에게 널리 공지된 것으로서, 국제 PCT 특허 공개 WO WO 92/22324 (Sawai et al., "Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and CDNa Expression Vectors", 1995, AJRI 34:26-34), 및 문헌[Mullinax et al., "Expression of a Heterodimeric Fab Antibody Protein in One Cloning Step", 1992, BioTechniques 12(6):864-869 및 Better et al., "Escherichia coli Secretion of an Active Chimeric Antibody Fragment" 1988, Science 240:1041-1043]에 기술된 것들을 포함하며, 이러한 문헌들은 본원에 참고문헌으로 통합된다.
scFv (단쇄 Fv 단편)를 생산하기 위해 사용될 수 있는 기술들의 예는 문헌[Huston et al., "Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins", Methods in Enzymology, vol. 203:46-88 (1991)]에 기재되어 있으며, 이의 내용은 참고문헌으로 통합된다.
특정 구체예에서, 항체 단편은 모리모토(Morimoto)의 방법에 따른 단백질 분해(proteolytic digestion)에 의해 전장 항체로부터 유래될 수 있다 [Morimoto et al., "Single-step purification of F(ab')2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins G1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW" Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]. 항체 단편은 또한 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다 [Carter et al., "High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment" Bio/Technology 10:163-167 (1992)].
여러 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 톨-유사 수용체 2에 의해 완전히 또는 일부 매개된 염증성 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다:
- 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 인간화 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하는 단계, 및
- 이를 염증성 증상의 치료를 필요로 하는 피검체에 투여하는 단계.
특정 구체예에서, 본 방법은 2, 3, 또는 4개 이상의 본 발명에 따른 항체를 포함하는 다가 단일특이적 항원-결합 단백질의 투여를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명에 따른 인간화 항체, 인간화 모노클로날 항체, 이의 항원 결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이성 분자를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
특정 구체예에서, 제형은 액상 제형, 동결건조된 제형, 액체로서 재구성되는 동결건조된 제형, 또는 에어로졸 제형이다. 특정 구체예에서, 이러한 제형에서의 항체는 약 0.5 mg/ml 내지 약 250 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 45 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 약 100 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 또는 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 농도이다.
특정 구체예에서, 본 제형은 완충제를 추가로 포함한다. 통상적으로, 제형의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5이다.
특정 구체예에서, 완충제는 약 4 mM 내지 약 60 mM 히스티딘 완충제, 약 5 mM 내지 약 25 mM 숙시네이트 완충제, 또는 약 5 mM 내지 25 mM 아세테이트 완충제를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 완충제는 약 10 mM 내지 300 mM, 통상적으로 대략 125 mM 농도의 소듐 클로라이드, 및 약 5 mM 내지 50 mM, 통상적으로 25 mM 농도의 소듐 시트레이트를 포함한다. 특정 구체예에서, 제형은 약 0% 내지 약 0.2% 농도의 계면활성제를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 및 이들의 조합물로 이루어진 군(이로 제한되지 않음)으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트-20이다. 특정 구체예에서, 제형은 약 0.001% 내지 약 0.05% 트윈(Tween)을 추가로 포함하고, 약 125 mM 농도의 소듐 클로라이드 및 약 25 mM 농도의 소듐 시트레이트를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 약제 조성물은 적어도 하나의 면역조절 화합물, 예를 들어 면역 억제 화합물, 이들의 2차 항체 또는 단편, 또는 제조합 단백질을 추가로 포함할 수 있거나 이와 함께 피검체에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 및 결합 구성원은 또한 톨-유사 수용체 2를 포함하는 질환 상태의 진단, 예를 들어 생체내 진단 및 이미지화에서 사용될 수 있는데, 여기서 본 발명의 항체는 타겟에 대해 사용되고 톨-유사 수용체 2를 발현시키는 세포에 결합시킬 수 있다. 또한, 특정 구체예에서, 제 2 분자 또는 화합물은 톨-유사 수용체 2를 발현시키는 세포에 대한 제 2 분자 또는 화합물을 타겟화시키는데 사용하기 위해 본 발명의 항체에 동시 연결될 수 있다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 톨-유사 수용체 2 매ro된 염증성 증상 또는 질환의 치료 또는 예방용 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 이러한 키트는 톨-유사 수용체 2에 결합하고 이의 기능적 활성을 길항시킬 수 있는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이를 환자에게 투여하기 위한 설명서를 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 인간화 중화 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공되는데, 여기서 항체는 포유류 톨-유사 수용체 2에 1x10-8 이하의 KD로 특이적으로 결합하지만, CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합하지 않으며, 항체는 상업적으로 입수가능한 T2.5로 명시되는 항체에 의해 결합된 것과 동일한 톨-유사 수용체 2의 세포외 도메인 상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또 다른 양태에 따르면, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공되는데, 여기서 항체는 포유류 톨-유사 수용체 2 상의 에피토프를 1x10-8 이하의 KD로 결합하고 CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합하지 않으며, 에피토프는 기준 항체에 의해 인식되며, 기준 항체는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 단리된 인간 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이 제공되는데, 이는 포유류 톨-유사 수용체 2를 특이적으로 결합시키고, 하기 성질들을 나타낸다:
- 포유류 톨-유사 수용체 2에 1x10-8 이하의 KD로 결합함.
- CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합하지 않음.
- 인간 톨-유사 수용체 2, 뮤린 톨-유사 수용체 2 및 원숭이 톨-유사 수용체 2에 교차 반응됨.
Fab
결합 구성원
본 발명의 상기 양태들의 특정 구체예에서, 항체의 항체 단편 또는 항원 결합 부분이 본 발명에 의해 제공된다. 결합 단편의 예는 Fab, F'ab, 또는 F(ab')2 단편을 포함하는데, 이는 헤테로테트라머 항체의 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 일가 단편이다. 특정 구체예에서, VL 도메인은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 가지며, VH 도메인은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, CL 및 CH1 도메인은 서브클래스 IgG 및 동형 IgG4의 면역글로불린의 CL 및 CH1 도메인, 또는 도 5의 서열 번호: 5에 도시된 CL 및 CH1 도메인의 아미노산 서열을 기초로 한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 이러한 구체예의 Fab 단편은 건선, 피부염, 포도막염 및 AMD (노인성 황반 퇴행)을 포함한 안질환을 포함하지만 이로 제한되지 않는 증상의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
단일 도메인 결합 구성원
TLR2에 대한 결합 특이성을 가지고 TLR 2 기능을 길항시키는 인간화 모노클로날 항체를 제공하는 것 이외에, 본 발명은 또한 서열 번호: 1에 규정된 바와 같은 VL (경쇄 가변)의 아미노산 서열 및 서열 번호: 4에 규정된 바와 같은 VH (중쇄 가변)의 아미노산 서열을 기초로 한, 한 쌍의 결합 도메인을 포함하는 항체와 다른 결합 구성원에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명의 항체의 인간화 항체의 VL 또는 VH 영역 중 하나를 기초로 한 단일 결합 도메인에 관한 것이다.
이에 따라, 본 발명의 특정의 다른 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체로부터 유래된 단일 결합 도메인을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 결합 구성원이 제공된다. 특정 구체예에서, 단일 결합 도메인은 서열 번호: 4에 규정된 바와 같이 VH (중쇄 가변 도메인)의 아미노산 서열로부터 유래된다. 이러한 결합 도메인은 TLR 2에 대한 타겟화 제제로서 사용될 수 있는데, 이는 면역글로불린 VH 도메인이 특정 방식으로 타겟 항원에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문이다.
CDR
잔기의
개질
상보성 영역의 서열(서열 번호: 7, 8, 9, 10, 11 및 12에서 규정된 바와 같은 서열) 뿐만 아니라 과가변 및 가변 영역의 서열은 TLR2에 특이적으로 결합하는 능력을 떨어뜨리지 않게 하면서 개질될 수 있다는 것은 당해 분야의 기술자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 인간화 항체로부터 유래된 결합 구성원의 CDR 영역은 본원에서 서열 번호: 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 규정된 아미노산 서열에 대해 동일하거나 고도로 상동적(예를 들어, 95% 이상의 서열 일치성)일 수 있다. 본원에서 정의된 용어 "고도로 상동적인"은 1개 내지 5개의 아미노산 치환이 CDR의 서열로 이루어질 수 있음을 의미한다. 특정 구체예에서, 개개의 CDR, 과가변 영역 또는 가변 영역과 이들의 비-개질된 상응하는 부분 사이에 존재하는 상동성의 정도는 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95% 및 가장 바람직하게 98% 초과일 것이다. 이러한 개질된 서열은 개질되거나 상동적인 결합 구성원이 TLR2에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고 이의 기능적 활성을 길항시키는 경우에 본 발명의 범위 내에 속한다.
폴리누클레오티드
여러 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 인간화 항체, 항체 단편, 및 결합 구성원을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 및 특히 단리된 폴리누클레오티드에 관한 것이다.
이에 따라, 본 발명의 다른 양태에서, 서열 번호: 1 및/또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다. 특정 구체예에서, 폴리누클레오티드는 단리된 폴리누클레오티드이다
본원에서 정의된 "폴리누클레오티드"는 임의의 폴리리보누클레오티드 또는 폴리데옥시리보누클레오티드를 포함하는데, 이는 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA를 포함하지만 이로 제한되지 않는 비개질된 RNA 또는 DNA, 또는 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드, 예를 들어 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 이의 대립 유전자 변형체 및/또는 중간 정도 또는 높은 엄격성의 조건 하에서 이러한 누클레오티드 서열을 하이브리다이징(hybridise)하는 폴리누클레오티드를 포함한 이의 보체(complement)를 포함한다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 1 및/또는 서열 번호: 4를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 이러한 벡터로 형질 변환된 숙주 세포에 관한 것이다.
융합 세포주
본 발명의 또 다른 양태는 서열 번호: 1의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호: 4의 경쇄 가변 아미노산 서열을 갖는 항체를 발현시키는 하이브리드 세포주 (융합 세포)를 제공한다.
도 1a는 본 발명에 따른 항체의 경쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열인 서열 번호: 1을 도시한 것이며, 도 1b는 카바트에 따라 번호가 매겨진, 가변 경쇄 누클레오티드 서열 (서열 번호: 17) 및 추정 아미노산 서열 (서열 번호: 18)을 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열인 서열 번호: 4를 도시한 것이다. 도 2b는 카바트에 따라 번호가 매겨진, 가변 중쇄 누클레오티드 서열 (서열 번호: 19) 및 추정 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸 서열 번호: 2를 도시한 것이다.
도 4는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 엔코딩하기 위해 번역될 수 있는 핵산 서열을 나타낸 서열 번호: 3을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 아미노산 서열인 서열 번호: 5를 도시한 것이다.
도 6은 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 엔코딩하기 위해 번역될 수 있는 핵산 서열을 나타낸 서열 번호: 6을 도시한 것이다.
도 7은 인간 톨-유사 수용체 2의 아미노산 서열을 제공하는 서열 번호: 15를 도시한 것이다.
도 8은 뮤린 톨-유사 수용체 2의 아미노산 서열을 제공하는 서열 번호: 16을 도시한 것이다.
도 9는 OPN-305 매개된 톨-유사 수용체 2 길항작용이 CD32에 결합하는 항체에 의존적이지 않음을 도시한 것으로서, 그룹 1은 대조군 염소 항체의 첨가를 나타낸 것이며, 그룹 2는 염소 항-hCD32a 차단 항체의 첨가를 나타낸 것이며, 그룹 3은 염소 항-hCD32b 차단 항체의 첨가를 나타낸 것이다.
도 10은 OPN301 모노클로날 항체에 의해 매개된 톨-유사 수용체 2 길항 작용이 CD32에 결합하는 항체에 의존적이며(도 10a), OPN-305 매개된 톨-유사 수용체 2 길항 작용이 CD32에 결합하는 항체에 의존적이지 않음(도 10b)을 도시한 것이다.
도 11은 OPN-305가 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지며(도 11a) IgG4 동형 대조군 항체가 톨-유사 수용체 2에 결합하기 위해 OPN-301과 경쟁적이지 않는(도 11b), FACS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 12는 OPN-305 (OPN-305-21)가 뮤린 TLR2 반응을, 뮤린 OPN-301 항체와 균등한 방식으로 억제함을 도시한 것이다.
도 13은 OPN-305가 과립구(도 13a) 및 단핵구(도 13b) 상에서 발현되지만 림프구에서 발현되지 않는(도 13c) 원숭이 TLR2에 결합한 3 FACS 분석 트레이스를 도시한 것이다.
도 14는 OPN-305가 원숭이 TLR2에 결합시키기 위해 항-TLR2 뮤린 모노클로날 항체 OPN-301과 경쟁적인 것으로 나타낸 2 FACS 분석 트레이스를 도시한 것으로서, 도 14(a)는 과립구에 대한 결과를 도시한 것이며, 도 14(b)는 단핵구에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 15(a) 및 (b)는 16/60 Sephacryl S200 칼럼 상에서 크기배제 크로마토그래피에 의해 연마된 항체 샘플의 트레이스를 도시한 것이다. 도 15(a)는 항-TLR2 키메라 항체를 도시한 것이며, 도 15(b)는 OPN305 항체 (VK5A/H4)를 도시한 것이다. 각 경우에, 모노머 피크 스패닝 부분(spanning fraction) B8 내지 B4가 수집되었다.
도 16은 4개의 도너 샘플(donor sample)에서 시험된 세포 독성 및 T 세포 조절 활성에 대한 시험 샘플의 사전-스크린을 도시한 것이다. 샘플 1(각 그룹의 제 1 칼럼(검정색 바))은 키메라 항-TLR2 항체이며, 샘플 2 (각 결과의 그룹의 제 2 칼럼 (백색 바)는 VK5A/H4 (OPN305)이며, 샘플 3 (제 3의 바 (진한 회색))은 KLH와 함께 VK5A/H5로 명시된 비교 항체이며, 샘플 4 (각 그룹의 오른쪽 측면 상의 제 4 바 (밝은 회색))는 단지 대조군인 KLH이다. 이러한 결과는 7일 째에 생존 세포 카운트를 도시한 것이다. KLH의 존재 하에서 인큐베이션된 샘플의 S.l.s은 KLH 단독과 비교하였다. KLH의 존재 하에 인큐베이션된 샘플의 S.I.s는 KLH 단독의 것과 비교되었다. S.I.s를 3일 샘플링 시간에 걸쳐 평균화되었다. 양성 반응을 결정하기 위한 컷-오프(cut-off)는 SI ≥ 2이다.
도 17(a), (b) 및 (c)는 에피스크린 테스팅(episcreen testing)의 결과를 도시한 3개의 바 차트(bar chart)를 도시한 것이다. 키메라 항-TLR2, VK5A/H4 및 VK5A/H5 항체를 21개의 도너로부터 PBMC를 이용하여 EpiScreen™ 타임 코스 T 세포 검정으로 시험하였다. 시험 항체와 함께 인큐베이션된 PBMC의 벌크 배양물을 5, 6, 7 및 8일째에 샘플링하고, 3H-티미딘과 함께 펄싱하였다. 세포를 수확하고, 방사성 활성의 도입을 섬광 카운팅(scintillation counting)으로 측정하였다. 각 제3 샘플(triplicate sample)에 대한 결과를 평균화하고, 자극 지수(SI)로 변환시킴으로써 일반화시켰다. 각 도너에 따른 각 시점에 대한 SI는 (a) 키메라 항체, (b) OPN-305 항-TLR2 항체 (VK5A/H4로 명시됨), (c) VK5A/H5로 명시된 비교 항-TLR2 항체에 대해 상기에 나타내었다. SI ≥ 2를 갖는 양성 반응을 결정하기 위한 컷-오프는 두꺼운 검정색 수평 라인에 의해 강조되었으며, 현저한 반응(스튜던트의 t-시험에서의 p<0.05)은 (*)로 나타내었다.
도 18은 EPISCREEN™ 기술을 이용하여 예측된 면역원성과 임상적 셋팅에서 관찰된 면역원성과의 비교를 나타낸 것이다. 16개의 치료학적 단백질을 EPISCREEN™ 기술을 이용하여 면역원성의 상대적 위험성에 대해 시험하였다. 결과를 임상에서 사용될 때 각 단백질에 대해 관찰된 면역원성(항-치료용 항체 반응)의 빈도에 대해 플롯팅하였다 (PubMed로부터의 공급된 데이타). 회귀 라인 및 보정 상수가 나타내어져 있다.
도 19는 OPN-305 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 22) 및 T2.5 뮤린 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 21)의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것으로서, 여기서 결정된 서열 일치성은 89.2%인 것으로 나타났다.
도 20은 OPN-305 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 24) 및 T2.5 뮤린 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 23)의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것으로서, 여기서 결정된 서열 일치성은 88.1%인 것으로 나타났다.
도 21은 TLR2 의존적 신호전달의 완전한 억제가 OPN-305의 최대 수용체 결합 미만으로 달성됨을 도시한 것이다. NF-kB 활성의 억제는 Pam3Csk4로의 처리 후에 용량 의존적 방식으로 관찰된다 (도 21a 및 21b). OPN305는 2㎍/ml의 농도에서 NF-kB 활성을 거의 완전히 억제한다(도 21c).
도 22a는 NF-kB 의존적 SEAP 활성 대 [Pam3CSK4]를 도시한 것이며, 도 22b는 1 A/ 대 1/S의 라인위버-버크 플롯을 도시한 것이다.
도 23은 플라젤린(TLR5, 도 23c) 및 LPS (TLR4, 도 23b)에 대한 톨-유사 수용체 매개된 반응이 OPN-305에 노출되지 않은 대조군 세포와 비교할 때 변경되지 않음을 도시한 3개의 챠트 A, B 및 C를 도시한 것이다. 예상되는 바와 같이, Pam3CSK 및 FSL-1에 대한 톨-유사 수용체 2 매개된 반응은 OPN-305에 의해 차단되었다(도 23a). 이는 OPN-305가 리간드에 대한 TLR4 또는 TLR5 반응성에 있어서의 임의의 예상치 못한 증가 또는 감소를 초래하지 않음을 나타내는 것이다.
도 24는 OPN-305 모노클로날 항체가 Pam3Csk4 유발 패혈증을 억제함을 도시한 것이다. 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 (n=4)을 100 ㎍의 Pam3Csk4으로 처리하기 30분 전에 OPN-305로 명시된 용량으로 처리하였다.
도 25는 OPN305가 Pam3Csk4 유발 패혈증을 억제함을 도시한 것이다. 이러한 실험에서, OPN305는 100 ㎍의 Pam3Csk4의 복막내 투여 30분 전에 정맥내로 투여되었다. 4 시간 후에, 마우스는 치사 마취에 의해 희생되었으며, 혈액을 채취하였다. 혈청을 얻고 시토카인 농도를 ELISA로 측정하였다. 혈청을 KC 및 IL 12p40의 경우에 1/10으로 및 IL-6 ELISA의 경우에 1/5로 희석시켰다.
도 26은 TLR2가 랫트 폐포 대식세포(NR8383) 상에서 발현되고 OPN305를 이용하여 검출됨을 도시한 것이다. (A) 염색되지 않은 세포, (B) 양성 대조군; 폴리클로날 토끼 항-랫트 TLR2 1차 항체, 2차 항체는 항-토끼 Alexa-Fluor 488임; (C) 폴리클로날 인간 IgG4로 처리된 세포, 2차 항체는 인간 항-IgG4 PE임; (D) OPN305 염색된 세포, 2차 항체 항-인간 IgG4 PE.
도 27은 TLR2가 돼지 PBMC 상에서 발현되고 OPN305에 의해 염색됨을 도시한 것이다. PBMC를 피콜(Ficoll)을 이용한 분리에 의해 정제하였다. A-C는 Pig 666으로부터의 PBMC이며, D-F는 Pig 488로부터이다. A, D는 염색되지 않은 것이며, B, E는 폴리클로날 인간 IgG4로 라벨링된 후에 PE 라벨링된 항-인간 IgG4로 2차 염색된 것이며, C, F는 OPN305로 라벨링된 후에 PE 라벨링된 항-인간 IgG4로 2차 염색된 것이다.
도 2a는 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열인 서열 번호: 4를 도시한 것이다. 도 2b는 카바트에 따라 번호가 매겨진, 가변 중쇄 누클레오티드 서열 (서열 번호: 19) 및 추정 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸 서열 번호: 2를 도시한 것이다.
도 4는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 엔코딩하기 위해 번역될 수 있는 핵산 서열을 나타낸 서열 번호: 3을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 아미노산 서열인 서열 번호: 5를 도시한 것이다.
도 6은 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 엔코딩하기 위해 번역될 수 있는 핵산 서열을 나타낸 서열 번호: 6을 도시한 것이다.
도 7은 인간 톨-유사 수용체 2의 아미노산 서열을 제공하는 서열 번호: 15를 도시한 것이다.
도 8은 뮤린 톨-유사 수용체 2의 아미노산 서열을 제공하는 서열 번호: 16을 도시한 것이다.
도 9는 OPN-305 매개된 톨-유사 수용체 2 길항작용이 CD32에 결합하는 항체에 의존적이지 않음을 도시한 것으로서, 그룹 1은 대조군 염소 항체의 첨가를 나타낸 것이며, 그룹 2는 염소 항-hCD32a 차단 항체의 첨가를 나타낸 것이며, 그룹 3은 염소 항-hCD32b 차단 항체의 첨가를 나타낸 것이다.
도 10은 OPN301 모노클로날 항체에 의해 매개된 톨-유사 수용체 2 길항 작용이 CD32에 결합하는 항체에 의존적이며(도 10a), OPN-305 매개된 톨-유사 수용체 2 길항 작용이 CD32에 결합하는 항체에 의존적이지 않음(도 10b)을 도시한 것이다.
도 11은 OPN-305가 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지며(도 11a) IgG4 동형 대조군 항체가 톨-유사 수용체 2에 결합하기 위해 OPN-301과 경쟁적이지 않는(도 11b), FACS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 12는 OPN-305 (OPN-305-21)가 뮤린 TLR2 반응을, 뮤린 OPN-301 항체와 균등한 방식으로 억제함을 도시한 것이다.
도 13은 OPN-305가 과립구(도 13a) 및 단핵구(도 13b) 상에서 발현되지만 림프구에서 발현되지 않는(도 13c) 원숭이 TLR2에 결합한 3 FACS 분석 트레이스를 도시한 것이다.
도 14는 OPN-305가 원숭이 TLR2에 결합시키기 위해 항-TLR2 뮤린 모노클로날 항체 OPN-301과 경쟁적인 것으로 나타낸 2 FACS 분석 트레이스를 도시한 것으로서, 도 14(a)는 과립구에 대한 결과를 도시한 것이며, 도 14(b)는 단핵구에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 15(a) 및 (b)는 16/60 Sephacryl S200 칼럼 상에서 크기배제 크로마토그래피에 의해 연마된 항체 샘플의 트레이스를 도시한 것이다. 도 15(a)는 항-TLR2 키메라 항체를 도시한 것이며, 도 15(b)는 OPN305 항체 (VK5A/H4)를 도시한 것이다. 각 경우에, 모노머 피크 스패닝 부분(spanning fraction) B8 내지 B4가 수집되었다.
도 16은 4개의 도너 샘플(donor sample)에서 시험된 세포 독성 및 T 세포 조절 활성에 대한 시험 샘플의 사전-스크린을 도시한 것이다. 샘플 1(각 그룹의 제 1 칼럼(검정색 바))은 키메라 항-TLR2 항체이며, 샘플 2 (각 결과의 그룹의 제 2 칼럼 (백색 바)는 VK5A/H4 (OPN305)이며, 샘플 3 (제 3의 바 (진한 회색))은 KLH와 함께 VK5A/H5로 명시된 비교 항체이며, 샘플 4 (각 그룹의 오른쪽 측면 상의 제 4 바 (밝은 회색))는 단지 대조군인 KLH이다. 이러한 결과는 7일 째에 생존 세포 카운트를 도시한 것이다. KLH의 존재 하에서 인큐베이션된 샘플의 S.l.s은 KLH 단독과 비교하였다. KLH의 존재 하에 인큐베이션된 샘플의 S.I.s는 KLH 단독의 것과 비교되었다. S.I.s를 3일 샘플링 시간에 걸쳐 평균화되었다. 양성 반응을 결정하기 위한 컷-오프(cut-off)는 SI ≥ 2이다.
도 17(a), (b) 및 (c)는 에피스크린 테스팅(episcreen testing)의 결과를 도시한 3개의 바 차트(bar chart)를 도시한 것이다. 키메라 항-TLR2, VK5A/H4 및 VK5A/H5 항체를 21개의 도너로부터 PBMC를 이용하여 EpiScreen™ 타임 코스 T 세포 검정으로 시험하였다. 시험 항체와 함께 인큐베이션된 PBMC의 벌크 배양물을 5, 6, 7 및 8일째에 샘플링하고, 3H-티미딘과 함께 펄싱하였다. 세포를 수확하고, 방사성 활성의 도입을 섬광 카운팅(scintillation counting)으로 측정하였다. 각 제3 샘플(triplicate sample)에 대한 결과를 평균화하고, 자극 지수(SI)로 변환시킴으로써 일반화시켰다. 각 도너에 따른 각 시점에 대한 SI는 (a) 키메라 항체, (b) OPN-305 항-TLR2 항체 (VK5A/H4로 명시됨), (c) VK5A/H5로 명시된 비교 항-TLR2 항체에 대해 상기에 나타내었다. SI ≥ 2를 갖는 양성 반응을 결정하기 위한 컷-오프는 두꺼운 검정색 수평 라인에 의해 강조되었으며, 현저한 반응(스튜던트의 t-시험에서의 p<0.05)은 (*)로 나타내었다.
도 18은 EPISCREEN™ 기술을 이용하여 예측된 면역원성과 임상적 셋팅에서 관찰된 면역원성과의 비교를 나타낸 것이다. 16개의 치료학적 단백질을 EPISCREEN™ 기술을 이용하여 면역원성의 상대적 위험성에 대해 시험하였다. 결과를 임상에서 사용될 때 각 단백질에 대해 관찰된 면역원성(항-치료용 항체 반응)의 빈도에 대해 플롯팅하였다 (PubMed로부터의 공급된 데이타). 회귀 라인 및 보정 상수가 나타내어져 있다.
도 19는 OPN-305 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 22) 및 T2.5 뮤린 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 21)의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것으로서, 여기서 결정된 서열 일치성은 89.2%인 것으로 나타났다.
도 20은 OPN-305 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 24) 및 T2.5 뮤린 항-TLR2 모노클로날 항체 (서열 번호: 23)의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것으로서, 여기서 결정된 서열 일치성은 88.1%인 것으로 나타났다.
도 21은 TLR2 의존적 신호전달의 완전한 억제가 OPN-305의 최대 수용체 결합 미만으로 달성됨을 도시한 것이다. NF-kB 활성의 억제는 Pam3Csk4로의 처리 후에 용량 의존적 방식으로 관찰된다 (도 21a 및 21b). OPN305는 2㎍/ml의 농도에서 NF-kB 활성을 거의 완전히 억제한다(도 21c).
도 22a는 NF-kB 의존적 SEAP 활성 대 [Pam3CSK4]를 도시한 것이며, 도 22b는 1 A/ 대 1/S의 라인위버-버크 플롯을 도시한 것이다.
도 23은 플라젤린(TLR5, 도 23c) 및 LPS (TLR4, 도 23b)에 대한 톨-유사 수용체 매개된 반응이 OPN-305에 노출되지 않은 대조군 세포와 비교할 때 변경되지 않음을 도시한 3개의 챠트 A, B 및 C를 도시한 것이다. 예상되는 바와 같이, Pam3CSK 및 FSL-1에 대한 톨-유사 수용체 2 매개된 반응은 OPN-305에 의해 차단되었다(도 23a). 이는 OPN-305가 리간드에 대한 TLR4 또는 TLR5 반응성에 있어서의 임의의 예상치 못한 증가 또는 감소를 초래하지 않음을 나타내는 것이다.
도 24는 OPN-305 모노클로날 항체가 Pam3Csk4 유발 패혈증을 억제함을 도시한 것이다. 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 (n=4)을 100 ㎍의 Pam3Csk4으로 처리하기 30분 전에 OPN-305로 명시된 용량으로 처리하였다.
도 25는 OPN305가 Pam3Csk4 유발 패혈증을 억제함을 도시한 것이다. 이러한 실험에서, OPN305는 100 ㎍의 Pam3Csk4의 복막내 투여 30분 전에 정맥내로 투여되었다. 4 시간 후에, 마우스는 치사 마취에 의해 희생되었으며, 혈액을 채취하였다. 혈청을 얻고 시토카인 농도를 ELISA로 측정하였다. 혈청을 KC 및 IL 12p40의 경우에 1/10으로 및 IL-6 ELISA의 경우에 1/5로 희석시켰다.
도 26은 TLR2가 랫트 폐포 대식세포(NR8383) 상에서 발현되고 OPN305를 이용하여 검출됨을 도시한 것이다. (A) 염색되지 않은 세포, (B) 양성 대조군; 폴리클로날 토끼 항-랫트 TLR2 1차 항체, 2차 항체는 항-토끼 Alexa-Fluor 488임; (C) 폴리클로날 인간 IgG4로 처리된 세포, 2차 항체는 인간 항-IgG4 PE임; (D) OPN305 염색된 세포, 2차 항체 항-인간 IgG4 PE.
도 27은 TLR2가 돼지 PBMC 상에서 발현되고 OPN305에 의해 염색됨을 도시한 것이다. PBMC를 피콜(Ficoll)을 이용한 분리에 의해 정제하였다. A-C는 Pig 666으로부터의 PBMC이며, D-F는 Pig 488로부터이다. A, D는 염색되지 않은 것이며, B, E는 폴리클로날 인간 IgG4로 라벨링된 후에 PE 라벨링된 항-인간 IgG4로 2차 염색된 것이며, C, F는 OPN305로 라벨링된 후에 PE 라벨링된 항-인간 IgG4로 2차 염색된 것이다.
본 발명은 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지고, 톨-유사 수용체 2에 결합할 때, 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시키는 완전 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 완전 인간 항체로부터 유래된 결합 단편, 및 서열 번호: 1의 가변 경쇄 도메인 아미노산 서열 및/또는 서열 번호: 4의 가변 중쇄 도메인 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하는 결합 구성원을 제공한다.
용어 "톨-유사 수용체 2 기능을 길항시키는", 또는 유사한 용어, 예를 들어 "톨-유사 수용체 2 길항제" 또는 톨-유사 수용체 2의 효능제"는, 항체, 단편 또는 결합 구성원이 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하고 톨-유사 수용체 2, 예를 들어 톨-유사 수용체 2 리간드의 활성화를 야기시키는 톨-유사 수용체 2에 대한 리간드 또는 결합 화합물의 결합을 억제하거나 차단함을 의미한다. 항체, 단편 또는 결합 구성원은 톨-유사 수용체 2 리간드의 결합 후에 톨-유사 수용체 2에 의해 매개된 세포내 신호전달을 억제하거나 저하시킴으로써 톨-유사 수용체 2 활성화 및 기능을 추가로 억제할 수 있다. "톨-유사 수용체 2 활성화 및 다운스트림 매개된 신호전달"은 TLR2의 활성화에 의해 유도된 임의의 세포내 신호전달 경로를 의미한다. 신호전달 경로는 TLR2 특이적 경로일 수 있거나, "공동의(shared)" 신호전달 경로일 수 있으며, 예를 들어 여기서 신호전달 경로는 다른 소스에 의해, 예를 들어 전사 인자 NF-kappaB와 같은 면역 반응의 매개체의 활성화에 기여하는 TLR2와는 다른 수용체의 활성화에 의해 활성화될 수 있다.
TLR2는 2 작용성 헤테로다이머로 다이머화하는 것으로 알려져 있다. 특히, TLR2는 톨-유사 수용체 1 또는 톨-유사 수용체 6 중 하나를 갖는 헤테로다이머를 형성시키는 것으로 알려져 있다. 다른 헤테로다이머는 톨-유사 수용체 4 (TLR4, TLR-4) 및 톨-유사 수용체 10 (TLR10, TLR-10)과 함께 형성되는 것이 가능하다. 이러한 다이머화는 상이한 미생물 유래된 리간드에 의해 TLR2의 결합을 초래하는 구별(discrimination)과 관련이 있다는 것이 교시되어 있다. 본 발명자는, 본 발명의 인간화 항체가 톨-유사 수용체 2가 톨-유사 수용체 1 또는 톨-유사 수용체 6을 갖는 헤테로다이머를 형성하는지의 여부와는 무관하게 TLR2 기능을 길항시키도록 기능한다는 것을 확인하였다.
항체 결합
에피토프
본 발명의 인간화 항체, 또는 이의 단편, 또는 이를 기초로 한 결합 구성원은 톨-유사 수용체 2에 선택적으로 결합하고, 이의 기능을 길항시킨다. 모노클로날 항체는 수용체의 리간드 결합 부위에 가까운 결합에 의해 이의 리간드에 의한 수용체의 활성화를 차단할 수 있으며, 이는 리간드 결합 부위에 대한 리간드의 접근을 방해하는 입체적 방해를 야기시킨다.
임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 본 발명에 따른 인간화 항체에 의해 결합된 결합 부위를 확인하였다. 상기 항체는 톨-유사 수용체 2 (TLR2)의 성숙한 세포외 도메인의 N-말단 및 C-말단 도메인 둘 모두로부터 유래된 잔기들을 포함하는 에피토프에 결합한다. 특정 구체예에서, 상기 에피토프는 톨-유사 수용체 2의 586개의 아미노산 서열로부터 결정된 바와 같이 톨-유사 수용체 2의 N-말단의 아미노산 잔기 19 내지 39를 포함하며, 상기 아미노산은 KEESSNQASLSCDRNGICKGS (서열 번호: 13)이다. 결합 에피토프는 서열 번호: 1의 아미노산 서열의 C-말단 영역에 존재하는 바와 같이 톨-유사 수용체 2의 아미노산 잔기 538 내지 549를 추가로 포함하며, 이러한 서열은 아미노산 CSCEFLSFTQEQQ (서열 번호: 14)를 포함한다.
교차-반응성
통상적으로, 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 결합 구성원에 의해 길항되는 TLR2는 포유류 TLR2 (또는 이의 작용성 변형체), 예를 들어 인간 TLR2 또는 뮤린 TLR2이다. 특정 구체예에서, 길항되는 TLR2는 도 7에서 서열 번호: 15로서 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 인간형의 TLR2이며, 이는 유전자은행 수탁번호 AAC 34133으로서 정의된 바와 같은 784개의 아미노산 전장 인간 톨-유사 수용체를 포함한다 (URL www.ncbi.nlm.nih.gov).
특정의 다른 구체예에서, 톨-유사 수용체 2는 뮤린 TLR2이며, 이는 유전자은행 수탁번호 NP_036035로부터 얻어진 바와 같이, 도 8에서 서열 번호: 16으로서 정의된 아미노산 서열을 포함한다(Mus musculus).
특정의 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 결합 구성원은 원숭이 세포 상에서 발현되는 톨-유사 수용체 2의 기능적 활성 또는 신호전달을 길항시키기 위해 제공된다.
특정의 다른 구체예에서, 항체는 (i) 10-7M 내지 10-11M의 해리 상수, (ii) 10-8M 내지 10-9M의 해리 상수, (iii) 10-9M 내지 10-10M의 해리 상수, (iv) 10-11M 내지 10-12M의 해리 상수로 이루어진 군으로부터 선택된 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 단편은 3x10-8 또는 미만, 또는 4x10-8 또는 미만의 Kd로 인간 또는 뮤린 톨-유사 수용체 2에 결합할 수 있다.
이에 따라, 톨-유사 수용체 2에 대한 본 발명의 항체의 결합은 TLR2와 이의 리간드의 리간드/수용체 상호작용과 관련된 세포내 신호전달을 차단시킬 수 있다.
항체 구조
본 발명의 항체 및 항체 단편은 완전 인간이다. 즉, 항체를 포함하는 아미노산 잔기는 예를 들어, 마우스와는 상반되는 바와 같이 인간 종으로부터 유래된다. 이에 따라, 본 발명의 항체는 뮤린 항체 또는 키메라 항체, 예를 들어 마우스/인간 항체 보다 낮은 면역원성을 갖는다.
뮤린 또는 키메라 항체의 투여로부터 얻어진 면역원성은 모노클로날 항체의 치료학적 사용에 대한 가장 현저한 장벽인 것으로 입증되었다. 이에 따라, 완전 인간 항체의 제공은 1회 초과의 피검체에 투여될 때, 항체에 대해 관련된, 면역원성 반응, 예를 들어 HAMA 반응을 형성시킬 수 있는, 뮤린, 또는 인간/마우스 키메라 항체의 제공과 관련된 문제를 극복한다. 이러한 반응은 피검체의 혈청으로부터 뮤린 또는 키메라 항체를 배제하여, 항체가 이의 타겟에 도달하고 이의 의도된 치료학적 효과를 형성시키는데 방해한다. 이에 따라, 본 발명의 완전 인간 항체는 이러한 뮤린 및 키메라 항체에 대한 현저한 장점을 부여한다.
항체에 대한 면역원성의 하나의 본질적인 원인은 항체 상에 존재하는 CD4+ T 세포 에피토프이다. 이에 따라, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 항체 또는 항체 단편 상에 존재하는 임의의 CD4+ T 세포 에피토프를 동정하고 개질시키기 위해 분석되었다. 이러한 공정은 본 발명의 항체 및 항체 단편의 면역원성을 추가로 감소시킨다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 피검체에 투여될 때 면역원성 반응이 항체에 대해 일어나지 않게 하기 위하여 추가로 사용될 수 있는 하나 이상의 기술로 처리될 수 있다. 이러한 기술들의 예는 당해 분야의 기술자에게 널리 공지된 것으로서, 면역성 감축 기술, 유전자 셔플링(gene shuffling) 및 페그화를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 생물학적 기능 또는 치료학적 활성을 향상시키기 위하여, 다른 최적화 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 항체의 하기 특성을 개질시킴을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 효능, 친화력, 결합 특이성, K 온(on) (결합 속도 상수), K 오프(off) (해리 속도 상수), 열역학적 안정성, 용해도, 혈청 반감기, 발현, 접힘 동력학, 단백질분해효소 감수성, Fc 영역 이펙터 기능 및 약물 회수. 조절될 수 있는 생물학적 기능 또는 치료학적 활성은 효능의 향상, 개선된 약물동력학 프로파일, 향상된 환자 편의성, 감소된 상품 비용, 개선된 안전성 프로파일, 감소된 면역원성 및 연장된 보관 기간을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
TLR2
-
매개된
질환의 치료
본 발명의 인간화 항체, 항체 단편 및 결합 구성원은 특히 톨-유사 수용체 2 매개된 활성화 및 신호전달을 억제함으로써 면역억제 (면역 반응, 가장 특히 전-염증성 면역 반응의 억제)를 유도할 수 있다. 톨-유사 수용체 2 기능의 이러한 억제는 본 발명에 의해, 톨-유사 수용체 2 활성화 및 신호전달이 질환의 개시 또는 진행에 기여하는 질환 증상의 치료 또는 예방에서의 유용성을 갖는 것으로서 확인되었다.
본 발명의 항체는 예를 들어, 시험관내, 생체외, 및 생체내 치료학적 방법에서 사용될 수 있다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 톨-유사 수용체 2 활성화 및 신호전달에 의해 매개된 질환 증상의 치료를 위한 본 발명의 항체, 항체 단편, 또는 결합 구성원의 용도에 관한 것이다.
허혈의 치료
이에 따라, 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 허혈 재관류 손상(ischemia reperfusion injury) 또는 이에 의해 야기되거나 이와 관련된 증상의 치료 및/또는 예방시키는 방법을 제공한다:
- 치료학적 유효량의, 본원에서 정의된 인간화 항체, 또는 이의 결합 단편을 제공하는 단계, 및
- 이러한 치료를 필요로 하는 피검체에 상기 화합물을 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 허혈 재관류 손상 또는 심장 염증성 증상(cardiac inflammatory condition)을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 완전 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원을 제공한다.
또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 허혈 재관류 손상 또는 심장 염증성 증상의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이의 단편 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도를 제공한다.
특정 구체예에서, 심장 염증성 증상은 재관류 손상의 발생으로부터 야기되는 것으로, 심근 허혈, 허혈성 심장 질환, 고혈압 심근 허혈, 울혈성 심부전, 조직 허혈, 장기 허혈, 급성 관동맥 증후군, 비대, 뇌경색, 심근 경색, 부정맥, 허혈 재관류 손상 (I/R 손상)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다.
허혈은 장기 또는 신체의 일부가 충분한 혈액 공급을 수용하지 못할 때 야기된다. 적절한 혈액 공급이 허용되지 않는 장기는 저산소성(hypoxic)이라고 한다. 재관류는 혈류가 임시 차단(deprivation) 후에 장기에 재개될 때 일어난다. 재관류 손상은 허혈 기간 후에 조직에 혈액 공급의 순환시에 조직 또는 장기에 대해 일어나는 손상과 관련이 있다. 허혈의 기간 동안 산소 및 영양소의 부재는 순환이 되돌아올 때, 염증 및 산화성 손상의 시기에 일어난다. 허혈 재관류 손상의 예는 저산소증, 뇌졸중, 심장 발작, 만성 신부전 또는 장기 이식을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 이러한 양태의 방법은 피검체에서 장기 이식으로부터 일어날 수 있는 허혈 재관류 손상의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 실질 장기 이식으로부터 일어날 수 있는 허혈의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기를 포함하는, 피검체에서 실질 장기 이식과 관련된 허혈 재관류 손상에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직에서의 톨-유사 수용체 2 (TLR2)의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키는 방법을 제공한다:
- 세포 또는 조직을 본 발명에 따른 톨-유사 수용체 2 길항성 항체와, 세포 또는 조직에서 TLR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키기에 충분한 양으로 접촉시킴.
특정 구체예에서, TLR2 발현 세포 또는 조직은 심근의 세포 또는 조직이다. 특정 구체예에서, TLR2 발현 세포 또는 조직은 심근 허혈, 허혈성 심장 질환, 고혈압 심근 허혈, 울혈성 심부전, 조직 허혈, 장기 허혈, 급성 관동맥 증후군, 비대, 뇌경색, 심근 경색, 부정맥, 허혈 재관류 손상 (I/R 손상)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택된 재관류 유도된 심장 염증성 증상과 관련된 세포 또는 조직이다.
특정 구체예에서, 본 방법은 허혈 재관류 손상을 가진 또는 이러한 위험을 갖는 인간 피검체 상에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 양태는 실질 장기 이식과 관련된 허혈 및 재관류를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
자가면역 질환의 치료
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 자가면역 질환 또는 이와 관련된 증상을 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다:
- 치료학적 유효량의, 본원에서 정의된 인간화 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하는 단계, 및
- 이러한 치료를 필요로 하는 피검체에 상기 화합물을 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원을 제공한다.
또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도를 제공한다.
특정 구체예에서, 자가면역 질환은 자가면역 관절염, 특히 류머티스성 관절염이다. 특정 구체예에서, 자가면역 질환은 건선, 피부염을 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정의 다른 구체예에서, 자가면역 질환은 당뇨병이다. 통상적으로, 당뇨병은 당뇨병(diabetes mellitus)이다. 특정 구체예에서, 당뇨병은 제 1형 당뇨병이다. 특정의 다른 구체예에서, 당뇨병은 제 2형 당뇨병이다.
특정 구체예에서, 당뇨병에 걸린 피검체로부터 나타나는 증상은 당뇨병 합병증이라고 불려질 수 있다. 이러한 당뇨병 합병증은 급성 합병증, 만성 합병증, 또는 둘 모두의 조합일 수 있다.
당뇨병 합병증이 급성 합병증인 경우에, 합병증은 망막증, 신경병증, 말초 순환 질병, 피부 궤양, 다뇨증, 번갈증, 다식증, 당뇨병성 케톤산증 (DKA) 및 고삼투압 비케톤성 상태를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 잇따. 특정의 다른 구체예에서, 상기 증상은 상기 급성 또는 만성 증상들 중 임의의 하나로부터 나타나는 증상일 수 있고, 실명, 단백료, 통증, 마비, 사이크로에스테시아(psychroesthesia), 간헐성 파행증 및 괴저를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
특정의 다른 구체예에서, 당뇨병 합병증은 혈관의 손상을 일으키는 혈액 글루코스 수준의 만성적인 상승으로부터 나타나는 혈관 질환과 같은 만성 합병증일 수 있다 (혈관병증). 이러한 구체예에서, 혈관 손상이 작은 혈관에 대해 일어나는 경우에, 이는 마이크로-혈관병증을 야기시킬 수 있고, 이는 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증, 및 당뇨병성 신장병증 중 하나 이상을 일으킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 상기 양태들 중 임의의 것에 따른 항체,또는 이로부터 유래된 결합을 치료학적 유효량으로 피검체에 투여함을 포함하여, 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2의 활성화에 의해 완전힌 또는 일부 매개된 피검체에서 비만 관련 질병을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 비만을 치료하고/거나 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원을 제공한다.
또 다른 양태는 증상이 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개되는 경우에 비만과 관련된 질환 증상의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서, 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도를 제공한다.
특정 구체예에서, 비만 관련 질병은 당뇨병, 특히 제 2형 당뇨병, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 감소된 글루코스 제거율, 이상 지질혈증, 비알코올성 지방간 질환, 고혈압, 염증, 간종, 간 지방증, 심근 경색, 천식 또는 뇌졸중을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상이다.
본 발명의 또 다른 양태는 피검체에, 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 항체, 또는 본 발명에 의해 제공된 결합 구성원을 투여함을 포함하는, 피검체에서 인슐린 내성을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 피검체에서 인슐린 내성을 치료하는데 사용하기 위한 인간화 항체, 이의 단편, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원을 제공한다.
또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개된 피검체에서 인슐린 내성의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도를 제공한다.
안질환의 치료
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함한 안질환을 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다:
- 치료학적 유효량의 본 발명에 의해 제공되는 인간화 항체, 결합 단편 또는 결합 구성원을 제공하는 단계; 및
- 이러한 치료를 필요로 하는 피검체에 상기 화합물을 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 안질환을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 안질환은 포도막염 또는 노인성 황반 퇴행 (AMD)이다.
신장 염증의 치료
본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 신장 염증 및 이에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다:
- 치료학적 유효량의, 본 발명의 의해 제공된 인간화 항체, 결합 단편 또는 결합 구성원을 제공하는 단계, 및
- 이러한 치료를 필요로 하는 피검체에 상기 화합물을 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개되는 신장 염증 또는 신장 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원을 제공한다.
또 다른 양태는 톨-유사 수용체 2 리간드에 의한 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 완전히 또는 일부 매개되는 신장 염증 또는 신장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원의 용도를 제공한다.
본원에서 정의된 용어 "신장 염증" 및 "신장 질환"은 신장 또는 신장의 세포 내에 염증의 발생에 의해 실질적으로 특징되거나 신장에서의 염증의 발생이 신장 이외의 신체에서의 부위에 주로 영향을 미치는 질환 또는 염증성 증상에 의해 야기되는 증상으로 확장한다. 특히, 염증은 사구체, 보우만 주머니 또는 보우만 공간을 포함하지만 이로 제한되지 않는 부위에서 발생할 수 있다. 통상적으로, 염증은 신장 기능의 적어도 부분적 손상 및/또는 신부전을 초래한다.
특정 구체예에서, 신장 염증 및 질환은 "신장 질환"을 포함하는 것으로서, 여기서 용어 신장 질환은 일반적으로 인간의 적어도 하나의 신장의 질병을 칭하는 것이며, 이러한 질병은 신장(들)의 기능을 떨어뜨리거나 손상시키며, 이는 예를 들어 소변으로 단백질의 유출에 의해 또는 질소 폐기물의 배설에 의해 생리학적으로 특징된다. 신장 질환은 또한 신장의 원발성 병리(primary pathology), 예를 들어 사구체 또는 세관에 대한 손상, 또는 다른 장기, 예를 들어 췌장에 대한 손상을 형성시킬 수 있으며, 이는 단백질의 보유와 같은 생물학적 기능을 수행하기 위한 신장의 능력에 악영향을 미친다. 이에 따라, 인간의 신장 질환은 다른 장기에 영향을 미칠 수 있는 질환 증상의 직접 또는 간접적으로 영향을 받을 수 있다. 신장에 영향을 미치지만 신장을 특이적으로 타겟화하지 않는 질환의 예에는 당뇨병 및 전신 루푸스(systemic lupus)가 있다. 용어 신장 질환은 구 "신장의 질환"으로 본원에서 교호적으로 사용된다. 신장 질환은 예를 들어, 신장 피질 또는 신장 골수 중 하나에서 사구체, 세관 또는 간질 조직에 대한 임의의 변경, 손상 또는 외상을 나타내거나 이의 결과일 수 있다.
특정 구체예에서, 신장 질환은 또한 진행성 신장 질환일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "진행성 신장 질환"은 시간에 따라 (예를 들어 일, 주, 달, 년) 신장 기능의 상실을 초래하는 신장의 임의의 질환을 칭한다. 본원에서 정의되는 용어 "신장 기능"은 일반적으로 신장의 생리학적 성질, 예를 들어 단백질을 보유하여 단백뇨 (예를 들어, 알부민뇨)를 예방하는 능력을 칭한다. 신장 기능은 예를 들어, 사구체 여과율(예를 들어, 크레아티닌 제거율), 소변에서의 단백질의 배출, 예를 들어 알부민뇨, 혈액 우레아 질소, 혈청 또는 혈장 크레아티닌, 또는 임의의 이들의 조합에 의해 평가될 수 있다.
용어 "신장 염증 및 질환"의 의미내에 속하는 특정 증상의 예는 만성 신부전, 급성 신부전, 이종 신독성 신장염, 사구체신염, 사구체의 경화증, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 당뇨병성 신장병, 간의 경화증을 수반하는 당뇨병성 신장병, 및 간의 경화증에 의해 수반되는 사구체신염을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 신장 질병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
특정의 다른 구체예에서, 신장 염증 및 질환은 신장의 세포 및/또는 신장기능에 영향을 미치는 면역-매개된 질환에 관한 것일 수 있다. 이러한 증상은 면역글로불린 A 신장병, 막증식 사구체신염, 혈관간세포 증식 사구체신염, 비증식 사구체신염, 막 사구체신염, 미소변화 사구체신염, 원발성 국소성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 특발성 원섬유성 사구체신염, 이뮤노탁토이드(immunotactoid) 사구체신염, 증식성 사구체신염, 진행성 사구체신염, 항-GBM 질환, 신장 허혈, 신장 맥관염, 항-호중구 세포질 항체 (ANCA)와 관련된 질환 (예를 들어, 베게너육아종증), 낭창성 신염 랭글로불린혈증 관련 사구체신염, 세균성 심내막염, 헤노흐-쉔라인 자반증, 감염후 사구체신염, C형 간염, 당뇨병성 신장병, 아밀로이드증, 고혈압성 신경화증, 다발성 골수종, 2차 초점성 사구체경화증, 및 고혈압성 신경화증으로부터의 경쇄 질환을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "신장 염증 및 질환"은 또한 급성 신부전을 포함한다. 급성 신부전("ARF")은 핍뇨증(<500 mL/일)과 함께 또는 이의 없이 급격하게 지속적으로 증가하는 질소 혈증과 관련된 임상적 증상을 칭하는 것이다. ARF의 원인은 하기의 세 가지 진단 카테고리로 그룹핑될 수 있다: 신전성 (적절치 않은 신관류); 신후성 (폐쇄); 및 신장. ARF의 병태생리학은 복잡하고 다인성이다. 현 개념은, ARF가 직접 신세뇨관 손상, 신장 허혈 또는 세뇨관내 폐쇄로부터 일어날 수 있다고 제시하고 있다. 임상적으로, ARF는 감소된 사구체여과 및 대사 폐기물, 물 및 전해질의 감소된 분비를 초래한다. 유체 오버로드(fluid overload), 전해질 불균형 및 요독 증후군은 장기 기능이상을 초래한다. 장기 기능이상은 궁긍적으로 사망을 초래할 수 있다.
여러 다른 양태에서, 본 발명은 TLR2-반응성 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 허혈을 일으키거나 허혈을 일으킬 수 있거나 재관류를 일으킬 수 있는 조직, 췌장의 랑거한스(Langerhans) 아일렌드의 세포, 또는 TLR2를 발현시키고 TLR2 매개된 질환 증상 또는 이의 진행과 연관된 임의의 다른 세포 타입)에서 기능을 조정하는 방법 (예를 들어 TLR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 변경시키는 방법)에 관한 것이다. 본 방법은 TLR2-반응성 세포 및/또는 TLR2-반응성 조직을 본 발명에 의해 제공되는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편을, TLR2-반응성 세포 또는 조직의 기능 또는 세포 또는 조직에서 TLR2의 생물학적 활성을 길항시키기에 충분한 양으로 접촉시킴을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 접촉 단계는 시험관내에서, 예를 들어 세포 용해물에서 또는 재구성된 시스템에서 달성될 수 있다. 대안적으로, 본 방법은 배양물 중의 세포 상에서, 예를 들어 시험관내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포, 예를 들어 정제되거나 재조합된 세포는 시험관내에서 배양될 수 있으며, 이러한 접촉 단계는 배양 배지에 TLR2 조절제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 통상적으로, TLR2-반응성 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 구체예에서, TLR2-반응성 조직은 허혈을 일으키고 재관류를 일으킬 수 있거나 이와 관련된 세포 집단인 조직이다. 다른 구체예에서, 본 방법은 피검체에 존재하는 세포, 예를 들어 생체내 프로토콜의 일부로서, 또는 동물 피검체(예를 들어 인간 피검체, 또는 생체내 동물 모델 포함)에서 수행될 수 있다. 생체내 프로토콜은 치료적 또는 예방적 프로토콜일 수 있으며, 염증성 모델은 예를 들어 유전학적으로 변형된 모델, 예를 들어 과발현된 TLR2, 또는 TLR 수용체에서의 돌연변이 또는 결실을 갖는 동물 모델일 수 있다. 생체내 방법에 대하여, 인간화 항체 또는 이의 단편은 단독으로 또는 다른 제제, 예를 들어 2차 치료제, 예를 들어 항-염증성 약물, 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합하여 제공될 수 있다. 통상적으로, 항체는 TLR2-매개된 증상, 예를 들어 류머티스성 관절염, 허혈 재관류 손상, 당뇨병 또는 신장 염증에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 피검체에, 피검체에서 하나 이상의 TLR2 매개된 활성 또는 기능을 길항시키기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 구체예에서, 투여되는 본 발명의 인간화된 항-TLR2 항체의 투약량은 TLR2의 하나 이상의 기능적 활성을 변경, 예를 들어 감소시키거나 억제하기 위해 요구되는 항체의 양을 시험관내 또는 생체외로 시험함으로써 투여 전에 결정될 수 있으며, 상기 기능적 활성은 통상적으로 본원에 기술된 하나 이상의 TLR2 생물학적 활성이다.
상기 임의의 치료 방법은 본 발명의 항-TLR2 항체 또는 항체 결합 단편 대신에, 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 이용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 진단 적용에서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. 이와 같이, 본 발명의 다른 양태는 톨-유사 수용체 2의 증가된 발현과 관련된 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 방법은 시험 세포를 본 발명의 항-TLR2 항체와 접촉시키고, TLR2에 한 항-TLR2 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에 의한 TLR2의 발현 수준을 (정성적이거나 정량적으로) 결정하고, 시험 세포에 의한 TLR2의 발현 수준을 대조군 세포에 의한 TLR2의 발현 수준(예를 들어, 정상 세포와 유사한 수준에서 TLR2를 발현시키는 세포 또는 시험 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포)과 비교함을 포함하는데, 여기서 대조군 세포와 비교하여 시험 세포에 의한 보다 높은 TLR2의 발현 수준은 TLR2의 증가된 발현과 관련된 질병의 존재를 나타내는 것이다. 특정 구체예에서, 시험 세포는 TLR2의 증가된 발현과 관련된 질병을 갖기에 쉬운 개체로부터 얻어진다. 특정 구체예에서, 질병은 상기에 기술된 염증성 질병 또는 면역 매개된 질병이다.
치료학적 효능
본 발명자는 본원에 제공된 인간화된 항-TLR2 항체가 당해 분야에 공지된 항-TLR2 뮤린 모노클로날 항체 보다 치료학적으로 더욱 바람직하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 인간화 항체 및 종래 기술의 뮤린 항-TLR2 항체의 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 존재하는 구조적 차이 이외에, 본 발명자는 또한 놀랍게도 임상적 셋팅에서 더욱 바람직한 이러한 항체를 사용하는 본 발명의 인간화 항체에 의해 부여되는 다수의 기능적 장점들을 확인하였다.
임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는, 11 G7 항-TLR2 뮤린 모노클로날 항체와 비교할 때, 본 발명에 따른 완전 인간화 항체가, TLR2가 TLR1 또는 TLR6 중 하나와 헤테로다이머를 형성하는지의 여부와 무관하게 상기 항체가 TLR2 기능을 길항시키기 때문에 우수한 기능적 및 임상적 유용성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
뮤린 TL2.1 항체와 관련하여, 본 발명자는 본 발명의 인간화 항체가 상이한 포유류 형태의 TLR2, 예를 들어 인간, 뮤린, 랫트, 돼지 및 원숭이 형태의 TLR2에 대해 교차 반응하는 반면 뮤린 TL2.1 항체가 단지 인간 TLR2에 대한 결합 특이성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 인간화 항체는 어떠한 뮤린 아미노산 잔기도 포함하지 않으며, 이에 따라 피검체에 투여될 때 중화 항체에 대해 발생되는 중화 항체의 가능성은 뮤린 유래된 TL2.1 항체와 비교할 때 최소이다.
T2.5 항체와 관련하여, 본 발명자는 놀랍게도, T2.5 항체 (마우스 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 항체, 융합 세포 클론 T.25 HyCuIt Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: 카탈로그 번호 1054로부터 유래됨)가 TLR2 활성화 및 신호전달의 길항작용을 매개하면서, 이는 CD32-의존적 방식으로 발생한다는 것을 확인하였다. 본 발명자는 본 발명의 완전 인간화 항체가 TLR2 신호전달의 억제를 매개하기 위해 CD32를 요구하지 않으며, 즉 항체의 Fab 부분에 의해 결합될 때 TLR2 수용체의 길항작용을 매개하기 위해 예를 들어 항체의 Tc 영역에 의한 CD32에 대한 결합이 일어나지 않는다는 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 OPN-305 완전 인간화 모노클로날 항체에 의해 매개된 톨-유사 수용체 2 기능의 길항작용은 CD32 독립적 방식으로 매개된다. 이는 CD32a 및 CD32b 둘 모두에 대한 결합을 포함한다. 본 발명자에 의해 이루어진 이러한 놀라운 관찰은, 본 발명의 완전 인간화 항체가 잠재적으로 보다 큰 환자 접근성을 갖기 때문에 임상적으로 유의미하다.
또한, 본 발명의 완전 인간화 항체는 TLR2 아미노산 서열의 N 및 C 말단 둘 모두에 존재하는 잔기에 의해 규정된 에피토프에 결합하는 것으로 예측된다. 이는 T2.5 모노클로날 항체에 의해 결합된 에피토프가 TLR2 서열의 (단지) N-말단에 위치된다고 기술되어 있는 WO 2005/028509와는 상반되는 것이다.
또한, 본원에 제공된 비교 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명자는 본 발명의 완전 인간화 항체가 감소된 면역원성 프로파일을 나타내고, 즉 상기 항체가 T 세포 에피토프의 결여로 인해 보다 낮은 면역원성임을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에 따른 항체는 인간 피검체에 투여될 때 이들에 대해 증가된 중화 항체 반응을 가지지 않을 것이다. 이러한 기능적 특징은, 본 발명의 완전 인간화 항체가 당해 분야에 공지된 뮤린 항체 TL2.1, T2.5 및 11G7, 또는 통상적인 CDR 이식 기술을 기초로 하여 개발될 수 있는 키메라 항체 또는 인간화 항체를 임상적 셋팅에서 사용하기 위해 훨썬 더욱 바람직하는 것을 의미한다.
항체
"항체"는 천연 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 형성된, 면역글로불린이다. 상기 용어는 또한 본 발명의 인간화 항체의 결합 도메인이거나 이에 대해 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
면역글로불린은 통상적으로 디설피드 결합에 의해 함께 연결된, 두개의 동일한 중쇄 및 두개의 동일한 경쇄를 포함하는 헤테로테트라머 구조를 갖는다. 각 중쇄 및 경쇄는 항원의 결합 특이성을 부여하는 가변 도메인을 포함하며, 이러한 도메인은 중쇄 및 경쇄 각각에 대한 VH 및 VL 도메인으로서 공지된 것이다. 각 사슬은 또한 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하며, 경쇄는 CL 도메인으로 명시된 단일 불변 도메인을 가지며, 중쇄 도메인은 세 개의 불변 도메인인 CH1 , CH2 및 CH3을 포함한다. 일부 항체 동형은 추가적으로 CH4 도메인으로서 칭하여진 추가 불변 도메인을 포함한다. 인간에서는 5개의 상이한 클래스의 항체, 즉 IgG, IgA, IgD IgE 및 IgM이 존재한다.
항체의 Fc 도메인은 통상적으로 각 사슬의 최종 2개의 중쇄 불변 영역 도메인을 포함한다. 이러한 것들은 ADCC 및 보체 결합과 같은 항체의 이펙터 기능의 매개의 원인이 되는 Fc 도메인을 형성시키기 위해 다이머화한다. 항체의 Fc 영역은 또한 항체의 순환 반감기에서 역할을 한다. 개질은 항체 기능을 조정하기 위해 Fc 도메인으로 이루어질 수 있다.
항체가 여러 방식으로 개질될 수 있기 때문에, 용어 "항체"는 본 발명의 인간화 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 임의의 특정 결합 구성원으로 확대하는 것으로 해석될 수 있다.
이에 따라, 용어 "항체"는 항체 단편 및 동족체 뿐만 아니라 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가지고 TLR2 기능을 길항시키기 위해 제공되는 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드로 확대한다.
또한, 전체 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이러한 결합 단편의 예는 (i) 헤테로테트라머 항체의 VL, VH, CL 및 CH1 도메인로 이루어진 Fab 단편, (ii) 경첩 영역에 디설피드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (iii) 경첩 영역의 일부를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편, (iv) 헤테로테트라머 항체의 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (v) 헤테로테트라머 항체의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결된 scFv (단쇄 Fv 분자), (vii) 단리된 CDR, 예를 들어 VHCDR3, 및 (viii) 유전자 융합 기술에 의해 형성된 다가 또는 다중특이적 단편일 수 있는 멀티머의 폴리펩티드인 디아바디(diabody)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
특정의 다른 양태에서, 본 발명은 또한 이중특이성 항체에 관한 것이다. 이러한 것들은 화학적 콘주게이션 수단에 의해, 또는 혼성 융합 세포주에 의해 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이중특이성 항체는 이중특이성 항체 단편, 예를 들어 scFv 다이머 또는 디아바디로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 전체 항체 보다 scFv 다이머가 사용될 수 있다. 이러한 디아바디는 단지 가변 도메인을 이용하여 구성될 수 있고, 이에 따라 Fc 영역 없이 제공되며, 이러한 구조는 HAMA 또는 항-특이형 면역 반응의 가능한 발생을 감소시킨다.
항체 도메인에서의 아미노산 잔기는 카바트 등(Kabat et al.)에 의해 발명된 시스템에 따라 통상적으로 번호가 매겨진다 (URL - www.kabatdatabase.com). 이러한 넘버링은 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된다.
펩티도미메틱(Peptidomimetics)
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 결합 단편을 기초로 한 펩티도디메틱에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "펩티도미메틱" 또는 "펩티드 미메틱(peptide mimetic)"은 폴리펩티드가 아니지만 이러한 구조의 유사 구조를 가지고 본 발명의 상황에서 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하고 이러한 방식으로 톨-유사 수용체 2의 기능적 활성을 길항시키는 분자를 칭하는 것이다. 이에 따라, 본 발명은 톨-유사 수용체 2 길항제로서 작용하는 본 발명의 항체를 기초로 한 펩티도디메틱으로 확장한다.
펩티도미메틱 길항제는 통상적인 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다[참조, Damewood J. R. "Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry" in Reviews in Computational Biology, 2007, Vol. 9, pp.1 -80, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1996; Kazmierski W.K., "Methods of Molecular Medicine: Peptidomimetic Protocols," Humana Press, New Jersey, 1999]. 톨-유사 수용체 2 길항제인 펩티도미메틱이 제조될 수 있는데, 여기서 상기 펩티도디메틱은 본 발명의 항체, 및 특히 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 기초로 한다. 예를 들어, 펩티드와 동일한 작용기를 갖는 다당류가 제조될 수 있다. 펩티도미메틱은 예를 들어 타겟 분자에 결합되거나 결합할 수 있는 환경에서 펩티드 제제의 3차원 구조를 확립시킴으로써 디자인될 수 있다. 펩티도미메틱은 적어도 두 개의 성분, 결합 부분 또는 부분들, 및 골격 또는 지지 구조물을 포함한다.
결합 부분은 타겟 분자, 예를 들어 리간드 결합 부위에 또는 부근의 아미노산(들), 예를 들어 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함한 톨-유사 수용체 2 에피토프와 반응하거나 (예를 들어, 소수성 또는 이온성 상호작용을 통해) 착물을 형성하는 화학적 원자 또는 기이다. 예를 들어, 펩티도디메틱에서의 결합 부분은 펩티드 또는 단백질 길항제에서의 결합 부분과 동일할 수 있다. 결합 부분은 본 발명의 항체와 동일한 또는 유사한 방식으로 톨-유사 수용체 2와 반응하는 원자 또는 화학적 기일 수 있다. 펩티드에서 염기성 아미노산을 위한 펩티도디메틱을 디자인하는데 사용하기 위해 적합한 결합 부분의 예는 질소 함유 기, 예를 들어 아민, 암모늄, 구아니딘, 및 아미드, 또는 포스포늄을 포함한다. 산성 아미노산을 위한 펩티도미메틱을 디자인하는데 사용하기 위해 적합한 결합 부분의 예는 예를 들어 카복실, 저급 알킬 카복실산 에스테르, 설폰산, 저급 알킬 설폰산 에스테르 또는 인산 또는 이의 에스테르를 포함한다.
지지 구조물은 결합 부분 또는 부분들에 결합될 때, 펩티도미메틱의 3차원 구성을 제공하는 화학적 독립체(chemical entity)이다. 지지 구조물는 유기물 또는 무기물일 수 있다. 유기 지지 구조물의 예는 유기 합성 폴리머의 다당류, 폴리머 또는 올리고머를 포함한다(예를 들어, 폴리비닐 알코올 또는 폴리락타이드). 지지 구조물은 펩티드 골격 또는 지지 구조물과 동일한 크기 및 치수를 실질적으로 갖는 것이 바람직하다. 이는 원자의 크기 및 펩티드와 펩티도미메틱의 결합을 계산하거나 측정함으로써 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 펩티드 결합의 질소는 산소 또는 황으로 치환되어 예를 들어 폴리에스테르 골격을 형성시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 카보닐은 설포닐 기 또는 설피닐 기로 치환될 수 있으며, 이에 의해 폴리아미드(예를 들어, 폴리설폰아미드)를 형성시킨다. 펩티드의 역 아미드(reverse amide)가 제조될 수 있다 (예를 들어, a-NHCO-기를 하나 이상의 CONH-기로 치환시킴). 또 다른 구체예에서, 펩티드 골격은 폴리실란 골격으로 치환될 수 있다.
이러한 화합물은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리에스테르 펩티도미메틱은 아미노산 상에서 상응하는 α-아미노 기를 히드록실 기로 치환시키고, 이에 의해 히드록시 산을 제조하고 이후에 히드록시 산을 에스테르화시키고, 임의적으로 부반응을 최소화하기 위하여 염기성 및 산성 측쇄를 블로킹시킴으로써 제조될 수 있다. 적절한 화학적 합성 경로를 결정하는 것은 일반적으로 화학적 구조를 결정 시에 용이하게 확인될 수 있다.
펩티도미메틱은 수 개 내지 다수의 별도의 분자 종을 포함하는 라이브러리로 합성화되고 어셈블링될 수 있다. 이러한 라이브러리는 조합 화학의 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 라이브러리가 요망되는 활성을 갖는 하나 이상의 펩티도미메틱을 포함하는 경우를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이후에 이러한 펩티도미메틱 길항제는 적합한 방법에 의해 분리될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 특정의 다른 양태는 본 발명의 톨-유사 수용체 2 결합 항체의 파라토프(paratope)를 기초로 하여 디자인된 펩티도미메틱에 관한 것이다. 특히, 이러한 펩티도미메틱은 본원에 기술된 항체의 CDR 영역의 구조를 기초로 한다. 이러한 펩티도미메틱의 생산 기술은 당해 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌 [Dougall et al. ("Design of pharmacologic agents based on antibody structure", Trends in Biotechnology. 1994. 12. p372-379)]의 방법을 포함할 것이다. 또한, 문헌[Saragovi et al. (Saragovi, et al., "Design and Synthesis of a 미메틱 from an Antibody Complementarity-Determining Region", Science 253:792-795 (1991) 및 Saragovi et al., "Loops and Secondary Structure Mimetics: Development and Applications in Basic Science and Rational Drug Design", Biotechnology 10: 773-778 (1992))]의 기술이 포함될 것이다. 이러한 펩티도미메틱은, 특히 중쇄의 CDR3을 기초로 할 수 있다. 문헌 [Williams, et al. (Williams et al., "Design of Bioactive Peptides Based on Antibody Hypervariable Region Structures", J.Biol. Chem. 266: 5182-5160 (1991))]에는 항체의 경쇄의 상보성 결정 영역으로부터 유래된 배좌 구속된 펩티드(conformationally constrained peptide)의 단리 및 합성이 기재되어 있다. 이러한 CDR은 이의 구조에 영향을 미치는 복잡한 유전학적 메카니즘의 결과로서 항체의 결합 특이성에서 특히 중요하며, 이는 다양한 패턴의 상호작용을 갖는 중간 정도 또는 긴 루프를 갖도록 야기시킨다. 펩티드 루프 또는 리버스 턴(reverse turn)의 배좌 성질은 폴리펩티드의 생물학적 활성에서 중요한 매개체로 여겨진다. 턴(turn)은 소분자에서 접혀진 형태를 안정화시킴으로써 생활성을 위해 필수적인 결합 기의 적합한 배향을 제공하고 결합 부위 및 인식 부위 둘 모두에서 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 톨-유사 수용체 2 항체를 기초로 한, 항체 미메틱, 예를 들어 애피바디(Affibody), 도메인 항체, 나노바디,(Nanobody) 유니바디(Unibody), DARPin, 안티칼린(Anticalin), 아비머(Avimer), 베르사바디(Versabody), 및 듀오칼린(Duocalin)에 관한 것이다. 광범위한 항체 미메틱 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 소위 도메인 항체 (Domantis, UK)는 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 하나의 가변 영역에 상응하는 항체의 작은 기능적 결합 단위이다. 이러한 도메인 항체의 생산에 대한 경향은 미국특허번호 6,291,158호, 미국특허번호 6,582,915호 및 미국특허번호 6,593,081호에서 확인될 수 있다. 나노바디는 카멜리드(camelid)에서 발견되는 천연 발생 중쇄 항체의 독특한 구조적 및 기능적 성질을 함유한 항체-유래 치료학적 단백질이다. 유니바디는 IgG4 항체의 경첩 영역의 제거를 기초로 한 다른 항체 단편 기술이다. 경첩 영역의 결실은 통상적인 IgG4 항체의 크기의 대략 절반이고 일가 결합 영역을 갖는 분자를 형성시킨다. 유니바디는 불활성이고 이에 따라 면역 반응을 유발시키지 않는 IgG4 항체의 성질을 보존한다. 이에 따라, 본원에 기술된 본 발명의 항체의 구체예와 같은, IgG4 항체 기반 치료제와 같이, 유니바디는 세포의 특정 기능을 길항시키기 위해 사용될 수 있지만, 세포 사멸은 통상적으로 일어나지 않을 것인데, 왜냐하면 IgG4 항체와 같은 유니바디가 결합될 타겟에 대한 면역 반응을 매개하지 않기 때문이다. 유니바디는 IgG4에 대해 유사한 속도로 신체로부터 제거되고 이들의 타겟 항원에 유사한 결합 친화성으로 결합한다.
다른 결합 분자는 애피바디 분자 (미국특허 5,831,012), DARPins (디자인된 안키린 반복 단백질), 및 안티칼린 (미국특허번호 7,250,297 및 WO 99/16873)을 포함한다. 베라바디는 다른 항체 미메틱 기술이다. 베르사바디 (Amunix, 미국특허출원공개번호 2007/0191272)는 마이크로단백질로 언급되는, 15% 초과의 시스테인 잔기를 갖는 3-5 kDa의 소단백질로서, 이는 통상적으로 단백질에 나타나는 소수성 코어를 대체하는 높은 디설피드 결합 밀도 골격을 형성시킨다.
아비머(Avimer)는 다른 타입의 항체 미메틱이다. 아비머는 인간 혈청 단백질의 패밀리의 재조합으로부터 기원한 것이다. 이러한 것들은 모듈러 결합 도메인으로 이루어진 단일 단백질 사슬이며, 이들 각각은 특정의 타겟 부위에 결합하도록 디자인된다. 아비머는 단일 단백질 타겟 상의 부위 및/또는 다중 단백질 타겟 상의 부위에 동시에 결합할 수 있다. 다중 포인트 부착 또는 친화성(avidity)으로서 공지된 바와 같이, 이러한 결합 메카니즘은 세포 및 분자가 신체에 상호작용하고 길항제 및 효능제의 발생을 지지하고 여러 기능 및 강력한 활성을 갖는 약물에 이를 수 있는 방식과 유사하다. 아비머 라이브러리는 본원에 참고로 통합된 WO 2004/044011호, 및 특히 99쪽의 실시예 6, 및 예를 들어 미국특허출원(공개)번호 US 2005/0053973, US2005/0089932, US2005/0164301에 따라 생산될 수 있다. 아비머 라이브러리는 또한 Avidia Inc. (Mountain View, California, USA)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
항체 생산
본 발명의 항체 및 결합 구성원은 화학적 합성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 결합 구성원은 당업자에게 널리 공지된 기술, 예를 들어 표준 액체 펩티드 합성 또는 고체상 펩티드 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체 및 결합 구성원은 액상 펩티드 합성 기술을 이용하여 용액 중에서, 또는 추가로 고체상, 액상 및 용액 화학의 조합에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 요망되는 펩티드 또는 폴리펩티드가 엔코딩될 수 있도록, 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 항체를 포함하는 적어도 하나의 아미노산을 엔코딩하는 핵산의 발현에 의한 항체 또는 결합 구성원의 생산에 관한 것이다.
예를 들어, 아미노산 경쇄를 엔코딩하는 핵산, 및 아미노산 중쇄를 엔코딩하는 제 2 핵산은 본 발명의 항체를 제공하기 위해 발현될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 특정의 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 결합 구성원을 형성하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산이 제공된다.
통상적으로, 본 발명의 항체 또는 결합 구성원을 형성하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산은 단리되거나 정제된 형태로 제공되거나 하나 이상의 조절 서열을 제외하고 이와 자연적으로 결합될 수 있는 물질이 실질적으로 존재하지 않는 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 결합 구성원을 발현시키는 핵산은 전부 또는 일부 합성될 수 있고, DNA, cDNA 및 RNA를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 결합 구성원을 엔코딩하는 핵산 서열은 당업자에 의해 문헌[Sambrook et al. "Molecular Cloning", A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1 -3, 2001 (ISBN-0879695773), 및 Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999 (ISBN - 0471250929)]에 기술된 것과 같은 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 기술들은 (i) 핵산의 샘플을 증폭시키기 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 사용, (ii) 화학적 합성, 또는 (iii) cDNA 서열의 제조를 포함한다. 본 발명의 DNA 엔코딩 항체 또는 결합 구성원은, 엔코딩 DNA를 채택하고 발현될 부분의 각 측면에서 적합한 제한 효소 인식 부위를 동정하고, DNA로부터 상기 부분을 절단함을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방식으로, 생성되고 사용될 수 있다. 이후에, 절단된 부분은 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 상업적으로 입수 가능한 발현 시스템과 같은 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 대안적으로, DNA의 관련 부분은 적합한 PCR 프라이머를 이용함으로써 증폭될 수 있다. DNA 서열의 개질은 부위 지향적 돌연변이 유발을 이용함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 결합 구성원을 엔코딩하는 핵산 서열은 상술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카셋트의 형태의 작제물로서 제공될 수 있다. 작제물은 하나 이상의 상기와 같은 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포 내에 포함될 수 있다. 발현은 통상적으로 적절한 조건 하에서 적합한 핵산 서열을 함유한 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현 이후에, 항체 또는 항체 단편은 임의의 적합한 기술을 이용하여 단리되고/거나 정제된 후에 적절하게 사용될 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템이 널리 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모, 곤충 및 바쿨로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 당해 분야에서 이용 가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 세포 및 NSO 마우스 골수종 세포를 포함한다. 통상적인 바람직한 박테리아 숙주는 대장균이다. 대장균과 같은 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당해 분야에 널리 확립되어 있다. 배양물에서 진행 세포의 발현은 또한 결합 구성원의 생산을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용 가능하다.
항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 이러한 방법들은 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497; 미국특허번호 4,376,110; Harlow and Lane, Antibody: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor]에서 논의되어 있다. 재조합 항체 분자의 제조를 위한 기술은 상기 참조문헌에, 및 또한 예를 들어 유럽특허번호 제0,368,684호에 기재되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 항체 또는 결합 구성원의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 위한 삽입 코딩을 포함하는 재조합 핵산이 사용된다. 정의에 따르면, 이러한 핵산은 엔코드 단일 가닥 핵산, 상기 코딩 핵산 및 이에 대한 상보적 핵산으로 이루어진 이중 가닥 핵산, 또는 이의 상보적 (단일 가닥) 핵산 자체를 포함한다.
또한, 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 엔코딩하는 핵산은 천연 발생 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인에 대해 코딩하는 원본 서열(authentic sequence), 또는 이의 돌연변이를 갖는 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산일 수 있다.
본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 수단에 의해 생산될 수 있으며, 이는 바람직하게 성숙된 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 분열 부위를 갖는 단일 서열 또는 그밖의 폴리펩티드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 분열되는) 서열이다. 본래 항체 신호 서열을 인식하고 처리하지 못하는 원핵 숙주 세포에 대하여, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다.
단리(
isolated
)
본 발명의 완전 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 결합 구성원, 또는 이를 엔코딩하는 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은, 상기 항체, 결합 구성원 또는 핵산 (폴리누클레오티드)이 단리되고/거나 정제된 형태로 제공되는, 즉 이러한 것들이 이들의 자연적인 환경으로부터 분리되거나, 단리되거나, 정제된 형태로 제공되고, 실질적으로 순수한 또는 이종 형태, 또는 요망되는 기능을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열과는 다른 기원의 핵산 또는 유전자가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않는 핵산의 경우에 제공되는 상태를 칭하는 것이다. 이에 따라, 이러한 단리된 항체, 결합 구성원, 및 단리된 핵산은 이러한 것들과 자연적으로 결합된 물질, 예를 들어 이들의 자연 환경 또는 이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실행되는 재조합 DNA 기술에 의해 이루어질 때 준비되는 환경(예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 그밖의 폴리펩티드 또는 핵산이 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않을 것이다.
항체, 결합 구성원 및 핵산은 희석제 또는 어주번트와 함께 제형화될 수 있고, 또한 실제적인 목적을 위하여, 단리된 형태로 제공되는 것으로서 여겨질 수 있다. 예를 들어, 항체 및 결합 구성원은, 면역검정에서 사용하기 위한 마이크로적정 플레이트를 코팅하기 위해 사용되는 경우에, 젤라틴 또는 그밖의 담체와 혼합될 수 있거나, 진단 또는 치료에서 사용할 때 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 항체 또는 결합 구성원은 자연적으로 또는 이종 진행 세포 (예를 들어, CHO 또는 NSO 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 이러한 것들은 (예를 들어, 원핵 세포에서 발현에 의해 생산되는 경우에) 비글리코실화될 수 있다.
항-TLR2 인간화 항체 분자를 포함하는 이종 제조물은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들어, 이러한 제조물은 피로글루탐산 잔기를 형성시키기 위한 N-말단 글루탐산의 환형과 같은, 다양한 정도의 글리코실화 및/또는 유도체화된 아미노산을 갖는, 전장 중쇄 및 C-말단 라이신이 결여된 중쇄와 항체의 혼합물일 수 있다.
투여
본 발명의 모노클로날 항체 또는 결합 구성원은 단독으로 투여될 수 있지만, 바람직하게 일반적으로 의도된 투여 경로에 따라 선택된 적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제 조성물로서 투여될 것이다. 적합한 약제학적 담체의 예는 물, 글리세롤, 에탄올 등을 포함한다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 결합 구성원은 임의의 적합한 경로를 통해 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 통상적으로, 조성물은 주사 또는 흡입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 바람직한 경로의 예는 정맥내, 심장내, 동맥내, 복막내, 근육내, 자궁강내, 피하, 점막, 흡입 또는 경피를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 투여 경로는 국소 및 소화관, 예를 들어 점막 (폐 포함), 경구, 비강, 직장을 추가로 포함할 수 있다.
조성물이 주사 가능한 조성물로서 예를 들어 정맥내, 피부내 또는 피하 적용으로 전달되는 구체예에서, 활성 성분은 발열원 부재이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 당업자들은 예를 들어 등장성 비히클, 예를 들어 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 또는 락테이트화된 링거 주사액을 이용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 요구되는 경우에, 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 그밖의 첨가제가 포함될 수 있다.
조성물은 또한 마이크로스피어, 리포좀, 그밖의 미립자 전달 시스템 또는 혈액을 포함하는 특정 조직에 배치된 서방출 제형에 의해 투여될 수 있다.
상술된 기술 및 프로토콜, 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 그밖의 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3 and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7]에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 통합된다.
본 발명의 조성물은 통상적으로 "치료학적 유효량"으로 피검체에 투여되는데, 이러한 치료학적 유효량은 조성물이 투여되는 피검체에 유익한 것으로 나타내는데 충분한 양이다. 투여되는 실제 용량, 및 투여 속도 및 시간-경로는 치료할 증상의 특성 및 중증도, 뿐만 아니라 치료할 피검체의 나이, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 투여 경로에 따를 것이고 이러한 것들과 상당히 관련하여 결정될 수 있다. 또한, 적당한 고려사항은 조성물의 성질, 예를 들어 이의 결합 활성 및 생체내 혈장 수명, 제형에서 항체 또는 결합 구성원의 농도, 뿐만 아니라 전달 경로, 부위 및 속도로 제공될 것이다.
투약 계획(dosage regimen)은 조성물의 단일 투여, 또는 조성물의 다중 투여 용량을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 본 발명의 항체 또는 결합 구성원이 치료를 위해 투여되는 증상의 치료를 위해 사용되는 그밖의 치료제 및 약제와 순차적으로 또는 별도로 투여될 수 있다.
피검체에 투여될 수 있는 투약 계획의 예는 1 ㎍/kg/일 내지 20mg/kg/일, 1 ㎍/kg/일 내지 10mg/kg/일, 10㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일을 포함하지만 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 투약은 1 ㎍/ml 내지 100㎍/ml 항체의 혈장 농도가 얻어지도록 이루어질 것이다. 그러나, 투여되는 조성물의 실제 용량, 및 투여 속도 및 시간-경로는 치료할 증상의 특성 및 중증도에 의존적일 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투약 등의 결정은 결국 일반 개업의 및 그밖의 의사의 책임내에 및 이들의 결정에 따르고, 통상적으로 치료할 질병, 개개 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 개업의에게 공지된 그밖의 인자들을 고려한다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 전문적 및 과학적 용어들은 본 발명의 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
명세서 전반에 걸쳐, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 파생어는 임의의 다른 항목 또는 항목들의 배제가 아닌, 기술된 항목 또는 항목들의 그룹의 포함을 뜻하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 단수 명사는 문맥에서 명확하기 달리 요구하지 않는 한 단수 대상 및 복수의 대상을 포함한다. 이에 따라, 예를 들어, "활성제" 또는 "약리학적 활성제"에 대한 언급은 단일의 활성제 뿐만 아니라 조합한 두 개 이상의 상이한 활성제를 포함하는 것이며, "담체"에 대한 언급은 단일의 담체 뿐만 아니라 두 개 이상의 담체들의 혼합물 등을 포함하는 것이다.
용어 "특이적으로 결합한다," "선택적으로 결합한다" 또는 "결합 특이성"은 비-타겟 에피토프에 결합될 때 형성되는 친화력 보다 큰 친화력을 갖는 톨-유사 수용체 상에 존재하는 타겟 에피토프에 결합하는 본 발명의 완전 인간화 항체 또는 결합 화합물의 능력을 칭하는 것이다. 특정 구체예에서, 특이적 결합은 비-타겟 에피토프에 대한 친화력 보다 적어도 10, 50, 100, 250, 500, 또는 1000 배 큰 친화력으로 타겟에 대한 결합을 칭하는 것이다. 특정 구체예에서, 이러한 친화력은 친화력 ELISA 검정에 의해 측정된다. 특정 구체예에서, 친화력은 BIAcore 검정에 의해 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 친화력은 동력학 법(kinetic method)에 의해 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 친화력은 평형/솔루션(equilibrium/solution) 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 신장에서 TLR2-매개된 염증을 억제하기 위해 요구되거나 중증도를 감소시키고/거나 TLR2-매개된 신장 질환 또는 이의 적어도 하나의 증상 또는 이와 관련된 증상을 완화시키는 본 발명의 제제, 결합 화합물, 소분자, 융합 단백질 또는 펩티도미메틱의 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방학적 유효량"은 본 발명의 화합물의 투여 후에 피검체에서 TLR2-매개된 질환 또는 염증성 증상, 또는 이의 적어도 하나의 증상의 최초 발병, 진행 또는 재발을 예방하는데 요구되는 조성물의 양에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료," 및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 관련된 용어들은 TLR2-매개된 증상 또는 이의 적어도 하나의 징후의 진행, 중증도 및/또는 기간의 감소를 의미하는 것으로서, 여기서 상기 감소 또는 완화는 본 발명의 TLR2 결합 에피토프에 대한 특이성을 갖는 결합 화합물의 투여로부터 나타나는 것이다. 이에 따라, 용어 '치료'는 피검체에 유익할 수 있는 임의의 투약 계획(regimen)을 칭하는 것이다. 이러한 치료는 존재하는 증상에 대한 것일 수 있거나 예방적인 것일 수 있다(예방학적 치료). 치료는 치유, 완화 또는 예방 효과를 포함할 수 있다. 본원에서 "치료학적" 및 "예방학적" 치료에 대한 언급은 이들의 가장 넓은 상황에서 고려되기 위한 것이다. 용어 "치료학적"은 반드시 피검체가 완전히 회복될 때까지 치료되는 것을 의미하는 것은 아니다. 유사하게, "예방학적"은 반드시 실제로 질환 증상을 줄이는 것을 의미하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "피검체"는 동물, 바람직하게, 포유동물, 및 특히 인간을 칭하는 것이다. 특정 구체예에서, 피검체는 포유동물, 특히 인간이다. 용어 "피검체"는 본원에서 사용되는 용어 "환자"와 서로 바꾸어 사용가능하다.
본 발명은 하기에서 하기 실시예를 참조로 하여 기술될 것인데, 하기 실시예는 예시 목적을 위해 제공된 것으로서 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않을 것이다.
실시예
실시예
1 - 완전 인간화 모
노클로날
항체의 생산
본 발명의 TLR2 길항성 항체는 통상적으로 완전 인간화 항체이다. 즉, 이러한 항체의 기원은 완전 인간으로서, 이에 따라, 이러한 항체는 마우스와 같은 비-인간 종으로부터 유래된 영역 또는 아미노산 조합물을 함유하지 않는다.
본 발명의 완전 인간화 항체를 생산하는 하나의 방법으로는 국제 PCT 특허출원번호 WO 2006/082406호에 기술된 바와 같이 조성물 인간 항체 기술 (Antitope, UK)을 이용하는 것이다. 이러한 항체는 인간 항체로부터 유래된 아미노산 서열의 2개 이상의 단편을 포함하는 복합 단백질이다. 최종 항체에서 T-세포 에피토프의 존재를 피하도록, 예를 들어 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함하지 않거나 MHC 클래스 II에 대한 펩티드의 결합을 고정시키는 잔기를 포함하지 않게 하기 위해 예를 들어 잔기, 특히 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 잔기를 스크리닝함으로써, 이러한 단편을 선택할 수 있다. 또한, T 세포 에피토프가 존재하지 않도록 하기 위해 본 발명의 완전 인간화 항체의 가변 영역을 분석하는 인-실리코(in-silico) 방법을 선택할 수 있다.
복합 인간 항체 기술을 이용하여 완전 인간화 항체를 생산함에 있어서, 많은 서열 단편의 조성물을 포함하는 최종 항체가 생산되는데, 여기서 이들 모두의 기원은 인간으로서 상이한 인간 항체로부터 유래된 것이다. 간단하게, 이러한 기술은, 상보성 결정 영역(CDR)을 동정하기 위해 출발 모노클로날 항체, 예를 들어 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 갖는 뮤린 또는 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 분석하는 단계를 포함한다. 이후에, 항체 가변 영역의 단백질 모델은 스위스 PDB를 이용하여 주형으로서 존재하는 항체 구조물을 이용하여 생성된다. 이러한 구조 모델은 이후에 항체의 결합 성질에 대해 필수적일 수 있는 본래 항체의 가변 도메인 영역에서 중요한 "구속(constaining)" 아미노산을 동정하기 위해 분석된다. 다수의 프레임워크 잔기와 함께, CDR 영역 내에 함유된 잔기 (카바트 및 코티아(Chothia) 정의 둘 모두를 이용하여 정의됨)가 통상적으로 중요하다. 단백질 모델로부터의 구조적 정보는 항체 구조 및 서열 데이타베이스로부터 항체 확인 및 존재하는 구조적으로 균등한 잔기와의 결합을 위해 중요한 잔기를 동정하고 비교하기 위해 사용된다. 이러한 아미노산은 최종 인간화된 서열의 하나 이상의 변형체 포함하기 위한 후보물질일 수 있다. 본 발명의 항체를 제조함에 있어서, 본 발명의 완전 인간화 항체를 기초로 하는 뮤린 항-TLR2 항체 (마우스 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 항체, 융합 세포 클론 T2.5로부터 유래, Cell Sciences, Canton, USA: 카탈로그 번호 1054)의 VH 및 VK 서열 둘 모두는 특히 항체가 임계 위치, 예를 들어 카바트 잔기 45-49 (LEWIG) 및 92-94 (CAR)에서 매우 통상적인 서열 배열을 갖는 VH에서 통상적인 프레임워크 잔기를 함유하는 것으로 보여진다.
이후에 소스 모노클로날 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산의 서열은 최종 인간화된 서열에 포함시키기 위한 가능한 중쇄 및 경쇄 인간 서열을 동정하기 위해 인간 가변 영역 서열의 상응하는 단편과 비교된다. 이후에, 최종 완전 인간화된 중쇄 및 경쇄는 인간 가변 영역 서열의 단편으로부터 전체적으로 디자인된다.
완전 인간화 항체는, 먼저 어닐링하고, 결찰되고 PCR 증폭된 일련의 오버랩핑 올리고누클레오티드를 이용하여 VH 및 VK 영역 유전자를 합성하여 전장 합성 V 영역을 수득함으로써 디자인되고 생성된다. 이후에, 폴리누클레오티드 서열은 적합한 발현 벡터로 직접 클로닝되는데, 이의 예는 당업자에게 널리 공지된 것으로서 예를 들어, 항체에 대해 엔코딩하는 발현 벡터 시스템, 예를 들어 IgG이다. 본 발명의 OPN-305 항체의 생산에서 사용되는 발현 벡터의 경우에, 발현 벡터 시스템은 개질된 경첩 영역 (S241 P 치환), 뿐만 아니라 중쇄 및 카파 경쇄를 포함하는 IgG4 유래 서열에 관한 것이다. 중쇄 및 경쇄는 이후에 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 NSO 세포로 안정적으로 트랜스팩션되고 200 nM 메토트렉세이트 (Sigma, 카탈로그 번호 M8407)를 사용하여 선택된다. 메토트렉세이트 내성 콜로니는 IgG 발현 수준에 대해 시험된다.
NSO 세포가 사용되었지만, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 세포가 사용될 수 있다. 특히 포유류 세포 배양물 내에서 포유류 세포의 사용은 본 발명의 항체 및 결합 단편의 생산을 위한 플랫폼으로서 바람직하다. 포유류 세포의 사용은, 단백질에 적용되는 N-글리코실화 프로파일로 인해 특히 바람직한데, 이는 이러한 글리코실화 프로파일이 인간 단백질에서 발견된 것과 유사하기 때문이다. 포유류 세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 세포주는 CHO, NSO 융합 세포, 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, 및 PER.C6™ 인간 세포를 포함한다. 생산 스케일 부피에서 포유류 세포 배양을 위해 사용되는 가장 통상적으로 사용되는 포유류 세포주는 CHO 및 NSO 세포주이다. 이러한 세포 타입은 유전공학적으로 비교적 용이하고, 광범위하게 특징분석되었고, 대용량으로 성장시키기에 비교적 용이하고, 용액 중에서 높은 역가의 재조합 단백질을 분비한다. CHO 및 NSO 세포주 둘 모두는 고 단백질 발현 수준을 형성시킬 수 있다.
포유류 세포 기반 단백질 발현 플랫폼 이외에, 플랜트(plant) 기반 발현 시스템, 또는 형질전환 동물 시스템의 사용은 또한 본 발명의 단백질의 생산 용도를 위해 이용될 수 있다.
이후에 복합 항체는 단백질 A 세파로즈 칼럼 (GE Healthcare 카탈로그 번호 110034-93) 상에서 세포 배양 상청액으로부터 정제되고 Ec(0.1 %)=1.43에서 계산된 소광 계수(extinction coefficient)를 이용하여 OD280nm에 의해 정량화되었다. 이후에 정제된 항체는 경쟁 ELISA 검정에서 시험되어 톨-유사 수용체 2에 대한 결합을 확인하였다. 이러한 결합은 기준 항체, 예를 들어 완전 인간 항체의 디자인을 기초로 한 바이오틴화된 형태의 톨-유사 수용체 2 결합 항체의 결합과 비교될 수 있다. 특히, ELISA 경쟁 검정으로부터의 흡광도는 샘플 농도에 따라 플롯팅되고 완전 인간 및 본래 바이오틴화된 항체와 관련된 데이타 셋트 각각을 통해 라인 핏팅될 수 있다. 이러한 직선의 방정식은 TLR2에 대한 바이오틴화된 기준 항체 결합을 50% 까지 억제하기 위해 요구되는 농도 (소위, IC50 값)를 계산하기 위해 사용되었다. IC50 값은 결합 효능의 배율 차이(fold difference)를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 측정된 결합 효능은 생산된 완전 인간화 항체의 특이성의 중요한 측정일 수 있다. 또한, 비교, 예를 들어 동일한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 키메라 또는 뮤린 항체에 대한 완전 인간화 항체의 비교가 또한 수행될 수 있다.
실시예
2 -
OPN
-305
모노클로날
항체의 결합 성질의 측정
본 발명자는 놀랍게도, T2.5 TLR2 길항성 뮤린 모노클로날 항체가 톨-유사 수용체 2 기능을 전부 길항시키기 위해 CD32에 대한 결합을 요구하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 중화 톨-유사 수용체 2 생물학적 활성의 효과를 매개하기 위해 T2.5 항체의 사용과 관련된 이러한 기능적 한계가 또한 OPN-305 모노클로날 항체의 사용과 관련되지 않음을 확인하기 위한 실험이 수행되었다.
재료 및 방법:
THP-1 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포이다. 톨-유사 수용체 리간드에 응하여, 전사 인자 NF-kappaB 및 그밖의 전사 인자는 THP1 세포에서 활성화된다. THP-1 Blue 세포주를 NF-kappaB 및 AP-1과 같은 수개의 전사 인자에 의해 유도 가능한 프로모터의 제어 하에서 분비된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP)를 엔코딩하는 보고된 플라스미드로 안정하게 트랜스펙션시켰다. THP-1 CD14 Blue 세포주 변형체는 향상된 감작성을 위해 세포 표면 단백질 CD14를 과발현시킨다. 얻어진 THP-1-CD14 Blue 세포는 선택 가능한 마커 제오신(Zeocin) 및 블라스티시딘에 대해 내성을 갖는다. TLR 자극 하에서, THP-1 Blue 세포는 전사 인자를 활성화시키고, 이후에 QUANTI-Blue 리포터를 이용하여 검출 가능한 SEAP의 분비를 활성화시킨다. QUANTI-Blue는 세포 배양물의 상청액에서 분비된 알칼리 포스파타제 (SEAP) 활성을 결정하기 위해 개발된 비색 효소 검정(colorimetric enzymatic assay)이다. SEAP의 존재 하에, QUANTI-Blue 배지는 육안으로 용이하게 검출될 수 있는 퍼플-블루 칼라로 변하거나 625-655nm에서 광학적 밀도(OD)를 판독함으로써 정량화된다.
THP1 CD14 Blue 세포는, 5㎍/ml-0.18㎍/ml의 범위로 항-CD32a 항체 (RnD #AF1875) 또는 항-CD32b 항체 (RnD #AF1330) 또는 염소 IgG로 사전 혼합된 OPN-305 항-TLR2 모노클로날 항체 (1 ㎍/ml)와 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션된 후에, 20ng/ml의 TLR1/TLR2 효능제 Pam3CSK4로 자극시켰다. OPN-305 모노클로날 항체는 서열 번호 2:로서 본원에서 정의된 경쇄 및 서열 번호: 5로서 본원에서 정의된 중쇄를 갖는 완전 인간화 항체이다.
이후에, 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이후에, 상청액을 제거하고, QUANTI-Blue (Invivogen, San Diego, USA)를 첨가하기 전에 열 불활성화시켰다. NF-kB 활성화를 나타내는 비색 변화를 루미노미터(luminometer)를 이용하여 650nm에서 측정하였다.
결과는 도 9에 도시되어 있는데, 이러한 결과는 톨-유사 수용체 2 길항제로서 OPN-305의 기능적 활성이 항-CD32a/b 항체의 첨가에 의해 차단되지 않음을 설명한다. 이에 따라, 이는, OPN-305에 의해 매개된 톨-유사 수용체 2 중화 활성이 CD32a 또는 CD32b에 대한 결합에 의존적이지 않음을 명시한다.
실시예
3 - 톨-유사 수용체 2 길항작용에서의
CD32
의 역할
실시예 2의 결과는, 본 발명의 OPN-305 완전 인간화 항체에 의한 톨-유사 수용체 2의 길항작용이 CD32 (CD32a 또는 CD32b 중 하나)에 대한 항체 결합에 의존적이지 않음을 시사한다.
이를 확인하고, 당해 분야에 공지된 그밖의 TLR2 길항성 항체, 예를 들어 T2.5 뮤린 TLR2 모노클로날 항체 (OPN-301)와의 비교를 제공하기 위하여, 추가 실험을 수행하였다.
재료 및 방법:
THP-1 CD14 Blue 세포 (Invivogen, San Diego, USA)를, CD32a 또는 CD32b를 차단하는 항체의 여러 용량으로 사전인큐베이션하였다.
사전인큐베이션된 THP-1 CD14 Blue 세포를 (i) 항-인간 FcgammaRlla (CD32a) 항체 (R&D Systems, 카탈로그 번호 AF1875, 상기 실시예에서 사용됨), (ii) 항-인간 FcgammaRII (CD32) 항체 (R&D Systems, 카탈로그 번호 AF1330) 또는 (iii) 동형 대조군 항체 (염소 IgG (R&D systems, 카탈로그 번호 AB-108-C)의 용량을 증가시키면서 인큐베이션시켰다. 이후에, 상기 세포를 100ng/ml의 TLR2 효능제 Pam3CSK4 (Invivogen)로 밤새 자극시켰다.
결과
NF-kB 의존성 SEAP 생산을 세포 상청액에서 측정하였다. 도 10a는 OPN-301 (T2.5 뮤린 항-TLR2 항체)에 노출된 세포에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 OPN-305 완전 인간화된 TLR2 길항제 항체에 노출된 세포에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 10a에서, 칼럼 A는 단지 Pam3CSK4로 자극된 세포에 관한 것이다. 칼럼 B는 OPN-301 항체에 노출된 세포에 관한 것이다. 칼럼 C는 0.4㎍/ml 항-CD32a/b 또는 대조군 염소 IgG 항체와 함께 OPN301 항체에 관한 것이다. 칼럼 D는 2㎍/ml 항-CD32a/b 항체 or a 대조군 염소 IgG 항체와 함께 OPN301 항체에 관한 것이다. 칼럼 E는 OPN301 항체, 플러스(plus) 10㎍/ml 항-CD32a/b 항체 또는 대조군 염소 IgG 항체에 관한 것이다.
도 10b에서, 칼럼 A는 단지 Pam3CSK42로 자극된 세포에 관한 것이다. 칼럼 B는 OPN-305 항체에 노출된 세포에 관한 것이다. 칼럼 C는 0.4㎍/ml 항-CD32a/b 또는 대조군 염소 IgG 항체와 함께 OPN305 항체에 관한 것이다. 칼럼 D는 2㎍/ml 항-CD32a/b 항체 또는 대조군 염소 IgG 항체와 함께 OPN305 항체에 관한 것이다. 칼럼 E는 OPN305 항체, 플러스 10㎍/ml 항-CD32a/b 항체 또는 대조군 염소 IgG 항체에 관한 것이다.
2개의 도면에 나타낸 데이타의 비교는, OPN-305에 의해 매개된 TLR2 길항작용이 CD32와 상호작용하는 항체에 대해 의존적이지 않음을 명확하게 나타내는 것으로서, 이는 CD32를 CD32a 또는 CD32 특이적 항체로 차단시키는 것이 OPN305의 TLR2 중화 능력에 영향을 미치지 않기 때문이다. 반대로, 뮤린 T2.5 항체 (OPN-301)는 톨-유사 수용체 2 기능 활성의 완전한 중화를 매개하기 위하여 CD32에 대한 결합에 의존적인 것으로 나타낸다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이에 따라, 본 발명자는, TLR2 길항작용을 매개함에 있어서 OPN-301 항체가 TLR2 및 CD32에 결합하며, CD32와의 이러한 상호작용이 톨-유사 수용체 2의 길항작용을 매개하는데 필수적이라는 것으로 예측한다. 이에 따라, 톨-유사 수용체 2 기능 활성을 길항시키는 것과 관련하여 OPN-305 항체 및 OPN-301 항체에 의해 사용되는 작용 메카니즘 간의 기능적 차이가 존재한다. 이에 따라, OPN-301의 TLR2 길항성 활성은 CD32에 대한 결합을 차단함으로써 차단될 수 있다. 그러나, CD32, CD32a 또는 CD32b에 결합시키기 위한 OPN-305의 능력을 차단하는 것은 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시키는 이의 능력에 영향을 미치지 않는다.
실시예
4 -
OPN
-305의 톨-유사 수용체 2 결합 특이성의 확인
본 실험은 본 발명의 OPN-305 모노클로날 항체 가 톨-유사 수용체 2 및 특히 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 나타내는 것을 확인하기 위해 디자인된 것이다.
재료 및 방법:
TLR1/TLR2 헤테로다이머를 형성시키기 위해 톨-유사 수용체 1 및 톨-유사 수용체 2로 안정하게 트랜스펙션된 HEK 293 (인간 배아 신장 293) 세포를 얼음 상에서 30분 동안 1.O㎍/ml의 바이오틴화된 형태의 뮤린 항-TLR2 항체 OPN-301 (T2.5) 단독으로 또는 이와 함께 1.O㎍ 또는 10㎍/ml의 완전 인간화된 항-TLR2 항체 OPN-305 또는 OPN-305 IgG4 동형 대조군 항체의 존재하에 인큐베이션하였다.
OPN-301 모노클로날 항체는 뮤린 IgGI 항-TLR2 항체 (마우스 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 항체, 클론 T2.5, HyCuIt Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: 카탈로그 번호 1054)이다.
OPN-305 모노클로날 항체는 서열 번호: 2로서 본원에서 규정된 경쇄, 및 서열 번호: 5로 본원에서 규정된 중쇄를 갖는 완전 인간 항체이다.
이후에 세포를 세척하고, PECy7에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘과 함께 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. FACScalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 결합을 측정하였다. 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11a는 OPN-305 (변형체 21로서 라벨링됨)의 결합에 관한 것이다. 왼쪽에서부터 오른쪽으로 이동하여, 제 1 피크의 가장 진한 라인은 적색 라인에 관한 것이다. 제 1 피크에서 가장 엷은 라인은 녹색 라인에 관한 것이다. 오른쪽으로 이동하여, 제 3, 제 4 및 제 5 피크는 각각 보라색, 청색 및 검정색 피크이다. OPN-305의 결합은 OPN-301 단독 (검정색 히스토그램)과 비교하여 청색 및 보라색 히스토그램 (OPN-301 및 OPN-305를 나타냄)의 왼쪽으로 이동에 의해 나타나는데, 이는 HEK 세포 상에서 인간 TLR2에 대한 결합을 위하여 OPN-305 보다 OPN-301과 경쟁하는 것을 나타내는 것이다. 결론적으로, 도 11a는 피크의 용량 의존적 이동을 나타낸 것으로서, 이는 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 OPN-301과 OPN-305 간의 결합의 경쟁을 나타낸 것이다.
도 11b는 IgG4 동형 대조군과의 결합 결과를 나타낸 것이다. IgG4 동형 대조군 항체가 TLR2에 대한 결합 특이성을 갖지 않기 때문에, 이는 결합에 대해 경쟁하지 않는다. 이에 따라, 검정색, 보라색 또는 청색 피크에서의 이동이 존재하지 않는데, 이는 도 11b의 오른쪽 측면 상에 나타낸 바와 같이 함께 그룹핑되고 제 2 피크로서 나타내고 있다. 왼쪽 측면 상의 피크는 적색 피크(보다 진한 라인) 및 녹색 피크(보다 엷은 라인)에 관한 것이다. 이에 따라, 이러한 결과는, OPN-305가 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 가짐을 확인시킨다.
실시예
5 -
뮤린
톨-유사 수용체 2에 대한
OPN
-305의 교차 반응성
OPN-305가 인간 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 나타낸다는 실시예 4에서의 측정과 함께, 본 실험은 OPN-305 모노클로날 항체가, 뮤린 톨-유사 수용체 2와 같은 다른 형태의 포유류 톨-유사 수용체 2에 OPN-305를 결합시킬 수 있는 톨-유사 수용체 2 종내(intra-species) 교차 반응성을 나타내는 지의 여부를 평가하는 것이다.
재료 및 방법:
J774 마우스 대식세포를 37℃에서 6 시간 동안 5㎍/ml OPN-305 (OPN-305-21로서 칭함), OPN-301 (T2.5) 또는 관련 동형 대조군 항체 (OPN-301의 경우 뮤린 IgGI 및 OPN-305의 경우 인간 IgG4)의 존재 하에 1 x106/ml으로 배양하였다. 세포를 TLR2 효능제 HKLM (Invivogen, San Diego, USA, 카탈로그 번호 tlr-kit2)에 노출시켰다. HKLM은 통기성 세포내 그램 양성 박테리아인 리스테리아 모노사이토진스(Listeria Monocytogenes)의 냉동 건조된 열처리된(heat-killed) 제조물이다. 이후에 상청액을 제거하고, 뮤린 TNF-α 수준을 RnD 시스템스 (R&D Systems)로부터의 특정 ELISA 듀오셋(duoset)으로 측정하였다.
결과
결과는 도 12의 그래프에 나타내었다. 이는 OPN-305가 OPN-301의 억제와 대체로 유사한 방식으로 뮤린 TLR2 반응을 억제하는 것으로 나타낸다. 이에 따라, OPN-305는 표면 또는 뮤린 세포 상에 발현된 톨-유사 수용체 2에 결합하는 교차 반응성이다.
결론적으로, OPN-305는 TLR2 효능제로 자극된 뮤린 J774 대식세포로부터 TNF-α 분비를 저하시키는 것으로 나타났다.
실시예
6 - 원숭이 톨-유사 수용체 2에 대한
OPN
-305의 교차 반응성
원숭이 세포 상에서 발현된 톨-유사 수용체 2에 대한 OPN-305의 결합 특이성을 측정하기 위한 다른 실험을 수행하였다. 이는 OPN-305 항체가 단지 인간 및 뮤린 형태 보다 더욱 광범위한 포유류 형태의 톨-유사 수용체 2에 대한 교차-반응적인 지의 여부를 확인하기 위한 것이다.
원숭이 톨-유사 수용체 2에 대한 OPN-305의 결합을 직접 항체 및 경쟁 결합 검정 둘 모두로 측정하였다.
(i) 직접 결합
시노몰로구스(cynomologus) 원숭이로부터의 전혈 세포를 실온에서 30분 동안 1.O㎍/ml의 OPN-305 또는 IgG4 동형 대조군 항체와 함께 인큐베이션한 후에, PharmLyse (BD Biosciences)와 함께 인큐베이션하여 적혈구를 용해시키고, 이후에 FITC 라벨링된 항-인간 IgG4로 검출하였다.
결과는 도 13a, 13b 및 13c에 나타내었다. 상이한 세포 타입은 이들의 전방 및 측방 산란 특징에 따라 게이팅(gate)되었다. 도 13a는 과립구에 관한 것이다. 도 13b는 단핵구에 관한 것이다. 도 13c는 림프구에 관한 것이다. 결합은, 동형 대조군 항체와 함께 인큐베이션된 세포 (녹색 히스토그램 - 이는 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하여 제 2 피크로서, 이러한 피크는 보다 엷은 칼라를 갖는다)와 비교하여 OPN-305와 함께 인큐베이션된 세포(청색 히스토그램 - 이는 피크의 그룹의 오른쪽 측에서의 피크이다)의 오른쪽으로의 히스토그램 이동에 의해 나타내었다. 도 13a 및 도 13b에서의 결과는, 청색 피크가 녹색 피크 보다 오른쪽으로 더욱 이동함을 나타낸다. 이는 OPN-305가 과립구 및 단핵구 상에서 발현된 원숭이 TLR2에 결합함을 나타내는 것이다. 이에 따라, OPN-305는 상이한 세포 타입 상에서 발현된 톨-유사 수용체 2에 대한 광범위한 교차 반응성을 나타낸다.
(
ii
) 경쟁 검정
시노몰로구스 원숭이로부터의 전혈 세포를 실온에서 30분 동안 1.O㎍/ml 바이오틴화된 OPN-301 단독 또는 1.O㎍ 또는 10㎍/ml OPN-305 또는 IgG4 동형 대조군 항체 (OPN305의 경우)와 함께 인큐베이션하였다. 이후에, 세포를 세척하고, 추가 30분 동안 PECy7에 콘주게이션된 트립타비딘과 함께 인큐베이션하였다.
OPN-301 모노클로날 항체는 뮤린 IgGI 항-TLR2 항체 (마우스 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 항체, 클론 T2.5, HyCuIt Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: 카탈로그 번호 1054)이다.
OPN-305 모노클로날 항체는 서열 번호: 2로서 본원에서 규정된 경쇄, 및 서열 번호: 5로 본원에서 규정된 중쇄를 갖는 완전 인간 항체이다.
Becton Dickinson으로부터의 FACScali bur를 이용하여 결합을 특정하였다. 결과는 도 14a, 14b, 및 14c에 나타내었다. 도 14a는 과립구에 관한 것이다. 도 14b는 단핵구에 관한 것이다. 도 14c는 림프구에 관한 것이다. OPN-305의 결합은 OPN-301 단독 (검정색 히스토그램)과 비교하여 녹색 히스토그램 (OPN-301+OPN-305을 나타냄)의 왼쪽으로의 이동에 의해 나타나는데, 이는 OPN-305 보다 원숭이 TLR2에 대한 결합에 대해 OPN-301과 경쟁적임을 나타내는 것이다. 이에 따라, 또한 OPN305는 원숭이 톨-유사 수용체 2 결합에 대해 경쟁적임을 나타낼 수 있다. 이는 또한 OPN-305가 인간, 마우스 또는 원숭이 세포 상에서 발현되는 톨-유사 수용체 2에 대해 교차-반응적임을 확인한다.
실시예
7 -
OPN
-305
모노클로날
항체의 면역원성
항체가 투여되는 피검체에 의해 항체에 대해 상승되는 HAMA 반응과 같은 면역 반응을 초래할 수 있는 면역원성 에피토프의 존재를 측정하기 위해 OPN-305 항체의 분석을 수행하였다. 상기에서 논의된 바와 같이, T 세포 에피토프의 존재는, 항체에 대한 중화 항체 반응의 형성이 치료 목적을 위한 환자에게 투여하기에 항체가 더 이상 적합하지 않음을 초래하기 때문에 매우 바람직하지 않다. 이에 따라, OPN-305 항체를 T 세포 에피토프가 실제로 존재하지 않도록 스크리닝하였다.
재료 및 방법:
도너(donor)
PBMC
의 제조 및 선택
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 National Blood Transfusion Service (Addenbrooke's Hospital, Cambridge, UK)로부터 획득된 건강한 모임의 도너 연층(24 시간 내에 체혈된 혈액)으로부터 분리하였다. PBMC를 LYMPHOPREP™ (Axis-Shield, Dundee, UK) 및 밀도 원심분리를 이용하여 연층으로부터 분리하고, CD8+ T 세포를 CD8+ ROSETTESEP™ (StemCell Technologies Inc., London, UK)를 이용하여 고갈시켰다. Biotest SSP-PCR 기반 조직-유형 키트 (Biotest, Landsteinerstraβe, Denmark)를 이용하여 HLA-DR 하플로타입(haplotype)을 확인하고 대조군 항원 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin) (KLH) (Pierce, Rockford, USA)에 대한 T 세포 반응을 측정함으로써 도너의 특징을 분석하였다. 이후에 PBMC를 요망될 때까지 액체 질소 중에서 냉동시키고 저장하였다.
세계 인구에서 발현되는 HLA-DR 알로타입(allotype)의 갯수 및 횟수를 가장 잘 나타내기 위해 21 도너의 코호트(cohort)를 선택하였다. 세계 인구에서 발현되는 것에 대한 코호트에서 발현된 알로타입의 분석은 >80%의 범위(coverage)가 달성되며, 모든 주요 HLA-DR 대립 형질 (세계 인구에서 >5% 횟수로 발현되는 개개의 알로타입)이 잘 나타나는 것으로 나타내고 있다.
에피스크린
시간 경과 T 세포 증식 검정
국제특허출원번호 WO 2007/099341호에 의해 교시된 바와 같이 T 세포 에피토프의 존재를 측정하기 위해 항체를 분석하였다. 각 도너로부터의 PBMC를 해동시키고, 계수하고, 생존력을 평가하였다. 세포를 실온 AIMV 배양 배지 (Invitrogen, Paisley, UK)에서 회복시키고, AIMV에서 4.6x106 PBMC/ml로 재현탁시켰다. 각 도너에 대하여, 총 1 ml 증식 세포 모액을 24개 웰 플레이트에 첨가하여 벌크 배양물을 제조하였다. 총 1 ml의 각 희석된 시험 샘플을 PBMC에 첨가하여 샘플 당 50㎍/ml의 최종 농도를 수득하였다. 각 도너에 대해, 양성 대조군 (100㎍/ml KLH와 함께 인큐베이션된 세포) 및 음성 대조군 (단지 배양 배지와 함께 인큐베이션된 세포)을 또한 포함하였다. 초기 4개의 도너에 대해, 추가 대조군을 시험 샘플을 이용하여 T 세포 반응의 조절을 시험하기 위해 포함시켰으며, 여기서 시험 샘플 및 KLH 둘 모두를 PBMC에 첨가하였다. 이러한 샘플과 KLH 단독의 비교는 증식에 대한 시험 샘플의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 배양물을 37℃, 5% CO2에서 총 8일 동안 인큐베이션하였다. 5, 6, 7 및 8일째에, 각 웰의 세포를 온화하게 재현탁시키고, 3 x 10O㎕ 분취액을 둥근 바닥 96웰 플레이트의 개개의 웰로 옮겼다. 배양물을 10O㎕ AIMV 배양 배지에서 1 μCi [3H]-티미딘 (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, USA)로 펄싱하고, TomTec Mach III 세포 수확기를 이용하여 필터 매트(filter mat) (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, USA) 상에서 수확하기 전에, 추가 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 대한 분 당 카운트(cpm)를 마이크로플레이트 베타 카운터 상에서 파라룩스, 낮은 백그라운드 카운팅 모드로 MELTILEX™ (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, USA) 섬광 카운팅로 측정하였다. 시험 샘플의 가능한 독성을 평가하기 위하여, 7일 인큐베이션 후에 최초 10개의 도너에 대한 시험 배양물의 샘플 및 배지 및 KLH 대조군에 대해 세포 생존력 카운트 (VICELL™ 카운터 이용 및 트립판 블루 염료 배제)를 수행하였다.
에피스크린
데이타
분석
증식 검정을 위하여, 2와 동일하거나 2보다 큰 자극 지수(SI) (SI≥2)의 경험적 문턱값은 미리 설정되었으며, 이에 의해 이러한 문턱값 보다 높은 증식성 반응을 유도하는 샘플은 양성인 것으로 간주된다(포함되는 경우에, 경계선 SI ≥ 1.95는 강조됨). 집중 검정 개발 및 이전 연구들은 이러한 것이 다수의 부정확한 양성 반응을 검출하지 않으면서 최대 감작성을 허용하는 노이즈 문턱값에 대한 최소 신호라는 것을 나타낸다. 증식 데이타 셋트(n=3)에 대해, 양성 반응을 통계학적 및 실험적 문턱값으로 정의된다:
쌍을 이루지 않는 두 개의 샘플 스튜던트 t-시험을 이용하여 배지 대조군에 대한 시험 웰의 cpm을 비교함에 의한 반응의 유의성 (p<0.05).
2 보다 큰 자극 지수 (SI > 2), 여기서 SI = 시험 웰의 평균 (cpm)/평균 배지 대조군 웰(cpm).
또한, 검정내 편차를, 레플리케이트 배양물(replicate culture)로부터 원시 데이타(raw data)의 변동 계수 및 표준 편차 (SD)를 계산함으로써 평가하였다.
결과
항-TLR2 항체 OPN-305 (VK5/VH4)를 단백질 A 친화력 크로마토그래피 및 이후 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 동질성(homogeneity)으로 정제하였다.
VK5A/H4라 불리워지는 변형체는 본원에 기술된 OPN-305 완전 인간화 모노클로날 항체이다. OPN-305 모노클로날 항체는 서열 번호: 2로서 본원에서 정의된 경쇄 아미노산 서열 및 서열 번호: 5로 본원에서 정의된 중쇄 아미노산 서열을 갖는 완전 인간화 항체이다.
모든 제조물은 단일 피크를 나타내는 모노머, 비-응집 항체로부터 유래된 것이고(도 15a 및 15b), 엔도톡신을 <5 EU/mg으로 함유하는 것으로 확인되었다.
면역원성의 상대적 위험을 측정하기 위하여, 세 개의 시험 샘플을 EpiScreen™ (Antitope, UK) 시간 경과 T 세포 검정을 이용하여 21명의 건강한 도너의 코호트에 대해 시험하였다. 샘플을 50㎍/ml의 최종 농도에서 시험하였는데, 이러한 양은 검출 가능한 단백질-특이적 T 세포 반응을 자극하는데 충분한 포화 농도를 제공하기 때문이다.
T 세포 조절 및 세포 독성 연구의 결과를 분석하였다. 7일 후에 배양물에서의 세포 생존능력은 65% 내지 95%의 범위이고, 모든 시험 샘플, 배지 대조군 및 KLH 대조군 간에 유사하다. 이에 따라, 시험 샘플은 검정에서 사용되는 세포에 독성 효과를 갖는 것으로 여겨지지 않았다. 또한, 도 16은, KLH 단독 또는 시험 샘플의 존재 하에 KLH에 의해 유도된 SI들 간의 유의미한 차이가 존재하지 않는 것으로 나타내고 있다(스튜던트 t-시험 p<0.05). 이는, 시험 샘플이 KLH (대조군 항원)에 반응하는 CD4+ T 세포 활성화를 직접적으로 조절하지 않음을 시사한다. 도 16은 세포 독성 및 T 세포 조절 활성에 대한 시험 샘플의 사전-스크린의 결과를 나타낸 것이다. 샘플 1은 키메라 항-TLR2 (인간 IgG4의 Fc 영역에 콘주게이트된 T2.5 뮤린 항체로부터 유래된 F'ab 단편)이며, 샘플 2는 항-TLR2 항체 OPN- 305 (VK5A/H4, OPN305)이며, 샘플 3은 VK5A/H5로 명시되는 변형체 항-TLR2 항체이다.
OPN-305 (VK5A/H4, OPN-305) 및 VK5/VH5 비교 항-톨-유사 수용체 2 항체, 뿐만 아니라 항-TLR2 키메라 항체로 수행된 EpiScreen™ 시간 경과 증식 검정으로부터의 결과를 분석하였다 (도 17a, 17b 및 17c). 키메라 항-TLR2 항체는 21개의 도너 중 4개에서 반응을 자극하였는데, 여기서 SI≥ 2 및 유의성은 스튜던트 t-시험 (p<0.05)에서 달성되었다. 도너 20은 시험 기간 전반에 걸쳐 높은 SI를 갖는 특히 격렬한 반응을 제공하였으며, 강력한 반응 (SI=6.99)은 또한 6일째에 도너 3에서 관찰되었다. 반대로, 연구 코호트에서 어떠한 도너도 OPN-305에 양성적으로 반응하지 않았다. 이에 따라, OPN-305 (VK5A/H4) 항체는 키메라 항체에 양성적으로 반응하는 도너에서 임의의 현저한 T 세포 반응을 형성시키지 못하였다.
결론
키메라 항체에 대한 EpiScreen™ 시간 경과 T 세포 검정에서 관찰된 양성 CD4+ T 세포 증식 반응은 15 내지 40%의 예상된 범위였다. 중요하게, 빈번하고 강력한 T 세포 반응은 대조군 항원인 KLH에 대해 관찰되었으며, 이는 예상되는 바와 같이 검정이 작동됨을 나타낸다. 이러한 결과는 또한, 완전 인간화 항체 OPN-305 (VK5A/H4) 가 임의의 도너에서 임의의 양성 면역 반응을 유도시키지 못하였으며 이에 따라 이러한 항체가 임상에서 낮은 면역원성 위험성을 갖는 것으로 여겨짐을 나타낸다.
도 18은 EpiScreen™ 검정을 이용하여 관찰된 면역원성의 수준과 치료학적 단백질의 큰 패널에 대해 임상에서 실제로 관찰된 면역원성 (항-단백질 치료용 항체 반응)의 수준(Baker and Jones, 2007) 사이의 명확한 상관관계를 나타낸다. 높은 수준의 면역원성은 임상 데이타 및 인플릭시마브(Infliximab) 및 캅파트(Campath)와 같은 단백질에 대한 EpiScreen™ 검정 둘 모두에서 관찰되었으며, 비교적 낮은 수준의 면역원성은 졸레르(Xolair), 헤르셉틴(Herceptin) 및 아바스틴과 같은 단백질에 대해 관찰되었다. 중요하게, 연구 코호트의 <10%에서 OPN-305 항체가 반응을 유발시켰는데, 여기서 이는 이전 실험을 기초로 하여, 낮은 위험의 면역원성을 갖는 바이오치료제와 관련된다.
실시예
8 -
OPN
-305
모노클로날
항체의 결합 친화력의 측정 및 비교
면역학적 바이오센스, 예를 들어 항원-항체 복합체의 결합 및 해리를 실시간으로 측정하는 BIACORE™ 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기기는 결합 동력학의 설명을 가능하게 한다. 화합물의 해리 속도 및 이의 후속 최적화는 특히 생약리학적 항체 개발에 있어 중요하다. BIACORE는 표면 결합된 분자 '리간드'와 용액 중의 결합 파트너 '분석물' 간의 상호작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용한다. SPR은 전자 변화-밀도 파 현상으로서, 이는 전체 내부 반사율의 조건 하에서 빛이 층에 반사될 때 금속성 층의 표면에서 일어나는 것이다. 발생되는 표면 플라즈몬은 반사광으로부터의 금속성 층의 마주하는 측면 상의 매질의 굴절률의 임의의 변화에 대해 민감하다. 표면에서 일어나는 단백질-단백질 상호작용은 매질의 굴절률에 영향을 미치고, 이에 따라 검출될 수 있다. 리간드 개질된 센서 표면에 대한 분자의 결합은 반응을 발생시키는데, 이는 검출할 결합된 분석물의 양의 작은 변화(낮은 피코그램 수준으로 낮아짐)를 가능하게 하는 결합된 질량에 비례한다. 이러한 기술은 10-5 내지 10-12M 범위에 걸쳐 친화 상수(KD), 103 내지 107 M-1 s-1의 결합 속도 상수 (ka) 및 10-1 내지 10-6 s-1의 해리 속도 상수(kd)를 측정하기 위해 사용될 수 있다(1-3).
본 연구의 목적은 두 개의 관련된 수용체 및 세 개의 mAb 간의 상호작용의 고해상도 동력학 특징분석을 위한 BIACORE T100 표면 플라즈몬 (Biacore, Inc.) 공명 기기를 사용하기 위한 것이다. 조사 하에서의 두 개의 수용체는 재조합 rhTLR-2 (재조합 인간 TLR-2) 및 rmTLR2/Fc (재조합 뮤린 TLR-2)이다.
재료 및 방법:
기기 준비
임의의 샘플을 진행시키기 전에, 시스템 체크 (Biacore Preventative Maintenance Kit 2)를 수행하였다. 시험된 모든 시스템을 통과시켰으며 (Reagent pump, Refractometer, Injections, Noise, Mixing and Buffer Selector), 이는 기기가 제조업자에 의한 기준 셋팅에 대해 수행되는 것을 지시하는 것이다. 시스템 체크 후에, 기기를 세정하기 위하여 Desorb/Sanitize (Biacore Preventative Maintenance Kit 2) 프로그램을 구동시켰다.
검정 전개
시스템 준비
CM5 칩의 삽입 시에, 시스템을 프라이밍하고, 이후에 BIAnormalising 용액 (Biacore Preventative Maintenance Kit 2)으로 표준화하였다. 샘플 선반(sample rack)을 기술될 때까지 25℃에서 인큐베이션하면서 모든 샘플을 25℃에서 진행시켰다. 칩을 구동 완충제로서 사용되는 HBS-EP와 함께 시스템에 첨가하였다. 칩 표면을 50 mM NaOH의 주사액 두 개로 30초 프라이밍하고 이후에 안정한 베이스라인이 모든 유세포(Flow cell)(Fes)에서 관찰될 때까지 방치시켰다.
샘플 제조
두 개의 항체, 즉 본원에 기술된 OPN-305 항-톨-유사 수용체 2 항체 및 T2.5 뮤린 항-톨-유사 수용체 2 항체 (융합 세포 클론 T2.5로부터 유래됨, HyCuIt Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: 카탈로그 번호 1054)를 분석하였다. 모노클로날 항체 둘 모두를 공급할 때 까지 저장하고, 모든 고정화 진행을 위해 1 ㎍.ml-1까지 희석시켰다. 수용체 rhTLR-2 및 rmTLR2/Fc를 HBS-EP를 이용하여 건조 분말로부터 1000 nM의 최종 농도로 재구성하고 4℃에서 저장하였다. 어떠한 담체 단백질도 이러한 용액에 첨가하지 않았다.
고정화 조건 및 활성
이러한 셋업이 최적화된 것으로 나타나는 이전 연구의 결과를 기초로 하여 본 연구에 대해 직접 검정을 선택하였다. 동력학적 실험을 위하여, 고정화된 리간드의 양은 칩의 표면에 질량 이동 효과를 방지하기 위해 제한될 필요가 있다.
글리코실화된 인간 수용체 분석물 (rhTLR-2)에 대해 77.5 kDa, 리간드 (mAb)에 대해 150 kDa, 및 2로서 화학양론(Sm)의 평균 MW를 사용하여, 고정시키기 위한 리간드의 이상적인 타겟 양은 145RU일 것이다. 이러한 고정화 수준은 또한 98 kDa의 MW를 갖는 경우에도 뮤린 수용체에 대해 적합하였다.
모든 항체를 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 고정시켰다. 고정화를 10 mM 아세테이트 완충제 pH 5.5에서 대략 1 ㎍.ml-1의 단백질 농도에서, 세 개의 CM5 시리즈 S 센서 칩 상에서 150RU의 타겟 반응 수준으로 수행하였다. 임의의 가능한 질량 이동 효과를 최소화하기 위하여 40㎕-min-1의 유속에서 동력학적 데이타를 획득하였다. 동력학적 분석에 대한 표면 및 두 개의 수용체 둘 모두의 안정성을 체크하기 위하여 블랭크(수용체 부재) 및 단일 농도의 분석물 (10OnM)을 동력학적 구동의 개시에서 반복하였다. 동력학적 분석의 2회 반복을 수행하였고, 결과를 비교하였다.
동력학적 사이클의 해리 시기 동안에 충분한 신호 감소(3-10%)를 관찰하기 위하여, 2000 초 동안에 해리를 측정하였다.
결과
결과는 하기 표 1에 나타내었다. 해리 속도(Kon) 및 해리 속도(Koff)를2가 결합 모델 (BSAcore Evaluation Software version 3.2)을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수(Ko)를 Kon/kon의 비로서 계산하였다.
표 1
결과는 OPN-305가 인간 톨-유사 수용체 2 및 뮤린 톨-유사 수용체 2 둘 모두에 T2.5 모노클로날 항체 보다 높은 결합 친화력으로 결합함을 나타내고 있다. 도 19는 OPN-305 완전 인간화된 항-TLR2 항체와 T.5 뮤린 항-TLR2 항체의 아미노산 서열 간에 서열 동정을 나타낸 정렬을 나타낸 것이다. 10%가 넘는 서열 일치성 차이를 알 수 있다. 또한, 도 20은 OPN-305 완전 인간화된 항-TLR2 항체 및 T.5 뮤린 항-TLR2 항체의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 정렬을 나타낸 것이다. 또한, 10%가 넘는 서열 일치성 차이가 존재한다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는, T2.5 뮤린 항체에 대한 OPN-305 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열의 차이가 톨-유사 수용체 2의 경우 OPN-305 항체에 대한 개선된 결합 특이성 및 친화력을 부여함을 예측한다.
실시예
9 -
TLR2
수용체 점유 연구
본 실험을 TLR2에 결합할 때 OPN-305 모노클로날 항체의 생물학적 활성의 억제를 위해 요구되는 최소 점유 수준을 확인하기 위하여 디자인하였다. 결합 대 기능을 THP- 1 리포터 세포주를 사용하여 시험하였다. 특히, OPN-305의 생활성을 Pam3CSK4 유도된 THP1-CD14 세포에서 평가하였다.
재료 및 방법
THP1-CD14 세포를 12개 웰 디시에 웰 당 1 x 106개의 세포의 밀도로 시딩하였다. OPN-305를 상기 웰에 다양한 농도(0.000488㎍/ml 내지 2㎍/ml)로 첨가한 후에 Pam3Csk4 (200ng/ml)를 첨가하였다. 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. NF-kB 유도된 SEAP 활성을 37℃에서 90분 동안 160㎕의 Quantiblue (Invivogen) 시약과 함께 열 비활성화된 컨디셔닝된 배지를 인큐베이션함으로써 측정하고 흡광도를 650 nm에서 기록하였다.
THP1-CD14 세포에서 OPN305의 수용체 점유를 측정하기 위하여, THP1-CD14 Blue 세포를 FACS 튜브에 배치시키고(1x106/튜브), FcR을 15분 동안 항-CD32 차단제 (Mitenyl Biotec)로 차단시켰다. 세포를 실온에서 15분 동안 OPN-305로 다양한 농도 (0.000488㎍/ml 내지 2㎍/ml 범위)로 라벨링하였다. 세척 후에, 세포를 실온에서 15분 동안 RPE 콘주게이팅된 항-인간 IgG4로 인큐베이션하였다. 최종 세척 단계 후에, 세포를 획득 전에 1% BSA/PBS 중 2% 포르몰 염수로 고정시켰다. 특이적 결합 백분율을 하기 수학식을 이용하여 계산하였다:
결과
결과는 도 21a, 21b 및 21c에 나타내었다. 이러한 결과들은, NF-kB의 억제가 Pam3Csk4로의 처리 후에 용량 의존적 방식으로 관찰됨을 나타내고 있다 (도 21a 및 21b). OPN-305는 거의 완전히 NF-kB의 활성을 2㎍/ml의 농도에서 억제한다(도 21c). THP1-CD14 세포에서의 특이적 결합의 백분율을 상술된 수학식을 이용하여 계산하였다.
THP-1 세포와의 포화 결합 실험은 동일한 세포 집단에서 생물학적 활성의 억제와 관련이 있다. TLR2 의존적 신호전달의 완전 억제는 최대 수용체 결합 보다 낮게 달성되었다. 이는 복잡한 시스템으로서, TLR2의 수준이 헤테로다이머 파트너 TLR1 및 TLR6에서 보다 현저하게 높은 것으로 나타난다. 수용체 점유는 모노머 또는 헤테로다이머로서 TLR2의 포화 결합을 나타낸다. 이는 기능적 신호전달 복합체를 형성하기 위한 파트너를 발견하는 자유 TLR2의 확률을 감소시키기 위한 충분한 TLR2의 중화가 100% 미만의 수용체 점유에서 생물학적 활성의 명확한 손실에 대한 설명일 수 있음을 나타낸다.
실시예
10 -
OPN
-305 항체가
TLR2
의존적 신호전달의 경쟁적 또는 비-경쟁적 억제제로서 작용하는지의 여부의 결정
재료 및 방법
THP1 CD14 Blue 세포를 96개 웰 플레이트에서 각 웰 당 100,000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 0, 1, 10 및 100 ng/ml의 OPN-305으로 짧게 사전 인큐베이션시킨 후에 37℃에서 밤새 다양한 용량의 Pam3Csk4로 자극시켰다. 4Oul의 상청액을 제거하고 65℃에서 10분 동안 비활성화시켰다. NF-kB 유도된 SEAP 활성을, 37℃에서 90분 동안 열 비활성화된 컨디셔닝된 배지를 16Oul의 Quantiblue (Invivogen) 시약과 함께 인큐베이션한 후에 650 nm에서 판독함으로써 측정하였다. 세포 기반 검정에서 수용체가 효소와 유사하게 거동한다는 가정 하에, V (NF-kB 활성) 대 S [Pam3CSK4] 뿐만 아니라 이중 역수 라인위버-버크 플롯 (1/v vs 1/s)을 플롯팅하였다.
결과
결과는 도 22에 나타내었으며, 여기서 도 22a는 NF-kB 의존적 SEAP 활성 대 [Pam3CSK4]를 도시한 것이며, 도 22b는 1 A/ 대 1/S의 라인위버 버스 플롯을 도시한 것이다.
이러한 결과는 리간드 농도가 증가됨에 따라, 용량 반응 곡선의 전통적인 우측 이동이 나타남을 나타낸다(도 22a). 라인위버 버크 플롯(도 22b)의 분석은 낮은 리간드 농도에서 경쟁적 메카니즘을 시사하지만 리간드가 특정 문턱값을 초과함에 따라 동력학이 변함을 시사한다. 억제 효과의 특성을 확립하는 것은 판독이 생물학적 활성임에 따라 세포에서 조사하며, 이는 TLR2/리간드 상호작용 뿐만 아니라 성분 다이머 신호전달 복합물을 형성시키기 위한 TLR1 또는 TLR6의 보충에 의존적이다. 일반적으로 입수 가능한 데이타베이스를 이용한 발현 프로파일링 분석은, TLR2가 파트너 분자의 적정의 결과로서 이-상 반응에 대한 가능성을 설명할 수 있는 TLR1 또는 TLR6에 대해 상당히 과량으로 존재하는 것으로 시사된다.
실시예
11 -
TLR2
에 대한
OPN
-305
결찰이
다른
TLR2
리간드에
대한 반응을 변경시키는 지의 여부의 결정
본 실험은 OPN-305에 의한 TLR2의 억제가 이들 개개의 리간드에 대한 다른 TLR의 반응에 영향을 미치는 지를 고려한 것이다.
재료 및 방법
THP1 CD14 Blue 세포를 384개의 웰 플레이트에 각 웰 당 25,000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 120분 동안 0, 1, 10 및 100 ng/ml의 OPN-305 또는 인간 IgG4 동형 대조군 항체으로 사전 인큐베이션한 후에 다양한 용량의 상이한 톨-유사 수용체 리간드 효능제로 자극시켰다. NF-kB 유도된 SEAP 활성을, HEK blue 검출 배지를 이용하여 밤새 인큐베이션 한 후에 컨디셔닝된 배지에서 직접적으로 측정하였다.
프라젤린을 TLR5 리간드로서 사용되었으며, 초순수 LPS는 TLR4 리간드로서 사용되었으며, Pam3CSK 및 FSL-1은 TLR2 리간드로서 사용되었다.
결과
결과는 도 23a, 23b 및 23c에 나타내었다. 플라젤린 (도 23c) 및 LPS (도 23b)에 대한 반응은, OPM-305에 노출되지 않은 대조군 세포와 비교할 때 변경되지 않았다. 예상되는 바와 같이, Pam3CSK 및 FSL-1 매개된 TLR2 활성화 반응은 OPN-305에 의해 차단되었다(도 23a). 플라젤린 및 LPS에 대한 반응은 대조군 세포와 비교하여 OPN-305에 노출되지 않은 대조군 세포와 비교할 때 변경되었다. 예상되는 바와 같이, Pam3CSK 및 FSL-1 반응은 OPN-305에 의해 차단되었다. 이는 OPN-305가 리간드에 대한 TLR4 또는 TLR5 반응성에 있어서 예상되지 않는 증가 또는 감소를 초래하지 않음을 시사한다.
실시예
12 - 패혈증의 치료에서의
OPN
-305의 사용
재료 및 방법:
암컷 BALB/c 마우스의 그룹 (n=4)을 OPN-305 모노클로날 항체로 10mg/Kg, 2mg/Kg 및 0.4 mg/Kg의 용량으로 처리하고 30분 후에 100 ug의 Pam3Csk4로 처리하였다. 모든 처리를 복막내로 투여하였다. 4 시간 후에, 마우스를 치사 마취로 희생시키고, 혈액을 취득하였다. 혈청을 얻고, 시토카인 농도를 ELISA로 측정하였다. 혈청을 KC 및 IL-12p40의 경우 1/10으로 및 IL-6 ELISA의 경우 1/5로 희석시켰다.
결과:
결과는 도 24a, 24b 및 24c에 나타내었다. OPN305는 Pam3Csk4 유발 패혈증을 억제하는 것으로 나타났다. 항-TLR2 OPN305의 저용량 (0.4mg/kg) 투여는 마우스에서 Pam3Csk4 유발 시토카인을 현저하게 억제할 수 있다.
본 실험을 또한 단지 OPN305 항체의 i.v.(정맥내) 투여 후 TLR2 효능제 Pam3CSK의 i.p.(복막내) 주사를 이용하여 OPN-305으로 반복하여 긍정적 효과가 동일한 구획으로 전달되는 항체 및 효능제의 결과가 아님을 확인하였다.
실험 결과는 도 25a 및 25b에 나타내었다. 이러한 결과는, OPN-305 모노클로날 항체가 Pam3Csk4 유발 패혈증을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 이전 실험과 동일한 것으로서, 이는 전신으로 전달된 OPN-305가 Pam3CSK의 i.p (복막내) 투여에 대한 반응으로 혈청 시토카인 생성을 억제할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예
13 -
랫트
세포에서 발현된
TLR2
에 대한
OPN
-305
모노클로날
항체의 결합
재료 및 방법
NR8383 세포를 ATCC로부터 구매하고, ATCC에 의해 지시된 바와 같이 FK12에서 성장시켰다. 세포를 랫트 특이적 항-CD32 (마우스IgG1)로 실온에서 10분 동안 차단시켰다. 세포를 15분 동안 OPN305 (또는 동형)로 처리하고, 세척하고, RPE 항-인간 IgG4로 검출하고, 획득하기 전에 2% 포르몰 염수로 고정시켰다. NR8383 세포를 또한 폴리클로날 토끼 항-랫트 TLR2 항체로 염색하고 Alexa-Fluor 488 항-랫트 IgG로 검출하였다.
결과:
결과는 도 26에 나타내었는데, 이는 TLR2가 랫트 폐포 대식세포 (NR8383) 상에서 발현되고 OPN305를 이용하여 검출됨을 나타낸 것이다. (A) 염색되지 않은 세포, (B) 양성 대조군; 폴리클로날 토끼 항-랫트 TLR2 1차 항체, 2차 항체는 항-토끼 Alexa-Fluor 488임; (C) 폴리클로날 인간 IgG4로 처리된 세포, 2차 항체는 인간 항-IgG4 PE임; (D) OPN305 염색된 세포, 2차 항체 항-인간 IgG4 PE.
실시예
14 - 돼지 세포 상에서 발현된
TLR2
에 대한
OPN
-305
모노클로날
항체의 결합
재료 및 방법
돼지 PBMC를 Ficoll을 이용하여 혈액으로부터 정제하였다. 세포를 계수하고 1x106 세포를 각 튜브 당 배치시켰다. 돼지에 대한 특이적 CD32 차단제의 부재 하에, 세포를 10분 동안 PBS 중 50% FCS/BSA의 매트릭스에서 인간 항-CD32를 이용하여 차단하였다. 세포를 실온에서 15분 동안 OPN305 (또는 동형 대조군)와 함께 인큐베이션시켰다. 1H11 (마우스 항-돼지 TLR2, Javier Dominguez)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 세척 후에, 세포를 실온에서 15분 동안 RPE 콘주게이션된 항-인간 IgG4와 함께 인큐베이션하였다. 최종 세척 단계 후에, 세포를 고정시키고, 획득하고, 분석하였다.
결과
결과는 도 27에 나타내었다. TLR2는 돼지 PBMC 상에서 발현되고 OPN305에 의해 염색되었다. PBMC는 Ficoll을 이용하여 분리함으로써 정제되었다. A-C는 Pig 666로부터의 PBMC 및 Pig 488로부터의 D-F를 나타내었다. A, D는 염색되지 않은 것이며; B, E는 대조군 폴리클로날 인간 IgG4로 라벨링된 후 PE 라벨링된 항-인간 IgG4로 2차 염색된 것이며; C, F는 OPN305로 라벨링된 후에 PE 라벨링된 항-인간 IgG4로 라벨링된 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 본원에 참고로 통합된다. 본 발명의 기술된 구체예에 대한 다양한 변형 및 변경은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명확하게 될 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 구체예와 관련하여 기술되어 있지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 구체예로 지나치게 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하는 기술된 모드의 변형 및 변경은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
Claims (68)
- 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 중화 항체, 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 항체가 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하는, 중화 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
- 제 1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합하지 않는, 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 CD32a (Fc 감마 수용체 IIa)에 결합하지 않는, 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인이 서브클래스 면역글로불린 G, 동형 4 (IgG4)의 항체로부터 유래된 불변 도메인에 연결된 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄의 가변 도메인이 서브클래스 면역글로불린 G, 동형 4 (IgG4)의 항체로부터 유래된 하나 이상의 불변 도메인에 연결된 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 경첩 영역의 아미노산 잔기 241이 세린 잔기에서 프롤린 잔기로 치환된 (S241P) 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄가 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 완전 인간화 항체인 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단리된 항체인 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 면역접합체, 탈푸코오즈화된 항체 및 이중특이성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA로부터 선택된 동형의 전장 항체인 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10-8 이하의 KD로 포유류 톨-유사 수용체 2에 결합하는 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 13항에 있어서, 포유류 톨-유사 수용체 2가 인간 톨-유사 수용체 2인 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 14항에 있어서, 항체가 1x10-8 이하의 KD로 인간 톨-유사 수용체 2에 결합하는 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 미메틱(antibody mimetic)인 톨-유사 수용체 2 중화 항체.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 항체로부터 유래된 톨-유사 수용체 2 중화 항원 결합 단편으로서, 항원 결합 단편이 Fab 단편 또는 scFv인 톨-유사 수용체 2 중화 항원 결합 단편.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 콘주게이트(conjugate)로서, 파트너 분자(partner molecule)가 하나 이상의 치료제인, 항체-파트너 분자 콘주게이트.
- 톨-유사 수용체 2를 특이적으로 결합시키고 톨-유사 수용체 2 기능을 길항시키는 단리된 항체 또는 이로부터 유래된 항원 결합 단편으로서, 상기 길항작용이 CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 대한 항체의 결합에 독립적으로 매개되며, 항체가 톨-유사 수용체 2의 세포외 도메인에 결합하고 서열 번호: 1의 경쇄 가변 아미노산 서열 또는 서열 번호: 1의 아미노산 서열의 20개 이상의 아미노산의 길이에 걸쳐 90% 이상의 아미노산 서열 일치성을 갖는 서열, 및 서열 번호: 4의 중쇄 가변 아미노산 서열 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 20개 이상의 아미노산의 길이에 걸쳐 90% 이상의 아미노산 서열을 갖는 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이로부터 유래된 항원 결합 단편.
- 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 엔코딩하는 단리된 핵산 분자.
- 제 20항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제 21항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 22항의 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 단계, 및 상기 숙주 세포로부터 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 톨-유사 수용체 2 항체를 제조하는 방법.
- 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 약제 조성물.
- 톨-유사 수용체 2 활성화의 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피검체에 치료학적 유효량의, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생체내 또는 생체외로 투여함을 포함하여, 톨-유사 수용체 2 활성화의 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 25항에 있어서, 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환이 류머티스성 관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알레르기 반응, 건선, 피부염, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 허혈 재관류 손상, 장기 이식, 안질환, 예를 들어 포도막염 또는 노인성 황반 퇴행 질환, 신장 염증, 당뇨병으로부터 기인한 허혈 재관류로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
- 제 27항에 있어서, 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환이 류머티스성 관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알레르기 반응, 건선, 피부염, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 허혈 재관류 손상, 장기 이식, 안질환, 예를 들어 포도막염 또는 노인성 황반 퇴행 질환, 신장 염증, 당뇨병으로부터 기인한 허혈 재관류로 이루어진 군으로부터 선택된 용도.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
- 제 29항에 있어서, 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환이 류머티스성 관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알레르기 반응, 건선, 피부염, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 허혈 재관류 손상, 장기 이식, 안질환, 포도막염, 노인성 황반 퇴행 질환, 신장 염증, 당뇨병으로부터 기인한 허혈 재관류로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 항원 결합 부분의 용도.
- 실질 장기 이식과 관련된 허혈 재관류 손상에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직을, 상기 세포 또는 조직의 TLR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키기에 충분한 치료학적 유효량의, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시킴을 포함하여, 피검체에서 실질 장기 이식과 관련된 허혈 재관류 손상에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직에서 톨-유사 수용체 2(TLR2)의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직을, 상기 세포 또는 조직에서 TLR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키기 위한 치료학적 유효량의 제 1 항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시킴을 포함하여, 피검체에서 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직에서 톨-유사 수용체 2 (TLR2)의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
- 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄를 형성시키는 융합 세포주.
- 톨-유사 수용체 2의 세포외 도메인 상에 존재하는, 모노클로날 항체 OPN-305에 의해 결합된 것과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 올리고누클레오티드, 펩티도미메틱 또는 유기 화합물로부터 유래된 모노클로날 항체, 결합 단편으로서, 모노클로날 항체가 T2.5로 명시된 상업적으로 입수 가능한 항체가 아닌, 항체, 펩티드, 올리고누클레오티드, 펩티도미메틱 또는 유기 화합물로부터 유래된 모노클로날 항체, 결합 단편.
- 제 34항에 있어서, 화합물에 의해 특이적으로 결합된 에피토프가 서열 번호: 13 및/또는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 펩티드, 올리고누클레오티드, 펩티도미메틱 또는 유기 화합물로부터 유래된 모노클로날 항체, 결합 단편.
- 키트의 사용을 위한 설명서와 함께 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 키트.
- 서열 번호: 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 서열 번호: 2로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 완전 인간화 모노클로날 항체로서, 항체가 포유류 톨-유사 수용체 2에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 톨-유사 수용체 2 기능적 활성을 길항시키며, 항체가 CD32에 결합하지 않는, 완전 인간화 모노클로날 항체.
- 제 37항에 있어서, 항체가 서열 번호: 4의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
- 제 37항 또는 제 38항에 있어서, 항체가 인간 톨-유사 수용체 2, 마우스 톨-유사 수용체 2 및 원숭이 톨-유사 수용체 2에 대한 결합 특이성을 갖는 완전 인간화 항체.
- 제 37항 내지 제 39항 중 어느 한 항의 항체로부터 유래된 항원 결합 단편.
- 제 40항에 있어서, 단편이 Fab 단편 또는 scFv인 항원 결합 단편.
- 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항의 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 엔코딩하는 단리된 핵산 분자.
- 제 42항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제 43항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 44항의 숙주 세포에서 완전 인간화 항체를 발현시키고 상기 숙주 세포로부터 항체를 단리시킴을 포함하여, 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 항-톨-유사 수용체 2 항체를 제조하는 방법.
- 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 약제 조성물.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피검체에 치료학적 유효량의 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생체내 또는 생체외로 투여함을 포함하여, 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 47항에 있어서, 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환이 류머티스성 관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알레르기 반응, 건선, 피부염, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 허혈 재관류 손상, 장기 이식, 안질환, 예를 들어 포도막염 또는 노인성 황반 퇴행 질환, 신장 염증, 당뇨병으로부터 기인한 허혈 재관류로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
- 제 49항에 있어서, 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환이 류머티스성 관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알레르기 반응, 건선, 피부염, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 허혈 재관류 손상, 장기 이식, 안질환, 포도막염, 노인성 황반 퇴행 질환, 신장 염증, 당뇨병으로부터 기인한 허혈 재관류로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 항원 결합 부분의 용도.
- 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
- 제 51항에 있어서, 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환이 류머티스성 관절염, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알레르기 반응, 건선, 피부염, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 허혈 재관류 손상, 장기 이식, 안질환, 포도막염, 노인성 황반 퇴행, 신장 염증, 또는 당뇨병으로부터 기인한 허혈 재관류로 이루어진 군으로부터 선택된 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
- 실질 장기 이식과 관련된 허혈 재관류 손상에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직을, 상기 세포 또는 조직의 TLR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키기 충분한 치료학적 유효량의, 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시킴을 포함하여, 피검체에서 실질 장기 이식과 관련된 허혈 재관류 손상에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직에서 톨-유사 수용체 2(TLR2)의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직을, 상기 세포 또는 조직에서 TLR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키기 위한 치료학적 유효량의 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시킴을 포함하여, 피검체에서 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환에서 연관된 TLR2 발현 세포 또는 조직에서 톨-유사 수용체 2 (TLR2)의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
- 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 따른 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 형성시키는 융합 세포주.
- 항체가 포유류 톨-유사 수용체 2에 1x10-8 이하의 KD로 특이적으로 결합하지만 CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합하지 않으며, 항체가 톨-유사 수용체 2의 세포외 도메인 상에 존재하는, T2.5로 명시된 상업적으로 입수 가능한 항체에 의해 결합된 것과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 중화 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
- 항체가 포유류 톨-유사 수용체 2에 1x10-8 이하의 KD로 특이적으로 결합하지만 CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합하지 않으며, 에피토프가 기준 항체에 의해 인식되며, 기준 항체가 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
- 포유류 톨-유사 수용체 2를 특이적으로 결합하고,
- 포유류 톨-유사 수용체 2에 1x10-8 이하의 KD로 결합하고,
- CD32 (Fc 감마 수용체 II)에 결합되지 않고,
- 인간 톨-유사 수용체 2, 뮤린 톨-유사 수용체 2 및 원숭이 톨-유사 수용체 2에 교차 반응적인, 성질들을 나타내는 단리된 인간 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분. - 제 55항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 면역접합체, 탈푸코오즈화된 항체 및 이중특이성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체.
- 제 55항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA로부터 선택된 동형의 전장 항체인 항체.
- 제 55항 내지 제 60항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 엔코딩하는 단리된 핵산 분자.
- 제 61항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제 62항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 63항의 숙주 세포에서 항체를 발현시키고 상기 숙주 세포로부터 항체를 단리시킴을 포함하여, 제 55항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 따른 항-톨-유사 수용체 2 항체를 제조하는 방법.
- 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제 55항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 약제 조성물.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피검체에 치료학적 유효량의 제 55항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생체내 또는 생체외로 투여함을 포함하여, 염증성 ,호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
- 톨-유사 수용체 2 활성화에 의해 매개된 염증성, 호흡기 또는 자가면역 증상 또는 질병을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 제 55항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
- 제 55항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 형성시키는 융합 세포주.
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