CN102482356B - 针对toll样受体2的人源化的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种对Toll样受体2具有结合特异性的完全人源化的抗体包括全部由人源的氨基酸序列组成的轻链和重链。轻链的可变区包括与SEQ?ID?NO:1的序列基本上同源的氨基酸序列,而重链的可变区包括与SEQ?ID?NO:4的序列基本上同源的氨基酸序列。还提供了编码所述抗体的核酸,以及所述抗体在药物尤其是用于治疗由Toll样受体2激活和信号传递介导的炎性疾病和自身免疫疾病的药物中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及完全人源化的抗体和其片段,且尤其涉及对Toll样受体2(TLR2,TLR-2)具有结合特异性的完全人源化的抗体。本发明还延伸到所述完全人源化的抗体用于治疗和预防由Toll样受体2激活和信号传递介导的炎性疾病和自身免疫疾病的用途。
发明背景
Toll样受体(TLR)形成一个模式识别受体的家族,所述模式识别受体在调节先天免疫反应中具有重要作用,它们还参与组织修复,维持组织完整性和肿瘤发生。至今在人类中已鉴定了11种Toll样受体。Toll样受体家族的成员是高度保守的,且绝大多数哺乳动物物种具有10到15种之间的Toll样受体。每种Toll样受体识别特定的病原体相关分子标签。Toll样受体2(TLR2,CD282,TLR-2)可通过肽聚糖、脂蛋白、脂磷壁酸和内源性配体来激活。
对Toll样受体2具有结合特异性的许多单克隆抗体是已知的。WO01/36488公开了命名为TL2.1的抗体,其来源于根据布达佩斯条约以登录号99102832保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的杂交瘤细胞系。该抗体拮抗表达于人类细胞的Toll样受体2的激活。
WO2005/028509公开了命名为T2.5的鼠单克隆抗体,其特异性地抑制哺乳动物TLR2的激活。显示T2.5单克隆抗体可与TLR2的人类形式和鼠类形式二者交叉反应。该文献还含有实验数据,其表明如WO01/36488中所公开的鼠TL2.1抗TLR2单克隆抗体不可与TLR2的人类形式和鼠类形式二者交叉反应,如该专利申请的说明书中所述。相反地,WO2005/028509中显示TL2.1抗体仅与人类Toll样受体2结合而不与鼠Toll样受体2结合。WO2005/028509的T2.5单克隆抗体针对TLR2的胞外域产生,且因此对Toll样受体2的该区域中的表位具有结合特异性。
WO2005/019431公开了对于TLR2具有结合特异性的抗体,其被命名为11G7。该鼠抗体可来源于以名称PTA-5014保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的杂交瘤细胞系11G7。11G7单克隆抗体选择性地结合TLR2的胞外域,并可阻遏利用激活Toll样受体1(TLR1)和TLR2之间形成的异源二聚体的激动剂刺激的人类外周血单核细胞(PBMC)进行的细胞因子产生的诱导。11G7抗体不抑制利用通过Toll样受体6(TLR6)和TLR2之间形成的异源二聚体诱导信号传递的激动剂刺激的PBMC进行的细胞因子产生。
已显示啮齿类单克隆抗体诸如鼠单克隆抗体用于体内治疗应用与被施用抗体的受治疗者生成的不期望的免疫反应的生成有关。所述免疫反应可导致有效地中和治疗性抗体的有效性的抗体的产生。所述免疫反应通常被称为人抗小鼠抗体(HAMA)反应。HAMA反应以多种方式来削弱被施用的抗体的治疗有效性,所述方式包括损害治疗性抗体到达其结合靶的能力,这削弱了抗体的治疗性作用。
已开发了许多方法来解决针对施用给个体的治疗性抗体产生的不想要的HAMA反应的问题。通常,这些方法包括导致利用来源于人类抗体的等效部分来替代小鼠抗体的某些组分的技术。所述方法可,例如,导致嵌合抗体的产生,所述嵌合抗体包括与人类来源的恒定区结合的小鼠可变区。可选地,可使用称为“CDR移植(CDRgrafting)”的技术,其中将来自鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到由人类抗体轻链可变域和重链可变域的区域所提供的构架中。这导致了保留鼠抗体的结合特异性,但其中仅有的非人类组分是移植的鼠CDR区的抗体的产生。
然而,在两种方法中,所得的人源化的抗体的治疗效力可能均受到损害。例如,嵌合抗体的鼠可变区组分仍可提供针对其发生HAMA反应的基础。并且,在产生CDR移植的人源化的抗体的地方,已观察到CDR区域的简单移植(transplantation)常由于抗体的结合亲和力的减小而导致抗体的降低的治疗效力。
发明概述
因此本发明人已鉴定产生完全人源化的单克隆抗体的需要,所述完全人源化的单克隆抗体对Toll样受体2具有结合特异性,且其拮抗TLR2功能,但其在人类中基本上为非免疫原性的。进行大量实验之后,本发明人已产生了完全人源化的单克隆抗体,其对人类Toll样受体2具有结合特异性,且其拮抗TLR2功能而无论Toll样受体2是否与Toll样受体1或Toll样受体6形成异源二聚体。该TLR2拮抗性抗体未从先前已知的嵌合技术或CDR移植技术中产生,且因此不含有任何鼠氨基酸残基。并且,显示该抗体介导TLR2中和,而不需要与CD32细胞表面抗原结合,所述与CD32细胞表面抗原结合是其它已知Toll样受体2拮抗性抗体的功能要求。并且,本发明的完全人源化的抗体是本领域中已知的第一个完全人类TLR2中和抗体。该抗体没有显示出任何T细胞表位且因此当施用给受治疗者时不会针对其产生中和抗体。该抗TLR2拮抗性抗体对于由多种哺乳动物细胞所表达的Toll样受体2还表现出广泛程度的交叉反应性,且惊讶地观察到了完全人源化的抗体与人类细胞、小鼠细胞和猴细胞表达的Toll样受体2的结合。
根据本发明的第一方面,提供了中和抗体,或其抗原结合部分,其能够特异性地结合Toll样受体2(TLR2、CD282、TLR-2),和其中所述抗体或抗原结合部分包括轻链和重链、由轻链和重链组成或基本上由轻链和重链组成,其中所述轻链的可变区(VL)包括与SEQIDNO:1的氨基酸序列相同或基本上同源的氨基酸序列,和其中所述重链的可变区(VH)包括与SEQIDNO:4的氨基酸序列相同或基本上同源的氨基酸序列、由与SEQIDNO:4的氨基酸序列相同或基本上同源的氨基酸序列组成或基本上由与SEQIDNO:4的氨基酸序列相同或基本上同源的氨基酸序列组成。
如本文所定义的,术语中和抗体描述了能够中和Toll样受体2的生物激活和信号传递的抗体。中和抗体,其也可称作拮抗性抗体,或阻遏抗体,特异性地且优选地选择性地结合Toll样受体2,并抑制Toll样受体2的一种或多种生物活性。例如,中和抗体可抑制诸如Toll样受体2配体的配体或底物与Toll样受体2配体结合位点的结合。可选地,中和抗体可防止Toll样受体2被配体激动剂结合时的激活,例如通过损害配体激动剂结合。在生理条件下或治疗条件下,通常中和抗体选择性地结合Toll样受体2,且因此基本上不结合其它Toll样受体家族成员(例如,Toll样受体4)。
在某些实施方案中,Toll样受体2中和抗体介导Toll样受体2功能活性的拮抗,而不需要抗Toll样受体2抗体,或结合片段与CD32(Fcγ受体II(FcγRII,RcgRII))尤其是CD32a和/或CD32b结合。因此,Toll样受体2的中和不需要抗体且尤其是抗体的Fc部分或抗体片段与CD32结合。
通常本发明的抗Toll样受体2抗体的特征是它们不含有当将所述抗体施用给受治疗者尤其是人类时针对其可介导免疫反应的任何结合表位。该特征在施用所述抗体的受治疗者中防止针对本发明的抗体生成中和抗体中是重要的,因为假如发生该免疫反应则抗体的治疗效力可受到严重损害。
通常,中和抗Toll样受体2抗体是完全人源化的抗体。即,构成抗体的所有氨基酸残基的组合完全是人源的,且因此不含有例如人类和非人类区域。尤其是,本发明的抗体仅包括人类可变区序列。因此本发明的抗体不同于例如在重链可变区和轻链可变区由来源于小鼠和人类两者的氨基酸残基组成的嵌合单克隆抗体,或不同于CDR移植的“人源化的”抗体,其中重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)包括来源于鼠抗体的氨基酸残基,而抗体的相关构架区(FR)和恒定区(CR)来源于人类抗体。因此,本发明的完全人源化的抗体具有均为人源的、或与人源的序列基本上相同的但不必来自同样抗体的重链可变区和恒定区与轻链可变区和恒定区。本发明的完全人源化的抗体还可被称作“人源化的”抗体,或称作完全来源于人类序列的抗体。
本发明的抗体的轻链的可变区(VL)的氨基酸序列如以下SEQIDNO:1所显示:
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFGASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGMYFCQQSRKLPWTFGGGTKVEIK
在SEQIDNO:1中,如图1中所示,标下划线的残基有关互补决定区的位置,其中残基24至残基34有关CDR1,残基50至残基56有关CDR2和残基89至残基90有关CDR3。图1B显示了可变轻链核苷酸序列和推断的氨基酸序列。在该图中,根据Kabat编号系统(KabatEA等人(1991)Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列),第5版.Bethesda:USDepartmentofHealthandHumanServices(美国卫生和人类服务部))对轻链域的残基进行常规编号。
应注意,这些CDR残基的鉴定与利用Kabat编号系统分配至CDR区域的残基是一致的,其中VLCDR1(即,轻链可变域的互补决定区1)包括残基24至残基34,VLCDR2(轻链可变域的互补决定区2)包括残基50至残基56,和VLCDR3(轻链可变域的互补决定区3)包括残基89至残基97。
如本文所定义的,与SEQIDNO:1的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列意为跨越至少20个氨基酸、50个氨基酸或100个氨基酸的长度、或序列全长的长度,与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性,更优选地为95%序列同一性,和最优选地为至少98%氨基酸同一性的氨基酸序列。通常这种同源氨基酸序列将对Toll样受体2具有结合特异性,并且当结合于Toll样受体2时将拮抗Toll样受体2功能活性。
通常,将轻链的可变区(VL)与人类免疫球蛋白κ恒定域(CL)连接以提供轻链,所述轻链为人源化的抗体的轻链。
因此,在其中本发明的抗体或结合成员包括完整的轻链的某些实施方案中,该轻链具有SEQIDNO:2的氨基酸序列:
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFGASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGMYFCQQSRKLPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在某些另外的实施方案中,本发明延伸到包括轻链的抗体或结合成员,所述轻链包括与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性、更优选地至少90%同一性、更优选地至少95%同一性和最优选地98%同一性的氨基酸序列,由与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性、更优选地至少90%同一性、更优选地至少95%同一性和最优选地98%同一性的氨基酸序列组成或基本上由与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%同一性、更优选地至少90%同一性、更优选地至少95%同一性和最优选地98%同一性的氨基酸序列组成。通常,包括与SEQIDNO:2具有至少80%或更高的氨基酸同一性的氨基酸序列的抗体将特异性地结合Toll样受体2,且当与之结合时将起作用以拮抗Toll样受体2功能活性。
在某些实施方案中,如SEQIDNO:2中定义的且如图3中描绘的轻链的氨基酸序列由如图4中所示的SEQIDNO:3的核苷酸序列所编码。在图4中所示的SEQIDNO:3的序列中,标下划线的核酸编码轻链可变区的氨基酸。
在一个实施方案中,重链的可变区(VH)的氨基酸序列如以下SEQIDNO:4中所示:
QVQLVQSGSELKKPGASVKLSCKASGFTFTTYGINWVRQAPGQGLEWIGWIYPRDGSTNFNENFKDRATITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARLTGGTFLDYWGQGTTVTVSS
在如图2中所示的SEQIDNO:4中,标下划线的残基有关3种互补决定区的氨基酸残基,其中残基31至残基35有关CDR1(VHCDR1(重链可变域的互补决定区1)),残基50至残基65有关CDR2(VHCDR2)和残基95至残基103有关CDR3(VHCDR3)。应注意这些CDR残基的定位与利用Kabat编号系统通常归于CDR区域的定位些微不同,其中CDR1存在于残基31至残基35处,CDR2存在于残基50至残基66处,和CDR3存在于残基95至残基103处。
如本文所定义的,与SEQIDNO:4的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列意为跨越至少20个氨基酸、50个氨基酸或100个氨基酸的长度,与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性、更优选地为95%序列同一性、和最优选地为至少98%氨基酸同一性的氨基酸序列。在某些另外的实施方案中,本发明延伸到包括重链可变(VH)域的抗体或结合成员,所述重链可变域包括以下、由以下组成或基本由以下组成:与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少80%、更优选地至少90%、更优选地至少95%和最优选地98%序列同一性的氨基酸序列同源性。
通常,将重链可变区(VH)与包括至少一个免疫球蛋白恒定区的另外的氨基酸序列连接。在某些实施方案中,免疫球蛋白恒定域来源于IgG(免疫球蛋白G)亚类的抗体以形成本发明的人源化抗体的完整的重链。因此,所述恒定域可包括CH1、CH2和CH3以及位于所述CH1域和CH2域之间的适宜的连接物。
在某些实施方案中,免疫球蛋白恒定域来源于IgG同种型的免疫球蛋白,通常为免疫球蛋白G,同种型4(IgG4)。IgG4抗体是动态分子,其通过与来自另一个分子的重链-轻链对交换重链和所结合的轻链(半分子)来交换Fab臂,该交换导致双特异性抗体的产生。因此,在某些实施方案中,对IgG4的至少一个恒定域的氨基酸序列进行至少一个突变以防止Fab臂交换发生。因此,在其中抗体或抗体片段包括来源于IgG4的恒定域的本发明的某些实施方案中,将对位于重链的铰链区的氨基酸残基241进行突变而将丝氨酸残基置换为脯氨酸残基(S241P)(如在AngalS.等人.MolecularImmunology.1993.卷30第1期,第105-108页中所教导的)。
因此,在某些实施方案中,用来提供重链恒定域残基和轻链恒定域残基的氨基酸残基来源于同种型IgG4的免疫球蛋白。在某些另外的实施方案中,免疫球蛋白来源于IgG亚类的免疫球蛋白和同种型IgG1、IgG2或IgG3的免疫球蛋白。在某些另外的实施方案中,用来提供重链恒定域残基和轻链恒定域残基的氨基酸残基来源于亚型IgA的免疫球蛋白。
在不同的另外的实施方案中,可对抗体的恒定域的氨基酸序列进行一个或多个突变、置换、缺失或插入以改变抗体的功能性质。例如,可对恒定域的氨基酸残基进行至少一个氨基酸突变、插入、缺失和/或置换以改变至少一个选自但不限于以下的性质:抗体的效应功能、效价或半衰期性质。
在某些实施方案中,根据本发明的抗体的重链的氨基酸序列提供为如以下SEQIDNO:5,其包括VH-CH1-CH2-CH3域,且其还包括铰链区:QVQLVQSGSELKKPGASVKLSCKASGFTFTTYGINWVRQAPGQGLEWIGWIYPRDGSTNFNENFKDRATITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARLTGGTFLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
在某些另外的实施方案中,本发明延伸到包括重链的抗体或结合成员,所述重链包括与SEQIDNO:5具有至少80%氨基酸序列同一性、更优选地至少90%氨基酸序列同一性、更优选地至少95%氨基酸序列同一性和最优选地98%氨基酸序列同一性的同源的氨基酸序列。
在某些实施方案中,如SEQIDNO:5中所定义的和如图5中所描绘的重链的氨基酸序列由如图6中所示的SEQIDNO:6的核苷酸序列所编码。在如图5中所示的SEQIDNO:5的序列中,粗体的残基为铰链区,斜体的残基为CH1恒定域的残基,标下划线的残基为CH2恒定域的残基,和在标下划线的残基之后列出的残基为CH3恒定域的残基。在某些实施方案中,CH1恒定域、CH2恒定域和/或CH3恒定域可用来源于任何适宜的免疫球蛋白亚型的CH1域、CH2域或CH3域来全部地或部分地置换,所述免疫球蛋白亚型比如,但不限于,IgG1、IgG2、IgA或IgM。在某些实施方案中,还可提供存在于任何恒定域中的至少一个氨基酸残基的缺失、添加或置换。通常所述缺失、添加或置换导致由此引起的抗体的Fc部分或抗体片段的结合性质的功能改变,且尤其是抗体的Fc区域结合Fc受体和介导效应功能的能力的调整(modulation)。
在某些另外的实施方案中,本发明延伸到分离的抗体,所述分离的抗体包括SEQIDNO:1的轻链可变域,或与其具有至少90%氨基酸序列同一性的变体,和SEQIDNO:4的重链可变域,或与其具有至少90%氨基酸序列同源同一性的变体。
在某些另外的实施方案中,提供了由轻链和重链形成的抗体,所述轻链包括SEQIDNO:2的氨基酸序列,或与其具有至少90%序列同一性的变体,所述重链具有SEQIDNO:5的氨基酸序列、或与其具有至少90%氨基酸序列同一性的变体。
将理解地是,用于产生本发明的抗体和抗体片段的轻链和重链二者的可变域和恒定域可包括这些域的变体,例如,所述可变域和恒定域与本文所描述的这些域的序列相比较可包括一个或多个氨基酸变异。将理解地是,变体恒定域可比本文所描述的恒定域更长或更短。在某些实施方案中,变体可变域或恒定域可具有与野生型抗体恒定域至少90%同一性或相似性的序列同源性。
如本文定义的“序列同源性”还可称作序列同一性或序列相似性。如本文所用的术语“同一性”或“序列同一性”,意为在比对序列中任何特定的位置,两个比对序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用的,术语“相似性”或“序列相似性”表示,在比对序列的任何特定位置,序列之间的氨基酸残基是相似的类型。例如,亮氨酸残基可置换异亮氨酸残基或缬氨酸残基。这可称作保守置换。优选地,当通过保守置换其中含有的任何氨基酸残基来修饰本发明的氨基酸序列时,当与未修饰的抗体相比较时这些改变对所得抗体的结合特异性或功能活性没有影响。
关于本发明的(天然)多肽和其功能衍生物的序列同源性或序列同一性涉及,在比对序列和导入空位(如果需要的话,以获得最大同源性百分比)之后,候选序列中与对应的天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比,且不将任何保守置换看作序列同一性的部分。N-末端延伸或C-末端延伸或插入均不应视作降低序列同一性或序列同源性。用于进行两个或多个氨基酸序列的比对并确定它们的序列同一性或序列同源性的方法和计算机程序是本领域中的技术人员熟知的。例如,2个氨基酸序列的同一性或相似性的百分比可以利用例如BLAST(Altschul等人1990)、FASTA(Pearson&Lipman1988)、或Smith-Waterman算法(Smith&Waterman1981)容易地计算。
在另一方面,本发明提供了完全人源化的抗体,其对于存在于Toll样受体2上的由鼠单克隆抗体T2.5识别的表位具有结合特异性,其中所述人源化的抗体包括:
-可变轻链,其中所述可变区包括SEQIDNO:1的氨基酸序列,由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成,
-重链,其中可变域包括SEQIDNO:4的氨基酸序列,由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中,可将抗体与至少一种效应分子或报道分子轭合。
在某些另外的方面,本发明延伸到完全人源化的单克隆抗体,命名为OPN-305,其包括具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的重链可变域。还可将OPN-305定义为具有由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成的轻链和由SEQIDNO:5的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:5的氨基酸序列组成的重链。
如本文所用的术语“基本上由…组成(consistsessentiallyof)”或基本上由…组成(consistingessentiallyof)”意为多肽可具有除所描述的那些之外的另外的特征或组分,条件是所述另外的特征或组分不显著影响抗体或抗体片段对Toll样受体2具有结合特异性的能力。即,包括多肽的抗体或抗体片段可具有不干扰所述抗体或抗体片段结合Toll样受体2并拮抗Toll样受体2功能活性的能力的另外的特征或组分,所述另外的特征或组分比如引入到氨基酸序列中以降低抗体的免疫原性的修饰。例如,基本上由指定的序列组成的多肽可在序列的任一端或在序列的两端含有1个、2个、3个、4个、5个或更多个另外的氨基酸,条件是另外的氨基酸不干扰、抑制、阻遏或阻断抗体或抗体片段中的多肽的作用。相似地,可利用一个或多个官能团对有助于本发明的Toll样受体2拮抗性抗体的多肽分子进行化学修饰,条件是所述官能团不干扰抗体或抗体片段与Toll样受体2结合并拮抗其功能的能力。
在某些另外的方面,本发明延伸到分离的、完全人源化的单克隆抗体,其包括轻链可变区和/或重链可变域,所述轻链可变区包括SEQIDNO:1的氨基酸序列、由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成,所述重链可变域具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。
如本文所用的,“完全人源化的”抗体指具有其中构架区(FR)、恒定区(CR)和互补决定区(CDR)来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体,。并且,如果抗体含有恒定区,则这些恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。本发明的完全人源化的抗体可包括非由人类免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基,比如通过随机诱变或定点诱变体外导入的突变。然而,完全人源化的抗体不意在包括其中已将来源于其他哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列移植到人类构架序列中的抗体。完全人源化的单克隆抗体是表现出单一结合特异性且具有其中构架区和CDR区二者均来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。这与例如人源化的单克隆抗体是不同的,所述人源化的单克隆抗体中已将来源于另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列移植到人类构架序列中。
在其中仅提供了可变重链(VH)序列的氨基酸序列或可变轻链(VL)序列的氨基酸序列的实施方案中,则本发明延伸到用于根据Portolano等人(Portolano等人TheJournalofImmunology(1993).150:880-887)和Clarkson等人(Clarkson等人Nature(1991)352:624-628)的教导通过针对互补可变域序列的文库筛选所述可变域序列而产生结合Toll样受体2尤其是哺乳动物Toll样受体2,通常是人类Toll样受体2的胞外域的抗体的方法,其中所述抗体发挥功能以拮抗Toll样受体2功能。
在某些另外的实施方案中,本发明提供了分离的抗体,所述分离的抗体特异性结合人类Toll样受体2,所述抗体包括重链可变域和轻链可变域,所述重链可变域包括SEQIDNO:4的氨基酸序列、由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成,所述轻链可变域包括SEQIDNO:1的氨基酸序列、由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成。在某些实施方案中,分离的抗体是基本上无具有不同的抗原特异性的其它抗体的基本上纯的分离的抗体。在某些另外的实施方案中,抗体是重组的抗体,即,抗体已通过重组方法来生成。
在某些另外的方面,提供了与Toll样受体2特异性结合的抗体,其中所述抗体由具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的重链组成,或基本上由具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的重链组成,其中所述抗体与表达于人类细胞、鼠细胞和猴细胞中的Toll样受体2是交叉反应性的(即,其对于所述Toll样受体2具有结合特异性)。通常抗体在配体结合位点与Toll样受体2结合,当结合抗体时所述配体结合位点防止结合Toll样受体2的配体结合位点的配体激动剂对Toll样受体2的激活。
在不同的另外的方面,本发明延伸到包括2个、3个、4个或更多个如本发明的前述方面中所定义的抗体的多价单特异性抗原结合蛋白,或延伸到其片段,其中所述抗体通过连接结构(connectingstructure)彼此结合。
在不同的另外的方面,本发明延伸到来源于本发明的前述方面的完全人源化的抗体的结合成员或抗原结合片段。所述抗原结合片段指保留特异性结合抗原,通常是Toll样受体2的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来执行。在某些实施方案中,结合成员或抗原结合片段可以是分离的结合成员。本发明的结合成员或抗原结合片段可包括本发明的抗体的片段,例如,完全人源化的抗体分子的片段,比如仅重链或轻链,或,例如,重链和/或轻链的可变域。在某些实施方案中,结合成员通常可包括抗体VH域和/或VL域、由抗体VH域和/或VL域组成或基本上由抗体VH域区和/或VL域组成。结合成员的VH域还作为本发明的部分来提供。在每个VH域和VL域内有3个互补决定区(“CDR”),以及4个相关的构架区(“FR”)。VH域通常包括3个HCDR(重链互补决定区),且VL域通常包括3个LCDR(轻链互补决定区)。因此,结合成员可包括VH域,所述VH域在序列中包括VHCDR1(或HCDR1)区、VHCDR2(HCDR2)区和VHCDR3(HCDR3)区以及多个相关构架区。结合成员可另外地或可选地包括VL域,所述VL域包括VLCDR1域、VLCDR2域和VLCDR3域以及相关的构架区。VH域或VL域通常包括4个构架区,FR1、FR2、FR3和FR4,其以以下排列散在于3个互补决定区之间:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
轻链的可变区(VL)包括3个互补决定区(CDR),其在赋予抗体或结合片段的结合特异性中具有作用。互补决定区还可称作高变区。以下显示的3个互补决定区为SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9,这些有关VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
VLCDr1:Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Glu-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Ser-Leu-Met-Gln
(RASESVEYYGTSLMQ(SEQIDNO:7))
VLCDR2:Gly-Ala-Ser-Asn-Val-Glu-Ser(GASNVES(SEQIDNO:8))
VLCDR3:Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Trp-Thr(QQSRKLPWT(SEQIDNO:9))
图1A显示了如SEQIDNO:1中所描绘的本发明的抗体的VL域的氨基酸序列。图1B显示了可变轻链核苷酸序列和推断的氨基酸序列。VLCDR1区、VLCDR2区和VLCDR3区的位置通过对适当的氨基酸残基标下划线来显示,其包括图1A中的每个互补决定区(CDR)。
在图1B中,根据由Kabat等人(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.和Foeller,C.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),第5版.NIH出版号.91-3242)设计的编号系统按常规对轻链可变域的残基进行编号。当提及可变域中的残基(约为轻链的第1-107位残基和重链的第1-113位残基)时一般使用Kabat编号系统。除非另外声明,本说明书中使用该编号系统。Kabat残基命名并非总是与本发明的重链可变区和轻链可变区的氨基酸残基的线性编号相符合。实际的线性氨基酸序列可含有与严格的Kabat编号相比更少的氨基酸或额外的氨基酸,对应于重链或轻链的基本可变域结构的结构组分(无论是构架区或者互补决定区(CDR))的缩短或其中的插入。通过利用已对其应用Kabat编号的标准序列与抗体的序列中的残基进行比对可确定任何给定的抗体的残基的正确的Kabat编号。
VLCDR1(也称作VL-CRD1,轻链可变域互补决定区1,或CDR-L1)由存在于如图1A中所示的轻链可变域序列的第24位残基至第38位残基的15个氨基酸残基组成。这些残基在图1B中显示为第24位残基至第34位残基,其中适当考虑第27位残基、第27a位残基、第27b位残基、第27c位残基和第27d位残基。因此,在VLCDR1的情况下,采用了15个残基来等同于根据Kabat定义的CDRL1区域。
如图1A中所示的VLCDR2(也称作VL-CRD2,轻链可变域互补决定区2,或CDR-L2)由7个氨基酸残基组成,并位于如图1B中所示的可变域序列的第50位残基至第56位残基。这些残基与为等同于根据Kabat定义的CDRL2区而采用的第50位残基至第56位残基准确相关。
如图1A所示的VLCDR3(也称作VL-CRD3,轻链可变域互补决定区3,或CDR-L3)由9个氨基酸残基组成,并位于如图1B中所示的轻链可变域序列的从第89位残基至第97位残基。这些残基与为等同于根据Kabat定义的CDRL3区而采用的第89位残基至第97位残基准确相关。
重链可变区(VH)也包括3个互补决定区(CDR),其在赋予抗体或抗体片段的结合特异性中具有作用。以下显示3个互补决定区为SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12,这些有关VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
VHCDR1:Thr-Tyr-Gly-Ile-Asn(TYGIN(SEQIDNO:10))
VHCDR2:Trp-Ile-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Thr-Asn-Phe-Asn-Glu-Asn-Phe-Leu-
Asp(WIYPRDGSTNFNENFKD(SEQIDNO:11))
VHCDR3:Leu-Thr-Gly-Gly-Thr-Phe-Leu-Asp-Tyr(LTGGTFLDY(SEQIDNO:12))
图2A显示了如SEQIDNO:2中所描绘的VH域的氨基酸序列。图2B显示了可变重链核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
在图2B中,根据Kabat(同前)设计的系统按常规对重链可变域的残基进行编号。在图2A中通过对适当的氨基酸残基标下划线来显示VHCDR1区、VHCDR2区和VHCDR3区的位置。
VHCDR1(也称作VH-CRD1,重链可变域互补决定区1,或CDR-H1)由存在于可变域序列的第31位残基至第35位残基的5个氨基酸残基组成。这些残基与为等同于根据Kabat定义的CDRH1区而采用的第31位残基至第35位残基准确相关。
VHCDR2(也称作VH-CRD2,重链可变域互补决定区2,或CDRH2)由17个氨基酸残基组成且位于可变域序列的从第50位残基至第65位残基。这些残基与为等同于根据Kabat定义的CDRH2区而采用的第50位残基至第65位残基准确相关。
VHCDR3(也称作VH-CRD3,重链可变域互补决定区3,或CDRH3)由9个氨基酸残基组成,且位于轻链可变域序列的从第95位残基至第103位残基。如图2B中所示出的,由于第100位和第100a位处2个残基的存在,认为其对齐Kabat来源的CDRH3区的CDRH3区的第100位残基,这9个残基与根据Kabat定义的CDHR2区的8个残基(第95位残基至第102位残基)准确相关。
在两组CDR均存在的情况中,轻链的CDR与重链的CDR缔合以赋予抗体或抗体结合片段的结合特异性。已知轻链可变区对结合能量的贡献相对于所缔合的重链可变区是小的。因此,已知在序列中包括3个互补决定区(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的分离的重链区具有抗原结合能力并常被称作单域抗体。本发明基于本发明提供的重链可变域提供了这样的抗体片段,比如SEQIDNO:1中所定义的。
在不同的另外的方面,本发明延伸到完全人源化的抗体或相关的结合成员,其对Toll样受体2(TLR2、TLR-2、CD282)具有结合特异性且其包括选自包括SEQIDNO:7至SEQIDNO:12的组的至少一种氨基酸序列、由选自包括SEQIDNO:7至SEQIDNO:12的组的至少一种氨基酸序列组成或基本上由选自包括SEQIDNO:7至SEQIDNO:12的组的至少一种氨基酸序列组成。在某些实施方案中,结合成员包括SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的氨基酸序列。在某些另外的实施方案中,提供了在序列中包括SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的氨基酸序列、由SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的氨基酸序列组成的结合成员。在某些实施方案中,可在序列中提供SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中的每一个,且构架区散在于其中。
在某些实施方案中,VH域或VL域的氨基酸序列可包括至少一个回复突变,所述回复突变为对序列的特定位置处的氨基酸残基的替代以提高人源化的抗体或其片段对TLR的结合特异性,和/或以增强人源化的抗体作为TLR2拮抗剂的治疗效力。通常可对轻链可变区和重链可变区中的构架区进行这样的修饰以减低抗体的免疫原性。在某些实施方案中,可使用另外的工程技术来修饰本发明的抗体,例如通过包括可能改变血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖的细胞毒性的Fc区的修饰。此外,在某些实施方案中,可产生具有改变的糖基化类型的抗体或抗体片段。在某些实施方案中,改变本发明的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列,其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。因此,多肽中这些三肽序列中的任一种的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖其中之一与羟氨基酸的连接,所述羟氨基酸最常见地为丝氨酸或苏氨酸,但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
在某些另外的实施方案中,通过将抗体与聚乙二醇(PEG)衍生物反应可将抗体聚乙二醇化。在某些实施方案中,抗体是去岩藻糖基化的且因此缺少岩藻糖残基。
在某些实施方案中,通过选择置换可实现对抗体的生物性质的修饰,所述置换影响(a)置换区域中的多肽骨架的结构,例如,片层构象或螺旋构象,(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积。根据氨基酸侧链的性质的相似性可将氨基酸分组(于A.L.Lehninger,Biochemistry(生物化学),第二版.,第73-75页,WorthPublishers,NewYork(1975)中):(1)非极性氨基酸:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)不带电荷的极性氨基酸:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gin(Q);(3)酸性氨基酸:Asp(D)、Glu(E);(4)碱性氨基酸:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可选地,根据共有的侧链性质可将天然存在的残基分为以下的组:(1)疏水性氨基酸:正亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸;(2)中性亲水性氨基酸:半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;(3)酸性氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸;(4)碱性氨基酸:组氨酸、赖氨酸、精氨酸;(5)影响链取向的残基:甘氨酸、脯氨酸;(6)芳香族氨基酸:色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。非保守置换将使这些种类之一的成员替换为另一种类。还可将所述被置换的残基引入到保守置换位点中,或,引入到其余的(例如,非保守的)位点中。
在某些另外的方面,本发明延伸到SEQIDNO:1的VL域,和/或SEQIDNO:4的VH域在形成人源化的抗体或其片段中的用途,其中所述抗体或片段对Toll样受体2具有结合特异性,且其中所述抗体或片段发挥功能以拮抗Toll样受体2功能活性。
在某些另外的实施方案中,本发明延伸到对Toll样受体2具有结合特异性且作为TLR2拮抗剂行使作用的结合成员,所述结合成员包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的氨基酸序列、由SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的氨基酸序列组成,或延伸到具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少80%同源性、更优选地至少90%同源性、更优选地至少95%同源性和最优选地至少98%氨基酸序列同源性的序列。
在某些另外的方面,本发明延伸到完全人源化的单克隆抗体,命名为OPN-305,以下的实施例中描述了其特征。OPN-305的轻链可变域(VL)氨基酸序列显示于SEQIDNO:1中,而OPN-305的重链可变域(VH)氨基酸序列显示于SEQIDNO:4中。并且,OPN-305的重链氨基酸序列显示于SEQIDNO:5中,而OPN-305的轻链氨基酸序列显示于SEQIDNO:2中。
抗体可通过重组的方式来产生,比如细胞培养,或可选地抗体可以是分离的抗体。在某些实施方案中,可对重链的Fc部分进行另外的修饰,且尤其是抗体的CH2恒定域和CH3恒定域。在这样的实施方案中,抗体将包括具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的轻链,和包括SEQIDNO:4的氨基酸序列的重链可变域。在某些实施方案中,结合片段可来源于OPN-305完全人源化的抗体,比如Fab片段、F’ab片段或sc-Fv。
在不同的另外的方面,本发明延伸到免疫轭合物,所述免疫轭合物包括连接于伴侣分子的本公开内容的抗体、或其抗原结合部分。在某些实施方案中,所述抗体-伴侣分子轭合物通过化学连接物来轭合,所述化学连接物比如肽基连接物、肼连接物或二硫化物连接物。在某些实施方案中,偶联伴侣是效应分子、标记物、药物或载体分子。用于将本发明的抗体与肽基偶联伴侣和非肽基偶联伴侣偶联的适宜的技术将是本领域中的技术人员熟知的。适宜的标记物的例子包括可检测的标记物、比如放射性标记物,或酶标记物,比如辣根过氧化物酶,或化学部分,比如生物素。可选地,标记物可以是功能性的标记物,例如,蓖麻毒蛋白,或能够在抗体结合位点将前药转化为活性药物的前药。
在不同的另外的方面,本发明延伸到双特异性分子,所述双特异性分子包括连接于第二官能部分的抗体或其抗原结合部分,所述第二官能部分具有与所述抗体或其抗原结合部分相比不同的结合特异性。
在某些另外的方面,本发明延伸到单克隆抗体、来源于抗体的结合片段、肽、寡核苷酸、模拟肽或有机化合物,其特异性地结合存在于Toll样受体2的胞外域上的与单克隆抗体OPN-305所结合的表位相同的表位,其中所述单克隆抗体不是命名为T2.5的商业上可获得的抗体。通常由化合物特异性地结合的表位包括SEQIDNO:13和/或SEQIDNO:14的氨基酸序列。所述化合物具有与本文所公开的抗体在相同的表位交叉竞争以结合Toll样受体2的能力。所述化合物可通过交叉竞争结合研究来鉴定,所述交叉竞争结合研究可针对本发明的抗体诸如OPN-305来进行。
在不同的另外的方面,本发明延伸到根据本发明的完全人源化的抗体、完全人源化的单克隆抗体或从其衍生的结合成员在预防和/或治疗全部地或部分地通过Toll样受体2激活和/或胞内信号传递所介导的疾病或病症中的用途。
在某些实施方案中,TLR2-介导的疾病或病症是炎性病症。
在某些实施方案中,结合成员可选自包括但不限于以下的组:Fab片段、Fab’片段、scFv(单链可变片段)、模拟肽、双抗体或相关的多价衍生物。
用于重组产生Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段的技术是本领域中的技术人员熟知的,且包括在以下中公开的那些:国际PCT专利公布WO92/22324、Sawai等人,“DirectProductionoftheFabFragmentDerivedFromtheSpermImmobilizingAntibodyUsingPolymeraseChainReactionandCDNaExpressionVectors(利用聚合酶链式反应和CDNa表达载体直接产生来源于精子制动抗体的Fab片段)”,1995,AJRI34:26-34,和Mullinax等人,“ExpressionofaHeterodimericFabAntibodyProteininOneCloningStep(在一个克隆步骤中表达异源二聚体Fab抗体蛋白)”,1992,BioTechniques12(6):864-869和Better等人,“EscherichiacoliSecretionofanActiveChimericAntibodyFragment(大肠杆菌分泌活性嵌合抗体片段)”1988,Science240:1041-1043,其内容通过引用并入本文。
可用来产生scFv(单链Fv片段)的技术的例子在Hustion等人(“ProteinEngineeringofSingle-ChainFvAnalogsandFusionProteins(单链Fv类似物和融合蛋白的蛋白质工程)”,MethodsinEnzymology,卷203:46-88(1991))中公开,其内容通过引用并入。
在某些实施方案中,抗体片段可通过根据Morimoto的方法(Morimoto等人,“Single-steppurificationofF(ab').sub.2fragmentsofmousemonoclonalantibodies(immunoglobulinsG1)byhydrophobicinteractionhighperformanceliquidchromatographyusingTSKgelPhenyl-5PW(通过利用TSKgelPhenyl-5PW进行疏水相互作用高效液相色谱对小鼠单克隆抗体(免疫球蛋白G1)的F(ab’)2片段的单步纯化)”JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992))的蛋白水解消化来源于全长抗体。现在也可通过宿主细胞直接产生抗体片段(参见Carter等人.,“HighlevelEscherichiacoliexpressionandproductionofabivalenthumanizedantibodyfragment(大肠杆菌高水平表达和产生二价人源化的抗体片段)”Bio/Technology10:163-167(1992))。
在不同的另外的方面,本发明提供了用于治疗和/或预防全部地或部分地通过Toll样受体2介导的炎性病症的方法,所述方法包括以下步骤:
-提供治疗有效量的根据本发明的人源化的抗体或其结合片段,和
-将其施用给需要所述治疗的受治疗者。
在某些实施方案中,该方法包括含2个、3个、4个或更多个根据本发明的抗体的多价单特异性抗原结合蛋白的施用。
本发明的又一方面提供了药物组合物,所述药物组合物包括根据本发明的人源化的抗体、人源化的单克隆抗体、其抗原结合部分、免疫轭合物或双特异性分子以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在某些实施方案中,制剂是液体制剂、冻干的制剂、重构为液体的冻干的制剂、或气溶胶制剂。在某些实施方案中,制剂中的抗体为以下的浓度:约0.5mg/ml至约250mg/ml、约0.5mg/ml至约45mg/ml、约0.5mg/ml至约100mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、或约50mg/ml至约250mg/ml。
在某些实施方案中,制剂还包括缓冲液。通常制剂的pH从约pH5.5至约pH6.5。
在某些实施方案中,缓冲液可包括从约4mM至约60mM的组氨酸缓冲液、约5mM至约25mM的琥珀酸缓冲液,或约5mM至25mM醋酸缓冲液。在某些实施方案中,缓冲液包括浓度为从约10mM至300mM,通常为约125mM浓度的氯化钠和浓度从约5mM至50mM,通常为25mM的柠檬酸钠。在某些实施方案中,制剂还可包括浓度为约0%至约0.2%的表面活性剂。在某些实施方案中,表面活性剂选自由以下组成的组,但不限于:聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85和其组合。在一个优选的实施方案中,表面活性剂是聚山梨醇酯-20。在某些实施方案中,制剂还包括约0.001%至约0.05%的吐温并且还可包括浓度为约125mM的氯化钠和浓度为约25mM的柠檬酸钠。
在某些实施方案中,药物组合物还可包括至少一种免疫调节化合物,或与至少一种免疫调节化合物一起施用给受治疗者,所述免疫调节化合物比如免疫抑制剂化合物、第二抗体或其片段、或重组蛋白。
本发明的抗体和结合成员还可用于诊断,例如用于涉及Toll样受体2的病状的体内诊断和成像,其中本发明的抗体可用来靶向和结合表达Toll样受体2的细胞。并且,在某些实施方案中,可将第二分子或化合物与本发明的抗体连接以用于将该第二分子或化合物靶向表达Toll样受体2的细胞。
在某些另外的方面中,本发明提供了用于治疗或预防Toll样受体2介导的炎性病症或炎性疾病的药盒。在某些实施方案中,药盒包括能够结合Toll样受体2并拮抗其功能活性的根据本发明的抗体或其抗原结合片段,和用于将其施用给患者的说明书。
根据又一方面,提供了人源化的中和抗体或其抗原结合部分,其中抗体以1×10-8或更小的KD特异性结合哺乳动物Toll样受体2,但不结合CD32(Fcγ受体II),其中抗体特异性地结合存在于Toll样受体2的胞外域上的与命名为T2.5的商业上可获得的抗体所结合的表位相同的表位。
根据又一方面,提供了分离的单克隆抗体,或其抗原结合部分,其以1×10-8或更小的KD结合哺乳动物Toll样受体2上的表位,且其不结合CD32(Fcγ受体II),其中所述表位被参考抗体识别,其中所述参考抗体包括含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重链可变区,和包括SEQIDNO:1的氨基酸序列的轻链可变区。
根据又一方面,提供了分离的人类单克隆抗体,或其抗原结合部分,其特异性地结合哺乳动物Toll样受体2并表现出以下的性质:
-以1×10-8或更小的KD结合哺乳动物Toll样受体2
-不结合CD32(Fcγ受体II)
-对人类Toll样受体2、鼠Toll样受体2和猴Toll样受体2是交叉反应性的。
Fab结合成员
在本发明的前述方面的某些实施方案中,本发明提供了抗体片段或抗体的抗原结合部分。结合片段的例子包括Fab、F’ab或F(ab’)2片段,其为单价片段,由异源四聚体抗体的VL域、VH域、CL域和CH1域组成或基本上由异源四聚体抗体的VL域、VH域、CL域和CH1域组成。在某些实施方案中,VL域具有SEQIDNO:1的氨基酸序列,和VH域具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中,CL域和CH1域基于IgG亚类和同种型IgG4的免疫球蛋白的CL域和CH1域的氨基酸序列,或如图5的SEQIDNO:5中所示CL域和CH1域的氨基酸序列。在某些实施方案中,本发明的该实施方案的Fab片段可用来治疗或预防病症,包括但不限于,银屑病、皮炎、和眼部疾病,包括葡萄膜炎和AMD(年龄相关性黄斑变性)。
单域结合成员
本发明除提供对TLR2具有结合特异性并拮抗TLR2功能的人源化的单克隆抗体之外,还延伸到非抗体的结合成员,所述结合成员包括基于如SEQIDNO:1中所定义的VL(轻链可变)区的氨基酸序列和如SEQIDNO:4中所定义的VH(重链可变)区的氨基酸序列的一对结合域。尤其是,本发明延伸到基于本发明的抗体的人源化的抗体的VL区或VH区的单结合域。
因此,在本发明的某些另外的实施方案中,提供了结合成员,所述结合成员包括来源于本发明的人源化的抗体的单结合区、由来源于本发明的人源化的抗体的单结合域组成或基本上由来源于本发明的人源化的抗体的单结合域组成。在某些实施方案中,单结合域来源于如SEQIDNO:4中定义的VH(重链可变域)的氨基酸序列。所述结合域可用作对于TLR2的靶向剂,因为已知免疫球蛋白VH域能够以特异性方式结合靶抗原。
CDR残基的修饰
将为本领域中的技术人员所理解地是,可对互补区的序列(如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中所定义的)以及高变区和可变区的序列进行修饰,而不丧失特异性地结合TLR2的能力。例如,来源于本发明的人源化的抗体的结合成员的CDR区可与本文在SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中定义的氨基酸序列相同或高度同源(例如,95%序列同一性或更高的序列同一性)。如本文所定义的,术语“高度同源”意为可对CDR的序列进行1至5个氨基酸置换。在某些实施方案中,相应CDR、高变区或可变区和它们未经修饰的对应物之间存在的同源度将至少为80%、优选地为90%、更优选地为95%和最优选地大于98%。在修饰的结合成员或同源的结合成员保留特异性结合TLR2并拮抗其功能活性的能力的情况下,所述修饰的序列在本发明的范围之内。
多核苷酸
在不同的另外的方面,本发明延伸到多核苷酸,且尤其是分离的多核苷酸,其编码本发明的人源化的抗体、抗体片段和结合成员。
因此在本发明的另一方面提供了编码SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中,多核苷酸是分离的多核苷酸。
如本文所定义的,“多核苷酸”包括任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸,其可以是未修饰的RNA或DNA,或修饰的RNA或DNA,包括但不限于,单链RNA和双链RNA,和为单链区和双链区的混合物的RNA。
本发明的多核苷酸,例如,编码包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽(polypeptide或polypeptides)的多核苷酸,包括其等位基因变体和/或其互补序列(complement),其包括在中严格度或高严格度的条件下与所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。
在不同的另外的方面,本发明延伸到表达载体,所述表达载体包括编码包括SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:4的多肽的多核苷酸。并且,本发明延伸到用所述载体转化的宿主细胞。
杂交瘤细胞系
本发明的另一方面提供了杂交细胞系(杂交瘤),其表达具有SEQIDNO:1的重链可变域氨基酸序列和SEQIDNO:4的轻链可变氨基酸序列的抗体。
附图简述
图1A显示了SEQIDNO:1,其为根据本发明的抗体的轻链的可变域的氨基酸序列,图1B显示了可变轻链核苷酸序列(SEQIDNO:17)和已根据Kabat进行编号的推断的氨基酸序列(SEQIDNO:18),
图2A显示了SEQIDNO:4,其为根据本发明的抗体的重链的可变域的氨基酸序列,图2B显示了可变重链核苷酸序列(SEQIDNO:19)和已根据Kabat进行编号的推断的氨基酸序列(SEQIDNO:20),
图3显示了SEQIDNO:2,其描绘了根据本发明的抗体的轻链的氨基序列,
图4显示了SEQIDNO:3,其显示了可被翻译以编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的核酸序列,
图5显示了SEQIDNO:5,其为根据本发明的抗体的重链的氨基酸序列,
图6显示了SEQIDNO:6,其为可被翻译以编码SEQIDNO:5的氨基酸序列的核酸序列,
图7显示了SEQIDNO:15,其提供了人类Toll样受体2的氨基酸序列,
图8显示了SEQIDNO:16,其提供了鼠Toll样受体2的氨基酸序列,
图9显示了OPN-305介导的Toll样受体2拮抗不依赖于抗体与CD32的结合,且组1显示了对照山羊抗体的添加,组2显示了山羊抗hCD32a封闭抗体的添加,和组3显示了山羊抗hCD32b封闭抗体的添加,
图10显示了由OPN301单克隆抗体介导的Toll样受体2拮抗依赖于抗体与CD32的结合(图10A),而OPN-305介导的Toll样受体2拮抗不依赖于抗体与CD32的结合(图10B),
图11显示了FACS分析的结果,其显示了OPN-305对于人类Toll样受体2具有结合特异性(图11A),而IgG4同种型对照抗体不与OPN-301竞争结合Toll样受体2(图11B),
图12显示了OPN-305(OPN-305-21)以与鼠OPN-301抗体等同的方式阻抑鼠TLR2反应,
图13显示了FACS分析痕迹,其显示OPN-305与表达于粒细胞(图13A)和单核细胞(图13B)上的猴TLR2结合,但不与表达于淋巴细胞上的猴TLR2结合(图13C),
图14显示了2个FACS分析痕迹,其显示了OPN-305与抗TLR2鼠单克隆抗体OPN-301竞争结合猴TLR2,其中图14(A)显示关于粒细胞的结果,和图14(B)显示关于单核细胞的结果,
图15(A)和(B)显示抗体样品的痕迹,所述抗体样品已通过在16/60SephacrylS200柱上的体积排阻色谱来精制。图15(A)显示了抗TLR2嵌合抗体,图15(B)显示了OPN305抗体(VK5/VH4)。在每种情况中,收集跨越级分B8至B4的单体峰。
图16显示了在4个供体样品中检验的关于细胞毒性和T细胞调节活性的对检验样品的预筛查。样品1(每组的第一个柱(黑条))是嵌合的抗TLR2抗体与KLH,样品2(每组结果的第二个柱(白色条))是VK5/VH4(OPN305)与KLH,样品3(第三个条(深灰色))是命名为VK5/VH5的对比抗体与KLH,而样品4(每组右侧的第四条(浅灰色))是仅KLH的对照。结果显示第7天存活的细胞计数。将在KLH存在下孵育的样品的刺激指数(S.I.)与单独的KLH的刺激指数相比较。将四天取样期间的刺激指数平均。确定阳性反应的截止值SI≥2。
图17(A)、(B)和(C)显示了显示episcreen检验结果的3个柱图。利用来自21个供体的PBMC在EpiScreenTM时程T细胞测定中检验嵌合的抗TLR2抗体、VK5/VH4抗体和VK5/VH5抗体。在第5天、第6天、第7天和第8天对与受试抗体一起孵育的PBMC的大量培养进行取样,并用3H-胸苷进行脉冲标记。收获细胞并通过闪烁计数来测量放射性的掺入。将每个重复三次的样品的结果进行平均并通过转换为刺激指数(SI)使其标准化。图上显示了对于以下抗体每个供体的每个时间点的SI:(a)嵌合的抗体,(b)OPN-305抗TLR2抗体(命名为VK5/VH4),(c)对比抗TLR2抗体,命名为VK5/VH5。通过粗黑水平线突出显示确定阳性反应的截止值SI≥2,并指出了显著的反应(学生t检验中p<0.05)(*)。
图18显示了用EPISCREENTM技术预测的免疫原性和临床背景中观察到的免疫原性的比较。利用EPISCREENTM技术检验16个治疗性蛋白的免疫原性的相对风险。将结果针对当每种蛋白用于临床中时所观察到的免疫原性(抗治疗性抗体反应)的频率(来源于PubMed的数据)绘制曲线。显示了回归线和相关系数。
图19显示了OPN-305抗TLR2单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:22)和T2.5鼠抗TLR2单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:21)的比对,其中所确定的序列同一性显示为89.2%。
图20显示了OPN-305抗TLR2单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:24)和T2.5鼠抗TLR2单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:23)的比对,其中所确定的序列同一性显示为88.1%。
图21显示了在小于OPN-305的最大受体结合时实现了TLR2依赖的信号传递的完全抑制。在用Pam3Csk4处理后观察到了剂量依赖方式的对NF-kB活性的抑制(图21A和B)。在2μg/ml的浓度时,OPN305几乎完全抑制了NF-kB活性(图21C)。
图22A描绘了NF-kB依赖的SEAP活性与[Pam3CSK4]相对比,而图22B描绘了1/V与1/S相对比的莱恩威佛-伯克线(LineweaverBurkPlot)。
图23显示了3个图,图A、B和C,描绘了当与未暴露于OPN-305的对照细胞相比较时,Toll样受体介导的对于鞭毛蛋白的反应(TLR5,图23C)和对于脂多糖的反应(TLR4,图23B)未改变。如预期地,Toll样受体2介导的对于Pam3CSK的反应和对于FSL-1的反应被OPN-305所阻遏(图23A)。这表明OPN-305未引起TLR4或TLR5对于配体的响应性的任何非预期的增高或降低。
图24显示了OPN-305单克隆抗体抑制Pam3Csk4诱导的脓毒症。用指定的剂量的OPN-305对雌性BALB/c小鼠的组(n=4)处理30分钟,然后用100μg的Pam3Csk4进行处理。
图25显示了OPN305抑制Pam3Csk4诱导的脓毒症。在该实验中,静脉内施用OPN30530分钟,然后腹膜内施用100μg的Pam3Csk4。4小时后,通过致死麻醉处死小鼠并采集血液。取得血清并通过ELISA来确定细胞因子浓度。将血清以1/10进行稀释以用于KCELISA和IL12p40ELISA,和以1/5进行稀释以用于IL-6ELISA。
图26显示了TLR2表达于大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)上,并利用OPN305检测TLR2。(A)未染色的细胞,(B)阳性对照;多克隆兔抗大鼠TLR2第一抗体,第二抗体是抗兔Alexa-Fluor488;(C)用多克隆人IgG4处理细胞,第二抗体是人类抗IgG4PE;(D)OPN305染色的细胞,第二抗体抗人IgG4PE。
图27显示了TLR2表达于猪PBMC上,并通过OPN305对TLR2进行染色。利用Ficoll通过分离纯化PBMC。A-C代表来自猪666的PBMC,和D-F来自猪488。A、D是未染色的;B、E是用多克隆人IgG4进行标记,然后用PE标记的抗人IgG4进行第二次染色的;C、F是用OPN305标记,然后用PE标记的抗人IgG4进行染色的。
发明详述
本发明提供了完全人类的单克隆抗体,其对于Toll样受体2具有结合特异性,和当其与Toll样受体2结合时,拮抗Toll样受体2功能活性。本发明还提供了来源于完全人类抗体的结合片段,以及结合成员,所述结合成员包括SEQIDNO:1的可变轻链域氨基酸序列和/或SEQIDNO:4的可变重链域氨基酸序列、由SEQIDNO:1的可变轻链域氨基酸序列和/或SEQIDNO:4的可变重链域氨基酸序列组成或基本上由SEQIDNO:1的可变轻链域氨基酸序列和/或SEQIDNO:4的可变重链域氨基酸序列组成。
术语“拮抗Toll样受体2功能”,或相似的术语,比如“Toll样受体2拮抗剂”或“Toll样受体2的激动剂”,其意为抗体、片段或结合成员特异性地结合Toll样受体2并抑制或阻遏诸如Toll样受体2配体的配体或结合化合物与Toll样受体2的结合,所述结合将进而导致Toll样受体2的激活。抗体、片段或结合成员通过抑制或阻抑Toll样受体2与Toll样受体2配体结合后介导的胞内信号传递还可抑制Toll样受体2激活和功能。“Toll样受体2激活和下游介导的信号传递”意为通过TLR2的激活诱导的任何胞内信号传递途径。信号传递途径可以是TLR2特异性途径,或可以是“共享的”信号传递途径,例如其中的信号传递途径可通过另外的源来激活,例如,通过有助于免疫反应的介导物诸如转录因子NF-κB的激活的除TLR2之外的受体的激活。
已知TLR2二聚化为2个功能性的异源二聚体。尤其是,已知TLR2与Toll样受体1或Toll样受体6形成异源二聚体。可能地是,与Toll样受体4(TLR4、TRL-4)和Toll样受体10(TLR10、TLR-10)形成另外的异源二聚体。认为该二聚化与导致不同的微生物来源的配体与TLR2结合的区别相关。本发明人已鉴定无论Toll样受体2是否与Toll样受体1或Toll样受体6形成异源二聚体,本发明的人源化的抗体起作用而拮抗TLR2功能。
抗体结合表位
本发明的人源化的抗体、或其片段或基于其的结合成员选择性地结合Toll样受体2并拮抗其功能。单克隆抗体可通过与受体的配体结合位点附近的结合来阻遏受体被其配体的激活,这导致了阻止配体与配体结合位点接近的空间位阻。
不希望受任何理论束缚,本发明人已鉴定由根据本发明的人源化的抗体结合的结合位点。抗体与包括来源于Toll样受体2(TLR2)的成熟胞外域的N末端域和C末端域的残基的表位结合。在某些实施方案中,表位包括如由Toll样受体2的586个氨基酸序列所确定的Toll样受体2的N末端的第19位至第39位氨基酸残基,所述氨基酸为KEESSNQASLSCDRNGICKGS(SEQIDNO:13)。结合表位还包括Toll样受体2的第538位至第549位氨基酸残基,其存在于SEQIDNO:1的氨基酸序列的C末端区域,该序列包括氨基酸CSCEFLSFTQEQQ(SEQIDNO:14)。
交叉反应性
通常,本发明的抗体、抗体片段或结合成员所拮抗的TLR2是哺乳动物TLR2(或其功能变体),例如,人类TLR2或鼠TLR2。在某些实施方案中,所拮抗的TLR2是TLR2的人类形式,其具有如图7中所定义的如SEQIDNO:15的氨基酸序列,其包括如Genbank登录号AAC34133(URLwww.ncbi.nlm.nih.gov)所定义的784个氨基酸的全长人类Toll样受体序列。
在某些另外的实施方案中,Toll样受体2是鼠TLR2,这包括图8中所定义的如SEQIDNO:16的氨基酸序列,来源于Genbank登录号NP_036035(小家鼠(Musmusculus))。
在某些另外的实施方案中,本发明的抗体、抗体片段或结合成员起作用而拮抗表达于猴细胞的Toll样受体2的功能活性或信号传递。
在某些另外的实施方案中,抗体可具有选自由以下组成的组的解离常数(Kd):(i)10-7M和10-11M之间的解离常数,(ii)10-8M和10-9M之间的解离常数,(iii)10-9M和10-10M之间的解离常数,(iv)10-11M和10-12M之间的解离常数。在某些实施方案中,本发明的抗体、或其片段可以3×10-8或更小的Kd、或4×10-8或更小的Kd与人类Toll样受体2或鼠Toll样受体2结合。
因此本发明的抗体与Toll样受体2的结合可导致与TLR2与其配体的配体/受体相互作用相关的胞内信号传递的阻遏。
抗体结构
本发明的抗体和抗体片段是完全人类的。即,构成抗体的氨基酸残基来源于人类物种,而非来源于,例如,小鼠。因此,本发明的抗体比鼠抗体或诸如小鼠/人类抗体的嵌合抗体具有更少的免疫原性。
已证明由施用鼠抗体或嵌合抗体导致的免疫原性是单克隆抗体的治疗应用的最显著障碍。因此,完全的人类抗体的提供克服了与鼠抗体或人类/小鼠嵌合抗体的提供相关的问题,当将所述鼠抗体或人类/小鼠嵌合抗体多次施用给受治疗者时,可导致直接针对抗体的免疫原性反应,比如HAMA反应。该反应将鼠抗体或嵌合抗体从受治疗者的血清中清除,从而防止抗体到达其靶点并产生其预期的治疗作用。因此,本发明的完全人类抗体赋予了超越所述鼠抗体和嵌合抗体的显著优点。
针对抗体的免疫原性的一个内因是存在于抗体上的CD4+T细胞表位。因此,已对本发明的抗体和结合片段进行分析以鉴定和修饰存在于抗体或抗体片段上的任何CD4+T细胞表位。该过程进一步降低了本发明的抗体和抗体片段的免疫原性。
并且,可对本发明的抗体或抗体片段进行一种或多种技术,所述一种或多种技术可进一步用来确保当将抗体施用给受治疗者时不会针对所述抗体产生免疫原性反应。所述技术的例子将是本领域中的技术人员所熟知的,且包括,但不限于,去免疫化、基因改组和聚乙二醇化。
并且,为增强本发明的抗体或抗体片段的生物功能或治疗活性,可使用另外的优化技术。所述技术包括,但不限于修饰抗体的以下性质:效价、亲和力、结合特异性、K结合(结合速率常数)、K解离(解离速率常数)、热力学稳定性、溶解度、血清半衰期、表达、折叠动力学、蛋白酶敏感性、Fc区效应功能和药物再循环。可调节的生物功能或治疗活性包括,但不限于:效力的增强、改良的药代动力学特征、增强的患者便利性、降低的货物成本、改良的安全性特征、降低的免疫原性和延长的贮存期限。
TLR2介导的疾病的治疗
本发明的人源化的抗体、抗体片段和结合成员可诱导免疫抑制(免疫反应、最特别是促炎性免疫反应的阻抑),尤其通过阻抑Toll样受体2介导的激活和信号传递。本发明人已鉴定了该Toll样受体2功能的阻抑在Toll样受体2激活和信号传递有助于疾病的发作或进展的疾病病症的治疗或预防中是有用的。
本发明的抗体可用于,例如,体外治疗方法、离体治疗方法和体内治疗方法中。
在某些另外的方面,本发明延伸到本发明的抗体、抗体片段或结合成员用于治疗由Toll样受体2激活和信号传递介导的疾病病症的用途。
局部缺血的治疗
因此,在另一方面,本发明提供了用于治疗和/或预防局部缺血再灌注损伤或由其引起的或与其相关的病症的方法,所述方法包括以下的步骤:
-提供治疗有效量的如本文所定义的人源化的抗体,或其结合片段,和
-将所述化合物施用给需要所述治疗的受治疗者。
本发明的又一方面提供了用于治疗全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活介导的局部缺血再灌注损伤或心脏炎性病症的根据本发明的完全人源化的抗体,或来源于其的结合成员。
另一方面提供了根据本发明的人源化的抗体,或其片段或来源于其的结合成员用于制备用来治疗或预防全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的局部缺血再灌注损伤或心脏炎性病症的药物的用途。
在某些实施方案中,心脏炎性病症由再灌注损伤的发生而引起,且可选自包括但不限于以下的组:心肌缺血、缺血性心脏病、高血压心肌缺血、充血性心力衰竭、组织局部缺血、器官局部缺血、急性冠脉综合征、肥大、脑梗死、心肌梗死、心律失常、局部缺血再灌注损伤(I/R损伤)。
当器官或身体的部分未能接受足够的血液供给时产生局部缺血。缺乏充足的血液供给的器官被称为低氧的。当血流在暂时性匮乏后重新回到器官时发生再灌注。再灌注损伤涉及局部缺血的时间段后血液供给重回到组织后发生于组织或器官的损害。局部缺血的时间段中氧气和营养物的缺乏导致循环恢复时的炎症和氧化性损害的时间段。局部缺血再灌注损伤的例子包括缺氧、中风、心脏病发作、慢性肾衰竭或器官移植。
在某些实施方案中,本发明的该方面的方法可用来治疗或预防可由受治疗者中的器官移植引起的局部缺血再灌注损伤。在某些实施方案中,本发明的抗体可用来治疗和/或预防可由实体器官移植引起的局部缺血。
本发明的又一方面提供了在受治疗者中降低实体器官移植相关的局部缺血再灌注损伤中涉及的TLR2表达细胞或组织中的Toll样受体2(TLR2)的一种或多种生物活性的方法,包括:
-将细胞或组织与足以在细胞或组织中降低TLR2的一种或多种生物活性的量的根据本发明的Toll样受体2拮抗性抗体相接触。
在某些实施方案中,TLR2表达细胞或组织是心肌的细胞或组织。在某些实施方案中,TLR2表达细胞或组织是再灌注诱导的心脏炎性病症涉及的细胞或组织,所述心脏炎性病症选自包括但不限于以下的组:心肌缺血、缺血性心脏病、高血压心肌缺血、充血性心力衰竭、组织局部缺血、器官局部缺血、急性冠脉综合征、肥大、脑梗死、心肌梗死、心律失常、局部缺血再灌注损伤(I/R损伤)。
在某些实施方案中,对患有局部缺血再灌注损伤、或处于患有局部缺血再灌注损伤的风险的人类受治疗者进行所述方法。
本发明的又一方面延伸到根据本发明的抗体或其结合片段用于治疗或预防与实体器官移植相关的局部缺血和再灌注的用途。
自身免疫疾病的治疗
在又一方面,本发明提供了用于治疗和/或预防自身免疫疾病或与其相关的病症的方法,所述方法包括以下步骤:
-提供治疗有效量的如本文所定义的人源化的抗体或其结合片段,和
-向需要所述治疗的受治疗者施用所述化合物。
本发明的又一方面提供了用于治疗全部地或部分地通过由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的自身免疫疾病的根据本发明的人源化的抗体或来源于其的结合成员。
另一方面提供了根据本发明的人源化的抗体,或来源于其的结合成员在制备用来治疗或预防全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的自身免疫疾病的药物中的用途。
在某些实施方案中,自身免疫疾病是自身免疫关节炎,尤其是类风湿性关节炎。在某些实施方案中,自身免疫疾病选自包括银屑病、皮炎的组。在某些另外的实施方案中,自身免疫疾病是糖尿病。通常糖尿病是糖尿病(diabetesmellitus)。在某些实施方案中,糖尿病是1型糖尿病。在某些实施方案中,糖尿病是2型糖尿病。
在某些实施方案中,由患有糖尿病的受治疗者引起的病症可称作糖尿病并发症。所述糖尿病并发症可以是急性并发症、慢性并发症或二者的组合。
当糖尿病并发症是急性并发症时,并发症可选自包括但不限于以下的组:视网膜病、神经病、外周循环疾患、皮肤溃疡、多尿症、多饮症、多食症、糖尿病酮症酸中毒(DKA)和高渗性非酮症病状。在某些另外的实施方案中,病症可以是由前述的急性病症或慢性病症中任何一种引起的病症,且可包括,但不限于,失明、蛋白尿、疼痛、麻木、冷觉、间歇性跛行和坏疽。
在某些其他实施方案中,糖尿病并发症可以是慢性并发症,比如由导致血管损害的血糖水平的慢性增高引起的血管疾病(血管病)。在其中血管损害发生于小血管的所述实施方案中,这可导致微血管病,其可导致糖尿病视网膜病、糖尿病神经病和糖尿病肾病(diabeticnephropathy)中的一种或多种。
根据本发明的再一方面,提供了在受治疗者中治疗或预防全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的肥胖相关疾患的方法,所述方法包括向受治疗者施用治疗有效量的根据本发明的任何前述方面的抗体或来源于其的结合成员。
本发明的又一方面提供了用于治疗和/或预防全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的肥胖的根据本发明的人源化的抗体,或来源于其的结合成员。
又一方面提供了根据本发明的人源化的抗体或来源于其的结合成员在制备用来治疗或预防与肥胖相关的疾病病症的药物中的用途,其中所述病症全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所导致。
在某些实施方案中,肥胖相关疾患是选自包括但不限于以下的组的至少一种病症:糖尿病,尤其是2型糖尿病、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、降低的葡萄糖清除、血脂障碍、非酒精性脂肪肝病、高血压、炎症、肝肿大、肝脂肪变性、心肌梗死、哮喘或中风。
本发明的又一方面提供了用于在受治疗者中治疗胰岛素抵抗的方法,所述方法包括向受治疗者施用治疗有效量的根据本发明的抗体或由本发明提供的结合成员。
本发明的又一方面提供了用于在受治疗者中治疗全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的胰岛素抵抗的人源化的抗体、其片段或来源于其的结合成员。
又一方面提供了根据本发明的人源化的抗体、或来源于其的结合成员在制备用来在受治疗者中治疗或预防全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的胰岛素抵抗的药物中的用途。
眼部疾病的治疗
在某些另外的方面,本发明延伸到用于治疗和/或预防眼部疾病的方法,其中所述方法包括以下步骤:
-提供治疗有效量的由本发明提供的人源化的抗体、结合片段或结合成员,和
-将所述化合物施用给需要所述治疗的受治疗者。
本发明的又一方面提供了根据本发明的抗体或来源于其的结合成员用于治疗或预防眼部疾病的用途。
在某些实施方案中,眼部疾病是葡萄膜炎或年龄相关性黄斑变性(AMD)。
肾脏炎症的治疗
本发明的又一方面提供了用于治疗和/或预防肾脏炎症和由其导致的或与其相关的疾病或病症的方法,所述方法包括以下步骤:
-提供治疗有效量的由本发明提供的人源化的抗体、结合片段或结合成员,和
-将所述化合物施用给需要所述治疗的受治疗者。
本发明的另一方面提供了用于治疗全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的肾脏炎症或肾脏病的根据本发明的人源化的抗体或来源于其的结合成员。
又一方面提供了根据本发明的人源化的抗体或来源于其的结合成员在制备用来治疗或预防全部地或部分地由Toll样受体2配体对Toll样受体2的激活所介导的肾脏炎症或肾脏病的药物中的用途。
如本文所定义的,术语“肾脏炎症”和“肾脏病(renaldisease)”延伸到基本上以肾或肾细胞中的炎症的发生为特点,或其中肾中的炎症的发生由最初影响身体中肾以外的位点的疾病或炎性病症所导致的病症。尤其是,炎症可发生的位点包括但不限于:肾小球、肾小囊或肾小囊腔。通常,炎症导致肾功能的至少部分损害和/或肾衰竭。
在某些实施方案中,肾脏炎症和肾脏病包括“肾疾病(kidneydisease)”,其中术语肾疾病一般指人类中至少一个肾的疾患,其中所述疾患削弱或损害肾的功能,这在生理上以诸如蛋白渗漏到尿中为特征,或以排泄含氮废物为特征。肾疾病还可由肾的原发性病变引起,比如对于肾小球或肾小管的损伤、或来自对于另一器官比如胰腺的损伤,其有害地影响了肾执行生物功能的能力,比如保留蛋白的能力。因此,人类中的肾疾病可以是可能影响另外的器官的疾病病症的直接作用或间接作用。影响肾但不特异性地靶向肾的疾病的例子是糖尿病和系统性红斑狼疮。术语肾脏病和肾疾病在本文中与短语“肾的疾病”互换使用。肾疾病可例如由对于肾皮质或肾髓质中的肾小球、肾小管或间质组织的任何改变、损害或创伤引起或是其结果。
在某些实施方案中,肾疾病还可以是进行性肾疾病。如本文所用的术语“进行性肾疾病”指随时间推移(例如,天、周、月、年)导致肾功能丧失的肾的任何疾病。如本文所定义的,术语“肾功能”一般指肾的生理性质,比如保留蛋白从而防止蛋白尿症(例如,清蛋白尿(albuminuria))的能力。可例如通过肾小球滤过率(例如,肌酸酐清除率)、尿中蛋白的排出,例如清蛋白尿、血尿氮、血清或血浆肌酸酐,或其任何组合来评估肾脏功能。
在术语“肾脏炎症和肾脏病”的含义的范围中的特定病症的例子包括但不限于:肾脏疾患,其包括但不限于:慢性肾衰竭、急性肾衰竭、异源肾毒性肾炎、肾小球性肾炎、肾小球硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病性肾病、其中糖尿病性肾病伴随肝硬化的糖尿病性肾病,和其中肾小球性肾炎伴随肝硬化的肾小球性肾炎。
在某些另外的实施方案中,肾脏炎症和肾脏病可涉及影响肾的细胞和/或肾功能的免疫介导的疾病。所述病症可包括,但不限于:免疫球蛋白A肾病、膜性增生性肾小球性肾炎、系膜增生性肾小球性肾炎、非增殖性肾小球性肾炎、膜性肾小球肾炎、微小病变型肾病(minimal-changedisease)、原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、纤维样肾小球性肾炎、免疫触须样肾小球性肾炎、增生性肾小球性肾炎、进行性肾小球性肾炎、抗GBM病、肾局部缺血、肾血管炎,包括抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关疾病(例如,韦格纳肉芽肿)、狼疮性肾炎冷球蛋白血症相关肾小球性肾炎、细菌性心膜炎、亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-purpura)、感染后肾小球性肾炎、丙型肝炎、糖尿病性肾病、淀粉样变性病、高血压肾硬化、来自多发性骨髓瘤的轻链病、继发性局灶肾小球性肾炎和高血压肾硬化。
术语“肾脏炎症和肾脏病”还包括急性肾衰竭。急性肾衰竭(“ARF”)指患有少尿症(<500mL/天)或不患有少尿症的情况下,与快速的、稳定增长的氮血相关的临床病症。ARF的原因可归于以下三种诊断分类:肾前性(不适当的肾脏灌注);肾后性(梗阻);和肾脏。ARF的病理生理学是复杂的和多因素的。目前的概念表明ARF可由直接的肾小管损伤、肾脏局部缺血或小管内梗阻所引起。临床上,ARF导致代谢废产物、水和电解质的减少的肾小球过滤和减少的分泌。液体过剩、电解质失衡和尿毒综合征导致了器官功能障碍。器官功能障碍可最终导致死亡。
在不同的另外的方面,本发明延伸到调节TLR2反应性细胞和/或组织(例如,已经历局部缺血、可能经历局部缺血或可能经历再灌注的组织、胰脏的朗格汉斯岛β细胞、或表达TLR2和参与TLR2介导的疾病病症或其发生的任何另外的细胞类型)中的功能(例如,改变TLR2的一种或多种生物活性)的方法。该方法包括将TLR2反应性细胞和/或TLR2反应性组织与足以在细胞或组织中拮抗TLR2反应性细胞或组织的功能、或拮抗TLR2的生物活性的量的本发明所提供的人源化的抗体或其结合片段相接触。在一个实施方案中,接触步骤可在体外实现,例如,在细胞裂解物或在重构的系统中实现。可选地,主题方法可在诸如体外培养或离体培养的细胞中进行。例如,可对细胞诸如纯化的细胞或重组的细胞进行体外培养,且接触步骤可通过将TLR2调节剂添加到培养基中来实现。通常,TLR2反应性细胞是哺乳动物细胞,比如人类细胞。在一些实施方案中,TLR2反应性组织是已经历局部缺血且可能经历再灌注的组织,或与其相关的细胞群体。在另外的实施方案中,方法可对在受治疗者中存在的细胞进行,例如,作为体内实验方案的部分,或在动物受治疗者(包括,例如,人类受治疗者,或体内动物模型)中进行。体内实验方案可以是治疗性的或预防性的,和炎症模型可以是,例如,遗传修饰的模型,比如,具有过表达的TLR2,或具有TLR受体的突变或缺失的动物模型。对于体内方法,人源化的抗体或其片段可单独地来提供,或与另一种剂组合来提供,所述另一种剂比如第二治疗物,比如抗炎药物、或药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。通常将抗体以足以在受治疗者中拮抗一种或多种TLR2介导的活性或功能的量施用给患有TLR2介导的病症或处于患TLR2介导的病症的风险的受治疗者,所述TLR2介导的病症比如类风湿性关节炎、局部缺血再灌注损伤、糖尿病或肾脏炎症。在某些实施方案中,被施用的本发明的人源化的抗TLR2抗体的量或剂量可在施用之前通过体外地或离体地检验改变(例如,降低或抑制)TLR2的一种或多种功能活性需要的抗体的量来确定,所述功能活性通常为本文所描述的一种或多种TLR2生物活性。
理解地是,以上任何治疗方法可利用本发明的免疫轭合物替代本发明的抗TLR2抗体或抗体结合片段来进行,或除本发明的抗TLR2抗体或抗体结合片段之外利用本发明的免疫轭合物来进行。
在某些另外的方面,本发明延伸到本发明的抗体在诊断性应用的用途。这样,本发明的另一方面提供了诊断与Toll样受体2的增高的表达相关的疾患的方法。在某些实施方案中,方法包括将受试细胞与本发明的抗TLR2抗体相接触;通过检测抗TLR2抗体与TLR2的结合确定受试细胞的TLR2的表达水平(定性地或定量地);和将受试细胞的TLR2的表达水平与对照细胞(例如,与受试细胞同样组织来源的正常细胞或以与所述正常细胞相当的水平表达TLR2的细胞)的TLR2的表达水平相比较,其中与对照细胞相比较受试细胞的较高水平的TLR2表达表明与TLR2的增高的表达相关的疾患的存在。在某些实施方案中,受试细胞获自怀疑患有与增高的TLR2的表达相关的疾患的个体。在某些实施方案中,疾患是如以上所描述的炎症疾患或免疫介导的疾患。
治疗效力
本发明人已鉴定本文所提供的人源化的抗-TLR2抗体比本领域中已知的抗TLR2鼠单克隆抗体在治疗上更合乎需要。
除本发明的人源化的抗体的轻链可变域和重链可变域与现有技术的鼠抗TLR2抗体的轻链可变域和重链可变域之间存在的结构差异之外,本发明还已惊讶地鉴定本发明的人源化的抗体所赋予的多种功能优点,其将使所述抗体在临床环境中的使用更优选。
不希望受束缚地,本发明人已鉴定,当与11G7抗TLR2鼠单克隆抗体相比较时,根据本发明的完全人源化的抗体表现出较高的功能应用和临床应用,因为无论TLR2是否与TLR1或TLR6形成异源二聚体,抗体均拮抗TLR2功能。
关于鼠TL2.1抗体,本发明人已鉴定本发明的人源化的抗体可与TLR2的不同哺乳动物形式交叉反应,所述哺乳动物比如人类、鼠、大鼠、猪和猴,而鼠TL2.1抗体仅表现出对于人类TLR2的结合特异性。并且,本发明的人源化的抗体不包括鼠氨基酸残基,且因此,当与鼠来源的TL2.1抗体相比较时,当施用给受治疗者时产生针对它们的中和抗体的可能性是最小的。
关于T2.5抗体,本发明人已惊讶地鉴定T2.5抗体(小鼠Toll样受体2(TLR2)抗体,来源于杂交瘤克隆T2.5,HyCultBiotechnologyb.v.,CellSciences,Canton,USA:目录号1054)介导TLR2激活和信号传递的拮抗,且此以CD32依赖的方式发生。本发明人已鉴定本发明的完全人源化的抗体不需要CD32来介导TLR2信号传递的阻抑,即,例如通过抗体的Fc区与CD32的结合不必发生,以当TLR2受体被抗体的Fab部分结合时介导TLR2受体的拮抗。因此,由本发明的OPN-305完全人源化的单克隆抗体介导的Toll样受体2功能的拮抗以CD32非依赖性的方式来介导。这包括与CD32a和CD32b二者的结合。本发明人已作出的该令人惊奇的观察是有临床意义的,因为本发明的完全人源化的抗体具有可能更高的患者可及性(patientaccess)。
并且,预测本发明的完全人源化的抗体与存在于TLR2氨基酸序列的N末端和C末端二者的残基所限定的表位结合。这与WO2005/028509形成对比,其说明了被T2.5单克隆抗体所结合的表位位于TLR2序列的(仅)N末端。
并且,如本文所提供的比较实施例中所示出的,本发明人已证实本发明的完全人源化的抗体表现出降低的免疫原性特征,即,抗体由于缺少T细胞表位而具有较小的免疫原性。因此,当施用给人类受治疗者时,根据本发明的抗体将非常不可能具有针对其引起的中和抗体反应。该功能特征意为,本发明的完全人源化的抗体比本领域中已知的鼠抗体TL2.1、T2.5和11G7,或可能基于传统CDR移植技术开发的嵌合抗体或人源化的抗体对于临床环境中的应用更合乎需要得多。
抗体
“抗体”是天然的免疫球蛋白、或部分地或完全地合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖具有为本发明的人源化的抗体的结合域、或与本发明的人源化的抗体的结合域同源的结合域的任何多肽、蛋白或肽。
免疫球蛋白通常具有异源四聚体结构,所述异源四聚体结构包括两个相同的重链和两个相同的轻链,其由二硫键连接在一起。每个重链和每个轻链包括赋予对抗原的结合特异性的可变域,且这些域对于重链和轻链分别被称作VH域和VL域。每个链还包括至少一个恒定域,且轻链具有一个单独的恒定域,命名为CL域,而重链域包括三个恒定域,CH1、CH2和CH3。一些抗体同种型还包括称作CH4域的另外的恒定域。在人类中,存在5种不同的抗体种类,即;IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。
抗体的Fc域通常包括每个链的后两个重链恒定区结构域。它们二聚化而形成Fc域,其负责介导抗体的效应功能,比如ADCC和补体结合。抗体的Fc区还在抗体的循环半衰期中具有作用。可对Fc域进行修饰以调节抗体功能。
因为可以多种方法来修饰抗体,术语“抗体”应理解为延伸到与本发明的人源化的抗体具有相同的结合特异性的任何特定的结合成员。因此,术语“抗体”延伸到对Toll样受体2具有结合特异性并用来拮抗TLR2功能的抗体片段和同源物以及包括免疫球蛋白结合域的任何多肽。
并且,已知完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。所述结合片段的例子包括,但不限于:(i)由异源四聚体抗体的VL域、VH域、CL域和CH1域组成的Fab片段,(ii)F(ab')2片段,包括在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段,(iii)Fab’片段,具有铰链区的部分的Fab片段,(iv)由异源四聚体抗体的VH域和CH1域组成的Fd片段,(v)由异源四聚体抗体的VH域和VL域组成的Fv片段,(vi)scFv(单链Fv分子),其中VH域和VL域由肽连接物所连接,(vii)分离的CDR,比如VHCDR3,和(viii)双抗体,这些双抗体是多肽的多聚体,其可以是通过基因融合技术产生的多价片段或多特异性片段。
在某些另外的方面,本发明还延伸到双特异性抗体。这些双特异性抗体可包括通过化学轭合方法来制备,或通过杂交的杂交瘤细胞系来制备的常规双特异性抗体。可选地,双特异性抗体可来源于双特异性抗体片段,比如scFv二聚体或双抗体。在某些实施方案中,可使用scFv二聚体而非完整抗体。所述双抗体可仅利用可变域来构建,且因此提供为不含Fc区,该结构减少了HAMA或抗独特型免疫反应的可能的发生。
抗体结构域中的氨基酸残基通常根据由Kabat等人设计的系统(URL-www.kabatdatabase.com)来编号。除另外指明外,本说明书中使用该编号。
模拟肽
本发明还延伸到基于本发明的抗体或其结合片段的模拟肽。如本文所用的,术语“模拟肽”或“肽模拟物”指非多肽的分子,但其模拟了多肽结构的方面,且其在本发明的上下文中以导致Toll样受体2的功能活性被拮抗的方式与Toll样受体2特异性地结合。因此,本发明延伸到作为Toll样受体2拮抗剂的基于本发明的抗体的模拟肽。
模拟肽拮抗剂可通过常规化学方法来制备(参见,例如,DamewoodJ.R.“PeptideMimeticDesignwiththeAidofComputationalChemistry(利用计算机化学进行肽模拟物设计)”于ReviewsinComputationalBiology,2007,卷9,第1-80页,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,1996;KazmierskiW.K.,“MethodsofMolecularMedicine:PeptidomimeticProtocols(分子医学方法:模拟肽方案),”HumanaPress,NewJersey,1999)。可制备作为Toll样受体2拮抗剂的模拟肽,其中所述模拟肽基于本发明的抗体,且尤其基于重链可变区和轻链可变区。例如,可制备具有与肽相同的官能团的多糖。模拟肽的设计可通过例如建立肽剂在被结合的或将与靶分子结合的环境中的三维结构来进行。模拟肽包括至少两种组分,结合部分(moiety或moieties)和骨架结构或支撑结构。
结合部分是将与靶分子反应的或与靶分子形成复合物(例如,通过疏水相互作用或离子相互作用)的化学原子或化学基团,例如,与配体结合位点处或配体结合位点附近的氨基酸反应或与其形成复合物,所述配体结合位点比如包括SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列的Toll样受体2表位。例如,模拟肽中的结合部分可与肽或蛋白拮抗剂中的结合部分相同。结合部分可以是以与本发明的抗体相同或相似的方式与Toll样受体2反应的原子或化学基团。对于肽中的碱性氨基酸,适用于设计模拟肽的结合部分的例子包括含氮基团,比如胺、铵、胍和酰胺或磷鎓。对于酸性氨基酸,适用于设计模拟肽的结合部分的例子包括,例如,羧基、低级烷基羧酸酯、磺酸、低级烷基磺酸酯或亚磷酸或其酯。
支撑结构是化学实体,当所述化学实体与结合部分(moiety或moieties)结合时提供模拟肽的三维构型。支撑结构可以是有机的或无机的。有机支撑结构的例子包括多糖、有机合成多聚体(比如,聚乙烯醇或聚乳酸)的多聚体或寡聚体。优选地是,支撑结构具有与肽骨架或支撑结构基本上相同的大小和尺寸。这可通过计算或测量肽和模拟肽的原子和键的大小来确定。在一个实施方案中,肽键的氮可用氧或硫来替代,例如,形成聚酯骨架。在另一个实施方案中,羰基可以用磺酰基或亚磺酰基来替代,从而形成聚酰胺(例如,聚磺酰胺)。可生成肽的反酰胺(reverseamide)(例如,将一个或多个-CONH-基团替代为-NHCO-基团)。在又一个实施方案中,肽骨架可用聚硅烷骨架来替代。
这些化合物可通过已知的方法来产生。例如,聚酯模拟肽可通过用羟基来替代氨基酸上相应的α-氨基,从而制备羟基酸并进而使所述羟基酸酯化来制备,任选地封闭碱性侧链和酸性侧链以使副反应最少。在确定化学结构后一般可容易地鉴定出适当的化学合成路径的确定。
可合成模拟肽并将其组装成包括数个至多个离散的分子种类的文库中。所述文库可利用组合化学的熟知的方法来制备,且可对其进行筛选以确定文库是否包括一个或多个具有期望的活性的模拟肽。然后可通过适宜的方法来分离所述模拟肽拮抗剂。
因此,本发明的某些另外的方面延伸到基于本发明的Toll样受体2结合抗体的互补位而设计的模拟肽。尤其是,所述模拟肽基于本文所公开的抗体的CDR区的结构。用于产生所述模拟肽的技术将是本领域中的技术人员所熟知的,且包括Dougall等人的方法(“Designofpharmacologicagentsbasedonantibodystructure(基于抗体结构的药理剂设计)”,TrendsinBiotechnology.1994.12.第372-379页)。以及,Saragovi等人的技术(Saragovi,等人.,“DesignandSynthesisofaMimeticfromanAntibodyComplementarity-DeterminingRegion(从抗体互补决定区设计并合成模拟物)”,Science253:792-795(1991)和Saragovi等人.,“LoopsandSecondaryStructureMimetics:DevelopmentandApplicationsinBasicScienceandRationalDrugDesign(环和二级结构模拟物:开发与在基础科学和合理药物设计的应用)”,Biotechnology10:773-778(1992))。所述模拟肽可以,尤其是基于重链的CDR3。Williams,等人.(Williams等人.,“DesignofBioactivePeptidesBasedonAntibodyHypervariableRegionStructures(基于抗体高变区结构的生物活性肽的设计)”,J.Biol.Chem.266:5182-5160(1991)),描述了来源于抗体的轻链的互补决定区的构象限制的肽的分离与合成。该CDR由于复杂的遗传机制在抗体的结合特异性中是特别重要的,该复杂的遗传机制影响抗体结构,导致抗体具有了具有不同的相互作用类型的中等环或长环。肽环(peptideloop)或回折的构象性质被认为是肽的生物活性中的重要介导物。转角(turn)通过在小分子中稳定折叠的构象而提供了生物活性必需的结合基团的适宜的取向,且可能参与结合位点和识别位点二者。
本发明还延伸到抗体模拟物,比如基于本发明的Toll样受体2抗体的亲和体(Affibody)、结构域抗体(domainantibody)、纳米抗体(Nanobody)、UniBody、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。多种抗体模拟物技术是本领域中的技术人员已知的。例如,所谓的结构域抗体(Domantis,UK)是对应于人类抗体的轻链或重链的可变区的抗体的小功能结合单元。用于产生所述结构域抗体的指导可见于美国专利第6,291,158号、美国专利第6,582,915号和美国专利第6,593,081号。纳米抗体是抗体来源的治疗性蛋白,其含有见于骆驼(camelids)的天然存在的重链抗体的独特的结构和功能性质。Unibody是另一种抗体片段技术,基于IgG4抗体的铰链区的去除。铰链区的去除产生了约传统IgG4抗体的一半大小且具有单价结合区的分子。Unibody保留了IgG4抗体的惰性性质,且因此不会引起免疫反应。因此,与基于IgG4抗体的治疗物(比如本文所描述的本发明的抗体的实施方案)一样,Unibody可用来拮抗细胞的特定功能,但通常不会发生细胞死亡,因为Unibody与IgG4抗体一样将不会针对其所结合的靶介导免疫反应。Unibody以与IgG4相似的速率从身体中清除,并以相似的结合亲和力结合其靶抗原。
另外的结合分子包括:亲和体分子(美国专利5,831,012)、DARPin(命名为锚蛋白重复蛋白)(国际PCT专利申请公布WO02/20565)和anticalin(美国专利第7,250,297号和WO99/16873)。Verabody是另外的抗体模拟技术。Versabody(Amunix,美国专利申请公布第2007/0191272号)是3-5kDa的小蛋白,称作微小蛋白,其具有15%以上的半胱氨酸残基,其形成替代蛋白通常表现出的疏水性核心的高二硫键密度支架。
Avimer是抗体模拟物的另一类型。Avimer来源于人类血清蛋白家族的重组。它们是单独的蛋白链,包括模块结合域,设计每个所述模块结合域与特定的靶位点结合。avimer可同时与单一蛋白靶上的位点和/或多蛋白靶上的位点结合。称作多点结合或多点亲合,该结合机制模拟了体内细胞和分子相互作用的方式,支持了拮抗剂和激动剂的生成,并产生具有多种功能和有效活性的药物。Avimer文库可根据通过引用并入本文的WO2004/044011来产生,且尤其是第99页的实施例6,和例如根据美国专利申请(公布)第US2005/0053973号、第US2005/0089932号、第US2005/0164301号来产生。Avimer文库还可商业上获自AvidiaInc,MountainView,California,USA。
抗体产生
本发明的抗体和结合成员可完全地或部分地通过化学合成来产生。例如,本发明的抗体和结合成员可通过本领域中的技术人员熟知的技术来制备,比如标准液相肽合成,或通过固相肽合成方法来制备。可选地,抗体和结合成员可利用液相肽合成技术在溶液中制备,或另外通过固相、液相和溶液化学的组合来制备。
本发明还延伸到通过在适宜的表达系统中表达编码构成本发明的抗体的至少一种氨基酸序列的核酸,从而可编码所期望的肽或多肽来产生本发明的抗体或结合成员。
例如,可表达编码氨基酸轻链的核酸和编码氨基酸重链的第二核酸以提供本发明的抗体。
因此,在本发明的某些方面,提供了编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。
通常,编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸可以分离的形式或纯化的形式来提供,或以除一种或多种调控序列之外基本上无可能与其天然结合的物质的形式来提供。表达本发明的抗体或结合成员的核酸可以是完全合成的或部分合成的,且可包括但不限于DNA、cDNA和RNA。
编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列可通过技术人员利用本领域中的技术人员熟知的技术容易地制备,所述技术比如描述于以下中的那些:Sambrook等人“MolecularCloning(分子克隆)”,Alaboratorymanual(实验室手册),coldSpringHarborLaboratoryPress,卷1-3,2001(ISBN-0879695773),和Ausubel等人.ShortProtocolsinMolecularBiology(分子生物学简明方案).JohnWileyandSons,第四版,1999(ISBN-0471250929)。所述技术包括(i)使用聚合酶链式反应(PCR)以扩增核酸样品,(ii)化学合成,或(iii)制备cDNA序列。可生成编码本发明的抗体或结合成员的DNA,并以本领域中的技术人员已知的任何适宜的方法来使用,包括,获取编码DNA,鉴定待表达的部分的每侧的适宜的限制酶识别位点,和从DNA中切除所述部分。然后可将被切割的部分与适宜的启动子可操作地连接并在适宜的表达系统中表达,比如商业上可获得的表达系统。可选地,DNA的相关部分可通过利用适宜的PCR引物来扩增。可通过利用定点诱变对DNA序列进行修饰。
编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列可作为构建体以包括至少一种如上所述的核酸的质粒、载体、转录盒或表达盒的形式来提供。构建体可包括在包括一种或多种如上的构建体的重组宿主细胞中。表达可通过在适当的条件下培养含适宜的核酸序列的重组宿主细胞来常规地实现。表达后,可利用任何适宜的技术来分离和/或纯化抗体或抗体片段,然后按需要进行使用。
用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。适宜的宿主细胞包括细菌系统、哺乳动物细胞系统、酵母系统、昆虫系统和杆状病毒系统。用于表达异源多肽的本领域中可获得的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞和NS0小鼠骨髓瘤细胞。常见的优选的细菌宿主是大肠杆菌。抗体和抗体片段在原核细胞诸如大肠杆菌中的表达已在本领域中成功建立。在培养中的真核细胞中的表达作为产生结合成员的选择对于本领域中的那些技术人员也是可获得的。
用于产生抗体的一般技术对于本领域中的技术人员是熟知的,且所述方法在例如以下中被讨论:Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497;美国专利第4,376,110号;Harlow和Lane,Antibodies:aLaboratoryManual(抗体:实验室手册),(1988)ColdSpringHarbor。用于制备重组抗体分子的技术描述于以上的参考文献中,以及例如欧洲专利第0,368,684号中。
在本发明的某些实施方案中,使用了包括编码抗体的重链可变域和/或轻链可变域或结合成员的插入物的重组核酸。根据定义,所述核酸包括编码单链核酸、由所述编码核酸和其互补核酸组成的双链核酸、或者这些互补(单链)核酸自身。
并且,编码抗体的重链可变域和/或轻链可变域的核酸可以是酶促合成的核酸或化学合成的核酸,具有编码天然存在的重链可变域和/或轻链可变域或其突变体的真实序列。
本发明的抗体可通过重组的方式产生,直接地产生,以及作为与异源多肽的融合多肽来产生,所述异源多肽优选地是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选地是宿主细胞识别和加工(即,通过信号肽酶来切割)的异源信号序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞,信号序列由原核信号序列来替代,所述原核信号序列选自,例如,碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的组。
分离的
当用于指本发明的完全人源化的抗体,或从其中来源的结合成员,或编码其的多肽时,术语“分离的”指所述抗体、结合成员或核酸(多核苷酸)以分离的和/或纯化的形式来提供的状态,即它们已与其天然环境分离(separated)、从其天然环境中分离(isolated)或纯化,且以基本上纯的或均质的形式来提供,或,在核酸的情况下,无或基本上无除编码具有所需功能的多肽的序列之外来源的核酸或基因。因此,所述分离的抗体、结合成员和分离的核酸将无或基本上无与其天然结合的物质,比如在其天然环境或制备(当所述制备通过重组DNA技术在体外或体内进行时)其的环境(例如,细胞培养)中发现与其在一起的另外的多肽或核酸。
抗体、结合成员和核酸可与稀释剂或佐剂一起配制,并为了实践目的,认为其是以分离的形式来提供。例如,如果用于包被用于免疫测定的微量滴定板,可将抗体和结合成员与明胶或另外的载体混合,或当用于诊断或治疗时,与药学上可接受的载体或稀释剂混合。抗体或结合成员可以是糖基化的,天然糖基化或通过异源真核细胞的系统(例如,CHO细胞或NSO细胞糖基化的,或它们可以是(例如,如果通过在原核细胞中表达而产生)未糖基化的。
包括抗TLR2人源化的抗体分子的非均质制备物也形成本发明的部分。例如,所述制备物可以是具有全长的重链的抗体和具有缺少C末端赖氨酸的重链的抗体的混合物,具有不同程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸,比如N末端谷氨酸的环化以形成焦谷氨酸残基。
施用
本发明的单克隆抗体或结合成员可以单独地施用,但将优选地作为药物组合物来施用,所述药物组合物一般将包括根据需要的施用途径不同而选择的适宜的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。适宜的药物载体的例子包括:水、甘油、乙醇和类似物。
本发明的单克隆抗体或结合成员可经由任何适宜的途径施用给需要治疗的患者。通常,组合物可通过注射或输注进行胃肠外施用。用于胃肠外施用的优选的途径的例子包括,但不限于:静脉内施用、心脏内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肌内施用、腔内施用、皮下施用、透粘膜施用、吸入施用或透皮施用。施用的路径还可包括局部施用和肠内施用,例如,粘膜(包括肺粘膜)施用、口服施用、鼻施用、直肠施用。
在其中组合物作为可注射组合物来递送的实施方案中,例如在静脉内应用、皮内应用或皮下应用中,活性成分可以是胃肠外可接受的水溶液的形式,其为无热原的并具有适宜的pH、等渗性和稳定性。本领域中的那些相关技术人员能够制备适宜的溶液,使用例如,等渗运载体诸如氯化钠注射液(injection)、林格氏(Ringer’s)注射液或乳酸林格氏注射液。按需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
组合物还可经由置于包括血液的某些组织中的微球体、脂质体、其它微粒递送系统或持续释放的制剂来施用。
上述的技术和方案和根据本发明可使用的其他技术和方案的例子可见于Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学),第18版,Gennaro,A.R.,LippincottWilliams&Wilkins;第20版ISBN0-912734-04-3和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(药物剂型和药物递送系统);Ansel,H.C.等人.第7版ISBN0-683305-72-7,其全部内容在此通过引用并入。
本发明的组合物通常以“治疗有效量”来施用给受治疗者,所述“治疗有效量”是足以对施用所述组合物的受治疗者显示益处的量。所施用的实际剂量和施用的速率和时程将取决于以下并可适当参考以下来确定:正在治疗的病症的性质和严重度,以及诸如正在治疗的受治疗者的年龄、性别和体重的因素以及施用路径。应另外适当地考虑组合物的性质,例如,其结合活性和体内血浆寿命,制剂中抗体或结合成员的浓度,以及递送路径、递送位点和递送速率。
剂量方案可包括组合物的单次施用,或组合物的多次施用剂量。组合物还可与用于治疗正在施用本发明的抗体或结合成员来治疗的病症的其他治疗物和药物顺序施用或分别施用。
可被施用给受治疗者的剂量方案的例子可选自包括但不限于以下的组:1μg/kg/天至20mg/kg/天、1μg/kg/天至10mg/kg/天、10μg/kg/天至1mg/kg/天。在某些实施方案中,剂量将是获得从1μg/m1到100μg/ml的抗体的血浆浓度的剂量。然而,所施用的组合物的实际剂量、和施用的速率和时程将取决于正在治疗的病症的性质和严重度。治疗的处方,例如,剂量的决定等,最终将在全科医师和其他内科医生的职责和判断中,且通常考虑待治疗的疾患,个体患者的状态,递送的位点,施用的方法和医师已知的其它因素。
定义
除非另外定义,本文所用的所有技术术语和科学术语具有本发明的领域中的技术人员所通常理解的含义。
贯穿说明书,除非上下文另外规定,术语“包括(comprise)”或“包括(include)”,或变化形式诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”“包括(includes)”或“包括(including)”将被理解为意指包括指定的整数或整数组,但不排除任何其他整数或整数组。
如本文所用的,除非上下文另外清楚规定,术语诸如“一(a)”、“一(an)”和“该”包括单数指代和复数指代。因此,例如,提及“活性剂”或“药理学活性剂”包括单一活性剂以及组合的两种或多种不同的活性剂,而提及“载体”包括两种或多种载体的混合物以及单一的载体,和类似物。
术语“特异性结合”、“选择性结合”或“结合特异性”指本发明的完全人源化的抗体或结合化合物以高于当与非靶表位结合时产生的亲和力的亲和力与Toll样受体上的靶表位结合。在某些实施方案中,特异性结合指以高于对于非靶表位的亲和力的至少10倍、50倍、100倍、250倍、500倍、或1000倍的亲和力与靶结合。在某些实施方案中,该亲和力通过亲和力ELISA测定来确定。在某些实施方案中,亲和力通过BIAcore测定来确定。在某些实施方案中,亲和力可通过动力学方法来确定。在某些实施方案中,亲和可通过平衡/溶液方法来确定。
如本文所用的,术语“有效量”或“治疗有效量”意为本发明的剂、结合化合物、小分子、融合蛋白或模拟肽在肾中阻抑TLR2介导的炎症所需的量,或降低TLR2介导的肾脏病或其至少一种症状或与其相关的病症的严重度和/或减轻TLR2介导的肾脏病或其至少一种症状或与其相关的病症的量。
如本文所用的,术语“预防有效量”指在施用本发明的化合物后,在受治疗者中防止TLR2介导的疾病,或炎性病症或其至少一种症状的初始发作、进展或复发所需的组合物的量。
如本文所用的,术语“治疗”和相关术语诸如“治疗(treat)”和“治疗(treating)”意为TLR2介导的病症或其至少一种症状的进展、严重度和/或持续时间的减少,其中所述减少或减轻由对于TLR2结合表位具有特异性的本发明的结合化合物的施用引起。因此术语“治疗”指可使受治疗者受益的任何方案。治疗可以是关于现有症状的或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可包括治愈性作用、减轻性作用或预防性作用。本文中提及“治疗性”治疗和“预防性”治疗认为是以其最广泛的含义。术语“治疗性”不必意指治疗受治疗者直至完全恢复。相似地,“预防性”不必意为受治疗者将不会最终感染疾病病症。
如本文所用的,术语“受治疗者”指动物,优选地是哺乳动物且尤其是人类。在特定的实施方案中,受治疗者是哺乳动物,尤其是人类。术语“受治疗者”与术语“患者”在本文中可互换地使用。
现将参照以下的实施例描述本发明,所述实施例的提供用于示例的目的而非意在被解释为限制本发明。
实施例
实施例1——完全人源化的单克隆抗体的产生
本发明的TLR2拮抗性抗体通常是完全人源化的抗体。即,抗体是完全人类来源的,且因此不含有来源于非人类物种诸如小鼠的区域或氨基酸组合。
产生本发明的完全人源化的抗体的一种方法是通过使用如国际PCT专利申请号WO2006/082406中所描述的复合人类抗体技术(Antitope,UK)。所述抗体是包括来源于人类抗体的氨基酸序列的2个或更多个区段的复合蛋白。可选择区段从而避免最终抗体中存在T细胞表位,例如通过筛选残基,尤其是轻链可变区和重链可变区的残基以确保它们不包括MHCII类结合基序,或它们不包括锚定肽与MHCII类的结合的残基。并且,计算机模拟方法分析本发明的完全人源化的抗体的可变区以确保不存在T细胞表位。
在利用复合人类抗体技术产生完全人源化的抗体中,产生的最终抗体包括许多序列区段的组合物,所述许多序列区段全部是人类来源的,且全部来源于不同的人类抗体。简言之,技术包括以下的步骤:分析起始单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区以鉴定互补决定区(CDR),所述起始单克隆抗体例如对Toll样受体2具有结合特异性的鼠抗体或嵌合抗体。然后利用SwissPDB利用现有抗体结构作为模板生成抗体可变区的蛋白模型。然后分析这些结构模型以鉴定原始抗体的可变域区域中可能为抗体的结合性质所必需的重要的“限制”氨基酸。CDR区中所含的残基(如利用Kabat定义和Chothia定义二者所定义的)连同大量的构架残基通常是重要的。使用来自蛋白模型的结构信息鉴定对于抗体构象和结合关键性的残基并与来自现有抗体结构和序列数据库的结构上等同的残基进行比较。然后这些氨基酸可以作为用于包括在最终人源化的序列的一种或多种变体的候选物。在制备本发明的抗体中,发现本发明的完全人源化的抗体所基于的鼠抗TLR2抗体(小鼠Toll样受体2(TLR2)抗体,来源于杂交瘤克隆T2.5,HyCultBiotechnologyb.v.,CellSciences,Canton,USA:目录号1054)的VH序列和VK序列二者含有典型的构架残基,尤其在VH中,其中抗体在关键位置例如Kabat第45-49位残基(LEWIG)处和第92-94位残基(CAR)处具有非常常见的序列构象。
然后将源单克隆重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的序列与人类可变区序列的相应的区段相比较以鉴定可能包括在最终人源化的序列中的可能的重链人类序列和轻链人类序列。最后,然后从人类可变区序列的区段完整地设计完全人源化的重链和轻链。
设计完全人源化的抗体并通过如下产生所述完全人源化的抗体:首先利用一系列重叠的寡核苷酸经退火、连接和PCR扩增得到全长的合成的V区而合成VH区基因和VK区基因。然后将多核苷酸序列直接克隆到适宜的表达载体中,所述适宜的表达载体的例子将是本领域中的技术人员熟知的,比如编码抗体诸如IgG的表达载体系统。在用于产生本发明的OPN-305抗体的表达载体的情况中,表达载体系统涉及包括修饰的铰链区(S241P置换)以及重链和κ轻链的IgG4来源的序列。然后经由电穿孔将重链和轻链稳定转染到NS0细胞中,并利用200nM的氨甲喋呤(Sigma,目录号M8407)进行筛选。检验氨甲喋呤抗性菌落的IgG表达水平。
虽然使用了NS0细胞,但可以使用本领域中的技术人员已知的任何适宜的细胞系。尤其在哺乳动物细胞培养中使用哺乳动物细胞作为产生本发明的抗体和结合片段的平台是优选的。由于应用于蛋白的N-糖基化特征,使用哺乳动物细胞是特别优选的,因为所述糖基化特征相似于发现于人类蛋白中的那些糖基化特征。通常用于哺乳动物细胞培养的细胞系包括CHO、NS0杂交瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和PER.C6TM人类细胞。用于生产规模体积的哺乳动物细胞培养的最常用的哺乳动物细胞系是CHO细胞系和NS0细胞系。这些细胞类型相对易于进行基因工程,已被广泛地表征,相对易于进行大规模的生长,并可在溶液中分泌高滴度的重组蛋白。CHO细胞系和NS0细胞系均可产生高蛋白表达水平。
除基于哺乳动物细胞的蛋白表达平台之外,还可使用基于植物的表达系统,或转基因动物系统以用于产生本发明的蛋白。
然后在蛋白A琼脂糖凝胶柱(ProteinAsepharosecolumn)(GEHealthcare目录号110034-93)上从细胞培养上清液中纯化复合抗体,并利用Ec(0.1%)=1.43的所计算的消光系数,通过OD280nm进行定量。然后在竞争ELISA测定中检验纯化的抗体以确定与Toll样受体2的结合。可将该结合与参考抗体的结合相比较,所述参考抗体比如基于其设计完全人类抗体的Toll样受体2结合抗体的生物素化的形式。特别地,可将来自ELISA竞争测定的吸光度针对样品浓度绘制曲线,并通过关于完全人类抗体和原始的生物素化的抗体的每个数据组拟合直线。使用直线的方程式来计算50%抑制生物素化的参考抗体与TLR2的结合所需的浓度(即所谓的,IC50值)。可使用IC50值来计算结合效率的倍数差异。所确定的结合效率可以是对产生的完全人源化的抗体的特异性的重要确定。还可进行另外的比较,例如,将完全人源化的抗体与对于相同的抗原具有结合特异性的嵌合抗体或鼠抗体相比较。
实施例2——OPN-305单克隆抗体的结合性质的确定
本发明人已令人惊奇地鉴定T2.5TLR2拮抗性鼠单克隆抗体需要结合CD32以完全拮抗Toll样受体2功能。因此进行实验以确定与使用T2.5抗体相关的该功能限制并不与使用OPN-305单克隆抗体以介导其中和Toll样受体2生物活性的作用相关。
材料和方法:
THP-1细胞是人类外周血单核细胞。响应于Toll样受体配体,转录因子NF-κB和另外的转录因子在THP1细胞中被激活。THP-1Blue细胞系已利用在通过诸如NF-κB和AP-1的一些转录因子可诱导的启动子的控制下、编码分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)基因的报道质粒来稳定转染。THP-1CD14Blue细胞系变体过表达细胞表面蛋白CD14以用于增强的灵敏性。所得的THP-1-CD14Blue细胞对于可选择的标志物博来霉素(Zeocin)和杀稻瘟素具有抗性。TLR刺激后,THP-1Blue细胞激活转录因子且随后分泌利用QUANTI-Blue报道系统可检测的SEAP。QUANTI-Blue是开发以确定在细胞培养物的上清液中分泌的碱性磷酸酶(SEAP)活性的比色酶法测定。在SEAP的存在下,QUANTI-Blue介质改变为可易于用裸眼来检测的紫蓝色,或通过读取625-655nm处的光密度(OD)来定量。
利用与5μg/ml-0.18μg/ml的范围中的抗CD32a抗体(RnD#AF1875)或抗CD32b抗体(RnD#AF1330)或山羊IgG预混合的OPN-305抗TLR2单克隆抗体(1μg/ml)在37℃下孵育THP1CD14Blue细胞5分钟,然后用20ng/ml的TLR1/TLR2激动剂Pam3CSK4进行刺激。OPN-305单克隆抗体是完全人源化的抗体,具有如本文SEQIDNO:2所定义的轻链和如本文SEQIDNO:5中所定义的重链。
然后在37℃下过夜孵育细胞。然后移去上清液并进行热灭活,之后添加QUANTI-Blue(Invivogen,SanDiego,USA)。利用光度计测量650nm处的代表NF-κB激活的比色改变。
结果显示于图9中,这些结果显示了OPN-305作为Toll样受体2拮抗剂的功能活性没有受到抗CD32a/b抗体的添加的阻遏。因此这表明由OPN-305介导的Toll样受体2中和活性不依赖于与CD32a或CD32b的结合。
实施例3——CD32在Toll样受体2拮抗中的作用
实施例2的结果表明本发明的OPN-305完全人源化的抗体对Toll样受体2的拮抗不依赖于抗体与CD32(CD32a或CD32b)的结合。
为确定如此,并且为提供与本领域中已知的其他TLR2拮抗性抗体诸如T2.5鼠TLR2单克隆抗体(OPN-301)的比较,进行了另外的实验。
材料和方法:
将THP-1CD14Blue细胞(Invivogen,SanDiego,USA)与阻遏CD32a或CD32b的抗体剂量一起预孵育。
将预孵育的THP-1CD14Blue细胞与渐增剂量的以下抗体一起孵育:(i)抗人类FcγRIIa(CD32a)抗体(R&DSystems,目录号AF1875,如先前的实施例中所用的),(ii)抗人类FcγRII(CD32)抗体(R&DSystems,目录号AF1330)或(iii)同种型对照抗体(山羊IgG(R&Dsystems,目录号AB-108-C)。然后向细胞添加200ng/ml的鼠抗TLR2抗体T2.5(OPN-301)或完全人源化的OPN-305抗体。然后用100ng/ml的TLR2激动剂Pam3CSK4(Invivogen)刺激细胞过夜。
结果
测量细胞上清液中NF-κB依赖的SEAP产生。图10A显示了暴露于OPN-301(T2.5鼠抗TLR2抗体)的细胞的结果。图10B显示了暴露于OPN-305完全人源化的TLR2拮抗剂抗体的细胞的结果。在图10A中,柱A关于仅用Pam3CSK4刺激的细胞。柱B关于暴露于OPN-301抗体的细胞。柱C关于OPN-301抗体连同0.4μg/ml抗CD32a/b或对照山羊IgG抗体。柱D关于OPN301抗体连同2μg/ml抗CD32a/b抗体或对照山羊IgG抗体。柱E关于OPN301抗体,加上10μg/ml抗CD32a/b抗体或对照山羊IgG抗体。
在图10B中,柱A关于仅用Pam3CSK4刺激的细胞。柱B关于暴露于OPN-305抗体的细胞。柱C关于OPN305抗体连同0.4μg/ml抗CD32a/b抗体或对照山羊IgG抗体。柱D关于OPN305抗体连同2μg/ml抗CD32a/b抗体或对照山羊IgG抗体。柱E关于OPN305抗体,加上10μg/ml抗CD32a/b抗体或对照山羊IgG抗体。
2个图中所示的数据的比较清楚地显示了由OPN-305介导的TLR2拮抗不依赖于抗体与CD32的相互作用,即用CD32a或CD32b特异性抗体阻遏CD32对OPN305的TLR2中和能力无影响。相比之下,显示鼠T2.5抗体(OPN-301)依赖于与CD32的结合以介导对Toll样受体2功能活性的完全中和。不希望受理论束缚地,本发明人因此预测,在介导TLR2拮抗中,OPN-301抗体结合TLR2和CD32,与CD32的该相互作用对于介导Toll样受体2的拮抗是必需的。因此OPN-305抗体与OPN-301抗体关于拮抗Toll样受体2功能活性所用的作用机制之间存在功能差异。因此,OPN-301的TLR2拮抗性活性可通过阻遏与CD32的结合来阻遏。然而,阻遏OPN-305与CD32、CD32a或CD32b结合的能力不影响其拮抗Toll样受体2功能活性的能力。
实施例4——OPN-305的Toll样受体2结合特异性的证实
设计本实验以证实本发明的OPN-305单克隆抗体对Toll样受体2且尤其是人类Toll样受体2表现出结合特异性。
材料和方法:
用单独的1.0μg/ml的生物素化形式的鼠抗TLR2抗体OPN-301(T2.5)或在1.0μg或10μg/ml的完全人源化的抗TLR2抗体OPN-305或OPN-305IgG4对照抗体存在下对用Toll样受体1和Toll样受体2稳定转染以允许TLR1/TLR2异源二聚体形成的HEK293(人类胚肾细胞293)细胞进行孵育,在冰上持续30分钟。
OPN-301单克隆抗体是鼠IgG1抗TLR2抗体(小鼠Toll样受体2(TLR2)抗体,克隆T2.5,HyCultBiotechnologyb.v.,CellSciences,Canton,USA:目录号1054)。
OPN-305单克隆抗体是完全人类的抗体,具有如本文SEQIDNO:2中所定义的轻链和如本文SEQIDNO:5中所定义的重链。
且然后洗涤细胞,并用轭合于PECy7的链霉亲和素再孵育30分钟。利用FACScalibur(BectonDickinson)测量结合。结果显示于图11中。
图11A关于OPN-305(标记为变体21)的结合。从左向右移动,第一峰的最深的线关于红色线。第一峰的最浅的线关于绿色线。向右移动,第三峰、第四峰和第五峰分别是紫色峰、蓝色峰和黑色峰。OPN-305的结合通过与单独的OPN-301(黑色图)相比较向蓝色图和紫色图(代表OPN-301和OPN-305)的左侧的迁移来证明,其证明OPN-305与OPN-301竞争结合HEK细胞上的人类TLR2。总之,图11A显示了峰的剂量依赖的迁移,这表明OPN-301和OPN-305对于人类Toll样受体2的结合的竞争。
图11B显示了与IgG4同种型对照结合的结果。因为IgG4同种型对照抗体对于TLR2不具有结合特异性,其不竞争结合。因此黑色峰、紫色峰或蓝色峰没有迁移,它们聚集在一起并表示为第二峰,如图11B的右侧所示。左侧的峰关于红色峰(较深的线)和绿色峰(较浅的线)。因此这些结果证实OPN-305对于人类Toll样受体2具有结合特异性。
实施例5——OPN-305对于鼠Toll样受体2的交叉反应性
在实施例4中已确定了OPN-305对人类Toll样受体2表现出结合特异性后,本实验评估了OPN-305单克隆抗体是否表现出Toll样受体2种间交叉反应性,其将允许OPN-305与其他形式的哺乳动物Toll样受体2相结合,诸如鼠Toll样受体2。
材料和方法:
在5μg/ml的OPN-305(称为OPN-305-21)、OPN-301(T2.5)或相关的同种型对照抗体(对于OPN-301的鼠IgG1和对于OPN-305的人IgG4)存在下以1×106/ml培养J774小鼠巨噬细胞,在37℃下持续6小时。将细胞暴露于TLR2激动剂HKLM(Invivogen,SanDiego,USA,目录号tlr-kit2)。HKLM是兼性胞内革兰氏阳性细菌——单核细胞增生利斯特氏菌(ListeriaMonocytogenes(LM))的冻干的热灭活的制备物。然后移去上清液并通过来自RnD系统(R&D系统)的特定的ELISAduoset来测量鼠TNF-α水平。
结果
结果显示于图12的图中。这显示了OPN-305以与OPN-301的抑制大体上相似的方式阻抑鼠TLR2反应。因此,OPN-305是交叉反应性的,因为其与表达于鼠细胞的表面上的Toll样受体2结合。
总之,已显示OPN-305阻抑用TLR2激动剂刺激的鼠J774巨噬细胞的TNF-α分泌。
实施例6——OPN-305对猴Toll样受体2的交叉反应性
进行另外的实验以确定OPN305对表达于猴细胞上的Toll样受体2的结合特异性。这将鉴定OPN-305抗体是否可与除人类形式和鼠类形式外的更多种哺乳动物形式的Toll样受体2交叉反应。
OPN-305与猴Toll样受体2的结合通过直接抗体结合测定和竞争结合测定两者来确定。
(i)直接结合
用1.0μg/ml的OPN-305或IgG4同种型对照抗体在室温下孵育来自食蟹猴的全血细胞30分钟,然后用PharmLyse(BDBiosciences)进行孵育以裂解红细胞,然后用FITC标记的抗人IgG4进行检测。
结果显示于图13A、B和C中。根据其前向散射特征和侧向散射特征对不同的细胞类型进行门控。图13A关于粒细胞。图13B关于单核细胞。图13C关于淋巴细胞。通过与用同种型对照抗体孵育的细胞(绿图——其为第二峰,从左向右移动,该峰为较浅的颜色)相比较用OPN-305孵育的细胞(蓝图——其为位于峰组的右侧的峰)的向右侧的图位移来证明结合。图13A和13B中的结果显示蓝峰已比绿峰向右移动地更远。这显示了OPN-305结合表达于粒细胞和单核细胞上的猴TLR2。因此OPN-305表现出对于表达于不同的细胞类型上的Toll样受体2的宽泛的交叉反应性。
(ii)竞争测定
用单独的1.0μg/ml的生物素化的OPN-301或在1.0μg/ml或10μg/ml的OPN-305或IgG4同种型对照抗体(对于OPN305)存在下用1.0μg/ml的生物素化的OPN-301在室温下孵育来自食蟹猴的全血细胞30分钟。且然后洗涤细胞并用轭合于PECy7的链霉亲和素再孵育30分钟。
OPN-301单克隆抗体是鼠IgG1抗-TLR2抗体(小鼠Toll样受体2(TLR2)抗体,克隆T2.5,HyCultBiotechnologyb.v.,CellSciences,Canton,USA:目录号1054)。
OPN-305单克隆抗体是完全的人类抗体,具有如本文SEQIDNO:2所定义的轻链和如本文SEQIDNO:5中所定义的重链。
利用来自BectonDickinson的FACScalibur测量结合。结果显示于图14A和B中。图14A关于粒细胞。图14B关于单核细胞。OPN-305的结合通过与单独的OPN-301(黑图)相比较绿图(代表OPN-301+OPN-305)向左侧的位移来证明,其证明OPN-305与OPN-301竞争结合猴TLR2。因此,可再次发现OPN305竞争与猴Toll样受体的结合。这进一步证实OPN-305可与表达于人类细胞、小鼠细胞或猴细胞上的Toll样受体2交叉反应。
实施例7——OPN-305单克隆抗体的免疫原性
进行OPN-305抗体的分析以确定可能导致由被施用抗体的受治疗者针对抗体来产生的诸如HAMA反应的免疫反应的免疫原性表位的存在。如前文所讨论的,T细胞表位的存在是高度不合需要的,因为针对抗体产生的中和抗体反应将导致该抗体不再适宜于施用给该患者以用于治疗目的。因此筛选OPN-305抗体以确定不明显存在T细胞表位。
材料和方法:
供体PBMC的制备和选择
从获自全国输血服务中心(NationalBloodTransfusionService)(Addenbrooke'sHospital,Cambridge,UK)的健康团体供体暗黄覆盖层(自抽血24小时之内)分离外周血单核细胞(PBMC)。通过LYMPHOPREPTM(Axis-Shield,Dundee,UK)密度离心从暗黄覆盖层分离PBMC,并利用CD8+ROSETTESEPTM(StemCellTechnologiesInc.,London,UK)清除CD8+T细胞。利用Biotest基于SSP-PCR的组织分型试剂盒(BiotesetSSP-PCRbasedtissue-typingkit)(Biotest,Landsteinerstraβe,Denmark)通过鉴定HLA-DR单元型以及测定对于对照抗原匙孔血蓝蛋白(KLH)(Pierce,Rockford,USA)的T细胞反应来表征供体。然后冷冻PBMC并贮存在液氮中直至需要。
选择21个供体的群组来最适当地代表在世界人群中表达的HLA-DR同种异型的数量和频率。针对在世界人群中表达的那些同种异型对在群组中表达的同种异型的分析显示达到了>80%的覆盖,且很好地代表了全部的主要HLA-DR等位基因(以>5%的频率在世界人群中表达的个体同种异型)。
EpiScreen时程T细胞增殖测定
如国际专利申请号WO2007/099341所教导的,对抗体进行分析以确定T细胞表位的存在。融化来自每个供体的PBMC,计数并评估生存率。将细胞在室温AIMV培养基(Invitrogen,Paisley,UK)中复苏,并重悬于AIMV中达4.6×106PBMC/ml。对于每种供体,建立大量培养,其中将总共1ml的增殖细胞贮存物添加到24孔板中。将总共1ml的每种稀释的受试样品添加到PBMC中以得到每样品50μg/ml的终浓度。对于每种供体,还包括了阳性对照(用100μg/mlKLH孵育的细胞)和阴性对照(仅用培养基孵育的细胞)。对于前4种供体,包括另外的对照以检验受试样品对T细胞反应的调节,其中受试样品和KLH均添加到PBMC中。可使用这些样品与单独的KLH的比较来评估受试样品对增殖的作用。在37℃下和5%CO2下总共孵育培养物8天。在第5天、第6天、第7天和第8天时,轻轻重悬每孔中的细胞,并将3×100μl的小份转移到圆底的96孔板的单独的孔中。在100μlAIMV培养基中用1μCi[3H]-胸苷(PerkinElmerTM,Waltham,Massachusetts,USA)脉冲标记培养物,并再孵育18小时,然后利用TomTecMachIII细胞收获器收获到过滤垫(PerkinElmerTM,Waltham,Massachusetts,USA)上。通过在paralux低背景计数模式的微量滴定板β计数器(MicroplateBetaCounter)上进行MELTILEXTM(PerkinElmerTM,Waltham,Massachusetts,USA)闪烁计数来确定每孔的每分钟计数(cpm)。为评估受试样品的潜在的毒性,在孵育7天之后,对于前10个供体在受试培养物的样品和培养基和KLH对照上进行细胞存活计数(利用VICELLTM计数器和台盼蓝染色排除法)。
EpiScreen数据分析
对于增殖测定,先前已建立了等于或大于2的刺激指数(SI)(SI≥2)的经验阈值,从而在该阈值以上诱导增殖反应的样品认为是阳性的(当包括界线时,界线SI≥1.95是突出显示的)。大量的测定开发和先前的研究已显示这是允许最大灵敏度而不检测大量假阳性反应的最小信噪比阈值。对于增殖数据组(n=3),通过统计学阈值和经验阈值来定义阳性反应:
利用非配对两样品学生t检验通过比较受试孔和培养基对照孔的cpm的反应的显著性(p<0.05)。
刺激指数大于2(SI≥2),其中SI=受试孔的平均值(cpm)/培养基对照孔的平均值(cpm)。
此外,通过计算来自重复两次培养的原始数据的变异系数和标准偏差(SD)来评估测定内部的变异。
结果
通过蛋白A亲和色谱、随后尺寸排阻色谱将抗TLR2抗体OPN-305(VK5/VH4)纯化至均质。
命名为VK5/VH4的变体是本文所公开的OPN-305完全人源化的单克隆抗体。OPN-305单克隆抗体是完全人源化的抗体,其具有如本文SEQIDNO:2所定义的轻链氨基酸序列和如本文SEQIDNO:5中所定义的重链氨基酸序列。
所有的制备物全部来源于代表单体的、非聚集的抗体的单峰(图15A和B)且发现含有<5EU/mg的内毒素。
利用EpiScreenTM(Antitope,UK)时程T细胞测定针对21个健康供体的群组检验三个受试样品以确定相关的免疫原性风险。在50μg/ml的终浓度下检验样品,因为该量提供了足以刺激可检测的蛋白特异性T细胞反应的饱和浓度。
分析了T细胞调节的结果和细胞毒性研究的结果。7天之后培养物中的细胞生存率范围从65%至95%,且在所有受试样品、培养基对照和KLH对照之间是相似的。因此不认为受试样品对测定中所用的细胞具有毒性作用。此外,图16显示了单独的KLH诱导的SI或在受试样品存在下的KLH诱导的SI之间无显著差别(学生t检验p<0.05)。这表明受试样品不直接调节响应于KLH(对照抗原)的CD4+T细胞激活。图16显示对受试样品的细胞毒性和T细胞调节活性的预筛查的结果。样品1是嵌合的抗TLR2(来源于T2.5鼠抗体的F’ab片段轭合于人IgG4的Fc区),样品2是抗TLR2抗体OPN-305(VK5/VH4,OPN305),样品3是变体抗TLR2抗体,命名为VK5/VH5。
分析了来自用OPN-305(VK5/VH4,OPN-305)抗体和VK5/VH5对比抗Toll样受体2抗体以及抗TLR2嵌合抗体进行的EpiScreenTM时程增殖测定的结果(图17A、B和C)。嵌合的抗TLR2抗体在21个供体中的4个(研究群组的18%)中刺激了反应,其中SI≥2并且在学生t-检验中达到了显著性(p<0.05)。在整个检验期间供体20产生了具有高SI的特别剧烈的反应,且在第6天用供体3也观察到了强反应(SI=6.99)。相比之下研究群组中无供体对于OPN-305呈阳性反应。因此OPN-305(VK5/VH4)抗体在对于嵌合抗体呈阳性反应的供体中不产生任何显著的T细胞反应。
结论
在EpiScreenTM时程T细胞测定中针对嵌合抗体观察到的阳性CD4+T细胞增殖反应在15%-40%的预期范围中。重要地是,针对对照抗原KLH观察到了频繁且有效的T细胞反应,这表示测定如预期地进行。结果还显示完全人源化的抗体OPN-305(VK5/VH4)不能在任何供体中诱导任何阳性免疫反应,且因此认为该抗体在临床中具有免疫原性的低风险。
图18显示了利用EpiScreenTM测定观察的免疫原性的水平和已在临床中针对大型套组的治疗性蛋白(Baker和Jones,2007)实际观察的免疫原性(抗蛋白质治疗性抗体反应)的水平之间的明显关联。在临床数据和EpiScreenTM测定二者中对于诸如英夫利昔单抗(Infliximab)和Campath的蛋白观察到了高水平的免疫原性,而对于诸如Xolair、赫赛汀(Herceptin)和阿瓦斯汀(Avastin)的蛋白观察到了相对低水平的免疫原性。重要地是,OPN-305抗体在<10%的研究群组中诱导了反应,基于先前的经验,这与具有免疫原性的低风险的生物治疗物相关。
实施例8——OPN-305单克隆抗体的结合亲和力的确定和比较
免疫学生物传感器,例如BIACORETM表面等离子体共振(SPR)仪器,其实时地测量抗原-抗体复合物的结合和解离,允许结合动力学的解释。化合物的解离的速率和其随后的优化对于生物药物抗体开发是尤其重要的。BIACORE利用了表面等离子体共振(SPR)实时地监测表面结合的分子“配体”和其在溶液中的结合伴侣“分析物”之间的相互作用。SPR是电子电荷密度波现象,其在完全内部反射条件下当光在金属层上反射时在该层的表面产生。生成的表面等离子体对于来自反射光的金属层的对侧上的介质的折射系数的任何改变是灵敏的。发生于表面的蛋白-蛋白相互作用影响介质的折射系数,且因此可被检测。分子与配体修饰的传感器表面的结合产生反应,其与结合的量是成比例的,这允许检测结合的分析物的量的小的改变(下降至低的皮克水平)。可使用该技术来测量范围从10-5M到10-12M的亲和常数(KD)、103M-1s-1和107M-1s-1之间的结合速率常数(ka)和10-1s-1和10-6s-1之间的解离速率常数(1-3)。
本研究的目的是使用BIACORET100表面等离子体(Biacore,Inc.)共振仪器以用于两个相关的受体和三个mAb之间相互作用的高分辨率动力学表征。研究的两个受体是重组rhTLR-2(重组人类TLR-2)和rmTLR2/Fc(重组鼠TLR-2)。
材料和方法:
仪器准备
在运行任何样品之前进行系统自检(BiacorePreventativeMaintenanceKit2)。所有系统检验(试剂泵(Reagentpump)、折射计(Refractometer)、注射(Injections)、噪声(Noise)、混合(Mixing)和缓冲液选择器(BufferSelector))的通过表明仪器按生产商设定的标准运行。系统自检后运行Desorb/Sanitize(BiacorePreventativeMaintenanceKit2)程序以清洁仪器。
测定开发
系统准备
插入CM5芯片后系统启动,且然后用BIA标准溶液(BIAnormalisingsolution)(BiacorePreventativeMaintenanceKit2)进行标准化。除非说明,在25℃下利用在25℃孵育的样品架来运行所有样品。将芯片添加到系统中,利用HBS-EP作为运行缓冲液。用两个30秒的50mMNaOH注射来启动芯片表面,然后放置直至在所有流动池(Flowcells)(Fc)中获得稳定的基线。
样品制备
分析了两种抗体,如本文所描述的OPN-305抗Toll样受体2抗体,和T2.5鼠抗Toll样受体2抗体(来源于杂交瘤克隆T2.5,HyCultBiotechnologyb.v.,CellSciences,Canton,USA:目录号1054)。将两种单克隆抗体如所供应的贮存并稀释至1μg.ml-1以用于所有的固定运行。利用HBS-EP从干粉重构受体rhTLR-2和受体rmTLR2/Fc至1000nM的终浓度,并贮存于4℃。未将载体蛋白添加到该溶液中。
固定化条件和活性
基于该设置显示为最优的先前研究结果选择了直接测定用于本研究。对于动力学实验,需要限制固定的配体的量以避免芯片的表面上的质量传递作用。
利用对于糖基化的人类受体分析物(rhTLR-2)的平均分子量77.5kDa,对于配体(mAb)的150kDa和化学计量数(Sm)2,固定的配体的理想靶量将为145RU。该固定的水平也适宜于鼠受体,虽然其具有98kDa的分子量。
利用标准胺偶联化学固定所有抗体。在10mM醋酸缓冲液pH5.5中以约1μg.ml-1的蛋白浓度进行固定,至三个CM5系列S探测芯片(CM5SeriesSsensorchip)上150RU的靶反应水平。在40μl.分钟-1的流速以最小化任何可能的质量传递作用下获得动力学数据。在动力学运行的起始重复空白(无受体)和单一浓度的分析物(100nM)以检验动力学分析中的表面和两个受体二者的稳定性。重复进行两次动力学分析并比较结果。
为在动力学循环的解离期过程中观察足够的信号降低(3-10%),持续2000秒测量解离。
结果
结果显示于表1中。利用二价结合模型(BIAcore评估软件3.2版(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2))计算结合速率(K结合)和解离速率(K解离)。按比率k解离/k结合计算平衡解离常数(Ko)。
表1
结果表明OPN-305以比T2.5单克隆抗体更高的结合亲和力与人类Toll样受体2和鼠Toll样受体2二者结合。图19显示了显示OPN-305完全人源化的抗TLR2抗体的氨基酸序列和T2.5鼠抗TLR2抗体的氨基酸序列之间的序列同一性的比对。可见大于10%的序列同一性偏差。而且,图20显示了OPN-305完全人源化的抗TLR2抗体的重链可变域氨基酸序列和T2.5鼠抗TLR2抗体的重链可变域氨基酸序列的比对。同样,存在大于10%的序列同一性偏差。不希望受理论束缚地,本发明人预测OPN-305抗体的轻链和重链的氨基酸序列与T2.5鼠抗体相比的偏差赋予了OPN-305抗体对于Toll样受体2的改良的结合特异性和亲和力。
实施例9——TLR2受体占据研究
设计本实验以鉴定当OPN-305单克隆抗体与TLR2结合时抑制生物活性所需的最小占据水平。利用THP-1报道细胞系检查结合对比功能。尤其在Pam3CSK4诱导的THP1-CD14细胞中评估OPN-305的生物活性。
材料和方法
将THP1-CD14细胞以1×106细胞每孔的密度接种到12孔盘中。将不同浓度的(范围从0.000488μg/ml至2μg/ml)OPN-305添加到孔中,然后添加Pam3Csk4(200ng/ml)。在37℃下过夜孵育细胞。通过在37℃下用160μl的Quantiblue(Invivogen)试剂孵育热灭活的条件培养基90分钟并读取650nm处的吸光度来测量NF-κB驱动的SEAP活性。
为确定OPN305在THP1-CD14细胞中的受体占据,将THP1-CD14Blue细胞置于FACS管中(1×106/管)并用抗CD32封闭试剂(MitenylBiotec)封闭FcR15分钟。用不同浓度的(范围从0.000488μg/ml至2μg/ml)OPN-305在室温下标记细胞15分钟。洗涤后,用RPE轭合的抗人IgG4在室温下孵育细胞15分钟。在最终洗涤步骤之后,在采集之前用含2%甲醛盐溶液的1%的BSA/PBS固定细胞。利用以下公式计算特异性结合百分比:
结果
结果显示于图21A、B和C中。这些结果显示了在用Pam3Csk4处理后观察到以剂量依赖方式对NF-kB活性的抑制(图21A和B)。OPN-305在2μg/ml的浓度时几乎完全抑制了NF-kB活性(图21)。利用上述的公式计算THP1-CD14细胞中OPN-305的特异性结合的百分比。
已将用THP-1细胞进行的饱和结合实验溯及相同的细胞群体中的生物活性的抑制。TLR2依赖性信号传递的完全抑制可利用少于最大受体结合来获得。这是复杂的系统,且似乎可能TLR2的水平显著高于异源二聚体伴侣TLR1和TLR6中的水平。受体占据检查了TLR2作为单体或异源二聚体的饱和结合。似乎可能足够的TLR2的中和以降低游离的TLR2寻找伴侣以形成功能信号传递复合物的可能性可以作为在小于100%受体占据时生物活性的明显损失的解释。
实施例10——确定OPN-305抗体作为TLR2依赖性信号传递的竞争性抑制物还是非竞争性抑制物而起作用
材料和方法
将THP1CD14Blue细胞以100,000细胞每孔接种在96孔板中。利用0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的OPN-305对细胞进行短暂的预孵育,然后用不同剂量的Pam3Csk4在37℃下过夜刺激细胞。移去40μl的上清液并在65℃下灭活10分钟。通过用160μl的Quantiblue(Invivogen)试剂在37℃下孵育热灭活的条件培养基90分钟并随后在650nm处进行读取来测量NF-kB驱动的SEAP活性。假设基于细胞的测定中的受体的表现与酶相似,将V(NF-kB活性)针对S[Pam3CSK4]绘图,并作出双倒数莱恩威佛-伯克线(doublereciprocallineweaverburkplot)(1/v对比1/s)。
结果
结果显示于图22中,其中图22A描绘了NF-kB依赖性的SEAP活性对比[Pam3CSK4],而图22B描绘了1/V对比1/S的莱恩威佛-伯克线。
这些结果显示了随配体浓度增高,发现剂量反应曲线的典型的向右位移(图22A)。莱恩威佛-伯克线(图22B)的分析表明在低配体浓度时的竞争机制,但当配体超过某阈值时动力学发生改变。在细胞中确定抑制作用的性质是挑战性的,因为读数结果是生物活性,其不仅依赖于TLR2/配体相互作用而且还依赖于有TLR1或TLR6的募集以生成有活性的二聚的信号传递复合物。利用公众可获得的数据库进行的表达谱分析表明TLR2的存在显著超过了TLR1或TLR6,这可能解释了双相反应作为伴侣分子的滴定结果的可能。
实施例11——OPN-305与TLR2的连接是否改变对其他TLR2配体的反应的确定
本实验考虑了OPN-305对TLR2的抑制是否影响了其它TLR对其相应的配体的反应。
材料和方法
将THP1CD14Blue细胞以25,000细胞每孔接种在384孔板中。利用0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的OPN-305或人IgG4同种型对照抗体预孵育细胞120分钟,然后用不同剂量的不同的Toll样受体配体激动剂进行刺激。在利用HEKblue检测培养基过夜孵育后,在条件培养基中直接测量NF-kB驱动的SEAP活性。
使用鞭毛蛋白作为TLR5配体,超纯脂多糖(ultrapureLPS)作为TLR4配体和Pam3CSK和FSL-1作为TLR2配体。
结果
结果显示于图23A、B和C中。当与未暴露于OPN-305的对照细胞相比较时,对于鞭毛蛋白的反应(图23A)和对于脂多糖的反应(图23B)未改变。如预期地,Pam3CSK介导的TLR2激活反应和FSL-1介导的TLR2激活反应受到OPN-305的阻遏(图23A)。当与未暴露于OPN-305的对照细胞相比较时,对于鞭毛蛋白的反应和对于脂多糖的反应未改变。这表明OPN-305未引起TLR4或TLR5对配体的反应的任何非预期的增高或降低。
实施例12——在脓毒症的治疗中使用OPN-305
材料和方法:
用10mg/Kg、2mg/Kg和0.4mg/Kg的剂量的OPN-305单克隆抗体处理雌性BALB/c小鼠的组(n=4),然后用100μg的Pam3Csk4进行处理。全部处理均是腹膜内施用的。4小时后,通过致死麻醉处死小鼠并采集血液。获取血清并通过ELISA确定细胞因子浓度。对于KCELISA和IL-12p40ELISA将血清稀释1/10,且对于IL-6ELISA将血清稀释1/5。
结果:
结果显示于图24。显示OPN305抑制了Pam3Csk4诱导的脓毒症。抗TLR2OPN305的低剂量(0.4mg/kg)施用可在小鼠中显著抑制Pam3Csk4诱导的细胞因子。
还仅用OPN-305重复了本实验,使用OPN305抗体的i.v.(静脉内)施用、随后i.p.(腹膜内)注射TLR2激动剂Pam3CSK以确保阳性作用不是抗体和激动剂被递送到同样的区室的结果。
本实验的结果显示于图25A和B中。结果显示了OPN-305单克隆抗体抑制了Pam3Csk4诱导的脓毒症。该结果等同于先前的实验,这表明系统递送的OPN-305可抑制响应于Pam3CSK的i.p(腹膜内)施用的血清细胞因子产生。
实施例13——OPN-305单克隆抗体与表达于大鼠细胞上的TLR2的结合
材料和方法
NR8383细胞购自ATCC,并按ATCC的说明培养于FK12培养基中。利用大鼠特异性抗CD32(小鼠IgG1)在室温下封闭细胞10分钟。用OPN305(或同种型)处理细胞15分钟,洗涤细胞、用RPE抗人IgG4进行检测并在采集之前用2%甲醛盐溶液进行固定。还利用多克隆兔抗大鼠TLR2抗体对NR8383细胞进行染色,并用Alexa-Fluor488抗兔IgG进行检测。
结果:
结果显示于图26中,其显示了TLR2表达于大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)上,并利用OPN305进行检测。(A)未染色的细胞,(B)阳性对照;多克隆兔抗大鼠TLR2第一抗体,第二抗体是抗兔Alexa-Fluor488;(C)用多克隆人IgG4处理的细胞,第二抗体是人类抗IgG4PE;(D)OPN305染色的细胞,第二抗体是抗人IgG4PE。
实施例14——OPN-305单克隆抗体与表达于猪细胞上的TLR2的结合
材料和方法
利用Ficoll从血液中纯化猪PBMC。计数细胞并将1×106个细胞置于每管。在不存在对于猪的特异性CD32封闭试剂下,利用含50%FCS/BSA的PBS的基质中人类抗CD32来封闭细胞10分钟。用OPN305(或同种型对照)在室温下孵育细胞15分钟。将1H11(小鼠抗猪TLR2,由JavierDominguez惠赠)用作阳性对照。洗涤之后,用RPE轭合的抗人IgG4在室温下孵育细胞15分钟。在最终洗涤步骤之后,固定细胞、进行采集并分析。
结果
结果显示于图27中。TLR2表达于猪PBMC上,且被OPN305染色。利用Ficoll通过分离来纯化PBMC。A-C代表来自猪666的PBMC和D-F来自猪488。A、D是未染色的;B、E是用对照多克隆人IgG4标记,然后用PE标记的抗人IgG4进行第二次染色;C、F是用OPN305标记的,然后用PE标记的抗人IgG4进行染色。
本说明书中涉及的所有文献通过引用并入本文。对于所描述的本发明的实施方案的不同的修改和变化对于本领域中的技术人员将是明显的而不脱离本发明的范围。虽然已结合特定的优选的实施方案描述了本发明,应理解,所要求保护的发明不应过度地局限于这些特定的实施方案。事实上,对于本领域中的技术人员是明显的对所描述的实施本发明的方式的不同的修改意在为本发明所覆盖。
Claims (22)
1.一种中和抗体,或其抗原结合片段,包括由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成的轻链可变域和由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成的重链可变域,其中所述抗体或抗原结合片段与Toll样受体2特异性地结合。
2.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述抗体或其抗原结合片段拮抗Toll样受体2功能不依赖于所述抗体或抗原结合片段与CD32的结合。
3.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述轻链的可变域与κ恒定域连接。
4.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述重链的可变域与来源于免疫球蛋白G亚类,同种型4的抗体的至少一个恒定域连接。
5.如权利要求4所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述重链的铰链区的氨基酸残基241由丝氨酸残基置换为脯氨酸残基。
6.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述轻链包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述重链包括SEQIDNO:5的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述重链包括SEQIDNO:5的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述抗体是完全人源化的抗体。
10.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述抗体是分离的抗体。
11.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述抗体选自由免疫轭合物、去岩藻糖基化的抗体和双特异性抗体组成的组。
12.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述抗体是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA组成的组的同种型的全长抗体。
13.如权利要求1所述的Toll样受体2中和抗体,所述Toll样受体2中和抗体以3×10-8M或更小的KD与人类或鼠Toll样受体2结合。
14.如权利要求13所述的Toll样受体2中和抗体,其中所述Toll样受体2是人类Toll样受体2。
15.一种抗体-伴侣分子轭合物,所述抗体-伴侣分子轭合物包括权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和伴侣分子,其中所述伴侣分子是至少一种治疗剂。
16.一种分离的抗体或从其中来源的抗原结合片段,所述分离的抗体或从其中来源的抗原结合片段特异性地与Toll样受体2结合并拮抗Toll样受体2功能,其中所述拮抗的介导不依赖于所述抗体或抗原结合片段与CD32的结合,其中所述抗体或从其中来源的抗原结合片段与Toll样受体2的胞外域结合,且包括SEQIDNO:1的轻链可变域氨基酸序列,和SEQIDNO:4的重链可变域氨基酸序列。
17.一种分离的核酸分子,所述分离的核酸分子编码权利要求1至14和权利要求16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
18.一种表达载体,所述表达载体包括权利要求17所述的核酸分子。
19.一种宿主细胞,所述宿主细胞包括权利要求18所述的表达载体。
20.一种制备根据权利要求1至14和权利要求16中任一项所述的Toll样受体2抗体或抗原结合片段的方法,所述方法包括在权利要求19所述的宿主细胞中表达所述抗体或抗原结合片段并从所述宿主细胞中分离所述抗体或抗原结合片段的步骤。
21.一种药物组合物,所述药物组合物包括根据权利要求1至14和权利要求16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
22.一种药盒,所述药盒包括如权利要求1至14和权利要求16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及使用所述抗体或其抗原结合片段的说明书。
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