BRPI1014016B1

BRPI1014016B1 - anticorpos humanizados para receptor tipo toll 2 e usos dos mesmos.

Info

Publication number: BRPI1014016B1
Application number: BRPI1014016A
Authority: BR
Inventors: Dellacasagrande Jerome
Original assignee: Opsona Therapeutics Ltd
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2010-07-06
Publication date: 2020-04-07
Also published as: JP6677466B2; JP2016025863A; CN102482356A; US20120164159A1; CA2766996C; BRPI1014016A2; KR101572171B1; CA2766996A1; EP2451842A1; NZ597447A; RU2011153932A; EP2805973A3; WO2011003925A1; NZ615441A; MX2012000316A; EP2805973B1; IN2012DN00938A; BRPI1014016B8; CN102482356B; US8734794B2

Abstract

anticorpos humanizados para receptor tipo toll 2 e usos dos mesmos a invenção se refere a um anticorpo completamente humanizado com especificidade de ligação a receptor tipo toll 2, que compreende uma cadeia leve e cadeia pesada inteiramente composto por uma sequência de aminoácidos de origem humana. a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de seq id nº: 1, enquanto o domínio da região variável consiste em uma sequência de aminoácido pesado que é substancialmente homóloga à sequência de seq id nº: 4. a invenção também se refere a ácidos nucléicos codificando tais anticorpos, bem como o uso de anticorpos na medicina, particularmente para o tratamento de doenças inflamatórias e auto-imunes que são facilitadas pela ativação e sinalização do receptor tipo toll 2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS HUMANIZADOS PARA RECEPTOR TIPO TOLL 2 E USOS DOS MESMOS

Campo da Invenção

A presente invenção se refere aos anticorpos plenamente humanizados e seus fragmentos, e especificamente, à presença de anticorpos plenamente humanizados, que possuem especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2 (TLR2, TLR-2). A invenção ainda se refere à utilização dos ditos anticorpos plenamente humanizados para o tratamento e prevenção de doenças inflamatórias e autoimunes mediadas por ativação do Receptor tipo Toll 2 e sinalização.

Histórico da Invenção

Os Receptores tipo Toll 2 (TLRs) formam uma família de receptores de reconhecimento padrão possuindo um papel chave na modulação da resposta imune inata, os mesmos também estão envolvidos na reparação de tecidos, manutenção da integridade dos tecidos e tumorigênese. Onze Receptores do Tipo Toll foram identificados em seres humanos atualmente. Os elementos da família dos Receptores Tipo Toll são altamente conservados, com a maioria das espécies de mamíferos possuindo entre 10 a 15 Receptores Tipo Toll. Cada Receptor Tipo Toll reconhece agentes patogênicos específicos associados às assinaturas moleculares. O Receptor tipo Toll 2 (TLR2, CD282, TLR-2) pode ser ativado por peptidoglicano, lipoproteinas, ácidos lipoteicóicos e ligantes endógenos.

Vários anticorpos monoclonais que possuem especificidade com relação ao Receptor tipo Toll 2 são conhecidos. O WO 01/36488 revela um anticorpo, denominado TL2.1, que é derivado de uma linhagem celular de hibridoma depositada de acordo com o Budapest Treaty at the European Colletion of Cell Cultures (ECACC), sob o número de acesso 99102832. Este anticorpo antagoniza a ativação do Receptor tipo Toll 2, expresso em células humanas.

O WO 2005/028509 descreve um anticorpo monoclonal murino, denominado T2.5, que inibe especificamente a ativação de mamíferos TLR2. O anticorpo monoclonal T2 é mostrado como sendo de reatividade cruzada para ambas as formas humanas e de murino de TLR2. Este documento contém ainda dados experimentais que sugerem que o anticorpo monoclonal TL2.1 anti-TLR2 de murino, tal como revelado no WOOl/36488, não apresenta reatividade cruzada para ambas as formas humanas e de murino de TLR2, como foi indicado na descrição daquele pedido de patente. Em vez disso, o anticorpo TL2.1 é mostrado no WO 2005/028509 apenas como se ligando ao Receptor tipo Toll 2 humano e não ao Receptor tipo Toll 2 de murino. O anticorpo monoclonal T2.5 do WO 2005/028509 foi levantado contra o dominio extracelular de TLR2 e, portanto, tem especificidade de ligação a um epitopo naquela área do Receptor tipo Toll 2.

WO 2005/019431 revela um anticorpo que apresenta especificidade de ligação para TLR2, que é denominado 11G7. Este anticorpo murino pode ser derivado da linhagem de célula de hibridoma 11G7 conforme depositado no American Type Culture Centre (ATCC) sob a denominação PTA-5014. 0 anticorpo monoclonal 11G7 se liga seletivamente ao domínio extracelular de TLR2 e pode bloquear a indução da produção de citocinas pelas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) estimuladas com um agonista que ativa um heterodimero formado entre o Receptor Tipo Toll 1 (TLR1) e TLR2. O anticorpo 11G7 não inibe a produção de citocinas por PBMC estimuladas com um agonista que induz a sinalização através de um heterodimero formado entre ο Receptor Tipo Toll 6 (TLR6) e TLR2.

A utilização de anticorpos monoclonais de roedores, tais como anticorpos monoclonais de murinos, para aplicações terapêuticas in vivo tem mostrado estar associada à geração de respostas imunes indesejáveis que são geradas pelo indivíduo ao qual o anticorpo é administrado. Tais respostas imunes podem resultar na produção de anticorpos que neutralizam eficazmente a eficácia do anticorpo terapêutico. Tais respostas imunes são geralmente ditas como respostas humanas de anticorpo anticamundongo (HAMA). As respostas HAMA comprometem a eficácia terapêutica do anticorpo administrado de diversas maneiras, incluindo o prejuízo a capacidade do anticorpo terapêutico de atingir o seu alvo de ligação, isto comprometendo o efeito terapêutico do anticorpo.

Várias abordagens foram desenvolvidas para lidar com a questão das respostas HAMA indesejadas que surgem contra anticorpos terapêuticos que são administrados aos indivíduos. Tipicamente, estas abordagens envolvem técnicas que resultam na substituição de certos componentes do anticorpo de camundongos com porções equivalentes derivadas de um anticorpo humano. Estas abordagens podem, por exemplo, resultar na produção de anticorpos quiméricos que compreendem as regiões variáveis de murino unidas às regiões constantes derivadas de humanos. Alternativamente, uma técnica conhecida como enxerto de CDR pode ser empregada, onde as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo de murino são enxertadas em uma estrutura provida pelas regiões de domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo humano. Isto resulta na produção de um anticorpo que retém a especificidade de ligação do anticorpo de murino, mas onde os únicos componentes não-humanos são as regiões de CDRs de murino enxertadas.

No entanto, em ambas as abordagens, a eficácia terapêutica do anticorpo humanizado resultante pode ser prejudicada. Por exemplo, o componente de região variável de murino de um anticorpo quimérico pode ainda proporcionar a base para uma resposta HAMA a ser montada contra isso. Adicionalmente, quando anticorpos humanizados enxertados com CDR são produzidos, vem sendo observado que o transplante simples das regiões CDR muitas vezes resulta em uma eficácia terapêutica reduzida do anticorpo devido à afinidade de ligação do anticorpo ser diminuída.

O inventor, portanto, identificou a necessidade de geração de anticorpos monoclonais plenamente humanizados, que possuam a especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2, e que antaqonizem a função de TLR2, porém que sejam essencialmente não-imunogênicos em seres humanos. Após extensa experimentação, o inventor produziu um anticorpo monoclonal plenamente humanizado, que apresenta especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2 humano, e que antagoniza a função de TLR2 independentemente se o Receptor tipo Toll 2 forma um heterodímero como Receptor Tipo Toll 1 ou Receptor Tipo Toll 6. Este anticorpo TLR2 antagonista não é produzido a partir de técnicas quiméricas previamente conhecidas de enxerto de CDR, e, portanto, não contém quaisquer resíduos de aminoácidos de murino. Além disso, é mostrado que o anticorpo medeia a neutralização de TLR2 sem a necessidade de se ligar ao antígeno de superfície celular CFD32, isto sendo um requisito funcional de outros anticorpos antagonistas de Receptor tipo Toll 2 conhecidos. Além disso, o anticorpo plenamente humanizado da presente invenção é o primeiro anticorpo neutralizante de TLR2 plenamente humano a ser conhecido na arte. 0 anticorpo não exibe quaisquer epítopos de células T e, portanto, os anticorpos neutralizantes não são gerados contra os mesmos quando administrado a um indivíduo. Os anticorpos antagonistas anti-TLR2 exibem, adicionalmente, um amplo nível de reatividade cruzada com Receptor tipo Toll 2, tal como expressa por uma vasta gama de células de mamíferos, com a ligação do anticorpo plenamente humanizado sendo surpreendentemente observada ao se ligar ao Receptor tipo Toll 2 expresso em células de seres humanos, camundongos e macacos.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção é proporcionado um anticorpo neutralizante, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar especificamente ao Receptor tipo Toll 2 (TLR2, CD282, TLR2), e onde o anticorpo ou porção de ligação de antigeno compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma cadeia leve e uma cadeia pesada, onde a região variável da cadeia leve (VL) compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica ou substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e onde a região variável da cadeia pesada (VH) compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos que é idêntica ou substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Conforme definido no presente documento, o termo anticorpo neutralizante descreve um anticorpo que é capaz de neutralizar a ativação biológica e sinalização do Receptor tipo Toll 2. O anticorpo neutralizante, que também pode ser referido como um anticorpo antagonista, ou um anticorpo de bloqueio, especificamente, e de preferência seletivamente, se liga ao Receptor tipo Toll 2 e inibe uma ou mais atividades biológicas do Receptor tipo Toll 2. Por exemplo, o anticorpo neutralizante pode inibir a ligação de um ligante ou substrato, tal como um ligante de Receptor tipo Toll 2 ao sitio de ligação do ligante do Receptor tipo Toll 2. Alternativamente, o anticorpo neutralizante pode impedir a ativação de Receptor tipo Toll 2, uma vez ligado por um agonista de ligante, por exemplo por prejuízo da ligação do agonista ao ligante. Normalmente, o anticorpo neutralizante se liga seletivamente ao Receptor tipo Toll 2 e, portanto, substancialmente não se liga substancialmente aos outros elementos da família do Receptor Tipo Toll (por exemplo, Receptor Tipo Toll 4) em condições fisiológicas ou terapêuticas.

Em determinadas modalidades, o anticorpo neutralizante de Receptor tipo Toll 2 medeia o antagonismo da atividade funcional do Receptor Tipo Toll independentemente do requisito do anticorpo do ant i-Receptor tipo Toll 2, ou fragmento de ligação, de se ligar ao CD32 (receptor Fc gama II) (FcyRII, FcgRII), especificamente CD32a e/ou CD32b. Por conseguinte, a neutralização do Receptor tipo Toll 2 não requer ligação do anticorpo, e especificamente da porção Fc do anticorpo, ou fragmento de anticorpo, ao CD32.

Tipicamente, os anticorpos anti-Receptor tipo Toll 2 da invenção são caracterizados pelo fato de que não contêm quaisquer epítopos de ligação contra os quais uma resposta imune pode ser mediada, quando o anticorpo é administrado a um indivíduo, especificamente um ser humano. Tal característica é importante na prevenção da geração de anticorpos neutralizantes contra os anticorpos da invenção no indivíduo ao qual os anticorpos são administrados, uma vez que a eficácia terapêutica dos anticorpos pode ser severamente comprometida caso tal resposta imune ocorra.

Tipicamente, o anticorpo neutralizante anti-Receptor tipo Toll 2 é um anticorpo plenamente humanizado. Isto é, todas as combinações dos residues de aminoácidos que compõem o anticorpo são inteiramente de origem humana, e, consequentemente, não contêm, por exemplo, regiões humanas e não humanas. Especificamente, o anticorpo da invenção compreende apenas sequências de região variável humanas. 0 anticorpo da invenção, portanto, difere, por exemplo, de um anticorpo monoclonal quimérico que consiste em resíduos de aminoácidos derivados de ambos os camundongos e seres humanos nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve, ou a partir de um anticorpo humanizado enxertado com CDR, onde a regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendem resíduos de aminoácidos derivados de um anticorpo de murino, enquanto que as reqiões de estrutura associadas (FR) do anticorpo e as regiões constantes (CR) são derivadas de um anticorpo humano. Assim, o anticorpo plenamente humanizado da invenção possui regiões variáveis e constantes, de ambas as cadeias pesadas e leves, que são todas de origem humana, ou que são substancialmente idênticas às sequências de origem humana, embora não necessariamente a partir do mesmo anticorpo. Os anticorpos plenamente humanizados da presente invenção podem ser ainda referidos como anticorpos humanizados ou como um anticorpo derivado plenamente a partir de sequências humanas.

A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo da invenção é mostrada a seguir como SEQ ID NO: 1:

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFGA SNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGMYFCQQSRKLPWTFGGGTKV EIK

Na SEQ ID NO: 1, conforme mostrado na figura 1, os resíduos sublinhados se referem à localização das regiões determinantes de complementaridade, onde os resíduos de 24 a 34 se referem à CDR1, resíduos 50 a 56 se referem à CDR2 e os resíduos 89 a 97 se referem à CDR3. A figura 1B mostra a sequência variável da cadeia leve de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida. Nesta figura, os resíduos do domínio de cadeia leve são convencionalmente numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat EA e outros,(1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5^a edição, Bethesda: US Department of Health and Human Services).

Deve ser observado que a identificação destes resíduos de CDR é consistente com os resíduos atribuídos às regiões

CDR, usando o sistema de numeração de Kabat, onde VLCDR1 (isto é, região determinante de complementaridade 1 do domínio variável de cadeia leve) compreende os resíduos 24 a 34, VLCDR2 (região determinante de complementaridade 1 do domínio variável de cadeia leve) compreende os resíduos 50 a 56 e VLCDR3 (região determinante de complementaridade 1 do domínio variável de cadeia leve) compreende os resíduos 89-97.

Conforme definido no presente documento, uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 significa uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente 95% de identidade de sequência, e mais preferencialmente menos pelo menos 98% de identidade de aminoácido ao longo de um comprimento de pelo menos 20, 50 ou 100 aminoácidos, ou de todo o comprimento da sequência, para a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Tipicamente, tais sequências de aminoácido homólogas apresentarão especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2 e, quando ligadas ao Receptor tipo Toll 2, antagonizarão a atividade funcional do Receptor tipo Toll 2.

Tipicamente, a região variável da cadeia leve (VL) é unida a um dominio constante Kappa de imunoglobulina humana (CL) para proporcionar uma cadeia leve, a dita cadeia leve sendo a cadeia leve do anticorpo humanizado.

Consequentemente, em certas modalidades, onde o anticorpo ou o elemento de ligação da invenção compreende uma cadeia leve completa, a cadeia leve apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2: DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFGASNVE SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGMYFCQQSRKLPWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Em certas modalidades adicionais, a invenção se estende a um anticorpo ou elemento de ligação compreendendo uma cadeia leve que compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% e mais preferivelmente 98% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Tipicamente, o anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 80% ou mais de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2 se ligará especificamente ao Receptor tipo Toll 2 e quando ligado ao mesmo, servirá para antagonizar a atividade funcional do Receptor tipo Toll 2.

Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos da cadeia leve, tal como definido na SEQ ID NO: 2 e, como representado na figura 3, é codificada a partir da sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 3, como mostrado na figura 4. Na sequência de SEQ ID NO: 3 mostrada na figura 4, os ácidos nucléicos sublinhadas codificam os aminoácidos da região variável de cadeia leve.

Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) é mostrada a seguir como SEQ ID NO: 4: QVQLVQSGSELKKPGASVKLSCKASGFTFTTYGINWVRQAPGQGLEWIGWIYPRDGSTN FNENFKDRATITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARLTGGTFLDYWGQGTTVTVSS

Na SEQ ID NO: 4, como mostrado na figura 2, os resíduos sublinhados se referem aos resíduos de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade 3, onde os resíduos de 31 a 35 se referem à CDR1 (VHCDR1 (região determinante de complementaridade 1 do domínio variável de cadeia pesada) ) , os resíduos 50 a 65 se refere à CDR2 (VHCDR2) e os resíduos 95 a 103 se referem à CDR3 (VHCDR3). Deve ser observado que o posicionamento destes resíduos de CDR difere ligeiramente para o posicionamento tipicamente atribuído às regiões CDR, usando o sistema de numeração de Kabat, onde CDR1 está presente nos resíduos 31 a 35, CDR2 está presente nos resíduos 50 a 66, e CDR3 está presente nos resíduos 95 a 103.

Conforme definido no presente documento, uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 significa uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente 95% de identidade de sequência, e mais preferencialmente menos pelo menos 98% de identidade de aminoácido longo de um comprimento de pelo menos 20, 50 ou 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades adicionais, a invenção se estende a um anticorpo ou elemento de ligação que compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH), que compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma homologia de sequência de aminoácidos de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência e de preferência pelo menos 98% de identidade de sequência com relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Tipicamente, a região variável da cadeia pesada (VH) é coligada a uma sequência de aminoácido adicional que compreende pelo menos um domínio constante de imunoglobulina. Em certas modalidades, o domínio constante de imunoglobulina é derivado de um anticorpo da subclasse IgG (imunoglobulina G) para formar a cadeia pesada completa do anticorpo humanizado da invenção. Por conseguinte, dito domínio constante pode compreender CHI, CH2 e CH3, juntamente com um ligante adequado localizado entre os ditos domínios CHI e CH2.

Em certas modalidades os domínios constantes de imunoglobulina são derivados de uma imunoglobulina do isotipo IqG, tipicamente imunoglobulina G, isotipo 4 (IgG4). Anticorpos de IgG4 são moléculas dinâmicas que realizam intercâmbio de ramificações Fab por troca de uma cadeia pesada e cadeia leve anexada (meia molécula) com um par de cadeias pesada-leve de outra molécula, esta troca resultando na produção de anticorpos biespecíficos. Assim, em certas modalidades, pelo menos uma mutação é feita na sequência de aminoácidos de pelo menos um dos domínios constantes da imunoglobulina lgG4 a fim de evitar a ocorrência de troca da ramificação Fab. Assim, em certas modalidades da invenção, onde um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende domínios constantes derivados de IgG4, uma mutação do resíduo de aminoácido 241 da cadeia pesada, localizada na região de articulação, seria realizada de tal modo que o resíduo serina seria substituído por um resíduo de prolina (S24 P) (como ensinado em Angal S. e outros, Molecular Immunology. 1993. Vol. 30. No. 1. pl05-108).

Assim, em certas modalidades, os resíduos de aminoácidos usados para fornecer os resíduos de domínio constante da cadeia pesada e leve são derivados de uma imunoglobulina do isotipo IgG4. Em certas modalidades adicionais, a imunoglobulina é derivada de uma imunoglobulina da subclasse IgG e do isotipo IgGl, IgG2 ou IgG3. Em certas modalidades, os resíduos de aminoácidos usados para fornecer os resíduos de domínio constante da cadeia pesada e leve são derivados de uma imunoglobulina do subtipo IgA.

Em várias modalidades, uma ou mais mutações, substituições, deleções ou inserções podem ser feitas à sequência de aminoácidos do domínio constante do anticorpo a fim de modificar as propriedades funcionais do anticorpo. Por exemplo, pelo menos, uma mutação de aminoácido, inserção, deleção e/ou substituição pode ser feita aos resíduos de aminoácidos de um domínio constante para modificar pelo menos uma propriedade selecionada, mas não se limitando a: função efetora, potência ou propriedades de meia vida do anticorpo.

Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a presente invenção, que compreende os domínios VH-CH1-CH2-CH3 e que inclui ainda uma região de articulação, é fornecida a seguir como SEQ ID NO: 5:

QVQLVQSGSELKKPGASVKLSCKASGFTFTTYGINWVRQAPGQGLEWIGWIYPRDGSTN FNENFKDRATITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARLTGGTFLDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Em certas modalidades adicionais, a invenção se estende a um anticorpo ou elemento de ligação compreendendo uma cadeia pesada que consiste em uma sequência de aminoácidos homóloga apresentando uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% e mais preferencialmente de 98% com relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada, tal como definida na SEQ ID NO: 5 e, como representado na figura 5, é codificada a partir da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6, como mostrado na figura 6. Na sequência de SEQ ID NO: 5 como mostrado na figura 5, os resíduos em negrito são a região de dobradiça, os resíduos em itálico são os resíduos do domínio constante CHI, os resíduos sublinhados são os resíduos do domínio constante CH2 e as resíduos enumerados após os resíduos sublinhados são os resíduos do domínio constante CH3. Em certas modalidades, os domínios constantes CHI, CH2 e/ou CH3 podem ser substituídos, no todo ou em parte com um domínio CHI, CH2 ou CH3 derivado de qualquer subtipo de imunoglobulina adequado, tal como, mas não limitado a IgGl, IgG2, IgA ou IgM. Em certas modalidades, a deleção, adição ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido presente em qualquer um dos domínios constantes, pode também ser proporcionada. Tipicamente ditas deleções, adições ou substituições causam uma alteração resultante funcional nas propriedades de ligação da porção Fc do anticorpo, ou fragmento de anticorpo e, especificamente uma modulação da capacidade da região Fc do anticorpo de se ligar ao receptor Fc e mediar funções efetoras.

Em certas modalidades, a presente invenção se estende a um anticorpo isolado que compreende um domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 1, ou uma variante que apresenta pelo menos 90% de identidade com relação à sequência de aminoácidos com a mesma, e um domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 4, ou uma variante que apresenta pelo menos 90% de homologia de identidade com relação à sequência de aminoácidos.

Em certas modalidades adicionais, é proporcionado um anticorpo formado de uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou uma variante que apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à mesma, e uma cadeia pesada apresentando a sequência de aminoácidos na SEQ ID NO: 5, ou uma variante que apresenta pelo menos 90% de identidade com relação à sequencia de aminoácidos.

Será apreciado que os domínios variáveis e constantes de ambas as cadeias leve e pesada para utilização na produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção, podem incluir variantes destes domínios, por exemplo, ditos domínios variáveis e constantes podem compreender uma ou mais variações de aminoácidos em comparação com a sequência destes domínios conforme descrito no presente documento. Será apreciado que os domínios constantes e variáveis podem ser mais longos ou mais curtos que os domínios constantes descritos no presente documento. Em certas modalidades, os domínios variáveis ou constantes variáveis podem apresentar uma homologia de sequência de pelo menos 90% de identidade ou similaridade com relação a um domínio de constante de anticorpo do tipo selvagem.

Conforme definido no presente documento homologia da sequência também pode ser referida como a identidade da sequência ou a similaridade da sequência. O termo identidade ou identidade da sequência tal como empregado no presente documento, significa que em qualquer posição especifica na sequencia alinhada, o residue de aminoácido é idêntico entre as sequências alinhadas. O termo similaridade ou similaridade da sequência conforme empregado no presente documento indica que, em qualquer posição especifica nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo semelhante entre as sequências. Por exemplo, a leucina pode ser substituída por um resíduo de isoleucina ou valina. Isto pode ser referido como substituição conservadora. De preferência, quando as sequências de aminoácidos da invenção são modificadas por meio de substituição conservadora de qualquer um dos resíduos de aminoácidos que contidos nas mesmas, estas alterações não possuem efeito sobre a especificidade de ligação ou a atividade funcional do anticorpo resultante quando comparado com o anticorpo não modificado.

Homologia da sequência ou a identidade da sequência com relação a um polipeptídeo (nativo) da invenção e seu derivado funcional se refere à percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos do polipeptídeo nativo correspondente, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para obter a homologia percentual máxima, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Nem as extensões de N- ou C- terminal nem as inserções devem ser entendidas como reduzindo a identidade ou homologia da sequência. Os métodos e programas de computador para a realização de um alinhamento de duas ou mais sequências de aminoácidos e determinação da sua identidade ou homologia de sequência são bem conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, a percentagem de identidade ou similaridade de duas sequências de aminoácidos pode ser prontamente calculada usando, por exemplo, algoritmos BLAST (Altschul e outros 1990), FASTA (Pearson e Lipman, 1988), ou o algoritmo de Smith-Waterman (Smith e Waterman, 1981).

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo plenamente humanizado que apresenta especificidade de ligação com o presente epitopo no Receptor tipo Toll 2, que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal de murino T2.5, onde o dito anticorpo humano compreende:

- uma variável de cadeia leve onde a região variável compreende, consiste ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1,

- uma cadeia pesada onde o domínio variável compreende, consiste ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Em determinadas modalidades, o anticorpo pode ser conjugado com, pelo menos, uma molécula efetora ou repórter.

Em certos aspectos adicionais, a presente invenção se estende a um anticorpo monoclonal plenamente humanizado, denominado OPN-305, que compreende uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e um dominio variável de cadeia pesada apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. O anticorpo OPN305 pode ser ainda definido como apresentando uma cadeia leve que consiste em ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma cadeia pesada que consiste ou consistindo essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

O termo consiste essencialmente em ou consistindo essencialmente em conforme empregado no presente documento significa que um polipeptídeo pode apresentar características adicionais ou elementos além dos descritos, contanto que tais características adicionais ou elementos não afetem signifícativamente a capacidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo de apresentar especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2. Isto é, os fragmentos de anticorpo ou anticorpo compreendendo os polipeptideos podem ter características adicionais ou elementos que não interferem com a capacidade dos fragmentos de anticorpo ou anticorpo de se ligar ao Receptor tipo Toll 2 e antagonizarem a atividade funcional do Receptor tipo Toll 2, tais como modificações introduzidas na sequência de aminoácidos, a fim de reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, um polipeptideo que consiste essencialmente em uma sequência especificada pode conter um, dois, três, quatro, cinco ou mais aminoácidos adicionais, em cada extremidade ou em ambas as extremidades da sequência, contanto que os aminoácidos adicionais não interfiram, inibam, bloqueiem ou interrompam o papel do polipeptideo em um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Do mesmo modo, uma molécula de polipeptideo que contribui para os anticorpos antagonistas do Receptor tipo Toll 2 da invenção podem ser quimicamente modificados com um ou mais grupos funcionais, desde que tais grupos funcionais não interferiram com a capacidade do anticorpo ou fragmento de

anticorpo	de	se liqar	ao Receptor	tipo	Toll 2 e	antagonizar
a sua função.
Em	determinados	aspectos	adicionais,	a presente
invenção	se	estende	a um anticorpo	isolado,	monoclonal,

completamente humanizado que isolado, plenamente humanizada do anticorpo, monoclonal, que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e/ou um domínio variável de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Conforme definido no presente documento um anticorpo plenamente humanizado se refere a um anticorpo apresentando regiões variáveis nas quais as regiões de estrutura (FR) , regiões constantes (CR) e regiões determinantes de complementaridade (CDR) são derivadas a partir de sequências de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana. Adicionalmente, se o anticorpo contiver regiões constantes, então, estas regiões constantes também são derivadas das sequências de imunoglobulinas humanas da linhagem germinativa. Os anticorpos plenamente humanizados da presente invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas humanas, tais como mutações introduzidas por mutagênese aleatória, ou de específica de sitio in vitro. No entanto, um anticorpo plenamente humanizado não se destina a incluir anticorpos onde as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, tais como camundongos, foram enxertadas nas sequências estruturais humanas. Um anticorpo monoclonal plenamente humanizado é um anticorpo que exibe uma especificidade de ligação única e que apresenta regiões variáveis nas quais tanto a estrutura e as regiões CDR são derivadas a partir de sequências de imunoglobulinas humanas da linhagem germinativa. Isto difere, por exemplo, de um anticorpo monoclonal humanizado, onde as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamíferos, tais como camundongo, foram enxertadas nas sequências estruturais humanas.

Nas modalidades onde apenas a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável (VH) ou sequência leve variável (VL) sequência são fornecidas, então a invenção se estende aos métodos para a produção de anticorpos que se ligam ao domínio extracelular de Receptor tipo Toll 2, especificamente, mamíferos de Receptor tipo Toll 2, tipicamente humana Receptor tipo Toll 2, onde os ditos anticorpos funcionam para antagonizar a função do Receptor tipo Toll 2, pela classificação das sequências de domínio variável contra uma biblioteca de seqüências complementares de domínio variável de acordo com os ensinamentos de Portolano e outros (Portolano e outros, The Journal of Immunology (1993). 150:880-887) e Clarkson e outro (Clarkson e outros Nature (1991) 352:624-628).

Em determinadas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado que se liga especificamente ao Receptor tipo Toll 2 humano, o dito anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente no aminoácido da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo substancialmente puro, isolado, que é substancialmente livre de outros anticorpos que tenham especificidades antigênicas diferentes. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante, isto é, o anticorpo que foi obtido por métodos

Em certos aspectos adicionais, é proporcionado um anticorpo que se liga especificamente ao Receptor tipo Toll 2, onde o anticorpo consiste, ou consiste essencialmente em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia pesada apresentando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, onde o anticorpo apresenta reatividade cruzada (isto é, que apresenta especificidade de ligação) para Receptor tipo Toll 2, expresso em células humanas, de murino e macaco. Tipicamente, o anticorpo se liga ao Receptor tipo Toll 2 em um sitio de ligação de ligante que, quando ligado pelo anticorpo, impede a ativação do Receptor tipo Toll 2 por um agonista de ligante ligando ao sítio de ligação do Receptor tipo Toll 2.

Em vários aspectos adicionais, a presente invenção se estende a uma proteína de ligação de antígeno multivalente, monoespecífica compreendendo dois, três, quatro ou mais dos anticorpos, conforme definido nos aspectos precedentes da invenção, ou aos fragmentos dos mesmos, onde os ditos anticorpos são ligados um ao outro por uma estrutura de ligação.

Em vários aspectos adicionais, a presente invenção se estende aos elementos de ligação ou fragmentos de ligação ao antígeno derivados dos anticorpos plenamente humanizados dos aspectos precedentes da invenção. Tais fragmentos de ligação aos antígenos se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antígeno, tipicamente Receptor tipo Toll 2. Tem sido demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento pleno. Em determinadas modalidades, os elementos de ligação ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser elementos de ligação isolados. Um elemento de ligação ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode compreender um fragmento dos anticorpos da presente invenção, por exemplo, um fragmento de uma molécula de anticorpo plenamente humanizada, tal como, apenas a cadeia pesada ou leve ou, por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada e/ou leve. Em certas modalidades, um elemento de ligação pode tipicamente compreender, consistir, ou consistir essencialmente em um anticorpo VH e/ou o domínio VL. Domínios VH dos elementos de ligação são também fornecidos como parte da invenção. Dentro de cada uma os domínios VH e VL se encontram 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs), juntamente com 4 regiões de estrutura associadas (FRs). Um domínio VH compreende tipicamente 3 HCDRs (regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada), e um domínio VL compreende tipicamente 3 LCDRs (regiões de complementaridade de cadeia leve). Por conseguinte, um elemento de ligação pode compreender um domínio VH que compreende, na sequência, VH CDR1 (ou HCDR1), CDR2 (HCDR2) e CDR3 (HCDR3) ao longo de regiões com uma pluralidade de regiões de estrutura associadas. Um elemento de ligação pode compreender adicional ou alternativamente um domínio VL compreendendo domínios VL CDR1, CDR2 e CDR3 juntamente com regiões de estrutura associadas. Os domínios VH ou VL compreendem tipicamente quatro regiões de estrutura, FR1, FR2, FR3 e FR4, intercaladas entre as 3 regiões determinantes de complementaridade na seguinte disposição:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3

A região variável da cadeia leve (VL) compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que atuam na conferência da especificidade de ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação. As regiões determinantes de complementaridade também podem ser conhecidas como regiões hipervariáveis. As 3 regiões determinantes de complementaridade são mostradas abaixo como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, estas relacionadas aos VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3.

VLCDR1: Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Glu-Tyr-Tyr-Gly-ThrSer-Leu-Met-Gln (RASESVEYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 7))

VLCDR2: Gly-Ala-Ser-Asn-Val-Glu-Ser (GASNVES (SEQ ID NO: 8))

VLCDR3: Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Trp-Thr (QQSRKLPWT (SEQ ID NO: 9))

A figura 1A mostra a sequência de aminoácidos do domínio VL de um anticorpo da presente invenção, como representado na SEQ ID NO: 1. A fiqura 1B mostra a sequência variável da cadeia leve dos nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida. A localização das regiões VLCDR1, VLCDR2, e VLCDR3 é mostrada pelo sublinhado dos resíduos de aminoácidos adequados que compreendem cada região determinante de complementaridade (CDR) na figura

ΙΑ.

Na figura 1 B, os resíduos do domínio variável de cadeia leve são convencionalmente numerados de acordo com o sistema de numeração concebido por Kabat e outros, (Kabat, EA, Wu.T.T., Perry, H., Gottesman, K. e Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a edição, NIH Publication No.91-3242). O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos de 1-113 da cadeia pesada). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo, exceto quando indicação em contrário. As designações de resíduos Kabat nem sempre correspondem diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve da presente invenção. A sequência de aminoácido real linear pode conter alguns ou aminoácidos adicionais em relação à numeração de Kabat estrita correspondendo a um encurtamento ou inserção de um componente estrutural, se uma região de estrutura ou região determinante de complementaridade (CDR) da estrutura de domínio variável básica da cadeia pesada ou leve. A numeração de Kabac correta dos resíduos por qualquer dado anticorpo por um alinhamento dos resíduos na sequência do anticorpo com uma sequência padrão a qual a numeração Kabat foi aplicada.

VLCDR1 (também conhecido como VL-CRD1, região 1 determinante de complementaridade de domínio variável de cadeia leve ou CDR-L1) consiste em 15 resíduos de aminoácidos presentes nos resíduos 24 a 38 da sequência de domínio variável da cadeia leve, como mostrado na figura 1A. Estes resíduos são mostrados como resíduos 24 a 34 na figura 1B, onde é realizada uma conta dos resíduos 27, 27a, 27b, 27c e 27d. Assim, no caso de VLCDR1, 15 resíduos são tomados para igualar uma região CDRL1 definida de acordo com Kabat.

VLCDR2 (também conhecida como região 2 determinante de complementaridade de domínio variável de cadeia leve VLCRD2 ou CDR-L2) como mostrado na figura 1A consiste em 7 resíduos de aminoácidos e está posicionada a partir de resíduos 50 a 56 da sequência de domínio variável, for como mostrado na figura 1B. Estes resíduos coincidem exatamente com resíduos 50 a 56 conforme tomados para igualar uma região CDRL2 definida de acordo com Kabat.

VLCDR3 (também conhecido como VL-CRD3, região 3 determinante de complementaridade de domínio variável de cadeia leve ou CDR-L3) como mostrado na figura IA é constituída por 9 resíduos de aminoácidos e está posicionada a partir de resíduos 89 a 97, se a sequência de domínio variável de cadeia for como mostrado na figura 1B.

Estes resíduos coincidem exatamente com resíduos 89 a 97 conforme tomados para igualar uma região CDRL3 definida de acordo com Kabat.

A região variável

da cadeia pesada (VH) também

compreende 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que atuam na conferência da especificidade de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo. As 3

regiões determinantes de

complementaridade são mostradas

abaixo como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 12,

estas se relacionando aos

VHCDR1, VHCDR2 e VHCDR3.

VHCDR1: Thr-Tyr-Gly-lle-Asn (TYGIN (SEQ ID NO: 10)).

VHCDR2: Trp-lle-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Thr-Asn-Phe-

Asn-Glu-Asn-Phe-Leu-Asp

(WIYPRDGSTNFNENFKD (SEQ ID NO:

11) ) ·

VHCDR3: Leu-Thr-Gly-Gly-Thr-Phe-Leu-Asp-Tyr (LTGGTFLDY (SEQ ID NO: 12)).

A figura 2A mostra

a sequência de aminoácidos do

domínio VH, como representado na SEQ ID NO: 2. A figura 2B mostra a sequência nucleotídica de cadeia variável pesada e a sequência de aminoácidos deduzida.

Na figura 2B, os resíduos do domínio variável de cadeia pesada são convencionalmente numerados de acordo com um sistema concebido por Kabat (supra). A localização das regiões VHCDR1, VHCDR2, e VHCDR3 é mostrada pelo sublinhado dos resíduos de aminoácidos apropriados na figura 2A. VHCDR1 (também conhecida como VH-CRD1, região 1 determinante de complementaridade de domínio variável de cadeia pesada ou CDR-H1) consiste em 5 resíduos de aminoácidos presentes nos resíduos 31 a 35 da sequência de domínio variável. Estes resíduos coincidem exatamente com resíduos de 31 a 35 conforme tomados para igualar a região 1 CDRH, de acordo com a definição de Kabat.

VHCDR2 (também conhecido como VH-CRD2, região 2 determinante de complementaridade de domínio variável de cadeia pesada, ou CDRH2) consiste em 17 resíduos de aminoácidos e é posicionada a partir de resíduos 50 a 65 da sequência de domínio variável. Estes resíduos coincidem exatamente com resíduos de 50 a 65 conforme tomados para igualar a região CDRH2 região definida de acordo com Kabat.

VHCDR3 (também conhecida como VH-CRD3, região 3 determinante de complementaridade de domínio variável de cadeia pesada ou CDRH3) é constituída por 9 resíduos de aminoácidos e está posicionada a partir de resíduos 95 a 103 se for a sequencia de domínio variável de cadeia leve. Devido à presença de 2 resíduos na posição 100 e 100a, que são considerados para se alinhar com resíduo 100 da região CDRH3 da região CDRH3 derivada de Kabat, como ilustrado na figura 2B, estes 9 resíduos coincidem exatamente com as 8 resíduos (resíduos 95 a 102) da região CDHR2 definida de acordo com Kabat.

As CDRs da cadeia leve associadas às CDRs da cadeia pesada para conferir a especificidade de ligação de um anticorpo, ou fragmento de ligação de anticorpo, nos casos onde ambos os conjuntos de CDRs estão presentes. Sabe-se que a contribuição realizada pela região variável da cadeia leve para a energética de ligação é pequena em relação à região variável da cadeia pesada associada. Consequentemente, as regiões de cadeia pesada isolada que compreendem, na sequência, as 3 regiões determinantes de complementaridade (VHCDR1, VHCDR2, e VHCDR3) , são conhecidas por apresentarem uma capacidade de ligação ao antígeno e são geralmente referidos como anticorpos de domínio único. Tais fragmentos de anticorpo são fornecidos pela presente invenção, com base na disposição do domínio variável da cadeia pesada da presente invenção, tal como o definido na SEQ ID NO: 1.

Em vários aspectos adicionais, a invenção se estende a um anticorpo plenamente humanizado ou elemento de ligação relacionado que apresenta especificidade de ligação com o Receptor tipo Toll 2 (TLR2, TLR-2, CD282) e que compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo compreendendo SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o elemento de ligação compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 11 e 12. Em determinadas modalidades adicionais é proporcionado um elemento de ligação compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em, na sequência, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, cada uma das SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 pode ser fornecida na sequência, com regiões de estrutura a ser intercaladas entre as mesmas.

Em certas modalidades, as sequências de aminoácidos dos domínios VH ou VL podem compreender pelo menos uma retromutação, dita retromutação sendo a substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição específica da sequência, de modo a melhorar a especificidade de ligação do anticorpo humanizado ou seu fragmento, para TLR2 e/ou para melhorar a eficácia terapêutica do anticorpo humanizado como um antagonista TLR2. Tipicamente tal modificação pode ser feita aos resíduos estruturais dentro das regiões variáveis de cadeia leve e pesada, de modo a diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Em certas modalidades, as técnicas de engenharia adicionais podem ser utilizadas para modificar os anticorpos da presente invenção, por exemplo, incluindo modificações da região Fc que podem alterar a meia vida no soro, fixação do complemento, ligação do receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antigeno. Além disso, em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser produzidos, os quais alteraram padrão de glicosilação. Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão onde o anticorpo é glicosilado. A glicosilação de polipeptideos é tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N se refere à anexação de uma fração de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para anexação enzimática da fração de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer destas sequências tripeptídicas em um polipeptideo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada a O se refere à anexação de um ou mais dos açúcares de N-acetilgalactosamina, galatose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser utilizadas.

Em determinadas modalidades, os anticorpos podem ser

peguilados	por reação	do	anticorpo com	um derivado	de
polietileno	glicol (	PEG)	. Em certas	modalidades,	o
anticorpo é	desfucosilado	e, portanto,	está isento	de
resíduos de	fucose.

Em certas modalidades, modificações nas propriedades biológicas de um anticorpo podem ser realizadas por seleção de substituições que afetam (a) a estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com semelhanças nas propriedades de suas cadeias laterais (em A.L. Lehninger, em Biochemistry, segunda edição, PP 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polar: lie Ala (A), VAI (V), Leu (L), (1), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) , (2) polar não carregado: Gly (G) , Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q ), (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) , (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) . Alternativamente, os resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ele, (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin, (3) ácidos: Asp, Glu, (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Substituições não conservadoras implicarão em troca de um elemento de uma destas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição conservadora ou no restante dos sítios (por exemplo, não-conservadora).

Em certos aspectos adicionais, a presente invenção se estende ao uso do domínio VL de SEQ ID NO: 1 e/ou o domínio VH de SEQ ID NO: 4 na formação de um anticorpo humanizado ou um seu fragmento, onde o referido anticorpo ou fragmento tem especificidade de ligação para o Receptor tipo Toll 2 e onde o dito anticorpo ou fragmento funciona para antagonizar a atividade funcional do Receptor tipo Toll 2.

Em determinadas modalidades, a presente invenção se estende a um elemento de ligação que apresenta especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2 e que funciona como um antagonista TLR2, o referido elemento de ligação compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 ou a sequências que possuem uma homologia de sequência de aminoácidos de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% da mesma.

Em certos aspectos adicionais, a invenção se estende a um anticorpo monoclonal plenamente humanizado, denominado OPN-305 o qual é caracterizado nos exemplos abaixo. A sequência de aminoácido de domínio variável de cadeia leve (VL) de OPN-305 é mostrada na SEQ ID NO: 1, enquanto a sequencia de aminoácido de domínio variável de cadeia pesada (VH) de OPN-305 é mostrada na SEQ ID NO: 4. Além disso, a sequencia de aminoácido de cadeia pesada de OPN305 é mostrada na SEQ ID NO: 5, enquanto que a sequência de aminoácido de cadeia leve de OPN-305 é mostrada na SEQ ID NO: 2.

anticorpo pode ser produzido por meios recombinantes, tais como cultura de células, ou, alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo isolado. Em certas modalidades, as modificações adicionais podem ser feitas à porção Fc da cadeia pesada, e especificamente aos domínios constantes CH2 e CH3 do anticorpo. Em tais modalidades, o anticorpo será composto por uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e o domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em determinadas modalidades, um fragmento de ligação pode ser derivado do anticorpo OPN-305 plenamente humanizado, tal como um fragmento Fab, um fragmento ou um F'ab ou sc-Fv.

Em vários aspectos adicionais, a presente invenção se estende a um imunoconjugado compreendendo um anticorpo da presente revelação, ou uma porção de ligação ao antigeno do mesmo ligada a uma molécula parceira. Em certas modalidades, tal conjugado de molécula parceira-anticorpo conjugado por meio de um ligante quimico, tal como um ligante peptidila, um ligante de hidrazina ou um ligante dissulfeto. Em certas modalidades, o parceiro de acoplamento é uma molécula efetora, marcação, medicamento ou molécula parceira. As técnicas adequadas para acoplamento dos anticorpos da invenção aos parceiros de acoplamento tanto peptidila e não-peptidila serão ainda conhecidas dos versados na técnica. Exemplos de tais marcações adequadas incluiram marcadores detectáveis, tais como um radiomarcador ou um marcador enzimático, tal como peroxidase de rábano, ou frações químicas, tais como a biotina. Alternativamente, a marcação pode ser uma marcação funcional, por exemplo, uma ricina, ou promedicamentos que são capazes de converter promedicamentos em medicamentos ativos no sítio de ligação do anticorpo.

Em vários aspectos adicionais, a invenção se estende a uma molécula biespecífica compreendendo um anticorpo ou porção de ligação ao antigeno do mesmo ligada a uma segunda porção funcional apresentando uma especificidade de ligação diferente daquela do referido anticorpo ou de uma porção de ligação do antígeno do mesmo.

Em certos aspectos adicionais, a presente invenção se estende a um anticorpo monoclonal, fragmento de ligação derivado de um anticorpo, um peptídeo, um oligonucleotídeo, um peptidomimético ou um composto orgânico que se liga especificamente ao mesmo epítopo presente no domínio extracelular do Receptor tipo Toll 2 como aquele ligado pelo anticorpo monoclonal OPN-305, onde o anticorpo monoclonal não é o anticorpo comercialmente disponível denominado T2.5. Tipicamente, o epítopo que é especificamente ligado pelo composto compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14. Tais compostos possuem a capacidade de competição cruzada com os anticorpos aqui descritos para se ligarem ao Receptor tipo Toll 2 no mesmo epítopo. Tais compostos podem ser identificados por meio de estudos de ligação de competição cruzada, que podem ser realizados contra um anticorpo da presente invenção, tal como OPN-305.

Em vários aspectos adicionais, a presente invenção se estende ao uso de um anticorpo plenamente humanizado, anticorpo monoclonal plenamente humanizado ou elemento de ligação derivado dos mesmos de acordo com a presente invenção na prevenção e/ou tratamento de uma doença ou condição que seja mediada na totalidade ou em parte, por ativação do Receptor tipo Toll 2 e/ou sinalização intracelular.

Em determinadas modalidades a doença ou condição mediada por TLR2 é uma condição inflamatória.

Em certas modalidades, o elemento de ligação pode ser selecionado a partir do grupo que compreende, mas não se limita a: um fragmento Fab, um fragmento Fab', um scFv (fragmento variável de cadeia única), um peptidomimético, um diacorpo, ou um derivado multivalente relacionado.

As técnicas usadas para a produção recombinante de fragmentos Fab, Fab' e F (ab')2 são bem conhecidos de um versado na técnica e incluem aquelas reveladas na Publicação de Patente PCT Internacional WO 92/22324, Sawai e outros, Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and CDNa Expression Vectors 1995, AJRI 34:26-34, e Mullinax e outros, Expression of a Heterodimeric Fab Antibody Protein in One Cloning Step, 1992, BioTechniques 12(6):864-869 e Better e outros, Escherichia coli Secretion of na Active Chimericc Antibody Fragment 1988, Science 240:1041 -1043, o conteúdo dos mesmos sendo incorporados ao presente documento como referência.

Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir scFv (fragmentos Fv de cadeia única) são revelados em Huston e outros, Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins, Methods in Enzymology, vol. 203:46-88 (1991), o conteúdo dos mesmos sendo incorporados como referência.

Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo podem ser derivados de anticorpos de comprimento pleno através da digestão proteolitica de acordo com o método de Morimoto (Morimoto e outros, Single-step purification of F(ab').sub.2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins Gl) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992). Fragmentos de anticorpo podem também ser produzidos diretamente por células hospedeiras (vide Carter e outros, High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment Bio/Technology 10:163-167 (1992)).

Em vários aspectos adicionais, a presente invenção proporciona um método para o tratamento e/ou prevenção de uma condição inflamatória que é mediada na totalidade ou em parte pelo Receptor tipo Toll 2, o dito método compreendendo as etapas de:

- provisão de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado ou um seu fragmento de ligação de acordo com a presente invenção, e

- administração do mesmo a um indivíduo em necessidade de tal tratamento.

Em determinadas modalidades, o método envolve a administração de uma proteína multivalente, monoespecífica de ligação ao antígeno compreendendo dois, três, quatro ou mais anticorpos de acordo com a invenção.

Um aspecto ainda adicional da presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado, uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou molécula imunoconjugada biespecífica de acordo com a presente invenção juntamente com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente.

Em certas modalidades a formulação é uma formulação líquida, uma formulação liofilizada, uma formulação liofilizada que é reconstituída como um líquido, ou uma formulação em aerossol. Em determinadas modalidades, o anticorpo na formulação está a uma concentração de: cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 45 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, cerca de 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, ou cerca de 50 mg/mL a cerca de 250 mg/mL.

Em certas modalidades, a formulação compreende ainda um tampão. Tipicamente, o pH da formulação é de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5.

Em certas modalidades, o tampão pode compreender desde cerca de 4 mM a cerca de 60 mM de tampão de histidina, cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de tampão de succinato, ou cerca de 5 mM a 25 mM de tampão de acetato. Em certas modalidades, o tampão compreende cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 10 mM a 300 mM, tipicamente a uma concentração de cerca de 125 mM e citrato de sódio a uma concentração de cerca de 5 mM a 50 mM, tipicamente 25 mM. Em determinadas modalidades a formulação pode ainda compreender um agente tensoativo com uma concentração de cerca de 0% a cerca de 0,2%. Em certas modalidades o agente tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em, mas não limitado a: polissorbato-20, polisorbato-40, polisorbato-60, polisorbato-65, polisorbato-80, polisorbato-85, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o agente tensoativo é polissorbato-20. Em certas modalidades, a formulação compreende ainda cerca de 0,001% a cerca de 0,05% de Tween e pode ainda compreender cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 125 mM e citrato de sódio a uma concentração de cerca de 25 mM.

Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender adicionalmente, ou ser administrada a um indivíduo, juntamente com pelo menos um composto imunomodulador, tal como um composto imunosupressor, um anticorpo secundário ou seu fragmento, ou uma proteína recombinante.

Os elementos de anticorpos e de ligação da presente invenção podem também ser utilizados no diagnóstico, por exemplo, no diagnóstico in vivo e de imagem de estados de doença envolvendo Receptor tipo Toll 2, onde o anticorpo da invenção pode ser usado para alvejar e se ligar às células expressando Receptor tipo Toll 2. Além disso, em certas modalidades, uma molécula secundária ou composto pode ser conjugado ao anticorpo da invenção para uso no alvejamento da molécula secundária ou composto em relação às células que expressam Receptor tipo Toll 2.

Em certos aspectos adicionais, a presente invenção proporciona um kit para o tratamento ou prevenção das condições inflamatórias mediadas pelo Receptor tipo Toll 2 ou doenças. Em certas modalidades, os kits compreendem um anticorpo de acordo com a presente invenção ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é capaz de se ligar a Receptor tipo Toll 2 e antagonizar a sua atividade funcional, e instruções para a administração do mesmo a um paciente.

Ainda de acordo com um aspecto adicional, é proporcionado um anticorpo humanizado de neutralização ou uma porção de ligação ao antigeno do mesmo, onde o anticorpo se liga especificamente ao Receptor tipo Toll 2 de mamíferos com uma K_D de 1 x 1CT⁸ ou menos, mas não se liga ao CD32 (receptor Fc gama II), onde o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo presente no domínio extracelular do Receptor tipo Toll 2 como aquele ligado pelo anticorpo comercialmente disponível denominado T2.5.

De acordo ainda com um aspecto adicional, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado, ou a porção de ligação ao antigeno do mesmo, que liga um epítopo ao Receptor tipo Toll 2 de mamífero com uma K_D de 1 x 10”⁸ ou menos e que não se liga ao CD32 (receptor Fc gama II), onde o epítopo reconhecido por um anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Ainda de acordo com um aspecto adicional, é proporcionado um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga especificamente ao Receptor tipo Toll 2 de mamíferos e apresenta as seguintes propriedades:

- se liga ao Receptor tipo Toll 2 de mamíferos com uma K_D de IxlCT⁸ ou menos,

- não se liga ao CD32 (receptor Fc gama II)

- apresenta reação cruzada em relação ao Receptor tipo Toll 2 humano, Receptor tipo Toll 2 de murino e Receptor tipo Toll 2 de macaco.

Elementos de ligação do Fab

Em certas modalidades dos aspectos anteriores da invenção, um fragmento de anticorpo ou uma porção de ligação de antigeno de um anticorpo é fornecido pela invenção. Exemplos de fragmentos de ligação incluem um fragmento Fab, F'ab, ou F (ab')2, que é um fragmento monovalente que consiste em, ou consiste essencialmente nos domínios VL, VH, CL e CHI de um anticorpo heterotetraméricos. Em determinadas modalidades, o domínio VL apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e o domínio VH apresenta uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, os domínios CL e CHI se baseiam na sequência de aminoácidos de um domínio CL e CHI de uma imunoglobulina da subclasse IgG e isotipo IgG4, ou dos domínios CL e CHI como mostrado na SEQ ID NO: 5 da figura 5. Em certas modalidades, o fragmento Fab desta modalidade da invenção podem ser utilizado para o tratamento ou profilaxia das condições, incluindo, mas não se limitando à psoríase, dermatite e doença ocular incluindo uveite e AMD (degeneração macular relacionada com a idade).

Elementos de ligação de domínio único

Além de proporcionar um anticorpo monoclonal humanizado que apresenta especificidade de ligação para TLR2 e que antagoniza a função de TLR2, a presente invenção também se refere a outros elementos de ligação além dos anticorpos que compreendem um par de domínios de ligação com base na sequência de aminoácidos de uma região VL (variável de cadeia leve) tal como definido na SEQ ID NO: 1 e uma sequência de aminoácidos de uma região VH (variável de cadeia pesada) tal como definido na SEQ ID NO: 4. Especificamente, a invenção se estende a domínios de ligação única que se baseiam em ambas as regiões VL ou VH dos anticorpos humanizados dos anticorpos da invenção.

Consequentemente, em certas modalidades adicionais da presente invenção, é provido um elemento de ligação compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em um único domínio de ligação derivado do anticorpo humanizado da invenção. Em certas modalidades, o domínio de ligação único é derivado da sequência de aminoácidos de VH (domínio variável da cadeia pesada) tal como definido na

SEQ ID NO: 4. Tal domínio de ligação pode ser usado como um agente de segmentação para TLR2, como é conhecido que os domínios de imunoglobulina VH são capazes de se ligarem aos antigenos alvo de uma forma específica.

Modificação dos resíduos de CDR

Será apreciado pelos versados na técnica que as sequências das regiões de complementaridade (tal como definido nas SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 e 12), bem como sequências das regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas, sem perder a capacidade de se ligar especificamente a TLR2. Por exemplo, as regiões CDR dos elementos de ligação derivados dos anticorpos humanizados da presente invenção podem ser idênticas ou altamente homólogas (por exemplo, 95% de identidade de sequência ou mais) em relação às sequências de aminoácidos definidas no presente documento nas SEQ ID NOs: 7, 8, 9 , 10, 11 e 12. Conforme definido no presente documento, o termo altamente homólogas significa que 1 a 5 substituições de aminoácidos podem ser feitas para as sequências das CDRs. Em certas modalidades, o grau de homologia existente entre as respectivas CDRs, regiões hipervariáveis ou regiões variáveis e suas contrapartes não modificadas será pelo menos de 80%, de preferência 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% e mais preferencialmente superior a 98%. Tais sequências modificadas se encontram no escopo da presente invenção nos casos onde o elemento de ligação homólogo ou modificado mantém a capacidade de se ligar especificamente ao TLR2 e antagonizar sua atividade funcional.

Polinucleotideos

Nos vários aspectos adicionais, a presente invenção se estende aos polinucleotideos, e especificamente aos polinucleotideos isolados que codificam os anticorpos humanizados, fragmentos de anticorpos e os elementos de ligação da presente invenção.

Por conseguinte, em um aspecto adicional da presente invenção, é provido um polinucleotideo que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 4. Em determinadas modalidades, o polinucleotideo é um polinucleotideo isolado.

Tal como definido no presente documento, um polinucleotideo inclui qualquer poliribonucleotideo ou polidesoxirribonucleotideo, que pode ser DNA ou RNA não modificado ou RNA ou DNA modificado incluindo, sem limitação, RNA de filamento único ou duplo e RNA que é uma mistura de regiões de filamentos únicos ou duplos.

Um polinucleotideo da invenção, por exemplo, um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo ou polipeptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4, inclui suas variantes alélicas e/ou seus complementos, incluindo um polinucleotideo que híbrida em tais sequências de nucleotídeos, sob condições de estringência moderada ou elevada.

Em vários aspectos adicionais, a invenção se estende a um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 4. Além disso, a invenção se refere a uma célula hospedeira transformada com um tal vetor.

Linhagens de células hibridoma

Um aspecto ainda adicional da presente invenção proporciona uma linhagem celular híbrida (hibridoma), que expressa uma sequencia de aminoácido de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve variável de sequência de aminoácido ácido da SEQ ID NO: 4.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura IA mostra a SEQ ID NO: 1 que é a sequência de aminoácidos do domínio variável de uma cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção, a figura 1B mostra a sequência nucleotídica de cadeia leve variável (SEQ ID NO : 17) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 18) que foi numerada de acordo com Kabat.

A figura 2A mostra a SEQ ID NO: 4, que é a sequência de aminoácidos do domínio variável de uma cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção. A figura 2B mostra a sequência nucleotidica de cadeia pesada variável (SEQ ID NO: 19) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 20), que foi numerada de acordo com Kabat.

A figura 3 mostra a SEQ ID NO: 2, que representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção.

A figura 4 mostra a SEQ ID NO: 3, que mostra uma sequência de ácidos nucléicos que pode ser traduzida para codificar a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

A figura 5 mostra a SEQ ID NO: 5, que é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a invenção.

A figura 6 mostra a SEQ ID NO: 6, que é uma sequência de ácidos nucléicos que pode ser traduzida para codificar a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

A figura 7 mostra a SEQ ID NO:15 que provê a sequência de aminoácidos do Receptor tipo Toll 2 humano.

A figura 8 mostra a SEQ ID NO: 16 que fornece a sequência de aminoácidos do Receptor tipo Toll 2 de murino.

A figura 9 mostra que o antagonismo do Receptor tipo Toll 2 mediado por OPN-305 não depende da ligação do anticorpo ao CD32, com o grupo 1 mostrando a adição de um anticorpo de cabra de controle, o grupo 2 mostrando a adição de um anticorpo de bloqueio anti-hCD32a de cabra e o grupo 3 mostrando a adição de um anticorpo de bloqueio anti-hCD32b de cabra.

A figura 10 mostra que o antagonismo do Receptor tipo Toll 2 mediado pelo anticorpo monoclonal OPN301 depende da ligação do anticorpo ao CD32 (figura 10A), considerando-se que o antagonismo do Receptor tipo Toll 2 mediado por OPN305 não depende da ligação do anticorpo a CD32 (figura 10B) .

A figura 11 mostra os resultados da análise de FACS que mostraram que OPN-305 tem especificidade de ligação para o Receptor tipo Toll 2 humano (Figura 11A), enquanto que um anticorpo de controle de isotipo IgG4 não compete com OPN-301 para se ligar ao Receptor tipo Toll 2 (Figura 11 B) .

A figura 12 mostra que OPN-305 (OPN-305-21) suprime respostas de TLR2 de murino de um modo equivalente ao anticorpo OPN-301 de murino.

A figura 13 mostra 3 traços de análise FACS que mostram que OPN-305 se liga ao TLR2 de macaco que é expresso nos granulócitos (figura 13A) e monócitos (figura 13B), mas não nos linfócitos (figura 13C).

A figura 14 mostra 2 traços de análise FACS que mostram que OPN-305 compete com o anticorpo monoclonal de murino OPN-301 anti-TLR2 para a ligação ao TLR2 de macaco, onde a figura 14(A) mostra os resultados para granulócitos e a figura 14(B) mostra os resultados para monócitos.

As figuras 15(A) e (B) mostram traços de amostras de anticorpos que tenham sido polidas por cromatografia de exclusão por tamanho sobre uma coluna 16/60 Sephacryl S200. A figura 15(A) mostra um anticorpo quimérico anti-TLR2, a figura 15(B) mostra o anticorpo OPN305 (VK5A/H4). Em cada caso, as frações de intervalo do pico monomérico B8 a B4 foram coletadas.

A figura 16 mostra a pré-classificação das amostras de teste para a citotoxicidade e a atividade de modulação de células T testada em 4 amostras de doador. A amostra 1 (primeira coluna de cada grupo (barra preta)) é um anticorpo quimérico anti-TLR2, a amostra 2 (segunda coluna de cada grupo de resultados (barra branca) é VK5A/H4 (OPN305), a amostra 3 (terceira barra (cinza escuro) é um anticorpo comparativo denominado VK5A/H5 juntamente com KLH, enquanto que a amostra 4 (quarta barra do lado direito de cada grupo (cinza claro)) é apenas um controle KLH. Os resultados mostram as contagens de células viáveis no dia 7. S.I.s das amostras incubadas na presença de KLH foram comparados aos de KLH sozinho. S.I.s foram ponderados no quarto dia do período de amostragem. O corte para determinação das respostas positivas foi com um Si maior ou igual a 2.

As figura 17 (A) , (B) e (C) mostram 3 gráficos de barras que mostram os resultados dos testes Episcreen. Os anticorpos quiméricos anti-TLR2, VK5A/H4 e VK5A/H5 foram testados em ensaios de célula T de curso de tempo EpiScreen™ usando PBMC de 21 doadores. Culturas em volume de PBMC incubadas com anticorpos de teste foram amostradas nos dias 5, 6, 7 e 8 e pulsadas com ³H-Timidina. As células foram colhidas e a incorporação da radioatividade medida por contagem em cintilação. Os resultados para cada amostra em triplicata foram calculados e normalizado por conversão no índice de Estimulação (SI) . O SI para cada ponto de tempo com cada doador é mostrado acima para (a) o anticorpo quimérico, (b) o anticorpo OPN-305 anti-TLR2 (denominado VK5A/H4), (c) um anticorpo comparativo anti-TLR2 denominado VK5A/H5. O corte para determinação de respostas positivas com Si igual ou superior a 2 é destacado pela linha preta grossa horizontal e respostas significativas (p <0,05 em um teste t de Student) são indicadas (*).

A figura 18 mostra uma comparação da imunogenicidade prevista usando EPISCREEN™ Tecnologia e imunogenicidade observada em um ambiente clínico. 16 proteínas terapêuticas foram testadas quanto ao seu risco relativo de imunogenicidade utilizando tecnologia EPISCREEN™. Os resultados foram colocados em gráficos contra a frequência de imunogenicidade (respostas de anticorpos antiterapêuticos) observados para cada proteína, quando utilizados na clínica (dados provenientes de PubMed). A linha de regressão e o coeficiente de correlação são mostrados.

A figura 19 mostra um alinhamento da sequência da reqião variável de cadeia leve de aminoácidos do anticorpo monoclonal OPN-305 anti-TLR2 (SEQ ID NO: 22) e o anticorpo monoclonal T2.5 anti-TLR2 de murino (SEQ ID NO: 21), onde a identidade de sequência determinada é mostrada como sendo de 89,2%.

A figura 20 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal OPN-305 anti-TLR2 (SEQ ID NO: 24) e o anticorpo monoclonal T2.5 anti-TLR2 de murino (SEQ ID NO: 23), onde a identidade de sequência determinada é mostrada como sendo de 88,1%.

A fiqura 21 mostra que a inibição completa da sinalização dependente de TLR2 é obtida com menos que a ligação de receptor máxima de OPN-305. A inibição da atividade de NF-kB é observada em um modo dependente da dose seguindo-se o tratamento com Pam3Csk4 (figuras 21A e

B). OPN-305 inibe quase plenamente a atividade de NF-kB, em concentrações de 2 pg/mL (figura 21C).

A figura 22A mostra atividade de SEAP dependente de NF-kB versus [Pam3CSK4], enquanto a figura 22B mostra um Gráfico Lineweaver Burk de 1/V versus 1/S.

A figura 23 mostra 3 gráficos A, B e C, ilustrando que as respostas mediadas pelo Receptor Tipo Toll para flagelina (TLR5, figura 230) e LPS (TLR4, figura 23B) foram inalteradas quando comparadas às células de controle não expostas a OPN-305. Como esperado, as respostas mediadas pelo Receptor tipo Toll 2 para Pam3CSK e FSL-1 foram bloqueadas por OPN-305 (figura 23A) . Isso sugere que OPN305 não está provocando um aumento inesperado ou diminuição da resposta de TLR4 ou TLR5 aos ligantes.

A figura 24 mostra que o anticorpo monoclonal OPN-305 inibe sépsis induzida por Pam3Csk4. Grupos de fêmeas de macacos BALB/c (n = 4) foram tratados com OPN-305, nas doses indicadas de 30 minutos antes do tratamento com 100 pg de Pam3Csk4.

A figura 25 mostra que OPN305 sépsis induzida por Pam3Csk4. Neste experimento, OPN305 foi administrado por via intravenosa 30 minutos antes da administração intraperitoneal de 100 pg de Pam3Csk4. Quatro horas mais tarde, os camundongos foram sacrificados por anestesia letal e o sangue foi colhido. 0 soro foi derivado e as concentrações de citocina foram determinadas por ELISA. Os soros foram diluídos a 1/10 para KC e IL 12p40 e 1/5 para a IL-6 ELISAs.

A figura 26 mostra que TLR2 é expresso em macrófagos alveolares de camundongos (NR8383), e é detectado usando OPN305. (A) células não coradas, (B) controle positivo; anticorpo primário de TLR2 anti-rato de coelho, policlonal, anticorpo secundário era o Alexa-Fluor 488 anti-coelho; (C) Células tratadas com IgG4 humano policlonal, anticorpo secundário era anti-IgG4 PE humano; (D) Células coradas de OPN305, anticorpo secundário anti-IgG4 PE humano.

A figura 27 mostra que TLR2 é expresso em PBMCs de porco e é corado por OPN305. PBMCs foram purificados por separação usando Ficoll. A-C representam PBMCs de Pig 666 e D-F é de Pig 488. A, D não são corados; Β, E são marcados como IgG4 policlonal humano, seguido por coloração secundária com IgG4 anti-humano marcado com PE; C, F são marcados com OPN-305, seguido por IgG4 anti-humano marcado com PE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal plenamente humano que apresenta especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2 e que, quando ligado ao

Receptor tipo Toll 2, antagoniza a atividade funcional do Receptor tipo Toll 2. A invenção proporciona ainda fragmentos de ligação derivados de anticorpo plenamente humano e adicionalmente elementos de ligação que compreendem, consistem ou consistem essencialmente na sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e/ou a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 4.

O termo função antagonizante do Receptor tipo Toll 2, ou termos similares, tais como antagonista de Receptor tipo Toll 2 ou agonista do Receptor tipo Toll 2 significam que o anticorpo, fragmento ou elemento de ligação se ligam especificamente ao Receptor tipo Toll 2 e inibem ou bloqueiam a ligação de um ligante ou composto de ligação ao Receptor tipo Toll 2, que por sua vez causaria a ativação do Receptor tipo Toll 2, por exemplo, um ligante de Receptor tipo Toll 2. O anticorpo, fragmento ou elemento de ligação pode inibir, adicionalmente, a ativação do Receptor tipo Toll 2 e funciona inibindo ou suprimindo a sinalização intracelular mediada pelo Receptor tipo Toll 2, seguindo-se a ligação de um ligante de Receptor tipo Toll 2. A ativação de Receptor tipo Toll 2 e sinalização mediada a jusante significam qualquer via de sinalização intracelular que é induzida por ativação de TLR2. A via de sinalização pode ser uma via especifica para TLR2, ou pode ser uma via de sinalização compartilhada, por exemplo, onde a via de sinalização pode ser ativada por outras fontes, por exemplo, por meio da ativação de receptores diferentes de TLR2 que contribuem para a ativação de mediadores da resposta imune, tais como, o fator de transcrição NF-kappaB.

TLR2 é conhecido por dimerização em dois heterodimeros funcionais. Especificamente, TLR2 é conhecido por formar um heterodimero tanto com Receptor Tipo Toll 1 quanto Receptor Tipo Toll 6. É possível que mais heterodimeros sejam formados com Receptor Tipo Toll 4 (TLR4, TLR-4) e Receptor Tipo Toll 10 (TLR10, TLR-10). Acredita-se que a dimerização seja associada a uma discriminação que resulta na ligação do TLR2 por diferentes ligantes derivados de micróbio. O inventor verificou que os anticorpos humanizados da invenção funcionam para antagonizar a função de TLR2 independentemente se o Receptor tipo Toll 2 forma um heterodimero com Receptor Tipo Toll 1 ou Receptor Tipo Toll 6.

Epitopo de ligação do anticorpo

Os anticorpos humanizados da presente invenção, ou os seus fragmentos, ou elementos de ligação com base nos mesmos se ligam seletivamente ao Receptor tipo Toll 2 e antagonizam a sua função. Os anticorpos monoclonais podem bloquear a ativação de um receptor por seu ligante por ligação próximo ao sitio de ligação ao ligante do receptor, isto resultando em impedimento estérico que inibe o acesso do ligante ao sitio de ligação ao ligante.

Sem limitar-se à teoria, o inventor identificou o sitio de ligação que é ligado pelos anticorpos humanizados de acordo com a presente invenção. 0 anticorpo se liga a um epitopo que compreende resíduos derivados tanto dos domínios de N-terminal e C-terminal do domínio extracelular maduro do Receptor tipo Toll 2 (TLR2) . Em determinadas modalidades, o epitopo compreende resíduos de aminoácidos 19 a 39 do N-terminal do Receptor tipo Toll 2, tal como determinado a partir da sequência de 586 aminoácidos do Receptor tipo Toll 2, ditos aminoácidos sendo KEESSNQASLSCDRNGICKGS (SEQ ID NO: 13). O epitopo de ligação compreende ainda resíduos dos aminoácidos 538 a 549, de Receptor tipo Toll 2, tal como presentes na região de término C da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, esta sequência compreendendo os aminoácidos CSCEFLSFTQEQQ (SEQ ID NO: 14) .

Reatividade cruzada

Tipicamente, o TLR2 que é antagonizado pelos anticorpos, fragmentos de anticorpos ou elementos de ligação da presente invenção é um TLR2 de mamíferos (ou uma variante funcional do mesmo), por exemplo, TLR2 humano ou TLR2 de murino. Em certas modalidades, o TLR2 antagonizado é a forma humana de TLR2 possuindo a sequência de aminoácidos conforme definida na figura 7 como SEQ ID NO: 15, que compreende a sequência de Receptor Tipo Toll humana de comprimento pleno de 784 aminoácidos, tal como definida como GenBank número de acesso AAC 34.133 (www.ncbi.nlm.nih.gov URL).

Em certas modalidades adicionais, o Receptor tipo Toll 2 é TLR2 de murino, este compreendendo a sequência de aminoácidos definida figura 8 como SEQ ID NO: 16., como derivada do GenBank número de acesso NP_036035 (Mus musculus)

Em certas modalidades, os anticorpos, fragmentos de anticorpos ou elementos de ligação da presente invenção servem para antagonizar a atividade funcional ou sinalização do Receptor tipo Toll 2, expresso em células de macaco.

Em certas modalidades adicionais, o anticorpo pode ter uma constante de dissociação (Kd) selecionada a partir do

grupo	consistindo em:	(i)	uma	constante	de	dissociação
entre	IO’⁷ M e IO’¹¹ M,	(ü)	uma	constante	de	dissociação
entre	ICT⁸ M e IO’⁹ M	(iü)	uma	constante	de	dissociação

entre 10~⁹ M e ΙΟ”¹⁰ Μ, (iv) uma constante de dissociação entre 10^-11 M e 10”¹² M. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos podem se ligar ao Receptor tipo Toll 2 de humano ou murino com uma Kd de 3 x 10“⁸ ou menos ou 4 x 10’⁸ ou menos.

A ligação de um anticorpo da invenção ao Receptor tipo Toll 2 pode, portanto, resultar no bloqueio da sinalização intracelular, que está associada à interação ligante/receptor de TLR2 e seu ligante.

Estrutura do anticorpo

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção são plenamente humanos. Isto é, os resíduos de aminoácidos que compreendem o anticorpo são derivados das espécies humanas em oposição a, por exemplo, um camundongo. O anticorpo da invenção é, portanto, menos imunogênico que um anticorpo de murino ou um anticorpo quimérico, tal como um anticorpo de camundongo/humano.

A imunogenicidade, que resulta da administração de um anticorpo de murino ou quimérico provou ser a barreira mais significativa para a utilização terapêutica de anticorpos monoclonais. Por conseguinte, o fornecimento de um anticorpo plenamente humano supera os problemas associados com o fornecimento de anticorpos quiméricos de murinos, humanos/de camundongo os quais, quando administrados a um indivíduo mais de uma vez, podem resultar em uma reação imunogênica, tal como uma resposta HAMA, sendo dirigida contra o anticorpo. Esta resposta limpa o anticorpo de murino ou quimérico do soro do individuo, impedindo assim que os anticorpos alcancem seu alvo e produzam seu efeito terapêutico pretendido. Consequentemente, o anticorpo plenamente humano da presente invenção confere uma vantagem significativa sobre tais anticorpos murinos e quiméricos.

Uma causa intrínseca de imunogenicidade contra um anticorpo são epítopos de células T CD4 + presentes no anticorpo. Por conseguinte, os fragmentos de anticorpo e de ligação da presente invenção foram analisados para identificar e modificar quaisquer epítopos de célula T CD4+ presentes no anticorpo ou fragmento de anticorpo. Este processo reduz ainda mais a imunogenicidade dos fragmentos de anticorpo e do anticorpo da invenção.

Além disso, os fragmentos de anticorpo ou anticorpo da invenção podem ser submetidos a uma ou mais técnicas que podem ainda ser utilizados para assegurar que uma resposta imunogênica não seja montado contra o anticorpo quando administrado a um indivíduo. Exemplos de tais técnicas serão bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, porém não estão limitados à desimunização, rearranjo dos genes e peguilação.

Além disso, a fim de melhorar a função biológica ou atividade terapêutica de um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção, as técnicas de otimização podem ser empregadas. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a modificação dos seguintes atributos do anticorpo: potência, afinidade, especificidade de ligação, K on (taxa de associação constante), K off (taxa constante de dissociação), estabilidade termodinâmica, solubilidade, meia vida sérica, expressão, cinética de enovelamento, suscetibilidade a protease, função efetora da região de Fc e reciclagem de medicamento. A função biológica ou atividade terapêutica que pode ser modulada inclui, mas não está limitada a: aumento da eficácia, perfil farmacocinético aperfeiçoado, conveniência melhorada do paciente, redução do custo das mercadorias, perfil de segurança aperfeiçoado, imunogenicidade reduzida e vida útil prolongada.

Tratamento de doença mediada por TLR2

Os anticorpos humanizados, fragmentos de anticorpos e os elementos de ligação da presente invenção podem induzir a imunossupressão (supressão de uma resposta imune, mais especificamente uma resposta imune pró-inflamatória), especificamente por supressão da ativação e sinalização mediadas pelo Receptor tipo Toll 2. Esta supressão da função do Receptor tipo Toll 2 foi identificada pelo inventor como tendo utilidade no tratamento ou prevenção de condições de doença, nas quais a ativação e sinalização do Receptor tipo Toll 2 contribuem para o aparecimento ou progressão da doença.

Um anticorpo da invenção pode ser utilizado, por exemplo, in vitro, ex vivo, e nos métodos terapêuticos in vi vo.

Em certos aspectos adicionais, a invenção se estende ao uso dos anticorpos, fragmentos de anticorpos ou elementos de ligação da invenção para o tratamento de condições de doença mediadas por ativação e sinalização do Receptor tipo Toll 2.

tratamento da isquemia

Consequentemente, em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método para o tratamento e/ou profilaxia de lesão isquêmica por reperfusão ou a condição assim causada ou associada a mesma, o método compreendendo as etapas de:

- provisão de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado, ou fragmento de ligação do mesmo conforme definido no presente documento, e

- administração do referido composto a um indivíduo em necessidade de tal tratamento.

Um aspecto ainda adicional da invenção proporciona um anticorpo plenamente humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo para utilização no tratamento de lesão isquêmica por reperfusão ou uma condição cardíaca inflamatória que é mediada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante de Receptor tipo Toll 2.

Um aspecto adicional provê ainda o emprego de um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um seu fragmento ou um elemento de ligação derivado do mesmo na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da lesão por reperfusão isquêmica isquemia ou de uma condição cardíaca inflamatória que é mediada na totalidade ou em parte por ativação de Receptor tipo Toll 2 por um ligante de Receptor tipo Toll 2.

Em certas modalidades, a condição cardíaca inflamatória resulta da ocorrência de lesão por reperfusão e pode ser selecionada do grupo compreendendo, porém não limitado a: isquemia do miocárdio, doença cardíaca isquêmica, isquemia do miocárdio por hipertensão, insuficiência cardíaca congestiva, isquemia do tecido, isquemia do órgão, síndrome coronariana aguda, hipertrofia, infarto cerebral, infarto do miocárdio, arritmia, lesão isquêmica por reperfusão (lesão I/R).

A isquemia é causada quando um órgão ou parte do corpo para de receber um fornecimento de sangue suficiente. Um órgão que é privado de um suprimento adequado de sangue é dito como sendo hipóxico. A reperfusão ocorre quando o fluxo de sangue recomeça a um órgão depois da privação temporária. A lesão de reperfusão se refere aos danos que ocorrem a um tecido ou em um órgão quando do retorno do fornecimento de sangue a um tecido após um período de isquemia. A ausência de oxigênio e nutrientes durante o período de isquemia resulta em um período de inflamação e lesão oxidativa quando a circulação retorna. Exemplos de lesão isquêmica por reperfusão incluem hipoxia, acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, insuficiência renal crônica ou transplante de órgãos.

Em certas modalidades, os métodos deste aspecto da invenção podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção da lesão de isquemia por reperfusão o que pode resultar de transplante de órqãos, em um indivíduo. Em certas modalidades, o anticorpo da invenção pode ser utilizado para o tratamento e/ou prevenção da isquemia que pode resultar de transplantes de órgãos sólidos.

Um aspecto ainda adicional da presente invenção proporciona um método de redução de uma ou mais atividades biológicas do Receptor tipo Toll 2 (TLR2) em uma célula expressando TLR2 ou tecido implicado na lesão isquemia por reperfusão associada ao transplante de órgãos sólidos em um indivíduo, compreendendo:

- contato da célula ou tecido com um anticorpo antagonístico de Receptor tipo Toll 2 de acordo com a presente invenção, em uma quantidade suficiente para reduzir uma ou mais atividades biológicas de TLR2 na célula ou tecido.

Em certas modalidades a célula ou tecido expressando TLR2 é uma célula ou tecido do miocárdio. Em certas modalidades a célula ou tecido expressando TLR2 é uma célula ou tecido envolvido com uma condição inflamatória cardíaca induzida por reperfusão selecionada do grupo que compreende, mas não está limitado a: isquemia do miocárdio, doença cardíaca isquêmica, isquemia do miocárdio por hipertensão, insuficiência cardíaca congestiva, isquemia do tecido, isquemia de órgãos, síndrome coronariana aguda, hipertrofia, infarto cerebral, infarto do miocárdio, arritmia, lesão isquêmica por reperfusão (lesão I/R).

Em certas modalidades o método é realizado em um indivíduo humano apresentando ou em risco de apresentar lesão isquêmica por reperfusão.

Um aspecto adicional da presente invenção se refere ao uso de um anticorpo de acordo com a presente invenção, ou um fragmento de ligação do mesmo, para uso no tratamento ou prevenção da isquemia e reperfusão associadas ao transplante de órgãos sólidos.

Tratamento de doença autoimune

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença autoimune ou condição associada à mesma, o método compreendendo as etapas de:

- administração do dito composto a um indivíduo que necessite de tal tratamento.

Um aspecto adicional da invenção provê um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo para uso no tratamento de uma doença autoimune que é mediada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante do Receptor Tipo Toll-2.

Um aspecto adicional provê ainda o emprego de um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença autoimune que é mediada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante do Receptor tipo Toll 2.

Em certas modalidades, a doença autoimune é artrite autoimune, em especial, artrite reumatóide. Em certas modalidades, a doença autoimune é selecionada do grupo compreendendo psoriase, dermatite. Em certas modalidades, a doença autoimune é o diabetes. Normalmente, o diabetes é o diabetes mellitus. Em certas modalidades, o diabetes é diabetes mellitus Tipo 1. Em certas modalidades, o diabetes é diabetes mellitus Tipo 2.

Em certas modalidades, a condição que resulta do indivíduo que apresenta diabetes pode ser denominada uma complicação diabética. Tais complicações diabéticas podem ser complicações agudas, complicações crônicas ou uma combinação de ambas.

Quando a complicação diabética for uma complicação aguda, a complicação pode ser selecionada a partir do grupo que compreende, mas não se limita à retinopatia, neuropatia, transtornos da circulação periférica, ulcerações da pele, poliúria, polidipsia, polifagia, cetoacidose diabética (CAD) e estado hiperosmolar não cetótico. Em determinadas modalidades adicionais a condição pode ser uma condição que resulta a partir de qualquer uma das condições anteriores agudas ou crônicas podendo incluir, mas não limitada à cegueira, proteinúria, dor, entorpecimento, psicroestesia, claudicação intermitente e gangrena.

Em certas modalidades adicionais a complicação diabética pode ser uma complicação crônica, tal como a doença vascular resultante da elevação crônica dos níveis de glicose no sangue conduzindo à lesão nos vasos sanguíneos (angiopatia). Em tais modalidades, onde ocorre lesão vascular aos vasos sanguíneos pequenos, isto pode levar à microangiopatia, o que pode conduzir a um ou mais dentre retinopatia diabética, neuropatia diabética e nefropatia diabética.

Ainda de acordo com um aspecto adicional da invenção é provido um método para tratar ou prevenir um transtorno associado à obesidade em um indivíduo, o qual é mediado na totalidade ou em parte pela ativação de Receptor tipo Toll 2 por um ligante do Receptor tipo Toll 2, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores da presente invenção, ou uma ligação derivada dos mesmos.

Ainda um aspecto adicional da invenção provê um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo para utilização no tratamento e/ou prevenção da obesidade que é mediada na totalidade ou em parte pela ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante do Receptor tipo Toll 2.

Um aspecto adicional provê ainda a utilização de um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de condições de doença que estejam associadas com a obesidade, onde a condição é causada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante de Receptor tipo Toll 2.

Em certas modalidades o transtorno associado à obesidade é pelo menos uma condição selecionada dentre o grupo que compreende, mas não se limita à diabetes, especificamente, diabetes mellitus Tipo 2, resistência à insulina, diminuição da depuração da hiperinsulinêmica, dislipidemia, doença do fígado gorduroso não alcoólica, hipertensão, inflamação, hepatomegalia, esteatose hepática, infarto do miocárdio, asma ou acidente vascular cerebral.

Um aspecto adicional da presente invenção provê um método para o tratamento da resistência à insulina em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a presente invenção ou um elemento de ligação fornecido pela presente invenção.

Ainda um aspecto adicional da invenção provê um anticorpo humanizado, fragmento do mesmo ou um elemento de ligação derivado do mesmo para utilização no tratamento de resistência à insulina em um indivíduo que é mediado na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante do Receptor tipo Toll 2.

Um aspecto adicional provê ainda a utilização de um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da resistência à insulina em um indivíduo que é mediada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante do Receptor tipo Toll 2.

Tratamento de doença ocular

Em certos aspectos adicionais, a presente invenção se estende aos métodos para o tratamento e/ou profilaxia da doença ocular, onde os ditos métodos compreendem as etapas de:

- provisão de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado, fragmento de ligação ou elemento de ligação de ligação provido pela presente invenção, e

- administração do referido composto a um indivíduo que necessite de tal tratamento.

Ainda um aspecto adicional da presente invenção provê a utilização de um anticorpo de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo para tratar ou prevenir doenças oculares.

Em certas modalidades, a doença ocular é uveite ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD).

Tratamento de inflamação renal

Ainda um aspecto adicional da presente invenção provê um método para o tratamento e/ou profilaxia de inflamação renal e doença ou de uma condição causada desta forma ou associada à mesma, o método compreendendo as etapas de:

- provisão de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado, fragmento de ligação, ou elemento de ligação fornecido pela presente invenção, e

Ainda um aspecto adicional da invenção provê um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo para uso no tratamento de inflamação renal ou doença renal que é mediada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante de Receptor tipo Toll 2

Ainda um aspecto adicional provê o uso de um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, ou um elemento de ligação derivado do mesmo na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de inflamação renal ou doença renal que é mediada na totalidade ou em parte por ativação do Receptor tipo Toll 2 por um ligante de Receptor tipo Toll 2.

Conforme definido no presente documento, os termos inflamação renal e doença renal se estendem às condições que são substancialmente caraterizadas pela ocorrência de inflamação nos rins, ou células renais, ou onde a ocorrência de inflamação nos rins é causada por uma doença ou uma condição inflamatória que afeta principalmente um sitio no corpo que não sejam os rins. Especificamente, a inflamação pode ocorrer em um sitio, incluindo, mas não se limitado ao glomérulo, cápsula de Bowman ou espaço de Bowman. Tipicamente, a inflamação resulta pelo menos em insuficiência parcial da função da função renal e/ou insuficiência renal.

Em certas modalidades, a inflamação e a doença renal incluem doença renal, onde o termo doença renal se refere geralmente a um distúrbio de pelo menos um rim em um ser humano, onde os transtornos comprometem ou prejudicam a função dos rins, isto sendo caracterizado fisiologicamente, por exemplo, por perda de proteínas pela urina ou por excreção de resíduos nitrogenados. A doença renal também pode resultar de uma patologia primária dos rins, tal como lesões no glomérulo ou túbulo, ou de lesão em outro órgão, tal como o pâncreas, o que afeta negativamente a capacidade dos rins de executar funções biológicas, tais como a retenção de proteínas. Assim, a doença renal em seres humanos pode ser o efeito direto ou indireto de uma condição de doença que possa afetar outros órgãos. Exemplos de doenças que afetam os rins, mas que não visam especificamente os rins são o diabetes e lúpus sistêmico. Os termos doença renal e doença hepática são empregado no presente documentos indiferentemente com a frase doenças renais. A doença renal pode resultar, por exemplo, ou ser uma consequência de qualquer alteração, lesão ou trauma aos glomérulos, túbulos ou tecido intersticial em ambos o córtex dos rins ou medula dos rins.

Em certas modalidades, a doença renal pode também ser uma doença renal progressiva. O termo doença renal progressiva tal como empregado no presente documento no presente documento se refere a qualquer doença do renal que ao longo do tempo (por exemplo, dias, semanas, meses, anos) leva a uma perda da função renal. Tal como definido no presente documento, o termo função renal se refere geralmente a uma propriedade fisiológica dos rins, tal como a capacidade de reter as proteínas pelo que prevenindo a proteinúria (por exemplo, albuminúria). A função renal pode ser avaliada, por exemplo, pela taxa de filtração glomerular (por exemplo, a depuração da creatinina), a excreção de proteínas na urina, por exemplo, albuminúria, nitrogênio na uréia sanguínea, creatinina no soro ou plasma ou qualquer combinação destas.

Exemplos de condições específicas que se encontram dentro do significado do termo inflamação e doença renal incluem, mas não estão limitados às: alterações renais que incluem, mas não estão limitados à falência renal crônica, falência renal aguda, nefrite nefrotóxica heteróloga, glomerulonefrite, esclerose do glomérulo, lúpus eritematoso sistêmico (LES), nefropatia diabética, nefropatia diabética onde a nefropatia diabética acompanha a esclerose do fígado, e glomerulonefrite, onde a glomerulonefrite é acompanhada pela esclerose do fígado.

Em certas modalidades, a inflamação e doença renal pode se relacionar a uma doença imune mediada que afeta as células dos rins e/ou função renal. Tais condições podem incluir, mas não estão limitados à nefropatia da imunoglobulina A, glomerulonefrite membranoproliferativa, glomerulonefrite proliferativa mesangial, glomerulonefrite não proliferativa, glomerulonefrite membranosa, doença de alterações mínimas, glomerulonefrite segmentar focal primária (GESF), glomerulonefrite fibrilar, glomerulonefrite imunotactóide, glomerulonefrite proliferativa, glomerulonefrite progressiva, doença antiGBM, isquemia renal, vasculite renal, incluindo doença associada aos anticorpos citoplásmicos antineutrófilos (ANCA), por exemplo, granulomatose de Wegener), glomerulonefrite associada à crioglobulenemia de nefrite lúpus, endocardite bateriana, púrpura de Henoch-Schõnlein, glomerulonefrite pós infecciosa, hepatite C, nefropatia diabética, miloidose, nefroesclerose hipertensiva, doença da cadeia leve de múltiplos mielomas, glomeruloesclerose focal secundária e nefroesclerose hipertensiva.

O termo inflamação e doença renal também engloba igualmente a insuficiência renal aguda. A insuficiência renal aguda (ARF) se refere às condições clinicas associadas a azotemia rápida de crescimento constante, com ou sem oligúria (<500 mL/dia) . A causa da ARF pode ser agrupada em três categorias de diagnóstico: pré-renal (perfusão renal inadequada); pós-renal (obstrução), e renais. A fisiopatologia da ARF é complexa e multifatorial. Conceitos atuais sugerem que a ARF possa resultar de lesão tubular renal direta, isquemia renal ou intratubular obstrução. Clinicamente, ARF resulta na filtração glomerular diminuída e secreção reduzida de produtos residuais metabólicos, água e eletrólitos. A sobrecarga de fluido, desequilíbrios de eletrólito e a síndrome urêmica resultam em disfunção do órgão. A disfunção do órgão pode de modo final resultar em morte.

Em vários aspectos adicionais, a presente invenção se estende aos métodos de modulação de uma função (por exemplo, alterando uma ou mais atividades biológicas de TLR2) em uma célula e/ou tecido sensível ao TLR2 (por exemplo, um tecido que tenha sido submetido a isquemia, que pode sofrer isquemia, ou que pode ser submetido a reperfusão, uma das células beta das ilhotas de Langerhans do pâncreas, ou qualquer tipo de célula que expresse TLR2 e que esteja implicada em uma condição de doença mediada por TLR2, ou o desenvolvimento do mesmo). O método inclui contato da célula sensível ao TLR2 e/ou tecido sensível ao TLR2 com um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação do mesmo, tal como provido pela invenção, em uma quantidade suficiente para antagonizar a função da célula ou tecido sensível ao TLR2, ou a atividade biológica de TLR2 na célula ou tecido. Em uma modalidade, a etapa de contato pode ser efetuada in vitro, por exemplo, em um lisado de células ou em um sistema reconstituído. Alternativamente, o método em questão pode ser realizado em células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo. Por exemplo, células, tais como células recombinantes ou purificadas podem ser cultivadas in vitro e a etapa de contato pode ser efetuada adicionando o modulador TLR2 ao meio de cultura. Tipicamente, a célula sensível ao TLR2 é uma célula de mamífero, tal como uma célula humana. Em algumas modalidades, o tecido sensível ao TLR2 é um tecido que foi submetido à isquemia e que pode ser submetido à reperfusão ou é uma população de células associadas ao mesmo. Em outras modalidades, o método pode ser realizado em células presentes em um indivíduo, por exemplo, como parte de um protocolo in vivo, ou em um indivíduo animal (incluindo, por exemplo, um indivíduo humano, ou um modelo animal in vivo) .

protocolo in vivo pode ser terapêutico ou profilático, e o modelo inflamatório pode ser, por exemplo, um modelo geneticamente modificado, tal como um modelo animal apresentando TLR2 superexpresso ou uma mutação ou deleção de um receptor de TLR. Para métodos in vivo, o anticorpo humanizado ou um seu fragmento pode ser provido sozinho ou em combinação com outro agente, tal como um terapêutico secundário, tais como um medicamento antiinflamatório, ou um veículo farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente. Tipicamente, o anticorpo é administrado a um indivíduo que sofre ou em risco de sofrer da condição mediada por TLR2, tal como, artrite reumatóide, lesão isquêmica por reperfusão, diabetes ou inflamação renal, em uma quantidade suficiente para antagonizar uma ou mais atividades ou funções mediadas por TLR2 no indivíduo. Em certas modalidades, a quantidade ou a dosagem do anticorpo anti-TLR2 humanizado da invenção que é administrada pode ser determinada antes da administração por meio de testes in vitro ou ex vivo, a quantidade de anticorpo necessária para alterar, por exemplo, diminuir ou inibir uma ou mais atividades funcionais do TLR2, a referida atividade funcional sendo tipicamente uma ou mais atividades biológicas TLR2 descritas no referido documento.

Entende-se que qualquer um dos métodos terapêuticos acima possa ser realizado utilizando um imunoconjugado da invenção no lugar ou além dos anticorpos anti-TLR2, ou fragmento de anticorpo de ligação da invenção.

Em certos aspectos adicionais, a invenção se estende ao uso dos anticorpos da presente invenção em aplicações de diagnóstico. Como tal, um aspecto adicional da invenção provê um método de diagnóstico de uma doença associada com a expressão aumentada de Receptor tipo Toll 2. Em certas modalidades, o método compreende o contato de uma célula de teste com um anticorpo anti-TLR2 da invenção; determinação do nível de expressão (quantitativa ou qualitativamente) de

TLR2 pela célula de teste através da detecção e ligação do

anticorpo	anti-TLR2 para	TLR2 ;	e	comparando	0	nível de
expressão	de TLR2 pela	célula	de	teste com	0	nível de
expressão	de TLR2 por uma	célula	de	controle	(por	exemplo,

uma célula normal da mesma origem do tecido como a célula de teste ou uma célula que expressa TLR2 em níveis comparáveis a tal célula normal) onde um nível mais elevado de expressão de TLR2 pela célula de teste em comparação com a célula de controle indica a presença de um distúrbio associado à expressão aumentada de TLR2. Em certas modalidades, a célula de ensaio é obtida a partir de um indivíduo suspeito de ter um distúrbio associado com expressão aumentada de TLR2. Em certas modalidades, o distúrbio é um transtorno inflamatório ou transtorno mediado imune, tal como descrito no presente documento anteriormente.

Efeito terapêutico

O inventor verificou que o anticorpo anti-TLR2 humanizado que é provido no presente documento é terapeuticamente mais desejável que os anticorpos monoclonais anti-TLR2 de murinos que são conhecidos na técnica.

Além das diferenças estruturais existentes entre os domínios variáveis da cadeia leve e pesada dos anticorpos humanizados da presente invenção e os anticorpos anti-TLR2 de murino da técnica anterior, o inventor identificou também de forma surpreendente um número de vantagens funcionais conferidas pelo anticorpo humanizado da presente invenção, o que tornaria o uso de tal anticorpo mais preferível em uma configuração clínica.

Sem pretender estar ligado a qualquer teoria, o inventor verificou que, quando em comparação com o anticorpo monoclonal anti-TLR2 de murino 11G7, o anticorpo plenamente humanizado de acordo com a presente invenção exibe utilidade funcional e clínica superiores, como o anticorpo antagoniza a função de TLR2 independentemente do fato de TLR2 formar um heterodímero com qualquer TLRl ou TLR6.

Em relação ao anticorpo de murino TL2.1, o inventor verificou que o anticorpo humanizado da presente invenção apresenta reação cruzada com relação às diferentes formas de mamíferos de TLR2, tais como humano, de murino, rato, porco e macaco, enquanto que o anticorpo TL2.1 de murino apresenta apenas especificidade de ligação com relação ao TLR2 humano. Adicionalmente, o anticorpo humanizado da presente invenção não inclui quaisquer resíduos de aminoácidos de murino e, consequentemente, é mínima a probabilidade de geração de anticorpos neutralizantes contra os mesmos quando administrados a um indivíduo, em comparação com o anticorpo TL2.1 derivado de murino.

Com relação ao anticorpo T2.5, o inventor, identificou, surpreendentemente, que o anticorpo T2.5 (um anticorpo de Receptor tipo Toll 2 (TLR2) de camundongo, derivado de clone de hibridoma de T2.5, HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: número do catálogo 1054) media o antagonismo da ativação de TLR2 e sinalização, com isto ocorrendo em uma maneira dependente de CD32. O inventor verificou que os anticorpos plenamente humanizados da presente invenção não requerem CD32, a fim de mediar a supressão de sinalização de TLR2, isto é, a ligação ao CD32, por exemplo, pela região Fc do anticorpo, não precisa ocorrer, a fim de mediar o antagonismo do receptor TLR2 quando ligado pela porção Fab do anticorpo. Por conseguinte, o antagonismo da função do Receptor tipo Toll 2 que é mediado por um anticorpo monoclonal plenamente humanizado OPN-305 da presente invenção é mediado em um modo independente de CD32. Isto inclui ligação a ambos CD32a e CD32b. Esta observação surpreendente, que foi feita pelo inventor é clinicamente significativa, como o anticorpo plenamente humanizado da presente invenção tem acesso potencialmente maior ao paciente.

Além disso, é previsto que os anticorpos plenamente humanizados da presente invenção se liguem a um epítopo definido pelos resíduos presentes em ambos os términos N e C da sequência de aminoácido TLR2. Isto contraste com o WO 2005/028509, que indica que o epítopo ligado pelo anticorpo monoclonal T2.5 está localizado na parte do término N (apenas) da sequência de TLR2.

Além disso, como exemplificado nos exemplos comparativos providos no presente documento, o inventor confirmou que o anticorpo plenamente humanizado da presente invenção exibe um perfil reduzido de imunogenicidade, isto é, que os anticorpos são menos imunoqênicos devido a uma falta de epítopos das células T. Consequentemente, de acordo com a invenção será muito pouco provável que os anticorpos apresentem uma resposta de anticorpo neutralizante levantada contra os mesmos quando administrados a um indivíduo humano. Esta característica funcional significa que o anticorpo plenamente humanizado da presente invenção é muito mais desejável para utilização em uma configuração clínica que os anticorpos de murinos TL2.1 e T2.5 e 11G7 que são conhecidos na técnica, ou com relação os anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados que podem ser desenvolvidos com base nas técnicas tradicionais de enxerto de CDR.

Anticorpos

Um anticorpo é uma imunoglobulina produzida de forma natural, parcial ou completamente sintética. O termo também abrange qualquer proteína, polipeptídeo ou peptídeos possuindo um domínio de ligação que é homólogo ao domínio de ligação dos anticorpos humanizados da presente invenção.

As imunoglobulinas possuem tipicamente uma estrutura heterotetramérica compreendendo duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, ligadas em conjunto por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada e leve compreende um domínio variável que confere a especificidade de ligação do antigeno, com estes domínios sendo conhecidos como domínios VH e VL para as cadeias pesada e leve, respectivamente. Cada cadeia também compreende pelo menos um domínio constante, com a cadeia leve apresentando um único domínio constante, denominado o domínio CL, enquanto o domínio de cadeia pesada compreende três domínios constantes, CHI, CH2 e CH3. Alguns isotipos de anticorpos incluem, adicionalmente, um domínio constante adicionalmente referido como o domínio de CH4. Nos seres humanos, existem cinco diferentes classes de anticorpos, nomeadamente; IgG, IgA, IgD IgE e IgM.

O domínio Fc de um anticorpo compreende tipicamente os dois últimos domínios de região constante de cadeia pesada de cada cadeia. Estes dimerizam para formar o domínio Fc que é responsável por mediar as funções efetoras do anticorpo, tais como ADCC e de fixação do complemento. A região Fc do anticorpo também tem um papel na meia vida circulatória do anticorpo. Modificações podem ser feitas ao domínio Fc para modular a função do anticorpo.

Como os anticorpos podem ser modificados em vários aspectos, o termo anticorpo deve ser interpretado como se estendendo a qualquer elemento de ligação específico, que apresenta a mesma especificidade de ligação como os anticorpos humanizados da presente invenção. Por conseguinte, o termo anticorpo se estende aos fragmentos de anticorpo e homólogos, bem como a qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina que apresenta especificidade de ligação em relação ao Receptor tipo Toll 2 e que serve para antagonizar a função de TLR2.

Além disso, é conhecido que os fragmentos de um anticorpo completo podem executar a função de antigenos de ligação. Exemplos de tais fragmentos de ligação incluem, mas não estão limitados a: (i) os fragmentos de Fab consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI de um anticorpo heterotetramérico, ii) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação, (iii) fragmento Fab', um fragmento Fab com uma parte da região de articulação, (iv) fragmentos Fd, consistindo nos domínios VH e CHI de um anticorpo heterotetramérico, (v) fragmentos Fv consistindo nos domínios VH e VL de um anticorpo heterotetramérico, (vi) scFv (moléculas Fv de cadeia única), onde um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante peptídico, (vii) uma CDR isolado, tal como VHCDR3 e (viii) diacorpos, estes sendo multímeros de polipeptídeos que podem ser fragmentos multivalentes ou multiespecíficos produzidos por técnicas de fusão de genes.

Em certos aspectos adicionais, a invenção também se estende aos anticorpos biespecíficos. Estes podem incluir anticorpos biespecíficos convencionais que podem ser preparados por meios de conjugação química ou por linhagens celulares de hibridoma híbrido. Alternativamente, os anticorpos biespecíficos podem ser derivados de fragmentos de anticorpo biespecíficos, tais como, dímeros de scFv ou diacorpos. Em certas modalidades, dímeros scFv podem ser utilizados, ao invés de anticorpos completos. Tais diacorpos podem ser construídos utilizando apenas domínios variáveis e, portanto, são fornecidos sem uma região Fc, tal estrutura reduzindo a possibilidade de ocorrência de HAMA ou resposta imune antiidiotípica.

Os resíduos de aminoácidos nos domínios de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema inventado por Kabat e outros (URL - www,kabatdatabase.com). Esta numeração é usada na presente especificação, exceto quando indicado em contrário.

Peptidomiméticos

A presente invenção também se estende aos peptidomiméticos que se baseiam nos anticorpos da presente invenção ou fragmentos de ligação dos mesmos. Tal como empregado no presente documento, o termo peptidomimético ou peptídeo mimético, se refere às moléculas que não são polipeptídeos, mas que imitam os aspectos de suas estruturas e que, no contexto da presente invenção, se ligam especificamente ao Receptor tipo Toll 2, de uma maneira que resulta na atividade funcional do Receptor tipo Toll 2 sendo antagonizada. Assim, a invenção se estende aos peptidomiméticos com base nos anticorpos da invenção que atuam como antagonistas do Receptor tipo Toll 2.

Antagonistas peptidomiméticos podem ser preparados por métodos químicos convencionais (vide, por exemplo, Damewood J.R. Peptide Mimetic Desin with the Aid of Computational Chemistry in Revews in Computational Biology, 2007, vol. 9, pp.1-80, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1996; Kazmierski W.K., Methods of Molecular Medicine: Peptidomimetic Protocols, Humana Press, New Jersey,

1999). Peptidomiméticos podem ser preparados, os quais são antagonistas do Receptor tipo Toll 2, onde os ditos peptidomiméticos se baseiam nos anticorpos da presente invenção e, especificamente com base nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve. Por exemplo, os polissacárideos podem ser preparados apresentando os mesmos grupos funcionais que os peptideos. Os peptidomiméticos podem ser concebidos, por exemplo, por estabelecimento de uma estrutura tridimensional de um agente peptidico no ambiente no qual ele é ligado ou se ligará a uma molécula alvo. O peptidomimético compreende pelo menos dois componentes, a fração de ligação ou frações e a estrutura de suporte.

As porções de ligação são os átomos ou grupos químicos que reagem ou formam um complexo (por exemplo, através das interações hidrófobas ou iônicas) com uma molécula alvo, por exemplo, com o(s) aminoácido(s) em ou próximo do sítio de ligação de ligante, tal como o epítopo do Receptor tipo Toll 2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Por exemplo, as porções de ligação em um peptidomimético podem ser as mesmas que aquelas em um peptídeo ou proteína antagonista. As frações de ligação podem ser um átomo ou grupo químico que reage com o Receptor tipo Toll 2 da mesma maneira ou semelhante aos anticorpos da presente invenção. Exemplos de frações de ligação adequadas para utilização na concepção de um peptidomimético para um aminoácido básico em um peptideo incluem grupos contendo nitrogênio, tais como, aminas, amônios, guanidinas e amidas ou fosfônios. Exemplos de frações de ligação adequadas para utilização na concepção de um peptidomimético para um aminoácido acidico incluem, por exemplo, carboxila, éster de ácido carboxilico de alquila inferior, ácido sulfônico, um éster de ácido sulfônico alquila inferior ou um ácido fosforoso ou éster do mesmo.

A estrutura de suporte é a entidade química que, quando ligada à porção de ligação ou frações, fornece a configuração tridimensional do peptidomimético. A estrutura de suporte pode ser orgânica ou inorgânica. Exemplos de estruturas de suporte orgânicas incluem polissacarídeos, polímeros ou oligômeros de polímeros sintéticos orgânicos (tais como, álcool polivinílico ou polilactídeo). É preferido que a estrutura de suporte possua substancialmente o mesmo tamanho e dimensões que a estrutura peptídica ou estrutura de suporte. Isto pode ser determinado através do cálculo ou medição do tamanho dos átomos e ligações do peptideo e peptidomimético. Em uma modalidade, o nitrogênio da ligação peptídica pode ser substituído com oxigênio ou enxofre, por exemplo, formando uma estrutura de poliéster. Em uma outra modalidade, a carbonila pode ser substituída com um grupo sulfonila ou grupo sulfinila, formando assim uma poliamida (por exemplo, uma polissulfonamida). Amidas reversas do peptideo podem ser fabricadas (por exemplo, substituindo-se um ou mais grupos CONH- por um grupo NHCO-). Ainda em outra modalidade, a estrutura polipeptitica pode ser substituída com uma estrutura de polissilana.

Estes compostos podem ser fabricadas por métodos conhecidos. Por exemplo, um poliéster peptidomimético pode ser preparado por substituição de um grupo hidroxila pelo grupo α-amino correspondendo nos aminoácidos, pelo que, preparando um hidroxiácido e sequencialmente esterificando

os hidroxiácidos,	opcionalmente	bloqueando	as	cadeias
laterais básicas	e ácidas	para	minimizar	as	reações
laterais. A determinação de	uma	via de síntese	química
apropriada pode	geralmente	ser	facilmente	identificada

mediante a determinação da estrutura química.

Os peptidomiméticos podem ser sintetizados e montados em bibliotecas que compreendem algumas a muitas espécies moleculares separadas. Tais bibliotecas podem ser preparadas utilizando métodos bem conhecidos da química combinatória, e podem ser classificadas para determinar se a biblioteca compreende um ou mais peptidomiméticos que possuem a atividade desejada. Tais antagonistas peptidomiméticos podem então ser isolados por métodos adequados.

Consequentemente, certos aspectos adicionais da presente invenção se estendem aos peptidomiméticos que são concebidos com base nos paratopos dos anticorpos de ligação do Receptor tipo Toll 2 da presente invenção. Especificamente, tais peptidomiméticos se baseiam na estrutura das regiões de CDR dos anticorpos descritos no presente documento. As técnicas para a produção de tais peptidomiméticos serão bem conhecidas dos versados na técnica e incluem o método de Dougall e outros (Design of pharmacologic agents based on antibody structure, Trends in Biotechnology. 1994, 12. P372-379). Além disso, as técnicas de Saragovi e outros (Saragovi e outros, Design and Synthesis of a Mimetic from an Antibody Complementarity-Determining Region, Science 253:792-795 (1991) e Saragovi e outros, Loops and Secondary Structure Mimetics: Development and Applications in Basic Science and Rational Drug Design, Biotechnology 10: 773-778 (1992)). Tais peptidomiméticos podem, em especial, se basear na CDR3 da cadeia pesada. Williams e outros (Williams e outros, Design of Bioactive Peptides Based on Antibody Hypervariable Region Structures, J.Biol. Chem. 266: 5182

5160 (1991)), descreve o isolamento e a síntese de peptídeos conformacionalmente limitados derivados de regiões determinantes de complementaridade de anticorpos de cadeia leve. Esta CDR é especificamente importante na especificidade de ligação de um anticorpo, como uma consequência do mecanismo genético complexo que influencia a sua estrutura, o que faze com que tenha alça média a longa que apresentam padrão diverso de interações. As propriedades conformacionais dos laços de peptídeo ou giros reversíveis são consideradas mediadores importantes na atividade biológica dos polipeptídeos. Os giros fornecem orientações de grupos de ligação essenciais para a bioatividade, estabilizando uma conformação dobrada em uma pequena molécula e podem estar envolvidos em ambos os sítios de ligação e de reconhecimento.

A presente invenção também se estende aos miméticos de anticorpo, tais como Affibodies, anticorpos de domínio, Nanocorpos e UniCorpos e DARPins e Anticalinas e Avimeros e Versacorpos, e Duocalinas que se baseiam no Receptor tipo Toll 2 da presente invenção. Uma qrande variedade de tecnologias de anticorpo mimético são conhecidas de um versado na técnica. Por exemplo, os assim chamados anticorpos de domínio (Domantis, UK) são pequenas unidades funcionais de ligação de anticorpos que correspondem às regiões variáveis tanto das cadeias leves quanto das cadeias pesadas de anticorpos humanos. Instruções para a produção de anticorpos de domínio podem ser encontradas na Patente US número 6.291, 158, Patente US número 6.582.915 e Patente dos US número 6.593.081. Nanocorpos são proteínas terapêuticas derivadas de anticorpos que contêm propriedades estruturais e funcionais únicas de ocorrência natural de anticorpos de cadeia pesada encontrados em camelídeos. Os Unicorpos são uma tecnologia de fragmento adicional de anticorpo, com base na remoção da região de articulação de anticorpos IgG4 . A supressão dos resultados da região de articulação de uma molécula que apresenta aproximadamente metade do tamanho de um anticorpo IgG4 tradicional e que apresenta uma região de ligação univalente. Os Unicorpos preservam a propriedade dos anticorpos IgG4 de serem inertes e, por conseguinte, não induzirem respostas imunes. Consequentemente, como terapêutica com base nos anticorpos IgG4, tais como as modalidades dos anticorpos da presente invenção descritas no presente documento, os Unicorpos pode ser usados para antagonizar funções especificas de células, mas a morte celular normalmente não ocorra como o Unicorpo, assim como um anticorpo IgG4, não mediará uma resposta imune contra o alvo ao qual ele está ligado. Os unicorpos são eliminados do organismo a uma taxa semelhante à IgG4 e se ligam com uma afinidade de ligação semelhante a de seus antígenos alvo.

Moléculas de ligação adicionais incluem: moléculas de Affibody (Patente US 5.831.012), DARPins (denominados proteínas de repetição de anquirina) (Pedido de Patente Internacional PCT WO 02/20565) e anticalinas (Patente US número 7.250.297 e WO 99/16873). Versacorpos são uma tecnologia adicional de anticorpos miméticos. Versacorpos (Amunix, Publicação do Pedido de Patente US 2007/0.191.272) são pequenas proteínas, ditas como microproteínas, de 35kDa com resíduos de cisteína maiores que 15%, que formam uma scaffold de densidade de ligação de dissulfeto alta que

substitui o	núcleo	hidrófobo	que a	proteína exibe
tipicamente.
Avímeros	são outre	> tipo de	mimético	de	anticorpo.	Os
avímeros se	originam	da recombinação	de	famílias	de

proteínas de soro humano. Os mesmos são cadeias de proteína única composta de domínios de ligação modular, cada um dos quais é projetado para se ligar a um sítio alvo específico. Os avímeros podem se ligar simultaneamente aos sítios em uma proteína alvo unia e/ou sítios de múltiplas proteínas alvo. Conhecido como anexação de múltiplos pontos ou avidez, este mecanismo de ligação imita a maneira como as células e moléculas interagem no corpo, suporta a geração de antagonistas e agonistas e resulta em medicamentos com múltiplas funções e atividade potente. As bibliotecas dos Avimeros podem ser produzidas de acordo com WO 2004/044011 incorporado ao presente documento como referência e especificamente o Exemplo 6 na página 99 e, por exemplo, os Pedidos de Patente US (Publicação) números US 2005/0053973, US2005/0089932, US2005/0164301. As bibliotecas dos avimeros estão também disponíveis comercialmente na Avidia Inc, Mountain View, Califórnia, USA.

Produção de anticorpos

Os anticorpos e os elementos de ligação da presente invenção podem ser produzidos, total ou parcialmente por síntese química. Por exemplo, os anticorpos e os elementos de ligação da invenção podem ser preparados por técnicas que são bem conhecidos dos versados na técnica, tais como a síntese padrão de peptídeo líquido ou por métodos de síntese de peptídeo de fase sólida. Alternativamente, os anticorpos e os elementos de ligação podem ser preparados em solução utilizando técnicas de síntese de peptídeos de fase líquida ou adicionalmente por uma combinação de fase sólida, fase líquida e química de solução.

A presente invenção também se estende à produção dos anticorpos ou elementos de ligação da invenção por

100 expressão de um ácido nucléico que codifica pelo menos um aminoácido que compreende um anticorpo da invenção em um sistema de expressão adequado, tal que um pepetideo ou polipeptideo desejado possa ser codificado.

Por exemplo, um ácido nucléico que codifica a cadeia leve de aminoácido e um segundo ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de aminoácidos podem ser expressos para prover um anticorpo da presente invenção.

Consequentemente, em certos aspectos adicionais da invenção, são providos ácidos nucléicos que codificam sequências de aminoácidos que formam os anticorpos ou os elementos de ligação da presente invenção.

Tipicamente, os ácidos nucléicos que codificam as sequências de aminoácidos que formam anticorpos ou elementos de ligação da presente invenção podem ser fornecidos na forma isolada ou purificada, ou fornecidos em uma forma que seja substancialmente isenta de material que possa ser naturalmente associado aos mesmos, com a exceção de uma ou mais sequências reguladoras. O ácido nucléico que expressa um anticorpo ou elemento de ligação da presente invenção pode ser total ou parcialmente sintético e pode incluir, mas não está limitado ao DNA, DNAc e RNA.

As sequências de ácidos nucléicos que codificam os anticorpos ou os elementos de ligação da presente invenção

101 podem ser prontamente preparadas por um versado na arte utilizando técnicas que são bem conhecidas dos versados na arte, tais como aquelas descritas em Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN 0879695773-), e Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4^a Edição, 1999 (ISBN - 0471250929). As ditas técnicas incluem (i) o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) para ampliar amostras de ácido nucléico, (ii) síntese química, ou (iii) preparação das sequências de cDNA. O DNA que codifica os anticorpos ou os elementos de ligação da invenção pode ser gerado e utilizado em qualquer forma adequada conhecida dos versados na técnica, incluindo tomada do DNA de codificação, identificação dos sítios de reconhecimento de enzima de restrição apropriados, cada lado da porção a ser expressa e corte da dita porção a partir do DNA. A porção excisada pode então ser ligada operavelmente a um promotor apropriado e expressa em um sistema de expressão apropriado, tal como, um sistema de expressão comercialmente apropriado. Alternativamente, as porções relevantes de DNA podem ser ampliadas por utilização de iniciadores de PCR apropriados. As alterações das sequências de DNA podem ser feitas usando mutagênese

102 dirigida ao sítio.

As sequências de ácidos nucléicos que codificam os anticorpos ou os elementos de ligação da presente invenção podem ser fornecidas como construções sob a forma de um plasmídeo, vetor, cassete de transcrição ou de expressão que compreende pelo menos um ácido nucléico conforme descrito acima. A construção pode ser compreendida dentro de uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como acima. A expressão pode ser convenientemente obtida por cultivo, sob condições apropriadas, das células hospedeiras recombinantes contendo sequências de ácido nucléico apropriadas. Seguindo-se a

expressão, o anticorpo ou fragmentos de	anticorpo pode ser
isolado e/ou purificado utilizando	qualquer	técnica
adequada, conforme apropriado.
Sistemas para a clonagem e	expressão	de um

polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem baterias, células de mamíferos, leveduras, insetos e sistemas de baculovírus. Linhagens celulares de mamífero disponíveis na arte para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebê e células de mieloma NSO de rato. Um

103 hospedeiro bacteriano preferido e comum é E.coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos nas células procarióticas, tais como E.coli é bem estabelecida na arte. A expressão nas células eucarióticas em cultura também está disponível aos versados na técnica como uma opção para a produção de um elemento de ligação.

As técnicas gerais para a produção de anticorpos são bem conhecidas do versado na técnica, com tais métodos sendo discutidos, por exemplo, em Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497; Patente US número 4.376.110; Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor. As técnicas para a preparação de moléculas de anticorpo recombinantes estão descritas nas referências acima e também, por exemplo, na Patente Européia número 0.368.684.

Em certas modalidades da invenção, são empregados os ácidos nucléicos recombinantes compreendendo um inserto codificando um domínio variável de cadeia pesada e/ou um domínio variável da cadeia leve de anticorpos ou elementos de ligação. Por definição, estes ácidos nucléicos compreendem codificação de ácidos nucléicos de filamento único, ácidos nucléicos de filamentos duplos consistindo na codificação dos ácidos nucléicos de ácidos nucléicos complementares aos mesmos ou estes ácidos nucléicos

104 complementares (filamento único) propriamente.

Adicionalmente, os ácidos nucléicos codificando um domínio variável de cadeia pesada e/ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpos podem ser ácidos nucléicos enzimática ou quimicamente sintetizados possuindo a sequência autêntica codificando um domínio variável de cadeia pesada ocorrendo naturalmente e/ou o domínio variável da cadeia leve, ou um seu mutante.

Um anticorpo da invenção pode ser produzido por meios recombinantes, não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é de preferência uma sequência sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de divagem específico no N terminal da proteína madura ou polipeptídeo. A sequência de sinal heteróloga selecionada é de preferência uma que seja reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras

procarióticas	que	não	reconhecem e	processam	uma	sequência
de sinal nativa	do	anticorpo, a	sequência	de	sinal é
substituída	por	uma	sequência	de sinal	procariótica
selecionada,	por	exemplo, a partir	do grupo	da	fosfatase

alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxinas II líderes estáveis ao calor.

Isolado

105

O termo isolado, quando utilizado em referência aos anticorpos plenamente humanizados da presente invenção, ou aos elementos de ligação derivados dos mesmos ou polipeptideos que codificam os mesmos, se refere ao estado no qual os ditos anticorpos, elementos de ligação ou ácidos nucléicos (polinucleotideos) são fornecidos em uma forma isolada e/ou purificada, ou seja, eles foram separados, isolados ou purificados a partir do seu ambiente natural e são fornecidos em uma forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso do ácido nucléico, isento ou substancialmente isento de ácido nucléico ou genes de origem diferentes da sequência codificando um polipeptideo com a função requerida. Consequentemente, tais anticorpos isolados, elementos de ligação e ácidos nucléicos isolados estarão isentos ou substancialmente isentos de material com o qual eles são naturalmente associados, tal como outros polipeptideos ou ácidos nucléicos com os quais são encontrados no seu ambiente natural, ou o ambiente no qual eles são preparados (cultura de células, por exemplo), quando tal preparação é realizada por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo.

Os anticorpos, elementos de ligação e os ácidos nucléicos podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda, para fins práticos, são considerados como sendo

106 fornecidos na forma isolada. Por exemplo, os anticorpos e elementos de ligação podem ser misturados com gelatina ou outros veículos se empregados para revestir placas de microtitulação para uso nos imunoensaios ou serão misturados com veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes quando usados em diagnóstico ou terapia. Os anticorpos ou elementos de ligação podem ser glicosilados, quer naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo, células CHO ou nos), ou podem ser, por exemplo, se produzidos por expressão em uma célula procariótica, não glicosilados.

As preparações heterogêneas compreendendo moléculas de anticorpo humanizado anti-TLR2 também fazem parte da invenção. Por exemplo, essas preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de comprimento pleno e cadeia pesadas sem a lisina de término C, com vários graus de glicosilação e/ou com derivatizados aminoácidos, tais como ciclização de um ácido glutâmico de término N para formar um resíduo de ácido piroglutâmico.

Administração

O anticorpo monoclonal ou elemento de ligação da presente invenção pode ser administrado isoladamente, porém de preferência será administrado como uma composição farmacêutica que compreende, geralmente, um excipiente

107 farmaceuticamente aceitável adequado, diluente ou veículo selecionado dependendo da via de administração pretendida. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados incluem; água, glicerol, etanol e semelhantes.

O anticorpo monoclonal ou elemento de ligação da presente invenção pode ser administrado a um paciente que necessite de tratamento através de qualquer via adequada. Tipicamente, a composição pode ser administrada por via parentérica por injeção ou infusão. Exemplos de vias preferenciais para administração parentérica incluem, mas não estão limitados à intravenosa, intracardíaca, intraarterial, intraperitoneal, intracavidade, intramuscular, subcutânea, inalação, transmucosa ou transdérmica. As vias de administração podem ainda incluir tópica e enteral, por exemplo, mucosa (incluindo pulmonar), oral, nasal, retal.

Em modalidades onde a composição é fornecida como uma composição injetável, por exemplo, na administração intravenosa, intradérmica ou aplicação subcutânea, o inqrediente ativo pode estar na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de piroqênios e possui pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os versados na técnica relevante são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção

108 de Ringer, ou Injeção de Ringer lactada. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário.

A composição também pode ser administrada através de microesferas, lipossomas, outros sistemas de distribuição de micropartículas ou formulações de liberação prolongada colocadas em certos tecidos, incluindo o sangue.

Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima e outras técnicas e protocolos que podem ser utilizados de acordo com a invenção podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^a edição, Gennaro, AR, Lippincott Williams & Wilkins, 20^a edição ISBN 0-912734-043 e Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. e outros, 7^a Edição ISBN 0-683.305-72-7, as descrições completas dos mesmos sendo incorporadas aqui como referência.

A composição da invenção é tipicamente administrada a um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz, esta sendo uma quantidade suficiente para mostrar benefício ao indivíduo a quem a composição é administrada. A dose real administrada e a taxa e tempo-curso de administração, dependerão, e podem ser determinadas com referência devida à natureza e a gravidade da condição que está a ser tratada, bem como fatores, tais como, idade, sexo e peso do

109 indivíduo a ser tratado, bem como a via de administração. Adicionalmente, deve ser dada a devida consideração às propriedades da composição, por exemplo, sua atividade de ligação e vida plasmática in vivo, a concentração do anticorpo ou elemento de ligação na formulação, bem como a via, sitio e taxa de liberação.

Os regimes de dosagem podem incluir uma única administração da composição, ou múltiplas doses administrativas da composição. As composições podem ainda ser administradas sequencial ou separadamente com outras terapêuticas e medicamentos que são utilizados para o tratamento da condição para a qual o anticorpo ou o elemento de ligação da presente invenção será administrado para tratamento.

Exemplos de regimes de dosagem que podem ser administrados a um indivíduo podem ser selecionados a partir do grupo que compreende, mas não se limita a 1 pg/kg/dia até 20 mg/kg/dia, 1 pg/kg/dia até 10 mg/kg/dia, 10 pg/kg/dia até 1 mg/kg/dia. Em certas modalidades, a dosagem será tal que uma concentração de plasma de 1 pg/mL a 100 pg/mL do anticorpo seja obtida. No entanto, a dose real da composição administrada e a taxa de tempo-curso de administração, dependerão da natureza e da gravidade da condição a ser tratada. A prescrição do tratamento, por

110 exemplo, decisões sobre a dosagem etc. se encontram de forma final, dentro da responsabilidade e a critério dos médicos clínicos gerais e outros médicos e tipicamente levam em conta o transtorno a ser tratado, a condição do paciente individual, o sítio de liberação, método de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes.

Definições

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos empregado no presente documentos apresentam o significado comumente entendido por um versado na técnica no campo da presente invenção.

Ao longo do relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, os termos 'compreendem' ou 'incluem', ou variações tais como 'compreende' ou 'compreendendo', 'inclui' ou 'incluindo' serão entendidos como implicando na inclusão de um inteiro declarado ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.

Como usado no presente documento, termos tais como um, uma e a, o incluem referências ao singular e plural, a menos que o contexto claramente exija o contrário. Assim, por exemplo, a referência a um agente ativo ou um agente farmacologicamente ativo inclui um único agente ativo, bem como dois ou mais agentes ativos em

111 combinação, enquanto as referências a um veiculo incluem misturas de dois ou mais veículos, bem como um veículo único e semelhantes.

Os termos se liga especificamente, se liga seletivamente ou especificidade de ligação se refere à capacidade dos anticorpos plenamente humanizados ou compostos de ligação da presente invenção de se ligarem a um epítopo alvo presente no Receptor Tipo Toll com uma afinidade maior que aquela que resulta quando liqados a um epítopo não-alvo. Em certas modalidades, a ligação específica se refere à ligação a um alvo com uma afinidade que é pelo menos 10, 50, 100, 250, 500, ou 1.000 vezes maior que a afinidade para um epítopo não-alvo. Em certas modalidades, esta afinidade é determinada por um ensaio ELISA de afinidade. Em certas modalidades, a afinidade pode ser determinada por um ensaio de BIAcore. Em certas modalidades, a afinidade pode ser determinada por um método cinético. Em certas modalidades, a afinidade pode ser determinada por um método de equilíbrio/solução.

Tal como empregado no presente documento, o termo quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz significa a quantidade de um agente, composto de ligação, molécula pequena, proteína de fusão ou peptidomimético da invenção que é necessária para suprimir a inflamação

112 mediada por TLR2 nos rins ou que reduz a gravidade e/ou

melhora de	uma	doença	renal	mediada por TLR2 ou pelo	menos
um sintoma	da	mesma	ou	de	uma condição associada	com a
mesma.
Tal como	utilizado	no	presente documento, o	termo

quantidade profilaticamente eficaz se refere à quantidade de uma composição que é necessária para prevenir o aparecimento inicial, a progressão ou recorrência de uma doença mediada por TLR2, ou uma condição inflamatória, ou pelo menos um sintoma da mesma em um indivíduo após a administração dos compostos da presente invenção.

Tal como empregado no presente documento, o termo tratamento e os termos associados, tais como tratar e tratando significa a redução da progressão, gravidade e/ou duração de uma condição mediada por TLR2 ou pelo menos um sintoma da mesma, onde a dita redução ou melhora resulta da administração de um composto de ligação que apresenta especificidade para o epítopo de ligação de TLR2 da presente invenção. O termo 'tratamento', portanto, se refere a qualquer regime que possa beneficiar um indivíduo. O tratamento pode ser em relação a uma condição existente ou pode ser profilático (tratamento preventivo). O tratamento pode incluir efeitos curativos, de alívio ou profiláticos. Referências no presente documento aos

113 tratamentos terapêutico e profilático devem ser consideradas em seu contexto mais amplo. 0 termo terapêutico não implica necessariamente que o indivíduo seja tratado até a recuperação total. De forma semelhante, profilático não significa que o indivíduo esteja livre de

Como empregado no presente documento, o indivíduo se refere a um animal, de preferência um mamífero e especificamente um ser humano. Em uma modalidade particular, o indivíduo é um mamífero, especificamente um se humano. O termo indivíduo é intercambiável com o termo paciente como empregado no presente documento.

A presente invenção será agora descrita com referência aos exemplos que se seguem, que são fornecidos com o propósito de ilustração e não se destinam a ser interpretados como sendo limitativos da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Produção de anticorpo monoclonal plenamente humanizado

Os anticorpos antagonísticos de TLR2 da presente invenção são tipicamente anticorpos plenamente humanizados. Isto é, os anticorpos são de origem plenamente humana, e, portanto, não possuem regiões ou combinações de aminoácidos derivadas de espécies não humanas, tais como camundongos.

Um método para produzir os anticorpos plenamente

114 humanizados da presente invenção é através da utilização de tecnologia de composição de anticorpo humano (Antitope, UK) tal como descrito no Pedido de Patente PCT Internacional número WO 2006/082406. Tais anticorpos são proteínas compósitas compreendendo 2 ou mais segmentos de sequência de aminoácidos derivada de anticorpos humanos. Os segmentos podem ser selecionados de tal forma que a presença de epítopos de células T no anticorpo final é evitada, por exemplo, por classificação dos resíduos, em especial das regiões variáveis de cadeia pesada e leve para garantir que eles não compreendam motivos de ligação de MHC classe II ou que elas não compreendam resíduos que ancorem a ligação de peptídeos aos MHC classe II. Além disso, métodos in-silico de análise das regiões variáveis do anticorpo plenamente humanizado da presente invenção asseguram que não epítopos de células T não estejam presentes.

Na produção de um anticorpo plenamente humanizado utilizando a técnica de anticorpo humano compósito, o anticorpo final é produzido compreendendo uma composição de muitos segmentos de sequência, todos os quais sendo de origem humana, e todos os quais são derivados de diferentes anticorpos humanos. Resumidamente, a técnica envolve as etapas de: análise das regiões de cadeia variável pesada e leve de um anticorpo monoclonal de partida, por exemplo, um

115 anticorpo de murino ou quimérico que apresenta especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2, a fim de identificar as regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Modelos de proteinas das regiões variáveis de anticorpo são então gerados usando estruturas de anticorpos já existentes como modelos empregando Swiss PDB. Estes modelos estruturais são então analisados para identificar aminoácidos de contenção importantes nas regiões de domínio variável do anticorpo original que provavelmente são essenciais para as propriedades de susceptíveis de serem essenciais para as propriedades de ligação do anticorpo. Os resíduos contidos dentro das regiões CDR (como definido utilizando tanto as definições de Kabat e de Chothia), juntamente com um número de resíduos de estrutura são tipicamente importantes. As informações estruturais do modelo de proteína são utilizadas para identificar e comparar os resíduos que são importantes para a confirmação do anticorpo e ligação com resíduos estruturalmente equivalentes de estruturas de anticorpos já existentes e bases de dados de sequência. Estes aminoácidos podem então ser candidatos a inclusão de uma ou mais variantes das sequências finais humanizadas. Na preparação do anticorpo da presente invenção, ambas as sequências VH e VK do anticorpo anti-TLR2 de murino nas quais o anticorpo

116 plenamente humanizado da presente invenção se baseia (anticorpo de (TLR2) de Receptor tipo Toll 2 de camundongo, derivado do clone de hibridoma T2.5, HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, EUA: número de catálogo 1054) mostraram conter resíduos estruturais típicos, especialmente na VH, onde o anticorpo tem configurações de sequência muito comuns em posições importantes, por exemplo, Resíduos Kabat 45-49 (LEWIG) e 92-94 (CAR).

As sequências de fonte monoclonal de sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve e pesada são então comparadas com os segmentos correspondentes de sequências de região variável humana a fim de identificar potenciais sequências humanas de cadeia pesada e leve para possível inclusão na sequência humanizada final. Cadeias leves e pesadas plenamente humanizadas, finais, são então projetadas totalmente de segmentos de sequências de região variável humana.

O anticorpo plenamente humanizado é concebido e produzido, em primeiro lugar, pela sintetização dos genes da região VH e VK usando uma série de oligonucleotídeos sobrepostos que foram recozidos, ligados e ampliados por PCR para fornecer regiões V sintéticas de comprimento pleno. A sequência polinucleotídica foi então clonada diretamente em um vetor de expressão adequado, exemplos dos

117 quais serão bem conhecidos dos versados na técnica, tais como um sistema vetor de expressão que codifica um anticorpo, tal como IgG. No caso do vetor de expressão utilizado na produção do anticorpo OPN-305 da presente invenção, o sistema de vetor de expressão se refere a uma sequência derivada de IgG4 compreendendo uma região de articulação modificada (uma substituição S241P), bem como cadeias pesadas e uma cadeia capa leve. As cadeias pesadas e leves são posteriormente transfectadas de forma estável no interior das células NSO via eletroporação e selecionadas usando metotrexato 200 nM (Sigma, número do catálogo M8407). Colônias resistentes ao metotrexato foram testadas quanto aos níveis de expressão de IgG. Embora as células NSO tenham sido utilizadas. Qualquer linhagem de célula apropriada que é conhecida de um versado na técnica podería ser empregada. Especificamente, o uso de células de mamífero em uma cultura de células de mamífero é preferido, como uma plataforma para produção de anticorpos e fragmentos de ligação da invenção. A utilização de células de mamíferos é especificamente preferida devido ao perfil de N-glicosilação que é aplicado à proteína, uma vez que tais perfis de glicosilação são semelhantes aos encontrados nas proteínas humanas. As linhagens celulares tipicamente empregadas para a cultura de células de mamífero incluem

118

CHO, células de hibridoma NSO, de rim de hamster bebê (BHK), e células humanas PER.C6™. A linhagem celular de mamífero mais comumente utilizada para a cultura de células de mamíferos em volumes em escala de produção são as linhagens de células CHO e NSO. Estes tipos de células são relativamente fáceis de manipular geneticamente, tendo sido extensivamente caracterizados e sendo de crescimento relativamente rápido em grande escala e podem excretar titulações altas de proteínas recombinantes na solução. Ambas as linhagens de células CHO e NSO podem produzir níveis de expressão de proteína altos.

Além das plataformas de expressão de proteína com base nas células de mamíferos, o uso dos sistemas de expressão com base em plantas ou sistemas de animais transgênicos pode também ser empregado para uso na produção das proteínas da invenção.

Os anticorpos compósitos foram, em seguida, purificados a partir de sobrenadantes de cultura de células em uma coluna de Sepharose de Proteína A (GE número de catálogo Healthcare 110.034-93) e quantificados por OD280nm, utilizando um coeficiente de extinção calculado onde Ec (0,1%) - 1,43. Os anticorpos purificados foram então testados em um ensaio de ELISA de competição para confirmar a liqação ao Receptor tipo Toll 2. Esta ligação

119 pode ser comparada com a ligação de um anticorpo de referência, tal como uma forma biotinilada de um anticorpo de Receptor tipo Toll 2 no qual o projeto do anticorpo plenamente humano se baseou. Especificamente, a absorvância a partir do ensaio de competição de ELISA pode ser traçada contra a concentração de amostra e linhagens lineares configuradas através de cada um dos conjuntos de dados pertencente ao anticorpo plenamente humano e original biotinilado. As equações das linhagens foram utilizadas para calcular a concentração necessária para inibir a ligação do anticorpo de referência biotinilado ao TLR2 em 50% (o assim chamado, valor de IC50). O valor de IC50 pode ser usado para calcular a diferença de vezes na eficiência de ligação. A eficiência de ligação determinada pode ser uma determinação importante da especificidade do anticorpo plenamente humanizado que é produzido. Outras comparações também podem ser realizadas, por exemplo, a comparação do anticorpo plenamente humanizado a um anticorpo quimérico ou de murino, que apresenta especificidade de ligação para o mesmo antígeno.

Exemplo 2 - Determinação das propriedades de ligação do anticorpo monoclonal OPN-305

O inventor identificou surpreendentemente que o anticorpo monoclonal de murino antagonístico T2.5 TLR2

120 exige ligação ao CD32, a fim de antagonizar plenamente a função do Receptor tipo Toll 2. A experimentação foi portanto realizada para confirmar que esta limitação funcional associada à utilização do anticorpo T2.5 não estava também associada à utilização de um anticorpo monoclonal OPN-305 OPN, a fim de mediar o seu efeito de neutralização da atividade biológica do Receptor tipo Toll 2.

Materiais e métodos:

Células THP-1 são células monociticas de sangue periférico humano. Em resposta aos ligantes de Receptor Tipo Toll, o fator de transcrição NF-capa B e outros fatores de transcrição são ativados nas células THP1. A linhagem de célula THP -1 Blue foi estavelmente transfectada com um plasmídeo reportado codificando o gene de fosfatase alcalina embriônico secretado (SEAP) sob o controle de um promotor induzível por vários fatores de transcrição, tais como NF-kB e AP-1. A variação da linhagem de célula THP-1 CD14 Blue superexpressa a proteína da superfície de célula CD14 para sensibilidade melhorada. As células THP -1-CD14 Blue são resistentes aos marcadores selecionáveis Zeocina e blasticidina. Após a estimulação TLR, as células THP-1 Blue ativam fatores de transcrição e, subsequentemente, a secreção de SEAP que é então detectável

121 utilizando o sistema repórter QUANTI-Blue. QUANTI-Blue é um ensaio enzimático colorimétrico desenvolvido para determinar a atividade da fosfatase (SEAP) alcalina secretada nos sobrenadantes das culturas de células. Na presença de SEAP, o meio QUANTI-Blue muda para uma cor azul púrpura que pode facilmente ser detectada a olho nu, ou quantificada através da leitura da densidade óptica (OD) a 625-655 nm.

Células THP1 CD14 Blue foram incubadas com o anticorpo monoclonal OPN-305 anti-TLR2 (1 pg/mL) pré-misturado com o anticorpo anti-CD32a (RND # AF1875) ou o anticorpo antiCD32b (RND # AF1330) ou IgG de cabra na faixa de 5 pg/mL0,18 pg/mL) durante 5 minutos a 37°C antes da estimulação com 20 ng/mL de antagonista TLR1/TLR2, Pam3CSK4. O anticorpo monoclonal OPN-305 é um anticorpo plenamente humanizado apresentando a cadeia leve definida no presente documento como SEQ ID NO: 2 e uma cadeia pesada conforme definido no presente documento na SEQ ID NO: 5.

As células foram então incubadas durante a noite a 37°C. Os sobrenadantes foram então removidos e inativados por calor antes da adição de QUANTI-Blue (Invivogen, San Diego, USA) . Alterações colorimétricas representando a ativação de NF-kB foram medidas a 650 nm usando um luminômetro.

122

Os resultados são mostrados na figura 9, estes resultados ilustram que a atividade funcional de OPN-305 como um antagonista Receptor tipo Toll 2 não é bloqueada por adição de anticorpos anti-CD32a/b. Isto portanto, indica que a atividade de neutralização do Receptor tipo Toll 2 mediada por OPN-305 não dependente da ligação a CD32a ou CD32b.

Exemplo 3 - Papel de CD32 no antagonismo do Receptor tipo Toll 2

Os resultados do Exemplo 2 sugerem que o antagonismo do Receptor tipo Toll 2 pelo anticorpo completamente humanizado OPN-305 da presente invenção não depende da ligação do anticorpo ao CD32 (tanto CD32a quanto CD32b).

A fim de confirmar isto, e para prover uma comparação com outros anticorpos antagonísticos TLR2 que são conhecidos no domínio, tais como o anticorpo monoclonal TLR2 de murino T2.5 (OPN-301), foi realizada experimentação adicional.

Materiais e métodos:

Células THP-1 CD14 Blue (Invivogen, San Diego, USA) foram pré-incubadas com doses de anticorpos que bloqueiam CD32a ou CD32b. Células THP-1 CD14 Blue pré-incubadas foram incubadas com doses crescentes de (i) anticorpo anti-humano FcgammaRIIa (CD32a) (R&D Systems, número de catálogo

123

AF1875, conforme usado no exemplo anterior), (ii) um anticorpo anti-humano FcgammaRII (CD32) (R&D Systems, número de catálogo AF1330) ou (iii) um anticorpo de controle de isotipo (IgG de cabra (R&D Systems, número de catálogo AB-108-C). As células em seguida, receberam adição tanto de 200 ng/mL do anticorpo anti-TLR2 de murino, T2.5 (OPN-301) ou o anticorpo OPN-305 plenamente humanizado OPN305. As células foram então estimuladas com 100 ng/mL do agonista TLR2, Pam3CSK4 (Invivogen) durante a noite.

Resultados

A produção de SEAP dependente de NF-kB foi medida nos sobrenadantes celulares. A figura 10A mostra os resultados para células expostas ao OPN-301 (anticorpo anti-TLR2 de murino, T2.5). A figura 10B mostra os resultados para as células expostas ao anticorpo antagonista de TLR2 plenamente humanizado OPN-305. Na figura 10A, a coluna A se refere às células estimuladas somente com Pam3CSK4. Coluna B se refere a células expostas ao anticorpo OPN-301. A coluna C se refere ao anticorpo OPN301, juntamente com 0,4 pg/mL de anti-CD32a/b ou um controle de anticorpo de cabra IgG. Coluna D se refere ao anticorpo OPN301 juntamente com 2 pg/mL de anticorpo anti-CD32a ou um anticorpo IgG de cabra de controle. A coluna E se refere ao anticorpo OPN301, mais 10 pg/mL de anticorpo anti-CD32a/b ou um

124 anticorpo de IgG de cabra de controle.

Na figura 10B, a coluna A se refere a células estimuladas somente com Pam3CSK4. A coluna B se refere às células expostas ao anticorpo OPN-305. A coluna C se refere ao anticorpo OPN305, juntamente com 0,4 pg/mL anti-CD32a/b ou um anticorpo de IgG de cabra de controle. A coluna D se refere ao anticorpo OPN305 juntamente com 2 pg/mL de anticorpo anti-CD32a 2 pg/mL/b ou um anticorpo de IgG de cabra de controle. A coluna E se refere ao anticorpo OPN305 anticorpo, mais 10 pg/mL de anticorpo anti-CD32a/b ou um anticorpo de IgG de cabra de controle.

Uma comparação dos dados mostrados nas figuras 2 mostra claramente que o antagonismo de TLR2 que é mediado por OPN-305 não depende do anticorpo interagindo com CD32, tal como o bloqueio de CD32 com um anticorpo específico CD32a ou CD32 não tem nenhum efeito na capacidade de neutralização de TLR2 de OPN305. Em contraste, o anticorpo de murino T2.5 (OPN-301) se mostra como dependente na ligação ao CD32, a fim de mediar a neutralização completa da atividade da função do Receptor tipo Toll 2. Sem estar limitado pela teoria, o inventor, por conseguinte, prevê que, na mediação do antagonismo de TLR2, o anticorpo OPN301 se liga ao TLR2 e também CD32, essa interação com CD32 sendo necessária para mediar o antagonismo do Receptor tipo

125

Toll 2. Portanto, existe um diferença funcional entre o mecanismo de ação utilizado pelo anticorpo OPN-305 e o anticorpo OPN-301 em relação ao antagonismo da atividade funcional do Receptor tipo Toll 2. Consequentemente, a atividade antagonista de TLR2 em OPN-301 pode ser bloqueada através do bloqueio de ligação ao CD32. Entretanto, o bloqueio da capacidade de OPN-305 de se ligar ao CD32, CD32a ou CD32b não afeta sua capacidade de antagonizar a atividade funcional do Receptor tipo Toll 2.

Exemplo 4 - Confirmação da especificidade de ligação do Receptor tipo Toll 2 de OPN-305

A experiência foi concebida para confirmar que o anticorpo monoclonal OPN-305 da invenção exibe especificidade de ligação ao Receptor tipo Toll 2 e especificamente, ao Receptor tipo Toll 2 humano.

Materiais e métodos:

Células HEK 293 (rim de embrião humano 293) transfectadas estavelmente com Receptor Tipo Toll 1 e Receptor tipo Toll 2, a fim de permitir a formação de um heterodimero TLR1/TLR2 foram incubadas com 1,0 pg/mL de uma forma biotinilada do anticorpo anti-TLR2 de murino, OPN-301 (T2.5) tanto sozinho quanto na presença de 1,0 pg ou 10 pg/mL de anticorpo anti-TLR2 plenamente humanizado OPN-305 ou de um anticorpo de controle de isotipo IgG4 OPN-305 por

126 minutos no gelo.

O anticorpo monoclonal OPN-301 é um anticorpo antiTLR2 IgGl de murino (anticorpo de camundongo de Receptor tipo Toll 2 (TLR2) clone T2.5, HyCult Biotecnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: número de catálogo 1054).

O anticorpo monoclonal OPN-305 é um anticorpo plenamente humano apresentando a cadeia leve definida no presente documento como SEQ ID NO: 2 e uma cadeia pesada conforme definido no presente documento na SEQ ID NO: 5.

As células foram então lavadas e incubadas com estreptavidina conjugada ao PECy7 por um adicional de 30 minutos. A ligação foi medida utilizando FACSCalibur (Becton Dickinson). Os resultados são mostrados na figura 11.

A figura 11A se refere à ligação de OPN-305 (marcado como variante 21). Movendo-se da esquerda para a direita, a linha mais escura do primeiro pico se refere à linha vermelha. A linha mais leve no primeiro pico se refere à linha verde. Movendo-se para a direita, o terceiro, quarto e quinto picos são os picos púrpura, azul e preto, respectivamente. A ligação de OPN-305 foi demonstrada por um deslocamento para a esquerda dos histogramas azul e púrpura (representando OPN-301 e OPN-305) em comparação com OPN-301 sozinho (histogramas pretos) o que demonstra que

127

OPN-305 está competindo com OPN-301 para a ligação ao TLR2 humano nas células HEK. Em conclusão, a figura 11A mostra um deslocamento dependente de dose dos picos, isto indicando competição na ligação entre OPN-301 e OPN-305 para Receptor tipo Toll 2 humano.

A figura 11B mostra os resultados de ligação com o controle de isotipo IgG4. Como o anticorpo de controle de isotipo IgG4 não apresenta especificidade de ligação ao TLR2 ele não compete para a ligação. Portanto, não existe deslocamento nos picos preto, púrpura ou azul, que são agrupados em conjunto e representados como o segundo pico conforme mostrado no lado direito da figura 11B. 0 pico no lado esquerdo se refere ao pico vermelho (linha mais escura) e o pico verde (linha mais clara). Estes resultados portanto, confirmam que OPN-35 apresenta especificidade de ligação para o Receptor tipo Toll 2.

Exemplo 5 - Reatividade cruzada do OPN-305 em relação ao Receptor tipo Toll 2 de murino

Tendo determinado no Exemplo 4 que OPN-305 apresenta especificidade de ligação para o Receptor tipo Toll 2 humano, esta experiência avaliou se o anticorpo monoclonal OPN-305 exibiu reatividade cruzada de intraespécies de Receptor tipo Toll 2, o que permitiría que OPN-305 se ligasse a outras formas de Receptor tipo Toll 2 de

128 mamífero, tal como Receptor tipo Toll 2 de murino.

Materiais e métodos:

Macrófagos J774 foram cultivados em 1 x 10⁶/mL na presença de 5 pg/mL de OPN-305 (referido como OPN-305-21), OPN-301 (T2.5) ou o anticorpo de controle de isotipo relevante (IgGl de murino para OPN-301 e IgG4 para OPN-305 humano) durante 6 horas a 37°C. As células foram expostas a HKLM de agonista TLR2 (Invivogen, San Diego, USA, número de catálogo tir-Kit2). HKLM é uma preparação de Listeria Monocytogenes (LM) exterminadas por liofilização, as mesmas sendo bactérias gram positivas intracelulares facultativas. Os sobrenadantes foram então removidos e níveis TNF-α de murino foram medidos por duoset ELISA específico da R&D Systems.

Resultados

Os resultados são mostrados no gráfico da figura 12. Isto mostra que OPN-305 suprime respostas de TLR2 em murinos em um modo amplamente semelhante à inibição de OPN301. Consequentemente, OPN-305 é reação cruzada, pelo que se liga ao Receptor tipo Toll 2 expresso na superfície ou nas células de murino. Concluindo, foi demonstrado que OPN305 suprime a secreção de TNF-α a partir de macrófagos de J774 de murino que foram estimulados com um agonista TLR2.

Exemplo 6 - Reatividade cruzada de OPN-305 para

129

Receptor tipo Toll 2 de macaco

Experiências adicionais foram realizadas para determinar a especificidade de ligação de OPN-305 para Receptor tipo Toll 2, expressa em células de macaco. Isto identificaria se o anticorpo OPN-305 obteve reatividade cruzada a uma ampla variedade de formas de Receptor tipo Toll 2 de mamífero, em relação apenas às formas humana e de murino.

A ligação de OPN-305 ao Receptor tipo Toll 2 de macaco foi determinada tanto por ligação direta ao anticorpo quanto ensaio de competição.

(i) Ligação direta

Células sanguíneas integrais de macacos cinomolgos foram incubadas com 1,0 pg/mL de OPN-305 ou um anticorpo de controle de isotipo IgG4 durante 30 minutos à temperatura ambiente, em seguida, incubadas com PharmLyse (BD Biosciences) para lisar as hemácias seguido por detecção com IgG4 anti-humano marcado FITC.

Os resultados são mostrados nas figura 13A, B e C. Os diferentes tipos de células foram agrupados de acordo com suas características de dispersão a frente e lateral. A figura 13A se refere aos granulócitos. A figura 13B se refere aos monócitos. A figura 13C se refere aos linfócitos. A ligação foi demonstrada por um deslocamento

130 do histograma para a direita das células incubadas com OPN305 (histograms azul - sendo este o pico no lado direito do grupo de picos) em comparação com células incubadas com anticorpo de controle de isotipo (histograma verde - sendo este o segundo pico, se movendo da esquerda para a direita, este pico sendo de cor mais clara) . Os resultados nas figuras 13A e 13B mostram que o pico azul se deslocou mais à direita que o pico verde. Isto mostra que OPN-305 se liga ao TLR2 de macaco que é expresso em granulócitos e monócitos. OPN-305, portanto, apresenta uma ampla reatividade cruzada para Receptor tipo Toll 2, expressa em diferentes tipos de células.

(ii) Ensaio de competição

Células sanguíneas integrais de macacos cinomolgos foram incubadas com 1,0 pg/mL de OPN-301 biotinilado tanto sozinhas quanto na presença de 1,0 pg ou 10 pg/mL de OPN305 ou um anticorpo de controle de isotipo IgG4 (para OPN305) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram então lavadas e incubadas com estreptavidina conjugada ao PECy7 por mais 30 minutos.

O anticorpo monoclonal OPN-301 é um anticorpo antiTLR2 IgGl de murino (anticorpo de Receptor tipo Toll 2 de camundongo (TLR2), clone T2.5, HyCult Biotecnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: número de catálogo 1054).

131

O anticorpo monoclonal OPN-305 é um anticorpo plenamente humano apresentando a cadeia leve definida no presente documento como SEQ ID NO: 2 e uma cadeia pesada conforme definida no presente documento na SEQ ID NO: 5.

A ligação foi medida utilizando FACScalibur da Becton Dickinson. Os resultados são mostrados nas figuras 14A, B e C. A figura 14A se refere aos granulócitos. A figura 14B se refere aos monócitos. A figura 14C se refere aos linfócitos. A ligação de OPN-305 é demonstrada por um deslocamento para a esquerda dos histogramas verdes (representando OPN-301 + OPN-305) em comparação com OPN-301 sozinho (histogramas pretos) que demonstra que OPN-305 está competindo com o OPN-301 para a ligação ao TLR2 de macaco. Por conseguinte, pode ser visto novamente que OPN-305 está competindo para ligação ao Receptor tipo Toll 2 de macaco. Isto confirma, adicionalmente, que OPN-305 apresenta reação cruzada ao Receptor tipo Toll 2, expressa em células humanas de camundonqo ou macaco.

Exemplo 7 - Imunogenicidade do anticorpo monoclonal OPN-305

Análise do anticorpo OPN-305 foi realizada para determinar a presença de epitopos imunogênicos que podem resultar em uma resposta imune, tal como uma resposta HAMA, que surge contra o anticorpo pelo indivíduo ao qual o

132 anticorpo é administrado. Conforme revelado anteriormente no presente documento, a presença de epítopos de células T é altamente indesejável, uma vez que isto resultaria na produção de uma resposta neutralizante de anticorpo contra o anticorpo, pelo que o anticorpo não é mais apropriado para administração ao paciente para fins terapêuticos. O anticorpo OPN-305 foi, portanto, peneirada para assegurar que nenhum epítopo de células T estivesse evidentemente presente.

Materiais e Métodos:

Preparação e Seleção de PBMC de Doadores

As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas de buffy coats de doadores de uma comunidade saudável (sangue extraído dentro de 24 horas) obtidas do National Blood Transfusion Service (Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Reino Unido). PBMC foram isoladas de buffy coats por centrifugação de densidade Lymphoprep™ (Axis-Shield, Dundee, Reino Unido) e as células T CD8+ foram esgotadas usando CD8+ ROSETTESEP™ (StemCell Technologies Inc., Londres, Reino Unido). Os doadores foram caracterizados através da identificação de haplótipos HLA-D usando um kit de tipagem de tecido com base em Biotest SSP-PCR (Biotest, LandsteinerstraPe, Dinamarca), bem como por determinação das respostas das células T a uma hemocianina do molusco

133 keyhole limpet (lapa californiana) de antigeno de controle (KLH) (Pierce, Rockford, EUA) . As PBMC foram então congeladas e armazenadas em nitrogênio liquido até serem necessárias.

Uma coorte de 21 doadores foi selecionado para melhor representar o número e a frequência de alótipos de HLA-DR expressos na população mundial. A análise dos alotipos expressos na coorte contra aqueles expressos na população mundial revelou que a cobertura de > 80% foi atingida e que todos os principais alelos HLA-DR (alotipos individuais com uma frequência > 5%, expressos na população mundial) foram bem representados.

Ensaios de proliferação de célula T em curso de tempo EpiScreen

O anticorpo foi submetido a análise para determinar a presença de epitopos de células T como ensinado no Pedido de Patente Internacional WO número 2007/099341. As PBMCs de cada doador foram descongeladas, contadas e viabilidade avaliada. As células foram reavivada a temperatura ambiente em meio de cultura AIMV (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) e ressuspensas em AIMV a 4,6 x 10⁶ PBMC/mL. Para cada doador, culturas em volume foram estabelecidas, nas quais um total de 1 mL do estoque de células de proliferação foi adicionado a uma placa de 24 poços. Um total de 1 mL de

134 cada amostra de teste diluída foi adicionado às PBMCs para fornecer uma concentração final de 50 pg/mL por amostra. Para cada doador, um controle positivo (células incubadas com 100 pg/mL de KLH) e um controle negativo (células incubadas apenas com meio de cultura) foram também incluídos. Um controle adicional foi incluído para os quatro primeiros doadores, de modo a testar a modulação de respostas das células T pelas amostras de ensaio, onde a amostra de teste e KLH foram ambos adicionados às PBMC. A comparação destas amostras com KLH por si só pode ser usada para avaliar os efeitos das amostras de ensaio na proliferação. As culturas foram incubadas durante um total de 8 dias a 37°C com CO₂ a 5%. Nos dias 5, 6, 7 e 8, as células em cada poço foram suavemente ressuspensas e alíquotas de 3 x 100 pL foram transferidos para poços individuais de uma placa de fundo redondo de 96 poços. As culturas foram pulsadas com 1 pCi [³H]-Timidina (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, USA) em 100 pL de meio de cultura AIMV e incubadas durante mais 18 horas antes da colheita em esteiras de filtro (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, USA) utilizando um colhedor de células TomTec Mach III. Contagens por minuto (cpm) para cada poço foram determinadas por MELTILEX™ (Perkin Elmer™, Waltham, Massachusetts, USA) contagem de cintilação em um Microplate

135

Beta Counter no modo de contagem de fundo baixo paralux. A fim de avaliar a toxicidade em potencial das amostras de ensaio, as contagens de viabilidade celular (usando contador VICELL™ e exclusão por corante azul de tripano) foram realizadas em amostras de culturas de teste e meios de controle KLH pra os primeiros 10 doadores, após sete dias de incubação.

Análise de Dados EpiScreen

Para os ensaios de proliferação, um limite empírico de um índice de estimulação (SI) igual ou maior que 2 (SI 2), foi previamente estabelecido, pelo que as amostras que induzem respostas proliferativas acima desse limite são consideradas positivos (quando incluído, limítrofe SIs > 1,95 são destacados). Desenvolvimento do ensaio extensivo e estudos anteriores mostraram que este é o sinal mínimo para limite de ruído permitindo sensibilidade máxima sem detectar um grande número de falsas respostas positivas. Para conjuntos de dados de proliferação (n = 3), respostas positivas foram definidas por limites estatísticos e empíricos:

O significado de (p < 0,05) da resposta por comparação de com dos poços de teste contra poços de meio de controle usando Teste t de Student de duas amostras não emparelhadas.

136 índice de estimulação maior que 2 (SI> 2), onde SI = média de poços de teste (cpm) /média de poços de meio de controle (cpm).

Além disso, a variação intraensaio foi avaliada por cálculo do coeficiente de variação e o desvio padrão (SD) dos dados em bruto a partir de culturas em duplicata.

Resultados

O anticorpo OPN-305 anti-TLR2 (VK5/VH4) foi purificado até à homogeneidade por cromatografia de afinidade com a proteína A, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho.

A variante denominada VK5A/H4 é o anticorpo monoclonal OPN-305 plenamente humanizado revelado no presente documento. O anticorpo monoclonal OPN-305 é um anticorpo plenamente humanizado apresentando uma sequência de aminoácidos de cadeia definida no presente documento como SEQ ID NO: 2 e uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada definida no presente documento como SEQ ID NO: 5.

Todas as preparações derivaram de picos individuais que representam anticorpo não agregado, monomérico, o (figuras 15 A e B) tendo sido verificado que continham endotoxina a <5 EU/mg.

As três amostras de teste foram testadas contra um coorte de 21 doadores saudáveis, utilizando ensaios de

137 célula T de curso de tempo EpiScreen™ (Antitope, Reino Unido) a fim de determinar o risco relativo de imunogenicidade. As amostras foram testadas a uma concentração final de 50 pg/mL, uma vez que esta quantidade forneceu uma concentração de saturação que foi suficiente para estimular respostas de células T especificas para proteína destacável.

Os resultados da modulação de células T e estudos de toxicidade de células foram analisados. As viabilidades das células nas culturas após sete dias variaram de 65% a 95% e foram semelhantes entre todas as amostras testadas, os meios de controle e de KLH. As amostras de teste não foram, portanto, consideradas como apresentando um efeito tóxico nas células utilizadas no ensaio. Além disso, a figura 16 mostra que não há diferenças significativas (Teste t de Student p <0,05) entre o SIs induzidos por KLH por si só ou na presença das amostras de teste. Isto sugere que as amostras não modulam diretamente a ativação da célula T CD4 + em resposta ao KLH (antígeno de controle). A figura 16 mostra os resultados de uma pré-classificação das amostras de teste quanto à citotoxicidade e a atividade de modulação de células T. A amostra 1 é anti-TLR2 quimérico (o fragmento F'ab derivado do anticorpo T2.5 de murino conjugado com a região Fc de lgG4 humano), a amostra 2 é o

138 anticorpo OPN-305 anti-TLR2 (VK5/VH4, OPN305), amostra 3 é uma variação do anticorpo anti-TLR2 denominado VK5/VH5.

Os resultados do ensaio de proliferação de curso de tempo EpiScreen realizado com o OPN-305 (VK5/VH4, OPN-305) e anticorpos anti-Receptor tipo Toll 2 comparativos VK5/VH5, bem como, anticorpos quiméricos anti-TLR2 foram analisados (figura 17A, B e C). O anticorpo anti-TLR2 quimérico estimulou respostas em 4 dos 21 doadores (18% do estudo de coorte), onde o Slh 2 e importância foram alcançados no teste t de Student (p <0,05). O doador 20 forneceu uma resposta particularmente vigorosa com SIs elevado durante todo o periodo de teste e uma resposta forte (SI = 6,99) foi também observada com o doador 3 no dia 6. Em contraste, nenhum dos doadores no coorte de estudo respondeu positivamente ao OPN-305. O anticorpo OPN305 (VK5/VH4), portanto, não produz quaisquer respostas de células T significativas nos doadores que responderam positivamente ao anticorpo quimérico.

Conclusões

As respostas de proliferação de célula T C4+ positiva observadas no ensaio de célula T de curso de tempo EpiScreen™ contra o anticorpo quimérico estavam na faixa esperada de 15 a 40%. De modo importante, respostas de célula T potentes e frequentes foram observadas contra o

139 antígeno de controle, KLH, o que indica que o ensaio funcionou como esperado. Os resultados também mostraram que o anticorpo plenamente humanizado OPN-305 (VK5/VH4) não conseguiu induzir qualquer resposta imune positiva em quaisquer doadores e este anticorpo é, por conseguinte, considerado como apresentando um baixo risco de imunogenicidade na clínica.

A figura 18 mostra uma clara correlação entre o nível de imunogenicidade observado utilizando o ensaio EpiScreen™ e o nível de imunogenicidade (respostas antiprotéicas de anticorpos terapêuticos) que tenha sido realmente observada na clínica contra um grande painel de proteínas terapêuticas (Baker e Jones, 2007). Níveis elevados de imunogenicidade foram observados em ambos os dados clínicos e ensaios EpiScreen™ para proteínas tais como Infliximab e Campath, enquanto que os níveis relativamente baixos de imunogenicidade foram observados para proteínas tais como Xolair, Herceptin, e Avastin. De modo importante, o anticorpo OPN-305 induziu respostas em < 10% do coorte de estudo, o que, com Bse na experiência anterior, está associado aos bioterapêuticos com um baixo risco de imunogenicidade.

Exemplo 8 - Determinação e comparação da afinidade de ligação do anticorpo monoclonal OPN-305

140

Biossensores imunológicos, por exemplo instrumentos de ressonância de plasmônio de superfície (SPR) BIACORE™ que medem a ligação e de dissociação de complexos antígenoanticorpo, em tempo real, permitem a elucidação da cinética de ligação. A taxa de dissociação de um composto e a sua subsequente otimização são especialmente importantes para o desenvolvimento de anticorpo biofarmacêutico. BIACORE utiliza ressonância de plasmônio de superfície (SPR) para monitorar a interação entre uma molécula de ligação de superfície ligante e seu parceiro de ligação na solução, analisado em tempo real. SPR é um fenômeno de onda de densidade de carga de elétrons, que surge na superfície de uma camada metálica, quando a luz é refletida na camada sob condições de refletância interna total. Os plasmônios de superfície que são gerados são sensíveis a alterações no índice de refração do meio no lado oposto da camada metálica a partir da luz refletida. Interações proteínaproteína que ocorrem na superfície afetam o índice de refração do meio e, por conseguinte, podem ser detectadas. A ligação das moléculas à superfície do sensor modificada pelo ligante gera uma resposta que é proporcional à massa de ligação permitindo pequenas alterações na quantidade de analisado ligado a ser detectado (níveis de picograma baixo para alto). A técnica pode ser usada para medir as

141 constantes de afinidade (KD) ao longo do intervalo de 10 ⁵a 10 M, as constantes de taxa de associação (ka) entre 103 e 107 M-ls-1 e constantes de taxa de dissociação (kd) entre 10’¹ e 10'⁶s¹ (1-3).

O objetivo deste estudo foi utilizar um instrumento de ressonância de plasmônio de superfície BIACORE T100 (Biacore, Inc.) para a caracterização de cinética de alta resolução da interação entre dois receptores correlatos e três mAbs. Os dois receptores sob investigação eram rhTLR-2 recombinante (TLR-2 recombinante humano) e rmTLR2/Fc (TLR2 recombinante de murino).

Materiais e métodos

Preparação do Instrumento

Antes de operar quaisquer amostras uma verificação do sistema (Biacore Preventative Maintenance Kit 2) foi realizada. Todos os sistemas testados passaram na verificação (bomba de reagente, refratômetro, injeções, Seletor de ruído, mistura e tampão), indicando que o instrumento estava de acordo com os critérios definidos pelo fabricante. Após a verificação do sistema, o programa de dessorção/sanitizante (Biacore Preventative Maintenance kit 2) foi operado para limpar o instrumento.

Desenvolvimento de Ensaio

Preparação do Sistema

142

Após a inserção do chip CM5 o sistema foi purgado e depois normalizado com solução BIAnormalising (Biacore Preventative Maintenance kit 2). Todas as amostras foram operadas a 25°C com um suporte de amostras incubadas a 25°C a menos que indicado de outra forma. O chip foi adicionado ao sistema com HBS-EP utilizado como o tampão de operação. A superfície do chip foi preparada com duas injeções de 30 segundos de 50 mM NaOH, em seguida, descansou até uma linha de base estável ser obtida em todas as células de fluxo (Fcs) .

Preparação da Amostra

Dois anticorpos foram analisados, o anticorpo OPN-305 do anti-Receptor tipo Toll 2,conforme descrito no presente documento e o anticorpo de murino T2.5 anti-Receptor tipo Toll 2 (derivado do clone de hibridoma de T2.5 HyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton, USA: número de catálogo 1054). Ambos os anticorpos monoclonais foram armazenados conforme fornecidos e diluídos para 1 pg.mL'¹para todas operações de imobilização. Os receptores rhTLR-2 e rmTLR2/Fc foram reconstituídas a partir de pó seco usando HBS-PE a uma concentração final de 1.000 nM e armazenados a 4°C. Nenhuma proteína transportadora foi armazenada nesta solução.

Condições de imobilização e atividade

143

Um ensaio direto foi escolhido para este estudo com base nos resultados de um estudo anterior, onde esta configuração foi mostrada como sendo ótima. Para as experiências de cinética a quantidade de ligante imobilizado necessita ser limitada para evitar os efeitos de transferência de massa na superfície do chip.

Usando um peso molecular médio (MW) de 77,5 kDa para o analisado do receptor humano glicosilado (rhTLR-2), 150 kDa para o ligante (mAb) e a estequiometria (Sm) como 2, uma quantidade alvo de ligante para imobilização seria de 145RUs. Este nível de imobilização foi também adequado ao receptor de murino, apesar de ter um MW de 98 kDa.

Todos os anticorpos foram imobilizados usando química de acoplamento padrão de amina. A imobilização foi realizada a uma concentração de proteína de cerca de 1 pg.mL'¹ em 10 mM de tampão de acetato, pH 5,5 a um nível de resposta alvo de 150RUs nos três chips sensores série S CM5. Os dados cinéticos foram obtidos em uma vazão de 40 pL.min'¹ para minimizar quaisquer efeitos em potencial de transferência de massa. O branco (sem receptor) e uma concentração simples de analisados (100 nM) foi repetida no início das operações de cinética, a fim de verificar a estabilidade da superfície e dois receptores sobre as análises de cinética. Duas repetições da análise cinética

144 foram realizadas e os resultados comparados.

A fim de observar um decréscimo de sinal suficiente (3-10%) durante a fase de dissociação dos ciclos cinéticos, a dissociação foi medida por 2.000 segundos.

Resultados

Os resultados são mostrados na Tabela 1. As taxas de associação (Kon) e taxas de dissociação (Koff) foram calculadas usando um modelo de ligação bivalente (BIAcore Evaluation Software versin 3.2). A constante de dissociação de equilíbrio (Ko) foi calculada como a razão de kon/kon.

Tabela 1

	TLR2 de murino	TLR2 humano
Anticorpo	ON	OFF	Kd(M)	ON	OFF	Kd(M)
Kd (1/MS)	Kd (1/s)	Kd (1/MS)	Kd (1/s)
T2.5	9703	0,000141	1,56 x IO’⁸	4819	0,000230	4, 82 x 10^-8
OPN-305	6772	0,000082	1, 19 x IO’⁸	3098	0,0000895	2,89 x IO’⁸

Os resultados indicam que OPN-305 se liga tanto ao

Receptor tipo Toll 2 humano quanto ao Receptor tipo Toll 2 de murino com uma maior afinidade de ligação que o anticorpo monoclonal T2.5. A figura 19 mostra um alinhamento apresentando a identificação da sequência entre sequências de aminoácidos do anticorpo OPN-305 plenamente humanizado de anti-TLR2 e o anticorpo T.5 de murino antiTLR2. A divergência da identidade de sequência de mais de

145

10% pode ser vista. Além disso, a figura 20 mostra um alinhamento das sequências de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo OPN-305 plenamente humanizado anti-TLR2 e o anticorpo T.5 de murino anti-TLR2. Novamente, uma divergência de identidade de sequência de mais de 10% está presente. Sem querer ser limitado pela teoria, o inventor prevê que as variações na sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada do anticorpo-305 OPN, mais o anticorpo T2.5 de murino conferem especificidade de ligação aperfeiçoada e afinidade ao anticorpo OPN-305 para Receptor tipo Toll 2.

Exemplo 9 - Estudos de ocupação do receptor TLR2

Este experimento foi desenvolvido para identificar os níveis de ocupação mínimos necessários para a inibição da atividade biológica do anticorpo monoclonal OPN-305 quando da ligação ao TLR2. Ligação versus função foi examinada usando uma linhagem de células repórter THP-1. Especificamente, a bioatividade de OPN-305 foi avaliada em células THP1-CD14 induzidas por Pam3CSK4 induzidas.

Materiais e Métodos

As células THP1-CD14 foram semeadas a uma densidade de 1 x 10⁶ células por poço em uma placa de 12 poços. OPN-305 foi adicionado aos poços em várias concentrações (variando de 0,000488 pg/mL a 2 pg/mL) antes da adição de Pam3Csk4

146 (200 ng/mL). As células foram incubadas durante a noite a 37°C. A atividade SEAP direcionada por NF-kB foi medida através da incubação dos meios condicionados inativados pelo calor com 160 pL de reagente Quantiblue (Invivogen) durante 90 minutos a 37°C e a absorbância foi lida a 650 nm.

Para determinar ocupação do receptor de OPN305 nas células THP1-CD14, as células THP1-CD14 Blue foram colocadas em tubos FACS (lxl0⁶/tubo) e FcR foram bloqueados com reagente de bloqueio anti-CD32 (Mitenyl Biotec) durante 15 minutos. As células foram marcadas com OPN-305 nas várias concentrações (variando de 0,000488 pg/mL a 2 pg/mL) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem, as células foram incubadas com IgG4 anti-humano conjugado RPE por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a etapa de lavagem finas as células foram fixadas com uma solução salina de formol a 2% em BSA/PBS a 1% antes da aquisição. A porcentagem de ligação específica foi calculada utilizando a fórmula:

% de ligação especifica = [MFI OPN3Q5 - Isotipo MFI * 100] [Max MFI (OPN305)-Isotipo MFI]

Resultados

Os resultados são mostrados nas figuras 2 A, B e C. Estes resultados mostram que a inibição da atividade de NF

147 kB é observada de um modo dependente da dose após o tratamento com Pam3Csk4 (figuras 21A e B) . OPN-305 inibe quase completamente a atividade de NF-kB, em concentrações de 2 pg/mL (figura 21C) . A porcentagem de ligação especifica de OPN-305 nas células THP1-CD14 foi calculada utilizando a fórmula descrita acima.

Experimentos de saturação de ligação com células THP-1 foram relacionados de volta para a inibição da atividade biológica nas mesmas populações de células. A inibição completa da sinalização dependente de TLR2 pode ser obtida com menos que a ligação máxima ao receptor. Este é um sistema complexo e parece provável que os níveis de TLR2 sejam significativamente maiores que nos parceiros heterodiméricos TLR1 e TLR6. A ocupação do receptor se parece na saturação de ligação de TLR2 como um monômero ou heterodímero. Parece provável que a neutralização de TLR2 suficiente para reduzir a probabilidade de TLR2 livre de encontrar um parceiro para formar um complexo de ligação funcional pode ser uma explicação para a perda aparente de atividade biológica em menos de 100% da ocupação do receptor.

Exemplo 10 - Determinação se o anticorpo OPN-305 atua como um inibidor competitivo ou não competitivo de sinalização dependente de TLR2

148

Materiais e métodos

Células THP1 CD14 Blue foram semeadas a 100.000 células por poço em uma placa de 96 poços. As células foram brevemente pré-incubadas com 0, 1, 10 e 100 ng/mL de OPN305 antes de serem estimuladas com doses variáveis de Pam3Csk4 durante a noite a 37 °C. Quarenta microlitros de sobrenadante foram removidos e inativados em aquecimento a 65°C por 10 minutos. A atividade SEAP orientada por NF-kB foi medida por incubação dos meios condicionados, inativados por calor com 160 pL de regente Quantiblue (Invivogen) durante 90 minutos a 37°C seguido por leitura a 650 nm. Presumindo que o receptor no ensaio com base em célula se comporte de modo semelhante a uma enzima, V(atividade NF-kB) versus S [Pam3CSK4] foi representada graficamente, bem como gráficos Lineweaver-Burk recíprocos duplos (1/v versus 1/s).

Resultados

Os resultados são mostrados na figura 22, onde a figura 22A mostra a atividade de SEAP dependente de NF-kB versus [Pam3CSK4], enquanto que a figura 22B ilustra um gráfico Lineweaver Burk de 1/V versus 1/S.

Estes resultados mostram que à medida que a concentração de ligante é aumentada, um deslocamento clássico para a direita da curva de dose-resposta é

149 observado (figura 22A) . A análise dos gráficos Lineweaver Burk (figura 22) sugere um mecanismo competitivo na concentração baixa do ligante, porém que a cinética muda conforme o ligante excede um limite determinado. O estabelecimento da natureza do efeito inibidor é um desafio nas células, uma vez que a leitura é atividade biológica e depende não apenas da interação de TLR2/ligante, porém também do recrutamento de TLR1 ou TLR6 para gerar um complexo de sinalização dimérico competente. A análise da expressão de perfis utilizando bases de dados publicamente disponíveis sugere que TLR2 está presente em excesso significativo para TLR1 ou TLR6 o que pode explicar o potencial para uma resposta bifásica como um efeito de titulação das moléculas parceiras.

Exemplo 11 - Determinação se a ligação de OPN-305 ao TLR2 altera a resposta aos outros ligantes de TLR2

Este experimento considerou se a inibição de TLR2 por OPN-305 afeta a resposta de outros TLRs aos seus respectivos ligantes.

Materiais e Métodos

Células THP1 CD14 Blue foram semeadas em 25.000 células por poço em uma placa de 384 poços. As células foram pré-incubadas durante 120 minutos com 0, 1, 10 e 100 ng/mL de OPN-305 ou um anticorpo de controle de isotipo

150

IgG4 humano antes de serem estimuladas com doses variáveis de diferentes agonistas de ligação de Receptor Tipo Toll. A atividade de SEAP direcionada por NF-kB foi medida diretamente nos meios condicionados, seguindo-se incubação durante a noite usando meios de detecção HEK blue.

Flagelina foi utilizada como um ligando TLR5, LPS ultra puro como um ligante TLR4 e Pam3CSK e FSL-1 como ligantes TLR2.

Resultados

Os resultados são mostrados nas figuras 23A, B e C. As respostas a flagelina (figura 23C) e LPS (figura 23B) foram inalteradas quando comparadas às células de controle não expostas ao OPN-305. Como esperado as respostas de ativação de TLR2 mediadas por Pam3CSK e FSL-1 foram bloqueadas por OPN-305 (figura 23A). As respostas à flagelina e LPS não se alteraram em relação às células de controle não expostas ao OPN-305. Como esperado, as respostas Pam3CSK e FSL-1 foram bloqueadas por OPN-305. Isso sugere que OPN-305 não está provocando um aumento inesperado ou diminuição da resposta de TLR4 ou TLR5 aos ligantes.

Exemplo 12 - Utilização de OPN-305 no tratamento de sépsis

Materiais e Métodos:

Grupos de fêmeas de camundongos BALB/c (n = 4) foram

151 tratados com o anticorpo monoclonal OPN-305 nas doses de 10 mg/kg, 2 mg/Kg e 0,4 mg/kg 30 minutos antes do tratamento com 100 pg de Pam3Csk4. Todos os tratamentos foram administrados de forma intraperitoneal. Quatro horas mais tarde, os camundongos foram sacrificados por anestesia letal e sangue foi colhido. O soro foi obtido e concentrações de citocinas foram determinadas por ELISA. O soro foi diluído 1/10 para KC e IL-12p40 e 1/5 para a IL-6 ELISAs.

Resultados:

Os resultados são mostrados nas figuras 24A, B e C. OPN-305 mostrou inibir sépsis induzida por Pam3Csk4. Uma dose baixa de administração (0,4 mg/kg) de OPN-305 antiTLR2 pode inibir significativamente citocinas induzidas por Pam3Csk4 em camundongos.

Esta experiência foi também repetida com OPN-305 usando apenas a administração i.v. (intravenosa) do anticorpo OPN305 seguido por injeção i.p. (intraperitoneal) de agonista TLR2 Pam3CSK para assegurar que os efeitos positivos não fossem uma consequência do anticorpo e agonista sendo liberados para o mesmo compartimento.

Os resultados desta experiência são mostrados nas figuras 25A e B. Os resultados mostram que o anticorpo monoclonal OPN-305 inibe a sépsis induzida por Pam3Csk4.

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Este resultado é equivalente ao experimento anterior, demonstrando que este OPN-305 liberado sistemicamente pode inibir a produção de citocina no soro em resposta a administração i.p. (intraperitoneal) de Pam3CSK.

Exemplo 13 - A ligação do anticorpo monoclonal OPN-305 ao TLR2 expresso nas células de rato

Materiais e métodos

Células NR8383 foram adquiridas do ATCC e cultivadas em meios FK12 conforme instruído pelo ATCC. As células foram bloqueados com anti-CD32 específico para rato (IgGl de rato) durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram tratadas com OPN305 (ou isotipo) durante 15 minutos, lavadas, detectadas com IgG4 anti-humano RPE e fixadas com salmoura em formol a 2% antes da aquisição. As células NR8383 foram também coradas com um anticorpo TLR2 anti-rato de coelho, policlonal e detectadas com IgG anticoelho Alexa-Fluor 488.

Resultados:

Os resultados são apresentados na figura 26 que mostra que TLR2 é expresso em macro fagos alveolares de ratos (NR8383), e é detectado usando OPN305. (A) células não coradas, (B) controle positivo; anticorpo primário TLR2 anti-rato de coelho policlonal, o anticorpo secundário era Alexa-Fluor 488 anti-coelho; (C) As células tratadas com

153 anticorpo policlonal secundário IgG4 humano eram anti-IgG4 PE humano; (D) células coradas de OPN305, anticorpo secundário anti-humano IgG4 PE.

Exemplo 14 - Ligação de anticorpo monoclonal OPN-305 ao TLR2 expresso em células porcinas

Materiais e métodos

PBMCs do porco foram purificadas do sangue usando Ficoll. As células foram contadas e IxlO⁶ células foram colocadas por tubo. Na ausência de um reagente de bloqueio específico para suínos, as células foram bloqueadas usando anti-CD32 humano em uma matriz de 50% de FCS/BSA em PBS durante 10 minutos. As células foram incubadas com OPN305 (ou controle de isotipo) durante 15 minutos à temperatura ambiente. 1H11 (TLR2 anti-porco de camundongo, cortesia de Javier Dominguez) foi utilizado como um controle positivo. Após a lavagem, as células foram incubadas com IgG4 antihumano conjugado com EPR durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a etapa de lavagem final, as células foram fixadas, adquiridas e analisadas.

Resultados

Os resultados são mostrados na figura 27. TLR2 é expresso em PBMCs suína e é corado por OPN305. PBMCs foram purificados por separação usando Ficoll. A-C representa PBMCs de Pig 666 e D-F é originário de Pig 488. A, D não

154 são corados; Β, E são marcados com IgG4 humana policlonal de controle, seguido por coloração secundária com IgG4

anti-humana	marcada com PE;	C, F são marcados	com OPN305,
seguido por	IgG4	anti-humana	marcada com	PE.
5 Todos	os	documentos	referidos	neste	relatório
descritivo	são	incorporados	ao mesmo	como	referência.

Várias modificações e variações das modalidades descritas da invenção serão evidentes aos versados na técnica sem se afastar do âmbito da invenção. Embora a invenção tenha sido 10 descrita em conexão com modalidades preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção, tal como reivindicada, não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. Na verdade, várias modificações dos modos descritos de se realizar a invenção e que são evidentes aos 15 versados na técnica devem ser englobadas pela presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antigeno do mesmo caracterizado pelo fato de compreender compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1, e um domínio variável de cadeia pesada compreendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno especificamente liga ao Receptor do tipo Toll 2 (TLR2) e em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno antagoniza TLR2 independente da ligação do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno ao CD32, e em que o domínio variável da cadeia leve compreende CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9, e o domínio variável da cadeia pesada compreende CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12.
2. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do domínio variável de cadeia leve estar unido a um domínio constante Kappa.

3. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do domínio variável de cadeia pesada estar unido a pelo menos um domínio constante

derivado de um anticorpo da subclasse de imunoglobulina G, isotipo4 (IgG4). 4. Anticorpo neutrali zante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do resíduo de aminoácido 241 da

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região de dobradiça da cadeia pesada ser substituído de um resíduo de serina para um . resíduo de prolina (S241P). 5. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da cadeia leve compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO :2. 6. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO :5. 7. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da cadeia pesada compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO :5. 8. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pelo fato do anticorpo ser um anticorpo totalmente humanizado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo.

9. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do anticorpo ser um anticorpo isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo.

10. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se ligar ao Receptor do tipo Toll 2 com um KD de 3x10-8M ou menos.

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11. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 e/ou a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6.

12. Célula hospedeira procariótica caracterizada pelo fato de compreender o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 11.

13. Método de preparação de anticorpos neutralizantes do Receptor do tipo Toll 2 ou porção de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira procariótica conforme definida na reivindicação 12 sob condições apropriadas, de forma que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo é expresso e isolar os anticorpos ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos da célula hospedeira ou do sobrenadante da cultua de células.

14. Anticorpo neutralizante ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo possuir especificidade de ligação ao Receptor do tipo Toll 2 humano, Receptor do tipo Toll 2 de camundongo e Receptor do tipo Toll 2 de macaco.

15. Uso de um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição doença selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, psoríase, dermatite, esclerose múltipla, aterosclerose, lesão isquêmica por reperfusão, doença

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4/4 ocular, uveíte, degeneração macular relacionada com a idade, ou diabetes.

16. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que se liga a um epítopo de Receptor do tipo Toll 2 humano com

um K_D de 3x10 ⁸ ou menos, e que media o antagonismo de Receptor do tipo Toll 2 independente de ligação do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo ao CD32 (receptor Fc gamma II), em que o epítopo é reconhecido por um anticorpo de referência, em que o anticorpo de

referência compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

17. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o anticorpo de referência compreender a cadeia pesada da SEQ ID NO:5 e a cadeia leve da SEQ ID NO:2.

18. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo possuir especificidade de ligação ao Receptor do tipo Toll 2 humano, Receptor do tipo Toll 2 de camundongo e Receptor do tipo Toll 2 de macaco.