KR20210049792A - 인간 il-4r 결합 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

인간 il-4r 결합 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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주펑 쉬
지아훠 지앙
리안샨 장
쉐밍 치엔
페이 텅
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지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 개시는 인간 IL-4R 결합 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다. 인간 IL-4R 결합 항체 및 이의 항원 결합 단편으로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체 및 인간화 항체, 인간 IL-4R 결합 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물, 및 알레르기 질환을 치료하는 약물로서의 이의 용도가 제공된다. 또한, IL-4R 매개성 질환 또는 병의 치료에 사용되는 약물의 제조에 있어서 인간화 항체 IL-4R 결합 항체의 용도가 제공된다.

Description

인간 IL-4R 결합 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도
본 출원은 2018년 8월 24일 출원된 중국 출원 CN201810971269.2, 2018년 12월 4일 출원된 중국 출원 CN201811472752.2, 2019년 3월 22일 출원된 중국 출원 CN201910221311.3, 및 2019년 5월 15일 출원된 중국 출원 CN201910401923.0의 우선권을 주장한다. 위에 기술된 바와 같은 출원 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시는 인간 IL-4R에 결합하는 항체, 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 위의 항체로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체 또는 인간화 항체, 및 인간 IL-4R에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물, 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약으로서의 이의 용도에 관한 것이다.
알레르기 질환은 일정 기간에 걸쳐 치유될 수 있는 생명을 위협하지 않는 알레르기 반응 및 생명을 위협하는 알레르기 질환을 포함하는 심각한 의학적 병태이다.
현재 알레르기를 치료하는 방법에는 알레르기 항원 회피, 증상의 약리학적 치료, 및 알레르기원 특이적 면역요법을 이용한 예방이 포함된다.
인터류킨-4(IL-4, B 세포 자극 인자 또는 BSF-1로도 알려짐)는 낮은 농도의 항-표면 면역글로불린 항체에 대한 반응으로 B 세포 증식을 자극하는 능력을 특징으로 한다. IL-4는 T 세포, 비만 세포, 과립구, 거핵구 및 적혈구 등의 성장을 자극하는 것을 포함하는 광범위한 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. IL-4는 휴식 중의 B 세포에서 MHC-II의 발현을 유도하고, 활성화된 B 세포에 의한 면역글로불린 IgE 및 IgG1의 분비를 증진시킨다.
IL-4의 생물학적 활성은 특정 세포 표면 IL-4 수용체(IL-4Rs)에 의해 매개된다. IL-4 수용체(IL-4R)는 802개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, IL-4R은 T 세포, B 세포, 흉선 세포, 골수 세포, 대식세포 및 비만 세포의 표면에서 발현된다. IL-4R의 α 쇄는 IL-13 수용체(IL-13R)의 구성 요소이기도 하므로, IL-4R은 IL-13의 생물학적 활성도 매개할 수 있다. 새로운 치료 방법으로서, IL-4R 길항제를 포함하는 의약 또는 조성물은 대상체의 알레르기원에 대한 노출 전, 중, 또는 후에, 또는 대상체의 알레르기 증상 발현 전, 중, 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
현재 여러 나라의 많은 제약 회사들은 다양한 관련 알레르기 질환의 치료를 위해 IL-4R에 대한 단클론 항체를 개발하고 있다. 관련 특허 출원에는 예를 들어, WO2010053751, WO2001092340, WO2008054606, WO2014031610 등이 있다. 그 중에서도 사노피 리제네론(Sanofi Regeneron)에서 개발한 천식 치료제인 두필루맙(Dupilumab)은 피부염 적응증에 대해 판매 승인을 받았다. 천식 적응증의 경우, 임상 제3상 시험도 완료되어, 시판 승인 단계에 들어갔다.
기존의 치료 전략은 효과적이지 않거나 더 큰 위험을 가지고 있다. 따라서, 높은 친화도로 hIL-4R과 결합하여 IL-4R의 생물학적 활성을 중화시킴으로써(IL-4R과의 상호작용을 차단하는 것을 포함) IL-4R 매개성 알레르기 질환을 치료할 수 있는 치료 방법뿐만 아니라, 의약 및 조성물을 제공하기 위하여, 높은 선택성 및 높은 생물학적 활성을 갖는 인간 IL-4R에 결합하는 항체를 제공할 필요성은 당해 분야에서 여전하다. 따라서, 본 발명은 이러한 필요성을 해결하고자 한다.
본원의 일부 구현예에서, IL-4R에 특이적으로 결합하는 항체(인간 IL-4R에 결합하는 항체, 항-인간 IL-4R 항체라고도 지칭됨) 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 이때, 중쇄 가변 영역은
(I) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 3, 4 및 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교 시 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체; 또는
(II) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 12 및 13에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교 시 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체;를 포함하고/포함하거나,
중쇄 가변 영역은
(I) 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교 시 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체; 또는
(II) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 14, 15 및 16에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교 시 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체; 또는
(III) 각각 서열번호 38, 서열번호 7 및 서열번호 40에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 38, 7 및 40에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교 시 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체; 또는
(IV) 각각 서열번호 42, 서열번호 39 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 42, 39 및 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교 시 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체;를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (I) 내지 (IV)로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 하나를 포함한다:
(I) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(II) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(III) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 38, 서열번호 7 및 서열번호 40에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(IV) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 42, 서열번호 39 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은
(I) 서열번호 1에 제시된 서열 또는 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(II) 서열번호 9에 제시된 서열 또는 서열번호 9와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(III) 서열번호 43에 제시된 서열 또는 서열번호 43과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고/포함하거나,
경쇄 가변 영역은
(I) 서열번호 2에 제시된 서열 또는 서열번호 2와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(II) 서열번호 10에 제시된 서열 또는 서열번호 10과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(III) 서열번호 37에 제시된 서열 또는 서열번호 37과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(IV) 서열번호 41에 제시된 서열 또는 서열번호 41과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적어도 하나의 구현예에서,
중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 바와 같거나; 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 바와 같거나; 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 43에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 37에 제시된 바와 같거나; 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 43에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 41에 제시된 바와 같다.
인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은
(I) 서열번호 25 내지 27 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 25 내지 27 중 하나와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(II) 서열번호 31 내지 33 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 31 내지 33 중 하나와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고/포함하거나,
경쇄 가변 영역은
(I) 서열번호 28 내지 30 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 28 내지 30 중 하나와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(II) 서열번호 34 내지 36 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 34 내지 36 중 하나와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 25 내지 27 중 하나에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 28 내지 30 중 하나에 제시된 바와 같다.
다른 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 31 내지 33 중 하나에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 34 내지 36 중 하나에 제시된 바와 같다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는
(I) 서열번호 17에 제시된 서열 또는 서열번호 17과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(II) 서열번호 19에 제시된 서열 또는 서열번호 19와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(III) 서열번호 44에 제시된 서열 또는 서열번호 44와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄는
(I) 서열번호 18에 제시된 서열 또는 서열번호 18과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(II) 서열번호 20에 제시된 서열 또는 서열번호 20과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(III) 서열번호 45에 제시된 서열 또는 서열번호 45와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
(IV) 서열번호 46에 제시된 서열 또는 서열번호 46과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
적어도 하나의 구현예에서, 중쇄는 서열번호 17에 제시된 바와 같고, 경쇄는 서열번호 18에 제시된 바와 같다.
또 다른 구현예에서, 중쇄는 서열번호 19에 제시된 바와 같고, 경쇄는 서열번호 20에 제시된 바와 같다.
또 다른 구현예에서, 중쇄는 서열번호 44에 제시된 바와 같고, 경쇄는 서열번호 45에 제시된 바와 같다.
또 다른 구현예에서, 중쇄는 서열번호 44에 제시된 바와 같고, 경쇄는 서열번호 46에 제시된 바와 같다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 항원 결합 단편은 뮤린(murine) 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 이의 단편이다.
일부 특정 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 포함한다:
- 인간 생식선(germline) 경쇄 IGKV3-11*01로부터 유래된 FR 영역 서열;
- 인간 생식선 경쇄 IGKV3-11*01로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이(back mutation) 서열. 일부 특정 구현예에서, 복귀 돌연변이는 L46P, L47W 및 F71Y로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 포함한다:
- 인간 생식선 중쇄 IGHV3-48*01로부터 유래된 FR 영역 서열;
- 인간 생식선 중쇄 IGHV3-48*01로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이 서열. 일부 특정 구현예에서, 복귀 돌연변이는 S49A, F67S 및 A93T로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 포함한다:
- 인간 생식선 경쇄 IGKV2D-29*01로부터 유래된 FR 영역 서열;
- 인간 생식선 경쇄 IGKV2D-29*01로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이 서열. 일부 특정 구현예에서, 복귀 돌연변이는 M4L 및/또는 V58I로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 추가로 포함한다:
- 인간 생식선 중쇄 IGHV1-2*02로부터 유래된 FR 영역 서열;
- 인간 생식선 중쇄 IGHV1-2*02로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이 서열. 일부 특정 구현예에서, 복귀 돌연변이는 M69L, R71I, T73K 및 R94K로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 프레임워크 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1의 중쇄 프레임워크 영역 또는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 43에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 43과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-IL-4R 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 κ, λ쇄의 불변 영역 또는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 44에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 또는 서열번호 44와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 위에 기술된 바와 같은 인간화 IL-4R 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.
적어도 하나의 구현예에서, 항체는 인간 IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함한다. IgG2 또는 IgG4는 ADCC 독성이 없다. 대안적으로, 아미노산 돌연변이 후 ADCC 독성(항체 의존적 세포 매개성 세포독성)이 없는 IgG1이 사용될 수 있다.
적어도 하나의 구현예에서, 변이체는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역 돌연변이를 포함한다: ADCC 기능을 감소시키거나 ADCC 기능의 소실을 초래하는 돌연변이, 예컨대, IgG1의 N297A, L234A, L235A(그러나 이에 한정되지 않음).
항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이고, 중쇄 서열은 서열번호 17에 제시된 바와 같거나 서열번호 17과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 경쇄 서열은 서열번호 18에 제시된 바와 같거나 서열번호 18과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이고, 중쇄 서열은 서열번호 19에 제시된 바와 같거나 서열번호 19와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 경쇄 서열은 서열번호 20에 제시된 바와 같거나 서열번호 20과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이고, 중쇄 서열은 서열번호 44에 제시된 바와 같거나 서열번호 44와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 경쇄 서열은 서열번호 45에 제시된 바와 같거나 서열번호 45와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이고, 중쇄 서열은 서열번호 44에 제시된 바와 같거나 서열번호 44와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 경쇄 서열은 서열번호 46에 제시된 바와 같거나 서열번호 46과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 단리된 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 이는 인간 IL-4R에 대한 결합에 대해 위에 기술된 바와 같은 인간 IL-4R에 결합하는 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하는 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체가 제공되는데, 이는 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 단쇄 항체가 제공되는데, 이는 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 제공되는데, 이는 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화한다.
다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 제공되는데, 이는 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 IL-4R 또는 이의 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 항체를 암호화한다.
다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드가 제공되는데, 이는 위에 기술된 바와 같은 이중특이적(bi-specific) 항체, 다중특이적(multi-specific) 항체, 또는 단쇄(single chain) 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 출원에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다.
일부 구현예에서, 위에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공되는데, 이는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터 또는 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포가 제공되는데, 이는 위에 기술된 바와 같은 벡터로 형질전환되고, 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
적어도 하나의 구현예에서, 원핵생물 세포는 박테리아, 예컨대, E. 콜라이(E. coli)로부터 선택된다.
적어도 하나의 구현예에서, 진핵생물 세포는 효모 및 포유동물 세포, 예컨대, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 CHO 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, IL-4R의 검출 또는 측정 방법이 제공되는데, 이는 샘플을 위에 기술된 바와 같은 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R의 검출 또는 측정 시약이 제공되며, 시약은 위에 기술된 바와 같은 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R의 검출 또는 측정 시약이 제공되며, 이는 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 IL-4R 또는 이의 에피토프(epitope)에 경쟁적으로 결합하는 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R의 검출 또는 측정 시약이 제공되며, 이는 위에 기술된 바와 같은 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 및 단쇄 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R 양성 세포와 관련된 질환의 진단을 위한 진단제를 제공하며, 이는 위에 기술된 바와 같은 상기 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 진단제는 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 IL-4R 또는 이의 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제약 조성물이 제공되며, 이는
- 본 출원에 따른 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
- 제약상 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체
를 포함한다.
일부 특정 구현예에서, 제약 조성물의 용량 단위는 본 출원에 따른 IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편 1 mg 내지 1000 mg을 포함한다.
일부 특정 구현예에서, 제약 조성물에 포함된 IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 1 mg/L 내지 1000 mg/L이다.
일부 특정 구현예에서, 제약 조성물은 완충제를 포함하며, 완충제의 함량은 1 mM 내지 1000 mM이다.
일부 구현예에서, IL-4R 매개성 질환(disease) 또는 병태(condition)의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서 위에 기술된 바와 같은 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, IL-4R 매개성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서 위에 기술된 바와 같은 제약 조성물의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 위에 기술된 바와 같은 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 위에 기술된 바와 같은 제약 조성물이 제공된다.
본 출원의 맥락에서, 병태 또는 질환은 면역 질환 또는 병태일 수 있다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 천식(asthma), 코 폴립(nasal polyps), 만성 부비동염(chronic sinusitis), 알레르기성 피부 질환(allergic skin disease), 호산구성 식도염(eosinophilic esophagits), 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 관절염(arthritis), 염증성 질환(inflammatory disease), 알레르기 반응(allergic reaction), 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 바렛 식도(Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 결핵(tuberculosis) 및 신장병(neuropathy)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
적어도 하나의 구현예에서, 질환 또는 병태는 천식이다.
다른 구현예에서, 질환 또는 병태는 알레르기성 피부 질환이다.
일부 구현예에서, 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되는데, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fv, scFv 또는 F(ab')2이다.
일부 구현예에서, IL-4R 매개성 질환 또는 병태의 치료 및/또는 예방 방법이 제공되는데, 이는 치료적 유효량(또는 예방적 유효량)의 위에 기술된 바와 같은 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자(또는 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-4R 매개성 질환 또는 병태의 치료 및/또는 예방 방법이 제공되는데, 이는 치료적 유효량(또는 예방적 유효량)의 위에 기술된 바와 같은 제약 조성물을 이를 필요로 하는 환자(또는 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 질환의 치료 및/또는 예방 방법이 제공되는데, 이는 치료적 유효량(또는 예방적 유효량)의 위에 기술된 바와 같은 인간 IL-4R에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제약 조성물을 이를 필요로 하는 환자(또는 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 인간 신규한 인간 IL-4R 결합 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 이들로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체 및 인간화 항체를 제공한다. 이들은 IL-4R 매개성 질환 또는 병의 치료 용도에 사용될 수 있으며, 또한, 인간 IL-4R의 검출 또는 측정에 사용될 수 있다.
도 1: 피부염의 마우스 모델에서, 아세톤으로 감작시킨 후, 인간화 항체 hu25G7-A, hu25G7-B 및 양성 기준 항체 두필루맙을 주 2회 피하 투여하고, 제27일에 마우스의 귀 두께를 측정하였다. 결과는 대조군에 비해 hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙이 마우스의 귀 두께를 효과적으로 감소시킬 수 있으며, hu25G7-B가 두필루맙보다 더 우수한 효과를 나타냄을 보여준다.
용어
본 개시 내용이 더욱 용이하게 이해되도록, 특정 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본원의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 출원이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
"인간 IL-4R(hIL-4R)"은 인터류킨-4(IL-4), IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 인간 사이토카인 수용체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산에 대한 세 문자 부호 및 단일 문자 부호는 문헌[J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558]에 기술된 바와 같다.
용어 "항체(antibody)"는 두 개의 동일한 중쇄와 두 개의 동일한 경쇄를 사슬 간 이황화 결합에 의해 연결하여 형성된 네 개의 펩티드 쇄 구조인 면역글로불린을 지칭한다. 상이한 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 상이한 아미노산 조성 및 서열 배열을 나타내며, 이에 의해 상이한 항원성을 나타낸다. 따라서, 면역글로불린은 5개의 카테고리(또는 면역글로불린 이소형), 즉, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 나눌 수 있고, 이들의 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄 및 ε 쇄이다. 힌지 영역의 아미노산 조성과 중쇄 이황화 결합의 수와 위치에 따라 동일한 유형의 Ig를 상이한 하위 범주로 더 나눌 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 상이한 불변 영역을 고려하여 κ 또는 λ 쇄로 나눌 수 있다. 5개의 Ig 각각은 κ 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
항체 중쇄 및 경쇄 서열의 N 말단 근처에서, 약 110개 아미노산의 서열이 주로 달라지며, 가변 영역(V 영역)으로 알려져 있다. C 말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적이며, 불변 영역(C 영역)으로 알려져 있다. 가변 영역은 세 개의 과가변 영역(HVR) 및 상대적으로 보존된 서열을 갖는 네 개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 세 개의 과가변 영역은 항체의 특이성을 결정하며, 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 아미노 말단부터 카복시 말단까지의 순서는 다음과 같다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 세 개의 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 지칭하고, 세 개의 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.
항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체를 포함하고, 이는 재조합에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 친화도 성숙에 의해 수득된 재조합 인간 항체일 수 있다.
용어 "재조합 인간 항체(recombinant human antibody)"는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 인간 항체를 포함하며, 관련된 기술 및 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, (1) 인간 면역글로불린 유전자 이식 동물 또는 염색체 이식 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마부터 단리된 항체; (2) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체; (3) 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 및 (4) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 또 다른 DNA 서열 등으로 스플라이싱함으로써 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 포함하며, 이러한 영역은 생식선 유전자에 의해 암호화되는 특정 인간 생식선 면역글로불린 서열을 포함하지만, 항체 성숙 중에 발생하는 것과 같은 후속 재배열 및 돌연변이도 수반한다.
본원의 용어 "뮤린 항체(murine antibody)"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 제조되는, 인간 IL-4R에 대한 단클론 항체를 지칭한다. 제조하는 동안, 시험 대상에게 IL-4R 항원 또는 이의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 주사를 놓은 다음, 원하는 서열 또는 기능적 특징을 보유하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다. 일부 특정 구현예에서, 뮤린 IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 뮤린 κ, λ 쇄의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하거나, 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.
용어 "인간 항체(human antibody)"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 출원의 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내에서의 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종(예컨대, 마우스)의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체(즉, "인간화 항체")를 포함하지 않는다.
CDR 이식 항체로도 알려져 있는, 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 비 인간 종의 CDR 서열을 인간 항체의 가변 영역 프레임워크로 이식하여 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 다량의 이종 단백질 성분을 보유하는 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 항체 반응을 극복한다. 면역원성의 감소에 따른 활성의 감소를 피하기 위해, 인간 항체의 가변 영역은 활성을 유지하기 위한 최소한의 복귀 돌연변이 처리가 될 것이다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합하여 형성되는 항체이며, 키메라 항체는 뮤린 항체 유도성 면역 반응을 완화할 수 있다. 키메라 항체를 확립하기 위해, 특정 뮤린 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 먼저 확립한 다음, 가변 영역 유전자를 마우스 하이브리도마 세포로부터 클로닝한 다음, 인간 항체의 불변 영역 유전자를 원하는 대로 클로닝하고, 마우스 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자에 연결시켜 인간 벡터에 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성하고, 마지막으로 키메라 항체 분자를 진핵생물 또는 원핵생물의 산업적 시스템에서 발현시킨다. 인간 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체로부터 선택되고, 바람직하게는 인간 IgG2 또는 IgG4, 또는 아미노산 돌연변이 후 ADCC(항체 의존적 세포 매개성 세포독성)이 없는 IgG1의 중쇄 불변 영역이다.
"항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"은 Fab 단편, Fab' 단편, 항원 결합 활성을 갖는 F(ab')2 단편, Fv 단편, 인간 IL-4R에 결합하는 scFv 단편 및 위의 단편을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 상기 "항원 결합 단편"은 본 출원에 따른 항체의 1개 이상의 CDR을 포함한다. Fv 단편은 모든 항원 결합 부위를 보유하는 최소한의 항체 단편으로, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 없다. 일반적으로, Fv 항체는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하며, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다. 또한, 상이한 링커를 사용하여 2개의 항체의 가변 영역을 연결하여 폴리펩티드 쇄, 즉, 단쇄 항체 또는 단쇄 Fv(scFv)를 형성할 수 있다.
"IL-4R에 대한 결합(binding to IL-4R)"은 인간 IL-4R과 상호작용하는 능력을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원 결합 부위(antigen binding site)"는 본 출원의 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 3차원의 부위를 지칭한다.
용어 "에피토프(epitope)"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘으로 인해 더 가까워진 인접하지 않은 아미노산에 의해 형성될 수 있다. 인접한 아미노산에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출된 후에 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리된 후에는 존재하지 않는다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 입체형태에 적어도 3 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 면역블롯팅 및 면역침전 분석 등을 포함하는, 주어진 항체에 의해 결합된 에피토프의 결정 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 에피토프의 공간 입체형태의 결정 방법은 X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명 등과 같은 당해 분야의 기술 및 본원에 기술된 기술을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다(specifically binds to)" 및 "선택적으로 결합한다(selectively binds to)"는 사전 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 사전 결정된 항원에 대략 10-7 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 결합하고, 사전 결정된 항원에 대한 결합에 대한 항체의 친화도는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 통해 기기에서 측정 시, 사전 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비 특이적 항원(예컨대, BSA)에 대한 결합에 대한 친화도보다 적어도 2배 더 크며, 이때, 재조합 인간 IL-4R은 분석물질로 사용되고, 항체는 리간드로 사용된다. 용어 "항원을 인식하는 항체(an antibody recognizing an antigen)"는 본원에서 용어 "특이적으로 결합하는 항체(an antibody specifically binding to)"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "교차 반응(cross-reaction)"은 본 출원의 항체가 상이한 종으로부터의 IL-4R에 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 IL-4R에 결합하는 본 출원의 항체는 다른 종의 IL-4R에도 결합할 수 있다. 교차 반응성은 결합 분석(예를 들어, SPR 및 ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출하거나, IL-4R을 생리적으로 발현하는 세포와의 결합 또는 기능적 상호작용을 검출하여 측정한다. 교차 반응성의 결정 방법은 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR) 또는 유세포 분석과 같은, 본원에 기술된 표준 결합 분석을 포함한다.
용어 "중화(neutralizing)" 또는 "차단(blocking)" 항체는 hIL-4R에 결합하여 hIL-4 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 지칭한다. hIL-4 및/또는 IL-13 생물학적 활성의 이러한 억제는 hIL-4 및/또는 hIL-13 유도성 세포 활성화 및 hIL-4의 hIL-4R에 대한 결합, 예를 들어, CN103739711A의 것들과 같은, 당해 분야에 잘 알려져 있는 hIL-4/또는 hIL-13의 생물학적 활성의 1개 이상의 지표(indicators)를 측정함으로써 평가할 수 있다. "성장의 억제(inhibition of growth)"(예를 들어, 세포를 지칭할 때)는 세포 성장의 임의의 측정 가능한 감소를 포함하고자 한 것이다.
용어 "면역 반응 유도(inducing immune response)" 및 "면역 반응 증진(enhancing immune response)"은 상호교환적으로 사용되며, 특정 항원의 자극에 대한 면역 반응(즉, 수동적 또는 적응성)을 지칭한다. CDC 또는 ADCC와 관련하여 용어 "유도"는 세포를 직접 사멸시키기 위한 특정 기전을 자극하는 것을 지칭한다.
용어 "ADCC"(항체 의존적 세포 매개성 세포독성)는 Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체의 Fc 세그먼트를 인식하여 항체가 코팅된 표적 세포를 직접 사멸시키는 것을 지칭한다. 항체의 ADCC 이펙터 기능은 IgG의 Fc 세그먼트에 대한 변형을 통해 감소 또는 제거될 수 있다. 변형은 IgG1, IgG2/4 키메라에서 N297A, L234A 및 L235A로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이 및 IgG4에서 F235E 및 L234A/E235A 돌연변이와 같이, 항체 중쇄 불변 영역에서 수행되는 돌연변이를 지칭한다.
융합 단백질은 DNA 재조합을 통해 두 유전자에 의해 공동 발현되는 단백질 생성물이다. 재조합 IL-4R 세포 외 영역 Fc 융합 단백질은 인간 항체 Fc 단편과 IL-4R 세포 외 영역을 DNA 재조합을 통해 공동 발현시킴으로써 수득되는 융합 단백질이다. IL-4R 세포 외 영역은 세포막 외부에서 발현되는 IL-4R 단백질의 일부를 지칭한다.
항체 및 항원 결합 단편의 제조 및 정제 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15]에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 마우스는 인간 IL-4R 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있으며, 그 후, 생성된 항체는 당해 분야에 잘 알려진 통상적인 방법을 사용하여 재생, 정제 및 서열 분석될 수 있다. 항원 결합 단편은 또한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 1개 이상의 인간 FR을 비 인간 CDR에 첨가하도록 유전자 조작된다. 인간 FR 생식선 서열은 웹사이트 http://imgt.cines.fr을 통해 ImMunoGeneTics(IMGT) 또는 문헌[The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351]에서 얻을 수 있다.
유전자 조작된 항체 또는 항원 결합 단편은 종래의 방법을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열을 클로닝하여 GS 발현 벡터 내로 재조합할 수 있다. 그런 다음, 재조합 면역글로불린 발현 벡터를 CHO 세포에 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 본원의 인간화 항체의 서열을 분자 클로닝 기술에 의해 상응하는 발현 벡터에 삽입하고, 상응하는 인간화 항체를 HEK293 세포 발현 시스템에서의 발현에 의해 수득한다. 당해 분야에서 더욱 권장되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단에서 항체의 글리코실화를 초래할 수 있다. 안정적인 클론은 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 발현을 통해 수득할 수 있다. 양성 클론은 생물 반응기에서 항체 생산을 위한 무혈청 배양 배지에서 확장시킬 수 있다. 항체가 분비된 배양 배지는 종래의 기술에 의해 수집 및 정제할 수 있다. 일반 기술을 이용하여 항체를 여과하고 농축할 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체는 분자 체 또는 이온 교환과 같은 일반 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 수득된 생성물은 즉시, 예를 들어 -70℃에서 냉동되거나, 동결건조될 수 있다.
항체는 단클론 항체(mAb)일 수 있으며, 이는 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론 세포 균주에 한정되지 않는 단일 세포주로부터 수득된 항체를 지칭한다. 단클론 항체 및 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술(예를 들어, CDR 이식), 또는 당해 분야에 공지된 기타 기술에 의해 수득될 수 있다.
항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다. 다중특이적 항체는 표적 펩티드의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 나타내거나, 또한 1개 초과의 표적 펩티드에 대한 특이성을 나타내는 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다. 인간 항-IL-4R 항체는 또 다른 기능적 분자(예컨대, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결되거나 이와 공동 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 기능적으로(예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비 공유 결합 또는 기타 수단에 의해) 하나 이상의 다른 분자(예를 들어, 또 다른 항체 또는 항원 결합 단편)에 연결되어 제2의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다.
"투여(administration, administering)" 및 "치료(treatment)"는, 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체와 외인성 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는 예컨대, 치료적, 약물동역학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약을 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라, 유체가 세포와 접촉하고 있는 경우 시약을 상기 유체와 접촉시키는 것도 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단법, 결합 조성물을 사용하여, 또는 또 다른 세포를 사용하는 것에 의한, 예컨대, 세포의, 시험관 내 및 생체 외 처치를 의미한다. "치료"는, 인간, 수의학, 또는 연구 대상체에 적용될 경우, 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치, 연구 및 진단적 응용을 지칭한다.
"치료하다"는 치료제(본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 것을 포함하는 조성물)을, 치료제가 공지된 치료적 활성을 갖는 1종 이상의 질환 증상을 나타내거나, 나타낸다고 의심되거나 또는 이에 민감한 환자(또는 대상체)에게 체내로 또는 체외로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 치료제는 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 이러한 증상의 진행을 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 억제함으로써, 치료되는 환자(또는 대상체) 또는 집단에서 1종 이상의 질환 증상을 완화시키기에 유효한 양으로 투여된다. ("치료적 유효량"으로도 지칭되는) 임의의 특정 질환 증상을 완화시키기에 유효한 치료제의 양은 인자(factors), 예컨대, 환자(또는 대상체)의 질환 상태, 연령, 및 체중, 그리고 의약이 환자(또는 대상체)에서 원하는 효과를 유도하는 능력에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지는 의료진 또는 다른 숙련된 보건의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상적 측정에 의해 평가하여 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가할 수 있다. 본 출원의 일 구현예(예컨대, 치료 방법 또는 제조 물품)가 각 환자(또는 대상체)의 각각의 관심 질환 증상을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 스튜던트 t 검정, 카이 제곱 검정, 맨-휘트니에 따른 U 검정, 크루스칼 왈리스 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라 검정 및 윌콕슨 검정과 같은 당해 분야에 공지된 임의의 통계적 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의미한 수의 환자(또는 대상체)에서 관심 목표 질환 증상을 완화시켜야 한다.
"보존적 변형(conservative modification)" 또는 "보존적 교체 또는 치환(conservative replacement or substitution)"은 단백질의 아미노산에 대해 비슷한 특징(예컨대, 전하, 곁사슬 크기, 소수성/친수성, 주요 사슬 구조 및 경직도 등)을 나타내는 다른 아미노산으로의 치환을 의미하며, 그 결과 단백질의 생물학적 활성을 바꾸지 않으면서 변형이 빈번하게 수행될 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비 필수 영역의 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 바꾸지 않음을 안다(예를 들어, 문헌[Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224 (4th edition)] 참조). 또한, 비슷한 구조 또는 기능의 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 낮다.
"유효량(effective amount)"은 의학적 병태의 증상 또는 징후를 개선하거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 대상체 또는 수의학적 대상체에 대한 유효량은 인자, 예컨대, 치료되는 병태, 대상체의 일반적인 건강, 투여 경로 및 용량 및 부작용의 중증도에 따라 다를 수 있다. 유효량은 상당한 부작용 또는 독성 효과를 막는 최대한의 용량 또는 투여 프로토콜일 수 있다.
"외인성(exogenous)"은 맥락에 따라, 유기체, 세포, 또는 인체 외부에서 생성되는 물질을 지칭한다.
"내인성(endogenous)"은 맥락에 따라, 세포, 유기체, 또는 인체 내부에서 생성되는 물질을 지칭한다.
"상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 두 개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 비교되는 두 서열에서의 한 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 차지할 경우, 예를 들어, 두 개의 DNA 분자 각각의 한 위치를 아데닌이 차지할 경우, 이 분자들은 이 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 두 서열이 공유하는 매치되는/상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나눈 다음, x100%를 곱한 함수이다. 예를 들어, 서열을 최적으로 정렬시킬 때 두 서열의 10개 위치 중 6개가 매치되거나 상동성인 경우, 두 서열은 60%의 동일성을 공유한다. 일반적으로, 두 서열이 최대 동일성 백분율을 제공하도록 정렬될 때 비교가 이루어진다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "적어도 85%의 서열 동일성"은 변이체가 모 서열과 적어도 85%의 상동성을 가지며, 두 서열이 적어도 85%의 상동성을 공유함을 의미한다. 일부 구현예에서, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 상동성을, 일부 특정 구현예에서, 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 상동성을, 다른 특정 구현예에서, 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는다. 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 모 서열과 비교할 때 1개 이상의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포(cell)", "세포주(cell line)" 및 "세포 배양물(cell culture)"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭의 의미는 이의 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 계대 횟수를 고려하지 않고 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적인 또는 무작위 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 본래 형질전환된 세포와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는, 스크리닝에 의해 수득된 돌연변이체 자손 또한 고려된다.
"선택적인(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 이어지는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만, 반드시 발생하지는 않음을 의미한다. 이러한 기재 내용은 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함한다"는 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만, 반드시 존재하지는 않음을 의미한다.
"제약 조성물(pharmaceutical composition)"은 본원에 기술된 1종 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 생리적으로/약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물 및 다른 화학 성분뿐만 아니라, 추가 성분, 예컨대, 생리적으로/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제의 혼합물을 포함하는 조성물을 지칭한다. 제약 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여, 생물학적 활성을 발휘하는 것을 목적으로 한다.
이하에서, 본 개시를 실시예를 참조하여 추가로 설명한다. 그러나 본 개시의 범위는 이에 한정되지 않는다. 실시예에서, 특정 조건이 설명되지 않는 경우, 실험은 일반적으로 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual and Molecular Cloning Manual, by Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같은 종래의 조건이나, 물질 또는 제품 제조사가 제안한 조건 하에 수행된다. 시약 공급원이 명시적으로 제공되지 않은 경우, 시약은 상업적으로 이용 가능하다.
실시예 1: 마우스의 면역화 및 시험(Immunization of mice and testing)
his-태그가 부착된 인간 IL-4R(h-IL-4R-his) 재조합 단백질, his-태그가 부착된 마우스 IL-4R(m-IL-4R-his) 재조합 단백질, 및 his-태그가 부착된 레서스 IL-4R(레서스 -IL-4R-his) 재조합 단백질을 Acrobiosystems에서 합성하였고, HEK293에서 발현시키고, 정제하였다.
인간 Fc 태그가 있는 인간 IL-4R(h-IL-4R-Fc)의 재조합 단백질을 사내에서 설계하고, 발현시키고, 정제하였다. 정제된 단백질을 실시예의 다음의 실험 각각에서 사용하였다.
이 실시예의 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 및 VH 영역의 CDR 아미노산 잔기의 수(number)와 위치(position)는 공지된 Kabat 넘버링 시스템(LCDR1~3, HCDR2~3)을 따르거나, 또는 Kabat 및 CHOTHIA(ABM) 넘버링 시스템(HCDR1)을 따른다.
면역원의 정보

명칭 		아미노산 서열
(처음부터 끝까지) 		데이터베이스 번호/카탈로그 번호
h-IL-4R-his Met26-His232 NP_000409.1
m-IL-4R-his Ile26-Arg233 NP_001008700
레서스-IL-4R-his Met26-Arg232 G7Q0S7
h-IL-4R-Fc Met1-His232 NP 000409.1
항-인간 IL4R 단일클론 항체를 마우스를 면역화하여 생성하였다. C57BL/6 마우스, 암컷, 6 내지 8주령(JOINN Laboratories (Suzhou) Research Center Co., Ltd., 동물 생산 면허 번호: 201503052)을 실험에 사용하였다.
급이 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 실험실 환경에 1주일 동안 유지시켜 12/12시간의 명암 주기, 20~25℃의 온도 및 40~60%의 습도에 적응시켰다. 적응시킨 마우스를 3개의 케이지, 각 케이지에 다섯 마리로 나누었다. 면역 항원은 Fc 태그가 있는 인간 IL-4R 재조합 단백질이었다(h-IL4R-Fc, 0.73 mg/ml의 농도). 항원을 프로인트 보강제(sigma, Cat#: F5881)로 유화시켰다: 완전 프로인트 보강제(CFA, Pierce, Cat#77140)를 1차 면역화에 사용하였고, 핵산 보강제(CpG, Shanghai Sangon) 및 알루미늄 보강제(Alum, Thermo Cat#77161)를 나머지 부스터 면역화에 사용하였다.
제0일에 70 μg/마우스의 유화된 항원을 복강 내(IP)로 주사하였다. 제14일, 제28일, 제42일, 제56일, 제77일에, 등의 종괴 및 복부 부종에 따라, 항원을 등 및 복강 내로 주사하였다(각 0.1 ml 주사). 혈액 검사를 위해 제21일, 제35일, 제49일, 제63일, 및 제84일에 혈액을 수집하였다. 마우스 혈청의 항체 역가를 결정하기 위해 시험예 1에 따라 마우스 혈청에서 ELISA 분석을 수행하였다. 4차 면역화 후, 혈청의 항체 역가가 높고, 역가가 플라토(plateau)인 경향이 있는 마우스를 비장 세포 융합을 위해 선택하였다. 부스터 면역화를 융합 3일 전에 수행하였다. 인산염 완충액을 이용하여 제조된 항원 용액을 10 μg/마우스로 복강 내 주사하였다. 최적화된 PEG 매개성 융합 단계를 이용하여, 비장 림프구 및 골수종 세포인 Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287TM)를 융합하여 하이브리도마를 수득하였다.
실시예 2: ELISA 테스트 및 항체의 스크리닝
1. ELISA 결합 테스트(ELISA binding test):
ELISA 테스트를 이용하여 IL-4R 항체의 결합 특성을 검출하였다. his-표지된 IL-4R 재조합 단백질이 직접 코팅된 미세적정 플레이트를 사용하고, 각 웰에 항체를 추가한 후, 2차 항체(HRP가 접합된 항-1차 항체 Fc) 및 HRP 기질 TMB를 첨가하여 항원에 대한 항체의 결합 활성을 검출하였다.
인간 또는 레서스 IL-4R-his 단백질을 96 웰의 미세적정 플레이트에 0.5 μg/ml의 농도로 웰당 100 μl로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 충분한 세척을 보장하기 위해 10초 동안 진탕하면서 각 세척 단계를 수행하였다. 200 μl/웰의 차단 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 충분한 세척을 보장하기 위해 10초 동안 진탕하면서 각 세척 단계를 수행하였다. 희석액으로 희석된 시험하고자 하는 항-IL-4R 항체 100 μl를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 μl의 HRP가 표지된 염소 항-인간 IgG 2차 항체(희석제로 1:20000으로 희석됨)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 μl의 TMB를 각 웰에 첨가하고, 암소(in dark)에서 15분 동안 반응을 유지시켰다. 50 μl의 0.16 M/L 황산을 각 웰에 첨가하였다. 450 nm의 OD 값을 Thermo MultiSkanFc 마이크로플레이트 판독기로 얻었고, IL-4R에 결합하는 IL-4R 항체의 EC50 값을 계산하였다.
2. ELISA 차단 테스트(ELISA blocking test):
이 테스트에서, 시험관 내 차단 실험에 의해, 선택된 항-인간 IL-4R 항체에 의한 인간 IL-4R의 인간 IL-4에 대한 결합의 차단을 검출하였다. 구체적으로, Fc 태그가 부착된 IL-4R 재조합 단백질을 96 웰 미세적정(microtiter) 플레이트에 코팅하고, 인간 IL-4R에 결합하는 항체를 첨가하여 에피토프에 충분히 결합하게 한 다음, IL-4(Biolegend, Cat #574004)를 첨가하고, 비오틴이 접합된 항 IL-4 항체와 뉴트라비딘-HRP(Pierce, Cat#31001)를 사용하여 IL-4가 IL-4R에 결합할 수 있는지를 검출하였으며, IL-4/IL-4R 결합을 차단하기 위한, IL-4R 항체에 대한 IC50 값을 계산하였다.
인간 IL-4R-Fc 단백질을 96 웰의 미세적정 플레이트에 0.5 μg/ml의 농도로 웰당 100 μl로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 충분한 세척을 보장하기 위해 10초 동안 진탕하면서 각 세척 단계를 수행하였다. 200 μl/웰의 차단 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 충분한 세척을 보장하기 위해 10초 동안 진탕하면서 각 세척 단계를 수행하였다. 희석액으로 희석된 시험하고자 하는 항-IL-4R 항체 100 μl를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 μl의 희석된 IL-4를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 μl의 희석된 비오틴이 접합된 항-IL-4 항체를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 용액으로 3회 세척하였다. HRP가 표지된 뉴트라비딘(희석제로 1:5000으로 희석됨)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 웰당 250 μl의 세척 용액으로 3회 세척하였다. 100 μl의 TMB를 각 웰에 첨가하고, 암소에서 15분 동안 반응을 유지시켰다. 50 μl의 0.16 M/L 황산을 각 웰에 첨가하였다. 450 nm의 OD 값을 Thermo MultiSkanFc 마이크로플레이트 판독기로 얻었고, IL-4에 대한 IL-4R의 결합을 차단하기 위한, IL-4R 항체에 대한 IC50 값을 계산하였다.
실시예 3: 인간 IL-4R에 결합하는 항체의 리포터 세포(reporter cell) 활성 실험
HEK-Blue IL-4 세포를 Invivogen(Cat#hkb-stat6)에서 구입하였다. 세포를 인간 IL-4R 유전자 및 STAT6 매개성 SEAP 게놈으로 안정적으로 형질감염시켰다. 상청액으로 분비된 SEAP를 SEAP 기질인 QUANTI-Blue에 의해 검출하여 IL-4R 신호전달 경로의 활성화 수준을 특성화할 수 있다.
이 실험에서, HEK-Blue IL-4 세포의 활성화를 검출하고, IL-4R 항체의 시험관 내 세포 활성을 IC50에 따라 평가하였다. HEK-Blue IL-4 세포를 10%의 FBS, 100 μg/ml의 제오신(Invivogen, Cat#ant-zn-05) 및 10 μg/ml의 블라스티시딘(Invivogen, Cat#ant-bl-05)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 주 2 내지 3회, 1:5 또는 1:10의 비율로 계대배양하였다. 계대배양을 위해, 배지를 제거하고, 세포층을 0.25%의 트립신 5 ml로 세척한 다음, 트립신을 제거하고, 세포를 인큐베이터에 3 ~ 5분 동안 두고, 신선한 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 100 μL의 세포 현탁액을 5x105개 세포/ml의 밀도로 96 웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였고, 배지는 10%의 FBS, 100 ug/ml의 제오신 및 30 ug/ml의 블라스티시딘을 함유하는 DMEM였고, 100 μl의 멸균수를 96 웰 플레이트 주변에 첨가하였다. 배양 플레이트를 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2). 세포가 벽에 부착되면, 시험하려는 연속 희석된 항체 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. 배양 플레이트를 인큐베이터에서 20 내지 24시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2). 20 μl의 세포 상청액을 각 웰에서 새로운 96 웰 평판 플레이트로 옮기고, 180 μl의 QUANTI-Blue 기질 용액을 첨가하고, 배양 플레이트를 암소에서 1 내지 3시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 620 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(Thermo MultiSkanFc)로 측정하였다.
실시예 4: 인간 IL-4R에 결합하는 항체는 TF-1 세포의 증식을 억제한다
TF-1 세포(ATCC CRL-2003)는 IL-4R을 발현하고 IL-4/IL-13과 같은 사이토카인에 민감한 림프종 세포이다. IL-4는 TF-1 세포를 자극하여 GM-CSF의 부재 하에 증식시킨다. IL-4의 경로를 차단하고 TF-1 세포의 증식을 억제하기 위해 중화 항체를 첨가하여 상이한 IL-4R 항체의 중화 활성을 실험에서 비교하였다. TF-1 세포를 10%의 FBS, 2 ng/ml의 GM-CSF(R&D, Cat#215-GM-010)를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포를 1:10의 비율로 주 2 내지 3회 계대배양하였다. 100 μL의 세포 현탁액을 2x105개 세포/ml의 밀도로 96 웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였고, 배지는 10%의 FBS를 함유하는 RRPMI1640 배지였고, 100 μl의 멸균수를 96 웰 플레이트 주변에 첨가하였다. 시험하려는 연속 희석(serially diluted) 항체 50 μl와 최종 농도 0.7 ng/ml의 IL-4(R&D, Cat#204-IL-050) 50 μl를 각 웰에 첨가하고, 배양 플레이트를 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2). 배양이 완료되었을 때, CTG 키트(Promega, Cat#G7572)를 사용하여 세포 증식을 검출하였다.
실시예 5: 시험관 내 결합 친화도 및 동역학 실험
비아코어(Biacore, GE 기기)를 사용하여 인간 IL-4R에 대한 인간화 항체의 결합 친화도(binding affinity)를 결정하였다.
인간 항-포획(anti-capture) 항체를 인간 항-포획 키트(Cat.#BR-1008-39, GE)의 설명서에 기술된 방법에 따라 비아코어 기기(Biacore X100, GE)의 바이오 감지 칩 CM5에 공유 결합시키고, 이에 의해 시험하려는 항체의 특정 양을 친화도에 의해 포획하였다. 일련의 농도 구배의 IL-4R 항원(Acrobiosystems에서 구입한 IL-4R 항원, Cat#ILR-H5221)을 칩 표면을 통해 유동시키고, 결합 및 해리 곡선을 얻기 위하여 비아코어 기기(Biacore X100, GE)를 이용하여 반응 신호를 실시간으로 검출하였다. 각 주기의 해리를 완료한 후, 바이오칩을 세척하고, 인간 항-포획 키트 내부에 제공된 재생 용액으로 재생시켰다. 실험에 사용된 아미노 커플링 키트는 GE(Cat. #BR-1000-50, GE)로부터 구입하였고, 완충액은 탈이온수로 1x(pH 7.4)까지 희석시킨 HBS-EP+10x완충 용액(Cat. #BR-1006-69, GE)이었다.
실험에서 얻은 데이터를 BiacoreX100 평가 소프트웨어 2.0 GE를 사용하여 (1:1) 결합 모델에 적합화하고, 친화도 값을 얻었다.
실시예 6: 항체의 서열 및 제조
위의 실시예 2의 ELISA 결합 실험(인간 IL-4R-his의 ELISA 결합) 및 ELISA 차단 실험(hIL-4/IL-4R의 ELISA 차단), 실시예 3의 IL-4에 의해 자극시킨 HEK293-Blue IL-4 세포의 활성화 억제 테스트, 및 실시예 4의 IL-4에 의해 자극시킨 TF-1 세포의 증식 억제 테스트에 의해, 최상의 시험관 내 활성을 보여주는 2개의 단일클론 하이브리도마 세포주를 선택하였다. 활성 테스트 결과를 표 2에 나타내었다.
최상의 시험관 내 활성을 갖는 선택된 하이브리도마 세포주

마우스 번호
하이브리도마
ELISA(EC 50 )
(ng/ml) 		ELISA에 의한 hIL-4/IL-4R의 차단
(IC 50 ) (ng/ml) 		(IL-4에 대한)
HEK293-Blue IL-4 세포의 결합의 차단(IC 50 )
(ng/ml) 		IL-4에 의한 TF-1 세포증식의 억제(IC 50 )
(ng/ml)
인간IL-4R-his 레서스 IL-4R-his 마우스 IL-4R-his
11 25G7 3.319 결합 없음 결합 없음 8.132 0.9749 51.26
3 7B10 45.78 결합 없음 결합 없음 29.86 79.76 418.1
두핍루맙 27.62 결합 없음 결합 없음 52.08 5.069 102.2
최상의 활성을 갖는 단일클론 하이브리도마 세포주 25G7 및 7B10을 선택하고, 이로부터 단일클론 항체 서열을 클로닝하였다. 하이브리도마로부터 서열을 클로닝하는 공정은 다음과 같다. 대수성장기(logarithmic growth phase)의 하이브리도마 세포를 수집하고, RNA를 Trizol(Invitrogen, 15596-018)(키트 설명서에 따름)로 추출하고, 역전사를 수행하였다(PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat #2680A). 역전사로 수득한 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev. B0503)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 서열 분석을 위해 서열 분석 회사에 전달하여, 얻은 항체 서열을 분석하였다.
뮤린 단클론 항체 25G7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
25G7 HCVR
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCTRGNKRGFFDYWGQGTILTVSS (서열번호 1);
25G7 LCVR
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCNASSSVSYMYWYQRKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWRSNPPMLTFGSGTKLEVK (서열번호 2);
그 안에 함유된 CDR 서열을 표 3에 제시하였다.
단클론 항체 25G7의 CDR 서열
명칭 서열 서열번호
HCDR1 GFTFSDYGMH 서열번호 3
HCDR2 FISSGSSIIYYADIVKG 서열번호 4
HCDR3 GNKRGFFDY 서열번호 5
LCDR1 NASSSVSYMY 서열번호 6
LCDR2 LTSNLAS 서열번호 7
LCDR3 QQWRSNPPMLT 서열번호 8
마우스 단클론 항체 7B10의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
7B10 HCVR
QVQLQQPGTELLKPGASVSLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLIHPNSDTTKFSENFKTRATLTIDKSSSTAYMKLSSLTSEDSAVYYCAKSKIITTIVARHWYFDVWGTGTTVTVSS(서열번호 9);
7B10 LCVR
DIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKASQSVDYGGDSYMNWYQQKLGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCQHSNENPPTFGGGTKLEIK(서열번호 10);
그 안에 함유된 CDR 서열을 표 4에 제시하였다.
단클론 항체 7B10의 CDR 서열
명칭 서열 서열번호
HCDR1 GYTFTSYWMH 서열번호 11
HCDR2 LIHPNSDTTKFSENFKT 서열번호 12
HCDR3 SKIITTIVARHWYFDV 서열번호 13
LCDR1 KASQSVDYGGDSYMN 서열번호 14
LCDR2 AASNLES 서열번호 15
LCDR3 QHSNENPPT 서열번호 16
수득한 가변 영역 서열을 인간 불변 영역 서열에 연결하여 인간-마우스 키메라 항체 서열을 수득하였다. 분자 클로닝 기술을 사용하여 키메라 항체 서열을 상응하는 발현 벡터에 삽입하였다. HEK293 세포 발현 시스템을 사용하여 인간-마우스 키메라 항체인 25G7-C 및 7B10-C를 얻을 수 있다.
실시예 2 내지 5의 방법에 따라, 정제된 키메라 항체를 시험관 내 활성에 대해 테스트하였다. 데이터를 표 5에 나타내었다. 결과는 항체 25G7-C의 경우 IL-4 결합에 미치는 차단 효과와 세포 증식에 미치는 억제 효과가 기준 항체인 두필루맙(문헌[WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012 synthesis]에 따라 합성됨)보다 현저하게 우수하였음을 보여주었다.
시험관 내 활성의 검출
인간 IL-4R-his ELISA 결합(EC 50 )
(ng/ml) 		레서스 IL-4R-his ELISA 결합(EC 50 )
(ng/ml) 		hIL-4/IL-4R
ELISA 차단(IC 50 )(ng/ml) 		(IL-4에 대한)HEK293-Blue IL-4 세포의 결합의 차단(IC 50 )
(ng/ml) 		IL-4에 의한 TF-1 세포의 증식의 억제(IC 50 )
(ng/ml)
K D (nM)
(비아코어)
25G7-C 9.094 결합없음 39.69 2.025 20.27 0.725
7B10-C 11.83 결합없음 162.3 9.034 46.43 0.278
두핍루맙 55.84 결합없음 209.4 3.235 207.2 0.126
실시예 7: 마우스 항체의 인간화 실험
수득한 뮤린 항체들 가운데 가장 강한 기능적 활성을 보여주는 2개의 세포주(25G7 및 7B10)를 인간화하였다. 수득한 뮤린 항체 VH/VLCDR의 전형적인 구조를 기초로 하여, 중쇄, 경쇄 가변 영역 서열을 항체 Germline 데이터베이스에 대해 정렬하여, 높은 상동성을 갖는 인간 생식선 주형을 수득하였다. 그 중에서도, 인간 생식선 경쇄 프레임워크 영역은 인간 카파 경쇄 유전자, 바람직하게는 인간 생식선 경쇄 주형 IGKV3-11*01(서열번호 22, 항체 25G7의 경우) 및 IGKV2D-29*01(서열번호 24, 항체 7B10의 경우)로부터 유래된다. 인간 생식선 중쇄 프레임워크 영역은 인간 중쇄, 바람직하게는 인간 생식선 중쇄 주형 IGHV3-48*01(서열번호 21, 항체 25G7의 경우) 및 IGHV1-2*02(서열번호 23, 항체 7B10의 경우)로부터 유래된다.
인간 생식선 주형 서열(template sequence)을 아래에 나타내었다.
인간 생식선 중쇄 주형 IGHV3-48*01:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열번호 21);
인간 생식선 경쇄 주형 IGKV3-11*01:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP (서열번호 22);
인간 생식선 중쇄 주형 IGHV1-2*02:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (서열번호 23);
인간 생식선 경쇄 주형 IGKV2D-29*01:
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSIQLP (서열번호 24).
뮤린 항체의 CDR 영역을 선택된 인간화 주형에 이식하여 인간화 가변 영역을 대체하였고, 그 다음 이를 IgG 불변 영역과 재조합하였다. 그 다음, 뮤린 항체의 3차원 구조에 기초하여, 매립된 잔기, CDR 영역과 직접 상호작용하는 잔기, 및 VL 및 VH의 입체형태에 중요한 영향을 미치는 잔기를 복귀 돌연변이시켜 일련의 인간화 분자를 얻었다.
그 중에서도, Hu7B10-VH-a, hu7B10-VH-b, 및 hu7B10-VH-c를 제약상의 목적으로 변형하였고, 중쇄 인간 생식선 주형의 첫 번째 위치를 Q에서 E로 바꾸었다. 또한, hu25G7을 제약상의 목적으로 변형시켰다. 2개의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역을 각각 서열번호 25 내지 27 및 서열번호 31 내지 33에 나타내었다. 경쇄 가변 영역 서열은 각각 서열번호 28 내지 30 및 서열번호 34 내지 36에 나타내었다.
hu25G7-VH-a:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQ A PGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNKRGFFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 25);
hu25G7-VH-b:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQ A PGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC T RGNKRGFFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 26);
hu25G7-VH-c:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQ A PGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGR S TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC T RGNKRGFFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 27);
hu25G7-VL-a:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCNASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRSNPPMLTFGGGTKVEIK (서열번호 28);
hu25G7-VL-b:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCNASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTD Y TLTISSLEPEDFAVYYCQQWRSNPPMLTFGGGTKVEIK (서열번호 29);
hu25G7-VL-c:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCNASSSVSYMYWYQQKPGQAPR PW IYLTSNLASGIPARFSGSGSGTD Y TLTISSLEPEDFAVYYCQQWRSNPPMLTFGGGTKVEIK (서열번호 30);
hu7B10-VH-a:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLIHPNSDTTKFSENFKTRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSKIITTIVARHWYFDVWGQGTTVTVSS (서열번호 31);
hu7B10-VH-b:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLIHPNSDTTKFSENFKTRVTMTIDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKSKIITTIVARHWYFDVWGQGTTVTVSS (서열번호 32);
hu7B10-VH-c:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLIHPNSDTTKFSENFKTRVTLTIDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKSKIITTIVARHWYFDVWGQGTTVTVSS (서열번호 33);
hu7B10-VL-a:
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYGGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSNENPPTFGGGTKVEIK (서열번호 34);
hu7B10-VL-b:
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYGGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSNENPPTFGGGTKVEIK (서열번호 35);
hu7B10-VL-c:
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYGGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASNLESGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSNENPPTFGGGTKVEIK (서열번호 36).
하이브리도마 클론 25G7에 대한 주형의 선택 및 복귀 돌연변이 설계를 표 6에 나타내었다.
주형의 선택 및 복귀 돌연변이 설계
25G7-VL 25G7-VH
hu25G7-VL-a 이식됨 hu25G7-VH-a S49A
hu25G7-VL-b F71Y hu25G7-VH-b S49A, A93T
hu25G7-VL-C L46P, L47W, F71Y hu25G7-VH-c S49A, F67S, A93T
하이브리도마 클론 7B10에 대한 주형의 선택 및 복귀 돌연변이 설계를 아래 표 7에 나타내었다:
주형의 선택 및 복귀 돌연변이 설계
7B10-VL 7B10-VH
hu7B10-VL-a 이식됨 hu7B10-VH-a 이식됨
hu7B10-VL-b M4L hu7B10-VH-b R71I, R94K
hu7B10-VL-C V58I hu7B10-VH-c M69L, R71I, T73K, R94K
위의 경쇄 및 중쇄 조합의 소규모 발현 테스트 및 복귀 돌연변이의 수의 비교 후, 최종 인간화 항체 hu25G7(VH-c 중쇄 및 VL-a 경쇄 보유) 및 항체 hu7B10 분자(VH-b 중쇄 및 VL-b 경쇄 보유)를 종합적으로 평가하고 선택하였다. 이들의 각각의 완전한 경쇄 및 중쇄 서열을 서열번호 17 내지 20에 나타내었다.
hu25G7 HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGNKRGFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 17);
hu25G7 LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCNASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRSNPPMLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 18);
hu7B10 HC
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGLIHPNSDTTKFSENFKTRVTMTIDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKSKIITTIVARHWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 19);
hu7B10 LC
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYGGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSNENPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 20).
인간화 항체의 서열을 분자 클로닝 기술에 의해 상응하는 발현 벡터에 삽입하고, 상응하는 인간화 항체를 HEK293 세포 발현 시스템에서의 발현에 의해 수득하였다.
실시예 8: 인간화 항체의 활성 데이터
인간화 항체 hu25G7 및 hu7B10를 실시예 2 내지 5에 기술된 바와 같이 시험관 내에서 테스트하였고, 테스트 결과를 표 8에 나타내었다. 결과는 hu25G7 및 hu7B10 둘 다 인간 IL-4R에만 결합하고 레서스 IL-4R에는 결합하지 않음을 보여주어, 두 항체가 레서스 IL-4R에 상동성이 아닌 인간 IL-4R의 에피토프에 결합하고, 인간 IL-4R에 특이적으로 결합할 수 있음을 나타내었다. 두 항체는 IL-4/IL-4R 결합 및 세포 내 신호전달 경로를 차단하여, IL-4 활성화 효과의 중화 및 TF-1 세포의 증식의 억제를 초래할 수 있는데, 이때, hu25G7의 차단 및 억제 활성은 기준 항체인 두필루맙보다 여전히 유의하게 우수한 한편, 친화도 KD 값은 상대적으로 더 낮다.
시험관 내 활성의 검출
인간 IL-4R-his
ELISA 결합
(EC 50 )(ng/ml) 		레서스 IL-4R-his ELISA
결합(EC 50 )
(ng/ml) 		인간 IL-4/IL-4R ELISA
차단(IC 50 )
(ng/ml) 		(IL-4에 대한)
HEK293-Blue IL-4 세포 결합의 차단(IC 50 )
(ng/ml) 		IL-4에 의한 TF-1 세포 증식의 억제 (IC 50 ) (ng/ml) K D (nM)
(비아코어)
hu25G7 3.413 결합 없음 23.6 0.9431 29.56 1.07
hu7B10 12.010 결합 없음 75.3 6.8700 112.4 0.284
두핍루맙 42.560 결합 없음 178.7 0.6668 491.2 0.126
실시예 9: 인간화 항체 hu25G7의 친화도 성숙(affinity maturation) 실험
더 효과적인 항-인간 IL-4R 항체를 수득하기 위하여, 25G7 항체를 효모 디스플레이 플랫폼 기술을 통해 친화도 성숙시키고, hu25G7 항체를 기반으로 하여 6개의 CDR을 표적으로 하는 친화도 성숙 효모 라이브러리를 설계하고 제작하였으며, 축퇴성 프라이머를 설계하였다. 설계된 돌연변이체 아미노산을 PCR 및 상동 재조합에 의해 hu25G7-scFv 항체 라이브러리에 도입하였다. 각 라이브러리의 크기는 약 109이었다. 라이브러리의 다양성을 확인하기 위하여 구축된 효모 라이브러리를 2세대 서열 분석(GENEWIZ) 방법으로 검증하였다.
비오틴 표지된 인간 IL-4R을 사용하여 hu25G7-scFv 효모 라이브러리에서 고 친화성 항체를 선택하였다. 2 라운드의 MACS 스크리닝(스트렙토마이신 자기 비드, Invitrogen) 및 2 라운드의 FACS 스크리닝(BD FACSAriaTM FUSION) 후, 단클론 배양 및 발현 유도를 위하여 효모 단일 클론을 선택하였다. FACS(BD FACSCanto II)를 사용하여 인간 IL-4R에 대한 단일 효모 클론의 결합을 검출하였고, 야생형 25G7 항체보다 더 높은 친화도를 갖는 단일 효모 클론을 서열 분석 검증을 위하여 선택하였다. 서열 분석 클론의 정렬 및 분석 후, 중복 서열을 제거하고, 비 중복 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위하여 전장(full-length) 인간 항체 분자로 전환시켰다. BIAcoreTM X-100(GE Life Sciences)을 사용하여 친화도 정제 후 전장 항체의 친화도를 테스트하고, 인간 IL-4R에 대한 친화도가 더 높은 후보 항체 분자를 다음과 같이 선택하였다. 인간 IL-4R에 대한 이러한 항체 분자의 친화도는 야생형 hu25G7 항체보다 높고, 이때, hu25G7-A 항체 분자의 친화도는 두필루맙과 비슷한 반면, hu25G7-B 분자의 친화도는 두필루맙보다 현저히 우수하다.
친화도 성숙 후, 항체 hu25G7-A의 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
hu25G7-A LCVR
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVPYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRAYPPMLTFGGGTKVEIK (서열번호 37).
그 안에 함유된 CDR 서열을 표 9에 제시하였다.
CDR 서열
명칭 서열 서열번호
LCDR1 RASSSVPYMY 서열번호 38
LCDR2 LTSNLAS 서열번호 7
LCDR3 QQWRAYPPMLT 서열번호 40
항체 hu25G7-B의 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
hu25G7-B LCVR
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASPGVPPLAWYQQKPGQAPRLLIYLASSRPSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRSNPPMLTFGGGTKVEIK (서열번호 41);
그 안에 함유된 CDR 서열을 표 10에 제시하였다.
CDR 서열
명칭 서열 서열번호
LCDR1 RASPGVPPLA 서열번호 42
LCDR2 LASSRPS 서열번호 39
LCDR3 QQWRSNPPMLT 서열번호 8
위의 경쇄 가변 영역 hu25G7-A LCVR을 hu25G7 경쇄 불변 영역과 재조합하여 hu25G7-A 항체 경쇄를 수득하였다. 위의 경쇄 가변 영역 hu25G7-B LCVR을 hu25G7 경쇄 불변 영역과 재조합하여 hu25G7-B 항체 경쇄를 수득하였다.
hu25G7-VH-c의 불안정한 아미노산 잔기를 최적화하여 약물기량성(druggability)을 증진시켜, 중쇄 가변 영역 hu25G7-VH를 수득하였다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGNKRGFFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 43).
위에 기술된 중쇄 가변 영역을 hu25G7 중쇄 불변 영역과 재조합하여 hu25G7-A/hu25G7-B 항체 중쇄를 생성할 수 있다.
hu25G7-A 및 hu25G7-B 전장 중쇄 서열을 서열번호 44에 나타내었다.
hu25G7 HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGNKRGFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 44);
각각의 전장 경쇄 서열을 서열번호 45 내지 46에 나타내었다.
hu25G7-A LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVPYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRAYPPMLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 45);
hu25G7-B LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASPGVPPLAWYQQKPGQAPRLLIYLASSRPSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRSNPPMLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 46).
실시예 10: 인간화 항체의 친화도 성숙 활성 데이터
2개의 항체 hu25G7-A 및 hu25G7-B를 실시예 3 및 실시예 4에 기술된 바와 같이 테스트하였다. hu25G7-A 및 hu25G7-B의 두 항체 모두 IL-4/IL-4R의 결합 및 세포 내 신호전달 경로를 차단하여, IL-4 및 IL-13의 활성화 효과의 중화 및 TF-1 세포의 증식의 억제를 초래할 수 있다. 활성화 데이터를 표 11에 나타내었다.
활성 데이터의 비교
항체 인간 IL-4/IL-4R ELISA
차단(IC 50 )
(ng/ml) 		(IL-4와의) HEK293-Blue 세포 결합의 차단(IC 50 )
(ng/ml) 		(IL-13과의) HEK293-Blue 세포 결합의
차단(IC 50 )
(ng/ml) 		IL-4에 의한 TF-1 세포 증식의
억제(IC 50 )
(ng/ml) 		IL-13에 의한 TF-1 세포 증식의
억제(IC 50 )(ng/ml)
hu25G7-A 144.2 6.49 10.02 83.72 13.24
hu25G7-B 108.4 6.598 8.38 50.95 13.71
두핍루맙 156.3 12.48 14.75 100.9 18.10
IL-13 자극으로 인한 TF-1 세포의 증식을 억제하는 실험에서, hu25G7-A와 hu25G7-B 둘 모두는 유익한 효과를 보여주었다. 효과를 반복적으로 검증하였고, 결과는 동일한 조건 하에서 TF-1 세포의 IL-13 자극 증식에 대한 hu25G7-A의 억제 (IC50) 값이 11.68이고, TF-1 세포의 IL-13 자극 증식에 대한 대조군 두필루맙의 억제 (IC50) 값이 22.85임을 보여주었다. 두필루맙과 비교할 때, hu25G7은 IL-4, IL-13의 IL-4R에 대한 결합 및 이러한 결합으로 인한 세포 증식을 차단하는 데 있어서 유의하게 개선된 효과를 갖는다.
실시예 11: 마우스 피부염에 미치는 인간화 항체의 영향에 관한 연구
마우스 피부염 모델을 확립하기 위하여, IL-4/IL-4Rα 유전자 이식 마우스(Cyagen Bioscience Biological Research Center (Taicang) Co., Ltd.로부터 구입)를 사용하였다. 감작을 위해 각 마우스의 복부에 100 μL의 1.5% OXZ 아세톤 올리브유 용액(아세톤:올리브유 = 4: 1)을 약 3 cm x 3 cm 고루 도포하였다. 감작일을 D0(제0일)으로 카운트하였다. 제7일에, 접종을 위해 마우스의 양쪽 귀(양쪽 모두)에 20 μL의 1% OXZ 아세톤 올리브유 용액을 고루 도포하였고, 72시간마다 1회 접종하였다.
정상 대조군(normal control group 감작 및 접종을 위해 아세톤 올리브유 용액만을 도포함), 모델 대조군(model control group), hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙군을 포함한 총 5개 군을 이 실험에서 설정하였고, 군당 3 내지 5마리로 구성하였다. 투여군을 위한 투여량은 50 mg/kg이었고, 투여 경로는 피하 투여, 주 2회였다(상세한 정보는 표 12 참조). 제27일에 마우스의 귀 두께를 버니어 캘리퍼로 측정하고, 결과를 표 12에 나타내었다.
각 군에 대한 투약 계획
군 동물 수 투여 경로 투여량 투여 빈도*
정상 대조군 3마리(수컷) S.C. - 주 2회
모델 대조군 5마리(암컷 3 +수컷 2) S.C. - 주 2회
hu25G7-A 5마리(암컷 3 +수컷 2) S.C. 50 mg/kg 주 2회
hu25G7-B 3마리(암컷 2 +수컷 1) S.C. 50 mg/kg 주 2회
두핍루맙 4마리(암컷 2 +수컷 2) S.C. 50 mg/kg 주 2회
결과는 모델 대조군의 마우스 귀가 명백한 병리학적 손상을 보여주었고 귀 두께가 정상 대조군보다 유의하게 더 큼을 보여주었다. hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙군의 마우스의 귀 두께는 제27일에 모델 대조군보다 유의하게 작았다. 즉, hu25G7-A, hu25G7-B 및 두필루맙은 피부염을 치료하는 데 사용될 수 있고, hu25G7-B가 두필루맙보다 훨씬 효과적이다.
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> HUMAN IL-4R BINDING ANTIBODY, ANTIGEN BINDING FRAGMENT THEREOF, AND MEDICAL USE THEREOF <130> 719056CPCT <160> 46 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(118) <223> murine mAb 25G7 heavy chain variable region <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN 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Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn 85 90 95 Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(108) <223> hu25G7-A light chain variable region <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(10) 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Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 45 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <222> (1)..(215) <223> hu25G7-A light chain <400> 45 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 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Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (19)

  1. 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    중쇄 가변 영역은
    (I) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는
    (II) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3;을 포함하고/포함하거나,
    경쇄 가변 영역은
    (I) 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
    (II) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
    (III) 각각 서열번호 38, 서열번호 7 및 서열번호 40에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
    (IV) 각각 서열번호 42, 서열번호 39 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 다음의 (I) 내지 (IV)로부터 선택된 임의의 하나를 포함하는 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (I) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (II) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (III) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 38, 서열번호 7 및 서열번호 40에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (IV) 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 42, 서열번호 39 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    - 인간 생식선 경쇄 IGKV3-11*01로부터 유래된 FR 영역 서열; 및
    - 인간 생식선 경쇄 IGKV3-11*01로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 복귀 돌연변이는 L46P, L47W 및 F71Y로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이의 조합이고/이거나;
    상기 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    - 인간 생식선 중쇄 IGHV3-48*01로부터 유래된 FR 영역 서열; 및
    - 인간 생식선 중쇄 IGHV3-48*01로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 복귀 돌연변이는 S49A, F67S 및 A93T로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이의 조합인 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    - 인간 생식선 경쇄 IGKV2D-29*01로부터 유래된 FR 영역 서열; 및
    - 인간 생식선 경쇄 IGKV2D-29*01로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 복귀 돌연변이는 M4L 및/또는 V58I로 구성된 군으로부터 선택되고/선택되거나;
    상기 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    - 인간 생식선 중쇄 IGHV1-2*02로부터 유래된 FR 영역 서열; 및
    - 인간 생식선 중쇄 IGHV1-2*02로부터 유래된 FR 영역과 적어도 95%의 동일성을 갖는 복귀 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된 단편 또는 이의 조합을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 복귀 돌연변이는 M69L, R71I, T73K 및 R94K로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 이의 조합인 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab') 2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 프레임워크 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 바람직하게는, 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 프레임워크 영역을 포함하고;
    더욱 바람직하게는, 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG4의 중쇄 프레임워크 영역을 포함하는 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    중쇄 가변 영역은
    (I) 서열번호 1에 제시된 서열 또는 서열번호 1과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (II) 서열번호 9에 제시된 서열 또는 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (III) 서열번호 43에 제시된 서열 또는 서열번호 43과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고/포함하거나,
    경쇄 가변 영역은
    (I) 서열번호 2에 제시된 서열 또는 서열번호 2와 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (II) 서열번호 10에 제시된 서열 또는 서열번호 10과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (III) 서열번호 37에 제시된 서열 또는 서열번호 37과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (IV) 서열번호 41에 제시된 서열 또는 서열번호 41과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고,
    바람직하게는, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 1에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 9에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 43에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 43에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 41에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    중쇄 가변 영역은
    (I) 서열번호 25 내지 27 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 25 내지 27 중 하나와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (II) 서열번호 31 내지 33 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 31 내지 33 중 하나와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고/포함하거나,
    경쇄 가변 영역은
    (I) 서열번호 28 내지 30 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 28 내지 30 중 하나와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (II) 서열번호 34 내지 36 중 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 34 내지 36 중 하나와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하는 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    중쇄는
    (I) 서열번호 17에 제시된 서열 또는 서열번호 17과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (II) 서열번호 19에 제시된 서열 또는 서열번호 19와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (III) 서열번호 44에 제시된 서열 또는 서열번호 44와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고/포함하거나,
    경쇄는
    (I) 서열번호 18에 제시된 서열 또는 서열번호 18과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (II) 서열번호 20에 제시된 서열 또는 서열번호 20과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (III) 서열번호 45에 제시된 서열 또는 서열번호 45와 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는
    (IV) 서열번호 46에 제시된 서열 또는 서열번호 46과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열;을 포함하고,
    바람직하게는, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 17에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 18에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
    서열번호 19에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 20에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
    서열번호 44에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 45에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
    서열번호 44에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 46에 제시된 바와 같은 경쇄;
    로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나를 포함하는 것인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 이의 단편인, 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터, 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    바람직하게는, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 포유동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되고,
    더욱 바람직하게는, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 중국 햄스터 난소 세포, 인간 배아 신장 293 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 숙주 세포.
  13. IL-4R의 검출 또는 측정 방법으로서, 샘플을 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 시약.
  15. 제14항에 있어서, 인간 IL-4R 양성 세포와 관련된 질환을 진단하는 데 사용하기 위한 시약.
  16. 제약 조성물로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    제약상 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체
    를 포함하는 제약 조성물.
  17. IL-4R 매개성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용, 또는 면역 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제10항의 폴리뉴클레오티드, 및 제16항의 제약 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나의 용도로서,
    바람직하게는, 질환 또는 병태는 천식(asthma), 코 폴립(nasal polyps), 만성 부비동염(chronic sinusitis), 알레르기성 피부 질환(allergic skin disease), 호산구성 식도염(eosinophilic esophagits), 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 관절염(arthritis), 염증성 질환(inflammatory disease), 알레르기 반응(allergic reaction), 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 바렛 식도(Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 결핵(tuberculosis) 및 신장병(neuropathy)으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    더욱 바람직하게는, 질환 또는 병태는 천식 또는 알레르기성 피부 질환인 것인, 용도.
  18. IL-4R 매개성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방, 및/또는 면역 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제16항에 따른 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는, 질환 또는 병태는 천식, 코 폴립, 만성 부비동염, 알레르기성 피부 질환, 호산구성 식도염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 알레르기성 비염, 관절염, 염증성 질환, 알레르기 반응, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 바렛 식도, 자가면역 포도막염, 결핵 및 신장병으로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, 질환 또는 병태는 천식 또는 알레르기성 피부 질환인 것인, 방법.
  19. 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법으로서,
    제12항의 숙주 세포에서 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계, 및
    숙주 세포로부터 항-IL-4R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
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