ES2818074T3

ES2818074T3 - Agente de unión a IL-17A y sus usos

Info

Publication number: ES2818074T3
Application number: ES14862443T
Authority: ES
Inventors: Lianshan Zhang; Jiajian Liu; Guoqing Cao; Piaoyang Sun
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2014-10-27
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2034-10-27
Also published as: CY1123493T1; EP3072905A1; KR102278487B1; JP2017502924A; US20160289321A1; CA2929662A1; RU2016122340A; RS61034B1; EP3072905A4; HK1212993A1; AU2014350758B2; EP3072905B1; BR112016009948A2; SI3072905T1; WO2015070697A1; JP6513657B2; HUE052184T2; CN104936981B; CA2929662C; KR20160085793A

Abstract

Un anticuerpo de unión a IL-17A o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región variable de cadena ligera de anticuerpo, que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 respectivamente; y una región variable de cadena pesada de anticuerpo, que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente; en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo se selecciona de las regiones variables de cadena pesada mostradas en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7; y en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo se selecciona de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN

Agente de unión a IL-17A y sus usos

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a un agente de unión a IL-17A y su uso como agente terapéutico, en particular como agente terapéutico para una variedad de enfermedades inflamatorias o autoinmunes.

Antecedentes

Las citocinas de la familia de la interleucina 17 se denominan como IL-17A a IL-17F, respectivamente. Al mismo tiempo, también se descubre la familia de sus receptores, el receptor A de IL-17 al receptor E de IL-17: estas citocinas de iL-17 se unen al receptor correspondiente, por lo que median diferentes respuestas inflamatorias.

El miembro más típico de la familia es IL-17A. Los linfocitos que migran a los sitios de infección o lesión pueden secretar IL-17A. Por un lado, IL-17A induce la expresión de citocinas y quimiocinas inflamatorias, por lo que recluta más células inmunes al sitio de inflamación y exacerba la respuesta inflamatoria; por otro lado, IL-17A induce la expresión de algunos factores relevantes para la reparación tisular, acelerando así la recuperación del organismo. Aunque la interleucina 17A tiene el efecto de amplificar la respuesta de defensa inmune y proteger a los organismos durante el proceso de antiinfección y reparación de tejidos en el huésped, en muchos pacientes que padecen enfermedades autoinmunes y cánceres, la interleucina 17A se expresa altamente; la expresión excesiva de interleucina 17A juega un papel de deterioro en el desarrollo patológico, ya que puede inducir la expresión de varios factores inflamatorios. Muchos experimentos con animales han demostrado que la gravedad patológica de diversas enfermedades autoinmunes puede suprimirse eficazmente mediante la deficiencia de interleucina 17A o la neutralización de anticuerpos de interleucina 17A. Existe evidencia de que la señal de IL-17 mostró cierto efecto como objetivo para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, incluida la artritis reumatoide (AR), psoriasis, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple (EM), enfermedad de psoriasis, asma y lupus (véase, por ejemplo, Aggarwal et al., J. Leukoc. Biol., 71 (1): 1-8 (2002); Lubberts et al.).

La IL-17 humana es un gen que codifica un polipéptido que tiene hasta 155 aminoácidos. El polipéptido comprende una secuencia señal de 19 aminoácidos y un área madura de 132 aminoácidos. Con un peso molecular relativo de 17.000 Da, la IL-17A humana es una glicoproteína que existe en forma de homodímero o heterodímero (Spriggs et al., J. Clin. Immunol, 17: 366-369 (1997)). IL-17F, un homólogo, puede combinarse con IL-17A para formar un heterodímero IL-17A/F. La secuencia de aminoácidos de IL-17F (IL-24, ML-1) tiene hasta un 55 % de similitud con la de IL-17A, ambas tienen el mismo receptor, IL-17R. IL-17R se expresa de forma ubicua en una variedad de células, incluidas células endoteliales vasculares, células T periféricas, células B, fibroblastos, mielomonocitos y células estromales de la médula ósea (Kolls et al., Immunity, 21: 467-476 (2004); Kawaguchi et al., J. Allergy Clin. Immunol, 114 (6): 1267-1273 (2004); Moseley et al., Cytokine Growth Factor Rev, 14 (2): 155-174 (2003)).

El documento WO 2010/034443 A1 se refiere a un anticuerpo que se une a IL-17 caracterizado por unirse al mismo epítopo de IL-17 al que se une el anticuerpo monoclonal 3C1, y ser del isotipo IgG1 humano modificado en la región bisagra en la posición del aminoácido 216-240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región entre dominios en la posición del aminoácido 327-331 entre CH2 y CH3, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

El documento WO 2007/070750 A1 se refiere a anticuerpos anti-IL-17 caracterizados por tener una alta afinidad y baja constante de disociación para la IL-17 humana, para el tratamiento de trastornos autoinmunes, inflamatorios, proliferativos celulares y del desarrollo.

El documento WO 2006/013107 A1 se refiere a una molécula de unión a IL-17, en particular un anticuerpo contra IL-17 humana, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por IL-17, por ejemplo, artritis reumatoide.

El documento WO 2008/021156 A2 se refiere a anticuerpos modificados genéticamente contra IL-17A humana. El documento WO 2009/136286 A2 se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos que reconocen IL-17F, el homodímero de IL-17F, IL-17A, el homodímero de IL-17A y/o el complejo proteico heterodimérico IL-17A/IL-17F y además a los métodos de uso de dichos anticuerpos monoclonales como compuestos terapéuticos, de diagnóstico y profilácticos.

El documento WO 2011/053763 A2 se refiere a antagonistas de anticuerpos de interleucina 17A (IL-17A), polinucleótidos que codifican antagonistas de anticuerpos de IL-17A o fragmentos de los mismos, y métodos para su preparación y uso.

El documento WO 2008/047134 A2 se refiere a moléculas de anticuerpo que tienen especificidad por determinantes antigénicos tanto de IL-17A como de IL-17F, usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpo y métodos para producir dichas moléculas de anticuerpo.

Desde el descubrimiento de la interleucina 17A, hasta ahora, se han encontrado una variedad de anticuerpos anti-IL-17A, tales como CN101001645A, CN101326195A, CN101646690A, pero todavía existe la necesidad de desarrollar varios tipos de anticuerpos mejorados para reducir eficazmente o eliminar la actividad de IL-17 en una respuesta inflamatoria y enfermedades autoinmunes.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-IL-17A con mayor afinidad y vida media más larga.

La presente divulgación proporciona un agente de unión a IL-17A, que comprende:

una región variable de cadena ligera de anticuerpo, que comprende 0-3 regiones LCDR seleccionadas de las mostradas en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15; y

una región variable de cadena pesada de anticuerpo, que comprende 0-3 regiones HCDR seleccionadas de las mostradas en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12;

en la que el número de regiones CDR de la región variable de cadena ligera de anticuerpo y las regiones variables de cadena pesada no es simultáneamente 0.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende la SEQ ID NO: 13.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende la SEQ ID NO: 14.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende la SEQ ID NO: 15.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende la SEQ ID NO: 10.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende la SEQ ID NO: 11.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende la SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende una región LCDR seleccionada de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende una región HCDR seleccionada de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende dos regiones LCDR seleccionadas de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende dos regiones HCDR seleccionadas de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende tres regiones LCDR, en las que la secuencia de aminoácidos de LCDR1 se muestra en la SEQ ID NO: 13, la secuencia de aminoácidos de LCDR2 se muestra en la SEQ ID NO: 14, la secuencia de aminoácidos de LCDR3 se muestra en la SEQ ID NO: 15.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A comprende tres regiones HCDR, en las que la secuencia de aminoácidos de HCDR1 se muestra en la SEQ ID NO: 10, la secuencia de aminoácidos de HCDR2 se muestra en la SEQ ID NO: 11, la secuencia de aminoácidos de HCDR3 se muestra en la SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A, en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende además la región FR de cadena ligera derivada de la cadena k, A murina o una variante de la misma. En algunos aspectos, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo es la SEQ ID NO: 2. Además, el agente de unión a IL-17A comprende una región constante de cadena ligera derivada de la cadena k, A murina o una variante de la misma.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A, en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende además la región FR de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 murinas o una variante de las mismas. En algunos aspectos, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo es la SEQ ID NO: 1. Además, el agente de unión a IL-17A comprende la región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 murinas o una variante de las mismas.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A, en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo del mismo comprende además la región FR de cadena ligera derivada de la cadena k, A humana o una variante de la misma; en algunos aspectos, la región FR de cadena ligera de la región variable de cadena ligera del anticuerpo es la región FR de cadena ligera A10 de la línea germinal humana cuyo aminoácido se muestra en la SEQ ID NO: 4, o una variante de la misma. En algunos aspectos, la variante de la región FR de la región variable de cadena ligera del anticuerpo se refiere a la región FR de cadena ligera A10 de la línea germinal humana con mutaciones de 0-10 aminoácidos. En algunos aspectos, la mutación de aminoácidos en una variante de la región FR de la región variable de cadena ligera es una o más seleccionadas del grupo que consiste en F71Y, K49Y, Y36F y L47W. En algunos aspectos, la cadena ligera del anticuerpo se selecciona de la SEQ ID NO: 9 y una variante de la misma. Además, el agente de unión a IL-17A comprende una región constante de cadena ligera derivada de la cadena k, A humana o una variante de la misma.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el agente de unión a IL-17A, en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo del mismo comprende además la región FR de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas o una variante de las mismas; en algunos aspectos, la región FR de cadena pesada de la región variable de cadena pesada del anticuerpo es la región FR de cadena pesada de la línea germinal humana VH1-18, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma; en algunos aspectos, una variante de la región FR de la región variable de cadena pesada del anticuerpo se refiere a la cadena pesada de la línea germinal humana VH1-18 con mutaciones de 0-10 aminoácidos; en algunos aspectos, la mutación de aminoácidos en las variantes de la región FR de la región variable de cadena pesada es una o más seleccionadas del grupo que consiste en: A93T, T71A, M48I, V67A, M69L, T73D y S76N; en algunos aspectos, la cadena pesada del anticuerpo se selecciona de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. Además, el agente de unión a IL-17A comprende una región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas o una variante de las mismas.

Además, de acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, se proporciona un vector que expresa IL-17A mencionado anteriormente. Las células huésped expresan y secretan el agente de unión a IL-17A después de ser transfectadas con el vector.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, el vector comprende un nucleótido que codifica el agente de unión a IL-17A de la presente divulgación.

Además, de acuerdo con algunos aspectos de la presente divulgación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el agente de unión a IL-17A como se describió anteriormente y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además, de acuerdo con algunos aspectos, la presente divulgación también proporciona el uso del agente de unión a IL-17A anterior, o la composición farmacéutica que lo contiene, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por IL-17. Las enfermedades son enfermedades inflamatorias o autoinmunes; las enfermedades se seleccionan entre psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, artritis inflamatoria; la enfermedad inflamatoria es preferiblemente artritis inflamatoria. La artritis inflamatoria se selecciona de osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumática u osteoporosis, preferiblemente artritis reumática.

De acuerdo con algunos aspectos, la presente divulgación también proporciona el uso del anticuerpo IL-17A anterior, o la composición farmacéutica que lo contiene, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por IL-17. Las enfermedades son enfermedades inflamatorias o autoinmunes. La enfermedad inflamatoria es preferiblemente artritis inflamatoria. La artritis inflamatoria se selecciona entre osteoartritis, artritis reumatoide u osteoporosis.

De acuerdo con algunos aspectos, la presente divulgación también proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por IL-17, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de agente de unión a IL-17A como se describió anteriormente o anticuerpo IL-17A humanizado o composición farmacéutica que lo contenga.

Para que la invención pueda entenderse más fácilmente, a continuación se definen específicamente ciertos términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte de este documento, todos los demás términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

I. Términos

Como se usa en este documento, el código de una sola letra y el código de tres letras para los aminoácidos son como se describe en J. Biol. Chem, 243, (1968) página 3558.

Como se usa en el presente documento, "agente de unión" se refiere a un receptor soluble o fragmentos o análogos del mismo, o anticuerpos o fragmentos del mismo o análogos del mismo capaces de unirse al objetivo. "Agente de unión a IL-17A" de acuerdo con la presente divulgación, se refiere a un anticuerpo o fragmento o análogo del mismo capaz de reconocer específicamente IL-17A y unirse a IL-17A.

El término "IL-17A" generalmente se refiere a IL-17A humana natural o recombinante y homólogos no humanos de IL-17A humana. A menos que se indique lo contrario, se adopta el peso molecular del homodímero de IL-17A (por ejemplo, 30 KDa para IL-17A humana) para calcular la concentración molar de IL-17A.

Como se usa en este documento, "Anticuerpo" se refiere a inmunoglobulina, una estructura de cadena de cuatro péptidos que consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas mediante un enlace disulfuro. Las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina exhiben diferentes órdenes y componentes de aminoácidos, por lo que presentan una antigenicidad diferente. En consecuencia, las inmunoglobulinas se pueden dividir en cinco categorías, o denominadas isotipos de inmunoglobulina, a saber, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. De acuerdo con sus componentes de aminoácidos de la región bisagra y el número y la ubicación de los enlaces disulfuro de la cadena pesada, la Ig de la misma categoría se puede dividir en diferentes subtipos, por ejemplo, la IgG se puede dividir en IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. La cadena ligera se puede dividir en cadena k o A por diferentes regiones constantes.

La región de aproximadamente 110 secuencias de aminoácidos cerca del extremo terminal N de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo cambia en gran medida, lo que se conoce como región variable (región V); la región del resto de la secuencia de aminoácidos cerca del extremo terminal C es relativamente estable, conocida como región constante (región C). La región variable comprende tres regiones hipervariables (HVR) y cuatro regiones FR relativamente conservadas (FR). Tres regiones hipervariables determinan la especificidad del anticuerpo, también conocida como región determinante de complementariedad (CDR). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y cada región variable de cadena pesada (HCVR) está compuesta por tres regiones CDR y cuatro regiones FR, orden secuencial desde el terminal amino hasta el terminal carboxilo es: FR1, CDR1, FR2, Cd R2, FR3, CDR3 y FR4. Tres regiones CDR de cadena ligera, a saber, regiones hipervariables de cadena ligera (LCDR), se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3; tres regiones CDR de cadena pesada, a saber, regiones hipervariables de cadena pesada (LCDR), se refieren a HCDR1, HCDR2 y HCDR3. El número y la ubicación de los residuos de aminoácidos de la región CDR en las regiones LCVR y HCVR del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en este documento cumplen con los criterios de numeración de Kabat conocidos (LCDR1-3, HCDE2-3), o cumplen con los criterios de numeración de Kabat y Chothia (HCDR1).

Como se usa en este documento, "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')²o un fragmento Fv único que tiene actividad de unión a antígeno. El anticuerpo Fv es un fragmento de anticuerpo mínimo que comprende una región variable de cadena pesada, una región variable de cadena ligera y todos los sitios de unión al antígeno, sin región constante. Generalmente, el anticuerpo Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL, y es capaz de formar una estructura requerida para la unión del antígeno.

Como se usa en este documento, el término "determinante de antígeno" de la presente divulgación, se refiere a los sitios tridimensionales, que son discretos en el antígeno, y reconocidos por el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación.

"Administración" y "tratamiento", según se aplican a animales, seres humanos, sujetos experimentales, células, tejidos, órganos o fluido biológico, se refieren a animales de contacto, seres humanos, sujetos, células, tejidos, órganos o fluido biológico. con medicamentos, agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico o composiciones exógenas. "Administración" y "tratamiento" pueden referirse, por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de investigación y experimentales. El tratamiento de las células comprende el contacto de las células con un agente, así como el contacto del fluido con un agente, en el que el fluido está en contacto con las células. "Administración" y "tratamiento" también significan tratamiento in vitro y ex vivo, por ejemplo de, células, por un agente, una composición de unión o de diagnóstico, o por otras células. "Tratamiento", como se aplica a sujetos humanos, veterinarios o de investigación, se refiere a tratamientos terapéuticos, medidas profilácticas o preventivas, para aplicaciones de investigación y diagnóstico. El "tratamiento", tal como se aplica a sujetos humanos, veterinarios o de investigación, o células, tejidos u órganos, comprende el contacto de sujetos humanos o animales, células, tejidos, compartimentos fisiológicos o fluidos fisiológicos con un agonista de IL-17A o un antagonista de IL-17A. El "tratamiento de células" también abarca situaciones en las que el agonista de IL-17A o el antagonista de IL-17A se pone en contacto con el receptor de IL-17A, por ejemplo, en la fase fluida o fase coloidal, y también abarca situaciones en las que el agonista o antagonista no se pone en contacto con las células o los receptores.

"Tratar" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de los compuestos de unión de la presente divulgación, interna o externamente a un paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad para los que el agente tiene actividad terapéutica conocida. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de enfermedad en el paciente o la población a tratar, induciendo la regresión o inhibiendo la progresión de dicho síntoma o síntomas en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de una enfermedad en particular (también denominada "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar de acuerdo con varios factores, como el estado de la enfermedad, la edad y el peso del paciente, y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el paciente.

En este documento se mencionan cuatro variantes de la proteína IL-17A humana:

1) Como se usa en el presente documento, los términos "IL-17A humana (huIL-17A)" e "IL-17A humana natural" se refieren a las formas maduras (es decir, los residuos 24-155) de la proteína IL-17A humana con números de acceso NP_002181 y AAT22064, y variantes y polimorfismos de origen natural de las mismas.

2) Como se usa en este documento, el término "rhIL-17A" se refiere a una IL-17A humana recombinante, esta nomenclatura se adopta por conveniencia al referirse a varias formas de IL-17A y puede no coincidir con el uso en la literatura.

3) Como se usa en este documento, el término "His-huIL-17A" se refiere a una IL-17A humana recombinante que tiene una etiqueta His unida al extremo terminal N, "FLAG-huIL-17A" se refiere a una IL-17A humana recombinante que tiene una etiqueta FLAG unida al extremo terminal N. En algunos experimentos, FLAG-huIL-17A está biotinilado. 4) La IL-17A humana de R&D Systems mencionada en el presente documento es una IL-17A humana recombinante adquirida a través de R&D Systems.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo secretado por un clon derivado de una sola célula. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y están dirigidos contra un solo epítopo. La célula no se limita a líneas celulares eucariotas, procariotas o clonales de fagos.

El anticuerpo monoclonal en este documento incluye específicamente un anticuerpo "quimérico", en el que una porción de cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a un tipo o subtipo de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otro tipo o subtipo de anticuerpo, así como un fragmento de dicho anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo humanizado" es una forma modificada de región variable del anticuerpo murino de acuerdo con la presente divulgación, que tiene regiones CDR derivadas de (o sustancialmente derivadas de) un anticuerpo no humano (preferiblemente un anticuerpo monoclonal de ratón), y regiones FR y regiones constantes sustancialmente derivadas de anticuerpos humanos; es decir, las secuencias de la región CDR del anticuerpo murino se injertan en diferentes tipos de secuencias marco de anticuerpos de la línea germinal humana. Dichas secuencias marco se pueden obtener de bases de datos públicas de a Dn o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal de los genes de la región variable pesada humana y los genes de la región variable de cadena ligera se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en la Internet www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), también como se encuentra en Kabat, EA, etc. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es factible construir un vector de expresión para expresar un anticuerpo recombinante que pueda imitar una característica específica de un anticuerpo natural.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el siguiente evento o situación puede ocurrir, pero no necesariamente, y la divulgación incluye los casos en los que el evento o situación ocurre o no. Por ejemplo, "contiene opcionalmente 1-3 regiones variables de cadena pesada de anticuerpo" significa que la región variable de cadena pesada de anticuerpo con secuencias específicas puede estar presente, pero no necesariamente, si está presente, puede haber 1, 2 o 3.

La transformación de la célula huésped con el ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Los transformantes obtenidos se cultivan usando métodos convencionales para expresar el polipéptido codificado por el gen de la divulgación. El medio de cultivo se puede seleccionar de varios medios de cultivo convencionales con base en las células huésped utilizadas. Las células huésped crecen en condiciones adecuadas.

II. Anticuerpos específicos para IL-17A humana

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-IL-17A modificados y usos de los mismos para tratar diversos trastornos inflamatorios, inmunes y proliferativos, que incluyen artritis reumatoide (AR), osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, fibrosis inflamatoria (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis pulmonar, y cirrosis), trastornos inflamatorios del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad inflamatoria del intestino), asma (que incluye asma alérgica), alergias, EPOC, esclerosis múltiple, psoriasis y cáncer.

Puede usarse cualquier método adecuado para generar anticuerpos monoclonales para generar los anticuerpos anti-IL-17A de la presente divulgación. Por ejemplo, un receptor animal puede inmunizarse con un enlace o por Ejemplo un homodímero de IL-17A de origen natural, o un fragmento del mismo. Puede utilizarse cualquier método adecuado para la inmunización. Dichos métodos pueden incluir adyuvantes, otros inmunoestimulantes, inmunizaciones de refuerzo repetidas y el uso de una o más rutas de inmunización.

Puede usarse cualquier forma adecuada de IL-17A como inmunógeno (antígeno) para la generación del anticuerpo no humano específico para IL-17A, el anticuerpo puede seleccionar por su actividad biológica. El inmunógeno provocador puede ser IL-17A humana madura de longitud completa, incluidos homodímeros de origen natural enlazados, o péptidos de los mismos que abarcan un solo epítopo o múltiples epítopos. El inmunógeno puede usarse solo o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El inmunógeno puede purificarse a partir de una fuente natural o producirse en células modificadas genéticamente. El ADN que codifica el inmunógeno puede derivarse de ADN genómicos o no genómicos (por ejemplo, ADNc). Se pueden usar vectores genéticos adecuados para expresar los ADN que codifican el inmunógeno, dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores baculovirales, plásmidos y vectores no virales.

En el Ejemplo 1 se describe un ejemplo de método para producir anticuerpos anti-IL-17A humana de la presente divulgación.

III. Humanización de anticuerpos específicos de IL-17A

El anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier tipo de inmunoglobulinas, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede usarse cualquier isotipo de IgG, incluidas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. También se contemplan variantes de los isotipos de IgG. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias derivadas de más de un tipo o isotipo. La optimización de las secuencias de dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se logra fácilmente mediante la selección de los anticuerpos en los ensayos biológicos descritos a continuación en los Ejemplos.

Asimismo, puede usarse cualquier tipo de cadena ligera en los compuestos y métodos de la presente invención. Específicamente, kappa (k), lambda (A) o una variante de los mismos es útil en los presentes compuestos y métodos. En el Ejemplo 2 se describe un ejemplo de método para humanizar anticuerpos anti-IL-17A humana de la presente divulgación.

Descripción detallada de la invención

A continuación, la presente invención se describe adicionalmente con referencia a ejemplos; sin embargo, el alcance de la presente invención no se limita a los mismos. En la medida en que los ejemplos incluyan cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones, se incluye simplemente con fines de referencia.

En los ejemplos descritos en el presente documento, cuando no se describen condiciones específicas, los experimentos se llevan a cabo generalmente en condiciones convencionales o en condiciones propuestas por los fabricantes del material o producto. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. Cuando no se proporciona específicamente la fuente de los reactivos, los reactivos son reactivos convencionales disponibles comercialmente.

Ejemplo 1: anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-17A humana

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales contra IL-17A humana como sigue. Ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad (Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp. Ltd, certificado de producción de animales de laboratorio No: SCXK (HU) 2008-0016) y ratones SJL hembra de 6-8 semanas de edad (Beijing Weitong Lihua certificado de producción de animales de laboratorio No: SCXK (Beijing) 2012-0001) se dividieron en dos grupos, grupo de dosis alta y el grupo de dosis baja. Se utilizaron 10 ratones BALB/c y 10 ratones SJL para cada grupo.

Los grupos de dosis alta y dosis baja se inmunizaron en serie con la variante natural de hIL-17A (His-hIL-17A, la secuencia de aminoácidos de hIL-17A se refiere a la proteína IL-17A humana con el número de acceso del GenBank NP-002181, la proteína resultante se purificó mediante una columna de afinidad de Ni (Superdex) 75SEQ secuencialmente), que además se etiquetaron con His en el extremo terminal N y se generaron mediante el sistema de expresión HEK293E (293-EBNA, Invitrogen, Lote No: 493985). Las inoculaciones se realizaron los días 0, 14, 35 y 56.

El día 0, al grupo de dosis alta se le administró His-huIL-17A, 500 pg/ratón, mediante inyección subcutánea (sc), y se le administró adyuvante completo de Freund (ACF) mediante inyección intraperitoneal (ip) al mismo tiempo. Los días 14 y 35, se administraron 25 pg/ratón de His-hIL-17A a través de inyecciones sc, al mismo tiempo. Se administró adyuvante incompleto de Freund (AIF) a través de inyección ip. El día 56, antes de fusionar los esplenocitos, se realizó una inmunización de refuerzo por inyección ip con 25 pg/ratón de His-hIL-17A disuelto en solución salina. El cronograma y el método para la inmunización del grupo de dosis baja son los mismos que los del grupo de dosis alta, excepto que la dosis administrada de His-hIL-17A el día 0 fue de 10 pg/ratón, la dosis administrada de His-hIL-17A el día 14, 35 y 56 fue de 5 pg/ratón.

Se realizaron análisis de sangre el día 22 y el día 43. Se analizó el suero de los ratones mediante la prueba ELISA descrita en el Ejemplo 1 para determinar los títulos de anticuerpos en suero. El día 56, se seleccionaron ratones con títulos de anticuerpos más altos en suero para la fusión de esplenocitos. El hibridoma se obtuvo fusionando linfocitos esplénicos con células de mieloma Sp2/0 (ATCC® CRL-8287MR) utilizando un procedimiento de fusión optimizado mediado por PEG.

Los procedimientos de inmunización fueron los siguientes:

Esquema 1, dosis alta, 10 ratones Balb/c y 10 ratones SJL, los procedimientos fueron los siguientes:

Esquema 2, dosis baja, los procedimientos fueron los siguientes:

La selección previa de los hibridomas resultantes se realizó mediante una prueba ELISA indirecta de antígenoanticuerpo en el Ejemplo de prueba 1. Se obtuvieron cepas de células monoclonales mediante dilución limitante de cepas de células positivas.

Las líneas celulares monoclonales obtenidas se seleccionaron adicionalmente, incluyendo:

1. Prueba de bloqueo del receptor, véase el Ejemplo 2 de prueba, los resultados se muestran en la Tabla 5, se seleccionó y obtuvo la línea celular monoclonal lL17-mAb049 que tiene una actividad superior a la del control positivo; 2. Prueba de afinidad: véase el Ejemplo 3 de prueba, los resultados se muestran en la Tabla 6, que revela que la línea celular monoclonal IL17-mAb049 seleccionada y obtenida en la presente divulgación mostró una actividad comparable o mejor en comparación con el control positivo;

3. Bioensayo a nivel celular (análisis GROa): véase el Ejemplo 4 de prueba, los resultados se muestran en la Tabla 8, que reveló que la línea celular monoclonal IL17-mAb049 seleccionada y obtenida en la presente divulgación mostró una actividad comparable o mejor en comparación con el control positivo.

Se estudiaron adicionalmente doce de los monoclones después de la primera y segunda selección. Se seleccionó un monoclón principal (mAb principal) de IL17-mAb049 mediante agrupación de epítopos, prueba de actividad biológica. Las secuencias específicas de cadena pesada (VH) y cadena ligera (LH) del anticuerpo murino IL-17A de ratón mAb049 (IL-17mAb) fueron las siguientes:

IL-17 mAb049 VH SEQ ID NO: 1 HVQLQQSGADLVRPGASVTLSCKASGYIFTDYEVHWVKQTPVHGLEWIGVIDPG-TGGVAYNQKFEGKATLTADDSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGT SVTVSS IL-17mAb049 VL SEQ ID NO: 2 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPGTSPKLWIYRTSNLA-SGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRME AEDAATYYCQQRSSYPWTFGGGTNLEIK

Ejemplo 2: Humanización de anticuerpos murinos anti-IL-17A humana

La humanización del anticuerpo monoclonal murino anti-IL-17A humana mAb049 se realizó esencialmente como se describe en una gran cantidad de bibliografía conocida por el público en la técnica. Brevemente, se usaron dominios constantes humanos para reemplazar los dominios constantes parentales (anticuerpo murino). Las secuencias de la línea germinal humana utilizadas para la humanización se seleccionaron de acuerdo con la homología entre el anticuerpo murino y el anticuerpo humano.

1. Regiones CDR del anticuerpo murino anti-IL-17A

Los residuos de aminoácidos de CDR VH/VL se identificaron y anotaron mediante el sistema de numeración de Kabat. Las secuencias de CDR del mAb049 murino en la presente divulgación se enumeraron en la siguiente tabla:

Tabla 1: Secuencias de CDR del anticuer o de ratón anti-IL-17A

2. Selección de secuencias de FR de la línea germinal humana

Sobre la base de las estructuras típicas de las CDR VH/VL de anticuerpos murinos obtenidos, las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se compararon con la base de datos de anticuerpos. Se obtuvieron la cadena pesada de la línea germinal humana VH1-18 (SEQ ID NO: 3) y la cadena ligera A10 (SEQ ID NO: 4) con alta homología y se usaron como secuencias de FR humanizadas. Las secuencias específicas son las siguientes: VH1-18 SEQ ID NO: 3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNY AQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR

A10 SEQ ID NO: 4 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGS GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP

3. Diseño de anticuerpos humanizados:

Se determinaron los residuos de aminoácidos que forman la conformación del anillo y la interfaz de VH. Teniendo en cuenta los siguientes factores, la mutación Q1E fue para eliminar la formación de ácido piroglutámico del extremo terminal N. Las mutaciones también incluyen aquellas que mantienen la coherencia dentro de la familia VH seleccionada, para mantener la estructura típica de CDR y la interfaz VH/VL, y evitar el patrón N-glicosilado (N-{P}-S/T) presente en la estructura humanizada.

El diseño de mutaciones humanizadas en regiones variables del anticuerpo murino mAb049 se resumió como sigue:

Tabla 2: Sitios humanizados diseñados en anticuer o murino mAb049

continuación

Tabla 3: Secuencias humanizadas^ del anticuer o munno mAb049

4. Expresión y purificación de anticuerpos humanizados

Los anticuerpos mencionados anteriormente se clonaron, expresaron y purificaron mediante métodos genéticamente recombinantes. Los anticuerpos humanizados con buen rendimiento se seleccionaron finalmente mediante ELISA, ensayo de inhibición de la unión al receptor, Biacore, prueba de viabilidad celular, etc. Los anticuerpos específicos se indican en la siguiente tabla:

Tabla 4: Com onentes del anticuer o IL-17A humanizado

Las secuencias específicas del anticuerpo humanizado mAb049 se enumeran a continuación:

Hu049-17.VH SEQ TD NO: 5

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWMGVIDPGTG GVAYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYS LFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS

Hu049-18.VH SEQ ID NO: 6

EV QLV Q S GAE VKKPG AS VKVSCKAS GYTFTD YEVH WVRQAPGQGLE WMGVIDPGT G GVAYNQKFEGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYS LFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS

Hu049-19.VH SEQ TD NO: 7

EV QLV Q SGAE VKKPG AS VKV S CKAS GYTFTD YEVH WVRQAPGQGLEWIGVIDPGT GG VAYNQKFEGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWG QGTLVTVSS

Hu049-20.VH SEQ ID NO: 8

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWIGVIDPGTGG VAYNQKFEGRATLT ADDSTNT AYMELRS LRSDDT AVYY CTRY S LFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS

Hu049VL SEQ ID NO: 9 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPDQSPKLWIYRTSNLASGVPSR FSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQRSSYPWTFGQGTKLEIKR

Ejemplo 3: Ensayo de farmacocinética y farmacodinámica in vivo del anticuerpo anti-IL-17 humanizada

La IL-17 humana puede unirse y estimular el receptor de IL-17 de ratón, lo que conduce al aumento y posterior secreción de quimiocinas en ratones macho KC (CXCL1). Se realizaron experimentos con varios tiempos y varias dosis para identificar la dosis óptima de IL-17 humana y el mejor momento para inducir KC en ratones (véase el Ejemplo de prueba 5). Estos experimentos muestran que 150 mg/kg de IL-17 humana y 2 horas después de la administración de IL-17 inducen el nivel más alto de KC en suero de ratón. Los anticuerpos de longitud completa de la presente divulgación se administraron por vía intravenosa a ratones a la concentración de 3, 30, 300, 3000 pg/kg, 20 horas antes de la inyección subcutánea de IL-17 humana. Dos horas después de la administración de IL-17 humana, se sacrificaron los ratones y se determinó el nivel de KC usando un kit disponible comercialmente, por ELASA de acuerdo con la especificación del fabricante (Kit de ELISA CXCL1/KC de ratón, R&D SYSTEM, # Sm Kc 00B). Se utilizó como control negativo el anticuerpo con el mismo isotipo. Los anticuerpos bloquean la capacidad de la IL-17 humana para estimular el receptor de IL-17 de ratón, lo que da como resultado la inhibición del aumento de KC de una manera dependiente de la dosis en ratones. En comparación con el anticuerpo de control ineficaz, el anticuerpo Hu049-18 de la presente invención redujo el nivel medio de KC a aproximadamente 1/6 en las condiciones descritas a la dosis de 3000 pg/ratón.

Se determinó la farmacocinética del suero en ratas y monos Rhesus después de la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo Hu049-18 de la presente invención (véase el Ejemplo de prueba 6). En ratas, la vida media fue de 9,91 días después de la administración intravenosa de 5 mg/kg y la vida media fue 11,5 días después de la administración subcutánea de 5 mg/kg. En macacos, la vida media fue de 24,4 días después de la administración intravenosa de 1 mg/kg.

Ejemplos de prueba

Ejemplo de prueba 1: ELISA indirecto

Propósito:

Se seleccionó el método ELISA indirecto para asegurar la selección de anticuerpos que pueden reconocer el epítopo conformacional y para seleccionar los hibridomas de ratón del Ejemplo 1 de la presente divulgación.

Materiales:

Se clonó IL-17A humana (hIL-17A) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando las secuencias de la proteína IL-17A humana con el número de acceso del GenBank NP-002181, y se transfectó transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

Se clonó IL-17A/F humana (heterodímero, hIL-17A/F) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando las secuencias de la proteína IL-17A humana con número de acceso del GenBank NP-002181 y secuencias de la proteína IL-17F humana con número de acceso del GenBank NP_443104 y transfectadas transitoriamente en células HEK293E para expresión.

Como controles positivos, los anticuerpos murinos anti-IL-17 de Lilly y Novartis (mAb de Lilly, mAb de Novartis) se clonaron mediante las secuencias murinas descritas en los documentos US 7.838.638B2 (LY 2439821) y US 7.807.155B2 (AIN 457), respectivamente, y transfectados transitoriamente en células HEK293E para expresión. Anticuerpos murinos mAb derivados de hibridomas de ratón descritos en el Ejemplo 1 de la presente divulgación. Protocolo:

1. Las placas de microtitulación se recubrieron directamente con 1 pg/mL de estreptavidina, a 4 °C durante la noche; 2. Las placas de microtitulación se bloquearon con 300 pL de PBST que contenía BSA al 2 % (v/v), se incubaron termostáticamente a 37 °C durante 1 hora, mientras que los pozos sin recubrir se bloquearon como control;

3. Lavado con PBST tres veces, todas las operaciones de lavado se realizaron en la lavadora automática Biotek (Elx 405);

4. Se añadieron 100 pL de PBS que contenían hIL-17A o hIL-17A/F (1 pg/mL) a cada pozo, se incubaron termostáticamente a 37 °C durante 1 h;

5. Lavado con PBST 3 veces.

6. Los controles positivos mAb de Lilly y mAb de Novartis o mAb de anticuerpo murino de la presente divulgación se titularon con una dilución de 1:5, la concentración inicial es 1 |jg/mL Se añadieron 100 jL de control positivo diluido o anticuerpo murino de la presente divulgación a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 1 hora. Cada concentración se tituló en pozos por duplicado;

7. Lavado con PBST 3 veces;

8. Se añadieron 100 jL de anticuerpo secundario anti-murino conjugado con HRP (Santa Cruz Cat.No.sc-2005) (1: 5000) a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 1 h;

9. Lavado con PBST 3 veces. Se añadieron 100 jL de sustrato TMB a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 5 min. Luego se detuvo la reacción mediante la adición de 100 jL de H²SO⁴2 M en cada pozo;

10. Se leyó el valor de DO a una longitud de onda de 450 nm en un lector de microplacas ELISA (Molecular Devices, Spectra Max).

11. Los valores de DO de los mAb de anticuerpos murinos se compararon con los de los controles positivos. Se seleccionaron líneas de células monoclonales con una relación mayor de 1, en las que se incluyó IL17-mAb049. Ejemplo de prueba 2: Ensayo de bloqueo del receptor de IL-17 (EBR)

Propósito:

El propósito del ensayo de bloqueo del receptor es seleccionar los anticuerpos capaces de bloquear la unión de IL-17 al receptor de IL-17 (por ejemplo, hIL-17RA). La prueba se basa en una prueba funcional y se puede utilizar para la detección de hibridomas de alto rendimiento.

Materiales y equipos:

Anticuerpo anti-Fc humano (anticuerpo específico de cabra anti-fragmento IgG-Fc humano (disponible a través de Jackson Immunoresearch, 109-005-008))

IL-17RA-Fc humano utilizado en este documento se clonó de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando las secuencias de aminoácidos del receptor de IL-17A humana con el número de identificación de GenBank ADY18334,1, y se transfecta transitoriamente en células HEK293E para su expresión en las que los fragmentos Fc se obtuvieron a partir de IgG1 humana.

Como controles positivos, se clonaron anticuerpos anti-IL-17 murinos de Lilly y Novartis (mAb de Lilly, mAb de Novartis) de acuerdo con las secuencias murinas descritas en los documentos US 7.838.638B2 (LY 2439821) y US 7.807.155B2 (AIN 457), y transfectadas transitoriamente en células HEK293E para expresión.

mIgG: IgG murina (número de catálogo de Millipore PP54), utilizado como control del blanco

Lector de placas ELISA: Molecular Devices, Spectra Max

Cepas de células monoclonales murinas obtenidas del Ejemplo 1 de la presente divulgación.

Protocolo:

1. Las placas de microtitulación se recubrieron directamente con 10 jg/m L de anticuerpo anti-Fc humano, se incubaron a 4 °C durante la noche;

2. Las placas de microtitulación se bloquearon con 300 jL de PBST que contenía BSA al 2 % (v/v), se incubaron termostáticamente a 37 °C durante 1 hora, mientras que el pozo sin recubrimiento se bloqueó como control;

4. Se añadieron 100 jL de PBS que contenía IL-17 RA-Fc (60 ng/mL) a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 2 h;

5. Lavado con PBST 3 veces;

6. Se diluyeron los controles positivos mAb de Lilly y mAb de Novartis o los anticuerpos de la presente divulgación en una proporción de 1:5, la concentración inicial fue de 40 jg/mL. Se diluyó mIgG con el mismo método. Se añadieron 50 jL de control positivo diluido o anticuerpo murino de la presente divulgación o mIgG a cada pozo, mientras tanto, se añadieron 50 jL de IL-17A marcada con biotina 0,2 nM al control positivo diluido o al anticuerpo de la presente divulgación, se mezclaron suavemente y se incubaron termostáticamente a 37 ° C durante 1 h;

7. Lavado con PBST 3 veces;

8. Se añadieron 100 jL de complejo de estreptavidina marcado con HRP (1:5000) a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 1 hora;

9. Lavado con PBST 3 veces. Se añadieron 100 jL de sustrato TMB a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 5 min. Luego se detuvo la reacción con la adición de 100 jL de H²SO⁴2 M en cada pozo;

10. Se leyó el valor de DO a una longitud de onda de 450 nm en un lector de microplacas ELISA.

11. Se calculó el valor de IC⁵⁰del anticuerpo a ensayar para bloquear la unión de iL-17 al receptor de IL-17.

Se obtuvo el valor IC⁵⁰(la concentración de anticuerpo cuando el valor de DO se redujo al 50%, es decir, EBR) de acuerdo con la curva de gradiente de los valores de DO frente a la concentración del anticuerpo.

Resultados experimentales:

De acuerdo con el método anterior, el hibridoma obtenido en el Ejemplo 1 se seleccionó para obtener un anticuerpo monoclonal murino, designado como IL17-mAb049, los resultados son los siguientes:

Tabla 5:

Conclusión: El anticuerpo murino IL17-mAb 049 seleccionado a partir de hibridomas mostró una mejor actividad que los anticuerpos positivos mAb de Lilly y mAb de Novartis.

Ejemplo de prueba 3: Prueba de afinidad

Propósito:

Se usó el método BIACORE en el experimento para determinar la cinética y afinidad de unión antígeno-anticuerpo. Materiales y equipos:

1.1 Proteínas:

Se clonó IL-17A/F humana (heterodímero, hIL-17A/F) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando las secuencias de la proteína IL-17A humana con el número de acceso de GenBank NP-002181 y las secuencias de la proteína IL-17F humana con el número de acceso de GenBank NP_443104, y transfectado transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

Se clonaron IL-17A de ratón (IL-17A Mu) e IL-17A de rata (IL-17A Rata) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando la proteína IL-17A de ratón con el número de acceso de GenBank NP_034682 y proteína IL-17A de rata con número de acceso de GenBank NP_001100367, respectivamente, y transfectadas transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

Como controles positivos, se clonaron anticuerpos anti-IL-17 murinos de Lilly y Novartis (mAb de Lilly, mAb de Novartis) de acuerdo con las secuencias murinas descritas en los documentos US 7.838.638B2 (LY 2439821) y US 7.807.155B2 (AIN 457), respectivamente, y se transfectaron transitoriamente en células HEK293E para su expresión. Como control positivo, se clonó el anticuerpo anti-IL-17 humanizado de Lilly (mAb(hu) de Lilly) de acuerdo con las secuencias humanizadas descritas en el documento US 7.838.638B2 (LY 2439821), y se transfectó transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

Anticuerpos de IL-17 humanizados obtenidos a partir del Ejemplo 2 de la presente divulgación.

1.2 Modelo BIACORE: BIACORE X 100, GE;

1.3 Chips y reactivos BIACORE (los nombres comerciales se enumeran a continuación, sin traducción reconocida):

Protocolo:

1. El anticuerpo de la presente divulgación se inmovilizó en un chip CM5: se preparó NHS 50 mM: EDC 200 mM 1:1 y se inyectó en el canal FC2 (celda de flujo 2) a una velocidad de 10 pL/min, durante 7 minutos, para activar el chip sensor CM5. El anticuerpo de la presente divulgación se disolvió en tampón de acetato de sodio 10 mM a una concentración de 30 pg/mL, pH 5,0, y se inyectó en un chip activado (tampón de fase móvi1HBS-EP: HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, pH 7,4) a una velocidad de 5 pL/min. Se inyectó etanolamina 1 M a una velocidad de 10 pL/min, durante 7 minutos, para sellar las posiciones de acoplamiento activadas restantes. Se generaron aproximadamente 8000 RU.

2. Prueba de cinética de unión: se usó FC1 (celda de flujo 1) como canal de referencia, se usó FC2 (celda de flujo 2) como canal de muestra, se capturó anticuerpo de control murino o humanizado o el anticuerpo de la presente divulgación en el canal FC2 en 300 RU, seguido de la inyección de diferentes concentraciones de IL-17 (incluyendo hIL-17A, IL-17 Mu, IL-17 Rata). Las condiciones del ciclo fueron: inyectar analitos en todos los canales de FC a razón de 30 pL/min durante 3 min, disociación durante 20 min, inyectar glicina 10 mM, pH 1,5, durante 60 s (a una velocidad de 10 pL/min) para la regeneración de la superficie. La diferencia entre la señal con anticuerpo capturado y la señal sin anticuerpo capturado se calculó mediante el software de evaluación Biacore X100 v 2.0 (Biacore), el tampón de proceso fue Hepes 10 mM, NaCl 650 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,05%.

Resultados experimentales:

1. De acuerdo con el método anterior, se seleccionaron los hibridomas obtenidos en el Ejemplo 1, los resultados son los siguientes:

Tabla 6

Conclusión: La afinidad del anticuerpo murino IL17-mAb 049 seleccionados de hibridomas es equivalente a la del anticuerpo positivo mAb de Lilly y mejor que la del mAb de Novartis.

2. De acuerdo con el método anterior, se probaron los anticuerpos de IL-17 humanizados obtenidos del Ejemplo 2, los resultados son los siguientes:

Tabla 7

Conclusión: La afinidad del anticuerpo humanizado aumentó 10 veces más que la del anticuerpo positivo de Lilly (1,48E-11 M).

Ejemplo de prueba 4: Bioensayo a nivel celular (ensayo GROa)

Propósito:

El siguiente experimento estaba destinado a detectar la actividad biológica celular del anticuerpo anti-IL-17A inhibiendo la secreción estimulada por IL-17 de GROa de células Hs27 con anticuerpo anti-IL-17A.

Materiales y equipos:

Células Hs27: ATCC catálogo No. CRL-1634 (Nota: las células cultivadas durante más de seis semanas no se recomiendan para bioensayo);

Medio de cultivo de células Hs27: DMEM FBS al 10%

DMEM: ATCC catálogo No 30-2002;

FBS: GIBCO catálogo No 10099, lote 8122818;

IL-17A humana recombinante (rhIL-17A): R&D Systems catálogo No. 317-ILB, lote SOA161109B;

IL-17A/F humana recombinante (rhIL-17A/F): R&D Systems catálogo No. 5194-IL/CF, lote RXT101109A;

Kit PharmPak CXCL1/GRO alpha Quantikine humano: R&D Systems catálogo No. PDGR00

Equipo: Lector de microplacas Biotek ELx808.

Cepa de células monoclonales murinas obtenida del Ejemplo 1 de la presente divulgación.

Anticuerpo IL-17 humanizado obtenido a partir del Ejemplo 2 de la presente divulgación.

Protocolo:

1. Cultivo de células Hs27:

Las células Hs27 se cultivaron en 50 mL de medio DMEM FBS al 10% en un matraz T175; las células (densidad de aproximadamente el 90%) se cultivaron por dilución en una proporción de 1:3 cada 3 días; las células se utilizaron para el bioensayo en un mes o se descongelaron nuevamente de nitrógeno líquido; las células nuevamente descongeladas deben cultivarse durante casi una semana antes del bioensayo.

2. Procedimiento experimental del bioensayo (IL-17A)

2.1 Se centrifugaron células Hs27 a 950 rpm durante 4 min (eliminación completa de tripsina-EDTA) y se recogieron. La viabilidad celular se analizó mediante tinción con azul de tripán, solo se utilizaron para el experimento células con> 80% de vitalidad;

2.2 Se añadió medio a una placa de 96 pozos a razón de 50 pL/pozo;

2.3 Se diluyeron células Hs27 con DMEM FBS al 10% y se añadieron a una placa de 96 pozos a una densidad de 10000 células/50 pL/pozo;

2.4 Se añadieron 25 pL de anticuerpo humano IL-17 en cada pozo por duplicado; el anticuerpo se diluyó en una proporción de 1: 3 con la concentración inicial de 10 nM;

2.5 Se añadieron 25 pL de IL-17A humana recombinante en cada pozo con una concentración final de 0,3 nM. La placa de 96 pozos se centrifugó a 500 rpm durante 1 min;

2.6 Las células se incubaron termostáticamente a 37 ° C durante 17 h;

2.7 Se recogió el sobrenadante del cultivo celular, se detectó la concentración de GROa en el sobrenadante mediante el kit CACL1/GRO alfa Quantikine humano (de acuerdo con las instrucciones del fabricante);

3. Procedimientos experimentales de bioensayo (IL-17A/F):

Los procedimientos del bioensayo de IL-17A/F son similares a los del bioensayo de IL-17A, excepto que IL-17A se sustituyó por IL-17A/F.

Resultados experimentales:

1. De acuerdo con los métodos anteriores, se seleccionó el hibridoma obtenido en el Ejemplo 1, los resultados son los siguientes:

Tabla 8:

Conclusión: La actividad biológica del anticuerpo IL17-mAb049 obtenido de hibridoma es equivalente a la del anticuerpo positivo mAb de Lilly, y mejor que la del mAb de Novartis.

2. De acuerdo con los métodos anteriores, se detectaron los anticuerpos humanizados obtenidos del Ejemplo 2, los resultados son los siguientes:

Tabla 9:

Conclusión: Estos resultados indican que todos los anticuerpos humanizados exhiben actividad biológica celular. Hu049-17, 18, 19 y 20 tienen IC⁵⁰(0,04 nM-0,066 nM) similar a la del anticuerpo positivo (0,04 nM). Además, estos anticuerpos muestran una reacción cruzada con IL-17A de cynomolgus (IC⁵⁰es 0,03 nM-0,039 nM). La actividad de IL-17A/F humana es aproximadamente 10 veces más débil que la de IL-17A.

Ejemplo de prueba 5: Prueba de neutralización de IL-17 humana in vivo

Propósito:

El objetivo de la prueba de neutralización in vivo es verificar que los anticuerpos de la divulgación pueden bloquear in vivo la unión de IL-17 al receptor de IL-17 (por ejemplo, hIL-17RA), inhibiendo así la expresión de CXCR1 inducida por IL -17.

Materiales y equipos:

Proteína: se clonó IL-17A humana (hIL-17A) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando las secuencias de la proteína IL-17A humana con el número de acceso del GenBank NP-002181, y se transfectó transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

Como control positivo, se clonó el anticuerpo anti-IL-17 humanizado de Lilly (mAb (hu) de Lilly) de acuerdo con las secuencias humanizadas divulgadas en el documento US 7.838.638B2 (LY 2439821) y se transfectó transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

IgG humana (HuIgG): (Millipore catálogo No. AG711).

Animales: ratones macho C57/B6 de 7 semanas de edad (adquiridos de SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, certificado No: SCXK (Shanghai) 2008-0016), 6 ratones por cada grupo.

Reactivos: solución de dilución de Ab: tampón de citrato (pH 5,0): citrato de sodio 10 mM, NaCl 50 mM.

Solución de dilución de hIL-17A: PBS (tampón de fosfato de sodio, pH 7,2).

Kit de ELISA CXCL1/KC Quantikine de ratón, placas de 6 pozos, R&D SYSTEM, No. SMKC00B.

Protocolo:

1) Los ratones se dividieron en 15 grupos, 6 por cada grupo.

2) Se administraron intraperitonealmente (IP) 100 pL de Hu049-18 o anticuerpo de control (HuIgG o mAb (hu) de Lilly) o una solución diluida a cada ratón, las dosis de administración de fármaco fueron 3000 pg/kg, 300 pg/kg, 30 pg/kg y 3 pg/kg, respectivamente.

3) 20 horas después, se inyectó subcutáneamente (SC) hIL-17A a razón de 150 pg/kg, se inyectó a cada ratón 100 pL.

4) 2 horas después, se recolectaron muestras de sangre, se colocaron a temperatura ambiente durante 2 horas, hasta coagulación, o 2-8 ° C durante la noche, hasta coagulación, y luego se centrifugaron a 2000x g durante 20 min. Se descartó el sobrenadante, se realizó la detección inmediatamente o se almacenaron alícuotas de la muestra a -20 °C. Evitar congelar y descongelar repetidamente.

5) Las muestras obtenidas en la etapa 4 se midieron con el kit ELISA CXCL1/KC Quantikine de ratón.

Resultados experimentales:

De acuerdo con el método anterior, se probó el anticuerpo humanizado Hu049-18 obtenido del Ejemplo 2, los resultados son los siguientes:

Tabla 10:

Conclusión: en comparación con el anticuerpo de control ineficaz, el anticuerpo Hu-049-18 de la presente invención reduce el nivel medio de KC a aproximadamente 1/6 a una dosis de 3000 pg/ratón en las condiciones descritas. En comparación con el anticuerpo de control, el anticuerpo Hu-049-18 de la presente invención exhibe una capacidad equivalente para inhibir KC a una dosis de 3000 pg/ratón en las condiciones descritas.

Ejemplo de prueba 6: Determinación de la vida media (T1/2) de los anticuerpos in vivo

Propósito:

Determinar los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo Hu049-18 de la presente invención en ratas o monos cynomolgus in vivo.

Materiales y reactivos:

Proteína: se clonó IL-17A humana (hIL-17A) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, utilizando las secuencias de la proteína IL-17A humana con el número de acceso de GenBank NP-002181, y se transfectó transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

Como control positivo, el anticuerpo anti-IL-17 humanizado de Lilly (mAb (hu) de Lilly) se clonó de acuerdo con las secuencias humanizadas descritas en el documento US 7.838.638B2 (LY 2439821), y se transfectó transitoriamente en células HEK293E para su expresión.

IgG humana (HuIgG): IgG humana, policlonal, Millipore catálogo número AG711

Animales: ratas macho SD de 230-250 g (adquiridas a través del Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., número de certificado: SCXK (Shanghai) 2007-0005), se dividieron en dos grupos de inyección: intravenosa (IV) (dorso de la pata) y subcutánea (SC), 5 ratas cada grupo.

Macaco: monos cynomolgus de 2-3 kg (Hainan Jingang Biotechnology Co., Ltd. Certificado No: SCXK (HN) 2010 0001, 0000152)

Reactivos: solución de dilución de anticuerpos: tampón de citrato (pH 5,0): citrato de sodio 10 mM, NaCl 50 mM Solución de dilución de hIL-17A: PBS (tampón de fosfato de sodio, pH 7,2)

Anticuerpo de cabra anti-IgG humana (específico de Fab) conjugado con peroxidasa, Sigma Cat. No.121M4811

Protocolo:

1. Procedimientos de detección en rata:

(1) Administración in vivo

Las ratas SD se dividieron aleatoriamente en dos grupos (grupo de inyección intravenosa (IV) (dorso de la pata) y grupo de inyección subcutánea (SC)), 5 ratas en cada grupo;

En condiciones estériles, se disolvió Hu049-18 en solución tampón de citrato (pH 5,0) hasta una concentración final de 2,5 mg/mL;

A cada rata se le administró en forma IV o SC una dosis de 5 mg/kg;

Para el grupo IV, se tomó una muestra de sangre a través de la vena de la cola a los 0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 2 d, 4 d, 7 d, 10 d, 14 d, 21 d, 28 d después de la administración, 200 pL (equivalente a 80 pL de suero) cada vez; para el grupo SC, se tomó una muestra de sangre a través de la vena de la cola a los 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 2 d, 4 d, 7 d, 10 d, 14 d, 21 d, 28 d después de la administración, 200 pL (equivalente a 80 pL de suero) cada vez;

Se recolectaron muestras de sangre y se colocaron durante media hora a temperatura ambiente hasta la coagulación, y luego se centrifugaron a 4 °C, a 10000 xg durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió para la prueba inmediata o se almacenaron alícuotas de la muestra a -80 °C. Evitar congelar y descongelar repetidamente.

(2) Las muestras de suero obtenidas en la etapa (1) se detectaron mediante ELISA

1) Curva estándar

a) La placa de microtitulación se recubrió directamente con 1 pg/mL de estreptavidina, a 4 °C durante la noche; b) La placa de microtitulación se bloqueó con 300 pL de PBST que contenía BSA al 2% (v/v), se incubó termostáticamente a 37 °C durante 1 hora, mientras que el pozo sin recubrimiento se bloqueó como control;

c) Lavado con PBST tres veces, todas las etapas de lavado se realizaron en lavadora automática Biotek (Elx 405); d) Se añadieron 100 pL de PBS que contenía hIL-17A (0,2 pg/mL) a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 1 h;

e) Lavado con PBST 3 veces;

f) Titulación de Hu049-18: diluido en una proporción de 1: 2 con dilución de anticuerpo, la concentración inicial fue de 0,8 pg/mL. Se añadieron 100 pL de Hu049-18 diluido en cada pozo, se graficó la curva estándar. La placa de 96 pozos se incubó termostáticamente a 37 °C durante 1 hora;

g) Lavado con PBST 3 veces;

h) Se añadieron 100 pL de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (específico de Fab) conjugado con peroxidasa (Sigma Cat. No. 121M4811) (1: 5000) a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37°C durante 1 h;

i) Lavado con PBST 3 veces. Se añadieron 100 pL de sustrato TMB a cada pozo, se incubó termostáticamente a 37 °C durante 5 min. Luego se detuvo la reacción con la adición de 100 pL de HCl 1 M en cada pozo;

j) Se leyó el valor de DO a una longitud de onda de 450 nm/630 nm en un lector de microplacas ELISA (Molecular Devices, Spectra Max).

2) Prueba de la muestra:

e) Lavado con PBST 3 veces;

f) Titulación de las muestras de suero: antes del experimento, se diluyó una muestra de suero de rata en diferentes proporciones para obtener una relación de dilución óptima en la que la concentración de anticuerpos en el suero estaba justo en el medio de la curva estándar. Las muestras de suero se diluyeron de acuerdo con la relación de dilución óptima, mientras que Hu049-18 se diluyó a 25 ng/mL. Se añadieron 100 pL de muestra de suero diluido y Hu049-18 en cada pozo y se incubaron termostáticamente a 37 °C durante 1 hora. Cada concentración se tituló en cada pozo por duplicado;

g) Lavado con PBST 3 veces;

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de unión a IL-17A o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende:

una región variable de cadena ligera de anticuerpo, que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 respectivamente; y

una región variable de cadena pesada de anticuerpo, que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente;

en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo se selecciona de las regiones variables de cadena pesada mostradas en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7;

y en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo se selecciona de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 9.

2. El anticuerpo de unión a IL-17A o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende una región constante de cadena ligera derivada de la cadena k humana o una región constante de cadena ligera derivada de la cadena A humana.

3. El anticuerpo de unión a IL-17A o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además la región constante de cadena pesada derivada de IgG1 humana, la región constante de cadena pesada derivada de IgG2 humana, la región constante de cadena pesada derivada de IgG3 humana, o región constante de cadena pesada derivada de IgG4 humana.

4. Un vector que expresa el anticuerpo de unión a IL-17A o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende un nucleótido que codifica el anticuerpo de unión a IL-17A o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. Una composición farmacéutica, que comprende: el anticuerpo de unión a IL-17A o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; y un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

7. El anticuerpo de unión a IL-17A o su fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, para uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes mediadas por IL-17;

en el que la enfermedad se selecciona de psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple o artritis inflamatoria.