BR112016009948B1 - Agente de ligação à il-17a, seus usos, vetor, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

AGENTE DE LIGAÇÃO DE IL-17A, SEUS USOS, VETOR, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se a um anticorpo capaz de reconhecer especificamente a IL-17A e ser combinado com a IL-17A. O anticorpo pode ser utilizado para o tratamento de inflamações e doen-ças autoimunes provocadas por uma elevada expressão de interleucina-17A, tais como psoríase, artrite psoriática, espondilite anquilosante, esclerose múltipla, artrite inflamatória.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um agente de ligação IL- 17A e o seu uso como um agente terapêutico, em particular como um agente terapêutico para uma variedade de doenças inflamatórias ou autoimunes.

ANTECEDENTES

[002] As citocinas da família da interleucina-17 são denominadas como IL-17A a IL-17F, respectivamente. Ao mesmo tempo, a família dos seus receptores, receptor A da IL-17 ao receptor E da IL-17, também é descoberta: estas citocinas IL-17 se ligam ao receptor correspondente, desse modo mediando diferentes respostas inflamatórias.

[003] O membro mais comum da família é IL-17A. Os linfócitos que migram para os locais de infecção ou lesão podem secretar IL- 17A. Por um lado, a IL-17A induz a expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias, recrutando assim mais células imunes para o local da inflamação e exacerbando a resposta inflamatória; por outro lado, a IL-17A induz a expressão de alguns fatores relevantes para a reparação de tecidos, acelera assim a recuperação do organismo. Embora a interleucina-17A tenha o efeito de amplificar a resposta de defesa imune e proteger os organismos durante o processo de anti- infecção e a reparação de tecidos em hospedeiros, em muitos pacientes sofrendo de doenças autoimunes e cânceres, a interleucina- 17A é altamente expressada, a expressão excessiva da interleucina- 17A desempenha um papel de deterioração no desenvolvimento patológico, uma vez que pode induzir a expressão de vários fatores inflamatórios. Muitas experiências com animais revelaram que a gravidade patológica de várias doenças autoimunes pode ser eficazmente suprimida por deficiência de interleucina-17A ou neutralização de anticorpo de IL-17A. Há evidências de que o sinal da IL-17 mostrou certo efeito como um alvo para o tratamento de doenças autoimunes, incluindo artrite reumatoide (RA), psoríase, doença de Crohn, esclerose múltipla (EM), doença psoríase, asma e lúpus (ver, por exemplo, Aggarwal et al., J.Leukoc.Biol, 71 (1): 1-8 (2002); Lübbert et al.).

[004] A IL-17 humana é um gene que codifica um polipeptídeo contendo até 155 aminoácidos. O polipeptídeo compreende uma sequência de sinal de 19 aminoácidos e uma área madura de 132- aminoácidos. Com peso molecular relativo de 17,000Da, a IL-17A humana é uma glicoproteína existente na forma de homodímero ou de heterodímero (Spriggs et al., J.Clin.Immunol, 17: 366-369 (1997)). IL- 17F, um homólogo, pode combinar-se com IL-17A para formar um heterodímero de IL-17A/F. A sequência de aminoácidos de IL-17F (IL- 24, ML-1) tem até 55% de semelhança com o da IL-17A, ambas têm o mesmo receptor, IL-17R. O IL-17R é ubiquamente expresso em uma variedade de células, incluindo as células endoteliais vasculares, células T periféricas, células B, fibroblastos, células mielomonocíticas e estroma da medula óssea (Kolls et al., Immunity, 21: 467-476 (2004); Kawaguchi et al., J.Allergy Clin.Immunol, 114 (6): 1267-1273 (2004); Moseley et al., Cytokine Growth factor de Rev, 14 (2): 155-174 (2003)).

[005] Desde a descoberta de interleucina-17A, até agora, uma variedade de anticorpos anti-IL-17A foram encontrados, tais como CN101001645A, CN101326195A, CN101646690A, mas há ainda a necessidade para o desenvolvimento de diversos tipos de anticorpos melhorados para reduzir de forma eficaz ou eliminar a atividade da IL - 17 na resposta inflamatória e doenças autoimunes.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção fornece um anticorpo anti-IL-17A com uma afinidade mais elevada e uma meia-vida mais longa.

[007] A presente invenção proporciona um agente de ligação IL- 17A, que compreende: região variável de cadeia leve do anticorpo, que compreende regiões LCDR 0-3 selecionadas a partir das mostradas na SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15; e região variável de cadeia pesada do anticorpo, que compreende regiões HCDR 0-3 selecionadas a partir das mostradas na SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; em que o número de regiões CDR de regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada não são simultaneamente 0.

[008] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende a SEQ ID NO: 13.

[009] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende a SEQ ID NO: 14.

[0010] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende a SEQ ID NO: 15.

[0011] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende a SEQ ID NO: 10.

[0012] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende a SEQ ID NO: 11.

[0013] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende a SEQ ID NO: 12.

[0014] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende uma região LCDR selecionada a partir de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15.

[0015] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A, compreende uma região HCDR selecionada a partir de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

[0016] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende duas regiões LCDR selecionadas a partir de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15.

[0017] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende duas regiões HCDR selecionadas a partir de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

[0018] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende três regiões LCDR, em que a sequência de aminoácidos de LCDR1 é mostrada em SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácidos de LCDR2 é mostrada em SEQ ID NO: 14, a sequência de aminoácidos de LCDR3 é mostrada em SEQ ID NO: 15.

[0019] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A compreende três regiões HCDR, em que a sequência de aminoácidos da HCDR1 é mostrada em SEQ ID NO: 10, a sequência de aminoácidos de HCDR2 é mostrada em SEQ ID NO: 11, a sequência de aminoácidos de HCDR3 é mostrada em SEQ ID NO: 12.

[0020] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A, em que a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende ainda região FR da cadeia leve derivada da cadeia K ou À de murino ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de anticorpo é a SEQ ID NO: 2. Além disso, o agente de ligação IL-17A compreende a região constante de cadeia leve derivada da cadeia K ou À de murino ou uma variante da mesma.

[0021] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A, em que a cadeia pesada da região variável do anticorpo compreende adicionalmente a região FR da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 de murino ou uma sua variante. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo é a SEQ ID NO: 1. Por outro lado, o agente de ligação IL-17A compreende a região constante da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 de murino, ou uma sua variante.

[0022] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A, em que a região variável de cadeia leve do anticorpo do mesmo compreende ainda região FR da cadeia leve derivada da cadeia k ou À de murino ou uma variante da mesma; em algumas modalidades, a região FR da cadeia leve da região variável de cadeia leve do anticorpo é a região FR A10 da cadeia leve da linhagem germinativa humana cujo aminoácido está ilustrado na SEQ ID NO: 4, ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a variante da região FR da região variável de cadeia leve do anticorpo se refere a região FR A10 humana de cadeia leve de linhagem germinativa com 0-10 mutações de aminoácidos. Em algumas modalidades, a mutação de aminoácidos em uma variante da região FR da região variável de cadeia leve é uma ou mais selecionada dentre o grupo que consiste em F71Y, K49Y, Y36F e L47W. Em algumas modalidades, a cadeia leve de anticorpo é selecionada a partir de SEQ ID NO: 9 e uma variante da mesma. Além disso, o agente de ligação IL-17A compreende a região constante de cadeia leve derivada da cadeia k ou À de murino ou uma variante da mesma.

[0023] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o agente de ligação IL-17A, em que a região variável de cadeia pesada do anticorpo do mesmo compreende ainda a região FR de cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou uma sua variante; em algumas modalidades, a região FR de cadeia pesada da região variável de cadeia pesada de anticorpo é a região FR da cadeia pesada VH1-18 da linhagem germinativa humana, cuja sequência de aminoácidos está ilustrada na SEQ ID NO: 3, ou uma sua variante; em algumas modalidades, uma variante da região FR da região variável de cadeia pesada do anticorpo se refere a cadeia pesada VH1-18 da linhagem germinativa humana com 0-10 mutações de aminoácidos; em algumas modalidades, a mutação de aminoácidos nas variantes da região FR da região variável de cadeia pesada é uma ou mais selecionada dentre o grupo que consiste em: A93T, T71A, M48I, V67A, M69L, T73D e S76N; em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo é selecionada a partir de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. Além disso, o agente de ligação IL-17A compreende a região constante da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana, ou uma variante da mesma.

[0024] Além disso, de acordo com algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um vetor que expressa a IL-17A mencionada acima. As células hospedeiras expressam e secretam o agente de ligação IL-17A depois de ter sido transfectadas com o vetor.

[0025] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o vetor compreende nucleotídeos que codifica o agente de ligação IL-17A da presente invenção.

[0026] Além disso, de acordo com algumas modalidades da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica, que compreende o agente de ligação IL-17A, tal como descrito acima e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0027] Além disso, de acordo com algumas modalidades, a presente invenção também proporciona a utilização do agente de ligação IL-17A acima, ou uma composição farmacêutica contendo o mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças ou desordens mediadas por IL-17. As doenças são doenças inflamatórias ou autoimunes; as doenças são selecionadas dentre psoríase, artrite psoriática, espondilite anquilosante, esclerose múltipla, artrite inflamatória; a doença inflamatória é, de preferência a artrite inflamatória. A artrite inflamatória é selecionada a partir de osteoartrite, artrite reumatoide, artrite reumática ou osteoporose, de preferência a artrite reumática.

[0028] De acordo com algumas modalidades, a presente invenção também proporciona a utilização do anticorpo de IL-17A acima, ou uma composição farmacêutica contendo o mesmo, na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças ou distúrbios mediados por IL-17. As doenças são doenças inflamatórias ou autoimunes. A doença inflamatória é, de preferência a artrite inflamatória. A artrite inflamatória é selecionada dentre osteoartrite, artrite reumatoide ou osteoporose.

[0029] De acordo com algumas modalidades, a presente invenção também fornece um método para tratar uma doença ou distúrbio mediado por IL-17, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de agente de ligação IL-17A, tal como descrito acima ou anticorpo de IL-17A humanizado ou composição farmacêutica contendo o mesmo.

[0030] Para que a invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificamente definido em outro local neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o significado normalmente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence.

I. TERMOS

[0031] Tal como é usado aqui, o código de letra única e o código de três letras para os aminoácidos são tal como descrito em J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558.

[0032] Tal como é usado aqui, “agente de ligação” se refere ao receptor ou fragmentos ou análogos solúveis dos mesmos, ou anticorpos ou seus fragmentos ou seus análogos capazes de se ligarem ao alvo. “Agente de ligação IL-17A” de acordo com a presente invenção, se refere a um anticorpo ou seu fragmento ou análogo, capaz de reconhecer especificamente a IL-17A e a ligação da IL-17A.

[0033] O termo “IL-17A” se refere geralmente a IL-17A humana recombinante ou natural e homólogos não humanos de IL-17A humana. A menos que indicado de outra forma, é adotado o peso molecular do homodímero da IL-17A (por exemplo, 30 kDa para IL-17A humana) para o cálculo da concentração molar de IL-17A.

[0034] Tal como aqui utilizado, “anticorpo” se refere a imunoglobulina, uma estrutura de cadeia de quatro peptídeos que consiste em duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas ligadas por meio de ligação dissulfeto. As regiões constantes de cadeias pesadas da imunoglobulina exibem diferentes componentes e ordens de aminoácidos, por conseguinte, apresentam antigenicidade diferente. Por conseguinte, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco categorias, ou chamados de isotipos de imunoglobulinas, ou seja, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. De acordo com os componentes de aminoácidos da região de dobradiça e o número e localização das ligações dissulfeto da cadeia pesada, a Ig na mesma categoria pode ainda ser dividida em diferentes subtipos, por exemplo, IgG pode ser dividida em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A cadeia leve pode ser dividida em cadeia K ou À por diferentes regiões constantes.

[0035] A região de cerca de 110 sequências de aminoácidos perto do N-terminal das cadeias pesadas e leves do anticorpo, modificações em grande parte, conhecida como a região variável (região V); a região do resto da sequência de aminoácidos perto da extremidade C- terminal é relativamente estável, conhecida como a região constante (região C). A região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões FR relativamente conservadas (FR). Três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecida como região determinante de complementaridade da cadeia leve (CDR). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) e cada região variável de cadeia pesada (HCVR) é composta de três regiões CDR e quatro regiões FR, ordem sequencial a partir do terminal amino para o terminal carbóxi é a seguinte: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Três regiões de CDR da cadeia leve, ou seja, regiões hipervariáveis da cadeia leve (LCDR), referem-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; três regiões de CDR de cadeia pesada, ou seja, regiões hipervariáveis de cadeia pesada (LCDR), referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a localização dos resíduos de aminoácidos da região de CDR em regiões LCVR e HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui obedecem a critérios conhecidos de numeração de Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3), ou cumprem com os critérios de numeração de Kabat e Chothia (HCDR1).

[0036] Tal como aqui utilizado, “fragmento de ligação ao antígeno” se refere a um fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2 ou fragmento Fv único tendo atividade de ligação ao antígeno. O anticorpo Fv é um fragmento de anticorpo mínimo que compreende uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve e todos os sítios de ligação ao antígeno, sem região constante. Geralmente, o anticorpo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, e é capaz de formar uma estrutura necessária para a ligação ao antígeno.

[0037] Tal como é usado aqui, o termo “antígeno determinante” da presente invenção, se refere aos locais tridimensionais, que são discretos no antígeno, e reconhecidos pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção.

[0038] “Administração” e “tratamento”, tal como se aplicam aos animais, humanos, indivíduos experimentais, células, tecidos, órgãos ou fluidos biológicos, referem-se a colocar em contato animais, humanos, indivíduos, células, tecidos, órgãos ou fluido biológico com medicamentos exógenos, agentes terapêuticos, agentes de diagnóstico ou composições. “Administração” e “tratamento” podem se referir, por exemplo, a método terapêutico, farmacocinético, de diagnóstico, pesquisa e experimentais. O tratamento de células abrange colocar as células em contato com um agente, bem como o fluido com um agente, em que o fluido está em contato com as células. “Administração” e “tratamento” também significam tratamento in vitro e ex vivo de, por exemplo, células, por um agente, uma composição de diagnóstico ou de ligação, ou por outras células. “Tratamento”, como aplicado a indivíduos humanos, veterinários, ou de investigação, se refere a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, para a pesquisa e aplicações de diagnóstico. “Tratamento” tal como se aplica a indivíduos humanos, veterinários ou de pesquisa, ou células, tecidos ou órgãos, engloba colocar seres humanos ou animais, células, tecidos, compartimentos fisiológicos, ou fluido fisiológico, em contato com um agonista de IL-17A ou antagonista de IL-17A. “Tratamento de células” também engloba situações em que o agonista de IL-17A ou antagonista de IL-17A é colocado em contato com o receptor de IL-17A, por exemplo, na fase fluida ou fase coloidal, e engloba também situações onde o agonista ou antagonista não é colocado em contato com as células ou os receptores.

[0039] “Tratar” significa administrar um agente terapêutico, tal como uma composição que contenha qualquer um dos compostos de ligação da presente invenção, internamente ou externamente a um paciente apresentando um ou mais sintomas da doença para os quais o agente tenha atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintomas da doença no paciente ou na população a ser tratada, quer por indução da regressão ou inibição da progressão de tais sintoma(s) por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma da doença em particular (também referida como a “quantidade terapeuticamente eficaz”) pode variar de acordo com vários fatores, tais como o estado da doença, idade e peso do paciente, e a capacidade do fármaco para eliciar uma resposta desejada no paciente.

[0040] Quatro variantes de proteína IL-17A humana são mencionadas aqui: 1) Como é usado aqui, os termos “IL-17A humana (huIL-17A)” e “IL- 17A humana natural” referem-se às formas maduras (isto é, os resíduos 24-155) da proteína IL-17A humana com os números de acesso NP_002181 e AAT22064, e variantes de ocorrência natural e polimorfismos dos mesmos. 2) Como é usado aqui, o termo “rhIL-17A” se refere a uma IL-17A recombinante humana, esta nomenclatura é adotada por conveniência ao referir-se a várias formas de IL-17A, e pode não coincidir com o uso na literatura. 3) Como é usado aqui, o termo “His-huIL-17A” se refere a uma IL-17A recombinante humana com um marcador N-terminal His anexado, “FLAG-huIL-17A” se refere a uma IL-17A recombinante humana com um marcador FLAG N-terminal anexado. Em alguns experimentos, o FLAG-huIL-17A é biotinilado. 4) IL-17A humana de R&D Systems mencionada aqui é uma IL-17A recombinante humana adquirida de R&D Systems.

[0041] Tal como é usado aqui, o termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo secretado por um clone derivado de uma única célula. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e são dirigidos contra um único epítopo. A célula não é limitada a linhagens celulares clonais procarióticas, eucarióticas ou de fago.

[0042] O anticorpo monoclonal inclui aqui especificamente anticorpos “quiméricos”, nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a um tipo ou subtipo particular de anticorpo, enquanto o restante da cadeia(s) é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outro tipo ou subtipo de anticorpo, bem como fragmento desse anticorpo, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[0043] Tal como é usado aqui, o termo “anticorpo humanizado” é uma forma modificada da região variável do anticorpo murino de acordo com a presente invenção, tendo as regiões de CDR derivadas (ou substancialmente derivadas) de um anticorpo não-humano (de preferência um anticorpo monoclonal de camundongo), e as regiões FR e regiões constantes substancialmente derivadas de um anticorpo humano; isto é, as sequências das regiões de CDR de anticorpos de murino são enxertadas em diferentes tipos de sequências de estrutura de anticorpos da linhagem germinativa humana. Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA da linhagem germinativa de genes da região variável pesada humana e os genes da região variável de cadeia leve podem ser encontradas na base de dados de sequência da linhagem germinativa humana “Vbase” (disponível na Internet www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como encontradas em Kabat, EA, etc. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Uma vez que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível construir um vetor de expressão para expressar o anticorpo recombinante, que pode imitar característica específica de um anticorpo que ocorre naturalmente.

[0044] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o seguinte evento ou situação pode, mas não necessariamente, ocorrer, e a descrição inclui os casos em que o evento ou a situação ocorre ou não. Por exemplo, “opcionalmente contém as regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo 1-3” significa que a região variável de cadeia pesada do anticorpo com sequências específicas pode estar, mas não necessariamente, presente, se presente, pode haver 1, 2 ou 3.

[0045] A transformação da célula hospedeira com o DNA recombinante pode ser realizada por técnicas convencionais bem conhecidas dos versados na técnica. Os transformantes obtidos foram cultivados usando métodos convencionais para expressar o polipeptídeo codificado pelo gene da presente invenção. O meio de cultura pode ser selecionado a partir de vários meios de cultura convencionais com base nas células hospedeiras utilizadas. As células hospedeiras crescem sob condições adequadas.

II. Anticorpos específicos para a IL-17A humana

[0046] A presente invenção fornece anticorpos anti-IL-17A modificados e seus usos para o tratamento de várias doenças inflamatórias, imunes e proliferativas, incluindo a artrite reumatoide (RA), osteoartrite, artrite reumatoide osteoporose, fibrose inflamatória (por exemplo, escleroderma, fibrose pulmonar e cirrose), doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerosa e doença inflamatória do intestino), asma (incluindo asma alérgica), alergias, COPD, esclerose múltipla, psoríase e câncer.

[0047] Qualquer método adequado para a geração de anticorpos monoclonais pode ser utilizado para gerar os anticorpos anti-IL-17A da presente invenção. Por exemplo, um receptor animal pode ser imunizado com um homodímero IL-17A ligado ou, por exemplo, de ocorrência natural, ou um fragmento do mesmo. Qualquer método adequado para a imunização pode ser utilizado. Tais métodos podem incluir adjuvantes, outros imunoestimulantes, imunizações de reforço repetidas, e o uso de uma ou mais rotas de imunização.

[0048] Qualquer forma adequada de IL-17A pode ser utilizada como o imunógeno (antígeno) para a geração do anticorpo específico não-humano para IL-17A, o anticorpo pode ser rastreado para a sua atividade biológica. O tal imunógeno pode ser IL-17A humana madura de comprimento completo, incluindo homodímeros de ocorrência natural ligados, ou seus peptídeos abrangendo epítopo único ou epítopos múltiplos. O imunógeno pode ser usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes de aumento da imunogenicidade conhecidos na técnica. O imunógeno pode ser purificado a partir de uma fonte natural ou produzido em células geneticamente modificadas. O DNA que codifica o imunógeno pode ser derivado de DNAs gnômicos ou não gnômicos (por exemplo, cDNA). Os vetores genéticos adequados podem ser utilizados para expressar os DNAs que codificam o imunógeno, referidos vetores incluem, mas não limitados a vetores adenovirais, vetores virais adeno-associados, vetores de baculovírus, plasmídeos e vetores não virais.

[0049] Um método exemplificativo da produção de anticorpos IL- 17A anti-humano da presente invenção é descrito no Exemplo 1.

III. Humanização de anticorpos específicos da IL-17A

[0050] O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer tipo de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG. Qualquer isótipo de IgG pode ser utilizado, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As variantes dos isótipos da IgG são também contempladas. O anticorpo humanizado pode compreender sequências derivadas de mais do que um tipo ou isótipo. A optimização das sequências do domínio constante necessária para gerar a atividade biológica desejada é facilmente conseguida por rastreamento dos anticorpos nos ensaios biológicos descritos adiante nos Exemplos.

[0051] Do mesmo modo, qualquer tipo de cadeia leve pode ser usada nos compostos e métodos da presente invenção. Especificamente, kappa (K), lambda (À), ou uma variante das mesmas é útil nos presentes compostos e métodos.

[0052] Um método exemplificativo da humanização de anticorpos IL-17A anti-humanos da presente invenção é descrito no Exemplo 2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0053] Daqui em diante, a presente invenção é descrita ainda com referência aos exemplos; no entanto, o escopo da presente invenção não está limitado a eles.

[0054] Nos exemplos da presente invenção, onde as condições específicas não são descritas, os experimentos são geralmente realizados em condições convencionais, ou sob as condições propostas pelo material ou fabricantes do produto. Ver Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. Sempre que a fonte dos reagentes não for especificamente dada, os reagentes são reagentes convencionais comercialmente disponíveis.

Exemplo 1 Anticorpo monoclonal de IL-17A anti-humana de camundongo

[0055] Os anticorpos monoclonais contra a IL-17A humana foram obtidos como se segue: camundongos BALB/c fêmeas de 6-8 semanas de idade (Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp, Ltd, certificado da produção de animais de laboratório No: SCXK (HU) 2008-0016) e camundongos SJL fêmeas de 6-8 semanas de idade (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co. Ltd, certificado da produção de animais de laboratório No: SCXK (Pequim) 2012-0001) foram divididos em dois grupos, grupo de dose elevada e grupo de dose baixa. 10 camundongos BALB/c e 10 camundongos SJL foram para cada grupo.

[0056] O grupo de dose alta e baixa foram serialmente imunizados com variante de hIL-17A naturais (His-hIL-17A, a sequência de aminoácidos de hIL-17A se refere a proteína de IL-17A humana, número de acesso Genbank NP-002181, a proteína resultante foi purificada por coluna de afinidade de Ni (Superdex) 75SEC sequencialmente), que foi, adicionalmente, marcada com His no N- terminal e gerada pelo sistema de expressão HEK293E (293-EBNA, Invitrogen, Lote Num: 493985). As inoculações foram realizadas no dia 0, 14, 35, e 56.

[0057] No dia 0, o grupo de dose elevada foi administrado com His-huIL-17A, 500 μg/camundongo, via injeção subcutânea (s.c.), e administrado com adjuvante completo de Freund (CFA) por injeção intraperitoneal (i.p.) ao mesmo tempo. No dia 14 e 35, 25 μg/camundongo His-hIL-17A foi administrado via injeções s.c., ao mesmo tempo, adjuvante incompleto de Freund (IFA) foi administrado através de injeção i.p. No dia 56, antes da fusão dos esplenócitos, uma imunização de reforço foi realizada por injeção i.p. com 25 μg/ camundongo His-hIL-17A dissolvidos em solução salina. O calendário de tempo e o método para a imunização de grupo de dose baixa são os mesmos como aqueles para o grupo de dose alta, exceto que a dose administrada de His-hIL-17A no dia 0 foi de 10 μg/camundongo, a dose administrada de His-hIL-17A no dia 14, 35, e 56 foi de 5 μg/ camundongo.

[0058] Os testes de sangue foram realizados no dia 22 e dia 43. O soro dos camundongos foi testado por ensaio ELISA descrito no Exemplo 1, para determinar os títulos de anticorpos no soro. No dia 56, foram selecionados camundongos com títulos mais altos de anticorpos no soro para a fusão de esplenócitos. O hibridoma foi obtido por fusão de linfócitos do baço com células de mieloma Sp2/0 células (ATCC® CRL-8287TM) utilizando procedimento de fusão mediada por PEG optimizado.

[0059] Os procedimentos de imunização foram os seguintes: Esquema 1, dose elevada, 10 camundongos Balb/c e 10 camundongos SJL, os procedimentos foram os seguintes: Esquema 2, dose baixa, os procedimentos foram como se segue:

[0060] O rastreamento primário dos hibridomas resultantes foi realizada pelo teste ELISA indireto antígeno-anticorpo no Exemplo de Teste 1. As cepas celulares monoclonais foram obtidas através de diluição limitante de cepas de células positivas.

[0061] As linhagens celulares monoclonais obtidas foram ainda pesquisadas, incluindo: 1. Teste de bloqueio do receptor, ver Exemplo de Teste 2, os resultados são apresentados na Tabela 5, linhagem celular monoclonal IL17-mAb049 com uma atividade superior para o controle positivo foi rastreada e obtida; 2. Teste de Afinidade: ver Exemplo de Teste 3, os resultados foram apresentados na Tabela 6, que revelou que a linhagem celular monoclonal IL17-mAb049 rastreada e obtida na presente invenção mostrou uma atividade comparável ou melhor, quando comparado com o controle positivo; 3. Bioensaio no nível celular (análise GROα): ver Exemplo de Teste 4, os resultados são apresentados na Tabela 8, que revelou que a linhagem celular monoclonal IL17-mAb049 rastreada e obtida na presente invenção mostrou uma atividade comparável ou melhor quando comparado com o controle positivo.

[0062] Doze dos monoclones foram estudados mais após o primeiro e segundo rastreamento. O monoclone líder (mAb líder) de IL17-mAb049 foi selecionado pelo agrupamento de epítopo, teste de atividade biológica. As sequências específicas de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (LH) do anticorpo de camundongo murino da IL-17A mAb049 (IL-17mAb) foram como se segue: IL-17 mAb049 VH SEQ ID NO: 1 HVQLQQSGADLVRPGASVTLSCKASGYIFTDYEVHWVKQTPVHGLEWIGVIDPGTGGV AYNQKFEGKATLTADDSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGT SVTVSS IL-17mAb049 VL SEQ ID NO: 2 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPGTSPKLWIYRTSNLASGVPVR FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPWTFGGGTNLEIK

Exemplo 2 Humanização de anticorpos IL-17A humano anti-murino

[0063] A humanização do anticorpo mAb049 monoclonal IL-17A humano anti-murino foi realizada essencialmente como descrito em muitas literaturas conhecidas ao público na técnica. Resumidamente, os domínios constantes de origem humana foram usados para substituir os domínios constantes parentais (anticorpo murino). As sequências da linhagem germinativa humana usadas para a humanização foram selecionadas de acordo com a homologia entre o anticorpo de murino e o anticorpo humano.

1. Regiões CDR do anticorpo anti-IL-17A de murino

[0064] Os resíduos de aminoácidos de CDR VH/VL foram identificados e anotados pelo sistema de numeração de Kabat. As sequências de CDR de mAb049 murino na presente invenção foram listadas na tabela seguinte: Tabela 1: sequências de CDR de anticorpos anti-IL-17A de camundongo

2. Seleção de sequências FR da linhagem germinativa humana

[0065] Com base nas estruturas típicas das CDRs VH/VL do anticorpo murino obtidas, as sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram comparadas com a base de dados de anticorpos. A cadeia pesada VH1-18 (SEQ ID NO: 3) e a cadeia leve A10 (SEQ ID NO: 4) da linhagem germinativa humana com homologia alta foram obtidas e utilizadas como sequências FR humanizadas. As sequências específicas são como se segue: VH1-18 SEQ ID NO: 3 QVQLVQSGAEX7KKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISW\rRQAPGQGLEWMGWISAYNGN TNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR A10 SEQ ID NO: 4 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSR FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP

3. Design de anticorpos humanizados:

[0066] Os resíduos de aminoácidos que formam a conformação do anel e a interface VH foram determinados. Levando em consideração os seguintes fatores, a mutação Q1E era eliminar a formação de ácido piroglutâmico N-terminal. As mutações também incluem aquelas que mantêm a consistência dentro da família VH selecionada, a fim de manter a estrutura típica de CDR e a interface VH/VL, e evitar o padrão N-glicosilado (N-{P}-S /T) presente na estrutura humanizada.

[0067] O design de mutações humanizadas em regiões variáveis de anticorpos mAb049 de murino foi resumido da seguinte forma: Tabela 2: sítios humanizados projetados em anticorpo mAb049 de murino NOTA: Por exemplo, A93T denota mutação regressiva de 93A para T de acordo com o sistema de numeração de Kabat. * Indica que a CDR do anticorpo de murino foi implantada em sequências FR da linhagem germinativa humana. Tabela 3: sequências humanizadas do anticorpo mAb049 de murino NOTA: Esta tabela mostra várias combinações de sequências de diferentes mutações. Por exemplo, Hu049-8 indica que duas mutações (Hu049VK.1A e Hu049VH.1B) estão presentes no anticorpo mAb049 de murino humanizado, e assim por diante.

4. Expressão e purificação de anticorpo humanizado

[0068] Os anticorpos mencionados acima foram clonados, expressados e purificados por métodos geneticamente recombinantes. Os anticorpos humanizados com bom desempenho foram finalmente selecionados por ELISA, ensaio de inibição de ligação ao receptor, Biacore, teste de viabilidade celular, etc. Os anticorpos específicos estão indicados na tabela seguinte: Tabela 4: Componentes de anticorpo IL-17A humanizado

[0069] Sequências específicas do anticorpo mAb049 humanizado estão listadas abaixo: Hu049-17.VH SEQ ID NO: 5 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWMGVIDPGTG GVAYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYS LFYGS SPYAMDYWGQGTL VTVSS Hu049-18.VH SEQ ID NO: 6 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWMGVIDPGTG GVAYNQKFEGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYS LFYGS SPYAMDYWGQGTL VTVSS Hu049-19.VH SEQ ID NO: 7 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWIGVIDPGTGG VAYNQKFEGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWG QGTL VTVSS Hu049-20.VH SEQ ID NO: 8 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWIGVIDPGTGG VAYNQKFEGRATLTADDSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYS LFYGSSPYAMDYWGQGTL VTVSS Hu049VL SEQ ID NO: 9 EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPDQSPKLWIYRTSNLASGVPSR FSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQRSSYPWTFGQGTKLEIKR

Exemplo 3 Teste de farmacocinética e farmacodinâmica in vivo do anticorpo IL anti-17 humanizado

[0070] A IL-17 humana pode se ligar a e estimular o receptor de IL-17 do camundongo, levando a um aumento e secreção subsequente das quimiocinas em camundongos machos KC (CXCL1). Experiências com vários tempos e diversas doses foram realizadas para identificar a dose óptima de IL-17 humana e o melhor tempo para induzir os camundongos KC (ver Exemplo de Teste 5). Estas experiências mostram que 150 mg/kg de IL-17 humana e 2 horas após a administração de IL-17 induz o nível mais alto de KC em soro de camundongo. Os anticorpos de comprimento completo da presente invenção foram administrados por via intravenosa a camundongos a uma concentração de 3, 30, 300, 3000 μg/kg, 20 horas antes da injeção subcutânea de IL-17 humana. 2 horas após a administração de IL-17 humana, os camundongos foram sacrificados e o nível KC foi determinado usando um kit disponível comercialmente, por ELASA de acordo com a especificação do fabricante (camundongo CXCL1/ KC Quantikine ELISA Kit, R & D SYSTEM, # SMKC00B). O anticorpo de isótipo combinado foi utilizado como controle negativo. Os anticorpos bloqueiam a capacidade da IL-17 humana estimular o receptor IL-17 do camundongo, o que resulta na inibição do aumento do KC de uma forma dependente da dose em camundongos. Em comparação com o anticorpo de controle ineficaz, o anticorpo Hu049-18 da presente invenção reduziu o nível médio da KC a cerca de 1/6, nas condições descritas na dose de 3000 μg/ camundongo.

[0071] A farmacocinética de soro em ratos e macacos rhesus foi determinada após a administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo Hu049-18 da presente invenção (ver Exemplo de Teste 6). Em ratos, a meia-vida foi de 9,91 dias após a administração intravenosa de 5 mg/kg, e a meia-vida foi de 11,5 dias após a administração subcutânea de 5 mg/kg. Em macaca, a meia-vida foi de 24,4 dias após a administração intravenosa de 1 mg/kg.

Exemplos de teste Exemplo de Teste 1 ELISA indireto Finalidade:

[0072] O método ELISA indireto foi selecionado para assegurar a seleção de anticorpos que podem reconhecer o epítopo conformacional, e para o rastreamento dos hibridomas de camundongo a partir do Exemplo 1 da presente invenção.

Materiais:

[0073] A IL-17A humana (hIL-17A) foi clonada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências de proteína IL-17A humana com Acesso Genbank NP-002181, e transientemente transfectadas para células HEK293E para expressão.

[0074] A IL-17A/F humana (heterodímero, hIL-17A/F) foi clonada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências de proteína IL-17A humana com Acesso Genbank NP- 002181 e sequências de proteína IL-17F humana com Acesso Genbank NP_443104, e transientemente transfectadas para células HEK293E para expressão.

[0075] Como controles positivos, os anticorpos anti-IL-17 de murino de Lilly e Novartis (Lilly mAb, Novartis mAb) foram clonados pelas sequências de murino descritos em US7838638B2 (LY 2439821) e US 7807155B2 (AIN 457), respectivamente, e transientemente transfectados para células HEK293E para expressão.

[0076] Os anticorpos mAbs de murino derivados de hibridoma de camundongo são descritos no Exemplo 1 da presente invenção. Protocolo: 1. Placas de microtitulação foram diretamente revestidas com 1 μg /mL de estreptavidina, a 4°C durante a noite; 2. Placas de microtitulação foram bloqueadas com 300 μL de PBST contendo BSA a 2% (v/v), incubadas termostaticamente a 37° C durante 1 h, enquanto que os poços não revestidos foram bloqueados como controle; 3. Lavar com PBST três vezes, todas as operações de lavagem foram realizadas em lavadora automática Biotek (Elx 405); 4. 100 μL de PBS contendo hIL-17A ou hIL-17A/F (1 μg/mL) foram adicionados a cada poço, incubados termostaticamente a 37° C durante 1 h; 5. Lavagem com PBST por 3 vezes. 6. Controles positivos Lilly mAb e Novartis mAb ou anticorpo de murino mAbs da presente invenção foram titulados sob diluição 1:5, a concentração inicial é de 1 μg/mL. 100 μL de controle positivo diluído ou um anticorpo de murino da presente invenção foram adicionados a cada poço, incubados termostaticamente a 37°C durante 1 h. Cada concentração foi titulada em poço em duplicado; 7. Lavagem com PBST por 3 vezes; 8. 100 μL de anticorpo secundário anti-murino HRP (Santa Cruz Cat.No.sc-2005) (1: 5000) foram adicionados a cada poço, incubados termostaticamente a 37°C durante 1 h; 9. Lavagem com PBST por 3 vezes. 100 μL de substrato TMB foram adicionados a cada poço, incubados termostaticamente a 37° C durante 5 min. Em seguida, a reação foi parada pela adição de 100 μL de H2SO4 2M a cada poço; 10. O valor OD no comprimento de onda de 450 nm foi lido em um leitor de microplacas ELISA (Molecular Devices, Spectra Max). 11. Os valores de OD dos anticorpos mAbs de murídeo foram comparados com as dos controles positivos. As linhagens celulares monoclonais com uma razão superior a 1 foram rastreadas, em que a IL17-mAb049 foi incluído.

Exemplo de Teste 2 Ensaio de bloqueio do receptor de IL-17 (RBA) Finalidade:

[0077] O objetivo do ensaio de bloqueamento de receptor é para selecionar os anticorpos capazes de bloquear a ligação da IL-17 ao receptor de IL-17 (por exemplo, hIL-17RA). O teste baseia-se no ensaio funcional, e pode ser utilizado para o rastreamento de alto rendimento do hibridoma.

Materiais e equipamentos:

[0078] O anticorpo Fc anti-humano (anticorpo específico de fragmento IgG-Fc anti-humano de cabra (disponível a partir de Jackson Immunoresearch, 109-005-008))

[0079] IL-17RA-Fc humano utilizado aqui é clonado de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências de amino ácido do receptor de IL-17A humano com Genbank No. ID ADY18334.1, e transientemente transfectados para células HEK293E para a expressão, em que os fragmentos Fc foram obtidos a partir da IgG1 humana.

[0080] Como controles positivos, anticorpos anti-IL-17 de murino Lilly e Novartis (Lilly mAb, Novartis mAb) foram clonados de acordo com as sequências de murino descritos em US 7838638B2 (LY 2439821) e US 7807155B2 (AIN 457), e transientemente transfectadas em células HEK293E para expressão.

[0081] mIgG: IgG murino (Millipore Cat.No.PP54), utilizado como controle branco Leitor de placas ELISA: Molecular Devices, Spectra Max Cepas celulares monoclonais de murinos obtidas do Exemplo 1 da presente invenção. Protocolo: 1. Placas de microtitulação foram diretamente revestidas com 10 μg/mL de anticorpo Fc anti-humano, incubadas a 4° C durante à noite; 2. Placas de microtitulação foram bloqueadas com 300 μL de PBST contendo BSA a 2% (v/v), incubadas termostaticamente a 37°C durante 1 h, enquanto o poço não revestido foi bloqueado como controle; 3. Lavar com PBST três vezes, todas as operações de lavagem foram realizadas em lavadora automática Biotek (Elx 405); 4. 100 μL de PBS contendo IL-17 RA-Fc (60 ng/mL) foram adicionados a cada poço, incubadas termostaticamente a 37° C durante 2 horas; 5. Lavagem com PBST por 3 vezes. 6. Controles positivos Lilly mAb e Novartis mAb ou anticorpos da presente invenção foram diluídos na proporção de 1: 5, a concentração inicial foi de 40 μg/mL. mIgG foi diluída com o mesmo método. 50 μL de controle positivo diluído ou um anticorpo de murino da presente invenção ou mIgG foi adicionado a cada poço, enquanto isso, 50 μL de 0,2 nM de IL-17A marcada com biotina foram adicionadas ao controle positivo diluído ou ao anticorpo da presente invenção, misturadas suavemente e incubadas termostaticamente a 37°C durante 1 hora. 7. Lavagem com PBST por 3 vezes; 8. 100 μL de complexo estreptavidina marcada com HRP (1: 5000) foram adicionadas a cada poço, incubadas termostaticamente a 37°C durante 1 h; 9. Lavagem com PBST por 3 vezes. 100 μL de substrato TMB foram adicionadas a cada poço, incubadas termostaticamente a 37°C durante 5 min. Em seguida, a reação foi interrompida com a adição de 100 μL de H2SO4 2 M a cada poço; 10. O valor OD no comprimento de onda de 450 nm foi lido em um leitor de microplacas ELISA. 11. O valor de IC50 do anticorpo a ser testado foi calculado para bloquear a ligação de IL-17 ao receptor de IL-17.

[0082] O valor de IC50 (a concentração de anticorpo quando o valor de OD reduzido para 50%, isto é RBA) foi obtido de acordo com a curva de gradiente de valores de OD em função da concentração de anticorpo.

Resultados experimentais:

[0083] De acordo com o método acima, o hibridoma obtido no Exemplo 1 foi rastreado para se obter um anticorpo monoclonal de murino, designado como IL17-mAb049, os resultados são os seguintes: Tabela 5:

[0084] Conclusão: O anticorpo murino IL17-mAb 049 rastreado de hibridomas apresentou melhor atividade do que os anticorpos positivos Lilly mAb e Novartis mAb.

Exemplo de Teste 3 Teste de Afinidade Finalidade:

[0085] O método de BIACORE foi utilizado na experiência para determinar a cinética e afinidade de ligação antígeno-anticorpo.

Materiais e equipamentos: 1.1: Proteínas

[0086] A IL-17A humana (hIL-17A) foi clonada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências de proteína IL-17A humana com Acesso Genbank NP-002181, e transientemente transfectada para células HEK293E para expressão.

[0087] A IL-17A/F humana (heterodímero, hIL-17A/F) foi clonada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências de proteína IL-17A humanas com Acesso Genbank NP- 002181 e sequências de proteína IL-17F humanas com Acesso Genbank NP_443104, e transientemente transfectada para células HEK293E para expressão.

[0088] IL-17A de camundongo (mu IL-17A) e IL-17A de rato (Rat IL-17A) foram clonadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, utilizando a proteína de IL-17A de camundongo com Acesso Genbank NP_034682 e proteína de IL-17A de rato com Acesso Genbank NP_001100367, respectivamente, e transientemente transfectados para células HEK293E para expressão.

[0089] Como controles positivos, anticorpos anti-IL-17 de murino Lilly e Novartis (Lilly mAb, Novartis mAb) foram clonados de acordo com as sequências de murídeo descritas em US 7838638B2 (LY 2439821) e US 7807155B2 (AIN 457), respectivamente, e transientemente transfectados em células HEK293E para expressão.

[0090] Como um controle positivo, o anticorpo anti-IL-17 humanizado Lilly (Lilly mAb(Hu)) foi clonado de acordo com as sequências humanizadas reveladas em US 7838638B2 (LY 2439821) e transientemente transfectados para células HEK293E para expressão.

[0091] Cepas celulares monoclonais de murinos obtidas do Exemplo 1 da presente invenção.

[0092] Anticorpos IL-17 humanizados obtidos do Exemplo 2 da presente invenção. 1.2BIACORE Modelo: BIACORE X 100, GE; 1.3BIACORE chips e reagentes (nomes comerciais foram listados a seguir, nenhuma tradução reconhecida): Protocolo: 1. O anticorpo da presente invenção foi imobilizado em um chip CM5: 1:1 de 50 mM NHS: 200 mM EDC foi preparado e injetado no canal FC2 (célula de fluxo 2) a uma taxa de 10 μL/min, durante 7 min, para ativar o chip de sensor CM5. O anticorpo da presente invenção foi dissolvido em 10 mM de tampão de acetato de sódio a uma concentração de 30 μg/mL, pH 5,0, e injetado no chip de ativado (tampão de fase móvel HBS-EP: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005 % de surfactante P20, pH 7,4) a uma taxa de 5 μL/min. 1M de etanolamina foi injetada a uma taxa de 10 μL/min, durante 7 min, para selar as posições de acoplamento ativadas restantes. Cerca de 8000RU foi gerado. 2. Ensaio de ligação cinética: FC1 (célula de fluxo 1) foi usado como canal de referência, FC2 (célula de fluxo 2) foi usada como canal de amostra, anticorpo de controlo de murino ou humanizado ou o anticorpo da presente invenção foi capturado no canal FC2 300RU, seguido por injeção de diferentes concentrações de IL-17 (incluindo hIL-17A, MuIL-17, Rat IL-17). As condições de ciclo foram: injeção de analitos em todos os canais FC em 30 μL/min por 3min, dissociação por 20 min, injeção de 10 mM de glicina, pH 1,5, por 60s (a uma taxa de 10 μL/min) para a regeneração da superfície. A diferença entre o sinal com o anticorpo capturado e sinal sem anticorpo capturado foi calculada pelo software de avaliação Biacore X100 ver 2.0 (Biacore), o tampão de corrida foi 10 mM Hepes, 650 mM NaCl, 3 mM EDTA, Tween-20 a 0,05%. Resultados experimentais: 1. De acordo com o método descrito acima, os hibridomas obtidos no Exemplo 1 foram rastreados, os resultados são os seguintes: Tabela 6

[0093] Conclusão: A afinidade do anticorpo de murino IL17-mAb 049 rastreado de hibridomas é equivalente ao do anticorpo positivo Lilly mAb, e melhor do que o do Novartis mAb. 2. De acordo com o método acima, os anticorpos IL-17 humanizados obtidos a partir do Exemplo 2 foram testados, os resultados são os seguintes: Tabela 7

[0094] Conclusão: A afinidade do anticorpo humanizado foi aumentada em 10 vezes do que a do anticorpo positivo de Lilly (1,48E- 11M).

Exemplo de Teste 4 Bioensaio no nível celular (ensaio de GROα) Finalidade:

[0095] A seguinte experiência foi destinada a detectar a atividade biológica celular de anticorpo anti-IL-17A pela inibição da secreção de IL-17 estimulada de GROα a partir de células HS27 com anticorpo anti-IL-17A.

Materiais e equipamentos:

[0096] Células HS27: ATCC Cat.No.CRL-1634 (Nota: as células cultivadas por mais de seis semanas não são recomendadas para o bioensaio); Meio de cultura de células Hs27: DMEM + FBS a 10% DMEM: ATCC Cat.No.30-2002; FBS: GIBCO Cat.No.10099, lote 8122818; IL-17A humana recombinante (rhIL-17A): R&D Systems Cat.No.317- ILB, lote SOA161109B; IL-17A/F humana recombinante (rhIL-17A/F): R&D Systems Cat No.5194-IL/CF, lote RXT101109A; CXCL1/GRO alfa humana Quantikine PharmPak kit: R&D Cat sistema. No. PDGR00 Equipamento: leitor de microplacas Biotek ELx808. Cepa celular monoclonal de murino obtida a partir do Exemplo 1 da presente invenção. Anticorpo IL-17 humanizado obtido a partir do Exemplo 2 da presente invenção.

Protocolo: 1. Cultura de células HS27:

[0097] Células HS27 foram cultivadas em 50 ml de meio DMEM + FBS a 10% em frasco T175; as células (densidade de cerca de 90%) foram cultivadas a diluição em uma relação de 1:3 a cada 3 dias; as células foram usadas para bioensaio dentro de um mês, ou re- descongeladas a partir de nitrogênio líquido; as células re- descongeladas devem ser cultivadas por cerca de uma semana antes do bioensaio. 2. Procedimento experimental de bioensaio (IL-17A) 2.1 Células HS27 foram centrifugadas a 950rpm por 4min (remoção completa de tripsina-EDTA) e recolhida. A viabilidade celular foi analisada por coloração com azul de tripan, somente as células com > 80% vitalidade foram utilizadas para a experiência; 2.2 O meio foi adicionado em placas de 96 poços a 50 μL/ poço; 2.3 Células HS27 foram diluídas com DMEM + FBS a 10% e adicionadas a placas de 96 poços a uma densidade de 10000 células / 50 μL / poço; 2.4 25 μL de anticorpo IL-17 humano foram adicionados a cada poço em duplicado; o anticorpo foi diluído em uma proporção de 1: 3, com a concentração inicial de 10 nM; 2.5 25 μL de IL-17A recombinante humano foram adicionados a cada poço com uma concentração final de 0,3 nM. Placa de 96 poços foi centrifugada a 500 rpm durante 1 min; 2.6 As células foram incubadas termostaticamente a 37°C durante 17h; 2.7 Sobrenadante celular da cultura foi recolhido, a concentração de GROα foi detectada no sobrenadante pelo kit CACL1/ GRO alfa humano Quantikine (de acordo com as instruções do fabricante); 3. Procedimentos experimentais de bioensaio (IL-17A / F):

[0098] Os procedimentos do bioensaio de IL-17A / F é semelhante ao bioensaio de IL-17A, exceto que a IL-17A foi substituída com IL- 17A/F. Resultados experimentais: 1) De acordo com os métodos acima, o hibridoma obtido no Exemplo 1 foi rastreado, os resultados são os seguintes: Tabela 8:

[0099] Conclusão: A atividade biológica do anticorpo IL17-mAb049 obtido a partir do hibridoma é equivalente à do anticorpo positivo Lilly mAb, e melhor do que a do Novartis mAb. 2) De acordo com os métodos acima, os anticorpos humanizados obtidos a partir do Exemplo 2 foram detectados, os resultados são os seguintes: Tabela 9:

[00100] Conclusão: Os resultados indicam que todos os anticorpos humanizados exibem uma atividade biológica de células. Hu049-17, 18, 19 e 20 têm IC50 (0,04nM-0,066nM) semelhante ao do anticorpo positivo (0,04nM). Além disso, estes anticorpos exibem reação cruzada com a IL-17A de cinomolgo (IC50 é de 0,03 nM-0,039 nM). A atividade de IL-17A/F humano é de cerca de 10 vezes mais fraca do que a IL-17A.

Exemplo de Teste 5 Teste de neutralização de IL-17 humana in vivo Finalidade:

[00101] O objetivo de um teste de neutralização in vivo é verificar que os anticorpos da invenção podem bloquear in vivo a ligação de IL- 17 ao receptor de IL-17 (por exemplo, hIL-17RA), desse modo, inibindo a expressão de CXCR1 induzida por IL-17.

Materiais e equipamentos:

[00102] Proteína: IL-17A humana (hIL-17A) foi clonada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências da proteína IL-17A humana de com Acesso Genbank NP-002181, e transientemente transfectadas em células HEK293E para expressão.

[00103] Como um controle positivo, anticorpo humanizado anti-IL- 17 de Lilly (Lilly mAb (hu)) foi clonado de acordo com as sequências humanizadas reveladas em US 7838638B2 (LY 2439821) e transientemente transfectadas para células HEK293E para expressão. IgG humana (HuIgG): (Millipore Cat.No.AG711).

[00104] Animais: camundongos machos C57/B6 de 7 semanas de idade (comprado de SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD, CO, Certificado No: SCXK (Shanghai) 2008-0016), 6 camundongos cada grupo.

[00105] Reagentes: Solução de diluição Ab: tampão de citrato (pH 5,0): 10 mM de citrato de sódio, 50 mM de NaCl

[00106] Solução de diluição de hIL-17A: PBS (tampão de fosfato de sódio, pH 7,2).

[00107] CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit de camundongo, placas de 6 poços, R&D SYSTEM, # SMKC00B. Protocolo: 3) Os camundongo foram divididos em 15 grupos, 6 por cada grupo. 4) 100 μL de Hu049-18 ou anticorpo de controle (HuIgG ou Lilly mAb (hu)) ou uma solução diluída foi intraperitonealmente (IP) administrada a cada camundongo, as doses de administração do fármaco foram 3000μg/kg, 300 μg/kg, 30 μg/kg e 3 μg/kg, respectivamente. 5) 20 horas mais tarde, a hIL-17A foi injetada por via subcutânea (SC) a 150 μg/kg, cada camundongo foi injetado com 100 μL. 6) 2 horas mais tarde, as amostras de sangue foram colhidas, colocadas à temperatura ambiente durante 2 horas, até coagulação, ou 2-8° C durante a noite, até coagulação, e em seguida centrifugadas a 2000x g durante 20 min. O sobrenadante foi descartado, a detecção foi realizada imediatamente ou alíquotas de amostras foram armazenadas a -20°C. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. 7) As amostras obtidas a partir do Etapa 4 foram medidas por CXCL1/KC Quantikine Kit ELISA de camundongo.

Resultados experimentais:

[00108] De acordo com o método acima, o anticorpo humanizado Hu049-18 obtido a partir do Exemplo 2 foi testado, os resultados são os seguintes: Tabela 10:

[00109] Conclusão: Em comparação com o anticorpo de controle ineficaz, o anticorpo Hu-049-18 da presente invenção reduz o nível KC médio de cerca de 1/6 a uma dose de 3000 μg/camundongos sob a condição descrita. Em comparação com o anticorpo de controle, o anticorpo Hu-049-18 da presente invenção exibe a capacidade equivalente para inibir a KC, a uma dose de 3000 μg/camundongos sob a condição descrita.

Exemplo de Teste 6 Determinação da meia-vida (T1/2) dos anticorpos in vivo Finalidade:

[00110] Determinar os parâmetros farmacocinéticos do anticorpo Hu049-18 da presente invenção em ratos ou macacos cinomolgos in vivo.

Materiais e Reagentes:

[00111] Proteína: IL-17A humana (hIL-17A) foi clonada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, utilizando as sequências humanas de proteína IL-17A com Acesso Genbank NP-002181, e transientemente transfectadas para células HEK293E para expressão.

[00112] Como um controle positivo, anticorpo anti-IL-17 humanizado de Lilly (Lilly mAb (hu)) foi clonado de acordo com as sequências humanizadas reveladas em US 7838638B2 (LY 2439821) e transientemente transfectadas para células HEK293E para expressão. IgG humana (HuIgG): IgG humana e policlonal, Millipore Cat.No.AG711

[00113] Animais: ratos machos SD 230-250g (adquiridos a partir de Xangai SLAC laboratory animal Co., Ltd., Certificado No: SCXK (Xangai) 2.007-0.005) foram divididos em dois grupos de injeção intravenosa (IV) (dorso do pé) e grupo de injeção subcutânea (SC), 5 ratos de cada grupo. Macaca: macacos cinomolgos 2-3 kg (Hainan Jingang Biotecnologia Co., Ltd. Certificado No: SCXK (HN) 2010-0001, 0000152.) Reagentes: Solução de diluição de anticorpo: tampão de citrato (pH 5,0): 10 mM de citrato de sódio, 50 mM de NaCl solução de diluição de hIL-17A: PBS (tampão de fosfato de sódio, pH 7,2) Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado a peroxidase (Fab- específica), Sigma Cat.No.121M4811

Protocolo: Procedimentos para a detecção no rato: (1) administração in vivo

[00114] Ratos SD foram divididos aleatoriamente em dois grupos: (grupo de injeção intravenosa (IV) (dorso do pé) e grupo de injeção subcutânea (SC)), 5 ratos cada grupo;

[00115] Sob condições estéreis, Hu049-18 foi dissolvido em solução tampão de citrato (pH 5,0) até uma concentração final de 2,5 mg/mL;

[00116] Cada rato foi administrado IV ou SC com uma dose de 5 mg/kg;

[00117] Para o grupo IV, a amostra de sangue foi feita através da veia da cauda em 0min, 5min, 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d, 28d após a administração, 200 μL (equivalente a 80 μL de soro) de cada vez; Para o grupo SC, amostra de sangue foi feita através da veia da cauda em 0min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d, 28d após a administração, 200 μL (equivalente a 80 μL de soro) de cada vez;

[00118] As amostras de sangue foram recolhidas e colocadas durante meia hora à temperatura ambiente até a coagulação, e depois centrifugada a 4°C, a 10000 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido para ensaio imediato ou alíquotas de amostras foram armazenadas a -80° C. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. (2) As amostras de soro obtidas no etapa (1) foram detectadas por ELISA 1) Curva padrão a) Placa de microtitulação foi diretamente revestida com 1 μg/mL de estreptavidina, a 4°C durante a noite; b) Placa de microtitulação foi bloqueada com 300 μL de PBST contendo BSA a 2% (v/v), incubada termostaticamente a 37°C durante 1 h, enquanto o poço não revestido foi bloqueado como controle; c) lavagem com PBST três vezes, todas as etapas de lavagem foram realizadas em lavadora automática Biotek (Elx 405); d) 100 μL de PBS contendo hIL-17A (0,2 μg/mm) foram adicionadas a cada poço, incubadas termostaticamente a 37° C durante 1 h; e) Lavagem com PBST por 3 vezes. f) Titulação de Hu049-18: diluída em uma proporção de 1: 2 com a diluição de anticorpo, a concentração inicial foi 0,8 μg/mL. 100 μL de Hu049-18 diluída foi adicionada a cada poço, a curva padrão foi representada graficamente. A placa de 96 poços foi incubada termostaticamente a 37° C durante 1 h. g) lavagem com PBST por 3 vezes; h) 100 μL do anticorpo de cabra anti-IgG humano conjugado à peroxidase (Fab específico) (Sigma Cat No. 121M4811) (1: 5000) foram adicionados a cada poço, incubado termostaticamente a 37° C durante 1 h; i) lavagem com PBST por 3 vezes. 100 μL de substrato TMB foi adicionado a cada poço, incubado termostaticamente a 37° C durante 5 min. Em seguida, a reação foi interrompida com a adição de 100 μL de 1M HCl cada poço; j) O valor OD a 450 nm/ 630nm de comprimento de onda foi lido em leitor de microplacas de ELISA (Molecular Devices, Spectra Max). 2) Teste da amostra: a) Placas de microtitulação foram diretamente revestidas com 1 μg/mL de estreptavidina, a 4°C durante a noite; b) Placas de microtitulação foram bloqueadas com 300 μL de PBST contendo BSA a 2% (v/v), incubadas termostaticamente a 37° C durante 1 h, enquanto o poço não revestido foi bloqueado como controle; c) Lavagem com PBST por três vezes, todas as etapas de lavagem foram realizadas em lavadora automática Biotek (Elx 405); d) 100 μL de PBS contendo hIL-17A (0,2 μg/mL) foram adicionadas a cada poço, incubadas termostaticamente a 37° C durante 1 h; e) Lavagem com PBST por 3 vezes. f) Titulação de amostras de soro: Antes do experimento, uma amostra de soro de rato foi diluída em proporções diferentes para obter uma razão de diluição ótima na qual a concentração do anticorpo no soro foi apenas no meio da curva padrão. As amostras de soro foram diluídas, em conformidade com a razão de diluição ótima, enquanto Hu049-18 foi diluída para 25 ng/mL. 100 μL de amostra de soro diluída e Hu049-18 foram adicionados a cada poço, e incubados termostaticamente a 37°C durante 1 h. Cada concentração foi titulada em poços em duplicado; g) Lavagem com PBST por 3 vezes; h) 100 μL de anticorpo de cabra anti-IgG humano conjugado à peroxidase (Fab específico) (Sigma Cat No. 121M4811) (1: 5000) foi adicionado a cada poço, incubado termostaticamente a 37° C durante 1 h; i) Lavagem com PBST por 3 vezes. 100 μL de substrato TMB foi adicionado a cada poço, incubado termostaticamente a 37° C durante 5 min. Em seguida, a reação foi interrompida com a adição de 100 μL de 1M HCl cada poço; j) O valor OD a 450 nm/ 630nm de comprimento de onda foi lido em um leitor de microplacas ELISA (Molecular Devices, Spectra Max).

2. Procedimentos de detecção para macacos:

[00119] Procedimentos de detecção in vivo para Macaca (Macaca fascicularis) foram semelhantes aos de ratos, as diferenças foram como se segue: a administração de macaco cinomolgus foi apenas por meio de injeção intravenosa (IV) a uma dose de 1 mg/kg, a amostra de sangue foi feita através da veia da cauda em 0min, 5min, 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h, 32hr, 3d, 4d, 5d, 6d, 9d, 12d, 14d, 17d, 21d, 28d, 35d após a administração, 500 μL de cada vez. A amostra de soro após centrifugação foi dividida em 3 partes (assegurar que cada uma das partes contenha 60 μL de amostra), e congeladas a -80° C para o teste.

Resultados experimentais:

[00120] De acordo com o método descrito acima, foi detectado o anticorpo Hu049-18 humanizado obtido a partir do Exemplo 2, os resultados são os seguintes: Tabela 11:

[00121] Conclusão: Os resultados mostram que, em comparação com o anticorpo de controle de Lilly (valor T1/2 do anticorpo positivo em macacos cinomolgo foi reportado como 6,5 dias (IV) e 10,3 dias (SC)), o anticorpo Hu049-18 da presente invenção prolonga significativamente a meia-vida in vivo, sob a condição descrita.

Claims (22)

1. Agente de ligação à IL-17A, caracterizado pelo fato de que compreende: região variável de cadeia leve do anticorpo, que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostradas em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; e região -3 regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostradas em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, respectivamente.

2. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende ainda a região FR de cadeia leve derivada da cadeia K de murino ou região FR de cadeia leve derivada da cadeia À de murino.

3. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve do anticorpo é mostrada em SEQ ID NO: 2.

5. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a região constante de cadeia leve derivada de cadeia k de murino ou uma região constante de cadeia leve derivada da cadeia λ.

5. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende ainda a região FR da cadeia pesada derivada de IgG1 de murino, a região FR da cadeia pesada derivada de IgG2 de murino, as regiões FR da cadeia pesada derivadas de IgG3 de murino, ou as regiões FR de cadeia pesada de IgG4 derivada de murino.

6. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo é mostrada em SEQ ID NO: 1.

7. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a região constante da cadeia pesada derivada de IgG1 de murino, a região constante da cadeia pesada derivada de IgG2 de murino, a região constante da cadeia pesada derivada de IgG3 de murino, ou a região constante da cadeia pesada da derivada de IgG4 de murino.

8. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve do anticorpo compreende ainda a região FR de cadeia leve derivada da cadeia K humana ou uma região FR da cadeia leve derivada da cadeia λ humana.

9. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região FR da cadeia leve é a região FR A10 de cadeia leve da linhagem germinativa humana, cuja sequência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 4, ou variantes das mesmas apresentando de 0 a 10 mutações de aminoácidos.

10. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mutação do aminoácido é uma ou mais selecionada a partir de F71Y, K49Y, Y36F e L47W.

11. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve do anticorpo é selecionada a partir da cadeia leve da SEQ ID NO: 9.

12. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a região constante de cadeia leve derivada da cadeia k humana ou uma região constante de cadeia leve derivada da cadeia λ humana.

13. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende ainda a região FR de cadeia pesada derivada de IgG1 humana, a região FR de cadeia pesada derivada de IgG2 humana, a região FR de cadeia pesada derivada de IgG3 humana, a região FR de cadeia pesada derivada de IgG4 humana.

14. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região FR de cadeia pesada é a região FR VH1-18 de cadeia pesada da linhagem germinativa humana, cuja sequência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 3, ou uma variante da mesma apresentando de 0 a 10 mutações de aminoácidos.

15. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a mutação do aminoácido é uma ou mais selecionada a partir de A93T, T71A, M48I, V67A, M69L, T73D e S76N.

16. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada é selecionada a partir das cadeias pesadas mostradas em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

17. Agente de ligação à IL-17A, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a região constante da cadeia pesada derivada de IgG1 humana, a região constante da cadeia pesada derivada de IgG2 humana, a região constante da cadeia pesada derivada de IgG3 humana ou a região constante da cadeia pesada derivada de IgG4 humana.

18. Vetor, caracterizado pelo fato de que expressa o agente de ligação à IL-17A, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Vetor, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos que codificam o agente de ligação à IL-17A, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: o agente de ligação à IL-17A, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17; e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Uso do agente de ligação à IL-17A, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para tratamento de doenças ou distúrbios mediados por IL-17A.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que: a doença é selecionada a partir de doenças inflamatórias ou autoimunes; a doença é selecionada a partir de psoríase, artrite psoriática, espondilite anquilosante, esclerose múltipla ou artrite inflamatória.