CN104936981A - Il-17a结合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种特异性识别IL-17A并能与IL-17A结合的抗体。可用于治疗因白介素-17A高表达引起的炎症和自身免疫疾病，包括银屑癣，银屑病关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化症，炎性关节炎等。

Description

IL-17A结合物及其用途 技术领域
本发明涉及一种IL-17A结合物，以及其作为治疗剂特别是作为各种炎症或自身免疫疾病治疗剂的用途。
背景技术
白介素-17家族的细胞因子被分别命名为白介素-17A到白介素-17F。同时，人们还找到了它们的受体家族：白介素-17受体A到白介素-17受体E。这些白介素-17细胞因子可以结合到相对应的受体成员上，从而介导不同的炎症反应。
该家族中最具代表性的成员是白介素-17A。迁移到机体受感染或损伤处的淋巴细胞会分泌白介素-17A。白介素-17A一方面会诱导炎症因子以及趋化因子的表达，从而招募更多的免疫细胞到达炎症部位加剧炎症反应；另一方面，白介素-17A还会诱导一些组织修复相关因子的表达，从而加速机体的恢复。虽然白介素-17A在宿主抗感染和组织修复过程中起到扩大免疫防御反应和保护机体的作用，但是在很多自身免疫病病人和肿瘤病人当中，白介素-17A是高表达的，过高的白介素-17A水平对于病理发展起到恶化作用，因为它可以诱导很多炎症因子的表达。很多动物实验也证明，白介素-17A的缺失或者白介素-17A被抗体中和，可以有效抑制多种自身免疫病病理程度。有证据证明以IL-17信号为靶点治疗自身免疫病，包括风湿性关节炎(RA)、银屑病、克罗恩氏病、多发性硬化症(MS)、牛皮癣疾病、哮喘和红斑狼疮，均有一定的疗效(参见例如Aggarwal等人,J.Leukoc.Biol.,71(1):1-8(2002)；Lubberts等人)。
人源IL-17基因编码是一条长达155个氨基酸的多肽。该多肽包含一个19个氨基酸的信号序列和一个132个氨基酸的成熟区域。人IL-17A是一个相对分子量为17,000Da的糖蛋白(Spriggs等人,J.Clin.Immunol.,17:366-369(1997))，以同源二聚体或异源二聚体的形式存在。同系物IL-17F可与IL-17A复合形成IL-17A/F异二聚体。IL-17F(IL-24,ML-1)与IL-17A的氨基酸顺序相似性高达55％，其受体同是IL-17R。IL-17R在各种细胞，包括血管内皮细胞、外周T细胞、B细胞、成纤维细胞、髓单核细胞和骨髓基质肌细胞中普遍表达(Kolls等人,Immunity,21:467-476(2004)；Kawaguchi等人,J.Allergy Clin.Immunol.,114(6):1267-1273(2004)；Moseley等人,Cytokine Growth Factor Rev.,14(2):155-174(2003))。
自白介素-17A的发现至今，发现了各种抗IL-17A抗体，如CN101001645A，CN101326195A，CN101646690A，然而仍需要开发各种在炎症反应和自身免疫疾病中有效降低或抵消IL-17活性的改良的抗体。
发明内容
本发明提供一种亲和力更高，半衰期更长的抗IL-17A抗体。
本发明提供如下的一种IL-17A结合物，其包含：
抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区包含0-3个选自如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的LCDR区；和
抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区包含0-3个选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的HCDR区；
其中抗体轻链可变区和重链可变区的CDR区数目不能同时为0。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含SEQ ID NO:13。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含SEQ ID NO:14。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含SEQ ID NO:15。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含SEQ ID NO:10。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含SEQ ID NO:11。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含SEQ ID NO:12。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含1个选自如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的LCDR区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含1个选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的HCDR区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含2个选自如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的LCDR区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含2个选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的HCDR区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含3个LCDR区，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其包含3个HCDR区，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。在一些实施方式中，所述的抗体轻链可变区序列为：SEQ ID NO:2。进一步地，所述的IL-17A结合物包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其抗体重链可变区进一步包含重鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区。在一些实施方式中，所述的抗体重链可变区序列为：SEQ ID NO:1。进一步地，所述IL-17A结合物包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其抗体轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区；在一些实施方式中，所述抗体轻链可变区的轻链FR区是氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的人种系轻链A10的FR区或其变体。在一些实施方式中，所述抗体轻链可变区上的FR区序列变体指在人种系轻链A10的轻链FR区有0-10的氨基酸变化。在一些实施方式中，所述抗体轻链可变区上的FR区序列变体的氨基酸变化选自以下的一种或多种：F71Y、K49Y、Y36F、L47W。在一些实施方式中，所述抗体轻链选自：SEQ ID NO:9及其变体。进一步地，所述的IL-17A结合物包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
根据本发明的一些实施方式，一种IL-17A结合物，其体重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区；在一些实施方式中，所述抗体重链可变区上的重链FR区是氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的人种系重链VH1-18的FR区或其变体；在一些实施方式中，所述抗体重链可变区上的FR区序列变体指在VH1-18的重链FR区有0-10的氨基酸变化；在一些实施方式中，其中所述抗体重链可变区上的FR序列变体的氨基酸变化选自以下的一种或多种：A93T、T71A、M48I、V67A、M69L、T73D、S76N；在一些实施方式中，其中所述抗体重链序列选自：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。进一步地，所述的IL-17A结合物包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
进一步地，根据本发明的一些实施方式，提供一种表达上述IL-17A结合物的载体。用载体转染宿主细胞后，宿主细胞表达分泌IL-17A结合物。
根据本发明的一些实施方式，所述载体含有编码本发明IL-17A结合物的核苷酸。
进一步地，根据本发明的一些实施方式，还提供一种药物组合物，其含有如上所述的IL-17A结合物和可药用的赋形剂、稀释或载体。
进一步地，根据本发明的一些实施方式，还提供一种如上所述的IL-17A结合物，或包含其的药物组合物，在制备用于治疗IL-17介导的疾病或病症的药物中的用途。所述的疾病为炎症或自身免疫疾病；选自银屑癣，银屑病关节炎，强直性脊柱炎，多发性硬化症，炎性关节炎；所述的炎症优选为炎性关节炎。所述的炎性关节炎选自骨关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎或骨质疏松症，优选风湿性关节炎。
根据本发明的一些实施方式，还提供一种如上所述的IL-17A抗体或人源化IL-17A抗体及包含其的药物组合物，在制备用于治疗IL-17介导的疾病或病症的药物中的用途。所述的疾病为炎症和自身免疫疾病。其中所述的炎症优选为炎性关节炎。所述的炎性关节炎选自：骨关节炎、类风湿性关节炎或骨质疏松症。
根据本发明的一些实施方式，还提供一种治疗IL-17介导的疾病或病症的方法，包括向患者施用有效量的如上所述的IL-17A结合物或人源化IL-17A抗体或 包含其的药物组合物。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
一、术语
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本文所述的“结合物”是指能够与靶结合的可溶性受体或其片段或其类似物，或抗体或其片段或其类似物。本发明所述的“IL-17A结合物”，是指能特异性识别IL-17A并与IL-17A结合的抗体或其片段或其类似物。
术语“IL-17A”一般是指天然的或重组的人IL-17A，以及人IL-17A的非人同源物。除非另有指示，否则使用IL-17A的同源二聚体的分子量(例如对于人IL-17A为30KDa)计算IL-17A的摩尔浓度。
本发明所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR)，指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR)，指HCDR1，HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体是含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明的术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或 生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。“处理”在应用于人、兽医学或研究受试都有或者细胞、组织或器官时，包括IL-17A激动剂或IL-17A拮抗剂与人或动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。“细胞的处理”还包括其中IL-17A激动剂或IL-17A拮抗剂例如在流体相或胶体相中接触IL-17A受体的情况，而且包括其中激动剂或拮抗剂不接触细胞或受体的情况。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。
本文指出了人IL-17A蛋白的4种变体：
1)本文使用的术语“人IL-17A(huIL-17A)”和“天然人IL-17A”是指人IL-17A蛋白登录号NP-002181和AAT22064的成熟形式(即残基24-155)，及其天然变体和多态性。
2)本文使用的术语“rhIL-17A”是指重组人IL-17A为方便起见，采用该命名法指示多种形式的IL-17A，可能与文献中的用法不匹配。
3)本文使用的术语“His-huIL-17A”是指在N-末端附加His标签的重组人IL-17A。FLAG-huIL-17A是指在N-末端附加Flag标签的重组人IL-17A。在某些实验中，FLAG-huIL-17A被生物素化。
4)在本文中指出的R&D Systerms人IL-17A指从R&D Systerms购买的重组人IL-17A。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应在序列相同或同源，以及此种类抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性。
本文使用的术语“人源化抗体”是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的性质的重组抗体。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在，存在时可以是1个，2个或3个。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
二、人IL-17特异性抗体
本发明提供的抗IL-17A抗体及其治疗炎症疾病、自身免疫疾病的用途。所述疾病包括类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、类风湿性关节炎骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和硬化)、炎性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应、COPD、多发性硬化、银屑病和癌症。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗IL-17A抗体。例如，可以用连接或例如天然存在的IL-17A同二聚体或其片段免疫受体动物。可以使用合适的免疫接种方法。这类方法可以包括佐剂。其它免疫刺激剂、重复加强免疫接种以及使用一种或多种免疫接种途径。
任何合适形式的IL-17A都可以用作免疫原(抗原)，用于产生对IL-17A特异性的非人抗体，可筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以为全长的成熟人IL-17A，包括连接的天然同二聚体，或其含单个表位或多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或者与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组的或非基因组的(例如cDNA)。可以使用适合的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。
生产本发明的抗人IL-17A抗体的示例性方法描述于实施例1。
三、IL-17A特异性抗体的人源化
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体。可以使用IgG的任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。还设想了IgG同种型的变体。人源化抗体可以包含来自一个以上的种类或同种型的序列。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ或其变体在本发明的化合物和方法中是有用的。
人源化本发明的抗人IL-17A抗体的示例性方法描述于实施例2。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1抗人IL-17A的小鼠单克隆抗体
如下获得人IL-17A(hIL-17A)的单克隆抗体。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2008-0016)和6-8周龄的雌性SJL小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)分成高低剂量两组，每组各10只BALB/c小鼠和10只SJL小鼠。
高低剂量组分别免疫接种一系列已由HEK293E(293-EBNA,Invitrogen,Lot Num:493985)表达系统生产的N-末端附加His标签的天然hIL-17A的变体(His-hIL-17A，其中hIL-17A的氨基酸序列可参见Genbank人IL-17A蛋白登录号NP-002181，表达得到的蛋白用Ni亲和柱(Superdex)75SEC sequentially纯化)。接种时间为第0、14、35、56天。
第0天高剂量组给予皮下(sc)注射500μg/鼠His-huIL-17A，同时腹膜内(IP)注射弗氏完全佐剂(CFA)。第14和35天sc注射25μg/鼠His-hIL-17A，同时IP注射弗氏不完全佐剂(IFA)。第56天在进行脾细胞融合前加强免疫，IP注射25μg/鼠His-hIL-17A的生理盐水溶液。低剂量组的免疫注射时间及方法与高剂量组相同，不同的是第0天给予的His-hIL-17A剂量为10μg/鼠，第14、35和56天给予的His-hIL-17A剂量为5μg/鼠。
于第22和43天进行血检，用测试例1的ELISA方法检测小鼠血清，确定小鼠血清中的抗体滴度。于第56天选择血清中抗体滴度高的小鼠进行脾细胞融合， 采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。
免疫方案步骤如下：
方案1，高剂量，10只BALB/c和10只SJL小鼠，步骤如下：
0天 预抽血15-30μL血清/鼠；初次免疫，IP，CFA 50μg/鼠
14 Boost 1(加强免疫1)：IP,IFA 25μg/鼠
21 抽血(15-30μL血清/鼠)
22 ELISA测试
35 Boost 2(加强免疫2)：IP,IFA 25μg/鼠
42 抽血(15-30μL血清/鼠)
43 ELISA测试
44 数据分析和阶段结论
56 融合前加强免疫，IP,生理盐水25μg/鼠
方案2，低剂量，步骤如下：
0天 预抽血15-30μL血清/鼠；初次免疫，IP，CFA 10μg/鼠
14 Boost 1(加强免疫1)：IP,IFA 5μg/鼠
21 抽血(15-30μL血清/鼠)
22 ELISA测试
35 Boost 2(加强免疫2)：IP,IFA 5μg/鼠
42 抽血(15-30μL血清/鼠)
43 ELISA测试
44 数据分析和阶段结论
56 融合前加强免疫，IP,生理盐水5μg/鼠
用测试例1抗原抗体间接ELSIA实验进行杂交瘤细胞的初次筛选。检测阳性的细胞株通过有限稀释得到单克隆细胞株。
对获得的单克隆细胞株进行进一步筛选，包括：
1、受体封闭试验，见测试例2，结果见表5，筛选得到活性优于阳性对照的单克隆细胞株IL17-mAb049；
2、亲和性检测：见测试例3，结果见表6，显示本发明筛选得到的单克隆细胞株IL17-mAb049活性相当或优于阳性对照；
3、细胞水平生物测定(GROα分析)：见测试例4，结果见表8，显示本发明筛选得到的单克隆细胞株IL17-mAb049活性相当或优于阳性对照。
本发明在第一次和第二次筛选后进一步研究了12个单克隆，并通过表位分组、生物学活性检测挑选了1个先导单克隆(lead mAb)IL17-mAb049。以下为IL-17A 鼠抗体mAb049的(IL-17mAb)重链(VH)和轻链(LH)的具体序列：
IL-17mAb049VH      SEQ ID NO：1
HVQLQQSGADLVRPGASVTLSCKASGYIFTDYEVHWVKQTPVHGLEWIGVIDPGTGGVAYNQKFEGKATLTADDSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGTSVTVSS
IL-17mAb049VL      SEQ ID NO：2
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPGTSPKLWIYRTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPWTFGGGTNLEIK
实施例2鼠源抗人IL-17A抗体的人源化
鼠源抗人IL-17A单克隆抗体mAb049的人源化基本上如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，进行人源化。
1、鼠源抗IL-17A抗体的CDR区
VH/VL CDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。本发明中鼠源mAb049的CDR序列如下表所述：
表1：鼠源抗IL-17A抗体CDR序列
2、选择人种系FR区序列
在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与抗体数据库比较，获得同源性高的人种系重链为VH1-18(SEQ ID NO：3)，轻链为A10(SEQ ID NO：4)作为人源化FR区序列。具体序列如下：
VH1-18      SEQ ID NO：3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR
A10      SEQ ID NO：4
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP
3、人源化的抗体的设计：
确定形成环构象和VH界面的氨基酸残基，考虑到如下等因素，Q1E突变以 消除N-末端焦谷氨酸的形成，突变也包括那些保持所选VH家族内一致性的突变，以维持CDR的典型结构和VH/VL界面，可避免N-糖基化模式(N-{P}-S/T)在人源化结构中出现等。
对鼠抗mAb049的可变区进行人源化突变设计总结如下：
表2：鼠抗体mAb049人源化位点设计
注：如A93T表示依照Kabat编号系统，将93位A突变回T。
*代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
表3：鼠抗体mAb049人源化序列
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如Hu049-8表示，在人源化的鼠抗体mAb049上的有Hu049VK.1A、Hu049VH.1B两种突变。其它类推。
4、人源化抗体的表达和纯化
用基因重组方法分别克隆、表达、纯化上述抗体，经ELISA,受体结合抑制实验、Biacore,细胞活性检测等，最终选出的性能好的人源化抗体。具体抗体如下表：
表4：人源化抗体IL-17A组成
mAb049人源化序列具体序列列举如下：
Hu049-17.VH      SEQ ID NO：5
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWMGVIDPGTGGVAYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS
Hu049-18.VH      SEQ ID NO：6
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWMGVIDPGTGGVAYNQKFEGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS
Hu049-19.VH      SEQ ID NO：7
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWIGVIDPGTGGVAYNQKFEGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS
Hu049-20.VH      SEQ ID NO：8
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEVHWVRQAPGQGLEWIGVIDPGTGGVAYNQKFEGRATLTADDSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRYSLFYGSSPYAMDYWGQGTLVTVSS
Hu049VL      SEQ ID NO：9
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPDQSPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQRSSYPWTFGQGTKLEIKR
实施例3人源化抗IL-17抗体的体内药效药代检测
人IL-17能结合并刺激小鼠IL-17受体，导致雄性小鼠KC(CXCL1)趋化因子的提高和随后的分泌。进行时间和剂量变化实验来鉴定人IL-17的最佳剂量和小鼠KC诱导的最佳时机(参见测试例5)。这些实验表明人IL-17的150mg/kg剂量和IL-17给药后2小时的时间引起小鼠血清中KC的最高水平。本发明的全长抗体以3、30、300、3000μg/kg，在人IL-17的皮下注射前20小时对小鼠静脉内施用。在人IL-17给药2小时后，处死小鼠并使用市售试剂盒，根据制造商的说明书(Mouse CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit,R&D SYSTEM,#SMKC00B)通过ELISA来测定 KC的水平。同种型匹配的抗体用作阴性对照。抗体阻断了人IL-17刺激小鼠IL-17受体的能力，以导致剂量依赖的方式抑制小鼠KC的升高。与无效应的对照抗体相比，本发明抗体Hu049-18在描述的条件下以3000μg/小鼠的剂量降低平均KC水平至约1/6。
在大鼠和猕猴中经静脉内或皮下给药后确定本发明抗体Hu049-18的血清药物动力学(参见测试例6)。大鼠经5mg/kg静脉给药后，半衰期为9.91天，经5mg/kg皮下注射给药后，半衰期为11.5天。猕猴经1mg/kg静脉给药后，半衰期24.4天。
测试例
测试例1间接ELSIA
实验目的：
选择间接ELISA方法，用于确保识别构象型表位的抗体的选择，筛选本发明实施例1中小鼠杂交瘤细胞。
实验材料：
人IL-17A(hIL-17A)：根据本领域已知的方法利用Genbank人IL-17A蛋白登录号NP-002181进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
人IL-17A/F(异二聚体，hIL-17A/F)：根据本领域已知的方法利用Genbank人IL-17A蛋白登录号NP-002181和人IL-17F蛋白登录号NP_443104进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
作为阳性对照的Lilly及Novartis的鼠源anti-IL-17抗体(Lilly mAb,Novartis mAb)分别根据US 7,838,638B2(LY 2439821)和US 7,807,155B2(AIN 457)提供的鼠源序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
本发明实施例1中小鼠杂交瘤细胞的鼠源抗体mAbs。
实验方法：
1、直接包被1μg/ml的链霉素亲和素，4℃过夜；
2、用300μl含2％BSA(v/v)的PBST封闭微量滴定板条，37℃恒温封闭1h，同时封闭无包被的空白孔作对照；
3、PBST洗涤3次，所有的洗涤在Biotek(Elx 405)自动洗板机上操作；
4、每孔加入100μl含hIL-17A或hIL-17A/F(1μg/ml)的PBS，37℃恒温孵育1h；
5、PBST洗涤3次；
6、阳性对照Lilly mAb和Novartis mAb或本发明中本发明的鼠源抗体mAbs滴定：按照1:5倍比稀释，初始浓度为1μg/ml，每孔加入100μl稀释的阳性对照或本发明鼠源抗体，37℃恒温孵育1h。每个滴定浓度设重复孔；
7、PBST洗涤3次；
8、每孔加入100μl HRP抗鼠二抗(Santa Cruz Cat.No.sc-2005)(1:5000)，37℃恒温孵育1h；
9、PBST洗涤3次。每孔加入100μl TMB底物，37℃恒温孵育5min，随后每孔加入100μl 2M H2SO4中止反应；
10、ELISA酶标仪(Molecular Devices,Spectra Max)读取450nm波长处的OD值。
11、将鼠源抗体mAbs测得的OD值与阳性对照比较，筛选得到比值大于1的单克隆细胞株，其中包括IL17-mAb049。
测试例2IL-17受体封闭试验(RBA)
实验目的：
进行受体封闭试验的目的是为了挑选可封闭IL-17结合到IL-17受体(如hIL-17RA)上的抗体。该试验以功能测试为基础，可用于杂交瘤细胞高通量筛选。
实验材料与仪器：
抗人Fc抗体(羊抗人IgG-Fc片段特异性抗体(购自Jackson Immunoresearch,109-005-008))
本发明中使用的人IL-17RA-Fc是根据本领域已知的方法利用Genbank ID号ADY18334.1提供的人IL-17受体氨基酸序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达得到的，其Fc片段取自人IgG1。
作为阳性对照的Lilly及Novartis的鼠源anti-IL-17抗体(Lilly mAb,Novartis mAb)分别根据US 7,838,638B2(LY 2439821)和US 7,807,155B2(AIN 457)提供的鼠源序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
mIgG：鼠源IgG(Millipore Cat.No.PP54)，作为空白对照
ELISA酶标仪：Molecular Devices,Spectra Max
本发明实施例1中得到的鼠源单克隆细胞株。
实验方法：
1、直接包被10μg/ml抗人Fc抗体孵育，4℃过夜；
2、用300μl含2％BSA的PBST封闭微量滴定板条，37℃恒温封闭1小时，同时封闭无包被的空白孔作对照；
3、PBST洗涤3次，所有的洗涤在Biotek(Elx 405)自动洗板机上操作；
4、每孔加入100μl含IL-17RA-Fc(60ng/ml)的PBS，37℃恒温下孵育2h；
5、PBST洗涤3次；
6、阳性对照Lilly mAb和Novartis mAb或本发明中抗体，按照1:5倍比稀释，初始浓度为40μg/ml，mIgG用相同方法稀释，每孔加入50μl稀释的阳性对照或本发明中抗体或mIgG，同时在稀释的阳性对照或本发明抗体中加入50μl 0.2nM生物素标记的IL-17A，轻轻混匀，37℃恒温孵育1h。
7、PBST洗涤3次；
8、每孔加入100μl HRP标记的链霉素亲和素复合物(1:5000)，37℃恒温孵育1h；
9、PBST洗涤3次。每孔加入100μl TMB底物，37℃恒温孵育5min，随后每孔加入100μl 2M H2SO4中止反应；
10、ELISA酶标仪读取450nm波长处的OD值。
11、计算待测抗体对封闭IL-17结合到IL-17受体的IC50值。
根据OD值对抗体浓度梯度曲线，求得IC50值(OD值减少50％时的抗体浓度(nM)，即RBA)。
实验结果：
按以上方法，对实施例1中得到的杂交瘤细胞进行筛选，得到鼠源单克隆抗体，命名为IL17-mAb049，结果如下：
表5：
抗体编号 huIL-17RBA(nM)
Lilly mAb 0.17
Novartis mAb 1.56
IL17-mAb049 0.07
结论：杂交瘤筛选得到的鼠源抗体IL17-mAb 049活性比阳性抗体Lilly mAb和Novartis mAb均要好。
测试例3亲和性检测
实验目的：
本实验使用BIACORE方法测定抗原-抗体结合动力学及亲和力。
实验材料与仪器：
1.1蛋白：
人IL-17A(hIL-17A)：根据本领域已知的方法利用Genbank人IL-17A蛋白登录号NP-002181进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
人IL-17A/F(异二聚体，hIL-17A/F)：根据本领域已知的方法利用Genbank人IL-17A蛋白登录号NP_002181和人IL-17F蛋白登录号NP_443104进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
小鼠IL-17A(Mu IL-17A)、大鼠IL-17A(Rat IL-17A)：分别根据本领域已知的方法利用Genbank小鼠IL-17A蛋白登录号NP_034682和大鼠IL-17A蛋白登录号NP_001100367进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
作为阳性对照的Lilly及Novartis的鼠源anti-IL-17抗体(Lilly mAb,Novartis mAb)分别根据US 7,838,638B2(LY 2439821)和US 7,807,155B2(AIN 457)提供的鼠源序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
作为阳性对照的Lilly人源化anti-IL-17抗体(Lilly mAb(hu),)根据US 7,838,638B2(LY 2439821)提供的人源化序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
本发明实施例1中得到的鼠源单克隆细胞株。
本发明实施例2中得到的人源化IL-17抗体。
1.2BIACORE型号：BIACORE X 100，GE；
1.3BIACORE芯片和试剂(以下为商品名，无公认的中译文)：
材料与试剂 公司 产品目录
1.Sensor Chip CM5Research Grade GE Healthcare BR-1000-14
2.Amine Coupling Kit GE Healthcare BR-1000-50
3.HBS buffer BIA Certified GE Healthcare BR-1001-88
4.乙酸盐(100ml) GE Healthcare BR-1003-51
5.Mouse Antibody Capture Kit GE Healthcare BR-1008-38
6.Regeneration buffer Glycine 1.5 GE Healthcare BR-1003-54
7.BIAmaintenance Kit GE Healthcare BR-1006-66
实验方法：
1、本发明抗体在CM5芯片的固定：现配1:150mM NHS:200mM EDC，以10μl/min速率注射入FC2(Flow cell 2)通道，注射时间7min，激活CM5传感器芯片。本发明抗体溶于10mM乙酸钠缓冲液中，浓度为30μg/ml，PH 5.0，以5μl/min注入激活的芯片中(HBS-EP流动相缓冲液:10mM HEPES,150mM NaCl,3.4mM  EDTA,0.005％surfactant P20,pH 7.4)。用1M ethanolamine以10μl/min速率注射7min，以封闭残留的主动耦合位置。大约8000RU产生。
2、结合动力学测定：以FC1(Flow cell 1)为参照通道，FC2(Flow cell 2)为样品通道，300RU时在FC2通道分别捕获鼠源或人源化的对照抗体或本发明抗体，随后注射不同浓度的IL-17(包括hIL-17A，MuIL-17，Rat IL-17)。循环条件为：在FCs所有通道中以30μl/min注射3min分析物，解离时间为20min，10mM Glycine,pH 1.5注射60s(速率为10μl/min)进行表面再生。通过Biacore X100evaluation software ver 2.0(Biacore)计算捕获抗体的信号和无捕获抗体的信号差值，运行缓冲液(running buffer)为10mM Hepes,650mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Tween-20。
实验结果：
1、按以上方法，对实施例1中得到的杂交瘤细胞进行筛选，结果如下：
表6：
抗体 人IL-17A KD(M)
Lilly mAb 2.18E-11
Novartis mAb 4.24E-10
IL17-mAb049 2.62E-11
结论：杂交瘤筛选得到的鼠源抗体IL17-mAb049同人IL-17A的亲和力和阳性抗体Lilly mAb相当，比Novartis mAb要好。
2、按以上方法，对实施例2中得到对人源化IL-17抗体进行检测，结果如下：
表7：
结论：人源化后抗体的亲和力比Lilly’s的阳性抗体(1.48E-11M)，提高了10倍。
测试例4细胞水平生物测定(GROαassay)
实验目的：
下面实验用抗-IL-17A抗体抑制IL-17刺激Hs27细胞分泌GROα来检测抗-IL-17A抗体的细胞生物学活性。
实验材料与仪器：
Hs27细胞：ATCC Cat.No.CRL-1634(备注：细胞培养超过6周则不推荐用于bioassay实验)；
Hs27细胞培养基：DMEM+10％FBS
DMEM：ATCC Cat.No.30-2002；
FBS：GIBCO Cat.No.10099,lot 8122818；
重组人IL-17A(rhIL-17A)：R&D Systems Cat.No.317-ILB,lot SOA161109B；
重组人IL-17A/F(rhIL-17A/F)：R&D System Cat No.5194-IL/CF,lot RXT101109A；
人CXCL1/GRO alpha Quantikine PharmPak kit：R&D system Cat.No.PDGR00
设备：Biotek ELx808酶标仪。
本发明实施例1中得到的鼠源单克隆细胞株。
本发明实施例2中得到的人源化IL-17抗体。
实验方法：
1、Hs 27细胞培养：
Hs27细胞用50ml DMEM+10％FBS培养基在T175培养瓶中培养；每隔3天细胞(密度约90％)按1:3比例稀释培养；培养的细胞在一个月之内进行bioassay实验，或从液氮中重新冻融；新冻融的细胞需培养近一周之后方可用于进行bioassay实验。
2、Bioassay(IL-17A)实验步骤
2.1950rpm离心4min(完全去除trypsin-EDTA)，收集Hs27细胞。用台盼蓝染色分析细胞活力，活力>80％方可用于实验；
2.2培养基按50μl/孔加入96孔板中；
2.3Hs27用DMEM+10％FBS稀释，按10000细胞/50μl/孔加入96孔板中；
2.4在重复孔中加入25μl IL-17人源抗体，抗体按1:3倍比稀释，初始浓度为10nM；
2.5每孔加入25μl重组人源IL-17A。IL-17A的最终浓度为0.3nM。96孔板按500rpm离心1min；
2.6细胞在37℃恒温孵育17h；
2.7收集细胞培养基上清液，用人CACL1/GRO alpha Quantikine kit(按厂家说 明书操作)检测上清液中GROα的浓度；
3、Bioassay(IL-17A/F)实验步骤：
IL-17A/F bioassay的操作步骤类似于IL-17A bioassay。不同之处为用IL-17A/F替代IL-17A。
实验结果：
1、按以上方法，对实施例1中得到的杂交瘤细胞进行筛选，结果如下：
表8：
结论：杂交瘤筛选得到的抗体IL17-mAb049生物学活性和阳性抗体Lilly mAb相当，比Novartis mAb要好。
2、按以上方法，对实施例2中得到的人源化抗体进行检测，结果如下：
表9：
结论：上述结果表明，人源化以后的抗体，都具有细胞生物学活性。Hu049-17、18、19、20的IC50(0.04nM–0.066nM)和阳性抗体(0.04nM)一样。此外，这些抗体和cynomolgus IL-17A有交叉反应(IC50为0.03nM-0.039nM)。对人IL-17A/F的活性比IL-17A弱大约10倍。
测试例5人IL-17的体内中和实验
实验目的：
进行体内中和试验的目的是为了验证本发明的抗体在体内可封闭IL-17结合到IL-17受体(如hIL-17RA)，从而抑制IL-17诱导的CXCR1表达。
实验材料与仪器：
蛋白：人IL-17A(hIL-17A)：根据本领域已知的方法利用Genbank人IL-17A蛋白登录号NP-002181进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
作为阳性对照的Lilly的人源化anti-IL-17抗体(Lilly mAb(hu))分别根据US7,838,638B2(LY 2439821)提供的人源化序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
人IgG(HuIgG)：(Millipore Cat.No.AG711)。
动物：7周龄雄鼠C57/B6(上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2008-0016)，每组6只。
试剂：Ab稀释溶液：柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0):10mM柠檬酸钠盐,50mM NaCl
hIL-17A稀释溶液：PBS(磷酸钠盐缓冲液，pH 7.2)。
小鼠CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit，6孔板，R&D SYSTEM,#SMKC00B。
实验方法：
1)小鼠随机分为15组，每组6只。
2)每只小鼠腹膜内给药(I.P.)100uL Hu049-18或对照抗体(HuIgG或Lilly mAb(hu))或稀释溶液，给药浓度分别为3000μg/kg,300μg/kg,30ug/kg和3μg/kg。
3)20小时后，皮下注射(S.C.)150μg/kg hIL-17A，每只小鼠注射100uL。
4)2小时后，收集血样，室温下置放2小时至凝集，或2-8℃过夜至凝集，然后2000x g离心20分钟。弃上清，立即进行实验或样品等分放置-20℃贮存。避免反复冻融。
5)用小鼠CXCL1/KC Quantikine ELISA Kit对步骤4得到的样品进行测定。
实验结果：
按以上方法对实施例2得到的人源化抗体Hu049-18进行检测，结果如下：
表10：
抗体(注射浓度3000μg/鼠) KC平均值(pg/mll)
HuIgG 937
Lilly mAb(hu) 158
Hu049-18 145
结论：与无效应的对照抗体相比，本发明抗体Hu-049-18在描述的条件下以3000μg/小鼠的剂量降低平均KC水平至约1/6。与对照抗体相比，本发明抗体Hu049-18在描述的条件下以3000μg/小鼠的剂量对小鼠KC水平的抑制能力相当。
测试例6体内抗体的半衰期(T1/2)检测
实验目的：
为了检测本发明抗体Hu049-18在大鼠或猕猴体内药代动力学参数。
实验材料与试剂：
蛋白：人IL-17A(hIL-17A)：根据本领域已知的方法利用Genbank人IL-17A蛋白登录号NP-002181进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞进行表达。
作为阳性对照的Lilly的人源化anti-IL-17抗体(Lilly mAb(hu))分别根据US7,838,638B2(LY 2439821)提供的人源化序列进行克隆，并瞬时转染HEK293E细胞 进行表达。
人IgG(HuIgG)：Human IgG,Polyclonal,Millipore Cat.No.AG711
动物：230-250g SD雄性大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005)，分足背静脉注射(IV)组和皮下注射(SC)组两组，每组5只
猕猴：2-3kg食蟹猴(海南金港生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(HN)2010-0001,0000152.)
试剂：抗体稀释溶液：柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0):10mM柠檬酸钠盐,50mM NaCl
hIL-17A稀释溶液：PBS(磷酸钠盐缓冲液，pH 7.2)
羊抗人IgG(Fab特异性)过氧化物酶偶联抗体，Sigma Cat.No.121M4811
实验方法：
1、大鼠体内检测步骤：
(1)体内给药
SD大鼠随机分为2组(分足背静脉注射(IV)组和皮下注射(SC)组)，每组5只；
无菌条件下，Hu049-18溶于柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中，终浓度为2.5mg/mL；
每只大鼠IV或SC给药，给药剂量为5mg/kg；
IV组按时间点0、5、15、30min、1、2、4、8、24hr、2、4、7、10、14、21、28d尾静脉取血，每次200uL(相当于取血清80uL)；SC组按时间点0、30min、1、2、4、8、12、24hr、2、4、7、10、14、21、28d尾静脉取血，每次200uL(相当于取血清80uL)；
收集的血样在室温下置放半小时至凝集，然后4℃下10000×g离心5分钟。收集上清，立即进行实验或样品等分放置-80℃贮存。避免反复冻融。
(2)用步骤(1)中得到是血清样品进行ELISA检测
1)标准曲线
a)直接包被1μg/ml的链霉素亲和素，4℃过夜；
b)用300μl含2％BSA的PBST封闭微量滴定板条，37℃恒温封闭1h，同时封闭无包被的空白孔作对照；
c)PBST洗涤3次，所有的洗涤在Biotek(Elx 405)自动洗板机上操作；
d)每孔加入100ul含hIL-17A(0.2μg/mL)的PBS，37℃恒温孵育1h；
e)PBST洗涤3次；
f)Hu049-18滴定：用抗体稀释液按照1:2倍比稀释，初始浓度为0.8μg/ml，每孔加入100μl稀释的Hu049-18，用于绘制标准曲线。37℃恒温孵育1h。
g)PBST洗涤3次；
h)每孔加入100μl羊抗人IgG(Fab特异性)过氧化物酶偶联抗体(Sigma Cat.No.121M4811)(1:5000)，37℃恒温孵育1h；
i)PBST洗涤3次。每孔加入100μl TMB底物，37℃恒温孵育5min，随后每孔加入100μl 1M HCl中止反应；
j)ELISA酶标仪(Molecular Devices,Spectra Max)读取450nm/630nm波长处的OD值。
2)样品测定
a)直接包被1μg/ml的链霉素亲和素，4℃过夜；
b)用300μl含2％BSA的PBST封闭微量滴定板条，37℃恒温封闭1h(1小时)，同时封闭无包被的空白孔作control对照；
c)PBST洗涤3次，所有的洗涤在Biotek(Elx 405)自动洗板机上操作；
d)每孔加入100μl含hIL-17A(0.2μg/mL)的PBS，37℃恒温孵育1h；
e)PBST洗涤3次；
f)血清样品滴定：实验前取一个大鼠血清样品，按照不同比例稀释，得到一个血清中抗体浓度正好在标准曲线中间位置的最佳稀释比例，将血清样品按照最佳稀释比例进行稀释，同时Hu049-18稀释至25ng/mL。每孔加入100μl稀释的样品血清和Hu049-18，37℃恒温孵育1h。每个滴定浓度设重复孔；
g)PBST洗涤3次；
h)每孔加入100μl羊抗人IgG(Fab特异性)过氧化物酶偶联抗体(Sigma Cat.No.121M4811)(1:5000)，37℃恒温孵育1h；
i)PBST洗涤3次。每孔加入100μl TMB底物，37℃恒温孵育5min，随后每孔加入100μl 1M HCl中止反应；
j)ELISA酶标仪(Molecular Devices,Spectra Max)读取450nm/630nm波长处的OD值。
2、猕猴体内检测步骤：
猕猴(食蟹猴)的体内检测步骤类似于大鼠的体内检测步骤，不同的是，食蟹猴的给药方式仅为静脉注射(IV)给药，剂量为1mg/kg，静脉取血时间为0、5、15、30min、1、2、4、8、24、32hr、3、4、5、6、9、12、14、17、21、28、35d，每次采血500μL，离心得到的血清样品分成3份(确保2份的血清样品含量为60μL)，-80℃冻存待测。
实验结果：
按以上方法，对实施例2中得到的人源化抗体Hu049-18进行检测，结果如下：
表11：
结论：以上结果表明，与Lilly的对照抗体相比(阳性抗体在食蟹猴体内T1/2报道值为6.5天(iv)和10.3天(sc)，本发明抗体Hu049-18在描述的条件下其体内半衰期显著延长。

Claims (32)

  1. 一种IL-17A结合物，其包含：
    抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区包含0-3个选自如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的LCDR区；和
    抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区包含0-3个选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的HCDR区；
    其中抗体轻链可变区和重链可变区的CDR区的数目不能同时为0。
  2. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其包含1个选自如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的LCDR区。
  3. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其包含1个选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的HCDR区。
  4. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其包含2个选自如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的LCDR区。
  5. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其包含2个选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的HCDR区。
  6. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其包含3个LCDR区，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
  7. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其包含3个HCDR区，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
  8. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区、或者鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区。
  9. 如权利要求8所述的IL-17A结合物，其中所述的抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
  10. 如权利要求8所述的IL-17A结合物，其进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、或者λ链或其变体的轻链恒定区。
  11. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、IgG2或其变体的重链FR区、IgG3或其变体的重链FR区、IgG4或其变体的重链FR区。
  12. 如权利要求11所述的IL-17A结合物，其中所述的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
  13. 如权利要求11所述的IL-17A结合物，其进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链恒定区、IgG2或其变体的重链恒定区、IgG3或其变体的重链恒定区、IgG4或其变体的重链恒定区。
  14. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其抗体轻链可变区进一步包含人源κ链或其变体的轻链FR区、或者λ链或其变体的轻链FR区。
  15. 如权利要求14所述的IL-17A结合物，其中所述轻链FR区是氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的人种系轻链A10的FR区或其变体。
  16. 如权利要求15所述的IL-17A结合物，其中所述人种系轻链A10的FR区变体是指在人种系轻链A10的FR区有0-10的氨基酸变化。
  17. 如权利要求16所述的IL-17A结合物，其中所述氨基酸变化选自如下的一种或多种：F71Y、K49Y、Y36F、L47W。
  18. 如权利要求14所述的IL-17A结合物，其中所述抗体轻链选自如SEQ ID NO:9所示的轻链及其变体。
  19. 如权利要求14所述的IL-17A结合物，其进一步包含人源κ链或其变体的轻链恒定区、或者λ链或其变体的轻链恒定区。
  20. 如权利要求1所述的IL-17A结合物，其中所述重链可变区进一步包含人源IgG1或其变体的重链FR区、IgG2或其变体的重链FR区、IgG3或其变体的重链FR区、IgG4或其变体的重链FR区。
  21. 如权利要求20所述的IL-17A结合物，其中所述重链FR区是氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的人种系重链VH1-18的FR区或其变体。
  22. 如权利要求21所述的IL-17A结合物，其中所述变体指在VH1-18的重链FR区有0-10的氨基酸变化。
  23. 如权利要求22所述的IL-17A结合物，其中所述氨基酸变化选自如下的一种或多种：A93T、T71A、M48I、V67A、M69L、T73D和S76N。
  24. 如权利要求21所述的IL-17A结合物，其中所述抗体重链选自：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示重链或其变体。
  25. 如权利要求20所述的IL-17A结合物，其进一步包含人源IgG1或其变体的重链恒定区、IgG2或其变体的重链恒定区、IgG3或其变体的重链恒定区、IgG4或其变体的重链恒定区。
  26. 一种表达上述权利要求中任一项所述IL-17A结合物的载体。
  27. 如权利要求26所述的载体，其含有编码上述权利要求中任一项所述IL-17A结合物的核苷酸。
  28. 一种药物组合物，其含有：如权利要求1至25任一项所述的IL-17A结合物；和可药用赋形剂、稀释剂或载体。
  29. 如权利要求1至25任一项所述的IL-17A结合物、或如权利要求28所述的药物组合物，在制备用于治疗IL-17介导的疾病或病症的药物中的用途。
  30. 如权利要求29所述的用途，其中：
    所述疾病选自：炎症和自身免疫疾病；
    所述疾病优选为银屑癣、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症、炎性关节炎。
  31. 一种治疗IL-17介导的疾病或病症的方法，该方法包括向患者施用有效量的如权利要求1至25任一项所述的IL-17A结合物、或如权利要求28所述的药物组合物。
  32. 如权利要求31所述的治疗IL-17介导的疾病或病症的方法，其中：
    所述疾病选自：炎症和自身免疫疾病；
    所述疾病优选为银屑癣、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症、炎性关节炎。
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